Aislamiento y caracterización de microsatélites a partir de la

Aislamiento y caracterización de microsatélites
a partir de la construcción de genotecas
enriquecidas de Rana dalmatina
Vanessa Sarasola
Diciembre de 2007
ÍNDICE
Introducción
2
Metodología
4
1. Extracción, purificación y estimación del ADN
4
2. Tamaño y pureza del ADN
5
3. Preparación del ADN genómico en un rango de tamaño de 300 a 700pb
5
4. Annealing y ligación de linkers
6
5. Amplificación por PCR del linker-DNA
6
6. Selección híbrida-enriquecimiento de la genoteca
7
7. PCR del ADN híbrido seleccionado
7
8. Eliminación de linkers
8
9. Ligación en el plásmido
8
10. Clonación y selección de plásmidos que contienen microsatélites
8
11. Rastreo (screening)
10
12. Secuenciación de los clones positivos
11
13. Análisis de los microsatélites obtenidos
11
Resultados y perspectivas
11
Bibliografía
13
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina
1
Introducción
La genética molecular tiene múltiples aplicaciones en la biología de la
conservación, y de hecho la genética de la conservación ha emergido como una
disciplina en sí misma. Sus objetivos principales son la comprensión de la relación
entre la diversidad genética y la viabilidad de las poblaciones, y el conocimiento del
tamaño efectivo de la población, parámetro crítico para mantener la diversidad
genética. La habilidad de los organismos para adaptarse a los cambios ambientales
(cambio climático, nuevos patógenos), llamada potencial evolutivo, está muy
relacionada con la diversidad genética.
Los marcadores moleculares son secuencias polimórficas de proteínas o de
ADN que pueden ser utilizadas como indicadoras de la variación genética y nos
pueden ayudar a responder preguntas en ecología que son difíciles de resolver de otra
manera. Son fragmentos del genoma generalmente muy pequeños, que son tratados
como loci, aunque no codifiquen para proteínas. El nivel de polimorfismo puede variar
entre cero y cientos de alelos en una especie. La gran ventaja que tienen es que la
variación en los marcadores puede ser cuantificada, lo que permite utilizar la
estadística para hacer comparaciones. Hay distintos tipos de marcadores, cada uno
con
ventajas
e
inconvenientes
(alozimas,
RFLP,
RAPD,
minisatélites,
microsatélites…), pero en los últimos años los microsatélites se han hecho muy
populares para resolver muchos aspectos de la ecología molecular (González, 2003;
Beebee & Rowe, 2004).
Los microsatélites o SSRs (simple sequence repeats) son motivos repetidos de
1 a 6 nucleótidos encontrados en todos los genomas, tanto procariotas como
eucariotas, analizados hasta el momento. Están presentes en regiones del genoma
tanto codificantes como no codificantes, con mayor presencia en estas últimas, y
presentan un alto grado de polimorfismo que los hace óptimos para utilizarlos como
marcadores moleculares en estudios de mapeo de genomas, estudios forenses, o
enfocados a la conservación, tales como: detección de posibles cuellos de botella,
medidas del flujo génico e hibridación entre poblaciones, asignación de individuos a su
población de origen o determinación de la estructura poblacional. Además son
selectivamente neutrales y co-dominantes, y se puede trabajar con reducidas
cantidades de ADN, sin que resulte necesario el sacrificio de los animales porque se
pueden amplificar con la técnica de la PCR (González, 2003; Zane et al., 2002).
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina
2
El mayor inconveniente de los microsatélites es que necesitan ser aislados de
novo en cada especie, debido a que se encuentran habitualmente en regiones no
codificantes del genoma donde la tasa de sustitución de nucleótidos es muy alta, por lo
que no existen primers o cebadores universales como en el ADN mitocondrial, lo que
supone un elevado esfuerzo. Últimamente, y cada vez con mayor frecuencia, se
intenta la amplificación cruzada con cebadores de una especie en otra distinta,
obteniéndose en algunos casos resultados positivos (Schlötterer et al., 1991;
González, 2003; Strecker, 2006).
En el grupo de los anfibios su utilización es muy frecuente para realizar estudios
poblacionales enfocados a la conservación (Rowe et al., 2000; Beebee & Rowe, 2001;
Vos et al., 2001; González, 2003; Burns et al., 2004) y se han aislado en muchas
especies (Brede et al., 2001; Wieczorek et al., 2002; Julian & King, 2003; Chan, 2007).
Una genoteca, en sentido estricto, es una colección desordenada de clones de
un microorganismo huésped en el que se introduce el genoma del microorganismo de
interés en forma de trozos aleatorios. Cuando se habla de una genoteca enriquecida,
esos trozos han sido seleccionados por alguna característica. En este caso, de
búsqueda de microsatélites, se seleccionan determinadas secuencias de pares de
bases que suelen formar parte de estos marcadores.
Las poblaciones ibéricas de Rana dalmatina representan el límite de distribución
suroccidental de esta especie y se hallan separadas del resto de poblaciones
europeas por la frontera natural que suponen los Pirineos (Gosá, 2002). A nivel
genético esta situación geográfica implica que son poblaciones cuyo intercambio de
genes está dificultado por dicha barrera que restringe el flujo de animales, y por tanto
genético, además de que el intercambio es unilateral, por lo que es más lento y la
adaptación a condiciones locales (climáticas, de contaminación) puede quedar
retardada, como consecuencia de una baja heterocigosidad.
El estudio genético de las regiones SSR o microsatélites permitirá averiguar si el
aislamiento físico al que pueden haber estado sometidas las poblaciones ibéricas de la
especie ha desembocado en una diferenciación genética. Si el aislamiento es antiguo,
consecuencia de cambios climatológicos pretéritos, como se supone, se espera
encontrar una diferenciación genética elevada con respecto a las poblaciones
europeas, al otro lado de los Pirineos, y una baja heterocigosidad.
Dentro de la Península se repite el patrón de aislamiento de las poblaciones. A
dicha escala las barreras que impiden la dispersión entre poblaciones suelen estar
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina
3
relacionadas con cambios de origen antrópico en los ecosistemas: infraestructuras
lineales, urbanización, campos de cultivo, etc. El análisis genético con microsatélites
permitirá conocer la estructura genética y el grado de fragmentación entre las
poblaciones ibéricas. También se podrá cuantificar la variabilidad genética de las
poblaciones. Estos parámetros poblacionales son decisivos para la supervivencia de
las poblaciones y proporcionan una importantísima información a la hora de tomar
medidas enfocadas a la conservación. Si la variabilidad genética de las poblaciones es
baja significa que el proceso de aislamiento, aunque reciente, es importante y que
puede existir una alta tasa de consanguinidad, pudiendo ser recomendables
programas de reintroducción y restauración genética.
La obtención de microsatélites, realizada entre abril y septiembre de 2007 en la
Universidad de Sussex (Inglaterra) bajo la tutela del Dr. T. J. C., Beebee, es el primer
paso, e ineludible, para desarrollar este proyecto enfocado a la conservación de la
especie en las poblaciones Ibéricas.
Metodología
Hay distintas estrategias para la obtención de genotecas enriquecidas en
microsatélites, documentadas por Zane et al. (2002). En la genoteca desarrollada para
Rana dalmatina se ha seguido una combinación de algunas de ellas. Los pasos han
sido:
1. Extracción, purificación y estimación del ADN
Se obtuvo ADN de alta calidad siguiendo el protocolo estándar de extracción y
purificación del fenol-cloroformo, a partir de cuatro larvas de Rana dalmatina
procedentes de la cría en cautividad de huevos de las poblaciones ibéricas en el año
2004, y conservadas en alcohol de 96º.
Se estimó la cantidad y pureza de los ácidos nucleicos en la preparación
mediante espectrofotometría. Éstos, en disolución acuosa, presentan máximos de
absorbancia en la región ultravioleta del espectro, a 260 nm, debido a la presencia de
las bases nitrogenadas. Para calcular su concentración, una unidad de absorbancia
(UA) corresponde aproximadamente a 50 μg/ml de ADN de cadena doble. Se utilizó el
espectrofotómetro de UV UNICAM HELIOS.
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina
4
2. Tamaño y pureza del ADN
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente
eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga
eléctrica, a través de una matriz gelatinosa.
Se utilizó la electroforesis en gel de agarosa para identificar y purificar los
fragmentos de ADN (figura 1). Como marcador se utilizó bromuro de etidio, sustancia
que emite una luz roja-anaranjada que se intensifica unas 20 veces después de
haberse unido al ADN, cuando se expone a la luz ultravioleta. Es una sustancia que se
debe manipular con mucha precaución, porque tiene importantes efectos mutágenos y
posiblemente cancerígenos.
Figura 1. Tamaño y pureza del ADN obtenido.
3. Preparación del ADN genómico en un rango de tamaño de 300 a 700pb
Las enzimas de restricción se han convertido en una herramienta básica de la
ingeniería genética. Son endonucleasas que reconocen y cortan secuencias
específicas en la doble hélice de ADN. Son extraídas de organismos procarióticos
(bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material
genético extraño que entra en la célula.
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina
5
En este caso, se utilizaron para obtener fragmentos de ADN con tamaños entre
300 y 700 pb, suficientemente grandes como para albergar los microsatélites, y
suficientemente pequeños para manejarlos.
El ADN genómico de Rana dalmatina fue digerido con la enzima de restricción
Mbo I, que proviene de la bacteria Moraxela bovis, causante de conjuntivitis en el
ganado vacuno. Produce el corte en la siguiente secuencia:
5´…▼GATC..…3´
3´…..CTAG▲…5´
Y es isosquizómero de la enzima Sau 3A1 (procedente de Staphylococcus
aureus), es decir, reconoce y digiere la misma secuencia de ADN y además rompe en
el mismo sitio de la secuencia, por lo que ambas enzimas generan extremos
compatibles.
Los fragmentos de 300 a 700 pb fueron seleccionados y purificados a partir del
gel de agarosa en que se corrió la muestra junto con un marcador de 100 pb.
4. Annealing y ligación de linkers
Los linkers son oligonucleótidos sintéticos autocomplementarios, que tienen
secuencias de reconocimiento de las endonucleasas y para los que existen cebadores
para la PCR. Forman enlaces fosfodiéster fácilmente con las moléculas de ADN.
Se ligaron los linkers SaulA y SaulB a los fragmentos de ADN cortados,
utilizando para ello la enzima T4 DNA ligasa.
SaulA: 5′-GCGGTACCCGGGAAGCTTGG-3′
SaulB: 5′-GATCCCAAGCTTCCCGGGTACCGC-3′
5. Amplificación por PCR del linker-DNA
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología
molecular que ha permitido un gran avance en los estudios, ya que permite la
obtención de grandes cantidades de ADN a partir de una pequeña muestra. Emplea
ciclos de altas y bajas temperaturas para desnaturalizar las hebras de ADN y dejar que
las DNA polimerasas las repliquen a partir de los cebadores o primers. Para ello se
utiliza un aparato llamado termociclador.
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina
6
Utilizando primers específicos para la secuencia de los linkers, se amplificaron
los fragmentos de ADN de Rana dalmatina obtenidos.
6. Selección híbrida-enriquecimiento de la genoteca
Consiste en dirigir la genoteca hacia la búsqueda de microsatélites. Se
realizaron dos genotecas enriquecidas siguiendo la misma metodología. En primer
lugar se buscaron microsatélites formados por una secuencia repetida de
dinucleótidos, que se ha comprobado en otras especies que es muy polimórfica. El
resultado de esta búsqueda no fue muy fructuoso y la cantidad de secuencias
obtenidas fue baja, por lo que se optó en buscar otro tipo de microsatélites
(dinucleótidos y tetranucleótidos) para obtener una cantidad adecuada y suficiente de
secuencias polimórficas.
Se utilizaron las propiedades de la estreptavidina y de las bolitas
paramagnéticas para separar secuencias de ADN de interés. La primera es una
proteína que presenta una extrema afinidad por la biotina y con la que se pueden
recubrir las bolitas paramagnéticas.
Se fabricaron oligonucleótidos con la secuencia de los microsatélites de interés
y se marcaron con una cola de biotina en el extremo 3´, para utilizarlos como sondas
de captura de los fragmentos de ADN de Rana dalmatina con la secuencia
complementaria. Estas sondas se unen fuertemente a la estreptavidina, que se
encuentra recubriendo bolitas paramagnéticas. Tras realizar la hibridación con el ADN
genómico y la captura de los microsatélites complementarios, se separaron las bolitas
utilizando un imán (vibrating simple magnetometer). De esta manera se recuperaron
los fragmentos de ADN que nos interesaban utilizando HCl y calor para separarlos de
las sondas.
Así, se buscaron los microsatélites con la secuencia GT/AC en la primera
genoteca y AG/CT, TATC/GATA y GACA/TGTC) en la segunda.
7. PCR del ADN híbrido seleccionado
Los fragmentos recuperados se usaron como molde para una nueva
amplificación, utilizando de nuevo la técnica de la reacción en cadena de las
polimerasas.
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina
7
8. Eliminación de linkers
Para eliminar los linkers se utilizó de nuevo una enzima de restricción. Los
linkers tienen además de secuencias que posibilitan la amplificación en la PCR,
secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción, en este caso para la
enzima Mbo 1.
De esta forma se recuperaron los fragmentos del ADN original, precipitándolo
con etanol y centrifugándolo.
9. Ligación en el plásmido
Los plásmidos son fragmentos de ADN extracromosómico presentes en
bacterias, que se utilizan en ingeniería genética por su capacidad de reproducirse de
manera independiente del ADN cromosomal, y porque es relativamente fácil
manipularlos e insertar en ellos nuevas secuencias genéticas.
Para ligar los fragmentos seleccionados en el plásmido, se digirieron los
plásmidos pUC19 con la enzima de restricción Sau 3A1, la cual genera extremos
cohesivos en el plásmido, compatibles con los extremos generados en los fragmentos
del ADN seleccionado tras la digestión con Mbo1.
Se incubaron ambos productos con la enzima T4 DNA ligasa en las
condiciones apropiadas y así se obtuvieron los plásmidos hibridados, relativamente
fáciles de replicar in vivo.
10. Clonación y selección de plásmidos que contienen microsatélites
La clonación permite una amplificación de los fragmentos de ADN in vivo y de
forma inespecífica. Se utilizó un plásmido que insertó los fragmentos de ADN y se
incluyó en células competentes que replican dichos fragmentos. Las células
competentes son bacterias tratadas con iones de calcio y choques de temperatura
para alterar las envueltas, sobre todo la membrana externa, y aumentar su
permeabilidad al ADN foráneo, como son los plásmidos, que entran en la célula como
moléculas de cadena doble.
El plásmido utilizado fue pUC19, un plásmido pequeño (tamaño 2686pb),
procedente de Escherichia coli (figura 2). En su secuencia destacan dos genes que
actúan como marcadores de selección. Un gen de resistencia al antibiótico ampicilina
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina
8
(gen AmpR), que confiere a las bacterias que incorporan este plásmido resistencia a
dicho antibiótico. Y el gen LacZ, que codifica para la enzima β-galactosidasa, la cual
degrada la lactosa y otros β-galactósidos como el X-gal, permitiendo la selección por el
método White/Blue.
Se transformaron células de Escherichia coli competentes DH5α con el
plásmido pUC19, con los insertos de ADN de Rana dalmatina, para que los vectores
recombinantes se multiplicaran. Una vez transformado el cultivo bacteriano se
seleccionaron las bacterias que habían insertado el plásmido recombinante.
El método de White/Blue es usado a menudo en ingeniería genética; está
basado en la expresión del Operón Lac y sirve para reconocer las bacterias
recombinantes. Consiste en utilizar los reactivos IPTG (isopropil-β-D-tiogalactósido),
un inductor artificial del gen lacZ y X-gal, un galactósido artificial. Las colonias que han
insertado el plásmido sin inserto tienen un aspecto azul por la degradación del X-gal.
Si el gen lacZ es inactivado por la presencia del inserto, las colonias son de color
blanco.
Además el medio de cultivo tenía ampicilina (antibiótico de selección), por lo
que las células que no insertaron el plásmido no podían crecer.
Figura 2. Mapa de restricción del plásmido pUC 19 (obtenido de Fermentas Life
Science).
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina
9
11. Rastreo (screening)
El conjunto de todos los clones, cada uno con un fragmento distinto del
genoma de Rana dalmatina, constituye la genoteca. El rastreo (screening) de ésta nos
permitió encontrar y aislar los clones de interés, que contienen los microsatélites.
Un elemento clave para identificar cualquier secuencia son las sondas:
fragmentos de ADN clonados que contienen parte de la secuencia que estamos
buscando. Éstas se marcan, usualmente con isótopos radioactivos, aunque también
existen procedimientos no radioactivos, para luego poder encontrarlas cuando hayan
hibridado con el fragmento de interés. Es una segunda selección de los microsatélites
utilizando sondas con las secuencias bi y tetranucleótidos antes seleccionadas
(GT/AC, AG/CT y TATC/GATA), y polimerasa.
A la hora de realizar la hibridación se escogieron condiciones más o menos
relajadas para que se formaran los heterodúplex aunque la homología no fuera
completa, que permitiera cierto porcentaje de malos emparejamientos entre la sonda y
el ADN diana.
Para ello, las colonias se incubaron en membranas neutras de nylon con
capacidad de fijación de los ácidos nucleicos (Hybond-N membrane), sobre medio de
cultivo sólido (LB, agar y ampicilina). Previamente, estas colonias habían sido
seleccionadas y recogidas una a una en placas de 96 celdillas. Las células de las
colonias se lisaron in situ con un tratamiento suave utilizando detergente, que disuelve
la membrana de las células y diluye las proteínas cubriéndolas de cargas negativas. El
ADN se desnaturaliza y se fija a las membranas mediante altas temperaturas.
En medio líquido (solución de hibridación) se mezclaron las membranas con el
ADN fragmentado y desnaturalizado de Rana dalmatina, y las sondas marcadas con
radioactividad y desnaturalizadas para que se produjera la hibridación. Si el ADN
sonda tiene algún grado de homología con el de algunos clones, se empareja para
generar la doble hélice. Luego se lavaron las membranas para eliminar el exceso de
sonda radioactiva y el resto de ADN no hibridado, y se secaron.
Finalmente, revelamos el resultado. Se pusieron los filtros en contacto con una
película de rayos X y al cabo de unas horas o días, la película se reveló. Las colonias
que habían hibridado quedaron marcadas como unos puntos negros que nos
indicaban su posición. Por último, se volvió a las placas matrices, donde estaban las
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 10
colonias con las células vivas, y se recuperaron los clones que habían insertado los
microsatélites.
12. Secuenciación de los clones positivos
Los clones positivos se mandaron a secuenciar en una empresa especializada.
Se diseñaron los primers con un programa informático llamado PRIMER3, que
también proporciona las condiciones óptimas de amplificación en el termociclador,
aunque había que revisarlas y algunas veces cambiarlas porque las temperaturas en
la PCR no eran las adecuadas.
13. Análisis de los microsatélites obtenidos
Utilizando el protocolo del fenol-cloroformo de nuevo, purificamos ADN de 10
individuos procedentes de tres poblaciones de la península Ibérica, aisladas entre
ellas: 4 de los robledales de la sierra de Izki (Álava), 3 del valle de Ultzama (Navarra) y
3 de Amurrio (Álava). Con estas muestras fueron probados los microsatélites aislados
y los primers diseñados para amplificarlos.
Después de la amplificación, utilizando nucleótidos sonda marcados con
radioactividad, las muestras se corrieron mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida, donde se pudo comprobar si los microsatélites eran mono o
polimórficos en las poblaciones seleccionadas.
Estos primeros muestreos se hacen para determinar si los microsatélites son
polimórficos en las poblaciones ibéricas. Como únicamente utilizamos 10 individuos,
cuando había más de un alelo, definimos el microsatélite como polimórfico. Cuando se
estudia una población de 20-100 individuos, los microsatélites se consideran altamente
polimórficos cuando se encuentran 8 alelos.
Resultados y perspectivas
En total fueron secuenciados 20 microsatélites, y diseñados y construidos
primers para todos ellos. El ADN procedente de 10 animales de la península Ibérica
fue amplificado con todos ellos para comprobar su mono o heteromorfismo. Además
se testó un microsatélite de Rana latastei y tres de R. temporaria. En ocho ocasiones
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 11
se tuvo que repetir el diseño de los primers porque no amplificaron en el termociclador.
Los resultados obtenidos fueron (tabla I):
Microsatélite Monomórfico Polimórfico
Rtemp1
X
Rtemp5
X
Rtemp9
X
RlatCa17
X
Rdal-1
X
Rdal-2
X
Rdal-3
Rdal-4
X
X
Rdal-5
X
Rdal-6
X
Rdal-7
X
Rdal-8
X
Rdal-9
X
Rdal-10
X
Rdal-11
X
Rdal-12
X
Rdal-13
X
Rdal-14
X
Rdal-15
X
Rdal-16
X
Rdal-17
X
Rdal-18
X
Rdal-19
X
Rdal-20
X
Tabla I. Carácter de los microsatélites obtenidos, en las poblaciones ibéricas.
Las poblaciones definidas como “grupo de individuos de la misma especie
aislados reproductivamente de otros grupos” están sujetas a cambios evolutivos, entre
los que se encuentran los cambios genéticos. Éstos pueden actuar disminuyendo la
variabilidad de las poblaciones (selección, deriva genética) o aumentándola (mutación,
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 12
migración). La pérdida de variabilidad genética disminuye la eficacia biológica de las
especies ante los cambios ambientales.
A pesar de que la mayor parte de los microsatélites obtenidos son
monomórficos en las poblaciones ibéricas, hay ocho que son polimórficos. Este
número se considera adecuado y suficiente para realizar los estudios poblacionales
previstos, describir la variabilidad y distribución biológica.
Los microsatélites se amplificarán en un gran número de individuos de
diferentes poblaciones para comprobar el número de alelos existente en cada uno de
ellos. Las frecuencias de los alelos de ocho microsatélites son suficientes para realizar
los análisis estadísticos y poblacionales propuestos: cuantificar la variabilidad genética
(heterocigosidad) de las poblaciones ibéricas, conocer su estructura genética y
comprobar si están siendo afectadas por problemas como la endogamia,
especialmente la de las más amenazadas, cuya gestión debe acometerse a corto
plazo, y valorar el flujo génico existente entre poblaciones y grupos de poblaciones,
parámetro muy importante en estudios enfocados a la conservación ya que en hábitats
fragmentados, como es el caso de la población ibérica, no se pueden producir las
recolonizaciones habituales, el flujo génico se ve interrumpido, los efectos genéticos
pueden afectar al precario estado de la especie y tal vez sea necesario diseñar
programas de restauración genética.
El conocimiento de todos estos parámetros es básico para acometer los planes
de conservación de la especie en la península Ibérica. Forman parte del estudio
multidisciplinar (biogeografía, hábitat, estado poblacional, etc.) al que deben
someterse las especies cuando se hacen planes de conservación.
Bibliografía
Beebee, T. J. C. & Rowe, G. 2001. Application of genetic bottleneck testing to the
investigation of amphibian declines: a case study with Natterjack Toads. Conservation
Biology, 15(1): 266-270.
Beebee, T.J.C. & Rowe, G. 2004. An introduction to molecular ecology. Oxford
University Press. 346 pp.
Brede, E. G., Rowe, G., Trojanowski, J. & Beebee, T. J. C. 2001. Polymerase chain
reaction primers for microsatellite loci in the common toad Bufo bufo. Molecular
Ecology Notes, 1: 308-310.
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 13
Burns, E. L., Eldridge, M. D. B. & Houlde, B. A. 2004. Microsatellite variation and
population structure in a declining Australian hylid Litoria aurea. Molecular Ecology, 13:
1745-1757.
Chan, L. M. 2007. Characterization of microsatellite markers for Couch´s spadefoot
toad (Scaphiopus couchii) and cross-amplification in other species of the family
Scaphiopodidae. Molecular Ecology Notes, 7: 318-320.
González, E.G. (2003). Microsatélites: sus aplicaciones en la conservación de la
biodiversidad. Graellsia, 59 (2-3): 377-388.
Gosá, A. (2002). Rana dalmatina Bonaparte, 1840. En: Atlas y Libro Rojo de los
Anfibios y Reptiles de España (Pleguezuelos, J.M., R. Márquez y M. Lizana, eds.).
Dirección General de Conservación de la Naturaleza-Asociación Herpetológica
Española (2ª impresión). Madrid: 120-122.
Julian, S. E. & King, T. L. 2003. Novel tetranucleotide microsatellite DNA markers for
the wood frog, Rana sylvatica. Molecular Ecology Notes, 3: 256-258.
Rowe, G., Beebee, T. J. C. & Burke, T. 2000. A microsatellite analysis of natterjack
toad, Bufo calamita, metapopulations. Oikos, 88: 641-651.
Schlötterer, C., Amos, B. & Tautz, D. 1991. Conservation of polymorphic simple
sequences in cetacean species. Nature, 354: 63-65.
Steinfartz, S., Küsters, D. & Tautz, D. 2004. Isolation and characterization of
polymorphic microsatellite loci in the Fire salamander Salamandra salamandra
(Amphibia: Caudata). Molecular Ecology Notes, 4: 626-628.
Strecker, U. 2006. Characterization and cross-species amplification of microsatellite
loci in a Cyprinodon species flock. Molecular Ecology Notes, 6: 843-846.
Vos, C. C., Antonisse-De Jong, A. G., Goedhart, P W. & Smulders M. J. M. 2001.
Genetic similarity as a measure for connectivity between fragmented populations of the
moor frog (Rana arvalis). Heredity, 86: 598-608.
Wieczorek, A. M.; Zamudio, R., King, T. L. & Gjetva, G. 2002. Isolation of microsatellite
loci in spotted salamanders (Ambystoma maculatum). Molecular Ecology Notes, 2:
313-315.
Zane, L., Bargelloni, L. & Patarnello, T. 2002. Strategies for microsatellite isolation: a
review. Molecular Ecology, 11: 1-16.
Aislamiento de microsatélites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 14