JUAN LOPEZ CRISPIN TESIS

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
RELACIÓN DE HALLAZGOS DE CITOLOGÍA VAGINAL EXFOLIATIVA Y
CONCENTRACIONES SÉRICAS DE PROGESTERONA DENTRO DE UN
ESQUEMA DE SINCRONIZACIÓN DE ESTROS EN OVEJAS DE PELO.
TRABAJO RECEPCIONAL EN LA MODALIDAD DE:
TESIS
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
PRESENTA:
JUAN LÓPEZ CRISPÍN
ASESORES:
DR. JOSÉ MANUEL MARTÍNEZ HERNÁNDEZ
MSC. CARLOS LAMOTHE ZAVALETA
H. VERACRUZ, VER. JULIO 2010
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE CUADROS ........................................................................................... iv
ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................. v
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. vi
DEDICATORIA...................................................................................................... viii
RESUMEN .............................................................................................................. ix
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 1
2. ANTECEDENTES ............................................................................................... 3
2.1 CICLOS ESTRALES ......................................................................................... 3
2.2 CITOLOGÍA VAGINAL EXFOLIATIVA .............................................................. 5
2.3 CONCENTRACIONES SÉRICAS DE PROGESTERONA (P4). ........................ 8
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................. 9
4. HIPÓTESIS ......................................................................................................... 9
5. OBJETIVOS .......................................................................................................10
5.1 GENERAL ....................................................................................................... 10
5.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................ 10
6. MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................11
6.1 LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA ..................................................................... 11
6.2 ANIMALES EXPERIMENTALES ..................................................................... 12
6.3 MANEJO NUTRICIONAL Y SANITARIO ........................................................ 12
6.4 TOMA Y MANEJO DE MUESTRAS ................................................................ 13
6.4.1 CITOLOGÍA VAGINAL EXFOLIATIVA ................................................................. 13
6.4.2 PROGESTERONA (P4) ........................................................................................... 14
6.5 ANÁLISIS DE MUESTRAS ............................................................................. 14
6.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ............................................................................... 16
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...........................................................................17
7.1 DÍA -14 DEL TRATAMIENTO ......................................................................... 17
7.2 DÍA -7 DEL TRATAMIENTO ........................................................................... 19
7.3 DÍA 0 DEL TRATAMIENTO............................................................................. 20
ii
7.4 DÍAS PREVIOS AGRUPADOS ....................................................................... 21
7.5 DÍA DE RETIRO DEL DISPOSITIVO (14)...................................................... 25
7.6 DÍA DE ESTRO (16) ....................................................................................... 27
8. CONCLUSIONES...............................................................................................31
9. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................32
iii
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1.- Porcentajes de células del epitelio vaginal en
los días -14, -7 y 0 para ovejas de pelo previos al tratamiento
de un progestágeno intravaginal……………………………………………………….22
Cuadro 2.- Porcentajes de células del epitelio vaginal al momento
del retiro de la esponja intravaginal (día 14) en ovejas de
pelo…………………………………………….………………………………………….26
Cuadro 3-. Porcentajes de células del epitelio vaginal al momento
del estro (día 16) en ovejas de pelo……………….……………………………..……28
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Módulo de ovinos y caprinos de la Posta Zootécnica
Torreón del Molino……………………………………………………………………….11
Figura 2. Clasificación de células encontradas en la citología
vaginal exfoliativa de ovejas de pelo…………………………………………………..15
Figura 3. Hallazgos de citología vaginal en el día -14 del tratamiento
con MAP y eCG en ovejas de pelo…………………………………………………….18
Figura 4. Hallazgos de citología vaginal en el día -7 del tratamiento
con MAP y eCG en ovejas de pelo…………………………………………………….19
Figura 5. Hallazgos de citología vaginal en el día 0 del tratamiento
con MAP y eCG en ovejas depelo……………………………………………………..21
Figura 6. Hallazgos de citología vaginal en los días previos (-14, -7 y 0)
al tratamiento con MAP y eCG en ovejas de pelo…………………………………...24
Figura 7. Células encontradas en la citología vaginal
exfoliativa de ovejas de pelo………………………………………………………. …..24
Figura 8. Hallazgos de citología vaginal al momento de retiro de
la esponja intravaginal (día 14) en ovejas de pelo…………………………………...25
Figura 9. Hallazgos de citología vaginal al momento del estro
en ovejas de pelo………………………………………………………………………...28
v
AGRADECIMIENTOS
Primeramente a Dios por estar conmigo siempre, por haberme permitido concluir
este gran proyecto de vida, a pesar de todas las dificultades que encontré a lo
largo del camino desde que inicié con mis estudios hasta hoy, gracias por no
dejarme caer cuando pensaba que todo estaba perdido.
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, nuestras casa, por pertenecer a
ella, y a los médicos que imparten clases en ella por la formación profesional.
A mis amigos: Raúl Galván, Víctor Balderrama, Efigenio, Gustavo Vela, Juan
Rubén, Andrés Guerrero, Andrés Sánchez, Erik Fuentes, Emanuel, Fernando
Gonzales, Jesús Santos, Gladis, Arely Cristóbal, Anghie y Miriam por el apoyo
brindado y por estar conmigo en momentos buenos y malos.
En especial a Marjorie por estar conmigo en momentos buenos y malos a pesar de
todo y por su apoyo en los muestreos de este trabajo.
A la Dra. Guadalupe Vega Rubio por su gran ayuda cuando empecé a escribir este
trabajo, por sus consejos y por su amistad brindada, en verdad que me han
servido de mucho; a la Dra. Rosa Ma. Cordero por ser como mi segunda madre,
por los consejos y por su apoyo incondicional; a la Dra. Bertha Clementina por
fungir como jurado y por la ayuda en la realización de las pruebas de
radioinmunoensayo; al Dr. Belisario por el apoyo en el laboratorio de
radioinmunoensayo; al Dr. Antonio Hernández por permitir procesar las muestras
en el laboratorio de Alteraciones Funcionales; a la Dra. Nelly Ibarra por el apoyo
en algún momento en el laboratorio de Histología; a la Dra. Gema Verde por la
ayuda en la traducción de portugués a español; al Ing. Rubén García por sus
consejos en la estadística; al MVZ Cocom por contribuir en mi formación
profesional cuando entré a la facultad; al Dr. Dino Herrera por la aportación de sus
conocimientos en cirugía y terapéutica que me han sido el pilar para seguir
generando conocimientos y por supuesto al Dr. Mancisidor por sus grandes
cátedras de inmunología, para mí una de las mejores clases que recibí.
vi
A mis asesores: Dr. José Manuel Martínez Hernández y MSc. Carlos Lamothe
Zavaleta, por su valioso tiempo que dedicaron en la realización de este trabajo,
por la ayuda brindada cuando la necesité.
A Luis Olivos porque aparte de ser un gran amigo tuve el privilegio de trabajar
conjuntamente con él en este proyecto, muestreando y corriendo las pruebas
necesarias. Ha sido una experiencia muy grata.
A Laboratorios Ovejero S.A., España y Sanfer, S.A. de C.V., México y
especialmente al MVZ Guillermo Benítez Rodríguez por la donación de los
fármacos hormonales para la realización de este estudio.
vii
DEDICATORIA
A MIS PADRES:
Abraham y Josefina, quienes depositaron toda su confianza en mí, por el
sobreesfuerzo que han hecho para cumplir este propósito, por el apoyo
incondicional a pesar de las críticas de la gente, porque nunca renunciaron a creer
en mí, porque cuando salí de casa hice un juramento, nunca defraudarlos, y hoy
se ha cumplido. Por sus oraciones que sin duda fueron escuchadas, para mi son
los mejores padres del mundo, los amo.
A MIS HERMANAS:
Cecilia, Rosaura y Martha, por haberme apoyado en este proyecto, por estar
siempre conmigo, por el apoyo moral que cuánto hace falta cuando estamos lejos
de casa, porque simplemente sin ustedes no lo hubiera logrado.
viii
RESUMEN
Juan López Crispín. Relación de hallazgos de citología vaginal exfoliativa y
concentraciones séricas de progesterona dentro de un esquema de
sincronización de estros en ovejas de pelo. Tesis de Licenciatura en Medicina
Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Veracruz, México. Directores
de tesis: Dr. Manuel Martínez Hernández y MSc. Carlos Lamothe Zavaleta.
El objetivo de este trabajo fue describir los hallazgos en las poblaciones celulares
del epitelio vaginal en ovejas de pelo y su relación con los niveles séricos de
progesterona, dentro de un esquema de sincronización de estros. Se utilizaron 40
ovejas, raza Katahdin y Pelibuey (Tr = 30 con tratamiento y 10 To = controles). En
el día 0 se insertó una esponja intravaginal (65 mg de acetato de
medroxiprogesterona) y fue retirada a los 14 días (día 14) y al mismo tiempo se
administraron 400 UI de eCG. La manifestación del estro se presentó a los dos
días posterior al retiro de la esponja. Para citología vaginal exfoliativa se muestreó
en los días -14, -7, 0, 14 y 16. Para medir niveles séricos de progesterona se
muestreó en los días -14, -7 y 0. El análisis estadístico se realizó por datos
categóricos evaluados por Chi cuadra dentro del procedimiento FREQ del paquete
estadístico SAS (SAS, 2006). Los grupos celulares identificados en la citología
vaginal fueron: células basales, células intermedias, células superficiales,
escamas nucleadas y escamas anucleadas. Los datos citológicos para los días 14, -7 y 0 se analizaron dentro de subgrupos con niveles altos de progesterona
(PB) y niveles bajos (NB), no encontrando diferencia significativa (P>0.05) entre
las poblaciones celulares de ambos subgrupos. Para el día 14 no se encontró
diferencia significativa (P>0.05) entre el grupo tratado y grupo control, y para el
día del estro si se encontró diferencia significativa (P<0.05). Se concluye que no
hay diferencia entre las poblaciones celular del epitelio vaginal de ovejas con
concentraciones altas y animales con concentraciones bajas de progesterona.
Además, la población celular del epitelio vaginal de las ovejas que presentaron
estro sincronizado fue diferente con las que presentaron estro natural.
Palabras clave: estro en ovinos, MAP, histología reproductiva.
ix
1. INTRODUCCIÓN
En México aproximadamente existen alrededor de 7.7 millones de cabezas de
ovinos (SIAP, 2008), de las cuales, una tercera parte se localizan en la zona
centro del país, región en que se encuentran los principales centros de consumo
(Torres, 1999). En la región tropical del país se presenta una gran diversidad de
sistemas de producción de ovinos que se caracterizan, en la mayor parte, por la
ausencia de prácticas de tipo sanitario, nutricionales y reproductivas más comunes
(Díaz, 1999).
La citología vaginal exfoliativa (CVE) se utiliza en la mayoría
de las
especies como un método diagnóstico de enfermedades vaginales, uterinas o bien
para detectar la etapa del ciclo estral o preñez (citología hormonal). La influencia
de las hormonas ováricas sobre el epitelio vaginal ocasiona cambios citológicos
característicos que permiten, en la mayoría de los casos, determinar la etapa del
ciclo estral en la que se encuentra la hembra, por lo que es un procedimiento
ampliamente utilizado en medicina veterinaria, sobre todo en la perra (De Buen,
2001). Aunque, el examen de células de la vagina ha sido reportado en gatas,
ovejas y otras especies dentro del diagnóstico reproductivo (Sanger, 1958;
Schutte, 1967).
En el ciclo normal de cabras de cría ocurren cambios endocrinos y
secretorios en los ovarios y túbulos genitales, estos cambios están asociados a
hormonas sexuales esteroides (Dielman, 1986; Pérez-Martínez et al., 1999).
1
De esta manera consideramos que es importante contar con técnicas de
diagnóstico reproductivo que sean relativamente de fácil acceso, además, al
establecer comparaciones entre diversas técnicas como la citología vaginal
exfoliativa y el radioinmunoensayo, se mejora la plataforma tecnológica para el
establecimiento de manejos reproductivos en pequeños rumiantes de zonas
tropicales con clima cálido.
2
2. ANTECEDENTES
La reproducción animal día con día ha ganado espacio en el mundo científico,
como un área facilitadora de la calidad genética y de la proliferación de animales
domésticos, con énfasis en las especies para la producción de carne y leche,
dando condiciones y perspectivas positivas en el contexto de alimentación a la
población humana (Raposo et al., 2000)
Los avances en la biotecnología de la reproducción de ovinos y caprinos
también han propiciado resultados fabulosos con respecto a la rápida propagación
de genes superiores, lo que ha aumentado el desempeño reproductivo (Amoah y
Gelaye, 1997), a su vez la citología vaginal representa ser una herramienta auxiliar
en la identificación del estado reproductivo de hembras, al facilitar el control del
estro, aprovechándolo para lograr una consecuente gestación, por lo que favorece
los programas de reproducción (Raposo et al., 1999).
2.1 CICLOS ESTRALES
La selección natural ha permitido la adaptación de los mamíferos a los diferentes
hábitats, favoreciendo que su reproducción ocurra armónicamente con las
variaciones ambientales (Bronson y Heideman, 1994). Por lo consiguiente, el
intervalo entre la concepción y el parto propio de cada especie, determina el
momento del año en que tiene lugar la época reproductiva. En general, es común
que las razas ovinas originarias de latitudes extremas (≥ 35° de latitud norte o sur)
3
tengan un anestro estacional superior a los cinco meses de duración y en
ocasiones hasta de ocho meses, mientras que en las razas originarias de latitudes
bajas (≤ a los 35°) este periodo no suele superar los tres meses (Lindsay, 1991).
En el caso de las razas originarias o adaptadas a vivir en latitudes bajas,
generalmente se ha considerado que carecen de un anestro estacional verdadero
(Porras et al., 2003).
Según Mies Filho (1987), la oveja es un animal poliéstrico estacional en la
que el ciclo estral comprende las fases de proestro, estro, metaestro y diestro, con
una duración de 16 a 17 días. El proestro varía de dos a tres días, el estro dura de
24 a 36 horas. El metaestro es una fase no muy bien definida que dura cerca de
dos días y el diestro regularmente dura diez días. Esos periodos ocurren de
manera cíclica y secuencial excepto en el anestro.
En regiones tropicales, donde la luminosidad no sufre grandes cambios, las
cabras y ovejas presentan estros y ovulan todos los meses del año (Ribeiro,
1997). En las regiones de México con estas mismas características, la producción
ovina se lleva a cabo con razas de pelo, como son: Tabasco o Pelibuey, y la
Blackbelly o Panza Negra, debido a su capacidad de adaptación a estas regiones
(Álvarez, 1995).
Al estudiar las variaciones estacionales en la presentación de estros en
ovejas Pelibuey bajo condiciones de pastoreo en el trópico húmedo (Martínez de
la Torre, Veracruz, México 20° 4' de latitud norte y 97° 3' de longitud oeste), la
manifestación de estros durante el año varió de 81.2% (abril) a 100% (agosto), lo
que indica que no hay diferencia significativa en la presentación de estros
atribuible a la época del año, al analizar el porcentaje de óvulos fertilizados los
4
resultados muestran que éste fue menor en abril, lo cual podría deberse a la
calidad y disponibilidad de forrajes en esa época (Cruz et al., 1994).
2.2 CITOLOGÍA VAGINAL EXFOLIATIVA
La citología vaginal exfoliativa es un método rápido y simple que permite la
observación de varios tipos de células de la vagina que coinciden con la fase
hormonal correspondiente, sufriendo modificaciones a lo largo de todo el ciclo
estral, siendo éste un método rápido y simple (Schutte, 1967). En medicina
veterinaria se ha empleado para detectar las diferentes fases del ciclo estral,
auxiliando para el tiempo óptimo de
la inseminación artificial y control de la
reproducción como un método rápido y viable económicamente (Bell et al., 1973;
Raposo et al., 1999; Toniollo et al., 2005).
En la citología vaginal encontramos células de las diferentes capas del
epitelio estratificado plano no queratinizado, a veces células endocervicales, de
reserva, y en ocasiones células endometriales, así como células no epiteliales y es
posible encontrar según la especie algunas variaciones en cuanto al tamaño de
las células del epitelio vaginal (De Buen, 2001). Estas variaciones se encuentran
en capas celulares morfológicamente distintas que forman la mucosa vaginal, las
cuales varían en espesura a lo largo del ciclo estral, durante la gestación, anestro
y lactación. En ovejas gestantes el estrato vaginal ovino sufre alteraciones
semejantes a las ocurridas durante la fase luteal, en tanto que al transcurrir el
periodo de gestación, hay una tendencia a la disminución progresiva de células
5
superficiales y un aumento en las células intermedias y parabasales, con
predominio de las parabasales (Ghannam et al., 1972).
En un estudio realizado por Raposo et al. (2000), hicieron la comparación de
citología vaginal de cabras cíclicas y gestantes de la raza Saanen, y encontraron
que durante todas las fases del ciclo estral (proestro, estro, metaestro y diestro) e
inclusive durante la gestación, las células intermedias fueron significativamente
superiores en relación a otros tipos celulares. Las células superficiales nucleadas
no presentaron variación significativa entre las diversas fases del ciclo estral y el
periodo
de
gestación
estudiado.
Las
escamas
anucleadas
fueron
significativamente superiores durante el estro en relación al metaestro, diestro y
gestación. En la fase del diestro entre el grupo de animales ciclando y del grupo
gestante, fue encontrada diferencia estadística solamente para las células
parabasales.
Vojtic (1997) estudió el epitelio vaginal en ovejas durante el periodo de
gestación comprendido entre el día 60 y 90 y observó que las células superficiales
nucleadas eran predominantes, mientras que las ovejas no gestantes presentaron
un número mayor de células parabasales.
Bajo la influencia estrogénica, las capas del epitelio estratificado de la
vagina, principalmente las más superficiales, sufren una proliferación, que tiene
como resultado la exfoliación de células queratinizadas. Mientras que cuando
predomina la acción de la progesterona consecuente a la actividad de los
estrógenos, ocurre la proliferación y maduración de células epiteliales presentes
en capas más profundas (Schutte, 1967; De Buen, 2001).
6
En un estudio realizado en cabras de la raza Alpina por
Toniollo et al.
(2005), no se observaron células basales en los frotis de citología vaginal
exfoliativa del ciclo estral de cabras sincronizadas y grupo control. En cuanto a las
células intermedias aun en el proestro, no hubo diferencia entre el grupo
sincronizado y el grupo control. Respecto a las células superficiales nucleadas no
se
observó
diferencia
significativa
entre
los
grupos
sincronizados
con
progestágenos y grupo control durante el metaestro y diestro. En las células
superficiales anucleadas hubo diferencia significativa en el proestro para ambos
grupos y para el estro los dos grupos presentaron mayor número de células
superficiales anucleadas.
En la caracterización de cambios citológicos que experimenta el epitelio
vaginal por efecto de las variaciones hormonales cíclicas, se realizaron frotis
diarios durante 60 días. El estro se caracterizó por la aparición de células
superficiales queratinizadas eosinofílicas (Ferrando et al., 1987).
Porto et al. (2007) informa que en ovejas de la raza Santa Inés, durante el
estro la frecuencia de células superficiales anucleadas fue estadísticamente
diferente que las células intermedias parabasales y basales. En la fase de
metaestro y diestro no encontraron diferencia significativa entre las células
superficiales anucleadas, intermedias y parabasales. En el proestro las células
parabasales e intermedias fueron diferentes significativamente entre sí, las
basales y superficiales anucleadas no presentaron diferencia significativa. Las
fases del ciclo estral en ovejas son de difícil interpretación, ya que las fases de
7
proestro y diestro son similares y se concluye que a través de la citología vaginal
exfoliativa se pueden diferenciar las fases del ciclo estral en ovejas.
2.3 CONCENTRACIONES SÉRICAS DE PROGESTERONA (P4).
Los valores característicos de progesterona (P4) y estradiol (E2) en suero, durante
los diferentes estados reproductivos de cabras, vacas y ovejas, se pueden
determinar por radioinmunoensayo (Herrera et al., 1993).
Entre las aplicaciones prácticas en la determinación de P4 por RIA en ovejas
y cabras tropicales, podemos señalar el estado reproductivo actual de los rebaños,
diagnósticos de no gestación, pubertad, ciclicidad, reinicio de la actividad cíclica
luteal, alteraciones del ciclo estral y mortalidad embrionaria, efecto macho,
gestación y parto. Un criterio que se ha utilizado para saber el estado reproductivo
de ovejas se efectúa al tomar tres muestras consecutivas separadas por una
semana cada una; si en las tres muestras los niveles de P 4 son mayores de 0.5
ng/mL, se considera gestación; de las tres muestras tomadas, si en una o dos los
niveles son mayores de 0.5 ng/ml se considera cíclica y si en las tres muestras
consecutivas los niveles de P4 no son detectables (valores por debajo de 0.5
ng/mL), se considera en anestro. El análisis de una sola muestra con P 4 mayor de
0.5 ng/mL no discrimina entre la fase lúteal del ciclo y una gestación (Delpino y
Gonzales-Stagnaro, 1993).
8
3. JUSTIFICACIÓN
El conocimiento de los cambios en la estructura poblacional de citología vaginal
exfoliativa en ovejas de pelo, así como las concentraciones séricas de P4 en
muestreos consecutivos, pueden ser empleados para mejorar la eficiencia en
programas de inseminación artificial, además, son una posible herramienta para
determinar la actividad luteal en ovejas al momento de iniciar un tratamiento de
sincronización de estros.
4. HIPÓTESIS
La estructura poblacional de las células del epitelio vaginal presenta variaciones
de acuerdo a las concentraciones séricas de progesterona en ovejas de pelo.
9
5. OBJETIVOS
5.1 GENERAL
Describir los hallazgos en las poblaciones celulares del epitelio vaginal en ovejas
de pelo y su relación con los niveles séricos de progesterona, dentro de un
esquema de sincronización de estros.
5.2 ESPECÍFICOS
a) Conocer la estructura poblacional de las células del epitelio vaginal en
ovejas de pelo a los -14, -7 y 0 días de la aplicación de esponjas
intravaginales
con
medroxiprogesterona
(MAP),
así
como
las
concentraciones séricas de P4 en los mismos días del muestreo celular.
b) Determinar el efecto del progestágeno sobre la estructura poblacional de
las células del epitelio vaginal en ovejas de pelo al momento del retiro del
dispositivo intravaginal.
c) Caracterizar la estructura poblacional de las células del epitelio vaginal en
ovejas de pelo al momento de la manifestación del estro posterior al
tratamiento con progestágenos.
10
6. MATERIAL Y MÉTODOS
6.1 LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA
Las ovejas se trabajaron en el módulo de ovinos y caprinos de la Posta Zootécnica
Torreón del Molino de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la
Universidad Veracruzana, que se encuentra ubicada en la carretera 140 en el
tramo Veracruz-Xalapa a la altura del kilómetro 14.5, ubicada al Noreste de la
congregación de Tejería, en el Municipio de Veracruz, a los 19° 10´ latitud Norte y
96° 10´ longitud Oeste, a una altura sobre el nivel del mar de 15 metros (García,
1981).
.
Figura 1. Módulo de ovinos y caprinos de la
Posta Zootécnica Torreón del Molino
11
6.2 ANIMALES EXPERIMENTALES
Se utilizaron un total de 40 ovejas vacías, con una condición corporal entre 3 y 4
en la escala del 1 al 5. De las 40 ovejas, 20 fueron de la raza Pelibuey y las otras
20 de la raza Katahdin, de las cuales a 30 se les aplicó tratamiento (15 Pelibuey y
15 Katahdin) y 10 se utilizaron como grupo control (5 Pelibuey y 5 Katahdin).
El tratamiento consistió en la inserción de esponjas intravaginales en el día 0
que contienen 65 mg acetato medroxiprogesterona, (SINCROGEST ESPONJAS®,
Laboratorios Ovejero S.A. España) y fueron retiradas a los 14 días. En este mismo
día, para sincronizar la ovulación se aplicó 400 UI de gonadotropina coriónica
equina (eCG) por animal (SERIGAN®, Laboratorios Ovejero S.A., España).
6.3 MANEJO NUTRICIONAL Y SANITARIO
Se continuó con el manejo nutricional ya establecido en el módulo de ovinos y
caprinos de la Posta Zootécnica Torreón del Molino, con una alimentación basada
en forraje de corte diario, que consistió de pastos: Estrella de África (Cynodon
nlemfuensis), Pará (Brachiaria mutica), Chetumal (Brachiaria humidicola) y
Pangola (Digitaria decumbens), ofrecido ad libitum, y 300 gr. de concentrado
con 18% de PC y con más de 2.0 Mcal. de energía digestible.
En cuanto al manejo sanitario, los animales son inmunizados con bacterinas
contra enfermedades clostridiales y pasterelosis.
12
6.4 TOMA Y MANEJO DE MUESTRAS
La citología vaginal y las muestras de sangre para medir niveles séricos de
progesterona se tomaron en cada oveja en los días -14, -7 y 0, tomando en cuenta
como día 0 el momento de la aplicación de las esponjas intravaginales. Se volvió a
realizar CVE el día de retiro de la esponja, que fue el día 14 y otra CVE en el día
de la manifestación del estro.
6.4.1 CITOLOGÍA VAGINAL EXFOLIATIVA
La citología vaginal exfoliativa se realizó por las mañanas por medio de un hisopo
impregnado con solución salina fisiológica;
abriendo los labios vulvares de la
oveja e introduciendo el hisopo en la comisura dorsal de la vulva, evitando pasar
por la fosa clitórica y se siguió en dirección dorsocraneal, hasta pasar el arco
isquiático (Silva et al., 2004). Se extendió por rodamiento en portaobjetos
debidamente identificado con el número del animal, raza y día, y se dejó secar al
medio ambiente, para ser llevadas al laboratorio de Alteraciones Funcionales de la
Unidad de Diagnóstico de la Posta Zootécnica Torreón del Molino. En el
laboratorio se procedió a fijarlas en alcohol al 70 %. La técnica de tinción utilizada
fue la de hematoxilina-eosina (Garrido et al., 2005).
13
6.4.2 PROGESTERONA (P4)
Las muestras de sangre para la extracción de suero fueron tomadas de la vena
yugular, utilizando tubos al vacío sin anticoagulante, identificando el número del
animal, la raza y el día que se tomó la muestra, que coincidió con la toma para
CVE.
Posteriormente las muestras de sangre fueron centrifugadas a 2000 rpm
durante 15 minutos (Delpino y Gonzalez, 1993), y el suero fue separado con una
pipeta automática de precisión a viales previamente rotulados; se empaquetaron y
se conservaron en congelación a -20 °C hasta que fueron analizadas en el
laboratorio de radioinmunoensayo.
6.5 ANÁLISIS DE MUESTRAS
Los frotis de CVE fueron observados en un microscopio óptico con objetivo de
40X, contando las primeras 100 células en diferentes campos.
Debido a que la diferenciación celular realizada por diversos autores difiere
entre uno y otro, para este estudio se estableció una clasificación que incluyó la
identificación de cinco tipos diferentes de células, de los tipos basales,
intermedias, superficiales y escamas nucleadas y anucleadas hasta llegar a contar
100, aproximándose más de acuerdo a lo informado por De Buen (2001) que
establece
la
siguiente
clasificación:
basales
o
germinales,
intermedias,
superficiales y escamas.
14
Figura 2. Clasificación de células encontradas en la citología vaginal exfoliativa de
ovejas de pelo.
Para el análisis de P4 se utilizaron kits (Coat-a-count® Siemens, California,
USA) en fase sólida y las muestras de suero fueron leídas mediante un contador
de rayos gamma (PerkinElmer WAllAC WIZARD 1470 AUTOMATIC GAMMA
COUNTER®) en el laboratorio de Radioinmunoensayo de la Unidad de
Diagnóstico de la Posta Zootécnica Torreón del Molino (Abraham, 1981).
15
6.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados de CVE de los animales en los días de muestreo -14, -7 y 0, se
agruparon de acuerdo a las concentraciones de P 4. Se formaron dos subgrupos,
considerándose niveles altos (NA) a los animales con valores de P4 mayor a 1
ng/mL, o sea la fase luteal (metaestro y diestro) y, el siguiente subgrupo
correspondió a los animales con niveles bajos (NB) de P4 menor de 1 ng/mL o
sea fase folicular (proestro y estro) (Amiridis et al., 2005; Rodríguez et al., 2009).
El análisis estadístico del promedio de las poblaciones celulares agrupadas por
concentraciones altas o bajas se realizó por datos categóricos evaluados por Chi
cuadra dentro del procedimiento FREQ del paquete estadístico SAS (SAS, 2006).
Se agruparon los datos CVE de valores altos para los días -14, -7 y 0, y de la
misma manera para los valores bajos.
Para el día de retiro de la esponja y sincronización de la ovulación (día 14),
se determinó si había diferencia estadística utilizando el mismo procedimiento
(FREQ) entre las poblaciones celulares del grupo tratado y un grupo testigo de
animales con valores altos de P4.
Para el día de estro se compararon las medias de las poblaciones celulares
entre el grupo tratado y el grupo control por el mismo procedimiento.
16
1. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1 DÍA -14 DEL TRATAMIENTO
Del grupo tratado (n=30) con esponja intravaginal impregnada con MAP se
determinó que en el día -14 previo a la aplicación de ésta, 26/30 (86.6 %) ovejas
se encontraban con NA de P4, es decir por arriba de 1 ng/mL y cuatro (13.3 %)
presentaron NB de P4. El análisis de RIA tuvo un coeficiente de variación de 5.1%
y una sensibilidad analítica de 0.02 ng/mL. El rango de los niveles de P4 para los
subgrupos de NA y NB fue de, 1.0 a 10.5 a ng/mL y de 0.1 a 0.8 ng/mL
respectivamente. Los promedios de P4 para tales subgrupos fueron de 5.2 y 0.5
ng/mL respectivamente.
Con respecto a los datos CVE para el día -14, el porcentaje de los grupos
celulares para el grupo con NA de P4 fue de: células basales 2%, células
intermedias 21%, células superficiales 28%, escamas nucleadas 23% y escamas
anucleadas 26%. Para el grupo con NB de P4, la población celular fue de: basal
1%, intermedia 13%, superficiales 21%, escamas nucleadas 35% y escamas
anucleadas 30%.
17
40
35
% de células
30
25
20
15
10
5
0
B
I
S
NA
EN
EA
NB
Figura 3. Hallazgos de citología vaginal en el día -14 del tratamiento con MAP y
eCG en ovejas de pelo. B = basales, I = intermedias, S = superficiales, EN =
escamas nucleadas y EA = escamas anucleadas. NA = niveles altos de P 4 y NB =
niveles bajos de P4.
En los animales con NA, el grupo celular que predominó fue de células
superficiales con un 28% y el grupo con menor presencia, fue de células basales
con un 2%; mientras que para los animales con P4 < 1 ng/mL, el grupo de células
que predominó fue el de escamas nucleadas con un 35% y el grupo celular con
menor presencia fue el de las células basales con 1%.
18
7.2 DÍA -7 DEL TRATAMIENTO
En el día -7 previo al tratamiento, 18/30 (60 %) de las ovejas se encontraban con
NA de P4 y 12 con niveles bajos. El rango para los subgrupos de animales con
concentraciones séricas de NA y NB de P4 fue de 1.1 ng/mL a 13. 3 ng/mL y 0.2
ng/mL a 0.6 ng/mL respectivamente. Los promedios para los grupos de NA y NB
fueron 4.8 ng/mL y 0.5 ng/mL respectivamente. El porcentaje de células de la CVE
para este día fue, subgrupo con NA de P4, fue: basales 3%, intermedias 17%,
superficiales 33%, escamas nucleadas 22% y escamas anucleadas 25%. Para el
grupo NB de P4, el porcentaje fue de: basales 3%, intermedias 21%, superficiales
23%, escamas nucleadas 24% y escamas anucleadas 29%.
35
30
% de células
25
20
15
10
5
0
B
I
S
NA
EN
EA
NB
Figura 4. Hallazgos de citología vaginal en el día -7 del tratamiento con MAP y
eCG en ovejas de pelo. B = basales, I = intermedias, S = superficiales, EN =
escamas nucleadas y EA = escamas anucleadas. NA = niveles altos de P 4 y NB =
niveles bajos de P4.
19
En los animales con NA de P4, el grupo celular que predominó fue de células
superficiales, con 33% y el grupo con menor presencia, fue de células basales con
un 3%; mientras que para los animales con NB de , P4 el grupo de células que
predominó fue el de escamas anucleadas con un 29%.
7.3 DÍA 0 DEL TRATAMIENTO
Para el día 0, momento en que se aplicó el dispositivo intravaginal, 23/30 (76.6%)
ovejas del grupo a tratar (n=30) se encontraban con NA de P4 y siete (23%) con
NB de P4. El rango para los subgrupos de animales con NA y NB de P4 fue de 1.4
ng/mL a 10.3 ng/mL y 0.2 ng/mL a 0.7 ng/mL respectivamente. El porcentaje
promedio de los grupos celulares en el día 0, para el subgrupo con NA de P4 fue
de: células basales
1%, células intermedias 11%, células superficiales
22%,
escamas nucleadas 29% y escamas anucleadas 37%, y para el subgrupo con NB
de P4 fue de: basales 1%, intermedia 15%, superficiales 32%, escamas nucleadas
26% y escamas anucleadas 26%.
20
40
35
% de células
30
25
20
15
10
5
0
B
I
S
NA
EN
EA
NB
Figura 5. Hallazgos de citología vaginal en el día 0 del tratamiento con MAP y eCG
en ovejas de pelo. B = basales, I = intermedias, S = superficiales, EN = escamas
nucleadas y EA = escamas anucleadas. NA = niveles altos de P 4 y NB = niveles
bajos de P4.
7.4 DÍAS PREVIOS AGRUPADOS
Se agruparon los datos de los animales con valores séricos con NA y NB de P4
para los días -14, -7 y 0 con el fin de comparar las poblaciones celulares del
epitelio vaginal entre los subgrupos así creados.
De acuerdo a las tres lecturas de P4 realizadas de manera seriada cada siete
días, los datos indican que de las 30 ovejas muestreadas, 22 presentaron valores
de P4 menor a 1 ng/mL en uno de los tres muestreos realizados a cada una, lo que
indica que los animales están ciclando, de acuerdo a lo encontrado por Delpino y
González-Stagnaro (1993) quienes establecen que si uno o dos valores de P 4 son
bajos en tres muestreos seriados en intervalos de 7 días, el animal se considera
21
ciclando. Sin embargo, ocho ovejas del grupo tratado fueron registradas con
valores altos de P4 para los tres muestreos, previos a la aplicación del dispositivo
intravaginal, lo que teóricamente indica una gestación o cuerpos luteos de fase
luteal o persistentes, sin embargo, hubo respuesta al tratamiento para la
manifestación del estro y aceptación del servicio por el carnero. Las
concentraciones con NA de P4 de estas ovejas, sugieren que dentro de un
muestreo seriado semanal, pueden empalmarse dos fases luteales, de ciclos
estrales adyacentes o que, la fase folicular tiene una duración menor a los cinco
días para el caso de las ovejas tratadas.
Cuadro 1. Porcentajes de células del epitelio vaginal en los días -14, -7 y 0 para
ovejas de pelo previos al tratamiento de un progestágeno intravaginal. B= basal, I
= intermedias, S = superficiales, EN = escamas nucleadas y EA = escamas
anucleadas. NA = niveles altos de P4 y NB = niveles bajos de P4.
SUBGRUPO
B
I
S
EN
EA
NA
2 Aa
16 A b
27 A bc
25 A bc
30 A c
NB
2 Aa
17 A b
26 A b
26 A b
29 A b
a,b, c
Letras minúsculas diferentes en la misma fila, indican diferencia
estadística significativa (P > 0.05).
A,B
Letras mayúsculas diferentes en la misma columna, indican diferencia
estadística significativa (P > 0.05).
22
De acuerdo a lo observado en el cuadro 1, en el subgrupo de NA las células
que predominaron fueron las escamas anucleadas con 30%, sin embargo,
estadísticamente no fueron diferentes a las células superficiales y escamas
nucleadas (P> 0.05). En menor cantidad se presentaron las células basales con
2%, las que resultaron estadísticamente diferentes (P< 0.05) al resto de las
poblaciones del mismo subgrupo de NB, lo que difiere con lo encontrado por
Toniollo et al. (2005) quienes al estudiar cabras alpinas no encontraron células
basales en ninguna etapa del ciclo estral. En el subgrupo de NB las células que
predominaron fueron también las escamas anucleadas lo que coincide con lo
encontrado por Raposo et al. (2000) en Brasil, quienes realizaron comparaciones
de citología vaginal entre cabras cíclicas y gestantes, y encontraron que durante el
estro las células que predominan son las escamas anucleadas; sin embargo, no
presentaron diferencia significativa respecto a las intermedias, superficiales y
escamas nucleadas; y de la misma manera las células con menor presencia
fueron las basales con un 2%, siendo diferentes estadísticamente al resto de las
poblaciones del mismo subgrupo. Al hacer la comparación entre las poblaciones
celulares del subgrupo de NA y NB de P4, se determinó que no existe diferencia
estadística entre las poblaciones celulares (P > 0.05).
A cuatro de las treinta ovejas se les cayó el dispositivo en el día uno de
aplicación, motivo por el cual quedaron fuera para los siguientes muestreos
23
35
30
% de células
25
20
15
10
5
0
B
I
S
NA
EN
EA
NB
Figura 6. Hallazgos de citología vaginal en los días previos (-14, -7 y 0) al
tratamiento con MAP y eCG en ovejas de pelo. B = basales, I = intermedias, S =
superficiales, EN = escamas nucleadas y EA = escamas anucleadas. NA = niveles
altos de P4 y NB = niveles bajos de P4.
Figura 7. Células encontradas en la citología vaginal exfoliativa de ovejas de pelo.
24
7.5 DÍA DE RETIRO DEL DISPOSITIVO (14)
Habiendo permanecido las ovejas (Tr) por 14 días con el dispositivo, éste les fue
retirado a 26 de ellas. Los porcentajes de las poblaciones celulares obtenidos para
este momento fueron: basales 4%, intermedias 21%, superficiales 30%, escamas
nucleadas 24% y escamas anucleadas 21%. Para el grupo testigo (To) los
porcentajes de células obtenidos fueron: basales 2%, intermedias 21%,
superficiales 28%, escamas nucleadas 23% y escamas anucleadas 26%.
35
30
% de células
25
20
15
10
5
0
B
I
% CVE de Tr
S
EN
EA
% CVE de TO
Figura 8. Hallazgos de citología vaginal al momento de retiro de la esponja
intravaginal (día 14) en ovejas de pelo. B = basales, I = intermedias, S =
superficiales, EN = escamas nucleadas y EA = escamas anucleadas. Tr = grupo
tratado y To = grupo control.
25
Cuadro 2. Porcentajes de células del epitelio vaginal al momento del retiro de la
esponja intravaginal (día 14) en ovejas de pelo. B= basal, I = intermedias, S =
superficiales, EN = escamas nucleadas y EA = escamas anucleadas. Tr = grupo
tratado, To = grupo control.
GRUPO
Tr
To
B
Aa
I
21 A b
S
30 A c
EN
24 A bc
EA
21 A bc
2 Aa
21 A b
28 A b
23 A b
26 A b
4
a, b, c
Letras minúsculas diferentes en la misma fila, indican diferencia
estadística significativa (P > 0.05).
A, B
Letras diferentes en la misma columna, indican diferencia estadística
significativa (P > 0.05).
El cuadro 2 ilustra, que en el grupo Tr las células que predominaron fueron las
superficiales con 30% y también presentaron diferencia significativa (P < 0.05) con
las células basales e intermedias, pero no así, con las escamas nucleadas y
anucleadas, con las cuales no presentaron diferencia estadística (P > 0.05), estos
resultados difieren a lo encontrado por Ferrando et al. (1987) en Chile, quienes al
realizar la caracterización vaginal en cabras criollas encontraron que en el diestro
las células que predominan son las intermedias y basales. Las células con menor
presencia fueron las basales con 4%, presentando diferencia significativa (P<
0.05) respecto al resto de las poblaciones del mismo grupo, lo que difiere con lo
encontrado por Pérez-Martínez et al. (1999), quienes al realizar estudios en cabras
criollas adultas después de haber administrado un tratamiento con acetato de
melengestrol (MGA) encontraron que las células que predominaron fueron las
basales. Para el grupo To las células que predominaron fueron las superficiales,
26
aunque estadísticamente fueron iguales (P > 0.05) con respecto a las demás
poblaciones, excepto con las células basales (P < 0.05).
Al hacer la comparación entre las poblaciones del grupo Tr y To, no se
encontró diferencia significativa entre una y otra población en ambos grupos (P>
0.05).
7.6 DÍA DE ESTRO (16)
Después de retirar el dispositivo (día 14), se esperó la manifestación de estro por
parte de las ovejas en tratamiento (día 16), los porcentajes de los grupos celulares
obtenidos para los 26 animales de tratamiento que presentaron estro fueron:
basales 3%, intermedias 12%, superficiales 34%, escamas nucleadas 31% y
escamas anucleadas 20%; mientras que para el grupo testigo los porcentajes
obtenidos fueron: basales 2%, intermedias 24%, superficiales 19%, escamas
nucleadas 20% y escamas anucleadas 35%.
27
40
35
% de células
30
25
20
15
10
5
0
B
I
S
Tr
EN
EA
To
Figura 9. Hallazgos de citología vaginal al momento del estro en ovejas de pelo. B
= basales, I = intermedias, S = superficiales, EN = escamas nucleadas y EA =
escamas anucleadas. Tr = grupo tratado y To = grupo control.
Cuadro 3. Porcentajes de células del epitelio vaginal al momento del estro (día 16)
en ovejas de pelo. B = basal, I = intermedias, S = superficiales. Tr = grupo tratado
y To = grupo control
GRUPO
B
I
S
EN
EA
Tr
3 Aa
12 A b
34 A c
31 A c
20 A b
To
2 Aa
24 B bc
19 B b
20 A b
35 B c
a,b, c
Letras minúsculas diferentes en la misma fila, indican diferencia estadística
significativa (P < 0.05).
A,B
Letras diferentes en la misma columna, indican diferencia estadística
significativa (P < 0.05).
28
Al momento del estro, en el grupo Tr las células que predominaron fueron las
superficiales, siendo diferentes a las células basales e intermedias (P < 0.05), pero
no presentaron diferencia significativa con las escamas nucleadas y escamas
anucleadas (P> 0.05); estos datos difieren de lo encontrado por Raposo et al.
(1999) quienes al realizar el perfil citológico en cabras de la raza Saanen
encontraron que las células intermedias predominaron durante todas las fases del
ciclo estral.
De acuerdo a lo presentado en el cuadro 3 se observa que para los animales
del grupo Tr, las células con porcentaje mas alto fueron las superficiales con 34%,
estadísticamente fueron diferentes (P < 0.05) al resto de las poblaciones celulares,
excepto a las escamas nucleadas con las cuales no presentó diferencia
significativa (P > 0.05), estos resultados difieren con lo encontrado por Porto et al.
(2007) quienes al realizar el perfil citológico en ovejas de la raza Santa Inés
encontraron que durante el estro predominaron las escamas anucleadas, siendo
estadísticamente diferentes al resto de las poblaciones celulares (P< 0.05). A
diferencia de estos datos, en el grupo To, la población celular que predominó fue
de escamas anucleadas con un 35 % siendo éste estadísticamente diferente al
resto de las poblaciones celulares (P < 0.05), sin embargo con respecto a las
células intermedias no fueron diferentes (P> 0.05), en este mismo grupo la
población de células intermedias, superficiales y escamas anucleadas fueron
iguales (P> 0.05), lo que concuerda con lo encontrado por el mismo Porto et al.
(2007), quienes no encontraron diferencia estadística entre estas mismas células
durante el estro en ovejas que presentaron celo de manera natural.
29
En cuanto a la diferencia entre las mismas poblaciones celulares del grupo Tr
y To, la población de células intermedias y superficiales del grupo Tr presentaron
diferencia significativa con las del grupo To (P< 0.05); y la población de escamas
anucleadas fue mayor en el grupo To (P < 0.05) lo cual coincide con los resultados
de Toniollo et al. (2005) que al realizar estudios en cabras sincronizadas con
progesterona natural (CIDR) encontraron que durante el estro había diferencia
estadística (P< 0.05) en las escamas anucleadas entre las tratados y las que
presentaron estro natural, presentándose con mayor frecuencia en este último.
30
8. CONCLUSIONES
Se concluye que no hay diferencia entre las poblaciones celular del epitelio vaginal
de ovejas con concentraciones altas y animales con concentraciones bajas de
progesterona. Las células basales siempre se presentan en menor cantidad no
importando la concentración de progesterona. La población celular del epitelio
vaginal de las ovejas que presentaron estro sincronizado fue diferente a la de las
ovejas que presentaron estro natural.
31
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