Distribución espacial de Dinophysis spp. y detección de

3.2 DISTRIBUCIÓN ESPACIAL DE Dinophysis spp Y DETECCIÓN DE
TOXINAS VDM DISUELTAS EN EL AGUA, MEDIANTE
SENSORES QUÍMICOS (X REGIÓN)
(CONA-CF11 05-14)
Gemita Pizarro1, César Alarcón1, José Franco2, Laura Escalera3, Beatriz Reguera3,
Gastón Vidal1 & Leonardo Guzmán1
1
Instituto de Fomento Pesquero, Punta Arenas, Chile.
2
Unidad Asociada CSIC-IEO de Fitoplancton Tóxico, Vigo, España.
3
Instituto Español de Oceanografía (IEO), Vigo, España.
INTRODUCCIÓN
Las especies de dinoflagelados del género Dinophysis constituyen un serio problema para la salud pública y la actividad económica de recursos marinos de importancia comercial en el mundo y en Chile, dado que estas especies están asociadas a la
producción de toxinas polietéreas diarreogénicas, como el ácido okadaico (AO) (Fig.
1) y hepatotóxicas, como las pectenotoxinas (PTXs) (Fig. 2) (Terao et al., 1986). En
Chile este grupo de toxinas se conoce como veneno diarreico de los mariscos (VDM)
por sus efectos sintomáticos en las personas que ingieren mariscos contaminados por
ellas. Otro grupo de toxinas polietéreas, de efectos cardiotóxicos (Terao et al., 1990),
son las yesotoxinas (YTXs) (Fig. 3), producidas por los dinoflagelados Protoceratium
reticulatum, presente en la X (Proyecto FDI C703MR-01) y XI región (B. Reguera,
com. pers.) y en menor cantidad Lingulodinium polyedrum (Satake et al., 1997;
MacKenzie et al., 1998). Tradicionalmente se incluían las toxinas diarreogénicas (OA
y derivados), las pectenotoxinas y las yesotoxinas en el mismo complejo denominado
“Diarrhetic Shellfish Poisoning” (DSP, VDM en nuestro país). Hoy día se ha hecho una
nueva clasificación y se han excluido las yesotoxinas y las pectenotoxinas del complejo DSP por no producir efectos diarreogénicos (Ogino et al., 1997). Las toxinas
polietéreas son parcialmente liberadas al medio por los organismos en cultivos (Paz et
al., 2004) y en el medio natural (MacKenzie et al., 2004).
En Chile, la ocurrencia de toxinas diarreogénicas (AO y derivados) ha sido señalada en reiteradas oportunidades desde 1970 en el área del seno Reloncaví X región
(Lembeye et al., 1993) y desde 1991 en la XI región (Anónimo, 1995). Durante 1999
y 2000 también ha sido detectada en el extremo norte de la XII región en niveles muy por
debajo de la normativa por lo que no representan peligro para las personas (Guzmán et al.,
2000, 2001). Durante el año 2005, los episodios de intoxicación de personas con
síntomas de VDM fueron críticos durante los meses de verano en la X región. Además, ha habido casos de confusión en cuanto a la identificación del agente causante
al coincidir la presencia de especies de Dinophysis en la columna de agua con un brote
de Vibrio parahaemoliticus. Esta bacteria patógena produce los mismos síntomas del
VDM al ingerir mariscos contaminados por ella. La principal diferencia estriba en que
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Crucero CIMAR 11
las toxinas diarreicas de origen fitoplanctónico son termo-resistentes y las del Vibrio
son termo-lábiles.
Los recurrentes eventos de VDM en el seno Reloncaví (1970, 1979, 1986), fiordo
Jacaf (1980, 1984), archipiélago Chonos (1991), estos dos últimos en la XI región,
estuvieron asociados a la presencia de D. acuta (Lembeye at al., 1993) y aunque no fue
confirmada como el organismo causante de la toxina éste ha sido el organismo más
probable de producirla pues fue encontrado en 1991 en el tracto digestivo de mariscos
contaminados con AO y dinofisistoxina-1 (DTX1) (predominante) (Zhao et al., 1993). En
1999 también fueron detectadas ambas toxinas en mariscos de la XI región pero en
niveles trazas (Villarroel 2004) y en el 2000 sólo fue detectada DTX1 en la misma región
(García et al., 2003).
Dinophysis acuta, D. acuminata, D. rotundata y D. caudata, son dinoflagelados
recurrentes en zonas templadas a nivel mundial, incluyendo algunas regiones de Chile. Dinophysis spp aparece principalmente durante los meses de primavera y verano
en las regiones sur-austral de Chile (Uribe et al., 1998). Todas ellas son productoras de
VDM en Europa (e.g. Lee et al., 1989; Andersen et al., 1996; Fernández et al., 2001;
Marcaillou et al., 2001; Fernández et al., 2004; Fernández et al., 2005), Japón (e.g.
Lee et al., 1989; Suzuki et al., 2001) y Nueva Zelanda (e.g. Suzuki et al., 2004;
Mackenzie et al., 2005) de modo que constituyen potenciales agentes causantes de
eventos tóxicos de VDM en Chile. Sin embargo, a la fecha los perfiles de toxinas de
dichas especies son desconocidos en nuestro país, razón por la que es necesario
dilucidar urgentemente, qué especies son los agentes causantes de los eventos VDM
en Chile (Dinophysis spp, Protoceratium reticulatum, Prorocentrum spp) y la contribución de cada uno de ellos a estos episodios.
Se ha encontrado que las mismas especies de Dinophysis presentan perfiles de
toxinas diferentes de acuerdo a su procedencia. Tal es el caso de D. acuta, que en
Irlanda presenta un perfil de toxinas con predominancia de dinofisistoxina-2 (DTX2),
seguida de AO y PTX2 (Fernández-Puente et al., 2004), mientras que la misma especie en Nueva Zelanda presenta un perfil con predominio de PTX2, PTX11 y pequeñas
cantidades de AO (Mackenzie et al., 2005). Así, D. acuta de Nueva Zelanda no
presenta DTX2, a diferencia de D. acuta de Irlanda (James et al., 1999), España
(Fernández et al., 2001) y Portugal (Vale, 2004). D. acuta en los países escandinavos
presenta DTX1, toxina que ha sido detectada en los mariscos de la XI Región de Chile
asociado a las proliferaciones de esta especie de Dinophysis. Además, una misma
especie puede resultar no tóxica en ciertas partes del mundo, como es el caso de D.
acuminata en la costa NE de USA (L. Maranda com. pers.) y constituir la principal
fuente de toxinas VDM en Europa y Nueva Zelanda (Lee et al., 1989; Moroño et al.,
2002; Fernández et al., 2001; Mackenzie et al., 2005). Más aún, existen especies
productoras de toxinas que presentan cepas con diferentes grados de producción y
perfil de toxinas procedentes de una misma localidad geográfica (e.g. Bravo et al.,
2001).
En el caso de Chile, el monitoreo para VPM está restringido a D. acuta y D.
acuminata, debido a la falta de estudios del contenido y composición de las toxinas en
otras especies. En este caso D. acuminata ha sido asociada a la producción de DTX1
en la XII región de Chile (Uribe et al., 2001). Las diferencias de perfiles de toxinas
— 60 —
entre las especies, e incluso entre cepas de la misma especie en distintas localidades
tienen una gran repercusión en las labores de regulación y manejo de los recursos
marisqueros susceptibles de ser contaminados por estas toxinas.
Ante tantas incógnitas, la aplicación de novedosas técnicas, como los sensores
químicos (SPATT) (Mackenzie et al., 2004), consistentes en pequeñas bolsitas rellenas con resina de adsorción pasiva de biotoxinas polietéreas, podría resultar de gran
utilidad como herramienta de detección precoz de ficotoxinas en Chile. Estas bolsitas de
resinas son utilizadas a modo de bivalvo artificial, lo que permite predecir estimativamente
la acumulación de toxinas VDM y YTXs en los mariscos cuando sus concentraciones
distan aún de los niveles de regulación no aptos para el consumo humano. La resina de los
sensores es inocua para el medio ambiente y tras permanecer unos días en la columna de
agua, son recuperados y conservados en el congelador hasta su análisis. Este modelo ha
demostrado ser sensible y de muy bajo costo, ideal para ser probado con el fin de utilizarlo
por largos períodos y en vastas extensiones geográficas como las regiones del sur austral
de Chile.
En los últimos años, gracias a las nuevas tecnologías de perfilamiento microestructural de la columna de agua con sistemas de última generación, se ha reportado frecuentemente que las especies de Dinophysis y otros dinoflagelados tóxicos como D. acuminata se pueden presentar en altas densidades en finas capas situadas en zonas de
discontinuidad termohalina de la columna de agua. Estas capas finas se sitúan en
profundidad variable y pueden alcanzar extensiones horizontales que pueden llegar a
25-30 km (Gentien et al., 2005). Así, la formación de las capas finas de alta densidad
celular dependería de la estructura vertical de la columna de agua y de la intensidad de
la estratificación. Esta línea de investigación está aún incipiente y su estudio representa grandes perspectivas para la comprensión de los ciclos de generación, persistencia y desaparición de los florecimientos de microalgas nocivas en Chile.
HIPÓTESIS
La composición de toxinas lipofílicas del fitoplancton presente en la X Región de
Chile es diferente al encontrado en Europa y Nueva Zelanda y dependerá de la composición y abundancia de distintas especies toxigénicas. Se espera que los perfiles de
toxinas sean similares en el fitoplancton de fiordos, canales y centros de cultivo dentro de la misma región.
El perfil de toxinas estará asociado a la especie de Dinophysis predominante en
el ensamble fitoplanctónico.
En períodos de estratificación, las especies de Dinophysis presentan máximos
celulares en capas óptimas, específicas de especie, determinadas por el gradiente de
densidad (incremento sigma-T respecto a Z) de la columna de agua.
Los sensores químicos podrían constituir una herramienta confiable, sensible y
barata para los monitoreos de toxinas lipofílicas como alerta temprana de la presencia
de VDM en los mariscos.
— 61 —
Crucero CIMAR 11
OBJETIVOS
Describir la distribución espacial de Dinophysis spp en primavera-verano.
Establecer la composición de toxinas lipofílicas presente en el fitoplancton (toxina particulada concentrada con red de arrastre) durante el período de muestreo en los
concentrados de fitoplancton y asociarlo a la presencia de especies potencialmente
tóxicas de dinoflagelados presentes durante diciembre-febrero de 2005-2006.
Evaluar la utilidad de los sensores químicos en el monitoreo de toxinas VDM en
la X región para su aplicabilidad potencial como alerta temprana de los niveles de
toxicidad bioacumulados por recursos de importancia comercial.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar de muestreo
La recolección de fitoplancton cuali y cuantitativo así como la puesta de contenedores con resina en la columna de agua por un período de 5-7 días, fue realizada en
10 estaciones (Fig. 4). Las estaciones pertenecen a la Sección CP (estaciones 4, 5, 6
y 7); sección DH (estaciones 2, 3 y 5); Sección QL (estaciones 3, 5 y 6). El fitoplancton
fue recolectado durante diciembre de 2005 y enero-febrero de 2006, en tanto las
resinas fueron colocadas en diciembre de 2005 y enero-febrero de 2006. Los contenedores de resina colocados en diciembre no lograron ser recuperados debido a las
condiciones climáticas, razón por la que no fueron analizados.
Recolección del fitoplancton
El fitoplancton cualitativo fue recolectado entre 0-30 m de profundidad con una red
de arrastre con apertura de malla de 20 µm. Una alícuota de esta muestra fue fijada en
lugol para el análisis microscópico cualitativo del fitoplancton. El fitoplancton cuantitativo
fue recolectado a 0-5-10-20-30 m de profundidad con botellas oceanográficas Niskin.
Una alícuota de 50 mL de estas muestras fueron fijadas con formalina para su posterior
análisis en un microscopio invertido según método de Utermöhl (1931).
Adsorción in situ de toxinas lipofílicas disueltas en el agua mediante resina DIAION:
Preparación
La determinación del perfil de toxinas disueltas en el agua de mar se realizó mediante la extracción de las toxinas del medio adsorbidas por resinas sintéticas porosas DIAION
(HP-20, Supelco) de 250-850 mm de tamaño de partícula y adsorbente poliaromático.
Previamente, la resina fue preparada de acuerdo a Mackenzie et al. (2004): 300 g de
resina, se depositaron en un vaso de 4 L y se añadió 3 L de MeOH, lo cual se agitó a baja
velocidad durante toda la noche. Se eliminó el MeOH en un embudo Buchner con papel
filtro y presión de vacío suave, se lavó la resina con MQ y traspasó al vaso de 4 L. Se
añadió aproximadamente unos 3 L de agua MQ, se agitó suavemente durante 30 min y se
filtró a presión de vacío suave. Esta operación de lavado se repitió una vez más. Finalmente, se recogió la resina en 2 L de agua MQ y se almacenó en botellas plásticas a 4 ºC
hasta su uso.
— 62 —
Se colocaron aproximadamente 0,5 g de resina húmeda activa, en el interior de
bolsitas (Fig. 5), confeccionada con una red de 77 µm de apertura de malla. Las
bolsitas, de dimensiones aproximadas de 60x60 mm, se confeccionaron con hilo de
poliéster. Estos contenedores se expusieron durante 5-7 días a 3 m de profundidad en
el mar (Fig. 4) próximos a líneas de cultivo de choritos. Una vez recuperados los
contenedores fueron almacenados a 4 º C hasta el momento del análisis.
Extracción de toxinas adsorbidas por la resina
La extracción de las toxinas adsorbidas por las resinas durante su permanencia
en la columna de agua se realizó siguiendo la metodología de Mackenzie et al. (2004)
con algunas modificaciones. Una vez recuperados los contenedores de resina, la resina fue traspasada a un tubo provisto con una red de 20 en uno de sus extremos,
donde fue lavada con abundante agua MQ (50-100 mL). Después de escurrir el exceso de agua, la resina fue traspasada a un vial de 20 mL con al menos 10-15 mL
metanol 100%, donde permaneció al menos dos días a 4 ºC en oscuridad. Una vez
extraída la toxina desde la resina, ésta fue traspasada a un tubo de elusión, cuyo
extremo inferior se taponeó con un tubo de silicona provisto con un filtro en su interior
(algodón hidrofóbico). Se reguló el flujo con una llave de paso. Transcurrido este
tiempo, el metanol fue eluido a través del filtro de algodón para retener las partículas
de resina. La resina se lavó dos a tres veces hasta completar 50 mL de metanol eluido.
Los extractos metabólicos se conservaron refrigerados hasta el momento del
análisis. Previo a inyectar la muestra en el LC-MS (20 µL), una alícuota de 4 mL se
evaporó a baja presión a 40 ºC (Speed Vac Savant), durante 3 h, se resuspendió en
500 µL de metanol y se filtró por 0,45 µm.
Análisis de toxinas por LC-MS
Los análisis de toxinas se realizaron en un cromatógrafo líquido THERMO FINNIGAN
acoplado a un espectrómetro de masas THERMO FINNIGAN LCQ-ADVANTAGE equipado
con trampa iónica y una interfase de electro-espray iónico (ESI). El ESI fue operado en
modo positivo y negativo (3,0 y 4,5 kV voltaje del espray, temperatura del capilar de 250
º C, flujo de gas de arrastre de 20 mL/min y flujo de gas auxiliar 10 mL/min). Las
condiciones óptimas de ionización fueron establecidas en modo positivo y negativo
con un estándar de ácido okadaico y fase móvil de acetato amónico 2 mM, pH 5,8 (A)
y metanol (B) (30:70).
La separación cromatográfica de las toxinas se realizó con una columna XTerra
C18 (2,1 x 150 mm, 5 mm), y flujo de la fase móvil de 0,2 mL/min en el siguiente
gradiente: 60% a 100% de B entre los 0 y 20 min, sostenido a 100% hasta el minuto
22, disminuyendo al 60% de B en el minuto 25 y sostenido hasta el minuto 30. A
través de un microcapilar 50 mL del eluyente proveniente del LC se dirigieron a la
interfase de pulverización iónica
Los cromatogramas se registraron en un rango m/z de 200-2000 y el valor de
detección iónico m/z para cada toxina fue: 827,5 [M+Na]+ y 803,5 [M-H]– para el AO y
DTX2; 841,5 [M+Na]+ y 817,5 [M-H]– para el DTX1; 881 [M+Na]+ y 857,5 [M-H]–para
la PTX2; 899 [M+Na]+ y 875,0 [M-H ]– para la PTX2SA y 1141 [M-2+H]– para la YTX.
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Crucero CIMAR 11
La calibración del sistema de LC-MS y la cuantificación de las toxinas se realizaron
con estándares de AO y PTX2 certificados por el Nacional Research Council de Canadá.
La solución estándar de PTX1 fue donada por el Dr. T. Yasumoto (laboratorio de Investigación de los Alimentos de Japón), el patrón de DTX2 (1 mg/mL) por el Dr. P. Hess
(Marine Institute, Galway, Irlanda), y los de PTX2SA y DTX1 (1 µg/mL) por el Dr. C. Miles
(National Veterinary Institute, Oslo, Norway). La solución estándar de YTXs fue provista
por el Dr. M. Satake, de la Universidad de Tohoku (Sendai, Japón).
Las curvas de calibración se elaboraron con una solución de trabajo consistente
en 0,60 ng/mL de AO, 0,59 ng/mL de DTX2 y 0,70 ng/mL de PTX2. Cada 15-20
muestras inyectadas, se generó una curva con 4 puntos obtenidos por una inyección
de volumen variable de la solución de trabajo. La linealidad de las concentraciones de
calibración usadas se confirmó estadísticamente siguiendo el método de Van-Trijp &
Roos (1991). Se utilizó una solución cualitativa de trabajo con PTX2SA, PTX1 y
DTX1 (0,25, 0,25 y 0,50 ng/mL, respectivamente) para la detección de estas toxinas
en las muestras de fitoplancton.
RESULTADOS
Estándares
Los cromatogramas de estándares de OA, DTX2, PTX2 y sus respectivos espectros m/z obtenidos por LC-MS se muestran en la figura 6. Así mismo se muestran
los cromatogramas de estándares de PTX2SA, PTX1, dos toxinas que son producto
de la transformación enzimática por parte de los moluscos que ingieren microalgas
productoras de PTX2. Los cromatogramas y espectros de las toxinas DTX1 y YTX,
ambas toxinas presentes en el sur de Chile se presentan en la Figura 7.
Toxinas adsorbidas por las resinas
La toxina presente con una mayor frecuencia en el área de estudio fue la PTX2
(Tabla I). Ejemplo de cromatograma y espectro m/z del extracto metanólico de la
resina con PTX2, adsorbida después de permanecer una semana (del 21 de enero de
2006) en la columna de agua en la localidad de San Antonio (CP4) se presenta en la
figura 8.
PTX2SA (Fig. 9) fue encontrada en las resinas después de permanecer una
semana (del 26 de enero de 2006 y 21 de enero de 2006) en la columna de agua de
la localidad de Toralla (DH3) y en San Antonio (QL3) respectivamente.
DTX1 fue otra de las toxinas del VDM, encontrada en LIN (CP7), Puluqui A
(CP5) y en Calbuco (CP4). Un ejemplo del cromatograma para DTX1 del extracto
metanólico de toxina adsorbida después de permanecer una semana (del 14 de febrero de 2006) en la columna de agua en LIN así como el espectro m/z respectivo obtenido por LC-MS, se presenta en la figura 10.
Puluqui A (CP5) fue la localidad en la que se encontró trazas YTX (Fig. 11). La
toxina fue adsorbida por la resina tras permanecer en la columna de agua durante la
semana del 14 de febrero de 2006.
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Fitoplancton cuali y cuantitativo
Durante el período de muestreo, predominaron fuertemente las diatomeas (Tabla II) respecto a los dinoflagelados. Especies potencialmente tóxicas de Dinophysis
sólo logró observarse en Yaldad (QL6), con 200 cél/L de D. acuminata. No obstante
las muestras cualitativas de fitoplancton (Tabla III) revelaron la presencia de otras
especies de Dinophysis: D. acuta y D. rotundata (Fig. 12). También se observó una
especie similar a Protoceratium reticulatum, productora de YTXs en otras partes del
mundo; sin embargo para establecer rigurosamente su identificación se requiere de un
análisis de placas de su teca, actividad que será informada en la publicación final de
esta expedición CIMAR 11.
DISCUSIÓN
La toxina predominante encontrada es PTX2, hallándose en trazas AO y YTX.
La PTX2Sa, producto de transformación enzimática del PTX2, también fue encontrada en dos de las estaciones, sin embargo no es posible establecer su procedencia por
cuanto su presencia en el agua puede ser debida al metabolismo de mariscos contaminados, zooplancton o incluso por mortalidad de las propias células fitoplanctónicas que la
producen.
De acuerdo a la hipótesis, existe DTX1 en las muestras de resina como segunda
toxina importante y concuerda con resultados anteriormente reportados para Chile.
Ninguna señal de la presencia de DTX2 fue encontrada.
De acuerdo a las células fitoplanctónicas observadas en las muestras, existe
una mejor representación de las Dinophysis en las muestras cualitativas que en las
muestras cuantitativas. Sólo fue posible encontrar 200 cél/L de D. acuminata en la
estación de Yaldad (QL6), en circunstancias que el listado de especies potencialmente
tóxicas incluye también D. acuta y D. rotundata. La presencia de YTXs en trazas
indica la presencia potencial del dinoflagelado Protoceratium reticulatum, sin embargo
se requiere un estudio de placas de la teca de la especie sospechosa observada en
muestras cualitativas para establecer rigurosamente su identidad.
El método es suficientemente sensible para ser utilizado como alerta temprana
de eventos del tipo VDM, no obstante lo anterior, para establecer una relación entre la
cantidad de toxinas adsorbidas por la resinas con el contenido de toxina en los mariscos (i.e. bioensayo) de acuerdo a la normativa vigente, es necesario realizar una serie
de tiempo controlando ambas variables.
AGRADECIMIENTOS
Investigación cofinanciada por el Centro de Estudios del Cuaternario, CEQUA
(con sede en Punta Arenas, XII región), que ha hecho posible una estadía en el
Centro Español de Oceanografía de Vigo, para realizar la investigación y análisis de
toxinas lipofílicas mediante Cromatografía Líquida acoplada a un Espectrómetro de
Masas.
— 65 —
Crucero CIMAR 11
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— 67 —
Crucero CIMAR 11
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— 68 —
Tabla I. Toxinas adsorbidas (ng/ bolsita) por las resinas que permanecieron durante
una semana en la columna de agua en distintas localidades de la X región.
Se indica la cantidad en peso seco de resina utilizada por bolsita.
Lugar
Calbuco
Calbuco
Puluqui A
Puluqui B
LIN
Huenao
Toralla
Coñab
San Antonio
Q Viejo
Yaldad
Sección
CP4
CP4
CP5
CP6
CP7
DH2
DH3
DH5
QL3
QL5
QL6
Fecha
OA
DTX2
14-feb-06
14-feb-06 trazas
14-feb-06 trazas
14-feb-06
14-feb-06
26-ene-06
26-ene-06
26-ene-06
21-ene-06
21-ene-06 trazas
21-ene-06
— 69 —
PTX2
PTX2SA
YTX
DTX1
trazas
59
64
10
71
19
34
65
60
7
164
22
31
15
resina (g)
peso seco
0,37
0,36
0,36
0,47
0,33
0,46
0,38
0,09
0,15
0,08
0,10
Crucero CIMAR 11
Tabla II. Resumen del fitoplancton cuantitativo presente en las estaciones
muestreadas en el área de estudio en los meses de verano.
CALBUCO
dic-05
CALBUCO
14-feb-06
PULUQUI A
14-feb-06
PULUQUI B
14-Feb-06
LIN
dic-05
LIN
14-feb-06
HUENAO
dic-05
HUENAO
26-ene-06
TORALLA
dic-05
TORALLA
26-ene-06
Profundidad
Total
Diatomeas
Total
Dinoflagelados
D. acuminata
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
75.800
99.800
189.300
61.400
26.920
18.700
163.000
49.500
56.800
74.100
367.900
817.900
220.300
1.514.000
416.600
83.000
132.500
1.291.800
664.600
977.000
587.920
413.240
3.379.360
72.000
5.700
581.020
623.780
944.960
84.200
8.400
171.300
121.100
140.600
75.800
101.200
137.000
172.600
133.300
33.800
51.200
1.276.100
1.568.700
128.300
158.500
497.300
503.300
368.100
279.600
433.800
306.100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2600
800
400
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
200
600
0
0
0
0
700
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
— 70 —
continuación Tabla II.
Profundidad
COÑA B
dic-05
COÑA B
26-ene-06
SAN ANTONIO
SAN ANTONIO
dic-05
21-ene-06
Q. VIEJO
dic-05
Q. VIEJO
21-ene-06
YALDAD
dic-05
YALDAD
21-ene-06
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
Om
5m
10 m
20 m
30 m
— 71 —
Total
Diatomeas
1.498.000
725.800
800.600
694.500
296.000
1.789.960
2.625.760
1.373.400
812.000
300.300
66.900
225.900
75.100
66.600
89.400
985.900
137.700
171.600
253.600
465.800
227.600
823.900
179.700
547.000
54.100
1.116.500
236.500
811.500
214.900
106.400
128.200
118.100
134.100
20.100
10.300
148.800
38.000
85.400
24.400
20.000
Total
Dinoflagelados
0
3400
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
200
400
400
500
0
D. acuminata
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
200
0
0
Crucero CIMAR 11
Tabla III. Ejemplo de especies de fitoplancton cualitativo presentes en las muestras
recolectadas el 21-ene-2006 en la estación San Antonio (QL3).
Diatomeas
Asterionella japonica
Coscinodiscus sp.
Diploneis sp.
Odontella sp.
Paralia sulcata
Pseudonitzschia sp.
Thalassiosira rotula
Dinoflagelados
Ceratium furca
Ceratium lineatum
Dinophysis acuminata
Dinophysis acuta
Dinophysis rotundata
Diplopsalis sp.
Gonyaulax sp.
Oblea sp.
Prorocentrum micans
Protoceratium sp.
Protoperidinium claudicans
Protoperidinium claudicans
Protoperidinium conicum
Pyrocystis lunula
Scrippsiella sp.
Silicoflagelado
Dyctiocha speculum
— 72 —
Figura 1: Estructura del ácido okadaico (OA) y derivados: dinofisistoxinas (DTXs) y
acyl derivados.
Figura 2: Estructura de las Pectenotoxinas (PTXs) y pectenotoxinas seco ácido
(PTXsSA).
— 73 —
Crucero CIMAR 11
R2
HO
H
O
H
O
H
O
H
H
H
H O
R 1O
NaO3SO
n
O
H
H
H
O
H
H
H
OH
O
H
H
O
O
H
O
H
H
O
H
Yessotoxin (YTX):
n=1; R1= SO3Na; R2=
45-HydroxyYTX:
n=1; R1= SO3Na; R2=
45, 46, 47-TrinorYTX
n=1; R1= SO3Na; R2=
HomoYTX:
n=2; R1= SO3Na; R2=
45-HydroxyhomoYTX:
n=2; R1= SO3Na; R2=
OH
H
OH
Figura 3: Estructura de las Yesotoxinas (YTXs)
— 74 —
43°
4 5
6
7
Golfo de Ancud
Se
cci
ón
I
C h s l a
i l
o é
P a
c í
f i
c o
O c
é a
n o
42° S
Sección CP
DH
2 3
5
Golfo Corcovado
Sección QL 6 5 3
Boca del Guafo
Ba. Tictoc
44°
75° W
74°
73°
Figura 4: Localidad de muestreo de fitoplancton y posición de bolsitas con resina en
la columna de agua por un período de 5-7 días.
Figura 5: Contenedor de resina utilizado en experimentos in situ para la adsorción de
toxinas lipofílicas disueltas en el agua de mar: Bolsita confeccionada con red
de 70 µm de tamaño de trama de 60x60 mm.
— 75 —
Crucero CIMAR 11
RT: 0.00 - 30.04
SM 7G
AO
DTX2
8.03
NL:
3.71 E6
m/z = 827.0-828.0
F: + c ESI Full ms
[200.00-2000.00] MS
1P3
3000000
7.14
2000000
Intensity
1000000
0
12000000
0.88
2.0
2.99 3.73 4.29
9.40 10.05
6.08
11.99
0
14.73 15.45
13.19
16.82 17.71
18.99
27.60
26.47
20.68 21.89 22.13 23.34 24.14 24.79
29.22
11.91
NL:
1.21 E7
m/z = 881.0-882.0
F: + c ESI Full ms
[200.00-2000.00] MS
1P3
10000000
8000000
6000000
4000000
2000000
0.71 1.53 2.34 3.24 4.21 4.94
0
0
9.72
7.62 8.19
6.08
8
6
4
2
12.95 13.84 14.4
11.34
10
12
66
18.19
20
26.07 26.80 27.84 28.97
24.38
19.56 20.28 21.33 22.37
18
16
14
22
28
26
24
30
Time (min)
1P3#171-201 RT:
6.98-8.11 AV:15 NL:
1.81E6 T: + c ESI Full
ms [200.00-2000.00]
827.4
6
4
787.1
769.2
278.9
2
Relative Abundance
391.0 458.7
849.3
907.5 953.5 1046.8
606.6 696.2
0
100
1306.2 1265.1 1502.5
1698.7 1770.7
1954.6
1P3#292-298 RT:
11.83-12.07 AV:4 NL:
3.01E7 T: + c ESI Full
ms [200.00-2000.00]
876.3
50
881.5
278.9
0
200
600
400
883.5 979.1
796.4 841.2
551.1
414.7
800
1200.2
1320.7 1437.6 1580.4 1656.3 1770.2
1400
1200
1000
1600
1969.9
2000
1800
m/z
Figura 6: Cromatogramas de estándares de OA, DTX2, PTX2 y sus respectivos espectros m/z obtenidos por LC-MS.
RT: 0.00 - 29.95
SM: 9G
PTX2SA
7.27
Intensity
1000000
500000
2.66
1.28 1.69
0
3.79
4.92
5.53
8.16
22.43
11.16
9.30
11.72
10.11
10.11
Intensity
3
0.63 1.77 2.74
0
3.87 4.20
6.38 7.11
8.97
8.16
16.07
10.83 12.12 12.93 14.14
27.72
20.10 20.98
18.33 19.05
28.20
DTX1
1000000
500000
13.74 14.78
25.15
23.96 24.67
25.64
24.75
15.67 16.47 17.36
22.83
20.66 21.79
18.89
26.60
25.64
27.72
28.36
9.30
2000000
PTX1
1000000
2.58
0. 6 1.77
0
3.55
25.80
11.16
4.60 5.49 6.22 7.27 7.92
14.86 15.99 16.39
8.17
18.41 19.21
20.90 22.19 22.83 23.64
27.08 28.20
11.20
100
YTX
50
2.46 3.19 3.99 4.56
0.67
0
0
2
4
8.69
6.10 7.07
6
8
10
12
14
20.94
19.01
16.84 17.88
9.99
18
20
22.63 23.84 24.80
22
24
26.64
26
27.28 28.24
NL:
1.06 E6
m/z = 899.00-900.00
F: + c ESI Full ms
[200.00-2000.00] MS
2P3
NL:
1.12 E6
m/z = 841.00-842.00
F: + c ESI Full ms
[200.00-2000.00] MS
2P3
NL:
2.14 E6
m/z = 892.00-893.00
F: + c ESI Full ms
[200.00-2000.00] MS
2P3
NL:
1.27 E6
m/z = 1141.00-1142.00
F: + c ESI Full ms
[200.00-2000.00] MS
2P3
28
Time (min)
Intensity
76
0
478.66 591.11 67
894.24
899.41
874.50 962.93 1095.64
534.64 676.30 7
863.47 983
0
1296.79 1402.53
1622.08
1836.83 1927.68
892.23
431.76
639.84 762.07 832.74
0
1000000
0
1949.18
841.44
1000000
2000000
1505.26 1633.13 1711.68
1 87.67
2P3#177-183 RT: 7.19-7.36 AV:3 NL:
2.14E6 T: + c ESI Full
ms [200.00-2000.00]
570.46
468.74
400
600
893.28
898.36 1
779.25 884.40
800
3.04
141
1464.17
1314.07
1086.69
1000
1200
m/z
1400
1628.33
1511.40
1673.72
1600
2P3#227-232 RT: 9.22-9.38 AV:3 NL:
2.82E6 T: + c ESI Full
ms [200.00-2000.00]
1878.74
2P3#271-280 RT: 10.96-11.28 AV:5 NL:
1.11E6 T: + c ESI Full
ms [200.00-2000.00]
1846.29
1800
2P3#247-252 RT: 10.03-10.19 AV:3 NL:
1.51E6 T: + c ESI Full
ms [200.00-2000.00]
2000
Figura 7: Cromatogramas de estándares de PTX2SA, DTX1, PTX1, YTX y sus respectivos espectros m/z obtenidos por LC-MS.
— 76 —
RT: 0.00 - 29.98
SM: 9G
11.73
NL:
4.14 E6
m/z = 881.00-882.00
F: + c ESI Full ms
[200.00-2000.00] MS
23C_060711145934
4000000
3500000
PTX2
3000000
Intensity
1.93
2500000
2000000
24.49
3.30 4.27
1500000
8.65
6.14
1000000
9.06
13.27
10.03
14.73
7.19
22.56
15.86
500000
16.42
18.68
0.63
19.17 19.57
20.54
21.02
27.55
23.85
26.34
25.46
28.43
0
0
2
4
8
6
10
16
14
Time (min)
12
18
20
22
24
26
1530.54
1605.91
28
23C_060711145934 #283-295
11.49-11.89 AV: 6 NL: 1.21E7
T: + c ESI Full ms [200.00-2000.00]
876.21
12000000
Intensity
10000000
8000000
6000000
877.22
881.49
4000000
2000000
297.02
420.27
556.21
758.46
691.12
883.55
1121.35
1192.73
1349.00
1743.01
1871.53
1974.79
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
m/z
Figura 8: Ejemplo de cromatograma (arriba) del extracto metanólico de resina con
PTX2, adsorbida después de permanecer una semana (del 21 enero 2006)
en la columna de agua en la localidad de San Antonio. Abajo se presenta el
espectro m/z respectivo obtenido por LC-MS.
RT: 0.00 - 30.05 SM: 9G
Intensity
NL:
3.26 E6
m/z = 899.00-900.00
F: + c ESI Full ms
[200.00-2000.00] MS
27C
Intensity
27C # 176-181 RT: 7.11-7.27 AV: 3 NL: 2.38E6
T: + c ESI Full ms [200.00-2000.00]
Figura 9:
Ejemplo de cromatograma (arriba) del extracto metanólico de resina con
PTX2SA, adsorbida después de permanecer una semana (noviembre 2005)
en la columna de agua en la localidad de Toralla. Abajo se presenta el espectro m/z respectivo obtenido por LC-MS.
— 77 —
Crucero CIMAR 11
RT: 0.00 - 30.01 SM: 9G
1.92
NL:
2.89 E6
m/z = 841.00-842.00
F: + c ESI Full ms
[200.00-2000.00] MS
19C_060711082530
2800000
2600000
2400000
2.73
2200000
2000000
DTX1
Intensity
1800000
1600000
1400000
1200000
24.77
5.48
5.15
1000000
26.61
27.10
15.58
6.53
11.76
11.13
12.10 13.72
10.16
800000
600000
23.48
17.19
14.93
0.71
400000
25.25
9.43
4.10
3.21
18.48
21.79
20.42
21.39
22.19
28.22
200000
28.78
0
0
2
6
4
Intensity
19C_060711082530
#233-237 RT: 9.43-9.52
T: + c ESI Full ms [ 200.00-2000.00]
8
10
12
16
14
Time (min)
18
20
22
26
24
28
30
AV: 2 NL: 3.99E6
2500000
Figura 10: Ejemplo de cromatograma (arriba) del extracto metanólico de DTX1
adsorbida por la resina tras permanecer una semana (del 14 de febrero de
2006) en la columna de agua en LIN. Abajo se presenta el espectro m/z
respectivo obtenido por LC-MS.
RT: 0.00 - 30.05 SM: 9G
12.08
NL:
9.83 E5
m/z = 1141.00-1142.00
F: - c ESI Full ms
[200.00-2000.00] MS
28C
900000
2.45
800000
YTX
13.05
Intensity
700000
600000
1.64
500000
13.94
11.11
400000
2.93
20.07
5.93
300000
200000
4.07
100000
15.71
16.92 17.25
18.05
4.63
7.63
21.85
25.88
18.94
24.91
20.72
10.30
27.00
23.54
27.89
9.33
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Time (min)
Rlative Abundance
28C #274-278
RT: 11.11-11.11 AV: 2 NL: 1.18E6
T: - c ESI Full ms [ 200.00-2000.00]
Figura 11: Ejemplo de cromatograma (arriba) del extracto metanólico de resina con
YTX (trazas), adsorbida después de permanecer una semana (noviembre
2005) en la columna de agua en la localidad de Puluqui A. Abajo se presenta el espectro m/z respectivo obtenido por LC-MS.
— 78 —
Figura 12: Microfotografías de Dinophysis acuminata (izquierda), D. acuta (centro) y
D. rotundata (derecha) en muestras cualitativas recolectadas el 21-en-2006
en la estación San Antonio (QL3).
— 79 —