UNIDAD DIDÁCTICA 3 TÉCNICAS DE LABORATORIO

UNIDAD DIDÁCTICA 3
TÉCNICAS DE LABORATORIO UTILIZADAS EN EL LABORATORIO
DE ALIMENTOS
Capítulo 8. Generalidades
La amplia variedad microbiana encontrada en los alimentos debe ser aislada
preliminarmente utilizando medios de cultivo apropiados para el ciclo de crecimiento
y reproducción de cada microorganismo. Esto facilita enormemente la identificación
del microorganismo asociado a una enfermedad de transmisión por alimentos.
Igualmente, esta identificación se corrobora con técnicas microscópicas y tinciones
especiales que permiten diferenciar las estructuras bacterianas, mejorando así la
observación en las muestras del laboratorio.
Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:
Lección 37. Microscopía
Lección 38. Preparación en fresco
Lección 39. Tipos de tinción
Lección 40. Medios de cultivo
Lección 37. Microscopía
La utilización del microscopio es fundamental en la identificación de los
microorganismos pues es el instrumento que permite visualizar aquello que no se
puede ver a simple vista. La observación en el microscopio se logra mediante dos
factores principalmente: aumento y resolución.
Aumento
La capacidad que tiene el microscopio para amplificar un objeto es fundamental
para que el ojo pueda apreciar con precisión e independencia las características de
lo que observa y así identificar claramente el microorganismo presente en la
preparación. Normalmente se expresa por el signo “x” y luego el número de
ampliación del objetivo: 4x, 10x, 40x y 100x.
Resolución
Se refiere a la capacidad que tiene el microscopio para dar imágenes distintas de
puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto que se está observando.
El manejo del microscopio es un conocimiento previo que debe recordarse del
estudio anterior en el curso de biología. El estudiante debe ubicar este tema en el
curso mencionado de biología, página Web de la UNAD, en las siguientes
direcciones1:
Video: el Microscopio parte 1
Vídeo: El microscopio parte 2
Manual de Prácticas de Biología: Microscopia Páginas 15 a 43
Lección 38. Preparaciones en fresco
Para este caso los microorganismos se pueden observar in vivo o en fresco y
corresponde a la forma más simple de observación. Existen principalmente dos tipos
de técnicas utilizadas para este tipo de preparaciones:
1
Piña, C. Manual de laboratorio. Curso Biología. UNAD.
En fresco
Este método microscópico permite observar el microorganismo vivo y conocer sus
características, morfología, color, tamaño real, movimiento, evita las deformaciones
de su morfología producidas por las técnicas de coloración y fijación.
Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos
intestinales como Entamoeba hystolitica, huevos y quistes de otros parásitos (como
el caso de las tenias y ascaris), larvas y gusanos adultos, hifas de hongos, Candida,
etc.
Gota Pendiente
En este tipo de observación microscópica se construye una “pequeña cámara
cerrada” que permite la observación continua de la movilidad bacteriana o el
crecimiento de células individuales de un microcultivo.
Lección 39. Tipos de tinciones
La mayoría de los microorganismos son incoloros lo que dificulta la identificación de
los mismos. Por esto se requiere someterlos a tinciones que permitan el contraste
de sus estructuras y se facilite la observación. Lo primero que se debe hacer es
tomar una muestra previa y realizar un frotis o extendido, es decir colocar una
película del microorganismo sobre la lámina portaobjetos y dejarla secar al aire.
Antes de teñir el microorganismo, a partir del frotis, es necesario realizar un
procedimiento denominado Fijación y que permite preservar la morfología y
composición química de la célula. Consiste en la muerte del organismo o célula que
se quiera observar, de manera que las estructuras que poseía en estado vivo se
conservan con un mínimo de artificios. La fijación puede ser mediante sustancias
químicas (acetona, formaldehido, tetróxido de osmio, entre otros) o por acción del
calor (flameado).
En general, los colorantes utilizados son sales compuestas por un ión positivo y un
ión negativo, uno de los cuales está coloreado y se conoce como cromóforo. El color
de los denominados colorantes básicos está en el ión positivo; en los colorantes
ácidos, está en el ión negativo. En un pH 7 las bacterias presentan una carga
levemente negativa, por lo tanto, el ión positivo coloreado en un colorante básico es
atraído hacía la célula bacteriana con carga negativa. Los colorantes básicos se
utilizan más que los ácidos, debido a que estos últimos no son atraídos por la mayor
parte de las bacterias pues la superficie bacteriana con carga negativa repele los
iones negativos del colorante, de modo que este tiñe el fondo y no la estructura
bacteriana2.
Entre los colorante básicos más usados están: azul de metileno, fuscina básica,
cristal violeta y safranina. Los colorantes ácidos se utilizan para teñir tejidos
animales infectados de microorganismos: fuscina ácida, eosina y rojo Congo.
En microbiología de alimentos el recuento directo de microorganismos utilizando
métodos microscópicos es limitado, debido a la dificultad en la identificación y en el
recuento bacteriano. Sin embargo, el análisis microscópico de una muestra
alimenticia puede dar un panorama previo de los microorganismos presentes en el
alimento.
Existen dos tipos de técnicas de tinción utilizadas en el área de alimentos:
Tinción simple
Esta tinción permite destacar el microorganismo completo para que se vean las
formas y las estructuras celulares básicas y normalmente se utiliza como una
solución acuosa o alcohólica de un colorante básico único.
Algunas veces es necesario aplicar una sustancia química que intensifica la
coloración y que se conoce como mordiente. Esta sustancia tiene funciones como:
aumentar la afinidad de un muestra biológica por un colorante, cubrir una estructura
(por ejemplo, un flagelo) para darle mayor espesor y/o facilitar la observación
después del teñido.
En el laboratorio las tinciones simples más utilizadas son: Azul de metileno,
carbolfucsina, el violeta de genciana (cristal violeta) y la safranina. Permiten
identificar las cepas del yogurt y el vinagre (cocos, bacilos y estreptococos).
En el caso de los hongos y levaduras la tinción más utilizada es el azul de lactofenol.
Tinción diferencial
Se utiliza para poder distinguir entre los diferentes tipos de bacterias o sus
estructuras intracelulares. El primer colorante es el primario, que actúa como una
tinción simple. Luego se hace la diferenciación, que consiste en aplicar una solución
que quita el colorante primario a algunas células, bacterias o estructuras. El
siguiente colorante es el colorante secundario o de contraste, que como su nombre
lo indica permite contrastar estructuras o células para poder diferenciarlas.
La tinción diferencial más utilizada en el área de microbiología es la tinción de Gram
y se utiliza para diferenciar las bacterias en dos grandes clases: grampositivas y
2
Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición.
Buenos Aires. p 69.
gramnegativas, además de permitir identificar la morfología celular bacteriana
(cocos, bacilos, positivos, negativos.) Esta tinción se denominó así por el
bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844.
Como ya se mencionó, sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram-positivas y Gram-negativas (en
este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrica,
sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las
bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares.
La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente,
80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano.
La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más
delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la
pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano.
Lección 40. Medios de cultivo
Para la adecuada identificación de un microorganismo, además de la observación
microscópica y la tinción, se hace necesario que haya un crecimiento de la bacteria
en condiciones controladas de temperatura, oxígeno y fuente de carbono, entre
otros. Esto es lo que se conoce como cultivo de un microorganismo.
Dicho crecimiento, para que sea totalmente controlado, se realiza en condiciones
de laboratorio, y en sustratos llamados medios de cultivo, que contienen los
nutrientes necesarios para el adecuado crecimiento microbiológico.
Clases de medios de cultivo
El tipo de medio de cultivo a utilizar depende del microorganismo de interés y de la
necesidad de realizar ese cultivo. Los medios se pueden utilizar para el crecimiento
de una especie o para diferenciar entre cepas o especies.
En la literatura se encuentran diferentes formas para clasificar los medios de cultivo
utilizados en el laboratorio. A continuación se enumeran algunas:
Según su consistencia o estado físico pueden ser:
1. Líquidos o caldos, que se emplean fundamentalmente para cultivar los
microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos; para
la producción de metabolitos específicos y estimular y promover la
selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se
multipliquen.
2. Semisólidos, que se utilizan para identificaciones bioquímicas y
averiguar si el microorganismo estudiado es móvil. Los medios
semisólidos tienen una consistencia blanda.
3. Sólidos o Agares, que se utilizan para obtener colonias aisladas de
microorganismos. A diferencia de los líquidos se les agrega Agar. El
agar es un polisacárido acídico producido por ciertas algas rojas, es
un elemento solidificante que se licúa completamente a la temperatura
del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. El agar se
usa a una concentración del 1,5%. Con mínimas excepciones no tiene
efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por
aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante pero
se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su
licuación.
Según su utilidad práctica pueden ser:
1. No selectivos o generales: permiten el cultivo y crecimiento de una amplia
gama de microorganismos. Por ejemplo, Caldo nutritivo, Agar nutritivo, Agar
Soya Tripticasa (TSA), Agar marino 2216 o Zobell. A menudo están
enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, Factor X,
Factor V, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las
bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.).
2. Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) permiten el
aislamiento y crecimiento del microorganismo o grupo de microorganismos
de interés, para lo cual se manipulan factores ya sean de tipo nutricional o de
tipo ambiental. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto
químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que
inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. En el
caso de utilizar factores nutricionales, se añaden al medio de cultivo
sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de microorganismos,
permitiendo a la vez el crecimiento de otros.
Los antibióticos, el cloruro sódico en altas concentraciones, colorantes y algunas
sustancias químicas, son ejemplos de agentes selectivos que se añaden a los
medios para inhibir el crecimiento de otros microorganismos diferentes al de interés.
El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de
polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una
grave intoxicación alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta
bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium.
Un ejemplo de la acción de los colorantes que inhiben selectivamente determinados
microorganismos, es el verde brillante (Agar verde brillante), utilizado para
establecer la presencia de Salmonella en heces fecales, ya que inhibe las bacterias
Gram
positivas
y
la
mayoría
de
las
bacterias
intestinales.
Para el caso de los factores ambientales se puede manipular la temperatura, el
grado de humedad, el pH, la concentración de oxígeno o la intensidad de la luz. Son
ejemplo de este tipo de medios: Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis, Sacarosa
(TCBS) para cultivo de Vibrio y Agar Cetrimida para cultivo de Pseudomonas.
Otros medios de cultivo utilizados son:
Enriquecidos: suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando
el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).
Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que
satisfacen requerimientos de grupos específicos de microorganismos, ayudando a
su identificación (Lowenstein). En los diferentes medios de cultivo se encuentran
numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre
completa, bilis, etc. En el caso de los hidratos de Carbono se adicionan por dos
motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar
reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos, por
ejemplo el caso de la lactosa.
Diferenciales: permiten distinguir unos microorganismos de otros por las
características que presentan las colonias. Para estos medios de cultivo se tienen
en cuanta principalmente las características fisiológicas específicas de los
microorganismos, por ejemplo, nutrición, respiración, entre otras. Algunos medios
diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la
degradación de un nutriente específico (generalmente un azúcar) por el cambio de
color que se origina cuando éste es metabolizado. Los colorantes que se añaden a
estos medios actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de
ácido. Un ejemplo es el medio Rojo Fenol, que es de color rojo en pH básico y
amarillo en pH ácido.
Utilizando el cultivo de microorganismos en medio diferencial se pueden distinguir
las bacterias que fermentan la lactosa (con producción de ácido) de las no
fermentadoras.
Otros componentes como los colorantes actúan inhibiendo el crecimiento de cierto
grupo de microorganismos, por ejemplo la Violeta de Genciana impide el
crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas.
Algunos medios pueden ser a la vez selectivos y diferenciales. El agar Mac Conkey
es un ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal
violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas (acción selectiva); la
fermentación de lactosa con liberación de productos ácidos hace virar un indicador
de pH incorporado en el medio (acción diferencial).
El agar sangre es un agar que contiene hematíes y permite reconocer los
microorganismos que producen hemólisis. Por ejemplo para aislar la bacteria que
causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre. Las colonias de esta
bacteria producen hemólisis, es decir, muerte y lisis de los hematíes generando una
zona transparente a su alrededor.
El Agar eosina-azul de metileno (EAM) permite identificar el crecimiento de
coliformes y E. coli. Este medio contiene peptona, lactosa y los colorantes eosina y
azul de metileno. En dicho medio se inhibe el crecimiento de otras bacterias, pero
no el de las coliformes (éstas desarrollan colonias típicas). E. coli muestra colonias
grandes, oscuras, negro-azuladas, centro casi negro, con brillo metálico verdoso
causado por la luz reflejada. La presencia de coliformes como Enterobacter se
manifiesta en colonias grandes, de color rosado pálido, mucosas, con centro oscuro
y sin brillo metálico.
Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi
cualquier bacteria.
Lectura de profundización sobre el cultivo de microorganismo y que
incluye medios de cultivo, métodos de aislamiento y crecimiento
bacteriano. Fuente: Universidad de Navarra. Instituto de
agrobiotecnología.
¿Qué significa resolución en un microscopio?
Preguntas
de repaso
¿Por qué es útil la identificación de Gram para recetar un tratamiento
antibiótico?
¿Cómo se relaciona el metabolismo microbiano con los medios de
cultivo utilizados?
Para qué sirve la microbiología?
Los microorganismos por sí solos no son capaces de causar daño, pero gracias a
los procesos evolutivos han logrado organizarse y convivir con especies diferentes,
de manera que se relacionan simbióticamente unos a otros, logrando así un mayor
poder de acción. Esto lo han hecho gracias a la posibilidad que tienen de formar lo
que se conoce como biofilms o biopeliculas: agrupación de bacterias formando una
biomasa en torno a una superficie cualquiera. Mediante a la observación directa con
el microscopio láser cofocal de barrido (CSML), el cual permite ver el biofilm
bacteriano in vivo, en tiempo real y completamente hidratado, se ha demostrado
claramente que la mayoría de biofilms están formados por microcolonias de células
bacterianas (15-20% volumen), envueltas en una densa matriz polimérica
extracelular (75-80%) con marcados canales de agua (Londoño, 2006). Un ejemplo
de la acción de estos biofilms es el V. cholerae, que gracias a esta forma de
organización, puede sobrevivir en el océano y resistir la acción del ácido estomacal.
Una vez el Vibrio atraviesa el estómago, las células individualmente se separan del
biofilm y colonizan el intestino donde empieza a producir su patología
característica3.
Capitulo 9. Técnicas de cultivo en alimentos
En general las bacterias requieren una serie de condiciones estándar para su
crecimiento y desarrollo, sin embargo existe un grupo de microorganismos que
necesita ambientes y nutrientes especiales para poder crecer, aislarse y ser
identificados en los alimentos. Esto hace necesario que deba haber claridad en las
diferentes técnicas de recuperación y caracterización de los microorganismos
causantes de una enfermedad o de la descomposición de un alimento, de manera
que el control y erradicación del microorganismo sea mucho más efectivo y
finalmente se obtenga un producto apto para el consumo humano.
Las lecciones que se encuentran en este capítulo son:
Lección 41. Técnica de diluciones seriadas
Lección 42. Sistemas de siembra y recuento de colonias
Lección 43. Técnicas de cultivo
Lección 44. Técnicas de identificación de microorganismos
Lección 45. Técnicas microbiológicas utilizadas en la evaluación de ambientes
Lección 41. Técnica de diluciones seriadas
3
Zambrano, M.A. y Suárez, L. 2006. Biofilms bacterianos. Universitas Odontológica. PUJ. 19-25p.
Cuando la muestra del alimento debe ser analizada microbiológicamente es
necesario realizar una serie de diluciones seriadas, que facilitan el recuento final de
microorganismos presentes en dicho alimento. La muestra original se diluye para
que el número de colonias desarrolladas en la placa, se encuentren entre 30 y 300
colonias y así permitir un óptimo crecimiento y facilitar la lectura. Cuando la muestra
se diluye, el cálculo del resultado se realiza contando las colonias en aquellas placas
que tengan entre 30 y 300 colonias, se promedia y se multiplica por el factor de
dilución (Figura 28).
El diluyente utilizado no debe afectar la viabilidad ni reproducción de los
microorganismos. Los diluyentes más utilizados son: Agua de peptona tamponada
(0,1%), solución salina isotónica y caldo de Tristona-sal.
Lección 42. Sistemas de siembra y recuento de colonias
La cantidad de microorganismos presentes en un alimento depende del tipo de
proceso al que se someta, su transporte y manipulación. Antes de que un alimento
se analice microbiológicamente se le deben hacer diluciones seriadas para que el
recuento de colonias sea ajustado a la realidad y a partir de estas diluciones
sembrar.
Figura 28. Técnica de diluciones seriadas. Se observa el procedimiento práctico para la realización de esta técnica,
ampliamente utilizada en el área de los alimentos y la farmacéutica.
Fuente:http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/
documen/uni_02/58/texthtml/cap804.htm
La siembra se refiere a la operación de transferir e incorporar la dilución respectiva
a una caja de petri con su correspondiente medio de cultivo. Existen varias formas
de siembra:
La siembra en superficie se realiza cuando, una vez solidificado el agar, se incorpora
la dilución y se extiende sobre la superficie mediante la técnica de estría. Se utiliza
para el recuento de hongos y levaduras.
La siembra en profundidad se realiza cuando la dilución se dispensa primero en la
caja de Petri vacía y luego se adiciona el agar tibio para mezclarlo con la dilución.
Esta técnica se utiliza para el recuento de mesófilos.
Una vez se llevan a incubar los medios de cultivo a los tiempos y temperatura que
requieran los microorganismos para su crecimiento se debe evaluar el recuento de
colonias. Para esto es necesario enumerar las unidades formadoras de colonias
(UFC). El valor de UFC es un valor que expresa el número relativo de
microorganismos de un taxón determinado en un volumen de un metro cúbico de
muestra. Este procedimiento de denomina recuento en placa y que en últimas
determina el número de células que pueden formar colonias en las cajas de petri
observadas.
El recuento de colonias puede hacerse visualmente o con ayuda de un contador
de colonias.
Conociendo el factor de dilución, el volumen del inóculo y el número de colonias
de la placa (o el promedio de las placas duplicadas), el número de
microorganismos del alimento se calcula mediante la siguiente expresión:
Recuento (UFC/ml o g)
Media del número de colonias de placas duplicadas
=
Factor de dilución x Volumen inoculado en la placa
Examen macroscópico de colonias
El examen morfológico de las colonias bacterianas es un paso preliminar importante
para la identificación de las colonias aisladas a partir de los alimentos. Las colonias
bacterianas se caracterizan por ser redondeadas, colonias puntiformes o circulares,
bordes lisos y en algunos casos ondulados y lobulados. Igualmente se observan
diferentes coloraciones.
Las colonias de levaduras son similares a las bacterianas mientras que las colonias
de hongos filamentosos son más grandes y con aspecto algodonoso. El excesivo
desarrollo de los mohos puede dar lugar a dificultades para el recuento.
Para la identificación de un microorganismo, además de sus características
morfológicas, se debe someter a pruebas adicionales bioquímicas, fisiológicas,
serológicas o genéticas. Además, el examen microscópico (tinción simple o
diferencial) es fundamental para la identificación morfológica de la cepa.
Lección 43. Técnicas de cultivo
Las técnicas de cultivo se realizan para enriquecer, enumerar (se refiere al recuento
de colonias) o aislar microorganismos.
Enriquecimiento
Es una técnica que se utiliza cuando la cantidad de microorganismos presentes en
el alimento no es la suficiente para ser detectada por el recuento directo en placa o
para revitalizar microorganismos presentes en el alimento.
El enriquecimiento se realiza en dos pasos fundamentales:
- Preenriquecimiento o enriquecimiento primario, en el cual se utiliza un medio no
selectivo buscando la recuperación del microorganismo de interés. Normalmente no
se utilizan medios extremadamente ricos ni una incubación óptima que favorezcan
el crecimiento acelerado de los microorganismos, pues el objetivo primordial de esta
fase es un aumento moderado en el número de microorganismos para luego pasar
a la siguiente fase.
- Enriquecimiento secundario o selectivo, en esta etapa se hace un subcultivo,
partiendo de la fase anterior, a un caldo selectivo donde, únicamente, crecerá el
microorganismo de interés y se inhibirá el resto de microorganismos.
Se utiliza para la identificación de microorganismos como: Clostridium perfringes,
Listeria monocytogenes, Salmonelas y Escherichia coli O157:H7.
Técnica del Número Más Probable (NMP)
Esta técnica también se conoce como técnica de tubos múltiples (Yousef, 2003) y
se utiliza para determinar el recuento presuntivo de coliformes. Para analizar el
alimento mediante la técnica del NMP la muestra se diluye por la técnica de
diluciones seriadas, como se describió anteriormente y luego se transfiere una
alícuota o muestra a un medio selectivo diferencial, que normalmente es caldo Bilis
Verde Brillante (BRILLA) donde, después de la incubación, se evidencia el
crecimiento de los microorganismos por la turbidez del medio y la reacción típica de
coliformes, que en este caso es la producción de gas a partir de la lactosa y que se
evidencia en los tubos invertidos de Durham. El número de tubos positivos de las
diluciones observadas se convierte en tablas estandarizadas para hallar el NMP. El
NMP se basa en fórmulas de probabilidad y es una estimación de la densidad media
de coliformes en la muestra4.
Aislamiento
El aislamiento de un microorganismo en un alimento se logra siempre que la
muestra, enriquecida o no, se siembra en una placa que contenga un medio
selectivo o selectivo diferencial adecuado. Para esta siembra se utiliza,
principalmente, la técnica de estría.
El cultivo en estos medios es el sistema más confiable para aislar el microorganismo
que se esté investigando.
A continuación se presentan los principales medios utilizados en el aislamiento de
patógenos en alimentos:
Microorganismo
Medio de cultivo utilizado
Agar Baird-Parker
Staphylococcus aureus
Agar manitol sal
Agar ADN azul de toluidina
Listeria monocytogenes
4
Agar Oxford Modificado
(MOX)
Observaciones
Medio selectivo-diferencial:
El S. aureus forma colonias
circulares, negras,
rodeadas por un halo
opaco y una zona clara.
Medio selectivo-diferencial:
El S. aureus produce
cambio de color,
apareciendo una tonalidad
amarilla brillante
Medio diferencial: Detecta
la desoxirribonucleasa del
S. aureus
Medio selectivo-diferencial:
Presenta sustancias
antimicrobianas como el
cloruro de litio, sulfato de
colistina y moxalactamo y
Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit.
Acribia. Zaragoza. España. p.176.
Agar Sulfito Bismuto
Salmonella
Agar Entérico Hektoen
Escherichia coli O157:H7
Caldo modificado para E.
coli con novobiocina
(mEC+N)
Caldo Sorbitol Rojo de
Fenol
que L. monocytogenes
resiste.
Medio selectivo/diferencial:
El bismuto selecciona la
Salmonella frente a
coliformes y Gram positivos
Medio selectivo/diferencial:
presenta componentes que
inhiben el desarrollo de
Gram positivas
Se utiliza para diferenciar y
enumerar coliformes. La
novoviocina impide el
crecimiento de los Gram
positivos y de algunos
Gram negativos, mientras
que la mayor parte de las
enterobacterias son
resistentes al antibiótico.
Confirma E. coli O157:H7
pues este serotipo no
fermenta el sorbitol.
Tabla 6. Principales medios de cultivo utilizados en el aislamiento de microorganismos
asociados a ETA´s.
Fuente: Claudia Zambrano
Lección 44. Técnicas de identificación de microorganismos
Una vez aislado el microorganismo, se han desarrollado una serie de técnicas que
permiten su identificación. Estas técnicas se pueden clasificar en tres grandes
grupos: Pruebas bioquímicas, Pruebas inmunológicas y Pruebas genéticas o
moleculares.
Pruebas Bioquímicas
En este caso se busca determinar las actividades metabólicas específicas de cada
microorganismo mediante la identificación de metabolitos que reaccionan con los
reactivos del medio de cultivo, produciendo virajes en el pH que se manifiestan con
cambios en el color del medio.
Las pruebas bioquímicas pueden ser tan sencillas como transferir una colonia a una
lámina portaobjetos donde haya una gota de peróxido de hidrógeno (H 2O2) y
observar si hay producción de gas. Esta prueba se conoce como Catalasa y permite
diferenciar entre Estafilococos y Estreptococos.
Otro ejemplo es la prueba de fermentación de lactosa, que puede determinarse a
partir de la siembra de agar MacConkey: si las colonias formadas son de color
violeta, indican que son géneros lactofermentadores (E. coli, Klebsiella,
Enterobacter) y si son colonias incoloras se está frente a no lactofermentadores
(Salmonella, Shiguella, Proteus).
Pruebas inmunológicas o serológicas
La importancia de este tipo de pruebas radica en la rapidez, relativa sencillez en el
procedimiento y la especificidad demostrada por la mayoría de las técnicas que
están siendo utilizadas con este objetivo. Además permiten estudios rápidos
epidemiológicos de ETA´s que surjan en la población.
Este tipo de pruebas se fundamentan en el hecho de que los microorganismos son
antigénicos, es decir que cuando ingresan en el cuerpo del humano o de un animal
estimulan la formación de anticuerpos. Los anticuerpos son proteínas que circulan
en la sangre y se unen específicamente con el microorganismo que origino su
producción.
Las pruebas serológicas son muy útiles en la identificación temprana de la hepatitis
A. Los marcadores serológicos de la infección aguda por VHA son Anticuerpos IgM
(IgM anti-VHA) que se logran identificar 5-10 días antes del inicio de los síntomas y
van disminuyendo durante los siguientes 6 meses hasta ser indetectables.
Además, las pruebas serológicas no sólo permiten diferenciar entre especies
bacterianas sino también entre cepas de una misma especie. Las cepas con
diferentes antígenos se denominan serotipos, serovariedades (serovares) o
biovariedades (biovares)5.
Una prueba serológica muy utilizada en el área de alimentos es ELISA (ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas). Esta técnica puede ser:
- Indirecta, que utiliza la detección de anticuerpos producidos por los patógenos
asociados a la enfermedad (utilizada en el campo de la microbiología médica).
- Directa, que detecta los antígenos del patógeno y es la más utilizada en el área de
alimentos.
En la ELISA directa se trabaja con la bacteria desconocida (el agente causal de la
ETA´s) que se introduce en los pocillos de una microplaca que contiene adheridos
anticuerpos conocidos. La reacción entre los anticuerpos conocidos y la bacteria
permite identificar la bacteria. Se utiliza para la detección de Salmonella, pues
permite descartar rápidamente los alimentos negativos, para esta bacteria, con una
5
Tortora, G.J. y col. 2007. Introducción a la microbiología. Edit. Médica Panamericana. 9ª. Edición.
Buenos Aires. p 766.
mayor rapidez. También se utiliza en la identificación de Listeria monocytogenes y
Clostridium perfringes enterotoxigénico y la detección de toxinas bacterianas y
micotoxinas.
Pruebas genéticas o moleculares
Estas pruebas se fundamentan en el hecho que la información genética de una
célula bacteriana se encuentra en el cromosoma y, a veces, en el plásmido. Las
secuencias que conforman el cromosoma son únicas para cada bacteria, lo que es
utilizado para su identificación. Las principales técnicas utilizadas en alimentos son:
- Hibridación de ácido nucleíco, en este caso la molécula de DNA del agente causal
se somete al calor para romper los enlaces de hidrogeno entre los bases y separar
las hebras que conforman el DNA. Luego se enfrían con lentitud las cadenas
separadas para permitir que se unan a sondas de DNA (secuencia conocida y única
de DNA) marcadas con enzimas que facilitan su identificación debido a reacciones
colorimétricas. Este paso es el que se conoce como hibridación. Si una sonda de
DNA se hibrida con DNA de un microorganismo desconocido es posible identificarlo
por la semejanza de sus secuencias. Esta técnica se utiliza en la identificación de
Salmonella.
- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permite la identificación del
microorganismo causal al aumentar la cantidad de DNA microbiano, utilizando
enzimas termorresistentes (ADN-polimerasa), nucleótidos y un cebador
(oligonucleótidos diseñados para unirse de forma complementaria a una única
secuencia del DNA investigado). Si el DNA buscado no existiera en el alimento, el
cebador no podría unirse y no se produciría la amplificación. Una vez amplificado el
DNA, mediante una serie de pasos que incluyen calentamientos y enfriamientos
sucesivos, la muestra se pasa por electroforesis en gel de agarosa para compararla
con un patrón específico de DNA, que permite la identificación del microorganismo
asociado a la ETA´s. En el área de alimentos esta técnica se utiliza para la
identificación de Listeria monocytogenes.
Igualmente, el diagnóstico de la gastroenteritis viral se realiza evaluando muestras
de heces o vómito con PCR.
Lectura de profundización sobre el uso de las técnicas moleculares en
el área de la biotecnología. Fuente: Amgen. Compañía mundial de
biofarmacia (biotecnología aplicada a productos farmacéuticos).
Infovideo que muestra los pasos a seguir para la realización de la
prueba serológica de ELISA. Fuente: Abnova Corp. Empresa
productora de anticuerpos y proteínas.
Lección 45. Técnicas microbiológicas utilizadas en la evaluación del ambiente
Evaluación de superficies
Para la evaluación de superficies se recomienda tener en cuenta las
características de la superficie:
Método de la torunda
En este método se utiliza una torunda estéril, que en el extremo tiene una bola de
algodón (aproximadamente 0,5 cm de diámetro y 2 cm de largo) unida a una varilla
de madera (12-15 cm) y puede ser construida por el analista. Esta torunda se
sumerge en agua estéril para poder tomar la muestra de la superficie 6. Es
recomendable en aquellas superficies de difícil acceso o que no sean totalmente
planas (superficies irregulares). También es conocido como el método del frotis.
Método de la esponja
Se utiliza para evaluar superficies amplias o para la recuperación de
microorganismos que tienen una baja incidencia en las zonas analizadas. En este
caso se trabaja con una esponja natural o sintética estéril (5x5 cm) y libre de
antimicrobianos. Para tomar la muestra se humedece la esponja en agua estéril y
se restriega sobre la superficie que se quiere muestrear. Si la finalidad del muestreo
es:
- La detección de patógenos, la esponja se transfiere a un caldo de enriquecimiento
y la mezcla se lleva a incubar, para continuar con el proceso de identificación.
- Cuantificar la flora del ambiente, la esponja se mezcla con 50 a 100 mL de
diluyente y se realizan las diluciones correspondientes7.
Método de replicación de microorganismos por contacto directo con agar
(RODAC)
6
Yousef, A and Carlstrom, C. 2006. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit.
Acribia. Zaragoza. España. p.182.
7
Ibis. p.194
También es conocido como Placa de contacto. Se aplica en superficies planas de
fácil acceso y que hayan sido previamente limpiadas o higienizadas. En este caso
se utilizan medios de cultivo apropiados que recuperen el microorganismo de interés
y que contengan una mayor cantidad de agar a la normal, de manera que exceda la
superficie de la caja de petri. Esto con el fin de tomar adecuadamente la muestra,
pues para eso se presiona la placa contra la superficie a analizar y se mueve sin
dejar de presionar. Después se coloca la tapa y se lleva a incubar, para observar el
crecimiento bacteriano.
Evaluación del aire
Los métodos más utilizados para la evaluación del aire son:
Sedimentación
Consiste en exponer el medio de cultivo al ambiente, por un determinado tiempo,
por ejemplo, 15 min. Los microorganismos del aire se depositan, por la fuerza de la
gravedad, en el medio de cultivo, que se lleva a incubar y de acuerdo al recuento
bacteriano se establecerá que nivel de contaminación existe en el aire.
Filtración
En este caso se hacen pasar corrientes de aire a través de microfiltros, con un
diámetro de poro definido. Los microorganismos que hayan quedado en el filtro
serán removidos mediante un diluyente adecuado, para luego inocularlos en los
medios de cultivo necesarios para su crecimiento.
Evaluación de manipuladores de alimentos
La evaluación del manipulador de alimentos se inicia con la valoración de manos y
uñas utilizando un escobillón impregnado de agua estéril para facilitar la
recuperación de los microorganismos presentes. El escobillón se pasa por dedos y
uñas para obtener una adecuada muestra del operario. Luego se pone en medio
líquido de Tioglicolato para favorecer el crecimiento bacteriano y a partir de este
caldo se siembra en los medios de cultivo correspondientes para la identificación
del microorganismo, por ejemplo, agar sangre y agar nutritivo.
Otra técnica utilizada es la impresión de dedos o guantes y que consiste en
presionar los dedos o los guantes sobre el medio de cultivo y esta muestra se lleva
a cultivar para recuperar los microorganismos presentes.
También se pueden obtener muestras de secreción faríngea y secreción nasal las
cuales se siembran en los medios de cultivo correspondiente para identificar la flora
microbiana presente y evaluar la presencia o no de microorganismos patógenos.
Otro punto anatómico importante a evaluar en el manipulador de alimentos es la
cavidad oral. Grandes masas de bacterias se desarrollan en el interior de la boca,
en las superficies epiteliales de la lengua, mejillas y en los dientes, por lo que su
valoración indica las condiciones en que esta laborando el manipulador. Existe un
grupo de microorganismos, asociados con problemas de contaminación en vinos
como son los Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius y Lactobacillus. Estas
bacterias se asocian con la producción de aminas biógenas, que se definen como
compuestos orgánicos de nitrógeno y que están relacionadas con una serie de
alteraciones físicas en el consumidor, como por ejemplo y donde se destaca, la
migraña. De ahí el interés en identificar este tipo de microorganismos en
manipuladores vinícolas8.
¿Cuáles son las ventajas de los métodos utilizados en el área de alimentos?
Preguntas
de repaso
¿El método del NMP se utiliza en que caso?
¿Qué ventajas tienen las pruebas serológicas y moleculares contra las
Técnicas microbiológicas de rutina?
Para qué sirve la microbiología?
Hacia 1815 se empezaron a incluir las primeras prácticas de control microbiológico
en los procedimientos quirúrgicos y el cloro fue uno de los primeros antisépticos en
usarse, incluso antes de que se supiera el papel real de los microorganismos en las
enfermedades. Se utilizaba como cloruro de calcio para el lavado de manos y evitar
la contaminación microbiana de heridas quirúrgicas. Fue muy importante para
impedir la sepsis puerperal, que era transmitida por las manos de los médicos y de
las parteras, y considerada como la causa de hasta el 25% de las muertes postparto en mujeres9. Actualmente el hipoclorito de sodio, de calcio o de litio son las
soluciones más utilizadas en las industrias alimenticias, en restaurantes, hoteles y
hospitales y su actividad antimicrobiana es evaluada mediante técnicas
microbiológicas que validan la acción de dichos desinfectantes. En general, el
control microbiológico de los establecimientos alimenticios o de las áreas
intrahospitalarias, se realiza con el fin de comprobar el grado de limpieza de los
mismos y por consiguiente el efecto de los desinfectantes en uso.
8
Angarita, E. 1990. Aminas vasopresoras en vinos, cervezas y jugos de frutas. Alimentaria.
Vol. 1.
No. 7. Pg 12-15.
9
Troya, J. 2007. Evaluación de la efectividad de desinfectantes Divosan Forte y MH en la
desinfección de equipos y parea de trabajo en una empresa procesadora de helados. Tesis. PUJ.
p.17.