aislamiento y caracterización de hongos patógenos presentes en

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE HONGOS PATÓGENOS
PRESENTES EN LULO, TOMATE DE ÁRBOL Y MORA DE CASTILLA
POTENCIALMENTE PATÓGENOS PARA LOS CULTIVOS DE GULUPA
(Pasiflora edulis var. edulis sims.)
JESENIA MOLINA ROA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar el titulo de
MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
BOGOTA
2010
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE HONGOS PATÓGENOS
PRESENTES EN LULO, TOMATE DE ÁRBOL Y MORA DE CASTILLA
POTENCIALMENTE PATÓGENOS PARA LOS CULTIVOS DE GULUPA
(Pasiflora edulis var. edulis sims.)
JESENIA MOLINA ROA
APROBADO
________________________________
____________________________
Ingrid Schuler Ph.D.
Decana Académica
Janeth Arias M.Sc, M.Ed.
Directora de Carrera
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE HONGOS PATÓGENOS
PRESENTES EN LULO, TOMATE DE ÁRBOL Y MORA DE CASTILLA
POTENCIALMENTE PATÓGENOS PARA LOS CULTIVOS DE GULUPA
(Pasiflora edulis var. edulis sims.)
JESENIA MOLINA ROA
APROBADO
______________________________________
Ma. Clemencia De La Rotta M.Sc.
Directora
________________________
Luis David Gómez MS.c
Jurado
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución N° 13 de Julio de 1946.
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no publique nada contrario al dogma y a
la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
AGRADECIMIENTOS
A María Clemencia de la Rotta por darme la oportunidad de vincularme al
proyecto “Fortalecimiento de la cadena productiva de la gulupa”, y por su gran
interés y apoyo durante el desarrollo de este trabajo de grado.
A Viviana Pinzón en UMATAS de Venecia.
A Jairo Garzón en Vivero Semigar y al Ingeniero Agrónomo Miguel Ángel
Choconta en Granada.
Al
Laboratorio de Fitopatología Universidad Nacional
instalaciones.
por
prestar
sus
RESUMEN
La gulupa (Pasiflora edulis var. edulis sims),
es una de las frutas con mayor
proyección internacional, exportando más de 700.000 kilos por año, ocupando el
cuarto lugar en las exportaciones de frutales después de banano, plátano, bananito y
uchuva (Pinzón et al 2007).
En Colombia los cultivos de gulupa se encuentran ubicados entre los 1800 y 2400
m.s.n.m., con temperaturas entre 16 y 24ºC, al igual que otra variedad de cultivos, que
algunos investigadores han denominado como “cultivos de clima frio moderado” donde
se encuentran especies como el lulo (Solanum quitoense Lam), tomate de árbol
(Solanum betaceum cav Sendt) y mora de castilla (Rubus glaucus Benth). La
expansión de este tipo de cultivos favorece la aparición de enfermedades que
deterioran la calidad de los frutos y/o disminuyen los rendimientos de los cultivos, ya
que son fuente permanente de inoculo en los ecosistemas donde se cultivan.
Existen varios géneros de hongos asociados como causantes de enfermedades de
origen fungoso en estos cultivos, como Alternaría, Botrytis, Cladosporium spp, y las
especies del genero Colletotrichum, gloeosporioides y
acutatum, y se espera que
puedan tener un posible patio de infección sobre los cultivos de gulupa. De esta
manera, en este trabajo se pretende evaluar el efecto de los principales agentes
causales de enfermedades en mora de Castilla, tomate de árbol y lulo sobre frutos de
gulupa, a través de pruebas de patogenicidad cruzada in vitro.
Para este fin, la recolección de muestras se realizó en zonas productoras de estos
frutales en el departamento de Cundinamarca. La patogenicidad de los aislamientos se
evaluó en cámaras húmedas, inoculando bloques de agar de 5x5 mm con el
crecimiento del microorganismo, extraídos de colonias de 15 días de incubación, sobre
frutos verdes de gulupa de diferentes tamaños con y sin heridas. Estas cámaras se
revisaron diariamente por un periodo de tiempo de 15 días, para determinar la
aparición de los primeros síntomas de la enfermedad.
Finalmente, se demostró el potencial de infección cruzada entre los asilamientos
(Cladosporium sp, Alternaría sp, Colletotrichum sp.) de clima frio moderado sobre
frutos de gulupa, resultados que deben ser tenidos en cuenta dentro del manejo
integrado de enfermedades en las especies cultivadas en agroecosistemas similares a
los de mora de castilla, tomate de árbol y lulo.
Palabras claves: Patogenicidad cruzada in vitro, gulupa, frutales de clima frio
moderado.
ABSTRACT
Gulupa (Passiflora edulis var. Edulis sims), is a fruit with more international, exporting
more than 700,000 kilos per year, ranking fourth in exports of fruit after bananas, baby
bananas and cape gooseberry (Pinzón et al 2007).
In Colombia, crops gulupa are located between 1800 and 2400 meters, with
temperatures between 16 and 24 º C, as well as a variety of other crops, which some
researchers have called " moderately cold weather crops " which are species like Lulo
(Solanum quitoense Lam), tree tomato (Solanum betaceum Sendt cav) and blackberry
(Rubus glaucus Benth.) The expansion of such crops encouraged the emergence of
diseases that impair the quality of fruits and / or lower crop yields because they are
permanent potential inoculum in the ecosystems where they are grown.
There are several kinds of fungi to cause diseases related to fungus in these crops,
such as Alternaria, Botrytis, Cladosporium spp, and species of the genus
Colletotrichum gloeosporioides and acutatum, and is expected to have a possible
infection yard on crops of gulupa. Thus, in this work was to evaluate the effect of the
causal agents of diseases in blackberry, tree tomato and lulo on gulupa fruits, through
cross pathogenicity tests in vitro
For this purpose, the collection of samples was carried out in these fruit-producing
areas in Cundinamarca. The pathogenicity of the isolates was evaluated in moist
chambers, inoculated agar blocks of 5x5 mm with the growth of microorganism
colonies taken from 15 days of incubation, on gulupa green fruits of different sizes with
and without injuries. These cameras were checked daily for a period of 15 days, to
determine the onset of disease symptoms.
Finally, we demonstrated the potential of cross infection among the isolates
(Cladosporium sp, Alternaria sp, Colletotrichum sp.) moderately cold weather crops on
gulupa fruits. Results should be taken into account in the integrated management of
diseases in cultivated species in agroecosystems similar to blackberry, tree tomato and
lulo.
Key words: cross pathogenicity tests in vitro, gulupa ,moderately cold weather fruits.
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN
8
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
10
3. MARCO TEORICO
11
3.1 Generalidades del cultivo
11
3.2 Etiología de las principales enfermedades
12
4. OBJETIVOS
14
5. METODOLOGIA
15
5.1 Localización
15
5.2 Tipo de estudio
15
5.3 Aislamientos
16
5.4 Pruebas de patogenicidad cruzada
16
5.5 Caracterización de los aislamientos
18
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
19
6.1 Descripción de los síntomas
19
6.2 Identificación y caracterización
21
6.3 Pruebas de Patogenicidad Cruzada
26
6.4 Reaislamientos
34
7. CONCLUSIONES
35
8. RECOMENDACIONES
36
9. BIBLIOGRAFIA
37
10. ANEXOS
41
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Lulo
Figura 2. Tomate de Árbol
Figura 3. Síntomas de antracnosis en tallos de mora
Figura 4. Aislamientos de lulo en PDA.
Fig. 5. Conidias típicas del genero Cladosporium sp.
Figura 6. Aislamientos de tomate de árbol en PDA
Fig. 7. Conidias típicas del género Alternaria sp.
Figura 8. Aislamientos de tallos de mora en PDA.
Fig. 9. Forma de las conidias de Colletotrichum provenientes de de tallos de mora.
Fig. 10. Pruebas de la inoculación de Botrytis aislado de Lulo.
Figura 11. Lesiones de Cladosporium sp. aislado de lulo sobre frutos de gulupa
Figura 12. Lesiones de Alternaria sp. proveniente de tallos y frutos de Tomate de Árbol
sobre frutos de gulupa.
Figura 13. Lesiones de Colletotrichum acutatum en gulupa aislados de tomate de árbol
Figura 14.
Frutos de gulupa inoculados con Colletotrichum
gloeosporioides aislados de tallos de mora.
acutatum y
C.
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Codificación de tamaño de los frutos de gulupa.
Tabla 2. Codificación de los aislamientos usados en las pruebas de inoculación cruzada.
Tabla
3. Resultados obtenidos de las inoculaciones realizadas con heridas en la
superficie de los frutos de gulupa y sin heridas.
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Reaislamiento de los patógenos a partir de los frutos de gulupa con síntomas
INTRODUCCIÓN
En Colombia, la producción frutícola es importante comercialmente por el gran
potencial que tiene tanto a nivel nacional como internacional. Las frutas ocupan los
renglones de exportación más altos, siendo, después del café y las flores los
productos agrícolas de mayor exportación (Pinzón, 2007).
En 2006 se exportaron 37,6 millones de dólares en frutas exóticas, de los cuales 4,5
correspondieron a pasifloráceas, y dentro de este grupo, 1,9 a granadilla y 1,7 a
gulupa, con una participación del 40%, superada sólo por la granadilla que representó
el 50% (Güiza, 2009).
En el país, el área sembrada de gulupa para el año 2006 fue de 700 ha
aproximadamente (SCCH, 2007), pero el área de cultivo registrada en el ICA con fines
de exportación, solamente fue de 86,8 Ha; su producción se encuentra distribuida en
los municipios de Cundinamarca, Tolima, Boyacá y Quindío, siendo la zona de
Sumapaz la que tiene mayor participación en la producción, en esta
región del
departamento de Cundinamarca se reporta una producción de 6620 toneladas anuales
aproximadamente.
La gulupa (Passiflora edulis f. edulis), pertenece al Orden Parietales, Familia
Passifloraceae, en la que también se incluyen especies como maracuyá (Passiflora
edulis var. flavicarpa), la curuba (Passiflora mollísima), la badea (Passiflora
quadrangularis) y la granadilla (Passiflora ligularis). Al parecer son nativas del sur de
Perú y los Andes desde Venezuela hasta Chile; en otras apreciaciones, tanto el
maracuyá como la gulupa serian originarias del Brasil donde esta última es
referenciada como forma púrpura del maracuyá que aun se encuentra en estado
silvestre, aunque las divergencias ecológicas y reproductivas entre ellas dejan dudas
sobre su origen común y hasta sobre su pertenencia a una misma especie (Quintero,
2008).
Para el desarrollo de cultivos de gulupa, se han asumido prácticas y manejos
asociados con maracuyá, los cuales evidentemente no satisfacen los requerimientos
necesarios para su cultivo, debido a las diferencias marcadas entre las dos formas de
P. edulis. La producción se lleva a cabo de manera empírica con base en la tecnología
y experiencias de los productores que se tiene acerca sobre los sistemas de
producción en maracuyá, granadilla y curuba, sin embargo la información respecto al
8
cultivo y los principales factores que afectan el mismo, es prácticamente nula
(Jiménez, 2006).
Las características agroecológicas de los cultivos que se encuentran alrededor de la
gulupa, que algunos investigadores han denominado como “cultivos de clima frio
moderado” permiten la expansión de especies como el lulo (Solanum quitoense Lam),
tomate de árbol (Solanum betaceum cav Sendt) y mora de castilla (Rubus glaucus
Benth), en los cuales también se presentan varias enfermedades que deterioran la
calidad de los frutos y/o disminuyen los rendimientos, y potencialmente pueden ser
nocivas para los cultivos de gulupa, dado que se convierten en fuentes permanentes
de inoculo en los ecosistemas donde se cultivan. Existen varios géneros de hongos
asociados como causantes de enfermedades de origen fungoso en estos cultivos,
como Alternaría, Botritys, Cladosporium spp, y las especies del genero Colletotrichum,
gloeosporioides y
acutatum, y se espera que puedan tener un posible patio de
infección sobre los cultivos de gulupa. De esta manera, en este trabajo se pretende
evaluar el efecto de los principales agentes causales de enfermedades en mora de
Castilla, tomate de árbol y lulo sobre frutos de gulupa, a través de pruebas de
patogenicidad cruzada, y, contribuir a que los productores implementen un manejo
adecuado de los cultivos, con el conocimiento adquirido sobre el rango de hospederos
que
tiene
los
agentes,
que
ocasionan
enfermedades
en
los
cultivos
agroecológicamente similares a los de la gulupa.
Dadas las circunstancias, esta investigación
fue formulada dentro del proyecto
titulado: “Fortalecimiento de la cadena productiva de la gulupa (Passiflora spp)
mediante el Manejo Integrado de Problemas Fitosanitarios en pre y Poscosecha”, que
cuenta con financiación del Ministerio de Agricultura, y es ejecutado por estudiantes de
la Pontificia Universidad Javeriana, de las Facultades de Agronomía de la Universidad
Nacional de Colombia y de Cundinamarca.
9
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La gulupa es una de las frutas con mayor proyección internacional, pues ha tenido una
importante acogida en los mercados de Europa, Estados Unidos y Japón, que le ha
permitido ganar posicionamiento en el mercado internacional, exportando más de
700.000 kilos por año, ocupando el cuarto lugar en las exportaciones de frutales
después de banano, plátano, bananito y uchuva (Pinzón et al 2007).
En Colombia, se han realizado algunos estudios en gulupa dirigidos principalmente al
conocimiento del manejo de la cosecha (Pinzón, 2006) y poscosecha de frutos
(Pachón 2006 citado por Herrera, 2008), así como también al conocimiento general del
manejo agronómico del cultivo (Neira, 2006 citado por Herrera, 2008), sin embargo,
existen varios aspectos relacionados con los problemas fitosanitarios que se
desconocen, y que actualmente causan pérdidas significativas en los cultivos y
constituyen una gran limitante para la exportación, teniendo en cuenta que los
parámetros de calidad establecidos por los diferentes compradores en el ámbito
internacional son altamente exigentes en cuanto a niveles fitosanitarios.
JUSTIFICACIÓN
En Colombia los cultivos de gulupa se encuentran ubicados entre los 1800 y 2400
m.s.n.m., con temperaturas entre 16 y 24ºC, al igual que otra variedad de cultivos
como el lulo, tomate de árbol y mora de castilla. La expansión de este tipo de cultivos
favorece la aparición de enfermedades que deterioran la calidad de los frutos y/o
disminuyen los rendimientos de los cultivos, ya que son potenciales permanente de
inoculo en los ecosistemas donde se cultivan. De esta manera, se hace evidente la
necesidad de
evaluar el efecto de los agentes patógenos que ocasionan
enfermedades en los cultivos mencionados anteriormente, sobre los frutos de gulupa ,
lo que permitirá, estimar su impacto económico, y sustentar nuevas propuestas de
manejo. De esta manera, en esta investigación se evaluará el potencial de infección
cruzada entre los aislamientos de patógenos causantes de enfermedades en los
cultivos aledaños sobre frutos de gulupa, con el fin de mejorar la sostenibilidad del
cultivo y su proyección como cultivo de exportación.
10
3. MARCO TEORICO
3.1 Generalidades del cultivo
La planta de gulupa
produce anualmente un promedio de 100 kg de fruta
y
dependiendo de su calidad, entre el 70% y 90% de dicha producción es destinada a la
exportación, razón por la cual la fruta es poco conocida a nivel nacional (Ortiz, 2008).
Una planta de gulupa puede tener una vida útil de más de 4 años, sin embargo, esto
está influenciado en gran parte por la calidad y la cantidad de fruta producida, y por la
pérdida de plantas en el tiempo. En los últimos años, la presencia de cultivos de
gulupa en el municipio de Granada, Cundinamarca ha tendido a desaparecer; una de
las razones se atribuye al manejo inadecuado del cultivo, ya que no se cuenta con un
paquete tecnológico que permita a los cultivadores obtener una productividad que
cumpla con sus expectativas de producción y exportación; esta situación ha
contribuido al manejo de cultivo con un bajo nivel técnico, que ha llevado a que se
expandan las enfermedades y con ello una mayor agresividad de los patógenos,
debida en parte por unas prácticas de control redundantes, basadas en productos
químicos.
En el municipio de Granada (Cundinamarca), los productores aseguran hacer control
químico contra las principales enfermedades atribuidas en forma preliminar a los
hongos de los géneros Alternaria, Fusarium, Botritys, y Cladosporium, entre otros; y a
pesar de esto, muchos han perdido la batalla contra estas plagas y han preferido
cambiar de actividad. Sin embargo, en algunos casos los cultivos de gulupa son
rentables, si al menos se tienen en cuenta la sanidad y las prácticas agronómicas
preventivas (Quintero, 2008).
Con respecto a patógenos asociados a cultivos de pasifloras en Colombia, solo se
cuenta con un inventario de enfermedades de especies de pasifloráceas como el
Maracuyá (P.edulis f. sp. flavicarpa), la Granadilla (P. ligularis Juss) y la Curuba (P.
mollissima L.) (Buriticá, 1999), pero con respecto a los patógenos de Gulupa
(Passiflora edulis f. sp. edulis) no se presenta mayor información. En este inventario
se reportan como agentes causales de enfermedad relacionados con estos cultivos
diferentes especies de Alternaria, Cladosporium, Colletothichum y Phoma (Ascochyta);
por la cercanía taxonómica entre las especies de plantas, estos patógenos se han
considerado hasta hoy, como potenciales agentes causales de enfermedades de la
gulupa.
11
Los cultivos de gulupa se encuentran ubicados entre los 1800 y 2400 m.s.n.m., con
temperaturas entre 16 y 24ºC, ya que a alturas mayores la producción inicia entre los
12 y 18 meses y el tamaño de la fruta es menor. Se desarrolla bien en diferentes tipos
de suelo, sin embargo, son más adecuados los suelos arenosos, ya que estos
permiten un buen desarrollo radical. Los pH aconsejables deben estar entre 6,5 a 7,5,;
es esencial que haya un buen drenaje y un bajo contenido de sales, igualmente, las
plantas responden bien a contenidos altos de materia orgánica (Jiménez, 2006).
3.2 Etiología de las principales enfermedades
Dentro de las principales enfermedades de origen fungoso en los cultivo de lulo, esta
la Gota o tizón ocasionada por Phytophthora infestans; Moho blanco (Sclerotinia
sclerotiorum);
mancha clorótica (Cladosporium sp) y la antracnosis del fruto,
ocasionada por Colletotrichum gloeosporioides siendo esta ultima el problema
fitosanitario más limitante. Los cultivos de tomate de árbol son afectados también por
antracnosis (C. gloesporoides y acutatum), moho blanco (Sclerotinia sp), añublo foliar
(Botrytis sp), cenicilla (Oidium sp), mancha anillada (Phoma sp.), mancha zonada
(Alternaría ) y Phytophthora, entre otros (Lozano et al, 2007; Sanabria, 2007).
En mora se encuentran las siguientes plagas de origen fungoso: pudrición del fruto
causada por Botrytis cinerea; antracnosis (C. gloesporoides y C. acutatum) y la
marchitez por Verticillium sp. (Tamayo, 2001).
En gulupa Quintero (2008), describe las siguientes enfermedades:
Mancha parda (Alternaria passiflorae) Daños en el follaje y frutos afectando el ciclo
productivo. En las hojas se presentan manchas de color pardo rojizo, y en condiciones
de mucha humedad se presentan márgenes acuosas. Cuando las infecciones
progresan,
las
lesiones
se
agrandan
formando
surcos
concéntricos
muy
característicos. Los frutos presentan manchas necróticas circulares ligeramente
hundidas de color pardo rojizo.
Roña o costra (Cladosporium herbarum). Ataca los frutos en sus diferentes estados
de desarrollo. Se caracteriza por la presencia de lesiones ulcerosas de tamaño
variable y color pardo, distribuidas de manera aislada, aunque en algunos casos
pueden agruparse.
12
Moho gris (Botrytis cinerea).Ataca los botones florales, las flores y en los frutos.
Cuando la enfermedad se presenta en los botones florales y en los frutos se observa
un moho de color café claro, que en condiciones de alta humedad relativa cubre todo
el fruto.
Antracnosis (Colletotrichum gloeosporioides).Este hongo afecta a hojas, tallos y
frutos. En las hojas los síntomas aparecen en los márgenes, y se manifiesta como
manchas acuosas de forma circular de 5 mm de diámetro, presentan un halo de color
verde oscuro. En hojas, tallos y frutos formación de manchas pardas que luego se
necrosan. En frutos, la corteza se vuelve quebradiza. Hay formación de ulceras y
chancros (Lozano et.,al 2008).
Finalmente, la evaluación de enfermedades en frutos de gulupa, permitirá valorar la
presencia de estos patógenos en cultivos colombianos, estimar su impacto económico,
y sustentar la proposición de estrategias de manejo.
13
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Establecer si existe patogenicidad cruzada entre los hongos que producen
enfermedades en lulo (frutos), tomate de árbol (frutos y tallos) y tallos de mora de
Castilla sobre frutos de gulupa en diferentes estados de desarrollo.
4.2 Objetivos específicos
Aislar, identificar los hongos patógenos de frutos de lulo, frutos y tallos de tomate de
árbol, y tallos de mora de Castilla.
Determinar si existe patogenicidad de los agentes encontrados en lulo, tomate de árbol
y mora de castilla, sobre frutos sanos de gulupa en diferentes estados de desarrollo.
Clasificar y caracterizar taxonómicamente los hongos de acción patogénica en gulupa,
aislados de lulo, tomate de árbol y mora de castilla.
14
5. METODOLOGIA
5.1 Localización
La recolección de muestras de lulo (frutos), mora de castilla (tallos), tomate de árbol
(frutos y tallos), se realizó en zonas productoras de estos frutales, como los ubicados
en los municipios de Venecia, Choachi, Tibacuy y Granada en Cundinamarca; los
frutos usados en las pruebas de patogenicidad fueron seleccionados en los
supermercados locales, teniendo en cuenta que se encontraran libres de daños
mecánicos y síntomas de alguna enfermedad de origen parasitario; los frutos sanos de
Gulupa en diferentes estados de desarrollo se recolectaron en
los municipios de
Venecia, Tibacuy y Granada.
El procesamiento de los tejidos, aislamientos, purificación,
identificación de los
microorganismos y las pruebas de patogenicidad se realizaron en el laboratorio de
Fitopatología, de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia,
sede Bogotá.
5.2 Tipo de estudio
El tipo de investigación realizada es cualitativa y observacional, por lo cual se realizó
un análisis descriptivo de los datos mediante registros permanentes de las
observaciones sobre las diferentes pruebas adelantadas; de esta manera se
registraron datos sobre los diferentes hongos aislados de las muestras tomadas a
partir de los cultivos aledaños a la gulupa (lulo, tomate árbol, mora) y si tienen la
capacidad de infectar los diferentes estados fenológicos de los frutos de gulupa.
5.3 Aislamientos
Los frutos y tallos recolectados fueron lavados con agua corriente y jabón, y se
secaron con una toalla de papel estéril. Los tejidos de interés se obtuvieron con la
ayuda de un bisturí estéril, cortando fragmentos de tejido infectado y sano
aproximadamente de 5x5 mm. Estos fragmentos se sumergieron durante 1 minuto en
hipoclorito de sodio a una concentración de 0.525% con el fin de eliminar la flora
normal presente en el tejido. Posteriormente, los fragmentos se enjuagaron
sumergiéndolos en agua destilada estéril para eliminar los residuos de desinfectante
que pudiesen interferir con el desarrollo normal del patógeno. Después, bajo
condiciones asépticas, se secaron los fragmentos de tejido utilizando una toalla de
papel estéril, para eliminar los excesos de humedad que contribuyeran con la
contaminación del aislamiento.
15
Posteriormente, los fragmentos de tejido se sembraron en medio Agar-Papa-Dextrosa
(PDA) con acido láctico, colocando cinco fragmentos de tejido en posición equidistante
en la placa de agar a través de maniobra con pinzas (Cedeño, et al., 1993; Dhingra, et
al., 1995 citado por Contreras, 2006).
Las placas de agar sembradas se incubaron a temperatura ambiente (±20°C),
posteriormente cada uno de los aislamientos obtenidos fue resembrado en placas de
PDA por separado con el fin de purificar el hongo, y asimismo se realizaron
observaciones microscópicas en los objetivos de 10 y 40X, para tal fin los montajes se
colorearon con azul de lactofenol, con el fin de verificar la naturaleza del patógeno y
observar la morfología de las conidias, el micelio, entre otras estructuras propias de
los microorganismos (Byrne, et al., 1997). La verificación de la naturaleza del hongo se
realizó con base en la clave para la identificación de hongos imperfectos de Barnett
(1999).
5.4 Pruebas de Patogenicidad Cruzada
Este experimento se realizó con el fin de observar la capacidad patogénica que tienen
los aislamientos de lulo (frutos), mora de castilla (tallos), y tomate de árbol (frutos,
tallos) de generar síntomas de alguna enfermedad sobre frutos sanos de gulupa en
diferentes estados de desarrollo.
Las pruebas preliminares se realizaron con frutos verdes de diferentes tamaños y
totalmente sanos. De acuerdo con los resultados preliminares, las pruebas siguientes
se realizaron seleccionando frutos entre 1.4 y 4.2 cm de diámetro, el cual fue medido
con un calibrador (pie de rey) (Tabla 1). Se selecciono esta medida dado que los
primeros estadios del fruto son más susceptibles a infección por los microorganismos
que causan enfermedades en los tejidos epidermales.
Tabla 1. Codificación de tamaño de los frutos de gulupa.
E1
Diámetro
ecuatorial(cm)
1.4
Diámetro
polar(cm)
1.8
E2
2.8
3.2
E3
3.8
4.4
E4
4.2
5.0
16
Los frutos seleccionados, se lavaron sumergiéndolos previamente a la inoculación en
agua corriente y jabón durante 3-5 minutos. Luego en condiciones asépticas se
secaron con una toalla estéril.
Para obtener un ambiente de alta humedad y favorecer la germinación y penetración
del microorganismo a evaluar, se utilizaron como recipientes cámaras desecadoras,
en las que se puede manejar una humedad relativa superior al 80%, mediante la
adición de agua destilada estéril separada de los frutos por medio de un disco de
porcelana. Estas cámaras se esterilizaron previamente con luz UV por 15 minutos.
Los frutos seleccionados se colocaron en la cámara húmeda por un periodo de dos
días, para predisponer el tejido al desarrollo de la enfermedad. Después de
transcurrido este tiempo, el recipiente fue llevado a una cámara de flujo laminar, para
la inoculación de los hongos de interés. En cada una de las pruebas, se emplearon
tres frutos por cada aislamiento y dos controles.
Cada fruto fue dividido longitudinalmente con un marcador permanente, indicando los
diferentes tratamientos y cumpliendo con un diseño completamente aleatorio. Los
tratamientos empleados fueron los siguientes:
Derecha: Bloques de agar con crecimiento micelial del microorganismo estudiado,
sobre pequeñas heridas realizadas en la superficie del fruto.
Izquierda: Bloques de agar con crecimiento micelial del microorganismo, sobre la
superficie del fruto sin heridas.
17
Como control negativo, sobre la cutícula de algunos de los frutos se realizaron
pequeñas heridas con ayuda de un alfiler entomológico, otros no se lesionaron,
posteriormente sobre sitios previamente demarcados se colocaron bloques de PDA,
totalmente libres de microorganismos. Para los tratamientos con diferentes agentes
causales de enfermedades, se usaron bloques de agar de 5x5 mm con el crecimiento
del microorganismo, extraídos de colonias de 15 días de incubación.
Después de la inoculación todos los materiales permanecieron en cámara húmeda a
una temperatura de ±20°C; se utilizó una cámara húmeda por cada cepa obtenida y
dos repeticiones, para un total de tres recipientes por aislamiento.
Estas cámaras se revisaron diariamente por un periodo de tiempo de 15 días, para
determinar la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad. Una vez cumplido
el periodo de incubación, se realizaron los respectivos aislamientos para comprobar
los postulados de Koch (Cai, 2009).
5.5 Caracterización de los aislamientos
Para su observación se realizaron microcultivos con el fin de conocer las principales
características taxonómicas de los microorganismos aislados en los diferentes tejidos,
y de esta forma, determinar el género y lograr su aproximación a la especie, que
incluye la observación macroscópica y microscópica de las colonias de los
reaislamientos obtenidos en las pruebas de patogenicidad.
En la descripción macroscópica se tuvieron en cuenta aspectos como el color, forma,
elevación, borde, apariencia, densidad de las colonias, y el tipo de micelio, este se
determinó mediante la observación directa, teniendo en cuenta los siguientes criterios:
micelio algodonoso, esponjoso, velloso, si el crecimiento del micelio se extiende por la
superficie del agar, si penetra por el medio, y la presencia de micelio aéreo (Contreras,
2006), dichas clasificaciones han sido empleados para realizar y dar a conocer
descripciones morfológicas de diversos microorganismos.
La descripción microscópica, se basa especialmente en la forma y tamaño de las
conidias, la aparición de estados asexuales o sexuales, así como también la formación
de otras estructuras taxonómicas, que permiten su ubicación dentro de un género y
especie.
18
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1. DESCRIPCION DE LOS SINTOMAS
Se observó que los frutos de lulo seleccionados presentaban pudriciones blandas, de
color café claro (Fig. 1A), a las que se les realizó el aislamiento correspondiente,
encontrando a Botrytis sp. como agente causal de estas pudriciones. Como lo afirma
Tamayo (2001), en la enfermedad ocasionada por el hongo conocido como moho gris,
se presentan pudriciones blandas en el fruto, y bajo condiciones húmedas produce
una capa fructífera visible de conidióforos y conidias sobre los tejidos afectados.
En otros frutos se encontraron lesiones circulares de color café, con bordes definidos,
y ligeramente levantadas, a manera de costras pequeñas (Fig. 1B), lo cual coincide
con las características descritas por Tamayo (2001) para la enfermedad denominada
la mona, cuyo agente causal es Cladosporium sp
A
B
Figura 1. Lulo. A. Pudricion blanda ocasionada por Botrytis sp.
B. lesiones por
Cladosporium sp.
Sobre los frutos de tomate de arbol con sintomas de antracnosis, se observaron
lesiones de color pardo a negro, con bordes definidos, acompañadas de un ligero
hundimiento, localizadas cerca al pedunculo del fruto (Fig. 2A). Al realizar los
aislamientos correspondientes se identificaron las dos especies de Colletotrichum
acutatum y C. gloeosporioides, tal como lo describe
Aranzazu y Rondón (1999);
también se observaron manchas de color café oscuro, aplanadas o hundidas, pero
19
con márgenes bien definidos (Fig. 2B). En tallos se observaron manchas oscuras,
profundas que se extienden y cubren el tallo (Fig. 2D) lo que corresponde a las
características descritas por Bernal (2003), para la Mancha parda ocasionada por
Alternaria sp.
Otros frutos, presentaron lesiones ulcerosas más o menos circulares y levantadas, de
color pardo (Fig. 2C), las cuales Bernal (2003), las describe como roña o costras,
ocasionadas por el hongo Cladosporium sp., como se confirmó en los aislamientos
realizados a partir de estas lesiones.
A
B
C
D
Figura 2. Tomate de Arbol. A. Sintomas de antracnosis. B. lesiones por Alternaria . en fruto.
C. Lesiones por Cladosporium. D. Sintomas de Alternaria. en tallo.
La antracnosis en tallos de mora de castilla, se observó como manchas superficiales
de color violeta o morado de apariencia oval y con bordes bien definidos (Fig. 3) como
lo confirma Forero (2001). También fue común encontrar manchas de tamaño
reducido alrededor de las espinas que a medida que avanzan afectan toda la rama y
coloniza el tallo principal. Estas lesiones ocasionan la muerte descendente del tejido
afectado, en este caso se identificó como agente causal a genero Colletotrichum y sus
especies acutatum y gloeosporioides.
Figura 3. Sintomas de antracnosis en tallos de mora.
20
6.2. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACION
LULO
En los aislamientos de pudricines blandas en frutos de lulo , se observaron colonias
radiales , de textura algodonosa, cubiertas por un micelio denso, de color blanco y café
(Fig. 4A) Características morfológicas similares a las descritas por Ellis (2001) para
Botrytis sp.
Al realizar el aislamiento de las lesiones asociadas a Cladosporium sp. en frutos de
lulo, en medio de cultivo PDA se observaron colonias radiales, de textura
aterciopelada cubiertas por un micelio plano y velloso, de color gris o verde-grisáceo,
con borde color crema (Fig. 4 B, C), características morfológicas similares a las
descritas por Ellis (2001) para Cladosporium sp
A
B
C
Figura 4. Aislamientos de lulo en PDA. A Botrytis sp. B y C. Cladosporium sp.
De las colonias encontradas de los aislamientos de pudriciones blandas,
microscópicamente se observaron hifas septadas, hialinas y ramificadas de manera
irregular o dicotómica. Conidióforos septados. El ápice de cada conidióforo finaliza en
una ampolla donde se desarrollan conidios, solitarios, unicelulares, lisos, globosos.
Características comparables descritas por Barnett (1999) para Botrytis sp.
Con respecto, a las colonias encontradas a partir de los aislamientos de roñas o
costras en frutos de lulo, microscópicamente se observaron hifas color café claro,
septadas, conidióforos rectos o ligeramente flexibles. Las conidias se forman en hifas
libres individuales o agrupadas, son lisas, de forma variada, unas elipsoidales, y otras
limoniformes o subesfericas, a veces con 1 septo y de color marrón pálido (Fig. 5),
características comparables con C.oxysporum, descritas por Ellis (2001), que permiten
en forma preliminar ubicar al microorganismo en esta especie.; además este
21
microorganismo ha sido reportado como causante de roñas y costras en frutas de la
pasión o maracuyá (Willingham, 2002).
Fig. 5. Conidias típicas del genero Cladosporium sp.
TOMATE DE ARBOL
En los aislamientos realizados a partir de las lesiones asociadas con antracnosis, se
obtuvieron colonias radiales de borde definido y aspecto algodonoso; inicialmente el
micelio fue de color blanco y se tornó salmón o rosado, debido a la producción de
masas de esporas , caracteristica que generalmente presentan los aislamientos de C.
acutatum (Fig 6A), como lo describe Reyes (2007); mientras que las colonias de C.
gloesporoides presentan tonalidades grisáceas (blanquecinas) (Fig 6B), lo cual
coincide con Cai (2009); en las observaciones bajo el estereoscopio, se encontraron
los acervulos como masas cremosas de color naranja, comunes en esta especie del
hongo. (Fig. 6F).
A partir de los aislamientos de las manchas pardas sobre tallos, se obtuvieron colonias
planas y ligeramente algodonosas, micelio de color blanco café con reverso negro
parduzco (Fig. 6C). Mientras que en los aislamientos de frutos, se observaron colonias
de color café claro, aspecto granular y ligeramente algodonosas (Fig.6D),
características que corresponden al género Alternaria sp. (Ellis,2001).
De las roñas o costras aisladas, se presentaron colonias aterciopeladas de color
verde oliva y café, cubiertas por un micelio plano y velloso (Fig. 6E), características
macroscópicas que se asocian al género Cladosporium sp. (Tamayo,2001).
22
A
B
C
D
E
F
Figura 6. Aislamientos de tomate de árbol en PDA. A. Colletotrichum acutatum. B. C.
gloeosporioides. C. Alternaria aislada de tallo D. Alternaria aislada de fruto E. Cladosporium. F.
Acervulos con masas de esporas de C. acutatum.
Al realizar la observación microscópica de los aislamientos de tallos y frutos de las
manchas pardas en tomate de árbol se observó la presencia de Alternaria sp. Este
microorganismo presentó un micelio oscuro, conidióforos que producen conidias que
se forman a partir de hifas libres, individuales o agrupadas, con septos transversales y
longitudinales, conocidas
como dictiosporas, que son de color parduzco, como lo
menciona Barnett et al (1999).
El hongo Alternaría aislado de tallos de tomate de árbol, presento conidias elipsoidales
alargadas, con septos longitudinales y transversales y prolongación apical(Fig. 7A),
que se encuentran en cadenas individuales o ramificadas de color café pálido y que
salen de conidióforos cortos (Fig. 7B) .Estas características sugieren que posiblemente
el microorganismo aislado de tallo de tomate de árbol sea Alternaria alternata (Ellis,
2001), además es una especie reportada por Buritica (1999), para esta especie
vegetal.
En cuanto al género Alternaría aislado de frutos de Tomate de árbol, presento conidias
e hifas con septos de color marrón, en su mayoría solitarias, pero de formas variadas,
algunas ovales (Fig. 7C) y otras ovales elongadas (Fig. 7D) con septos transversales,
longitudinales y oblicuos.
23
A
B
C
D
Fig. 7. Conidias típicas del género Alternaria sp. A. Conidia elipsoidal con prolongación
apical. B. Conidias provenientes de cadenas ramificadas. C. Conidias ovales D. Conidias
ovales elongadas.
MORA DE CASTILLA
De los aislamientos de tallos de mora con síntomas de antracnosis, se observaron dos
tipos diferentes de Colletotrichum, algunas de las colonias presentaron crecimiento
radial, micelio esponjoso y denso de color crema y gris oscuro (Fig. 8A),
características que corresponden a C. gloeosporioides, además, se observaron
colonias algodonosas de color blanco y rosado (Fig. 8B) especificas de C. acutatum,
características descritas para este género según Forero (2001).
24
A
B
Figura 8. Aislamientos de tallos de mora en PDA. A. Colletotrichum gloesporoides B. C.
acutatum.
De los aislamientos de Colletotrichum realizados en este trabajo, se tuvo en cuenta la
variación en la forma de las conidias, lo cual morfológicamente se ha empleado como
un método tradicional de clasificación para diferenciar las dos especies frecuentes en
los frutales denominados como de clima frio moderado.
La forma de las conidias de C. acutatum son fusiformes, con un extremo terminado en
punta y el otro redondo, o con ambos extremos terminados en punta (Fig. 9A) mientras
que las conidias de C. gloeosporioides son de forma cilíndrica con los extremos
redondos (Fig. 9 B).
A
BB
Fig. 9. Forma de las conidias de Colletotrichum provenientes de de tallos de mora.
A. Conidias fusiformes de C. acutatum B. Conidias cilíndricas de C. gloeosporioides.
25
6.3 Pruebas de Patogenicidad cruzada
En estas pruebas, se utilizaron aislamientos procedentes de lulo, tomate de árbol y
mora sobre frutos de gulupa; en la Tabla 2, se presenta la forma como fueron
codificados los microorganismos aislados e identificados.
Tabla 2. Codificación de los aislamientos usados en las pruebas de inoculación cruzada.
PROCEDENCIA
AISLAMIENTO
TEJIDO
MICROORGANISMO
AISLADO
CODIGO
Lulo
Fruto
Botrytis
LFB
Lulo
Fruto
Cladosporium
LFCl
Tomate de arbol
Tallo
Alternaria
TTA
Tomate de arbol
Fruto
Alternaria
TFA
Tomate de árbol
Fruto
Cladosporium
TFCL
Tomate de arbol
Fruto
C. acutatum
TFCa
Tomate de arbol
Fruto
C. gloeosporioides
TFCg
Mora
tallo
C. acutatum
MTCa
Mora
tallo
C. gloeosporioides
MTCg
A continuación se presentan los resultados obtenidos de las inoculaciones realizadas
con heridas en la superficie de los frutos de gulupa y sin heridas, aisladas de lulo
tomate de árbol y mora.
26
Tabla 3. Pruebas de inoculación de los aislamientos de lulo, tomate de árbol, y mora de
castilla sobre frutos de gulupa con (CH) y sin heridas (SH).
Hospedero / código aislamiento
Lulo
T. árbol
Mora
LFB
LFCL
TTA
TFA
TFca
TFcg
TFCL
MTca
MTcg
E1
CH SH
*
*
+
*
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
*
Tamaño frutos gulupa
E2
E3
E4
CH SH
CH SH CH SH
*
*
*
*
*
*
+
*
+
*
+
*
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
*
+
*
+
*
+ Positivo: Síntomas y enfermedad
- Negativo: No presenta ninguna sintomatología
* Variante: Lesiones atípicas sin desarrollo de la enfermedad
Los resultados de la inoculación con LFB, sobre frutos de gulupa fueron variables en
los dos casos, con y sin heridas; después del periodo de incubación, se observó
crecimiento del microorganismo inoculado sobre los bloques de agar (Fig. 10 A) y en la
superficie del fruto se presentaron en los FCH (frutos con heridas) lesiones de color
pardo y forma irregular (Fig. 10B); sobre los FSH (frutos sin heridas) las manchas
fueron redondas y de aspecto pálido (Fig. 10C). Sin embargo, el microorganismos no
produjo una capa fructífera visible de moho gris sobre los tejidos afectados,
característica de las enfermedades por Botritys bajo condiciones húmedas (Agrios,
2006) y también reportada por Quintero en 2008, sobre frutos de gulupa afectados por
el hongo. En los dos casos el microorganismo se reaisló sobre medio de cultivo
artificial (Anexo 1A).
27
A
B
C
Fig. 10. Pruebas de la inoculación de Botrytis aislado de Lulo. A. crecimiento del
microorganismo después de 15 días de incubación. B. lesiones irregulares de color pardo en
fruto E2 con heridas. C. lesiones redondas de aspecto pálido en frutos E4 sin heridas
Dadas las características anteriores, es posible que el microorganismo haya logrado
penetrar en el hospedero y producir diversos grados de infección. Sin embargo,
según Agrios (2006), incluso después de que el patógeno ha penetrado las estructuras
de defensa, el hospedero muestra varios grados de resistencia que consisten en la
formación de estructuras que tienen cierta actividad para contrarrestar las invasiones
posteriores de los patógenos, como la formación de capas de corcho, y de tejidos
necróticos. Teniendo en cuentas las lesiones de apariencia corchosa presentadas
sobre la superficie de los frutos (Fig. 10B), posiblemente
sea resultado de la
estimulación que ejercen las sustancias que secreta el patógeno sobre las células del
hospedante. Las capas de corcho no solo inhiben el avance que pueda intentar el
patógeno sobre las otras células, sino también bloquean la difusión de cualquier
sustancia que el patógeno pueda secretar. Además, estos tejidos necróticos, aíslan al
microorganismo de las sustancias vivas de las que depende para nutrirse, crecer y
propagarse. De esta manera, Botrytis se comporta como microorganismo saprófito y
no como patógeno, porque produce algunos síntomas más no desarrolla el ciclo de la
enfermedad sobre frutos de gulupa, aunque es posible que permanezca en estado
quiescente en los frutos evaluados, y en campo a medida que los frutos van
madurando, el micelio quiescente se active e induzca los síntomas característicos del
moho gris.
Con respecto a las inoculaciones con
Cladosporium sp., LFCl el periodo de
incubación fue de 12 días en los frutos de los estados E1 y E2 que presentaron
manchas circulares pequeñas con bordes definidos de color café claro y centro pálido
(Fig. 11A); sobre los frutos E3 y E4 se presentaron lesiones ulcerosas más o menos
circulares y levantadas, de color café claro, que podían estar aisladas o agrupadas
(Fig. 11B), aspectos que según Agrios (2006), Quintero (2008) y Galindo (2010), es
28
característico del microorganismo. Sin embargo, las lesiones en frutos de todos los
estados fueron diferentes, lo que sugiere un progreso de chancro hasta roña a medida
que el fruto crece y se desarrolla la enfermedad. De esta manera sobre los FSH se
presentaron lesiones pequeñas de color pardo sin forma definida (Fig. 11C); en todos
los casos el microorganismo fue reaislado a partir de las lesiones obtenidas (Anexo
1B), lo cual indica que es posible que bajo ciertas condiciones Cladosporium sp. no
posea la capacidad necesaria para iniciar
la enfermedad, cuando emplea como
mecanismo de penetración las aberturas naturales o la forma directa, necesitando de
heridas para inducir la sintomatología, lo cual coincide con lo citado por Torres (1999),
quien menciona que la afección por Cladosporium sp., se inicia con la presencia de
un vector, el cual al introducir el estilete en el epicarpio, causa heridas que estimulan la
reacción en los tejidos de la planta produciendo zonas corchosas.
Según los resultados obtenidos en el presente trabajo se sabe que el mecanismo de
penetración de Cladosporium posiblemente oxysporum en los frutos de gulupa es más
exitoso mediante heridas previamente ocasionadas, lo cual se confirma con el trabajo
de Rojas (2010).
A
B
C
Figura 11. Lesiones de Cladosporium sp. aislado de lulo sobre frutos de gulupa. A.
manchas circulares de borde definido. B. lesiones ulcerosas más o menos circulares y
levantadas. C. lesiones pequeñas de color pardo a vino tinto en fruto sin heridas.
En relación con los resultados obtenidos sobre los frutos de gulupa inoculados con
TTA,(Tabla 3) se observó sintomatología a los 10 ddi (días después de infección)
sobre la superficie de los tejidos se presentaron manchas ligeramente hundidas con
borde definido y de color parduzco, (Fig. 12A), al realizar un corte superficial se
observaron lesiones profundas, en el mesocarpio del fruto (Fig. 12B); algunos de los
frutos presentaron lesiones circulares de 5mm de diámetro, ligeramente hundidas y de
color pardo rojizo con bordes bien definidas (Fig. 12C), sintomatología que coincide
con lo reportado por Agrios (2006) y Quintero (2008).
29
A
B
C
D
E
F
Figura 12. Lesiones de Alternaria sp. proveniente de tallos(A, B, C) y frutos (D, E, F) de
Tomate de Árbol sobre frutos de gulupa.
En los FCH inoculados con TFA se presentaron síntomas a los 15 ddi manchas
similares a las descritas anteriormente (Fig.12 D, E, F), pero superficiales, que no
afectaron el mesocarpio. En los FSH de los estados E3 y E4 no presentaron algún
tipo de síntomas.
Al comparar los resultados de las inoculaciones con TTA y TFA es posible que por
las diferencias encontradas en el periodo de incubación, la facilidad de penetrar la
superficie del fruto (con y sin heridas), y la severidad de la sintomatología, se trate de
dos especies distintas de Alternaria, lo cual se refuerza con las características
macroscópicas de los reaislamientos (ANEXO 1.D, E) y microscópicas descritas
anteriormente.
Con respecto a la inoculación de TFCa, se observaron resultados positivos en FCH y
FSH a los 15 ddi; se desarrollaron lesiones profundas, con márgenes definidos de
color café negro y con centro blanco grisoso, que avanzan al endocarpio, por lo
general acompañadas de micelios del microorganismo inoculado (Fig.13). Mientras
que,
en las inoculaciones con C. gloesporoides TG4 se observaron resultados
positivos en frutos E1 y E4 con heridas, y E1 y E2 sin heridas, presentando lesiones
en la superficie del exocarpio de menor tamaño en el mismo tiempo pos infección. Los
30
frutos E3 y E4 sin heridas no presentaron ninguna lesión al compararlos con los
controles.
Figura 13. Lesiones de Colletotrichum acutatum en gulupa aislados de tomate de árbol
Al inocular los frutos de gulupa con TFCl no se presentó ningún tipo de lesión, es
posible que se deba, a que algunos patógenos son específicos de una especie
particular o de cierto género de plantas, mientras que otros tienen un rango más
amplio que incluye
muchos grupos taxonómicos de plantas superiores. También
puede ser por la variabilidad en las condiciones de la temperatura ambiental, bajo
las cuales el patógeno no puede atacar a su hospedero, o a su resistencia a la
infección a pesar de que estén presentes ambos componentes , no se produce alguna
enfermedad en el hospedero (Agrios, 2006).
Sobre los resultados positivos, obtenidos en la inoculación con MTCa sobre los FCH y
FSH (Tabla 3) cabe destacar que este microorganismo presentó sintomatología
característica en los frutos a los 5 ddi. En los frutos E3 y E4, se presentaron lesiones
profundas en el mesocarpio, de aspecto redondo con borde definido de color café
claro y hendidas en el centro, con presencia de micelio (Fig. 14A y B), mientras que los
frutos pequeños E1 y E2 presentaron momificación, mostrando una colonización total
del microorganismo. En las inoculaciones de
MTCg sobre FCH se presentaron
síntomas característicos a los 12 ddi (Fig. 14C). En los FSH inoculados, se
presentaron lesiones escasas, de tamaño pequeño, redondas (puntos) y de color café
oscuro. En los dos casos el microorganismo se reaisló sobre medio de cultivo artificial
(Anexo 1F).
31
A
B
C
Figura 14. Frutos de gulupa inoculados con Colletotrichum acutatum (A y B) y C.
gloeosporioides (C) aislados de tallos de mora.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos de la inoculación del genero
Colletotrichum sobre frutos inmaduros de gulupa, se puede determinar que C.
acutatum tiene mayor actividad patogénica sobre frutos inmaduros de gulupa que C.
gloeosporioides, dado que al comparar las cepas TFCa y MTCa se puede determinar
que estas últimas fueron más agresivas, ya que el periodo de incubación fue de 5 días,
y presentó colonización total en frutos pequeños, y las lesiones características en
frutos de los estados E3 y E4. Además, la cantidad de crecimiento del patógeno y la
severidad del tejido afectado evidencian la efectividad o patogenicidad del
microorganismo. Este periodo de incubación de 5 días coincide con lo reportado para
C. acutatum en otros frutos, en los que se observa gran degradación del tejido a las
120 horas pos inoculación (Wharton, 2009).
Con respecto a la patogenicidad de C. gloeosporioides, es necesario tener en cuenta
que para que se produzca una infección efectiva, no basta con que el patógeno entre
en contacto con su hospedero. Los patógenos sintetizan (enzimas, polisacáridos,
toxinas) ya sea durante el curso normal de sus funciones o en el momento de
desarrollarse sobre ciertos sustratos (Agrios, 2006).
Para que el hongo pueda penetrar la cutícula del fruto requiere de un complejo
enzimático que le permita macerar la cutícula y penetrar en exocarpio. Según Wattad y
Prusky (1994), la secreción de enzimas pectolíticas responsables de la maceración de
la pared celular durante el ataque de C. gloeosporioides, es un factor limitante durante
la patogénesis y las condiciones que afectan la secreción de estas enzimas, pueden
evitar la activación del Colletotrichum sp en la colonización de frutos inmaduros (Parra,
2008). Otro factor que determina la relación parasítica hospedero- patógeno es el pH
del hospedero, que puede ser concluyente en la dinámica de las infecciones
quiescentes en los diferentes estados fenológicos de los frutos. Yakoby et al, (2000),
32
sugieren que la secreción de pectinasas están influenciadas por el pH, indicando que
la susceptibilidad de los frutos está regulada por decrecimientos de compuestos
antifungales e incrementos en el pH del pericarpio, que modula la secreción de
pectinasas y otras enzimas.
Las pectinasas de C. gloeosporioides son secretadas con valores de pH mayores a
5.8, aunque también puede ser producida con valores de 5.1 (Prusky, et al, 2001), lo
que indica que cuando los niveles de pH del hospedero son adecuados, se puede
iniciar el proceso de infección. Teniendo en cuenta lo anterior y lo citado por Pinzón,
(2006) los valores de pH en los estados de madurez de la gulupa están entre 2,99 y
3,60 lo cual permite suponer que posiblemente C. gloeosporioides penetró en los
frutos inmaduros de gulupa, y se encuentra en estado inactivo o quiescente, y en este
estudio, no mostro una patogenicidad tan severa como C. acutatum, pero que en
campo, en donde el microorganismo de una u otra manera se ve favorecido, presente
los síntomas de la enfermedad. De esta manera, es importante tener en cuenta que el
género Colletotrichum puede infectar en todos los estados de desarrollo del fruto
(Hartung, & al., 1981;Daykin & Milholland, 1984, Adaskaveg & al., 2000, citados por
Wharton, 2009).
La patogenicidad de C. acutatum en este trabajo, posiblemente se deba a que este
microorganismo puede aumentar los niveles de pH por la secreción de amonio como
ocurre en otros frutos con antracnosis (Prusky et al., 2001) para superar las barreras
fisiológicas impuestas por el hospedero. La regulación que C. acutatum, hace sobre el
pH es un factor de patogenicidad importante que debe ser tenido en cuenta a la hora
de establecer un manejo de la enfermedad.
Por otro lado, los dos aislamientos de C. gloeosporioides utilizados TFCg y MTCg se
pueden comparar en este estudio, de acuerdo a los resultados, en los cuales el
segundo presento mayor patogenicidad, teniendo en cuenta que el periodo de
incubación fue menor (12 días), síntomas
característicos en FCH y FSH , como
lesiones pequeñas; que posiblemente expliquen la penetración y permanencia del
microorganismo en un estado de latencia en los tejidos, donde el crecimiento del
hongo se restringe a la capa epidérmica
33
6.4 Reaislamientos
El posterior reaislamiento de los patógenos a partir de los frutos de gulupa con
síntomas, confirmó la presencia de los mismos indicando el cumplimiento de los
postulados de Koch (Anexo 1).
Finalmente, se pueden determinar que los hongos patógenos aislados de algunos de
los frutales cultivados en zonas agroecológicas similares a los de gulupa que se
evaluaron en este estudio, presentaron lesiones características de enfermedades en
frutos inmaduros de gulupa, que taxonómicamente se clasificaron en los géneros:
Cladosporium posiblemente oxysporum aislado de frutos de lulo, Alternaria
posiblemente alternata de tallos de tomate de árbol y C. acutatum de tallos de mora,
los cuales penetraron fácilmente los tejidos superficiales del frutos, en presencia o
ausencia de heridas.
34
CONCLUSIONES
Se realizó el aislamiento y la identificación de los siguientes hongos: Botrytis sp.
Cladosporium sp. en lulo; Colletotrichum sp., Alternaria sp. , y Cladosporium sp., en
tomate de árbol, y Colletotrichum sp. en mora.
Se demostró el potencial de infección cruzada entre los aislamientos de Cladosporium
sp posiblemente oxysporum proveniente de lulo, Alternaría sp. posiblemente alternata
de tomate de árbol y Colletotrichum de mora sobre frutos inmaduros de gulupa, lo cual
permite sugerir a los productores la implementación de nuevas estrategias de manejo
dado el potencial permanente de inoculo en los ecosistemas donde se cultivan.
Aunque el género Colletotrichum presenta gran variabilidad, en este estudio los
sistemas tradicionales de clasificación con base en las características morfológicas y
los resultados en las pruebas de patogenicidad permitieron establecer algunos criterios
de clasificación de especies dentro del género.
De acuerdo a la severidad de las lesiones y el tiempo de incubación en este estudio,
se puede deducir que Colletotrichum acutatum proveniente de tallos de mora es el
microorganismo más patógeno sobre frutos verdes de gulupa, ya que produjo
síntomas severos que necrosaron en forma rápida gran parte del tejido inoculado.
En cuanto a las prácticas de manejo, este trabajo, indica en forma preliminar que con
la aplicación de Benomyl, utilizado en los cultivos de gulupa, es muy probable que no
se esté ejerciendo algún control sobre C. acutatum y que la incidencia de la
enfermedad pueda ser mayor a medida que se incrementan las áreas de cultivo y se
hace uso inadecuado del control químico.
35
RECOMENDACIONES
Adelantar pruebas de patogenicidad cruzada con Colletotrichum sp. proveniente de
lulo. Al igual que con microorganismos patógenos provenientes de frijol, que es otra
planta asociada a los cultivos de gulupa, en los municipios de Venecia, San Bernardo
y Granada en Cundinamarca.
Complementar este estudio con pruebas tanto biológicas como de caracterización
molecular; ya que finalmente lo que determina el inicio y desarrollo de las
enfermedades es la presencia e interacción concurrentes de genes específicos que
determinan la virulencia en el patógeno y la susceptibilidad en la planta hospedante.
36
BILIOGRAFIA
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ANEXOS
ANEXO 1. Reaislamiento de los patógenos a partir de los frutos de gulupa con
síntomas
A. Botrytis sp.(LFB) B. Cladoporium sp.(LFCL) C. Colletotrichum acutatum (TFca). D.
Alternaria (TTA) E. Alternaria (TFA) F. C. gloeosporioides. (MTcg)
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