memoria kathleen holzer - Tesis

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA
CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS EN PROCESOS DE
BIOLIXIVIACIÓN MEDIANTE NMP-PCR
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN
BIOTECNOLOGÍA
KATHLEEN INGRID HOLZER SCHAA
PROFESOR GUÍA:
Sra. BLANCA ESCOBAR MIGUEL
MIEMBROS DE LA COMISIÓN:
Sra. ORIANA SALAZAR AGUIRRE
Sr. TOMÁS VARGAS VALERO
Santiago de Chile
Abril, 2007
RESUMEN DE LA MEMORIA
PARA OPTAR AL TÍTULO DE
INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA
POR: KATHLEEN HOLZER SCHAA
FECHA: MARZO 2006
PROF.GUÍA: SRA. BLANCA ESCOBAR
“CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS EN PROCESOS DE BIOLIXIVIACIÓN
MEDIANTE NMP-PCR”
El siguiente trabajo de memoria tiene como objetivo cuantificar mediante la técnica de
NMP-PCR (Número más probable y PCR), poblaciones de las bacterias más importantes en
procesos de biolixiviación de minerales sulfurados de Cobre: Acidithiobacillus ferrooxidans,
Leptospirillum ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans.
La metodología empleada comprendió dos etapas: una de diseño computacional de
partidores específicos para el reconocimiento de la región 16S rDNA de las especies
Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans y una etapa de trabajo
experimental. Esta se dividió en calibración de la técnica de NMP-PCR, extracción de DNA
genómico de especies provenientes de soluciones de refino e identificación y cuantificación de
las especies de interés mediante la técnica de NMP-PCR. Además, se registró la composición
química de cada muestra de solución de refino: pH, Eh y concentración de Fiero total, Fe+3, Fe+2,
sulfato y Cu.
Se logró implementar cada una de las etapas antes mencionadas. Se determinaron los
partidores específicos. Con esto, se logró identificar y cuantificar Acidithiobacillus ferrooxidans
en el 100% las muestras; y Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans
sólo en el 70%; en tanto que Leptospirillum ferrooxidans no fue detectado en las muestras
analizadas. La etapa de calibración de la técnica mostró una diferencia de 6 órdenes de magnitud
entre las técnicas de recuento directo y de NMP-PCR, lo que puede atribuirse a la pérdida celular
en las etapas previas a la cuantificación. Por último, no fue posible establecer una relación entre
la concentración bacteriana y la composición de las soluciones, debido principalmente a la falta
de estudios de población microbiana de procesos reales de biolixiviación.
En resumen, se trata de una técnica cuya implementación aún se está trabajando, cuya
mayor importancia es permitir identificar y cuantificar especies directamente desde muestras de
soluciones de refino de procesos industriales, sin previo enriquecimiento. Sin embargo, debe ser
validada mediante el uso de otras técnicas de cuantificación sobre muestras del mismo origen.
A mi familia,
juntos vamos a hacer cosas grandes,
son únicos, los quiero.
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a cada uno de los que me apoyaron, acompañaron, escucharon,
soportaron y entendieron en todos estos años de estudio.
Los más importantes, mi familia. Mis papás, por aguantarse todas mis crisis, mis dudas y
mis cambios de humor (especialmente cuando tenía una prueba para la cual estudiar o un trabajo
que entregar), gracias por su paciencia y amor. Mis hermanos, Heilkki (mi “mellizo”) y Karen
(mi “hermanita chica”) nuestras peleas no tienen comparación, sin ellas no seríamos los mismos,
gracias por hacerme reír. Y mi “cuarta hermana” Angélica, te quiero mucho. Ustedes son lo más
importante para mí.
A mi profesora guía, Blanquita, gracias por todo el tiempo, por ser tan preocupada de mi
trabajo, por sus consejos y nuestras conversaciones. Aprendí mucho con usted.
A mis amigos y compañeros. Los más antiguos, los que entraron a la Escuela conmigo,
gracias por todo Ha Nui y Magaly, ustedes sí que me entienden. Mis compañeros BT, gracias por
hacer de las clases un momento agradable, me reí mucho con ustedes, hicieron que fuera más
fácil y más entretenido terminar la carrera. Y mis amigas químicas, Gabriela, Carmina y Perla, lo
hemos pasado bien, no? Sobre todo en nuestros paseos en Buin.
Gracias a todos.
1
ÍNDICE
1
CAPÍTULO I: Introducción ..............................................................4
1.1
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................4
1.2
ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ......................................................................7
1.2.1
Proceso de biolixiviación......................................................................................7
1.2.2
Microorganismos presentes en procesos de biolixiviación...................................10
1.2.3
Técnicas de detección y cuantificación de microorganismos ...............................12
1.2.4
Amplificación y cuantificación del gen 16s rDNA mediante PCR-NMP .............17
1.3
DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO............................................................................21
1.3.1
Presentación y justificación del proyecto ............................................................21
1.3.2
Objetivos ............................................................................................................22
1.3.3
Alcances .............................................................................................................23
2
CAPÍTULO II: Materiales y Métodos ............................................24
2.1
ESTRATEGIA DE TRABAJO...................................................................................24
2.2
MATERIALES ..........................................................................................................24
2.2.1
Muestras.............................................................................................................24
2.2.2
Reactivos............................................................................................................25
2.2.3
Microorganismos................................................................................................25
2.2.4
Equipamiento .....................................................................................................25
2.3
MÉTODOS ................................................................................................................26
2.3.1
Diseño de partidores específicos .........................................................................26
2.3.2
Extracción de DNA ............................................................................................28
2.3.3
Amplificación del 16s rDNA mediante PCR .......................................................32
2.3.4
Técnica de determinación del número más probable NMP. .................................34
3
3.1
CAPÍTULO III: Resultados y Discusión.........................................35
PARTE COMPUTACIONAL ....................................................................................35
3.1.1
3.2
Diseño de partidores ...........................................................................................35
PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................................39
2
3.2.1
Extracción de DNA ............................................................................................39
3.2.2
Extracción de DNA desde cultivos puros ............................................................39
3.2.3
Extracción de DNA desde soluciones de refino...................................................42
3.2.4
Extracción de DNA desde muestras de mineral...................................................43
3.2.5
Determinación de temperatura de alineamiento de partidores específicos para
Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans ...................................44
3.2.6
Temperatura de alineamiento de partidores específicos para Acidithiobacillus
thiooxidans ........................................................................................................................46
3.2.7
Temperatura de alineamiento de Sulfobacillus thermosulfidooxidans ..................49
3.2.8
Detección y cuantificación de DNA....................................................................51
4
CAPÍTULO IV: Conclusiones .........................................................63
5
ANEXOS...........................................................................................65
5.1
ANEXO I. COMPOSICIÓN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO...............65
5.2
ANEXO II. MÉTODOS .............................................................................................68
5.2.1
Electroforesis en gel de agarosa ..........................................................................68
5.2.2
Protocolo determinación de fierro .......................................................................68
5.3
ANEXO IV. CEPAS UTILIZADAS EN EL DISEÑO DE PRIMERS ........................69
5.3.1
Acidithiobacillus thiooxidans..............................................................................69
5.3.2
Sulfobacillus thermosulfidooxidans.....................................................................71
5.4
ANEXO V. TABLA DE NMP ...................................................................................72
5.5
ANEXO VI. FECHA DE RECEPCIÓN DE MUESTRAS..........................................73
6
BIBLIOGRAFÍA..............................................................................74
3
1
1.1
CAPÍTULO I: Introducción
INTRODUCCIÓN
Durante los últimos 50 años la vida útil de las reservas mundiales conocidas de cobre se
han mantenido constantes. La discusión planteada hoy en día no es el agotamiento de las
reservas, si no la capacidad de innovación en tecnologías que permitan satisfacer la demanda del
mineral. La demanda de cobre total para el siglo XXI se estima en 5 mil millones de toneladas,
unas 10 veces la producción del siglo XX. En este escenario Chile juega un rol fundamental con
un 35% de la producción mundial. Preservar el liderazgo obtenido dentro de la producción
minera significaría aumentar la producción a 11.5 millones de toneladas para el año 2050, lo que
pasaría por incentivar la creación de nuevas tecnologías de producción competitivas,
involucrando a toda la producción privada. Una de estas tecnologías es el proceso de
Biolixiviación, la cual tiene un rol cada vez más importante dentro de la industria minera.
Las reservas minerales disminuyen en ley y contenido de óxidos a través del tiempo,
aumentando la cantidad de sulfuros, lo que hace más difícil la extracción con tecnologías
convencionales. Todo este material sulfurado cuyo contenido de cobre no es posible recuperar,
ha sido considerado de descarte por décadas. La biolixiviación, practicada industrialmente desde
1960 para el tratamiento de minerales de baja ley en botaderos (dump leaching), permite el
tratamiento de este material y ha permitido incorporar como reservas los millones de toneladas de
minerales de descarte acumulados en diversas minas de cobre del mundo [1]. La contribución de
la biolixiviación es estimada en un 15% a la producción mundial total de cobre [2].
La lixiviación es definida como un proceso hidrometalúrgico de disolución para la
recuperación de metales desde minerales. En particular un mineral sulfurado es solubilizado (o
lixiviado) en ambiente ácido y en presencia de un agente oxidante, el cual al reducirse capta
electrones desde el sulfuro y posibilita así el rompimiento de su estructura. La disolución de
sulfuros en condiciones ambientales es termodinámicamente posible en presencia de oxígeno,
4
pero muy lenta. Sin embargo el proceso es fuertemente catalizado ante la presencia de ciertos
microorganismos que están presentes en la microflora natural del mineral, esto es lo que se
denomina biolixiviación [1].
La Biolixiviación se ha transformado en una alternativa atractiva debido a una serie de
ventajas respecto de los procesos convencionales para la recuperación de minerales. Entre ellas se
puede nombrar la baja necesidad energética, reduciéndose las temperaturas de operación desde
los 1500ºC hasta menos de 100ºC. No produce emisiones de gases sulfurados y se reduce el
consumo de ácido gracias a la capacidad de las bacterias de producirlo. Permite el tratamiento de
minerales y productos residuales pobres, los que son imposibles de tratar con los procesos hidro y
pirometalúrgicos convencionales. Todo esto junto con reducidos costos de operación lo hacen un
proceso económico y ambientalmente más seguro.
El cobre constituye el principal recurso minero de Chile y el producto más importante de
exportación. Representa, en promedio, la tercera parte de los ingresos de exportaciones del país y
durante el 2005 alcanzó a un 42%. Chile tiene las mayores reservas explotables de cobre del
mundo, las que alcanzan a más de 250 millones de toneladas de cobre fino, lo que representa un
35% del total de cobre explotable a nivel mundial [3].
Evidentemente la minería representa una actividad de gran importancia para el
crecimiento económico del país, y en particular la extracción de cobre. Esto junto con el
escenario de la actividad para el siglo XXI hace necesario sustentarla mediante la utilización de
nuevas tecnologías de producción como la Biolixiviación. Para hacer de ésta una tecnología más
eficiente es necesaria una mayor comprensión y caracterización de los procesos y
microorganismos involucrados, y de este modo aprovechar al máximo sus capacidades.
La microflora natural del mineral es variada, desde bacterias mesófilas y termófilas que
oxidan hierro y azufre, sólo hierro o sólo azufre, hasta arqueas. Las bacterias involucradas son
microorganismos acidófilos, autótrofos y quimiolitrótofos, es decir viven a pH bajo, ocupan
5
como fuente de carbono CO2 y obtienen su energía de la oxidación de compuestos inorgánicos
(como el Fe y el S). El más común (encontrado en mayor cantidad, el más estudiado y utilizado)
en procesos industriales de biolixiviación es la especie Acidithiobacillus ferrooxidans. Sin
embargo existen muchas otras que de acuerdo a las condiciones del medio del proceso
predominarán sobre la anterior [4].
Para detectar y cuantificar bacterias es de suma utilidad el uso de técnicas moleculares,
dada la dificultad que presenta el cultivarlas. Por otro lado las técnicas de cultivo impiden
determinar o detectar la población bacteriana real de un proceso de Biolixiviación, discriminando
sólo entre hierrooxidantes y azufreoxidantes, o privilegiando el crecimiento de una especie por
sobre otra. Pero además, se hace necesario el poder cuantificar las bacterias de una manera
rápida, con el fin de poder determinar bajo ciertas condiciones cuál población de bacteria es la
que mejor se desarrolla, haciendo más eficiente el proceso.
Esto último es lo que se pretende abordar en el siguiente trabajo, estudiando la microflora
natural de una solución de proceso de Biolixiviación mediante técnicas de biología molecular de
análisis de DNA. Y de este modo, cuantificar cada una de las especies en estudio,
Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans
y
Sulfobacillus thermosulfidooxidans, y relacionar su abundancia con los parámetros de la solución
de proceso.
6
1.2
ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
1.2.1 Proceso de biolixiviación
La Biolixiviación se ubica dentro de la clasificación de proceso comercial de Biominería,
que es el término usado para describir el uso de microorganismos en la extracción de metales
desde minerales o concentrados sulfurados y/o con contenido de hierro. Cuando el metal es
extraído desde soluciones, el proceso recibe el nombre de biooxidación o biolixiviación.
El verdadero papel que desempeñan los microorganismos en la biooxidación de minerales
es un debate de largo tiempo, en cuanto a si el mecanismo usado por los mismos sería directo o
indirecto. El ataque directo es visto como un proceso en el cual componentes presentes en la
membrana bacteriana interactúan directamente con el metal y sus compuestos sulfurados usando
un tipo de mecanismo enzimático. Por otro lado, el mecanismo indirecto tiene que ver con al
ataque químico del ión férrico o del ácido sobre el mineral sulfurado, lo que resulta en la
disolución del mineral y la formación de ión ferroso y varias formas de sulfuro [5].
A pesar de una serie de mecanismos nuevos que se han propuesto, aún continua
estudiándose ambos mecanismos para una mejor comprensión del proceso. A continuación se
describe cada uno de los mecanismos.
1.2.1.1 Mecanismos directo
En este caso, la bacteria ataca al sulfuro metálico de forma directa, adhiriéndose a la
superficie del mineral y posteriormente lo oxida enzimáticamente por transporte de electrones
desde la parte reducida del mineral al oxígeno. La reacción general es:
MS + 2O2 bacterias

→ MSO4
7
La adherencia de las bacterias al mineral es una condición necesaria para la lixiviación.
Sin embargo, no es una condición suficiente en sí misma debido a la existencia de un mecanismo
alternativo: el indirecto. Las bacterias libres en solución pueden secretar un oxidante al medio
que lixivia al mineral en forma alternativa al propio mecanismo directo.
1.2.1.2 Mecanismo indirecto
A diferencia del mecanismo directo, el indirecto considera principalmente la acción de
iones férricos sobre el mineral sulfurado, disolviéndolo. A partir de esta reacción química se
producen ión ferroso y azufre elemental, los que posteriormente son oxidados biológicamente a
ión férrico y ión sulfato, respectivamente. Este mecanismo no necesita la adherencia de las
células al mineral. Las ecuaciones de este mecanismo son las siguientes:
MS + 2 Fe 3+ → M 2 + + S + 2 Fe 2 +
En el caso de la pirita, la reacción es:
FeS 2 + 14 Fe 3+ + 8H 2 O → 15Fe 2+ + 16 H + + 2SO42−
Por otro lado, la oxidación del ión ferroso y del azufre elemental catalizada por la acción de
bacterias se lleva a cabo según las siguientes reacciones:
1
2 Fe 2+ + O2 + 2 H + bacterias

→ 2 Fe 3+ + H 2 O
2
3
S + O2 + H 2 O bacterias

→ 2 H 2 SO4
2
Para la explicación de este mecanismo, en los últimos años distintos investigadores han
tratado de proponer modelos que aclaren su funcionamiento. Así los trabajos del grupo de W.
Sand en la Universidad de Hamburg [6] son muy interesantes. Según este modelo los iones
8
férricos y/o los protones son los únicos agentes que disuelven el sulfuro, por lo tanto, el
mecanismo es estrictamente indirecto. Por otro lado, el modelo afirma que las funciones de las
bacterias son: regenerar los iones férrico y/o los protones; y concentrar estos iones en la interfase
mineral/agua o mineral/célula bacteriana para favorecer la degradación del mineral. También
proponen la formación de una capa fina de exopolímeros (EPS) que rodea las células, en la cual
se llevan a cabo los procesos químicos que producen la degradación del sulfuro (Figura 1).
Basándose en los compuestos intermediarios, diferencian dos tipos de mecanismo indirecto: vía
tiosulfato y vía polisulfuro.
Figura 1. Diagrama esquemático de las reacciones involucradas en el proceso de lixiviación a través de la superficie
que rodea al mineral, llamada exopolisacárido (EPS).
Mecanismo del tiosulfato
Aquí la solubilización del metal se produce gracias al ataque del ión férrico sobre el
mineral sulfurado, donde el tiosulfato es el principal compuesto intermedio y el sulfato el
principal producto final. La reacción sobre calcopirita procede de la siguiente manera:
9
Mecanismo del polisulfuro
En este caso la solubilización del metal sulfurado es una combinación del ataque de
protones y del ión férrico, donde el azufre elemental es el principal compuesto intermedio. Este
azufre elemental es relativamente estable, pero puede ser oxidado a sulfato por la acción de
microorganismos azufre-oxidantes. Así la reacción procede de la siguiente manera:
Esto explica por qué algunas bacterias como Acidithiobacillus thiooxidans son capaces de
oxidar sólo algunos minerales sulfurados. Por otro lado, el ión ferroso producido durante el
proceso puede ser reoxidado por la acción de microorganismos hierro-oxidantes a ión férrico.
Por lo tanto, la acción de los microorganismos es la de proveer ácido sulfúrico para el
ataque proteónico y mantener el hierro en su estado oxidado.
1.2.2 Microorganismos presentes en procesos de biolixiviación
Los microorganismos que participan en procesos de lixiviación de minerales se
caracterizan por su capacidad de desarrollarse en ambientes extremos. Los ambientes acuosos
asociados a los vertidos de las minas se caracterizan por su bajo pH, altas concentraciones de
metales pesados y en algunos casos por elevadas temperaturas. A pesar de estas condiciones,
existen estos microorganismos, que además son capaces de desarrollarse y reproducirse. En estos
ambientes los microorganismos utilizan como fuente primaria de energía las especies reducidas
del azufre y ciertos metales en disolución [7].
10
Una gran variedad de microorganismos participan en la oxidación de minerales
sulfurados, los que constituyen la microflora natural de estos minerales. Es decir, coexisten
distintos microorganismos cuyo metabolismo aporta los elementos necesarios para el desarrollo
de cada uno de ellos. Estos tienen varias características en común: son quimiolitótrofos (ocupan
compuestos inorgánicos como fuente de energía (azufre reducido o Fe+2), son autótrofos (CO2
como fuente de carbono), son acidófilos (pH óptimo está en un rango de 1.6 a 2) y de acuerdo a
la temperatura a la que pueden desarrollarse se dividen en mesófilos, termófilos moderados y
termófilos [4, 7].
Dentro de los microorganismos que coexisten en los minerales de lixiviación se
encuentran arqueas y bacterias, aunque se han encontrado algunos hongos y levaduras también.
Aunque está claro que existe una gran variedad de microorganismos involucrados, los más
importantes en el proceso de biolixiviación, y de los que se tiene mayor conocimiento son
principalmente bacterias, entre ellas: Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans,
Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus termosulfidooxidans. Y también algunas arqueas:
Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus metallicus, etc. [4]. Se describen a continuación las
principales características de las especies lixiviantes que involucra este estudio:
Acidithiobacillus ferrooxidans: durante años se pensó que era el único organismo
importante en biolixiviación, y hoy en día es considerado como uno de los más importantes. Es
una bacteria Gram-negativa, acidófila, autótrofa y mesófila, cuya temperatura óptima de
crecimiento es entre 30 y 35ºC. Obtiene su energía de la oxidación de ion ferroso y especies
reducidas de azufre y su pH óptimo de crecimiento está entre 1.8 y 2.5 [4, 7]
Leptospirillum ferrooxidans: microorganismo aislado por primera vez en 1972, es una
bacteria Gram-negativa, acidófila, mesófila, aytótrofa y quimiolitótrofa [10]. A diferencia de A.
ferooxidans es capaz de oxidar sólo hierro ferroso, es más resistente al ácido (crece a pH 1.2),
más tolerante a temperaturas más elevadas y menos sensible a la inhibición por Fe+3 [4, 8].
11
Acidithiobacillus thiooxidans: en procesos de biolixiviación aparece siempre junto con A.
ferooxidans y son indistinguibles morfológicamente. Es una bacteria Gram-negativa, acidófila,
autótrofa y mesófila, cuya temperatura óptima de crecimiento es entre 30 y 35ºC. Obtiene su
energía de la oxidación de especies reducidas de azufre y tolera mayores concentraciones de
ácido que A. ferooxidans.
Sulfobacillus termosulfidooxidans: se trata de una bacteria termófila moderada
soportando temperaturas de hasta 50ºC. Es un microorganismo mixotrófico, pudiendo asimilar
carbono tanto desde CO2 (autótrofo) como de azúcares (heterótrofo). Es una bacteria Grampositiva, capaz de oxidar hierro ferroso y azufre
1.2.3 Técnicas de detección y cuantificación de microorganismos
El conocimiento de la microbiología de un proceso de biolixiviación es clave en el
avance comercial de la operación de este proceso. Hasta hoy la ecología microbiana de los
procesos a gran escala de biolixiviación de minerales de cobre secundarios, columnas y pilas, han
sido escasamente estudiados y no se han hecho grandes esfuerzos para conocer, entender y
manejar los componentes microbiológicos del proceso. Es fundamental contar con técnicas de
identificación y cuantificación que permitan obtener información real de la dinámica poblacional
de la solución de proceso.
Durante años se ha utilizado como único método de detección la técnica de cultivo, el que
es eficiente en detectar el microorganismo más estudiado en procesos de biolixiviación:
Acidithiobacillus ferrooxidans. Sin embargo, hay estudios que sugieren que existen otras especies
que jugarían un papel importante en el proceso como Leptospirillum ferrooxidans y Sulfobacillus
thermosulfidooxidans, especies que requieren mucho tiempo para crecer en medio sólido o que
son incapaces de formar colonias [9]. Por otro lado, la dificultad de aislar las cepas desde un
conjunto de microorganismos con requerimientos metabólicos semejantes, hace que los métodos
tradicionales sean insuficientes en describir la población microbiana de un sistema complejo. Las
12
técnicas moleculares e inmunológicas han sido desarrolladas para poder detectar y cuantificar
grupos filogenéticos específicos de microorganismos, lo que es importante para entender la
dinámica poblacional del sistema.
En la actualidad las técnicas utilizadas en el estudio de la diversidad microbiana de
procesos de biolixiviación, para la detección y cuantificación de las especies se dividen en:
técnicas convencionales de cultivo, técnicas inmunológicas y técnicas moleculares basadas en el
DNA.
Métodos convencionales
Corresponden a las técnicas de cultivo convencional y no convencional,
análisis
microscópico y Número Más Probable (NMP). Para llegar a la detección y posterior
cuantificación de los microorganismos es necesario primero aislarlos del medio y luego
cultivarlos para obtener una concentración suficiente que permita estudiarlos. Las técnicas de
cultivo utilizadas y descritas se pueden dividir de acuerdo al medio de cultivo utilizado: agarosa,
sílica gel o filtros de membrana [10]. En la literatura se han reportado otras metodologías de
cultivo no convencional para el crecimiento de especies autótrofas acidófilas, las cuales son
sensibles a la presencia de orgánicos derivados principalmente de la hidrólisis del medio de
cultivo sólido (agarosa, agar, etc.). Estas técnicas impiden la inhibición del crecimiento por esta
materia orgánica proveniente de la hidrólisis de la agarosa. Una de ellas es la técnica de placa de
doble capa.
Para la cuantificación es comúnmente utilizado el recuento directo al microscopio directo,
y la metodología NMP. Esta última consiste en el cultivo de bacterias en medio líquido
específico, el que posteriormente es analizado para determinar la presencia de los
microorganismos deseados y su cuantificación mediante la tabla de NMP.
13
Estas técnicas presentan una serie de desventajas y dificultades, que acarrean
principalmente mayores tiempos de trabajo. En primer lugar, las técnicas de cultivo requieren
largos tiempos de espera y monitoreo de las muestras, además de la dificultad de cultivar
microorganismos que no crecen en medio sólido [8]. En segundo lugar, el cultivo de
microorganismos no permite la identificación de una especie filogenética específica, si no que
aisla microorganismos de acuerdo a sus necesidades nutricionales: hierrooxidantes o
azufreooxidantes. Por último, esta técnica no entrega una visión acabada de la población nativa
de la solución de proceso al utilizar medios con composición diferente a la de origen. Esto
privilegia el crecimiento de un microorganismo por sobre otro o simplemente algunas especies no
son capaces de crecer. Todas estas dificultades son obstáculos para la posterior cuantificación,
siendo la etapa de cultivo la etapa previa necesaria.
Métodos inmunológicos
En el intento por detectar e identificar variedades de bacterias acidofílicas, se han
desarrollado técnicas inmunológicas de identificación y cuantificación basadas en el uso de
anticuerpos marcados fluorescentemente. Estos métodos son de alta sensibilidad e incluso pueden
identificar serotipos específicos. En la literatura se ha encontrado el uso de estas técnicas para la
detección
de
Acidithiobacillus
ferrooxidans,
Leptospirillum
ferrooxidans,
Sulfolobus
acidocaldarius y Acidithiobacillus caldus [11, 12, 13]. Sin embargo, estos métodos sólo permiten
detectar células en suspensión y son ineficientes en el caso de células adheridas. Así se ha
desarrollado la técnica de enzyme-linked immunofiltration assay (ELIFA) [13], una técnica
derivada del método ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) que permite la detección de
bacterias adheridas al mineral.
Sin embargo presentan una serie de desventajas como son el alto costo asociado y los
múltiples serotipos que existen por especies, de los cuales hay una gran cantidad para los que no
existen anticuerpos asociados.
14
Métodos moleculares basados en el DNA.
Los métodos moleculares de identificación de microorganismos se basan en el estudio de
las moléculas de DNA y RNA, los que en su mayoría, a excepción de los métodos de hibridación
(DNA-RNA, DNA-DNA, RNA-RNA), están basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR). La PCR permite obtener un elevado número de copias del fragmento a amplificar a partir
de una pequeña concentración de DNA, prescindiendo del cultivo de los microorganismos. Con
ella es posible el análisis de ciertas regiones de los genes 16S, 23S y 5S del rDNA, usando
partidores específicos que reconocen la secuencia nucleotídica de estas regiones. En el caso del
gen 16S, es una herramienta comúnmente utilizada en la identificación de bacterias, esto pues es
una unidad evolutivamente conservada y contiene zonas que son comunes para microorganismos
filogenéticamente semejantes. Por otro lado, se trata de un gen relativamente corto, de
aproximadamente 1500pb.
En la literatura se ha reportado el uso de técnicas basadas en PCR tanto para identificación
como para cuantificación de microorganismos, siendo en su mayoría técnicas semi-cuantitativas
es decir, revelan solo abundancia relativa dentro de una población. Dentro de esta clasificación se
encuentran los métodos basados en polimorfismos, con los que es posible detectar pequeñas
diferencias en secuencias específicas de DNA usando por ejemplo, enzimas de restricción. Luego
es posible diferenciar fragmentos de la secuencia ya sea por el tamaño del fragmento de
restricción o por diferencia de nucleótidos. Para ambientes biolixiviantes se ha aplicado distintos
métodos basados en poliformismos: RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism analysis),
para diferenciar fragmentos de restricción desde un producto de amplificación del gen 16S rDNA
[14, 15]; DGGE (Denaturing Gel Electrophoresis), para separar especies de acuerdo a la
migración del 5S rRNA a través de un medio denaturante [16, 17]; RADP (Randomly amplified
polymorphic DNA) y REP-PCR (PCR amplification of repetitive genomic sequences) que usa
partidores no específicos en la amplificación de fragmentos para la creación de patrones
genómicos, entregando resultados taxonómicos discriminatorios [18] y ARDREA (Amplified
ribosomal DNA restriction enzyme analysis). Por otro lado, se ha aplicado otras técnicas
asociadas a PCR como el análisis del espacio intergénico 16S-23S (ISR) [19], amplificación del
16sS rDNA [9] y real-time PCR [20].
15
Los métodos de amplificación presentan una sensibilidad superior a las técnicas de
hibridación. Por esto su uso se ha hecho común en la detección de diversos microorganismos de
distintos ambientes microbianos. Sin embargo, existe una técnica de hibridación cuantitativa,
FISH (Fluorescente in situ hybridization), mediante la cual no es necesario extraer el material
genético y que detecta DNA o RNA que se encuentra en la célula de la especie a identificar. La
secuencia de prueba es marcada con un compuesto fluorescente por lo tanto, las células con
secuencias complementarias al DNA de prueba pueden ser visualizadas en microscopios de
epifluorescencia. Se trata de una técnica que entrega información acerca de la diversidad
bacteriana de la muestra además del aporte de cada especie, que no depende de extracción de
DNA; sin embargo, es una técnica laboriosa y de gran consumo de tiempo.
Las técnicas nombradas anteriormente son en su mayoría de detección e identificación de
especies, y entregan información importante acerca de la composición de una comunidad y de su
diversidad microbiana; no dependen de etapas de cultivo, siendo más rápidos que los métodos
tradicionales. En el caso de las técnicas basadas en polimorfismos, tienen la desventaja que el
análisis de los resultados depende de la resolución visual de los distintos fragmentos de
restricción, como ocurre con ARDREA, lo que limita el análisis a una reducida fracción de
fragmentos [21]. Otro inconveniente de técnicas como DGGE es el requerimiento de gran
cantidad de muestras, siendo todavía técnicas lentas y laboriosas [17]. Por último, generan
perfiles complejos que son difíciles de analizar para comunidades diversas, complicando su
traducción en información taxonómica. T-RFLP es otra técnica basada en polimorfismos que a
diferencia de ARDREA, DGGE o RDP trabaja sobre los fragmentos terminales de restricción,
limitando su número y generando un juego de datos manejable que son analizados de manera
automática por equipos de secuenciación, permitiendo procesar una gran cantidad de muestras
[21]. Sin embargo, todos estos métodos tienen en común que no son técnicas cuantitativas.
Por último, las técnicas asociadas a PCR para la identificación del gen 16S rDNA son
ampliamente usadas en el estudio de la ecología de procesos de biolixiviación, siendo un método
rápido en la detección e identificación de especies desde una comunidad diversa. La
identificación del gen 16S rDNA se utiliza en diversas técnicas asociadas a PCR como etapa
previa, sin embargo en el caso de este trabajo se implementará como técnica individual, que se
16
combinará con el método microbiológico de NMP. De este modo, se convierte en una técnica de
detección cuantitativa.
1.2.4 Amplificación y cuantificación del gen 16s rDNA mediante PCR-NMP
Amplificación del gen 16S rDNA mediante PCR
La amplificación directa del gen 16S rDNA desde muestras de poblaciones microbianas
naturales, usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa, ha concentrado gran interés,
convirtiéndose en una técnica atractiva para la caracterización de los miembros de una
comunidad compleja, principalmente porque evita los métodos tradicionales de cultivo. Existen
diversas modalidades de amplificación del 16S rDNA, principalmente referidas al objetivo de
amplificación, realizando la identificación de un microorganismo específico o del conjunto de la
población.
La técnica de PCR constituye una vía de amplificación para la obtención de secuencias
nucleotídicas a partir de una muestra con baja concentración de células y, en consecuencia con
baja concentración de DNA, el que no puede ser detectado por métodos tradicionales de
hibridación. En la PCR la enzima termoestable DNA polimerasa Taq (Thermus aquaticus) es
usada para amplificar la secuencia de DNA de interés. Con este objetivo se diseñan partidores de
oligonucleótidos cuya función es reconocer una secuencia específica de aprox 20pb en una zona
del gen 16s rDNA.
Por medio de ciclos térmicos se lleva a cabo las etapas que comprende un programa de
PCR: denaturación del DNA de doble hebra, alineamiento y extensión. Estas tres etapas
constituyen un ciclo de amplificación y cada una se realiza a una temperatura específica. Para la
denaturación se utiliza una temperatura entre 92 y 95ºC que rompe los enlaces que unen ambas
hebras para separarlas y dejarlas disponibles para el alineamiento con los partidores. La
17
temperatura de alineamiento depende de los partidores utilizados ya que en esta etapa los
partidores se unen a cada hebra de DNA en su secuencia complementaria. La última etapa se
realiza a 72ºC, en que la enzima DNA polimerasa Taq realiza la extensión de la hebra de DNA
incorporando los nucleótidos. Por cada ciclo de amplificación se obtiene el doble de DNA de la
etapa previa, por lo tanto luego de n ciclos se tendrá un 2n números de copias.
La técnica de amplificación por si sola es una técnica cualitativa, que permite identificar
un microorganismo específico dentro de una población compleja de microorganismos. Esto es
posible gracias a que el gen 16S rDNA varía filogenéticamente, y posee zonas altamente
conservadas para organismos del mismo género, que sirven como blanco para ser reconocidas por
partidores específicamente diseñados. En bacterias de lixiviación el número de copias de 16S
rDNA por genoma es de 1 a 2, lo que da una relación proporcional entre el número de bacterias y
el número de copias de 16S rDNA por muestra [20].
Aunque la técnica de amplificación mediada por PCR presenta importantes ventajas, tales
como rapidez, sensibilidad, necesidad de baja concentración de templado, independencia de
cultivo y especificidad, trae consigo una serie de desventajas intrínsecas de la técnica. Uno de
estos problemas es la aparición de falsos positivos por efecto de contaminación con ácidos
nucleicos; en este caso la extrema sensibilidad de la técnica pasa a ser un problema, basta una
minúscula concentración de estas secuencias para que sirvan de templado y generen
amplificación indeseada [21]. También hay que considerar la inhibición de la reacción, que puede
ser por degradación de reactivos (como la hidrólisis de dNTPs por efecto de ciclos de
congelamiento/descongelamiento) o por contaminantes como metales y proteínas que inhiben la
acción de la enzima DNA polimerasa Taq. Otro problema es la formación de productos
quiméricos o distorsiones (mutaciones puntuales, deleciones, etc.). Por último, se tiene la
amplificación de productos inespecíficos, problema que está relacionado principalmente con el
tiempo y la temperatura de alineamiento.
La técnica por sí sola es de gran utilidad para la identificación y clasificación taxonómica
de diferentes tipos de bacterias, sin embargo no permite obtener una estimación numérica de la
18
diversidad bacteriana en una muestra compleja. Para resolver este problema se usa en conjunto
con una técnica microbiológica de cuantificación como es el método de NMP.
Método de NMP
Este método consiste en el cultivo de bacterias en medio líquido específico a distintas
concentraciones. Por medio de diluciones desde el cultivo inicial se construye un juego de
distintas concentraciones de células que son analizadas para detectar la presencia de bacterias.
Cada dilución representa una concentración de células 10 veces menor que la de la dilución
anterior, y por cada dilución se tiene de tres a cinco tubos iguales. Luego se analiza cada juego de
tubos buscando la presencia de bacterias asociada a alguna característica, definiendo la presencia
como una señal positiva (1) y la no presencia como señal negativa (0). Así se llega hasta la
dilución en que todos los tubos del juego dan señales negativas, desde este se busca hacia atrás el
juego de tubos que tenga sólo señales positivas y desde éste se utilizan las dos diluciones
siguientes. Es decir se tendrá una combinación de tres números, cada uno entre 0 y 5, la cual se
busca en una tabla de Número más Probable. La tabla de NMP está construida como la
probabilidad de encontrar determinada concentración de células para la combinación obtenida.
Figura 2. Esquema gráfico del método de Número Más Probable. En este caso la característica asociada a la
presencia de bacterias es la turbidez del medio luego de su desarrollo.
19
La implementación PCR-NMP consiste en ocupar la metodología de NMP pero en la
etapa de amplificación, es decir, las diluciones antes mencionadas se realizan en el templado de la
reacción. Así se obtienen amplificaciones a distintas concentraciones de DNA. Esta técnica ha
sido utilizada con relativo éxito en la detección de poblaciones de Nitrobacter en suelo [22],
subestimando en algunos casos la población; sin embargo, resultó ser un procedimiento rápido
eficiente y directo que, con este trabajo, se pretende utilizar en bacterias de biolixiviación.
20
1.3
DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO
1.3.1 Presentación y justificación del proyecto
Dada la importancia de la actividad minera en Chile y la inevitable utilización de nuevas
tecnologías que permitan optimizar el proceso de extracción desde minerales cuya ley es cada día
menor, es muy importante la aplicación de la biolixiviación de minerales.
Para la implementación de un proceso de Biolixiviación es necesario conocer y manejar
muy bien todos los parámetros involucrados. Debido a que son microorganismos los que llevan a
cabo el proceso, es vital otorgarles las condiciones óptimas para su desarrollo. Lo anterior lleva a
la necesidad de identificar los microorganismos que conviven en un determinado mineral de
interés, de una forma rápida y confiable. Las técnicas de cultivo más usadas no son eficientes
para todos los microorganismos de ambientes biolixiviantes, requieren de mucho tiempo, no
permiten diferenciar microorganismos con necesidades nutricionales similares y no puede
reproducir las mismas condiciones ambientales del proceso real.
Por otro lado, además de saber qué microorganismo está presente en el mineral, también
interesa conocer su concentración. De este modo, se puede variar parámetros con el fin de
mejorar su rendimiento o favorecer el crecimiento de algún microorganismo específico. No es
objetivo de esta memoria la variación de parámetros de la solución de proceso, pero la
cuantificación permitirá tener una visión general del comportamiento de la población microbiana
que entregue pautas para una eventual optimización del proceso en estudio.
Este proyecto pretende implementar una metodología rápida y confiable para la
cuantificación de bacterias en procesos de biolixiviación de minerales, en el marco del estudio de
la dinámica poblacional de soluciones de bolixiviación. Por esto, es fundamental contar con
muestras de procesos industriales reales, sin la utilización de etapas previas de cultivo. En primer
lugar se extraerá el DNA desde las muestras de solución de salida de una columna de
biolixiviavión, para luego realizar la detección de los microorganismos y su posterior
cuantificación con las técnicas de PCR y NMP acopladas. Para la implementación de la técnica
de PCR es necesario contar con los partidores específicos para cada bacteria, en este caso se
utilizarán partidores previamente diseñados para Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum
ferrooxidans, y se diseñarán los partidores correspondientes para Acidithiobacillus thiooxidans y
Sulfobacillus thermosulfidooxidans.
21
1.3.2 Objetivos
1.3.2.1 Objetivo general
Poder cuantificar mediante Técnicas Moleculares las variaciones de las poblaciones de las
bacterias más importantes en procesos de biolixiviación de minerales sulfurados de Cobre.
.
1.3.2.2 Objetivos específicos
n Diseñar primers específicos para amplificar la región 16S rDNA de Acidithiobacillus
thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans.
n Utilizar la técnica de PCR para la detección de poblaciones de A. ferrooxidans, L.
ferrooxidans, A. thiooxidans y S. thermosulfidooxidans en soluciones de proceso.
n Utilizar la técnica de NMP- PCR para la cuantificación de poblaciones de A. ferrooxidans,
L. ferrooxidans, A. thiooxidans y S. thermosulfidooxidans en soluciones de proceso.
n Estudiar la relación entre las poblaciones bacterianas cuantificadas y la composición de
las soluciones y condiciones ambientales del proceso.
22
1.3.3 Alcances
De acuerdo a los objetivos de este trabajo lo que se quiere lograr es la cuantificación de
variaciones de poblaciones de bacterias en procesos de biolixiviación de minerales sulfurados de
cobre desde soluciones de proceso, para tener una visión más acabada de las características del
proceso. Con este fin, se implementará la técnica cuantitativa de PCR-NMP, basada en la
identificación del gen 16S rDNA mediante partidores específicos para cada tipo de bacteria:
Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferroxidans, Acidithiobaciluus thiooxidans y
Sulfobaciluus thermosulfidooxidans. La implementación de la técnica tiene como pasos previos
en primer lugar el diseño de partidores específicos para los microorganismos Acidithibacillus
thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans. En segundo lugar la detección de cada
microorganismo en cada una de las muestras, y su cuantificación.
Con estos datos, se hará un análisis que relacione los parámetros de la solución de proceso: pH,
Eh, porcentaje de sulfato y cobre, con la cantidad de cada microorganismo en cada muestra.
23
2
CAPÍTULO II: Materiales y Métodos
2.1
ESTRATEGIA DE TRABAJO
La primera actividad para avanzar en el desarrollo del trabajo es el diseño de partidores
para Sulfobacillus thermosulfidooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans. Se necesita partidores
que reconozcan la mayor cantidad de secuencias de 16s rDNA disponibles en las bases de dato,
para cada bacteria y además que sean específicos.
Luego se trabaja con muestras de solución de una columna de biolixiviación de las cuales
se extrae el DNA, y con cada una se realiza la detección de cada microorganismo para después
proceder con la cuantificación.
Para la calibración de la técnica se hace la cuantificación de Acidithiobacillus
ferrooxidans, cultivado con sulfato ferroso en medio de cultivo MC pH 1.6.
2.2
MATERIALES
2.2.1 Muestras
Para el desarrollo de este trabajo se analizaron muestras de solución y de mineral
provenientes de la columna de biolixiviación MC-11 de la Compañía Minera El Abra. Se tiene a
continuación la descripción del mineral y de la solución de percolado:
•
Mineral Bornita-Calcopirita dominante (Bn-Cpy, DOE2).
•
Percolado: soluciones acuosas levemente ácidas de CuSO4, gravedad específica 1.11-1.10
24
2.2.2 Reactivos
En cada etapa del proceso, cultivo, extracción de DNA y amplificación del 16s rDNA se
utilizan una serie de reactivos que corresponden a los protocolos correspondientes. Para ver la
composición y elaboración de cada uno ver la sección de Anexos.
2.2.3 Microorganismos
Se utilizaron cultivos de: Acidithiobacillus ferrooxidans, cepa ATCC 19859;
Leptospirillum ferrooxidans, cepa ATCC 29407 y Acidithiobacillus thiooxidans, cepa ATCC
8085. Para Sulfobacillus thermosulfidooxidans se utilizó un cultivo de células en azufre que de
acuerdo a un estudio anterior (T-RFLP), mostraba la presencia de este microorganismo.
2.2.4 Equipamiento
•
Balanza semianalítica, Precisa 1620C
•
Baño térmico, Memmert
•
Cámara de electroforesis, Bio JSP
•
Cámara de electroforesis
•
Fuente de poder, Bio Rad
•
Microcentrífuga, Biofuge A
•
Termociclador Mastercycler, Eppendorf
•
Transiluminador UV, Vilber Loumart
•
Centrífuga refrigerada, Sorvall
•
Espectrofotómetro
25
2.3
•
Vórtex
•
Micropipetas de 2, 10, 20, 100 y 200 µl, Gilbert y Capp
MÉTODOS
En esta sección se describen cada uno de las metodologías empleadas para cada etapa del
proceso:
-
Diseño de partidores específicos para Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus
thermosulfidooxidans.
-
Extracción de DNA desde cultivos puros, soluciones de refino y mineral.
-
Detección y cuantificación de cada uno de los microorganismos por medio de
PCR-NMP.
2.3.1 Diseño de partidores específicos
Para poder llevar a cabo la amplificación del gen 16S rDNA de los microorganismos
Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans primero se debe contar con
los partidores para cada uno de ellos. Así, estos deben ser diseñados de manera específica a partir
de secuencias nucleotídicas del gen de distintas cepas disponibles en bases de datos de Internet, y
con la ayuda de herramientas computacionales.
Existen distintas bases de datos disponibles en Internet que almacenan secuencias
nucleotídicas del gen 16S rDNA de diversos microorganismos para los cuales ha sido posible
secuenciar el gen. Para cada uno de los microorganismos hay en la base de datos gran cantidad de
cepas con el gen secuenciado, tanto cultivadas como no cultivadas. Una de estas bases de datos es
26
la Ribosomal Database Project II1, RDP, herramienta creada por investigadores de la University
of Illinois at Urbana-Champaign (UIUC) y apoyada por la Michigan State University (MSU),
que además de almacenar secuencias del gen 16S rDNA ofrece análisis de datos en línea,
creación de árboles filogenéticos a partir de rRNA, y alineamiento de secuencias de rRNA. Las
secuencias utilizadas para el diseño de los partidores de las bacterias antes nombradas se
obtuvieron desde esta base de datos. En el caso de Acidithiobacillus thiooxidans se utilizó 17
cepas de las 27 disponibles en la base de datos, con largos que variaron entre 1301 y 1499 pb.
Para Sulfobacillus thermosulfidooxidans se utilizó las 5 cepas disponibles en la base de datos, con
largos que variaron entre 1334 y 1519 pb.
Luego se trabaja con el software Primer Premier versión 5.0, una herramienta
computacional que ayuda en el diseño de partidores. El programa realiza alineamientos de las
secuencias obtenidas desde las bases de datos, buscando un patrón común a todas, es decir, la
posición de los nucleótidos en la secuencia ribosomal. Luego el programa entrega una lista de
todos los posibles partidores para cada alineamiento.
Para el diseño, es necesario además definir los parámetros de búsqueda, es decir de todos
los posibles partidores el programa desplegará aquellos que se ajusten a las necesidades del
usuario. Los parámetros de búsqueda son:
Destino de la secuencia: se define que la secuencia será utilizada para amplificación mediada
por PCR, en el programa se elige la opción PCR Primers.
Tipo de búsqueda: en esta sección se define qué tipos de partidores se está buscando, en este
caso se busca un par de partidores complementarios a ambas hebras. Un partidor sense
complementario a la hebra 3`-5`, y un partidor antisense complementario a la hebra 5`-3` del
DNA. En el programa se elige la opción Pairs.
1
RDP II, http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp
27
Rango de búsqueda: aquí se le indica al programa que busque un par de partidores entre el
nucleótido número 1 y el último nucleótido del alineamiento. En el caso de Acidithiobacillus
thiooxidans la búsqueda se hace hasta el nucleótido número 1377, y para Sulfobacillus
thermosulfidooxidans se realiza hasta el nucleótido número 1369. Por último se define el tamaño
mínimo del producto de PCR en 900 pb y el tamaño máximo como el largo del alineamiento.
Largo de los partidores: se define el largo de los partidores en 20 ± 2 pb.
Por otro lado, cada par de partidores va acompañado por una tabla de información que
entrega los parámetros fisicoquímicos de la reacción: temperatura de meeting (Tm) de los
partidores, el porcentaje GC de cada partidor y la energía libre de Gibbs (ΔG) de la reacción de
hibridación del partidor a la hebra de DNA. También entrega otra tabla con las posibles
estructuras secundarias indeseadas que podrían formarse, como dímeros entre partidores,
autoplegamiento de un partidor y falso partidor (un partidor se pega en una región distinta de la
secuencia blanco), con su respectivo ΔG.
Basado en los parámetros anteriores se elige un par de partidores que además sea
específico. La especificidad de cada partidor se analiza nuevamente en el sitio de RDP, el cual
ofrece una herramienta para realizar match entre los partidores y todas las secuencias
almacenadas en su base de datos. Este análisis entrega una lista de organismos que podrían ser
amplificados con los partidores ingresados. Este proceso se realiza para cada par de partidor que
entrega el programa computacional, hasta encontrar un par de partidores que reconozcan sólo
secuencias de cepas de los organismos deseados.
2.3.2 Extracción de DNA
Los siguientes son los protocolos diseñados previamente [15, 23] para la extracción de
DNA de bacterias de biolixiviación provenientes desde cultivos, soluciones de refino y mineral.
28
Protocolo de extracción de DNA desde cultivos
•
Tomar 80-100 ml de muestra y centrifugar en tubos para centrífuga de 40 ml a 13.000
rpm por 15 min. Descartar sobrenadante.
•
Lavar el pellet con 20 ml de PBS 1X pH 1.2 agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 rpm
por 15 min. Descartar sobrenadante. Repetir el lavado.
•
Lavar con 10 ml de buffer de lavado agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 rpm por 15
min. Descartar sobrenadante.
•
Resuspender en 3 ml de buffer A2X. Adicionar lisozima a una concentración final de 3
mg/ml e incubar por 1 hora a 37 ºC.
•
Agregar SDS a una concentración final de 5% p/v. Realizar 3ciclos de congelamientodescongelamiento, de 3 min cada uno, a -20 ºC y 70 ºC, respectivamente.
•
Centrifugar a 1.000 rpm por 2 min. Recuperar sobrenadante y repartir en tubos Eppendorf
de 1.5 ml, aproximadamente 0.7 ml en cada tubo.
•
Agregar fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) hasta una concentración de 50%
v/v. Vortex hasta homogenizar. Centrifugar a 12.000 rpm por 5 min. Recuperar fase
superior y traspasar a tubos Eppendorf de 1.5 ml limpios.
•
Agregar isopropanol absoluto frío hasta una concentración de 50% v/v y acetato de sodio
3M pH 5.2 a una concentración final de 10% v/v. Incubar a -20 ºC toda la noche.
•
Centrifugar a 14.000 rpm por 25 min. Descartar sobrenadante.
•
Lavar con 500 ul de etanol al 70%, agitar suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm por 10
min. Repetir el lavado.
•
Descartar sobrenadante y secar el pellet al mechero por 2 0min.
•
Resuspender en 100 ul de buffer TE (sólo en un tubo). Almacenar a -20 ºC.
Para visualizar los resultados obtenidos se realiza electroforesis en gel de agarosa al 0.8%.
29
Protocolo de extracción de DNA desde soluciones de procesos de biolixiviación
•
Filtrar el volumen de solución a tratar (entre 1 y 1.5 litros) con membrana de 0.2 um. Una
vez concluido recuperar la membrana y depositarla en el interior de un tubo para
centrífuga de 40 ml.
•
Lavar el pellet con 20 ml de PBS 1X pH 1.2 agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 rpm
por 15 min. Descartar sobrenadante.
•
Lavar con 10 ml de buffer de lavado agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 rpm por 15
min. Descartar sobrenadante.
•
Resuspender en 3 ml de buffer A2X. Adicionar lisozima a una concentración final de 3
mg/ml e incubar por 1 hora a 37 ºC.
•
Agregar SDS a una concentración final de 4% p/v.
•
Agregar NaCl 5M hasta llegar a una concentración final de 0.7M y luego CTAB (CTAB
10% en 0.7M NaCl) para tener una concentración final de 1% CTAB. Incubar a 65 ºC por
1 hr.
•
Realizar 3ciclos de congelamiento-descongelamiento, de 3 min cada uno, a -20 ºC y 70
ºC, respectivamente.
•
Centrifugar a 1.000 rpm por 2 min. Recuperar sobrenadante y repartir en tubos Eppendorf
de 1.5 ml, aproximadamente 0.7 ml en cada tubo.
•
Agregar fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) hasta una concentración de 50%
v/v. Vortex hasta homogenizar. Centrifugar a 12.000 rpm por 5 min. Recuperar fase
superior y traspasar a tubos Eppendorf de 1.5 ml limpios.
•
Agregar isopropanol absoluto frío hasta una concentración de 50% v/v y acetato de sodio
3M pH 5.2 a una concentración final de 10% v/v. Incubar a -20 ºC toda la noche.
•
Centrifugar a 14.000 rpm por 25 min. Descartar sobrenadante.
•
Lavar con 500 ul de etanol al 70%, agitar suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm por 10
min. Repetir el lavado.
•
Descartar sobrenadante y secar el pellet al mechero por 20 min.
•
Resuspender en 50 ul de buffer TE (sólo en un tubo). Almacenar a -20 ºC.
Para visualizar los resultados obtenidos se realiza electroforesis en gel de agarosa al 0.8%.
30
Protocolo de extracción de DNA desde minerales
•
Tomar 10 g de mineral molido en mortero y lavar con 20 ml de H2SO4 0.04N. Centrifugar
a 10.000 rpm por 15 min. Descartar sobrenadante. Repetir el lavado.
•
Lavar el pellet con 20 ml de buffer de lavado de mineral, agitando en vortex. Centrifugar
a 6.000 rpm por 10 min. Descartar sobrenadante. Repetir el lavado (es recomendable
repetir de dos a tres veces esta etapa, para eliminar la mayor cantidad de contaminantes)
•
Resuspender en 2 ml de buffer de lavado de mineral. Adicionar lisozima a una
concentración final de 15 mg/ml e incubar por 1 hora a 37 ºC.
•
Adicionar 250 ul de proteinasa K (10 mg/ml) e incubar por 1 hora a 37 ºC.
•
Agregar SDS a una concentración final de 5% p/v.
•
Agregar NaCl 5M hasta llegar a una concentración final de 0.7M y luego CTAB (CTAB
10% en 0.7M NaCl) para tener una concentración final de 1% CTAB. Incubar a 65 ºC por
1 hora.
•
Realizar 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento, de 3 min cada uno a -20 ºC y 70
ºC, respectivamente.
•
Centrifugar a 4.000 rpm por 10 min. Recuperar sobrenadante y repartir en tubos
Eppendorf de 1.5 ml, aproximadamente 0.7 ml en cada tubo.
•
Agregar fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) hasta una concentración de 50%
v/v. Vortex hasta homogenizar. Centrifugar a 12.000 rpm por 5 min. Recuperar fase
superior y traspasar a tubos Eppendorf de 1.5 ml limpios.
•
Agregar isopropanol absoluto frío hasta una concentración de 50% v/v y acetato de sodio
3M pH 5.2 a una concentración final de 10% v/v. Incubar a -20 ºC toda la noche.
•
Centrifugar a 14.000 rpm por 25 min. Descartar sobrenadante.
•
Lavar con 500 ul de etanol al 70%, agitar suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm por 10
min. Repetir el lavado.
•
Descartar sobrenadante y secar el pellet al mechero por 20 min.
•
Resuspender en 100 ul de buffer TE (sólo en un tubo). Almacenar a -20 ºC.
Para visualizar los resultados obtenidos se realiza electroforesis en gel de agarosa al 0.7%.
31
2.3.3 Amplificación del 16s rDNA mediante PCR
Para la amplificación por PCR es necesario definir las condiciones de reacción, es decir
los reactivos usados con sus respectivas concentraciones y el programa de PCR con las
respectivas temperaturas y tiempos de reacción.
Para los microorganismos Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans
las condiciones de amplificación se encuentran previamente definidas en una tesis anterior [23], y
son
las
mismas
utilizadas
para
Acidithiobacillus
thiooxidans
y
Sulfobacillus
thermosulfidooxidans. Se observa en la Tabla I las concentraciones de cada reactivo para un
volumen final de reacción de 25 ul.
Tabla I. Concentraciones y volúmenes de reactivos de una reacción de PCR.
Concentración inicial
Concentración final
Volumen [μl]
Partidor sense
10 μM
1 μM
2.5
Partidor antisense
10 μM
1 μM
2.5
Nucleótidos
10 mM
200 μM
0.5
Buffer
5X
1X
5
MgCl2
25 mM
1.5 mM
1.5
Taq polimerasa
5 U/μl
2.5 U
0.5
Para este volumen de reacción se usa un volumen de DNA genómico de 1 ul, utilizándose
sin diluir y en diluciones que van desde 1:10 a 1:1000000.
El programa de PCR utilizado para Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum
ferrooxidans, que difiere únicamente en la temperatura de alineamiento (Ta), es el siguiente:
32
Denaturación inicial: 95 ºC por 2 min.
Denaturación: 95 ºC por 45 s
Alineamiento: Ta por 45 s
Extensión.
se repite 20 veces
72 ºC por 45 s
Extensión final: 72 ºC por 2 min
La temperatura de alineamiento para Acidithiobacillus ferrooxidans es 58.5 ºC y para
Leptospirillum ferrooxidans es 53 ºC.
En el caso de Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans
el
programa de PCR utilizado es:
Denaturación inicial: 95 ºC por 5 min.
Denaturación: 95 ºC por 1 min
Alineamiento: Ta por 30 s
Extensión.
se repite 29 veces
72 ºC por 1 min
Extensión final: 72 ºC por 5 min
Para la visualización de los resultados se realizaron geles de agarosa al 1.2% (ver
protocolo en Anexos)
33
2.3.4 Técnica de determinación del número más probable NMP.
Para la cuantificación con NMP y PCR se realizan distintas diluciones de la muestra que
van desde 1:10 hasta 1:1000000. Luego se realiza la amplificación en triplicado de cada una de
las diluciones, incluyendo la muestra sin diluir, según el protocolo antes descrito. En este caso la
señal positiva del método de NMP será la amplificación del templado, las que se obtienen luego
de realizar una electroforesis en gel de agarosa de las muestras amplificadas.
Luego se determina la dilución en la cual no hay amplificación, es decir cuando
desaparece la señal. En seguida se busca la última dilución en la cual se observan tres señales
positivas, a la cual se le otorga un número 3, desde ésta se analizan las dos diluciones siguientes.
Finalmente se tendrá una combinación de tres números XXX, el primero fijo en 3 y los dos
siguientes variando entre 3 y 0. Con esta combinación se va a una tabla de Número más Probable
(ver Anexos) que entrega la concentración de unidades genómicas por cada 100 ml para esa
muestra.
La combinación de señales positivas entrega un valor de NMP/100 ml según la tabla de
NMP. Este número permite calcular la concentración de unidades genómicas de acuerdo a la
siguiente fórmula:
Unidades genómicas/100 ml = (NMP/100 ml X 10)/ última concentración con 3 señales (+)
34
3
CAPÍTULO III: Resultados y Discusión
En el siguiente capítulo se presentan y analizan los resultados obtenidos a partir de las
distintas actividades realizadas para cumplir los objetivos del trabajo. Estas actividades
comprenden una parte computacional con el diseño de partidores; y otra parte experimental dada
por los procedimientos para la extracción de DNA, identificación del gen 16S rDNA y
cuantificación mediante PCR-NMP de bacterias, desde soluciones y mineral provenientes de un
proceso de biolixiviaión de un mineral sulfurado en columnas.
3.1
PARTE COMPUTACIONAL
3.1.1 Diseño de partidores
Se realizó el diseño de partidores específicos para las bacterias Acidithiobacillus
thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans, basados en la región 16S del DNA ribosomal
de estas especies. A continuación se presentan los resultados de este diseño.
Acidithiobacillus thiooxidans
A partir del alineamiento de las secuencias ribosomales de 17 cepas de Acidithiobacillus
thiooxidans encontradas en la base de datos RDP II (ver las cepas en Anexo) se identificó una
secuencia blanco apropiada de 1377 pb, para la cual se diseñaron los siguientes partidores
forward y reverse:
Partidor forward (AzufreI): 5`- AAGAGGAGCCTACGTCTGA – 3`
Partidor reverse (Azufre II): 5`- GTGTAGCCCTGGACATAAA- 3`
35
Este par de partidores permite la amplificación de 23 cepas de Acidithiobacillus
thiooxidans de las 27 cepas cuyo gen 16S de DNA ribosomal se encuentra secuenciado y
almacenado en las bases datos. Mediante el programa Primer Premier v5.0 es posible predecir el
largo del producto de amplificación, este corresponde a 1021 pb el cual se extiende desde el
nucleótido 210 al 1230 de la secuencia blanco. De esta manera, el partidor AzufreI que se alinea a
la hebra 3`-5`, lo hace a partir del nucleótido 210. Por otro lado, el partidor AzufreII se alinea a la
hebra 5`-3`a partir del nucleótido 1230.
El software además entrega las principales propiedades de los partidores (Tabla II), así
como también condiciones termodináminas bajo las cuales se pueden producir reacciones
indeseadas.
Tabla II. Propiedades de los partidores específicos de Acidithiobacillus thiooxidans
Partidor
Tm (ºC)
Largo (pb)
ΔG[kcal/mol]
GC%
Forward Azufre I
51.8
19
-34.7
52.6
Reverse Azufre II
50.4
19
-34.3
47.4
En este caso se predice la formación de estructuras secundarias en el partidor forward:
•
Autoplegamiento con una energía de activación de 0.1 Kcal/mol
•
Dímero con una energía de activación de -6.3 Kcal/mol
•
Un dímero cruzado entre ambos partidores con una energía de activación de -3.9
Kcal/mol.
La energía de activación ΔG antes mencionada para cada una de las reacciones,
incluyendo la reacción de hibridación del partidor a la secuencia blanco, entrega una noción de
tendencia de formación de cada estructura. Esta energía libre corresponde a la energía necesaria
para llevar a cabo una reacción, así mientras menor sea la energía más se favorecerá que ocurra la
reacción. De este modo, se debe comparar las energías de cada reacción indeseada con la de la
36
reacción de interés. En este caso la energía de activación de la reacción de hibridación para el
partidor forward y el partidor reverse es de -34.7 Kcal/mol y -34.3 Kcal/mol, respectivamente.
Lo que comparado con las energías de activación de las reacciones indeseadas: 0.1Kcal/mol para
el autoplegamiento, -6.3 Kcal/mol para el dímero y -3.9 Kcal/mol para el dímero cruzado, es un
valor muy inferior. Así se puede inferir que la probabilidad de que se formen estructuras
secundarias es mucho menor a la probabilidad de la reacción de la correcta amplificación para la
cuál se diseñaron los partidores.
Por último, todos los valores y datos entregados anteriormente se realizan en base a la
temperatura óptima de alineamiento entregada por el software, la que corresponde a 54.2 ºC. Esta
es la temperatura que se usa como punto de partida para encontrar la temperatura de alineamiento
definitiva que se aplicará en la reacción de PCR.
Sulfobacillus thermosulfidooxidans
A partir del alineamiento de las secuencias ribosomales de 5 cepas de Sulfobacillus
thermosulfidooxidans encontradas en la base de datos RDP II (ver las cepas en Anexo) se obtiene
una secuencia blanco de 1369 pb para la cual se diseñaron los siguientes partidores forward y
reverse:
Partidor forward (Thermo f): 5`- GTGCGTAATACATGCAAGTCG – 3`
Partidor reverse (Thermo r): 5`- TGTCCAGTCCTGGTAAGGTTCT – 3`
Este par de partidores permite la amplificación de 4 cepas de Sulfobacillus
thermosulfidooxidans de las 5 cepas cuyo gen 16S de DNA ribosomal se encuentra secuenciado y
almacenado en las bases datos. Mediante el programa Primer Premier v5.0 es posible predecir el
largo del producto de amplificación, este corresponde a 927 pb el cual se extiende desde el
nucleótido 37 al 963 de la secuencia blanco. De esta manera el partidor Thermo f que se alinea a
37
la hebra 3`-5`, lo hace a partir del nucleótido 37. Por otro lado el partidor Thermo r se alinea a la
hebra 5`-3`a partir del nucleótido 963.
El software además entrega las principales propiedades de los partidores (Tabla III), así
como también condiciones termodináminas bajo las cuales se pueden producir reacciones
indeseadas.
Tabla III. Propiedades de los partidores específicos de Sulfobacillus thermosulfidooxidans
Partidor
Tm (ºC)
Largo (pb)
ΔG[kcal/mol]
GC%
Forward Thermo f
56.9
21
-38.6
47.6
Reverse Thermo r
57.9
22
-39.5
50
En este caso se predice la formación de estructuras secundarias:
•
Dímero en el partidor forward, con una energía de activación de -7.0 Kcal/mol
•
Dímero en el partidor reverse, con una energía de activación de -6.6 Kcal/mol
Como se dijo anteriormente la energía de activación es el parámetro que define la
tendencia de que una reacción se realice. En este caso la energía de activación de la reacción de
hibridación para el partidor forward y el partidor reverse es de -38.6 Kcal/mol y -39.5 Kcal/mol,
respectivamente. Este valor es muuy inferior comparado con las energías de activación de las
reacciones indeseadas: -7.0 Kcal/mol para el dímero en el partidor forward y -6.6 Kcal/mol para
el dímero en el partidor reverse. Así se puede inferir que la probabilidad de que se formen
estructuras secundarias es mucho menor a la probabilidad de la reacción de la correcta
amplificación.
Por último, todos los valores y datos entregados anteriormente se realizaron en base a la
temperatura de melting entregada por el software, la que corresponde a 58.4 ºC. Esta es la
38
temperatura que se usó como punto de partida para encontrar la temperatura de alineamiento
definitiva usada en la reacción de PCR.
3.2
PARTE EXPERIMENTAL
3.2.1 Extracción de DNA
Esta corresponde a la etapa previa a la identificación y cuantificación, con la que se
obtuvo el material genético tanto de cultivos puros de Acidithiobacillus ferrooxidans,
Leptospirillum ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans,
como de las bacterias en las soluciones de refino y mineral de una columna de biolixiviación.
3.2.2
Extracción de DNA desde cultivos puros
Con el fin de utilizar el material genético de microorganismos provenientes de cultivos
puros como controles positivos y negativos en el diseño de los partidores, y como una manera de
conocer y manejar los protocolos de extracción, se realizó la extracción de DNA desde estos
cultivos. Es necesario hacer notar que a pesar de tratarse de cultivos puros, es altísima la
probabilidad de contaminación entre ellos. Es así como en trabajos de tesis anteriores [15] se ha
detectado mediante la técnica de T-RFLP, la presencia de alguna de las bacterias de interés en los
cultivos supuestamente puros de las otras.
Para Acidithiobacillus ferrooxidans se preparó 100 ml de cultivo con una concentración
de 3 g/l de sulfato ferroso (FeSO4), 2 ml de inóculo y medio MC (pH 1.6); este cultivo se
conservó en un agitador a 30ºC por alrededor de 48 h. Para Leptospirillum ferrooxidans se
preparó también 100 ml de solución con FeSO4 a una concentración final de 3 g/l, 4 ml de
inóculo y medio 9K modificado; se mantuvieron en agitador a 30 ºC por alrededor de 72-96 h. En
el caso de Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans se utilizaron
cultivos en perlas de azufre a una concentración de 3 g/100 ml de medio, en medio MC (pH 2.3).
39
Mediante recuento directo se midió una concentración de células en cada uno del orden de 108
cel/ml.
En la Figura 3, se presenta la foto de un gel de electroforesis en agarosa al 0.8%, con el
DNA extraído de algunos de estos cultivos. En él se logró distinguir una banda de alto tamaño
molecular, que coincide con el patrón esperado en una extracción de DNA genómico.
Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% de extracción de DNA genómico. Carril 1: marcador de peso
molecular 1Kb,
carril 2: Acidithiobacillus ferrooxidans, carril 3: Acidithiobacillus thiooxidans y carril 4:
Sulfobacillus thermosulfidooxidans.
En el caso de las cuatro especies se utilizó el mismo protocolo de extracción, el cual fue
estudiado y probado en tesis anteriores [15, 23]. Sin embargo se le introdujo algunas
modificaciones con el fin de mejorar la recuperación de material genético y eliminar
contaminantes. Con este objetivo se estudiaron tres etapas del protocolo:
•
Las etapas de lavado previa lisis celular
•
La etapa de extracción con fenol-cloroformo
•
La etapa de lavado del pellet con etanol al 70%.
40
En el caso del lavado previo, se hace necesario no generalizar el protocolo a cualquier
muestra, es decir dependiendo de la suciedad de la muestra es conveniente repetir una o dos veces
el lavado con buffer de lavado. Así mismo, se puede incorporar como una primera etapa la
centrifugación a 1000 rpm por 10 min, recuperando el sobrenadante y descartando el pellet con
los elementos contaminantes.
La etapa de extracción con fenol-cloroformo consistió en la separación en dos fases del
DNA de las proteínas contaminantes. Estas proteínas tienen un efecto inhibitorio de la reacción
de PCR, por lo tanto es muy importante su eliminación. Así, es conveniente realizar siempre dos
veces esta etapa, una con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y otra con fenolcloroformo (24:1). Sin embargo, hay que destacar que cada repetición de estas etapas trae
consigo la pérdida parcial de material genético, por lo tanto no es conveniente realizarlas más de
dos veces.
Finalmente, la etapa de lavado con etanol al 70% para la recuperación de DNA desde la
mezcla de Isopropanol y Acetato de Sodio, se realizó dos veces para eliminar contaminantes
como metales, que puedan interferir en la reacción de PCR. El procedimiento utilizado fue lavar
el pellet de DNA con 500 μl de etanol al 70%, agitarlo por inversión del tubo, suavemente, hasta
visualizarlo en la solución.
Sin embargo, los efectos de las modificaciones mencionadas anteriormente fueron apenas
visibles, manteniéndose la presencia de un barrido producto de suciedad en la muestra. Sin
embargo, permiten que se produzca la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) sin problemas
de inhibición.
Las modificaciones del protocolo de extracción son extensibles para soluciones de refino
y mineral, de acuerdo a las condiciones de la muestra.
41
3.2.3 Extracción de DNA desde soluciones de refino
Se utilizaron diez muestras de soluciones de refino de una columna de biolixiviación de la
sociedad minera El Abra. De cada una se concentraron las células por medio de microfiltración y
se extrajo el DNA mediante protocolo de extracción descrito en métodos. Por otro lado, a todas
las muestras se les realizaron los siguientes análisis: recuento directo de células, pH, Eh,
concentración de Fe total, Fe+3 y Fe+2, concentración de sulfato y concentración de Cu.
La Figura 4 corresponde a la foto de un gel de electroforesis en agarosa al 0.8% con la
extracción de DNA desde soluciones de refino.
Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% de DNA genómico extraído desde muestras de solución de
refino. Carril 1: marcador de peso molecular 1 Kb, carril 2: DNA genómico muestra 5, carril 3: DNA genómico
muestra 6, carril 4: DNA genómico muestra 7, carril 5: DNA genómico muestra 8, carril 6: DNA genómico muestra
9.
Se aprecia una banda de alto tamaño molecular, sobre 10,000 pb, según el patrón esperado
en una extracción de DNA genómico. Se aprecia además una especie de barrido bajo la banda de
DNA, lo que corresponde a DNA genómico degradado y contaminación propia de las muestras.
Esta contaminación se intentó eliminar mediante modificaciones en el protocolo de extracción,
principalmente en la etapa de lavado con fenol-cloroformo y con etanol al 70%, tal como se
describió en la sección anterior. Sin embargo, dado que las soluciones contienen escasa presencia
de células, del orden de 106 cel/ml, la incorporación de mayor cantidad de etapas de lavado se
42
traduciría en pérdida de DNA. Por otro lado, la alta concentración de contaminantes del tipo sales
y metales se hacía evidente en la etapa previa de filtración de la muestra, produciéndose la
saturación de los filtros. Todo lo anterior muestra la dificultad de obtener DNA limpio desde este
tipo de soluciones.
Además, para el estudio de la población bacteriana de las muestras se realizó la medición
de distintos parámetros relacionados de alguna forma con la presencia de un tipo de bacteria en la
solución, o de su predominancia por sobre las otras. Estos parámetros corresponden a pH, Eh
concentración de Fe total, ión férrico, ión ferroso, sulfato y Cu. Cada uno de éstos parámetros se
midió al momento de recibir la muestra (ver Tabla en la sección ANEXOS, con la fecha de
recepción de cada muestra).
Cabe destacar que la extracción de DNA genómico se realizó directamente desde las
soluciones de refino no enriquecidas, logrando un buen resultado. Esto es un importante aporte
para el estudio de la diversidad bacteriana real de una muestra.
3.2.4 Extracción de DNA desde muestras de mineral
A pesar de que el estudio se centra exclusivamente en el análisis de las soluciones de
refino, es de utilidad conocer la diversidad bacteriana presente en el mineral mismo. Esto debido
a que se da el caso que bacterias como Leptospirillum ferrooxidans tendrían una tendencia a
crecer fundamentalmente adheridas al mineral.
El protocolo usado para esta extracción también sufrió modificaciones para obtener un
DNA libre de impurezas. Así, se incluyó un lavado adicional con buffer de lavado de mineral y
un lavado adicional con etanol al 70%. En la Figura 5 se presenta la foto de un gel de
electroforesis con la extracción de la muestra de mineral, la que se ajusta al patrón esperado de
extracción de DNA genómico, con un tamaño sobre 10,000pb.
43
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% de muestra de DNA genómico proveniente de mineral
aglomerado. Carril 1: DNA genómico de muestra de mineral, carril 2: marcador de peso molecular 1 Kb.
La extracción de DNA desde las células presentes en el mineral se realizó sin ningún tipo
de enriquecimiento bacteriano, obteniéndose una concentración suficiente de DNA para realizar
una reacción de PCR, como se verá más adelante. Luego, al comparar el resultado de esta
extracción con el de las soluciones de refino, que son aquellas muestras cuyo material genético es
de una mezcla de microorganismos, no se aprecia una gran diferencia en la intensidad de las
bandas de los respectivos geles. Esto significa una eficiencia de recuperación semejante entre
ambas muestras, lo que da cuenta de la efectividad del protocolo de extracción usado para
muestras de biolixiviación.
3.2.5 Determinación de temperatura de alineamiento de partidores específicos para
Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans
Para realizar la amplificación del gen 16S rDNA de cada uno de estos microorganismos,
es necesario determinar la temperatura de alineamiento de ambos partidores. Con la ayuda del
programa Primer Premier v5.0 se obtuvo las secuencias de los partidores específicos así como
también los productos de amplificación esperados, sin embargo el programa predice una
temperatura de alineamiento óptima que en muchos casos no arroja los mejores rendimientos de
44
amplificación. Por lo tanto, es necesario utilizar un método experimental para determinar esta
temperatura, que en este caso se trata de un PCR de gradiente de temperatura.
La reacción se realizó simultáneamente para doce temperaturas distintas, dentro de la cual
se incluye la temperatura de alineamiento entregada por el programa de diseño. Mediante una
función especial, el termociclador es capaz de utilizar temperaturas diferentes para distintos
pocillos del equipo. Así dependiendo de la bacteria se construye un gradiente diferente, en el caso
de Acidithiobacillus thiooxidans las temperaturas variaron entre 45 ºC y 65.6 ºC y para
Sulfobacillus thermosulfidooxidans el rango de temperaturas fue entre 48 ºC y 68.5 ºC (Tabla
IV).
Tabla IV. Temperaturas utilizadas en PCR con gradiente de temperatura para A. thiooxidans y S.
thermosulfidooxidans.
Pocillo
A. thiooxidans [ºC]
S. thermosulfidooxidans [ºC]
1
45
48
2
45.3
48.3
3
46.4
49.4
4
48.2
51.2
5
50.4
53.5
6
53
56.1
7
55.8
58.8
8
58.5
61.5
9
61
64
10
63.1
66.1
11
64.7
67.7
12
65.6
68.5
45
3.2.6 Temperatura de alineamiento de partidores específicos para Acidithiobacillus
thiooxidans
En la Figura 6 se presenta la foto de un gel de electroforesis con el resultado del PCR de
gradiente de temperatura para Acidithiobacillus thiooxidans. Se aprecia, para cada temperatura,
una banda del tamaño molecular esperado, 1021 pb, alrededor de la banda de tamaño 1000 pb del
marcador molecular de 1 Kb. Se ve además, que para cada temperatura del gradiente se obtiene
una banda única, sin productos inespecíficos ni impurezas. De este modo, el siguiente paso es
escoger una temperatura de entre las doce, con la cual se obtenga el mejor rendimiento de
amplificación.
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR con gradiente de temperatura para
Acidithiobacillus thiooxidans. Parte A, carril 1: marcador de peso molecular 1 Kb; carril 2: 45ºC; carril 3: 45.3ºC;
carril 4: 46.4ºC; carril 5: 48.2ºC; carril 6: 50.4ºC; carril 7: 53ºC; carril 8: 55.8ºC; carril 9: 58.5ºC. Parte B, carril 1:
marcador de peso molecular 1 Kb; carril 2: 61ºC, carril 3: 63.1ºC; carril 4: 64.7ºC, carril 5: 65.6ºC.
De todas las temperaturas se eligió aquella que diera como resultado una banda intensa,
pero que además fuera relativamente alta para evitar reacciones indeseadas o productos
inespecíficos. En este caso se escogió una temperatura de 63.1 ºC.
46
Prueba de especificidad de partidores diseñados para Acidithiobacillus thiooxidans
Para probar la especificidad de los partidores y dado que todas las temperaturas entregan
una sola banda como resultado de amplificación se realiza un PCR cruzado. Es decir la
amplificación de la secuencia 16S rDNA con los partidores específicos para Acidithiobacillus
thiooxidans diseñados, de DNA genómico proveniente de cultivos puros de: Acidithiobacillus
thiooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum
ferrooxidans.
En la Figura 7 se observa que a la temperatura de 63.1 ºC se obtiene amplificación desde
DNA de cada uno de los cultivos puros, sin embargo para cada uno es una banda del mismo
tamaño y sin productos inespecíficos.
Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR cruzado con partidores de A.
thiooxidans para T=63.1 ºC. Carril 2-3: amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100
y 10-1, respectivamente. Carril 4-5: amplificación DNA genómico cultivo puro L. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1,
respectivamente. Carril 6-7: amplificación DNA genómico cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 101
, respectivamente. Carril 8-9: amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1,
respectivamente. Carril 1: marcador peso molecular 1Kb.
La alternativa para hacer la amplificación más específica es elevar la temperatura de
alineamiento, esto elimina reacciones y productos inespecíficos. Por otro lado, se observa en la
figura que las bandas de mayor intensidad son aquellas de los cultivos puros de Acidithiobacillus
47
thiooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans y Acidithiobacillus ferrooxidans, cultivos que
pueden presentar algún tipo de contaminación. En el caso de Sulfobacillus thermosulfidooxidans
no hay certeza de que efectivamente se trate de un cultivo puro, mientras que en trabajos de tesis
anteriores [15] se detectó, mediante la técnica de T-RFLP, la presencia de Acidithiobacillus
thiooxidans en cultivos puros de Acidithiobacillus ferrooxidans, en el laboratorio de
Biohidrometalurgia de la Universidad de Chile.
Para eliminar la amplificación inespecífica encontrada a la temperatura de 63.1 ºC, se
llevó a cabo otra amplificación mediante PCR, esta vez a una temperatura de 65.8 ºC. En la
Figura 8 se observa la foto del gel de electroforesis con el resultado de esta amplificación. En él
sólo se observa bandas para el cultivo puro de Acidithiobacillus thiooxidans, en diluciones 100,
10-1 y 10-2. Por otro lado se trata de bandas intensas y gruesas, lo que es un buen resultado de
amplificación. Así, la temperatura de alineamiento escogida para la amplificación del gen 16S
rDNA de Acidithiobacillus thiooxidans fue de 65.8 ºC, utilizando el programa de amplificación
descrito en métodos.
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR cruzado partidores A. thiooxidans para
T=65.8 ºC. Carril 2, 3, 4: amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100, 10-1 y 10-2,
respectivamente. Carril 5-6: amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1,
respectivamente. Carril 7-8: amplificación DNA genómico muestra proveniente de lodos, en duplicado. Carril 1:
marcador peso molecular 1Kb.
48
3.2.7 Temperatura de alineamiento de Sulfobacillus thermosulfidooxidans
En la Figura 9 se presenta la foto del gel de electroforesis del resultado del PCR con
gradiente de temperatura para Sulfobacillus thermosulfidooxidans.
Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR de gradiente de temperatura para
Sulfobacillus thermosulfidooxidans. Parte superior del gel, carril 1: marcador de peso molecular, carril 2: 48ºC,
carril 3: 48.3ºC, carril 4: 49.4ºC, carril 5: 51.2ºC, carril 6: 53.5ºC, carril 7: 56.1ºC, carril 8: 58.8ºC, carril 9: 61.5ºC.
Parte inferior del gel, carril 1: marcador de peso molecular 1Kb, carril 2: 64ºC, carril 3: 66.1ºC, carril 4: 67.7ºC y
carril 5: 68.5ºC.
Aquí se puede ver bandas inespecíficas para las siete primeras temperaturas, de este modo
la temperatura de alineamiento será de entre 61.5 ºC y 68.5 ºC. En la medida que se aumenta la
temperatura de alineamiento desaparecen bandas inespecíficas producto de reacciones
indeseadas. Por otro lado, las bandas observadas para cada una de las temperaturas corresponden
al tamaño molecular esperado de 927 pb, ubicándose por debajo de la banda de 1000 pb del
marcador de peso molecular 1 Kb.
49
Prueba de especificidad de partidores diseñados para Sulfobacillus thermosulfidooxidans
Dada la situación de posible contaminación en los cultivos puros, se realizó un segundo
PCR con gradiente de temperatura, pero esta vez para la amplificación de DNA genómico de los
cultivos de Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus
thermosulfidooxidans. Este PCR se lleva a cabo en un rango de temperaturas de entre 62.1 ºC y
63.8 ºC, con diluciones de 100 y 10-1 para cada cultivo. En la Figura 10 se puede ver una foto del
gel de electroforesis de los productos del PCR cruzado con gradiente de temperatura realizado
con los partidores específicos diseñados para Sulfobacillus thermosulfidooxidans.
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR cruzado con gradiente de temperatura
para partidores de Sulfobacillus thermosulfidooxidans. T = 62.1 ºC, carriles 2-3 amplificación DNA genómico
cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 4-5 amplificación DNA
genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 6-7 amplificación DNA
genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente. T=62.7 ºC, carriles 8-9 amplificación
DNA genómico cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 10-11
amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 12-13
amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente. T=63.3, carriles
14-15 amplificación DNA genómico cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente;
carriles 16-17 amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente;
carriles 18-19 amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente.
Se observa que para la temperatura de 63.3 ºC desaparecen las bandas de amplificación
relativas a Acidithiobacillus ferrooxidans (carriles 18 y 19), sin embargo de todas maneras existe
amplificación para el caso del cultivo puro de Acidithiobacillus thiooxidans. Dado que, el diseño
50
de los partidores dio resultados de amplificación específicos de acuerdo a las bases de datos de
secuencias de DNA ribosomal, y el PCR entrega productos de amplificación coherentes con los
tamaños esperados, es altamente probable la contaminación del cultivo de Acidithiobacillus
ferrooxidans con Sulfobacillus thermosulfidooxidans.
3.2.8 Detección y cuantificación de DNA
Este proceso se llevó a cabo para la detección y cuantificación de cuatro especies
presentes en procesos de biolixiviación: Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum
ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans, en las diez
muestras de solución de refino.
En primer lugar se realizó la cuantificación de Acidithiobacillus ferrooxidans, para cada
una de las muestras. Para calibrar la técnica de PCR-NMP se aplicó ésta a una muestra de cultivo
puro de Acidithiobacillus ferrooxidans. En la Figura 11 se puede ver la foto de un gel de
electroforesis con el resultado de esta cuantificación. Las diluciones del DNA extraído utilizadas
van desde 100 a 10-5, en triplicado.
Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de A. ferrooxidans en cutltivo
puro. Carril 1: estándar peso molecular 1Kb. Carril 2-3-4: dilución 100; carril 5-6-7: dilución 10-1; carril 8-9-10:
dilución 10-2; carril 11-12-13: dilución 10-3.
En el gel anterior se aprecia la señal de amplificación positiva hasta la dilución 10-3, con
la visualización de tres bandas en cada dilución. Se aprecia también la ausencia de amplificación
51
en la dilución 100. Esto es señal de una elevada concentración de DNA en la muestra, lo que se
traduce a su vez en una elevada concentración de los contaminantes que contiene esta muestra,
los cuales inhiben la amplificación.
De este modo la concentración de unidades genómicas para el cultivo puro de
Acidithiobacillus ferrooxidans es: 800 UG/ml. Lo que es mucho menor a la concentración de 108
cél/ml medida por recuento directo del cultivo. Esta diferencia puede atribuirse principalmente a
la pérdida de células que se produce en la etapa de extracción de DNA.
Con esta calibración se calculó la concentración real de células en cada muestra, mediante
una relación lineal entre la concentración celular de la calibración y la concentración medida por
técnicas moleculares.
Por otro lado, la cuantificación de Acidithiobacillus ferrooxidans presente en las muestras
de solución de refino reveló la presencia de esta bacteria en todas las muestras, incluso a niveles
de concentración de ión férrico elevados, del orden de 8.600 mg/l. En la Figura 12 se presenta la
foto de un gel de electroforesis con el resultado de la cuantificación mediante NMP-PCR para
una de las muestras. Se ve las señales en triplicado para cada dilución, hasta su extinción.
Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de A. ferrooxidans en muestra de
solución de refino. Carril 2-4: dilución 100; carril 5-7: dilución 10-1; carril 8-10: dilución 10-2; carril 2-4, inferior:
dilución 10-3; carril 1: marcador de peso molecular 1Kb.
52
La tendencia en la cuantificación de esta bacteria fue la aparición de señal sólo hasta la
dilución 10-3, y al igual que para las otras bacterias en estudio lo habitual es que desaparezca la
señal por completo, en triplicado, en una dilución específica. Esta desaparición de las tres
muestras de una misma dilución da cuenta de la reproducibilidad de la técnica de PCR.
La Tabla V corresponde a los resultados de la cuantificación de Acidithiobacillus
ferrooxidans para cada muestra del estudio. En ella se presenta, para cada dilución, los resultados
de la amplificación como señal positiva, y además la concentración de UG de la bacteria en
cuestión, para cada muestra.
Tabla V. Resultados de la cuantificación de Acidithiobacillus ferrooxidans presente en soluciones de refino,
expresado como concentración en Unidades genómicas (UG) por ml.
Calibración
Muestra
0
10
-1
10
-2
10
10
-3
10
-4
10
-5
UG/100ml
UG/ml
UG/ml
1
1x108
P1
3
3
3
0
0
0
8000
8x10
P2
0
3
0
0
0
0
800
8x100
1x107
P3
3
3
3
3
0
0
80000
8x102
1x109
P4
3
3
3
0
0
0
8000
8x101
1x108
P5
0
3
3
3
0
0
80000
8x102
1x109
P6
0
3
3
3
0
0
80000
8x102
1x109
P7
3
3
3
0
0
0
8000
8x101
1x108
P8
3
3
3
0
0
0
8000
8x101
1x108
P9
3
3
3
0
0
0
8000
8x101
1x108
P10
3
3
0
0
0
0
800
8x100
1x107
Se puede observar que Acidithiobacillus ferrooxidans fue identificado en todas las
muestras, incluso para los niveles más bajos de ferroso detectados, de 39.23 mg/l. En el Gráfico 1
se presenta el análisis de Fe realizado para todas las muestras, en el cual la variable tiempo
corresponde al día de recepción de la muestra. Este consistió en medir la concentración de Fe
total, Fe+2 y Fe+3 para cada una de las muestras. En él se puede observar que la concentración de
53
ferroso mencionada anteriormente, corresponde a la muestra 2 recibida el día 28 del período de
estudio
Esta muestra a su vez, es aquella con la concentración más baja de UG del
Concentración [mg/l]
microorganismo, de 8 UG/ml.
10.000
9.000
8.000
7.000
6.000
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0
Fierro total
Ferroso
Férrico
0 28 35 40 47 56 78 88 92 96
tiempo [días]
Gráfico 1. Análisis de Fe total (verde), Fe+2 (rojo) y Fe+3 (amarillo) para cada muestra de solución de refino
proveniente de columna de biolixiviación de Sociedad minera El Abra. Cada trío de columnas corresponde a una
muestra, cuya variable tiempo corresponde al día de recepción de la muestra.
Uno de los objetivos de este trabajo tiene que ver con el estudio de la relación que existe
entre la concentración de microorganismos y las condiciones del medio. En el caso de
Acidithiobacillus ferrooxidans, su capacidad oxidativa se ve afectada por diversos factores, entre
los cuales uno de los más importantes es la elevada concentración de ión férrico en la solución.
Este compuesto es capaz de inhibir el crecimiento de esta bacteria, sin embargo es posible que la
baja concentración de ión ferroso disponible sea aún más relevante para el crecimiento de
Acidithiobacillus ferrooxidans. Si se intenta relacionar la concentración de UG de
Acidithiobacillus ferrooxidans con algún parámetro de la solución, no es posible encontrar un
comportamiento coherente. La variación de hierro total no permite establecer una relación entre
el consumo de ión ferroso y la disminución de la concentración de Acidithiobacillus
ferrooxidans. Por otro lado, las concentraciones de ión férrico detectadas no son suficientemente
altas como para inhibir el crecimiento de Acidithiobacillus ferrooxidans.
54
Según estudios [8], la ausencia de Acidithiobacillus ferrooxidans relacionada con un
coeficiente Fe+3/Fe+2 elevado, se traduciría en el aumento de la concentración de Leptospirillum
ferrooxidans. Sin embargo, en este trabajo no se detectó Leptospirillum ferrooxidans en ninguna
de las diez muestras analizadas. Esto podría tener su explicación en el elevado pH de las
muestras, alrededor de 2.02, siendo el pH óptimo de crecimiento de Leptospirillum ferrooxidans
de 1.3 [24, 8]. En el Gráfico 2 se presenta el análisis de pH realizado para cada una de las
muestras, observándose que ese parámetro no baja de 1.9. Por otro lado, como se trata de una
bacteria que sólo oxida hierro, su crecimiento es menos eficiente en minerales sulfurados del tipo
calcopirita [4] si no tiene disponible ión ferroso para sus requerimientos metabólicos.
2,15
2,1
2,05
pH
2
1,95
1,9
1,85
1,8
1,75
0
28
35
40
47
56
78
88
92
96
tiempo [días]
Gráfico 2. Análisis de pH para cada muestra de solución de refino proveniente de columna de biolixiviación de
Sociedad minera El Abra. Cada columna corresponde a una muestra, cuya variable tiempo corresponde al día de
recepción de la muestra.
Es posible también, que el diseño de estos partidores específicos para Leptospirillum
ferrooxidans no contemplara cepas de esta bacteria que están presentes en este mineral, producto
de la menor cantidad de cepas disponibles en las bases de datos hace dos años, fecha en la cual
los partidores fueron diseñados.
Por otro lado, se buscó también Leptospirillum ferrooxidans en muestras de mineral, dado
que se trata de una bacteria que crece mejor adherida al mineral que en solución. Sin embargo no
55
se detectó, lo que se puede atribuir, como se dijo anteriormente, al tipo de mineral con el que se
está trabajando.
Finalmente, se descartó algún problema con los partidores de Leptospirillum ferrooxidans
llevando a cabo una reacción de PCR con un cultivo puro de esta especie, obteniendo una banda
del tamaño esperado para esta amplificación, 1088 pb.
En la Figura 13 se presenta la foto de un gel de electroforesis con el resultado de la
cuantificación de Acidithiobacillus thiooxidans para una muestra de solución de refino.
Figura 13. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de A. thiooxidans en muestra de
solución de refino. Carril 2-4: dilución 100; carril 5-7: dilución 10-1; carril 8-10: dilución 10-2; carri 11-13: dilución
10-3; carril 14-16: dilución 10-4; carril 1 y 20: marcador de peso molecular 1Kb.
En el caso de esta bacteria, se logró identificar su presencia en sólo 7 muestras, además de
la muestra de mineral. En la Tabla VI se entregan los resultados de la cuantificación de este
microorganismo. Acidithiobacillus thiooxidans es una bacteria capaz de producir ácido sulfúrico
rápidamente, lo que ayuda a bajar el pH y mejora las condiciones ambientales para
Acidithiobacillus ferrooxidans. A valores de pH más bajos el crecimiento de Acidithiobacillus
ferrooxidans es mayor lo que acelera las velocidades de oxidación del sustrato y la extracción de
metales es mayor [7, 26].
56
Tabla VI. Resultados de la cuantificación de Acidithiobacillus thiooxidans presente en soluciones de
refino, expresado como concentración en Unidades genómicas (UG) por ml.
Calibración
Muestra
100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
UG/100ml
UG/ml
UG/ml
P1
3
3
3
3
0
0
0
80000
8x102
1x109
P2
3
3
3
3
3
3
0
8000000
8x104
1x1011
P3
3
3
3
3
0
0
0
80000
8x102
1x108
P4
3
3
3
0
0
0
0
8000
8x101
1x108
P5
3
3
3
3
0
0
0
80000
8x102
1x109
P6
3
3
3
2
0
0
0
14000
1,4x102
1,75x10
2
1x109
P7
3
3
3
3
0
0
0
80000
8x10
P8
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
P9
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
P10
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Por otro lado, estudios [26] muestran que poblaciones bacterianas mixtas compuestas
predominantemente por Acidithiobacillus thiooxidans y por Acidithiobacillus ferrooxidans
presentan los mayores niveles de recuperación de cobre, mejorando el proceso.
Para evidenciar una mejora en el proceso un parámetro importante a medir es la
concentración de cobre disuelto. En el Gráfico 3 se presenta la variación de concentración de Cu
disuelto, para cada una de las muestras estudiadas. La tendencia general es que los mayores
porcentajes de Cu disuelto se dan en los casos en que las concentraciones de UG de
Acidithiobacillus thiooxidans y de Acidithiobacillus ferrooxidans son más elevadas, esto es para
las muestras 3, 5 y 6. Por otro lado, en los casos en que una de las dos bacterias disminuye su
concentración considerablemente o desaparece, como se ve en la Tabla VI en el caso de
Acidithiobacillus thiooxidans en las muestras 8, 9 y10, la concentración de Cu disuelto
disminuye.
57
Concentración Cu [g/l]
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
28
35
40
47
56
78
88
92
96
tiempo [días]
Gráfico 3. Análisis de Cu disuelto en solución de refino para cada muestra de solución de refino proveniente de
columna de biolixiviación de Sociedad minera El Abra. Cada columna corresponde a una muestra, cuya variable
tiempo corresponde al día de recepción de la muestra.
Lo anterior da cuenta de la importancia de Acidithiobacillus thiooxidans como agente
oxidante de azufre reducido, y por lo tanto como generador de ácido sulfúrico. Su capacidad de
generar ácido sulfúrico provoca una disminución en el pH de la solución, lo que podría explicar
la disminución de pH entre las muestras 2 y 5. En este caso según la Tabla VI, para la muestra 2
se obtuvo una concentración de 80.000 UG/ml de Acidithiobacillus thiooxidans, lo que se traduce
en un incremento en la concentración de ácido sulfúrico que tiene su efecto bajando el pH de la
columna, lo que se puede ver en el Gráfico 2 alrededor del día 35. Por otro lado, la concentración
de sulfato se eleva con el aumento de concentración de Acidithiobacillus thiooxidans, y luego
baja progresivamente hasta la muestra 5 con la disminución de concentración del
microorganismo. El Gráfico 4 presenta la variación de la concentración de sulfato entre las
distintas muestras analizadas.
58
Concentración Sulfato [g/l]
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
28
35
40
47
56
78
88
92
96
tiempo [días]
Gráfico 5. Análisis de sulfato para cada muestra de solución de refino proveniente de columna de biolixiviación de
Sociedad minera El Abra. Cada columna corresponde a una muestra cuya variable tiempo corresponde al día de
recepción de la muestra.
En la Figura 14 se ve la foto de un gel de electroforesis con las resultados de la
cuantificación de Sulfobacillus thermosulfidooxidans para una de las muestras de solución de
refino.
Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de S. thermosulfidooxidans en
muestra de solución de refino. Carril 2-4: dilución 10-1; carril 5-7: dilución 10-2; carril 8-10: dilución 10-3; carril:
marcador de peso molecular 1Kb.
Este microorganismo se logró detectar en sólo siete muestras de las diez totales, como se
aprecia en la Tabla VII.
59
Tabla VII. Resultados de la cuantificación de Sulfobacillus thermosulfidooxidans presente en
soluciones de refino, expresado como concentración en Unidades genómicas (UG) por ml.
Calibración
Muestra
1
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
UG/100ml
UG/ml
UG/ml
P1
3
3
3
0
0
0
0
8000
8x101
1x108
P2
3
3
2
0
0
0
0
1400
1,4x101
1,75x107
P3
3
3
3
0
0
0
0
8000
8x101
1x108
P4
3
3
0
0
0
0
0
800
8x100
1x107
P5
3
3
3
3
0
0
0
80000
8x102
1x109
P6
3
3
3
0
0
0
0
8000
8x101
1x108
P7
3
3
3
1
0
0
0
11000
1,1x102
1,38x108
P8
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
P9
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
P10
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
En esta tabla se entregan los resultados de la cuantificación y las concentraciones de UG
del microorganismo encontradas para cada muestra. Las concentraciones de UG encontradas para
este microorganismo son inferiores a las correspondientes a Acidithibacillus ferooxidans y a
Acidithibacillus thiooxidans, en la mayoría de las muestras. Esto puede deberse a su condición de
bacteria termófila, por la cual su crecimiento óptimo ocurre a temperaturas entre 45ºC y 50ºC, por
lo tanto en ambientes de bacterias mesófilas su crecimiento se ve disminuido. Así mismo, las
elevaciones en la concentración de UG pueden atribuirse a elevaciones en la temperatura del
medio, como en el caso de las muestras 1, 3, 6 y 7. Por otro lado, su mayor concentración
coincide en número con las concentraciones de Acidithiobacillus ferooxidans y Acidithiobacillus
thiooxidans, que a su vez determina la mayor concentración de Cu soluble (ver Gráfico 3).
En el Gráficos 5, se presentan los resultados de la dinámica poblacional en el tiempo para
las tres bacterias identificadas.
60
Concnetración [UG/ml]
900
800
700
600
ST
500
AF
400
300
A
200
100
0
0
28
35
40
47
56
78
88
92
96
Concentración [UG/ml]
tiempo [días]
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
AT
B
0
28
35
40
47
56
78
88
92
96
tiempo [días]
Gráfico 6. Dinámica poblacional bacteriana de muestras de solución de refino provenientes de columna de
biolixiviación de Sociedad minera El Abra. Gráfico A: variación de Acidithiobacillus ferrooxidans (columnas
verdes) y Sulfobacillus thermodulfidooxidans (columnas amarillas). Gráfico B: variación de Acidithiobacillus
thiooxidans.
En el gráfico anterior se puede apreciar que el comportamiento de Acidithiobacillus
ferooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans, presenta cierta semejanza, aún cuando la
concentración de éste último es menor a la de Acidithiobacillus ferooxidans. Ambos son
microorganismos que oxidan Fe y compuestos reducidos de azufre, por lo que sus variaciones
deberían
ser
semejantes.
Sin embargo,
como
se
dijo
anteriormente,
Sulfobacillus
thermosulfidooxidans es un microorganismo termófilo, lo que explica su menor crecimiento en
ambientes de microorganismos mesófilos.
61
Finalmente, dado que no se trata de un ambiente controlado no es posible establecer
relaciones precisas y certeras entre la concentración de un determinado microorganismo y los
parámetros de la solución del proceso, como ocurre en la mayoría de los estudios realizados hasta
ahora. En el caso de Leptospirillum ferrooxidans, diversos trabajos [8, 25] avalan la tendencia de
esta especie de predominar por sobre Acidithiobacillus ferrooxidans a concentraciones elevadas
de Fe+3. Sin embargo, se trata de estudios llevados a cabo bajo ambientes diseñados
especialmente a escala de laboratorio, donde los nutrientes, pH, T, Eh, etc., de la solución fueron
controlados. Esto puede ser la causa de la imposibilidad de establecer la misma tendencia en el
presente trabajo. Esto hace que los resultados obtenidos no se correlacionen exactamente con la
información disponible.
Sin embargo, la mayor importancia de la técnica cuya implementación se presenta en este
trabajo, radica en que permite identificar y cuantificar especies directamente desde muestras de
soluciones de refino de procesos industriales, sin previo enriquecimiento. Esto es un avance en el
estudio de poblaciones bacterianas de procesos reales de biolixiviación.
62
4
CAPÍTULO IV: Conclusiones
Con los resultados obtenidos para cada una de las actividades realizadas y en base a los
objetivos planteados al inicio de este trabajo se puede concluir que:
Se diseñó, mediante el uso de herramientas computacionales y bases de datos disponibles
en internet, primers específicos para la amplificación del gen 16S rDNA de Acidithiobacillus
thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans. Sin embargo, problemas de contaminación de
cultivos hacen necesario un nuevo estudio sobre su especificidad.
Mediante la técnica de PCR, fue posible detectar en muestras de soluciones de proceso la
presencia de Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus
thermosulfidooxidans. En el caso de Acidithiobacillus ferrooxidans se detectó su presencia en
todas las muestras analizadas, mientras que Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus
thermosulfidooxidans se detectaron sólo en el 70% de las muestras.
No se detectó la presencia de Leptospirillum ferrooxidans en ninguna de las muestras
analizadas, así como tampoco en muestras de mineral; o más bien no se encontraba en
concentraciones detectables. Sin embargo, fue probada con éxito la eficiencia de los partidores en
muestra de cultivo puro de esta especie.
Se llevó a cabo la cuantificación de Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus
thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans, mediante NMP-PCR Con lo que se obtuvo una
medida de concentración de UG de cada especie, para cada muestra en estudio. Por no haberse
detectado Leptospirillum ferrooxidans, este no fue cuantificado.
Acidithiobacillus ferrooxidans es la única especie común en todas las muestras, aún para
los niveles detectados de Fe+3 más elevados, 8.700 mg/l. Así mismo, este nivel coincide con la
63
concentración más baja de UG y con el Eh más elevado. Sin embargo, no se trata de una
concentración lo suficientemente elevada como para inhibir su crecimiento y favorecer el
crecimiento de Leptospirillum ferrooxidans.
La calibración de la técnica arroja una diferencia de hasta 6 órdenes de magnitud entre el
uso de la técnica de NMP-PCR y la técnica de recuento directo. Esta diferencia da cuenta de
problemas propios de la técnica de cuantificación utilizada, como la pérdida de células en la etapa
de extracción de DNA. Sin embargo, podría establecerse algún tipo de correlación entre la
cantidad obtenida por medio de NMP-PCR y el recuento directo de cultivos puros.
No fue posible establecer una relación entre las poblaciones bacterianas y la composición
de las soluciones, tal como se ha obtenido en trabajos anteriores. Esto principalmente debido a la
diferencia de las condiciones experimentales, es decir los registros que existen son en base a
procesos a escala de laboratorio y con parámetros controlados. Esto hace que los resultados
obtenidos no se correlacionen exactamente con la información disponible.
Se trató de establecer una relación entre el cobre disuelto (como una medida de la
recuperación de cobre) y la concentración de los microorganismos. Así, se estableció que la
mayor concentración de Cobre disuelto, o recuperación de Cu, se obtuvo cuando
Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans, estaban presentes. Mientras que la
disminución de alguno de ellos se traduce en la disminución del metal en solución. Lo que
concuerda con las observaciones de que la presencia de ambos microorganismos significa
mayores niveles de recuperación de cobre.
En resumen, en este trabajo se presenta una técnica cuya implementación aún se está
trabajando, cuya mayor importancia es permitir identificar y cuantificar especies directamente
desde muestras de soluciones de refino de procesos industriales, sin previo enriquecimiento. Sin
embargo, debe ser validada mediante el uso de otras técnicas de cuantificación sobre muestras del
mismo origen. De cualquier forma, es un avance en el estudio de poblaciones bacterianas de
procesos reales de biolixiviación.
64
5
5.1
ANEXOS
ANEXO I. COMPOSICIÓN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
En las tablas VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV y XV se entregan las composiciones de cada
reactivo usado en la etapa de extracción de DNA genómico. Además de la composición de los
reactivos usados en electroforesis.
Tabla VIII. Composición Buffer A2X.
Compuesto
Concentración [mM]
Tris HCL pH 8.0
200
EDTA
50
NaCl
200
Citrato de Na
2
CaCl2
10
Tabla IX. Composición Buffer de lavado.
Compuesto
Concentración (v/v)
Buffer A2X
50%
Glicerol
25%
Agua destilada
25%
Tabla X. Composición Buffer lavado de mineral.
Compuesto
Concentración
Tris HCL pH 7.6
50mM
EDTA
50mM
Sacarosa
20% p/v
65
Tabla XI. Composición Buffer TE.
Compuesto
Concentración [mM]
Tris HCL
10
EDTA pH 8.0
1
Tabla XII. Composición Buffer de carga 6X.
Compuesto
Concentración
Glicerol
30% v/v
Azul de bromofenol
0.25% p/v
Tabla XIII. Composición Buffer TAE 50X.
Compuesto
Concentración
Tris HCL
24.2% p/v
Ácido acético glacial
5.71% v/v
EDTA 0.5M pH 8.0
10% v/v
Tabla XIV. Composición Buffer de almacenamiento.
Compuesto
Concentración [mM]
Tris HCL pH 7.5
100
NaCl
200
Tabla XV. Composición de estándar de peso molecular, 1Kb.
Compuesto
Concentración (v/v)
Buffer de almacenamiento
10%
Estándar de peso molecular
10%
Buffer de carga 6X
16.5%
66
Todas las soluciones son preparadas con agua destilada, a excepción de buffer TAE 50X
que fue preparado con agua desionizada. Los pH fueron ajustados con H2SO4 o NaOH
concentrado según lo requerido, excepto en el caso de Tris HCl cuyo pH fue ajustado con HCl.
Las tablas XVI y XVII contienen la composición de los medios de cultivo MC y 9K
modificado, usados para el cultivo de Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum
ferrooxidans, respectivamente.
Tabla XVI. Composición medio MC.
Compuesto
Concentración [g/l]
(NH4)2SO4
0.4
MgSO4x7H2O
0.4
K2HPO4x3H2O
0.056
Tabla XVII. Composición medio 9K Modificado.
Compuesto
Concentración [g/l]
(NH4)2SO4
0.2
MgSO4x7H2O
0.4
K2HPO4x3H2O
0.1
Para la preparación de los medios de cultivo se disolvieron las sales en 1 litro de agua y el
pH se ajustó con H2SO4 concentrado a 1.6 para el medio MC y 1.7 para el medio 9K modificado.
Luego se esterilizan mediante calor húmedo por 15 minutos.
67
5.2
ANEXO II. MÉTODOS
5.2.1 Electroforesis en gel de agarosa
•
Pesar 0.8 o 1.2 gramos de agarosa, dependiendo del uso que se le dará al gel (para DNA
genómico o producto de PCR). Disolver en 100ml de Buffer TAE 1X en horno
microondas agitando cada 20 segundos hasta disolver completamente.
•
Adicionar 10μl de Bromuro de Etidio a la mezcla tibia.
•
Armar la cámara de electroforesis con las peinetas correspondientes. Luego agregar la
agarosa disuelta hasta que las peinetas queden levemente sumergidas y se forme el
pocillo.
•
Una vez sólida la agarosa cubrir con Buffer TAE 1X y luego retirar las peinetas.
•
Cargar las muestras en el gel. Para esto se mezcla 5μl de muestra de DNA y 3μl de Buffer
de carga 6X. Luego el volumen total se carga en uno de los pocillos del gel.
•
Cargar 5μl de estándar de peso molecular.
•
Correr el gel por 40 minutos a 100Volts.
•
Retirar el gel de la cámara y visualizar en transiluminador UV.
Usar guantes para manipular el Bromuro de etidio y la agarosa, y lentes con protección UV para
manipular el transiluminador.
5.2.2 Protocolo determinación de fierro
Determinación de ferroso.
•
Tomar 0.1ml de muestra diluida hasta una concentración de 100ppm de ferrroso.
•
Agregar 0.4ml de solución de fenantrolina. Agitar.
•
Agregar 2 ml de agua destilada. Agitar.
•
Leer absorbancia a 510nm contra blanco.
68
Determinación de Fierro total.
•
Tomar 0.1ml de muestra diluida hasta una concentración de 100ppm de ferroso
•
Agregar 0.1ml de hodroxilamina. Agitar.
•
Agregar 0.4ml de solución de fenantrolina. Agitar.
•
Agregar 1.9ml de agua destilada. Agitar.
•
Leer absorbancia a 510nm contra blanco.
Determinación de ferroso en soluciones con alta concentración de férrico.
•
Tomar 0.1ml de muestra sin diluir.
•
Agregar 1ml de solución NaF 0.5M en tubo plástico. Agitar.
•
Agregar 0.4ml de solución de fenantrolina. Agitar.
•
Agregar 1ml de agua destilada. Agitar.
•
Leer absorbancia a 510nm contra blanco.
Las diluciones de la muestra original son hechas en agua ácida (pH 1.6).
5.3
ANEXO IV. CEPAS UTILIZADAS EN EL DISEÑO DE PRIMERS
5.3.1 Acidithiobacillus thiooxidans
Cepas utilizadas en el diseño.
1. S000018546 Acidithiobacillus thiooxidans; ATCC 19377; AJ459803
2. S000018551 Acidithiobacillus thiooxidans; B-53; X75269
3. S000021079 Acidithiobacillus thiooxidans; "ATCC19377 = type strain"; Y11596
69
4. S000467259 Acidithiobacillus thiooxidans; OGCS3; AY830898
5. S000467260 Acidithiobacillus thiooxidans; ONAS8; AY830899
6. S000467261 Acidithiobacillus thiooxidans; ORCS8; AY830900
7. S000467262 Acidithiobacillus thiooxidans; OYCS3; AY830901
8. S000467263 Acidithiobacillus thiooxidans; NBRC13701; AY830902
9. S000474032 Acidithiobacillus thiooxidans; WJSo; AY495961
10. S000538630 Acidithiobacillus thiooxidans; DQ067562
11. S000630428 Acidithiobacillus thiooxidans; PIAC10; AY552079
12. S000630429 Acidithiobacillus thiooxidans; COSI13.1; AY552080
13. S000630430 Acidithiobacillus thiooxidans; SACA46; AY552081
14. S000630437 Acidithiobacillus thiooxidans; DAMS; AY552088
15. S000630439 Acidithiobacillus thiooxidans; Sed6.3; AY552090
16. S000630441 Acidithiobacillus thiooxidans; CASQ23; AY552092
17. S000712735 Acidithiobacillus thiooxidans; SZS; DQ676508
Cepas de Acidithiobacillus Thiooxidans que reconocen entre ambos partidores.
1. S000018546 Acidithiobacillus thiooxidans; ATCC 19377; AJ459803
2. S000018551 Acidithiobacillus thiooxidans; B-53; X75269
3. S000021079 Acidithiobacillus thiooxidans; "ATCC19377 = type strain"; Y11596
4. S000467259 Acidithiobacillus thiooxidans; OGCS3; AY830898
5. S000467260 Acidithiobacillus thiooxidans; ONAS8; AY830899
6. S000467261 Acidithiobacillus thiooxidans; ORCS8; AY830900
7. S000467262 Acidithiobacillus thiooxidans; OYCS3; AY830901
8. S000467263 Acidithiobacillus thiooxidans; NBRC13701; AY830902
9. S000474032 Acidithiobacillus thiooxidans; WJSo; AY495961
10. S000538630 Acidithiobacillus thiooxidans; DQ067562
11. S000630428 Acidithiobacillus thiooxidans; PIAC10; AY552079
12. S000630429 Acidithiobacillus thiooxidans; COSI13.1; AY552080
13. S000630430 Acidithiobacillus thiooxidans; SACA46; AY552081
14. S000630431 Acidithiobacillus thiooxidans; BRAN50; AY552082
15. S000630432 Acidithiobacillus thiooxidans; STAM61; AY552083
70
16. S000630434 Acidithiobacillus thiooxidans; QUEI69; AY552085
17. S000630436 Acidithiobacillus thiooxidans; ATCC 19377; AY552087
18. S000630437 Acidithiobacillus thiooxidans; DAMS; AY552088
19. S000630438 Acidithiobacillus thiooxidans; Sed3.3; AY552089
20. S000630439 Acidithiobacillus thiooxidans; Sed6.3; AY552090
21. S000630441 Acidithiobacillus thiooxidans; CASQ23; AY552092
22. S000712735 Acidithiobacillus thiooxidans; SZS; DQ676508
23. S000712738 Acidithiobacillus thiooxidans; BY-s; DQ676511
5.3.2 Sulfobacillus thermosulfidooxidans
Cepas utilizadas en el diseño.
1. S000006675 Sulfobacillus thermosulfidooxidans (T); AT-1; X91080
2. S000148467 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; DSM 9293; AB089844
3. S000438420 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; BC1; U75648
4. S000460459 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; G2; AY140233
5. S000712407 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; YN22; DQ650351
Cepas de Sulfobacillus thermosulfidooxidans que reconocen entre ambos partidores.
1. S000006675 Sulfobacillus thermosulfidooxidans (T); AT-1; X91080
2. S000148467 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; DSM 9293; AB089844
3. S000438420 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; BC1; U75648
4. S000460459 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; G2; AY140233
71
5.4
ANEXO V. TABLA DE NMP
Combinación
de
positivos
0 0 0
0 0 1
0 1 0
0 2 0
Combinación
de
positivos
4 2 0
4 2 1
4 3 0
4 3 1
4 4 0
NMP/100ml
<2
2
2
4
1
1
1
1
1
0
0
1
1
2
0
1
0
1
0
2
4
4
6
6
2
2
2
2
2
2
0
0
1
1
2
3
0
1
0
1
0
0
5
7
7
9
9
12
3
3
3
3
3
3
0
0
1
1
2
2
0
1
0
1
0
1
8
11
11
14
14
17
4
4
4
4
4
0
0
1
1
1
0
1
0
1
2
13
17
17
21
26
72
NMP/100ml
22
26
27
33
34
5
5
5
5
5
5
0
0
0
1
1
1
0
1
2
0
1
2
23
31
43
33
46
63
5
5
5
5
5
5
2
2
2
3
3
3
0
1
2
0
1
2
49
70
94
79
110
140
5
5
5
5
5
5
3
4
4
4
4
4
3
0
1
2
3
4
180
130
170
220
280
350
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
0
1
2
3
4
5
240
350
540
920
1600
≥2,400
5.5
ANEXO VI. FECHA DE RECEPCIÓN DE MUESTRAS
Tabla XVIII. Fecha de recepción de muestras de refino
Fecha
Día
Muestra
17-Ago
0
P1
14-Sep
28
P2
21-Sep
35
P3
26-Sep
40
P4
03-Oct
47
P5
12-Oct
56
P6
03-Nov
78
P7
13-Nov
88
P8
17-Nov
92
P9
21-Nov
96
P10
73
6
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