Tesis Electrónicas UACh - Universidad Austral de Chile

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias Agrarias
Escuela de Ingeniería en Alimentos
Caracterización de Cepas de Bacillus Aisladas de
Muestras de Miel y de Colmena Mediante la
Secuenciación del Gen Ribosomal 16S
Memoria presentada como parte de los
requisitos para optar al Título de
Ingeniero en Alimentos.
Katherine Angélica Valderas Álvarez
VALDIVIA – CHILE
2012
PROFESOR PATROCINANTE:
____________________________________
Renate Schöbitz Twele
Tecnólogo Médico, M.Sc.
Instituto de Ciencias y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Ciencias Agrarias
PROFESORES INFORMANTES:
____________________________________
Alex Romero Zúñiga
Bioquímico, Ph. D.
Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática
Facultad de Ciencias Veterinarias
____________________________________
Ociel Muñoz Fariña
Bioquímico, Ph. D.
Instituto de Ciencias y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Ciencias Agrarias
ÍNDICE DE MATERIA
Título
Página
RESUMEN
1
SUMMARY
2
1
INTRODUCCIÓN
3
2
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
5
2.1
Las abejas y la apicultura
5
2.2
Enfermedades y enemigos de las abejas
6
2.2.1
Loque Americana (L.A).
8
2.2.2
Paenibacillus larvae.
10
2.3
Ribosoma bacteriano
11
2.3.1
Caracterización bacteriana utilizando el gen ribosomal 16S
13
2.3.2
Operones ribosómicos
13
2.4
Clonamiento del gen ribosomal 16S
15
3
MATERIAL Y MÉTODO
17
3.1
Materiales y equipos utilizados
17
3.1.1
Equipos
17
3.1.2
Medios de cultivo y reactivos
17
3.1.3
Material
17
3.1.4
Material biológico
17
3.2
Selección de la muestra a analizar
18
3.3
Método
18
2
3.3.1
Cultivo de las cepas de Bacillus
18
3.3.2
Extracción del ADN genómico de la cepas de Bacillus.
18
3.3.3
Amplificación del gen ribosomal 16S
19
3.3.4
Electroforesis en gel de agarosa al 1,5%
21
3.3.5
Purificación del gen ribosomal 16S amplificado por PCR desde el gel de
22
agarosa.
3.3.6
Clonamiento del gen ribosomal 16S
24
3.3.6.1
Ligación del producto PCR
24
3.3.6.2 Transformación de E. coli competentes con el ADN plasmidial
25
3.3.6.3 Extracción del ADN plasmidial por el Método de Ebullición
26
3.3.7
Análisis de restricción de ADN plasmidial purificado
26
3.3.8
Extracción de ADN plasmidial, para secuenciación
27
3.3.9
Lectura y análisis de secuencias
28
3.3.10
Prueba de antagonismo sobre césped
29
3.3.10.1 Antagonismo entre cepas de Bacillus
29
3.3.10.2 Antagonismo de cepas de Bacillus, frente a P. larvae
30
4
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
32
4.1
Preparación de la muestra
32
4.2
Cuantificación del ADN genómico
33
4.3
Amplificación del gen ARNr 16S por medio de PCR
34
4.4
Purificación del gen ARNr 16S
35
4.5
Clonamiento del gen ARNr 16S de los aislados de Bacillus
36
4.5.1
Transformación bacteriana
37
4.6
Secuenciación e identificación de las cepas de Bacillus
41
4.7
Pruebas de antagonismo
43
3
4.7.1
Antagonismo entre las cepas de Bacillus identificadas
45
4.7.2
Antagonismo de las cepas de Bacillus frente a P. larvae.
47
5
CONCLUSIONES
50
6
BIBLIOGRAFÍA
51
ANEXO
58
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro
1
Página
Principales enfermedades apícolas en Chile, según naturaleza del agente,
7
etapa de la biología y ocurrencia.
2
Resumen de síntomas de la enfermedad de la Loque Americana.
9
3
Mezcla utilizada en la reacción de PCR para amplificar el gen ARNr 16S.
20
4
Componentes para agregar nucleótidos de adenina a los productos de PCR
24
purificados.
5
Componentes para la ligación del producto de PCR en el plasmidio
25
pGEMT-Easy.
6
Cuantificación del ADN genómico extraído de Bacillus.
33
7
Cuantificación del ADN enviado a secuenciar.
41
8
Resumen de la identificación bacteriana después de la secuenciación.
43
9
Densidad óptica (Do) a 620nm de las cepas incubadas en CST.
44
10
Recuento a las 12h de incubación en AST.
45
11
Halos de inhibición en las pruebas de antagonismo entre cepas del
46
género Bacillus.
12 Tamaño de los halos de inhibición de la prueba de antagonismo de las
cepas 87, 95, 97 y mezclas de ellas, contra P. larvae ATCC 25745 y de
Campo.
48
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
1
Página
Esporas de P. larvae de cadáveres de larvas de abejas (izquierda) y
11
esporas de P. larvae de cultivo (derecha).
2
El ribosoma bacteriano. Se muestra su estructura, las subunidades y
12
las macromoléculas que lo componen.
3
Representación esquemática de un operón ribosómico (rrn).
14
A) Genes estructurales de los tres tipos de ARNr (rrs, rrl y rrf), los
promotores P1 y P2, y las regiones intergénicas (IG). B) Amplificación
del gen rrs (ADNr 16S). Se indica la posición de los iniciadores I1 (directo),
I2 e I3 (reversos) utilizados para la amplificación (y posterior secuenciación)
del gen completo (I1-I3; amplicón de 1.500pb, aproximadamente) o de un
fragmento menor (11-I2; 500pb correspondientes al extremo 59 del gen) C)
Visualización de ambos fragmentos por electroforesis en gel de agarosa.
4
Esquema general del proceso de clonación.
16
5
Protocolo de extracción del ADN genómico de las cepas de Bacillus.
19
6
Protocolo de amplificación del ADN ribosomal 16S, método de la
21
polimerasa en cadena “PCR”.
7
Protocolo preparación del gel de agarosa al 1,5%.
22
8
Protocolo purificación del ADN amplificado por PCR desde el gel de agarosa.
23
9
Protocolo de extracción de ADN plasmidial.
28
10
Pasos para prueba de antagonismo entre cepas del género Bacillus.
30
11
Pasos para la prueba de antagonismo entre las cepas de P. larvae contra
31
las cepas del género Bacillus.
12
Colonias puras de las ocho cepas del género Bacillus en Agar Soya Tripticasa. 32
13
Electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, que muestra la amplificación
35
del ADNr 16S mediante PCR de ocho aislados de Bacillus. Carriles: Est,
marcador de peso molecular de 100-3000pb; 1g; 20; 22; 67; 87; 92; 95 y 97,
aislados de Bacillus; (+), control positivo; (-), control negativo de F.
psychrophilum.
14
Electroforesis del gen ARNr 16S purificado. Carriles: Est, marcador
36
de peso molecular de 100-3000pb; 1g; 20; 22; 67; 87; 92; 95 y 97,
aislados de Bacillus.
15
Cultivo de E. coli transformantes en placas de agar LB/ampicilina/IPTG
37
y X-Gal.
16
Análisis electroforético del ADN plasmidial recombinante digerido
39
con EcoRI. Carriles: Est, marcador de peso molecular de 100-3.000pb;
921, 922, 923, 201, 202 y 203, aislados de Bacillus.
17
Análisis electroforético del ADN plasmidial conteniendo el gen 16S con
40
la enzima de restricción EcoRI. Carriles: Est, marcador de peso molecular
de 100-3000pb; 97; 87; 67 y 95, aislados de Bacillus.
18
Análisis electroforético del ADN plasmidial conteniendo el gen 16S con
40
la enzima de restricción EcoRI. Carriles: Est, marcador de peso.
19
Pruebas de antagonismo sobre agar soya tripticasa entre cepas de
45
Bacillus, con inhibición de las cepas 95 y 97 por la cepa 87.
20
Pruebas de antagonismo sobre agar MYPGP entre cepas del género
Bacillus frente a P. larvae ATCC 25745 y de Campo.
47
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo
Página
1
Medios de cultivos y buffer
58
2
Electroforesis en gel de garosa para la purificación de los productos de PCR
60
3
Análisis electroforético del ADN plasmidial recombinante digerido con EcoRI.
61
4
Secuencias de las cepas del genero Bacillus.
64
1
RESUMEN
La Loque Americana (L.A), es una de las enfermedades más perjudiciales que afecta a
las abejas de la especie Apis mellifera L, no sólo mata las larvas infectadas, también es
potencialmente letal para las colonias. Esta enfermedad es altamente contagiosa, ya
que su propagación se ve facilitada por el intercambio entre el material de la colmena y
las colonias de abejas.
El objetivo del presente trabajo fue aislar e identificar hasta el nivel de especie, cepas
pertenecientes al género Bacillus, aisladas de muestras de miel y material de colmena
para ser evaluadas como antagonistas frente a las cepas de Paenibacillus larvae
(ATCC 25745 y de campo), agente causal de la L.A. La identificación se realizó
mediante la secuenciación del gen ARNr 16S, para esto se amplificó y clonó el gen
ribosomal 16S de las cepas en el plasmidio pGEMT-Easy y se envío a secuenciar el
gen 16S contenido en el plasmidio de las ocho cepas de Bacillus. Las secuencias
obtenidas se compararon con la base de datos para conocer su identidad.
No se encontraron cepas de P. larvae entre los Bacillus identificados. Las especies
correspondieron a B. cereus, B. subtilis y B. pumilus. De las ocho cepas identificadas,
tres fueron chequeadas como mezcla e individualmente contra las cepas de P. larvae.
Estas pruebas de antagonismo, revelaron inhibición de la cepa 87 (B. pumilus) al ser
enfrentada a la cepa 95 (B. subtilis) y 97 (B. pumilus), de estas tres cepas las que
presentaron mayor actividad antagónica contra P. larvae ATCC 25745 y de campo, fue
la especie 95 (B. subtilis) y 97 (B. pumilus) respectivamente. Estas especies son
inocuas para el apiario y para el ser humano, por lo tanto poseen un gran potencial
como fuente de compuestos biocontroladores para la inhibición del patógeno.
2
SUMMARY
American Foulbrood (A.F) is one of the most harmful disease that affects the bees of
the Apis mellifera L. species. It not only kills the infected larvae, but also is potentially
lethal for the colonies. This disease is highly contagious, because it is facilitated by the
exchange between the material of the beehive and the bee colonies.
The objective of the present study was, to isolate and identify to the species level,
strains belonging to the genus Bacillus, isolated from honey samples and beehive
material. The strains were evaluated as antagonists against Paenibacillus larvae ATCC
25745 and a field strain, causative agent of the A.F. The identification was performed
by sequencing the 16S rRNA gene. For this purpose the gene of each strain was
amplified and cloned in the plasmid pGEMT-Easy. The plasmid containing the gene
was sent abroad for sequencing, wich was done for the eight Bacillus strains. The
sequences obtained were compared with the database to find their identity.
No strains belonging to the species P. larvae were identified among the Bacillus, the
species were identified as B. cereus, B. subtilis and B. pumilus. Of the eight strains
identified, three were checked against the two P. larvae strain, individually and as a
mixture. Such antagonism tests revealed an inhibition of the strain 87 (B. pumilus) when
faced with the strains 95 (B. subtilis) and 97 (B. pumilus). These two Bacillus strains
showed the highest antagonistic activity against P. larvae ATCC 25745 and P. larvae
field strain. These species are harmless to the apiary and humans, thus have a great
potential like biocontroler compounds for the inhibition of the pathogen.
3
1 INTRODUCCIÓN
La “Loque Americana” (LA) es una de las enfermedades que afecta más severamente
a las crías de abejas del Apis mellifera L., según PICCINI et al., (2004). El agente
causante de la L.A nombrado por HEYNDRICKX et al., (1996) es el Paenibacillus
larvae, una bacteria Gram positiva, que produce esporas, las cuales resultan ser
extremadamente resistentes a las altas temperaturas y agentes químicos (ANTÚNEZ
et al., 2004). Esta enfermedad se encuentra presente en todo el mundo, reportándose
casos en casi todas las regiones apícolas de los cinco continentes.
En Chile se reportaron dos casos de P. larvae en el año 2001 fuera de la III región.
Posteriormente el 15 de Octubre de 2005, en la provincia de Curicó, VII Región, se
enfrentó un brote de “Loque Americana”, inmediatamente se presentaron casos en las
Regiones III, V, RM, VI, VIII y X. Hoy en día esta enfermedad se considera establecida
con una condición de endemismo, de presentación esporádica y localizada en ciertas
regiones del país (SERVICIO AGRÍCOLA Y GANADERO (SAG), 2009).
En el año 1980, un nuevo estándar para identificación de bacterias comenzó a ser
desarrollado. Estudios mostraron que las relaciones filogenéticas de bacterias, y, en
efecto, de todas las formas de vida, pueden ser determinadas por la comparación de
una parte estable del código genético. La parte del ADN que ahora se utiliza
comúnmente para propósitos taxonómicos en bacterias, es el gen ARNr 16S
(CLARRIDGE, 2004). La elección de éste gen como herramienta óptima para tales
efectos, se basa en las observaciones y las hipótesis de conservación ribosomal.
La secuenciación del gen ARNr 16S proporciona lo medios precisos para la
identificación de microorganismos. La calidad de esta identificación, depende
principalmente de la base de datos que se utiliza (HARMSEN y KARCH, 2004).
Es así como actualmente, los dos tratados fundamentales de bacteriología, el Bergey`s
Manual of Systematic Bacteriology y The Prokaryotes, basan su estructuración del
4
mundo procariota, en las relaciones filogenéticas establecida por esta misma
macromolécula.
Como señala ANTÚNEZ et al., (2004), la confirmación específica de P. larvae, se
puede realizar por medio del método de detección PCR (reacción en cadena de la
polimerasa). Para esto se amplifica selectivamente por medio de partidores
universales, un fragmento del gen ARNr 16S de P. larvae extraído de un cultivo puro
(PICCINI et al., 2002).
HIPOTESIS
Cepas de bacterias pertenecientes al género Bacillus aisladas de miel y colmenas
identificadas por medio de la secuenciación del gen ribosomal 16S, pueden utilizarse
como controladores biológicos de Paenibacillus larvae.
Objetivo general
Caracterizar cepas del género Bacillus a partir de aislados de miel y colmena, por
medio de la secuenciación del gen ribosomal 16S y evaluar el antagonismo de estas
cepas frente a P. larvae mediante la prueba de antagonismo en placa.
Objetivos específicos

Confirmar la pureza de los cultivos conservados congelados de ocho cepas de
Bacillus, aisladas a partir de miel y de material de colmenas.

Amplificar y clonar el gen 16S de las cepas de Bacillus, en el plasmidio pGEMT-
Easy.

Secuenciar el gen 16S contenido en el plasmidio de las ocho cepas de Bacillus
y compararlo con las secuencias de bases de datos, para conocer su identidad.

Estudiar mediante pruebas de antagonismo en placa la interacción entre cepas
de Bacillus.

Realizar pruebas de antagonismo en placa de las cepas de Bacillus
identificadas contra dos cepas de P. larvae.
5
2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Las abejas y la apicultura
La abeja es un insecto del orden de los himenópteros, la especie Apis mellifera L. es la
más desarrollada en la apicultura y se ha domesticado para poder generar productos
en cantidades importantes (TRHLIN et al., 2011). Es un insecto social cuya
organización responde al de una colonia, en la cual existe una hembra fértil llamada
reina, múltiples hembras infértiles llamadas obreras y una casta de machos con tareas
principales de tipo reproductivas llamados zánganos, que viven sólo en época de
primavera y verano (PADILLA y CUESTA, 2003).
La apicultura es una actividad agropecuaria orientada a la crianza de abejas, para
obtener beneficios derivados de la venta de una multiplicidad de productos apícolas
(miel, polen, cera, jalea real, propóleo, veneno de abejas) y de la acción polinizadora
en los cultivos, que contribuye a la preservación de la biodiversidad botánica, la
actividad agrícola y más particularmente la fruticultura (ALVIS et al., 2009).
En Chile, la apicultura es uno de los rubros que presenta mayor crecimiento, durante
los últimos años ha alcanzado un gran desarrollo, por las características que presenta
el país, principalmente por las condiciones ambientales y recursos naturales tales
como un prodigioso clima templado, una gran diversidad de especies melíferas nativas
y el resguardo sanitario dado por efectivas barreras naturales (GERDING y
RODRIGUEZ, 2010; LESSER, 2004).
El precio estable de las exportaciones de la miel y el trabajo de los apicultores, en su
mayoría pequeños productores, sustentan el desarrollo de la actividad apícola
nacional. La miel a granel lidera los envíos nacionales, con un 85% de participación.
Sin embargo, la miel a granel con algún grado de diferenciación (monofloral u orgánica)
ha ido ganando terreno, constituyendo más del 14% del mercado (ODEPA, 2011).
Las estadísticas presentadas por ODEPA (2011) indican que las exportaciones
chilenas totales de miel durante el año 2010, totalizaron 8.601 toneladas evaluadas en
6
US$28,9 millones, representando un descenso del 12,5% en volumen, pero
manteniendo su valor respecto al año 2009. Por otra parte, hasta Junio de 2011, las
exportaciones de miel totalizaron 6.337 toneladas, avaluadas en US$ 23,4 millones, lo
que representa un aumento del 36,1% en valor y 22,2% en volumen, respecto al mismo
período del año 2010. Estos resultados muestran una recuperación en las
exportaciones a los niveles previos al terremoto del 27 de Febrero del año 2010, donde
hubo pérdidas en las bodegas de las exportadoras y retrasos en el despacho de la miel
en puertos nacionales.
2.2 Enfermedades y enemigos de las abejas
Como ocurre con todas las especies vivientes, las abejas A. mellifera L. son atacadas
por una variedad de enfermedades. Éstas generalmente se pueden clasificar en
enfermedades que afectan a las abejas adultas y en enfermedades que afectan a las
crías (larvas y pupa) (PIERRE y YVES, 2006).
La mayoría de las enfermedades llegan a las colmenas, porque las abejas la
transportan de una colmena a otra o por los manejos inadecuados por parte del
apicultor, al no cumplir con los estándares de higiene al realizar trabajos e
inspecciones en la colmena. Comúnmente los apicultores intercambian panales
(vacíos, con cría, miel o polen) entre las colonias y ocasionalmente entre apiarios, lo
que representa una vía importante en la diseminación de las enfermedades (MEDINA y
MAY, 2005).
Los factores determinantes de las enfermedades pueden ser bacterias, hongos, virus,
parásitos, insectos “enemigos”, es decir, parásitos mayores, como la polilla o menores
como el piojo (MENDIZABAL, 2004).
Es de gran importancia conocer las enfermedades que afectan a las crías
principalmente, para evitar o reducir el impacto negativo en las colonias de abejas, ya
que de no tratarse a tiempo se puede incurrir en pérdidas del material vivo y en
pérdidas económicas (CABALLERO, 2009).
Algunas de las principales enfermedades que afectan a las A. melliferas L. se resumen
a continuación en el CUADRO 1.
7
CUADRO 1 Principales enfermedades apícolas en Chile, según naturaleza del
agente, etapa de la biología y ocurrencia.
Nombre
Nombre
Naturaleza del
Etapa de la
Ocurrencia en
común
científico
agente causal
biología de la
Chile
abeja en que
se presenta
Varroa
Varroa destructor
Ácaro
Crías y Adultos
Presente
Acariosis
Acarapis woodi
Ácaro
Adultos
Presente
Nosema
Nosema Apis
Protozoo
Adultos
Presente
Malpighamoaeba
Protozoo
Adultos
Presente
Bacteria
Crías
Presente
Hongo
Crías
Presente
Amebiasis
mellificae
Loque
Paenibacillus
americana
larvae larvae
Cría tiza
Ascosphaera
Apis
Piojo
Braula coeca
Insecto
Adultos
Presente
Loque
Melissococcus
Bacteria
Crías
Ausente
europea
plutonios
Pequeño
Aethina tumida
Insecto
Crías
Ausente
Tropilaelaps
Ácaro
Crías
Ausente
escarabajo de
la colmena
Ácaro asiático
clareae
FUENTE: NEIRA (2009).
8
Para el control de estas enfermedades es importante el manejo de las colmenas y su
control periódico, más que los tratamientos (PADILLA y CUESTA, 2003).
2.2.1 Loque Americana (L.A). La “Loque Americana”, es una de las enfermedades
más graves que ataca a las colonias de abejas, es infecciosa y altamente contagiosa.
(SANAD y AL-BARRAK, 2010).
Esta enfermedad provoca una pudrición de la cría operculada. La bacteria causante de
ésta enfermedad es el P. larvae, la cual tiene efectos devastadores en apiarios
infectados sufriendo grandes pérdidas económicas debido a una disminución
significativa de las poblaciones de abejas y por consecuencia la producción de miel
(LEE et al., 2009).
Según CHANTAWANNAKUL y DANCER (2001), durante el proceso de infección de la
larva, P. larvae secreta proteasas extracelulares, enzimas que probablemente ayudan
en el proceso de descomposición de la cría después de la muerte.
La miel, cera y propóleos son portadores de estas esporas, al igual que el polen,
siendo estos productos contaminados una forma corriente de contagio. Las esporas
son ingeridas por las larvas, se multiplican en el estómago y se extienden por todo el
cuerpo, ocasionándoles la muerte, ataca a las larvas obreras, cuando ellas han sido
operculadas (CHANTAWANNAKUL y DANCER, 2001).
A modo de prevención, es importante mantener una vigilancia y monitoreo permanente,
examinando todo el panal antes de seleccionar la muestra, buscando larvas o pupas
con signos que sean característicos de la enfermedad de la Loque Americana.
En caso de tener sospecha de la presencia de dicha enfermedad, deben enviarse
inmediatamente muestras al laboratorio, para realizar un diagnóstico adecuado
(USABIAGA et al., 2002).
En el CUADRO 2, se describen algunos de los síntomas que se deben tener en cuenta,
ya que son claros signos de presencia de la enfermedad de L.A.
9
CUADRO 2 Resumen de síntomas de la enfermedad de la Loque Americana.
Características
Síntomas de la Loque Americana.
Apariencia general del panal
- Cría salteada.
- Opérculos hundidos, perforados,
oscurecidos y aspecto grasoso.
- Larvas muertas en celdas operculadas y
celdas desoperculada por abejas.
Edad de la cría muerta
- Prepupa y pupas.
Color de la cría muerta
- Primero cremoso, luego café claro, café
oscuro y finalmente negro.
Consistencia de la cría muerta
- Primero acuosa y luego viscosa.
Olor de la cría muerta
- Cola para pegar madera.
Características de la escama
- Se forma en el piso de la celda.
- Quebradizas difícil de desprender.
- Hilo pupal estirada hacia el techo, la
cabeza plana y tendida
- Color negro
FUENTE: SHIMANUKI y KNOX (2000).
10
Debido a que es muy difícil de eliminar la L.A., se recomienda quemar todos los
implementos y útiles, aunque también se puede tratar en forma menos drástica,
eliminando el foco de infección, que son las crías y transfiriendo las abejas a una
colmena limpia y desinfectada, cambiando la reina por una nueva, lo cual ayuda a la
recuperación más rápida de la población (NEIRA, 2006).
Diferentes técnicas son utilizadas por los apicultores para el tratamiento de las colonias
infectadas con P. larvae. A menudo se utilizan agentes químicos, tales como el
sulfatiazol sódico y la oxitetraciclina (CHANTAWANNAKUL y DANCER, 2001). Sin
embargo, varios problemas han sido asociados al uso prolongado de antibióticos.
El principal problema, es que estos residuos de antibióticos, pueden persistir en la miel
afectando su calidad y seguridad para el consumo humano (GENERSCH, 2010). Por
otro lado se sabe que la bacteria desarrolla gradualmente resistencia a los antibióticos
que se utilizan para tratar la enfermedad, por lo tanto, se ha recomendado el uso de
antibióticos sólo cuando la enfermedad ha sido identificada y no aplicar antibióticos a
las colonias con fines preventivos (KILIC et al., 2010).
Por todo lo anteriormente señalado, es que con el tiempo el control biológico a través
de bacterias antagonistas representa un mecanismo de control promisorio. Diversos
estudios han reportado que ciertos microorganismos asociadas normalmente a las
abejas y la miel poseen la capacidad de inhibir hongos y bacterias, por la secreción de
antibióticos con propiedades antifúngicas y bacteriocinas.
Un estudio realizado por ALIPPI y REYNALDI (2006), tuvo por objetivo, investigar el
antagonismo de bacterias formadoras de endosporas aisladas desde muestra de miel y
de otras partes de la colmena, capaces de inhibir el P. larvae. Durante la investigación
se encontró con cepas de B. pumilus, B. subtilis, B. cereus, B. circulans, B. megaterium
B. licheniformis y B. laterosporus, capaces de inhibir el crecimiento de la cepa de P.
larvae, corroborando así la producción de compuestos antibacterianos, que poseen
algunas bacterias.
2.2.2
Paenibacillus larvae. Es la bacteria causante de la enfermedad Loque
Americana. SHIMANUKI y KNOX (2000), señalan que su forma es de varilla delgada,
con puntas ligeramente redondeadas y con tendencia a crecer en cadena. El largo de
la bacteria es muy variable en longitud, de 2,5 a 5 µm de largo y 0.5 µm de ancho. La
11
espora es ovalada, dos veces más larga que ancha, entre 0.6 x 1.3 µm, como se puede
observar en la FIGURA 1.
Según HORNITZKY (1998), puede encontrarse en dos estadíos, en forma vegetativa y
de espora, que es la que le asegura su sobrevivencia en el entorno (fuera del cuerpo
de su huésped), siendo capaz de germinar cuando las condiciones son favorables.
FIGURA 1 Esporas de P. larvae de cadáveres de larvas de abejas (izquierda) y
esporas de P. larvae de cultivo (derecha).
FUENTE: CHANTAWAWANNAKUL y DANCER (2001).
Las esporas de P. larvae son muy resistentes a condiciones adversas, tales como,
calor y frío extremo, desecación y desinfectantes químicos. Con estas características
conserva su habilidad para germinar por muchos años. Se ha comprobado que
esporas de 35 años presentes el medio ambiente, son capaces de causar la
enfermedad (PICCINI y ZUNINO, 2001).
2.3 Ribosoma bacteriano
Los ribosomas son orgánulos indispensables, altamente especializados, que utilizan
los organismos para el proceso de síntesis de proteínas.
12
El ribosoma bacteriano tiene un coeficiente de sedimentación de 70S, que a su vez
está formado por dos subunidades de diferentes tamaños (FIGURA 2). La subunidad
más grande (50S), contiene una molécula de ARN ribosomal, el ARNr 5S, 23S y 34
proteínas. La subunidad menor (30S), está formada por una molécula de ARNr 16S y
21 proteínas (TRESGUERRES et al., 2003).
Debido a su universalidad y la conservación estructural, el componente de ARN de la
subunidad del ribosoma pequeño, ha demostrado ser un importante y útil cronómetro
molecular para cuantificar las relaciones evolutivas entre los organismos (MEVARECH
et al., 1989).
FIGURA 2 El ribosoma bacteriano. Se muestra su estructura, las subunidades y
las macromoléculas que lo componen.
FUENTE: TRESGUERRES (2003).
13
2.3.1 Caracterización bacteriana utilizando el gen ribosomal 16S
En la década de 1980, como lo señala CLARRIDGE (2004), un nuevo estándar para
identificación de bacterias comenzó a desarrollarse en los laboratorios de Woese y de
otros investigadores, demostrando que las relaciones filogenéticas de las bacterias y
de todas las formas de vida, se pueden determinar mediante la comparación de una
parte estable del código genético.
La parte del ADN más utilizado para propósitos taxonómicos en bacterias es el gen
ARNr 16S, siendo indiscutible que la información contenida en este gen, ha jugado un
papel fundamental en la microbiología.
El gen ARNr 16S es una secuencia de aproximadamente 1.500 nucleótidos, contiene
regiones altamente conservadas, que permiten establecer la relación taxonómica
profunda entre familias, clases y filos, así como regiones variables que posibilitan
discriminar entre especies dentro del mismo género (TORTORI, 2003). Estas
características permitieron utilizar el gen como marcador filogenético y herramienta de
identificación (MAC-FADDIN, 2003).
El análisis del los genes de ARNr, con el uso de las bases de datos de referencia de
alta calidad, proporciona un método eficaz para la identificación de microorganismos
(HARMSEN y KARCH, 2004).
2.3.2 Operones ribosómicos. Todas las bacterias contienen genes codificantes para
diferentes ARNs ribosomales. Estos genes que codifican los ARN ribosomales están
organizados en operones. En eubacterias, cada operón ribosómico (rrn) incluye genes
para los ARNr: 23S (rrl), 16S (rrs) y 5S (rrf), separados por regiones espaciadoras o
intergénicas (IG) y contiene además genes para uno o más ARN de transferencia
(BARRY et al., 1991).
El producto de la transcripción del operón a partir de dos promotores P1 y P2, situados
en la región anterior a rrs, es procesado por la enzima ARNasa III, la que mediante
cortes en sitios específicos da origen a las tres clases de ARNr, el o los ARNt y las dos
regiones IG (GÜRTLER y STANISICH, 1996).
A continuación en la FIGURA 3, se representa esquemáticamente la organización de
un operón ribosómico.
14
FIGURA 3 Representación esquemática de un operón ribosómico (rrn). A) Genes
estructurales de los tres tipos de ARNr (rrs, rrl y rrf), los promotores
P1 y P2, y las regiones intergénicas (IG). B) Amplificación del gen rrs
(ADNr 16S). Se indica la posición de los iniciadores I1 (directo), I2 e I3
(reversos) utilizados para la amplificación (y posterior secuenciación)
del gen completo (I1-I3; amplicón de 1.500pb, aproximadamente) o de
un fragmento menor (11-I2; 500pb correspondientes al extremo 59 del
gen) C) Visualización de ambos fragmentos por electroforesis en gel
de agarosa.
FUENTE: RODICIO y MENDOZA (2004).
15
2.4 Clonamiento del gen ribosomal 16S
El clonamiento de fragmentos de ADN es una técnica de biología molecular que surge
gracias a las técnicas de aislamiento de ADN y al descubrimiento de las enzimas de
restricción, que hacen posible cortar el ADN o lo que se desee amplificar, para
posteriormente incorporar fragmentos a vectores plasmidiales, que a su vez se
introducen en bacterias de Escherichia coli, también llamadas células anfitrionas,
donde tiene lugar la propagación del plasmidio (LUQUE y HERRAEZ, 2008).
El proceso de clonamiento, comienza con la ligación de un fragmento de ADN o gen al
vector plasmidial en el sitio de múltiple clonamiento. Esta pequeña molécula de ADN
circular es capaz de autoreplicarse en una bacteria y de esta forma propagar el
fragmento de ADN clonado. Para ligar el ADN al plasmidio se utiliza la enzima ADN
ligasa, formando lo que se conoce con el nombre de ADN recombinante. Además este
vector plasmidial posee genes selectivos, como el gen de la resistencia a ampicilina, el
cual permite que las bacterias conteniendo el plasmidio puedan desarrollarse de forma
selectiva en medios de cultivo conteniendo el antibiótico. Además, estos plasmidios de
clonamiento, contienen el gen de la beta-galactosidasa, lo que nos indica, cual de las
colonias bacterianas posee el plasmidio con el inserto o fragmento (LEHNINGER et al.,
2009).
El proceso de transformación, consiste en ingresar el ADN recombinante hacia el
interior de la célula bacteriana al modificar la membrana de esta, por medio de CaCl2 el
cual cambia la permeabilidad de la membrana. Finalmente el cultivo bacteriano se
realiza en medios sólidos suplementados con ampicilina junto al sustrato selectivo XGal, lo que determinan las colonias que realmente poseen el plasmidio y el inserto.
(MATHEWS, 2002). En resumen las células transformadas se seleccionan por medio
de un sistema de detección doble, que utiliza antibióticos y sustratos cromogénicos
(que producen color) (VOET y VOET, 2004). Después las bacterias se lisan para
extraer y purificar el ADN plasmidial recombinante del resto de los contenidos
celulares. La preparación purificada de ADN plasmídico contendrá millones de copias
del fragmento de ADN original (ALBERTS et al., 2004).
En la FIGURA 4, se grafica un esquema general del proceso de clonación.
16
FIGURA 4 Esquema general del proceso de clonación.
FUENTE: VOET y VOET (2004).
17
3 MATERIAL Y MÉTODO
En esta sección se describirán los materiales y la metodología empleada en el
desarrollo de la tesis. Las actividades prácticas del estudio fueron realizadas en el
laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática, de la facultad de ciencias
veterinarias y el laboratorio Bioinsumos-Bacterialogía del Instituto de Producción y
Sanidad Vegetal, de la Facultad de Ciencias Agrarias, pertenecientes a la Universidad
Austral de Chile. Financiado por el Proyecto CAPI-IDO901.
3.1 Materiales y equipos utilizados
A continuación se presentan los materiales y equipos utilizados durante el desarrollo de
la investigación:
3.1.1 Equipos. Balanza digital (Shimadsu), agitador magnético, autoclave, baño
termoregulado, estufa a 30+2ºC (Memmert), estufa a 37+2 (Shel lab), centrífuga
(Equilab),
refrigerador
(Mademsa),
pHímetro
marca
Hanna
modelo
9321PH
microscopio óptico (Zeiss), campana flujo laminar (ESCO, clase BSC II), vortex (Velp),
espectrofotómetro (NANODROP 2000), espectrofotómetro (Multiskan FC, Thermo
Scientific), micropipetas (Arquimed), termociclador (MULTIGENE, labnet), capturador
fotos gel electroforesis Vilber lourmart (Arquimed), pie de metro (Mitutoyo).
3.1.2 Medios de cultivo y reactivos. Caldo Soya Tripticasa, Agar Soya Tripticasa,
Agar MYPGP (DWORKIN et al., 2006), buffer fosfato salino como diluyente, gel
agarosa, buffer TAE, (ANEXO 1).
3.1.3 Material. Tubos de vidrio con tapa, tubos falcon 50mL, placas petri, porta objetos,
puntas de plástico, tubos Eppendorf, jarra anaerobiosis.
3.1.4 Material biológico. Cepas de Bacillus pertenecientes al cepario del laboratorio
del ICYTAL, cepas de P. larvae otorgadas por el SAG de Chile, de tipo ATCC 25745 y
otra identificada como de campo.
18
3.2 Selección de la muestra a analizar
Se utilizaron ocho cepas aisladas de miel con código 20, 22, 67, 87, 92, 95, 97 y una
aislada de colmena con código 1g. Estas cepas fueron aisladas e identificadas en
trabajos de tesis previos (SANDOVAL, 2010; SANCHEZ 2010). Las cepas se
encontraban congeladas en el cepario del Laboratorio del Instituto de Ciencias y
Tecnología de los Alimentos, de la Universidad Austral de Chile. Las ocho cepas se
seleccionaron por tener un halo de inhibición grande en investigaciones anteriores y
por ser sospechosas de ser P. larvae.
3.3 Método
A continuación se procede a describir la metodología utilizada durante la identificación
de las cepas bacterianas y las pruebas de antagonismo.
3.3.1 Cultivo de las cepas de Bacillus. Las cepas congeladas a -20ºC se cultivaron
en caldo soya tripticasa, durante 24 a 48h. Una vez cultivadas, se pasaron a placas
con agar soya tripticasa. A partir de una colonia aislada se les realizó una tinción Gram,
para verificar su pureza. De cada placa se tomó una colonia aislada pura con un asa
estéril y se dejó crecer en caldo soya tripticasa, para el proceso de extracción de ADN.
3.3.2 Extracción del ADN genómico de la cepas de Bacillus. Para la extracción del
ADN genómico se utilizó el kit “Wizard Genomic DNA Purification” de Promega, de
acuerdo a las instrucciones del fabricante. En resumen el ADN genómico se extrajo a
partir de 1mL del cultivo bacteriano puro (3.3.1), el que se centrifugó a 16.000 x g por
2min, obteniéndose un sedimento bacteriano. Una vez removido el sobrenadante, este
sedimento fue resuspendido en 480µL de EDTA 50mM con 120µL de lisozima
(10mg/mL), mezclándose lentamente, para luego colocarla a incubar a 37ºC por 60min.
Luego la mezcla se centrifugó por 2min a 16.000 x g y se removió el sobrenadante. El
propósito de este tratamiento previo es debilitar la pared celular para una lisis eficiente.
Para la lisis bacteriana, el sedimento resultante fue resuspendido suavemente en
600µL de solución de lisis, para luego incubar a 80ºC por 5min. Finalmente, se dejó
enfriar a temperatura ambiente y se agregó 3µL de la solución RNAasa, invirtiendo el
tubo 2-5 veces para mezclar y se incubó a 37ºC por 60min y se enfrió la muestra a
temperatura ambiente. El lisado celular obtenido fue incubado con 200µL de la solución
de precipitación de proteínas mezclado en vortex por 20s e incubando la muestra en
19
hielo por 5min, para luego centrifugar a 16.000 x g por 3min. El sobrenadante que
contenía el ADN se transfirió a un tubo microcentrífuga limpio de 1,5mL y se agregó
600µL de isopropanol a temperatura ambiente para precipitar el ADN, se mezcló
lentamente invirtiendo el tubo hasta observar filamentos de ADN y se centrifugó a
16.000 x g por 2min. El sobrenadante se extrajo cuidadosamente y se secó el tubo en
papel absorbente limpio. Una vez seco el pellet de ADN, éste se lavó con 600µL de
etanol al 70% a temperatura ambiente, invirtiendo el tubo suavemente varias veces,
posteriormente centrifugar 16.000 x g por 2min y descartar el sobrenadante. El
sedimento de ADN se secó al aire por 15min.
Al observar el sedimento de ADN seco, se rehidrató agregando 100µL de la solución
de rehidratación al tubo, incubando durante la noche a temperatura ambiente o a 4ºC.
Finalmente, el ADN resuspendido se almacenó a 4ºC.
FIGURA 5 Protocolo de extracción del ADN genómico de las cepas de Bacillus.
FUENTE: Elaboración propia.
3.3.3 Amplificación del gen ribosomal 16S. Las cepas de Bacillus se identificaron
mediante la secuenciación del gen ARNr 16S, por medio de la amplificación por PCR.
20
Los partidores que se utilizaron para la amplificación fueron los siguientes: UN5´ACG
GAT ACC TTG TTA CGA GTT 3´ y EB 5´AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3´,
capaces de amplificar el gen 16S de cualquier eubacteria. Los componentes,
volúmenes y concentraciones para la mezcla de PCR utilizados, se detallan a
continuación en el CUADRO 3.
CUADRO 3 Mezcla utilizada en la reacción de PCR para amplificar el gen ARNr
16S.
Componentes
Concentración
Volumen (µL)
10x
5,0
1x
MgCl2
25mM
6,0
3,0mM
dNTPs
10mM c/u
2,0
0,4mM c/u
Primer 1
50pmol/µL
1,0
1,0µM
Primer 2
50pmol/µL
1,0
1,0µM
5 U/µL
0,2
1,0 U/µL
100ng aprox.
5,0
-
-
32,8
-
-
50,0
-
Buffer PCR
ADN Taq polimerasa
ADN templado
Agua desionizada,
Concentración final
estéril
Volumen final
FUENTE: Elaboración propia.
El programa de amplificación que se utilizó en el termociclador, es el que se detalla a
continuación:
Desnaturalización inicial
3min a 95ºC
Posteriormente 35 Ciclos de PCR:
21
Desnaturalización
1min a 95ºC
Elongación
1min a 45ºC
Extensión
1min a 72ºC
Extensión final
5min a 72ºC
FIGURA 6
Protocolo de amplificación del ADN ribosomal 16S, método de la
polimerasa en cadena “PCR”.
FUENTE: Elaboración propia.
3.3.4 Electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Una vez finalizada la reacción de
PCR, los fragmentos amplificados fueron visualizados por una electroforesis en gel de
agarosa. Para ellos, se pesaron 0,6g de agarosa (Winkler) en un matraz y se disolvió
en 40mL de buffer TAE 1X, la solución se calentó, para disolver por completo la
agarosa. Posteriormente se agregaron 12µl de gel red (nucleic acid stain), cuidando
que no se evapore. Esta solución fue vertida en molde de la cámara de electroforesis,
cuidando de colocar las peinetas que dará origen a los pocillos del gel una vez
22
gelificada la agarosa. La corrida de electroforética se realizó en buffer TAE 1X a 100V
por 1h, agregando 15µl de muestra mezclada con 3µl de buffer de carga 6X en los
pocillos del gel de agarosa. Finalmente, terminada la electroforesis, se observó el gel
en un transiluminador UV.
FIGURA 7 Protocolo preparación del gel de agarosa al 1,5%.
FUENTE: Elaboración propia.
3.3.5 Purificación del gen ribosomal 16S amplificado por PCR desde el gel de
agarosa. Para tal efecto, se utilizó el kit “E.Z.N.A Gel extracción” de Omega Bio-Tek,
según las indicaciones del fabricante. En breve se recortó desde el gel de agarosa, el
producto de PCR amplificado con la ayuda de un bisturí. El trozo de agarosa
conteniendo el ADN, se depositó en un tubo de 1,5mL y asumiendo que la densidad de
la agarosa es 1mg/mL, se agregó un volumen igual de solución “binding buffer XP2”.
La mezcla fue incubada a 60ºC por 7min, hasta que el gel se disolviera por completo (ir
mezclando en vortex cada 2 o 3min). Una vez disuelto el trozo de gel conteniendo el
ADN, se transfirieron 700µL de la solución ADN/agarosa a una columna de “ADN
HiBinding” ensamblada en un tubo de 2mL (provisto por el kit). Se centrifugó a 10.000 x
g por 1min a temperatura ambiente y descartar el líquido. Posteriormente se agregaron
23
300µL de solución Binding buffer, se centrifugó a 10.000 x g por 1min a temperatura
ambiente. Para lavar la columna, se agregaron 700µL de “buffer SPW” diluido
previamente en etanol, para luego incubar por 3min y centrifugar a 10.000 x g por 1min
a temperatura ambiente.
Enseguida se descartó el filtrado y se centrifugó la columna vacía por 1min a 10.000 x
g para secar la matriz de la columna (paso crítico para obtención del ADN).
Finalmente la columna se depositó en un tubo de 1,5mL, para luego agregar 50µL de
“buffer de elución” sobre la matriz de la columna. Se centrifugó a 13.000 x g por 1min,
con la finalidad de eluir el ADN (esta elución se repitió para mejorar el rendimiento del
ADN).
Para determinar la concentración del ADN obtenido, se procedió a determinar la
cantidad de ADN en la solución por espectrofotometría, midiendo la absorbancia de la
muestra obtenida a 260nm.
FIGURA 8 Protocolo purificación del ADN amplificado por PCR desde el gel de
agarosa.
FUENTE: Elaboración propia.
24
3.3.6 Clonamiento del gen ribosomal 16S. El clonamiento del gen 16S se realizó
utilizando el vector plasmidial pGEMT-Easy y se llevó a cabo a través de cuatro pasos,
que se describen a continuación:
3.3.6.1 Ligación del producto PCR. Para la ligación de producto PCR se utilizó el
plasmidio pGEMT-Easy de Promega. Antes de la ligación, los productos de PCR
purificados fueron tratados con ADN Taq polimerasa para agregar nucleótidos de
adenina, con el fin de facilitar la ligación con el plasmidio. Como se muestra en el
CUADRO 4, se agregaron en un tubo de 1,5mL: 3,25 µl de agua, 5µl de buffer PCR 5X,
0,5µl de MgCl2, 1,0µl de dNTPs, 0,25µl de Taq ADN polimerasa y el producto PCR
purificado.
CUADRO 4 Componentes para agregar nucleótidos de adenina a los productos
de PCR purificados.
Componentes
Componentes (ul)
Producto PCR purificado
15
Buffer PCR 5x
5
Taq ADN polimerasa
0,25
dNTPs
1,0
Agua PCR
3,25
MgCl2
0,5
FUENTE: Elaboración propia.
Realizada la mezcla, se incubó a 72ºC por 30min en el termociclador, así el ADN
quedó listo para comenzar la ligación.
25
Para la ligación, se mezclaron en un tubo eppendorf las cantidades y volúmenes como
se indica el CUADRO 5 en el siguiente orden: Agua estéril, buffer de ligación rápida 2X,
plasmidio pGEMT- Easy, ADN ligasa T4 y el inserto.
CUADRO 5 Componentes para la ligación del producto de PCR en el plasmidio
pGEMT-Easy.
Componentes
Volumen (ul)
Buffer rápida ligación 2x
5,0
Vector pGEM-T (50ng)
1,0
DNA ligasa T4
1,0
Inserto
2,5
Agua
2,5
FUENTE: Elaboración propia.
La mezcla de ligación fue incubada a 4ºC durante toda una noche.
3.3.6.2 Transformación de E. coli competentes con el ADN plasmidial
conteniendo el gen 16S de Bacillus. Este es un método realizado para incorporar
ADN plasmidial recombinante en células de E. coli competentes. Primero se
descongelaron las células competentes en hielo (almacenadas a -80ºC). Se
transfirieron 100µL de células bacterianas a tubos de 1,5mL pre-enfriados en hielo y se
añadió a las células bacterianas todo el volumen de la mezcla de ligación
(vector/inserto) y se incubaron por 30min en hielo, agitando suavemente cada 5min.
Posteriormente los tubos con la mezcla se incubaron en un baño de agua a 42ºC 1min
15s, este tiempo es crítico para la eficiencia de la transformación. Inmediatamente se
incubó en hielo durante 2min. Después se trasfirió la mezcla de E. coli y ADN
26
plasmidial a un tubo de 15ml con 1mL de medio LB y se incubó a 37ºC en agitador
orbital (200rpm) por 1h. Posteriormente, el cultivo de bacterias, se centrifugó a
3000rpm por 5min y se retiraron 900µL de sobrenadante y se resuspendieron las
bacterias con 100µl de sobrante que quedó. Enseguida se sembró todo el volumen en
placas de agar LB/ampicilina (50µg/mL), conteniendo además 20mg/mL de X-gal e
IPTG 0,84M). Las placas sembradas fueron cultivadas a 37ºC durante 16h
aproximadamente para la obtención de colonias recombinantes.
3.3.6.3 Extracción del ADN plasmidial por el Método de Ebullición. Para determinar
la presencia de los plasmidios recombinantes en las colonias de E. coli, se procedió a
realizar una extracción de ADN plasmidial por medio del método de ebullición para su
posterior análisis.
Para ello se sembró una colonia de E. coli recombinante (colonias blancas) en un tubo
de 15mL conteniendo 4mL de medio LB fresco, con el antibiótico ampicilina y se incubó
durante 16h a 37ºC. Posteriormente se colectaron 1,2mL de bacterias en un tubo
microcentrífuga de 1,5mL y se centrifugó durante 3min a máxima velocidad. El
sedimento bacteriano obtenido, se resuspendió en 110µL de solución STET (Solución
STET que contiene: Sacarosa 8%; Tris-HCl 50mM pH 8,0; EDTA 50mM; Triton X-100
5%) y se mezcló en vortex por 2min. Enseguida la mezcla se incubó en baño maría por
1min y se centrifugó el lisado bacteriano a temperatura ambiente a 12.000 x g por
10min. El ADN plasmidial contenido en el sobrenadante se precipitó con 100µL de
isopropanol (equivalente a la cantidad de sobrenadante que se obtiene) y luego se
mezcló en vortex por algunos segundos, para luego ser centrifugado a temperatura
ambiente a máxima velocidad durante 15min. El ADN precipitado se lavó con 0,5mL de
etanol frío 70% (-20ºC) por la pared contraria al precipitado (lentamente) y se dejó
reposar por 3min. Finalmente, el ADN plasmidial precipitado, se dejó secar a
temperatura ambiente y se disolvió en 20µL de agua, agregando 0,7µL RNAasa a
2ng/mL.
3.3.7 Análisis de restricción de ADN plasmidial purificado. Para determinar la
presencia del 16S insertado en los plasmidios purificados se realizó una digestión con
la enzima de restricción EcoRI, la cual libera el fragmento de ADN insertado en el
plasmidio.
27
Los componentes de la mezcla de digestión fueron las siguientes: 2µl buffer 10X, 0,5µl
de la enzima EcoRI, ADN purificado y agua en cantidades suficientes para completar
20µl. La digestión se realizó a 37ºC por 3h y los productos de éstas se observaron en
un gel de agarosa.
3.3.8 Extracción de ADN plasmidial, para secuenciación. Una vez identificados los
clones de E. coli conteniendo los plasmidios recombinantes, se procedió a realizar una
extracción de ADN plasmidial para su posterior secuenciación, utilizando el kit “E.Z.N.A
miniprep para plasmidio” de Omega Bio-TeK.
Primeramente una colonia de E. coli recombinante se inoculó en 10-15mL de caldo
LB/ampicilina (50ug/mL), se incubó a 37ºC con agitación orbital (150rpm) por 16h y se
centrifugó a 5.000 x g por 10min a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante
y el sedimento bacteriano se resuspendió en 500µL de solución I RNasa con agitación
en vortex. Es vital resuspender completamente el sedimento bacteriano para obtener
un buen rendimiento de ADN.
Luego las células en suspensión se trasfirieron a un tubo de 2mL y se agregaron 500µL
de la solución II, mezclando por inversión del tubo hasta obtener un lisado claro y se
incubó por 5min a temperatura ambiente. Enseguida, se agregaron 700µL de la
solución III, mezclando rápidamente por inversión del tubo hasta obtener un lisado
blanco. Luego, se centrifugó a temperatura ambiente a 10.000 x g por 10min y el
sobrenadante se aspiró cuidadosamente, cuidando de no tomar el sedimento. El
sobrenadante obtenido se agregó a una columna HiBind™ miniprep ensamblada en un
tubo colector de 2mL y se centrifugó a 10.000 x g por 1min, se descartó el filtrado
obtenido y se lavó el ADN unido a la columna con 500µL de buffer HB. Se centrifugó a
10.000 x g por 1min, eliminando el sobrenadante y agregando luego 750µL de buffer
de lavado diluido previamente con etanol. Nuevamente se centrifugó a 10.000 x g por
1min y se descartó el sobrenadante. Posteriormente, la columna se centrifugó seca a
10.000 x g por 1min, este paso es crítico para remover el etanol de la columna.
Finalmente la columna fue puesta en un tubo microcentrífuga limpio de 1,5mL y se
agregaron 80µL de agua desionizada estéril para eluir el ADN unido a la matriz de la
columna. Se centrifugó a 10.000 x g por 1min, obteniéndose así al alrededor del 75-
28
80% de ADN plasmidial recombinante unido a la matriz, el cual se cuantificó en
NANODROP 2000 para su posterior secuenciación.
FIGURA 9 Protocolo de extracción de ADN plasmidial.
FUENTE: Elaboración propia.
3.3.9 Lectura y análisis de secuencias. El ADN plasmidial recombinante,
conteniendo el gen 16S, fue enviado a secuenciar a la empresa Macrogen
(http://www.macrogen.com). Las secuencias obtenidas se compararon con las
secuencias de ADNr 16S que se encuentran en la base de datos del GenBank
mediante el software BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) del NCBI (National
center for Biotechnology Information).
La alineación de las secuencias se realizó mediante el software Clustal W de la EBI
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
ClustalW
es
un
programa
para
la
alineación de secuencias de ADN o proteínas. Produce alineaciones de secuencias
múltiples biológicamente significativas de secuencias divergentes. Calcula el mejor
29
fósforo para seleccionar las secuencias que presentan el mayor porcentaje de
identidad.
3.3.10 Prueba de antagonismo sobre césped. Se realizaron dos pruebas de
antagonismo sobre césped, una con las cepas de Bacillus identificadas, seleccionando
las que no causan daño a la salud, todo con el objetivo de evaluar como se comportan
individualmente y estando juntas, para posteriormente ocuparlas frente a P. larvae. La
segunda prueba de inhibición se hizo con las dos cepas de P. larvae en el césped, la
cepa de campo (SAG) y la cepa ATCC 25745, frente a los antagonistas (cepas de
Bacillus).
3.3.10.1 Antagonismo entre cepas de Bacillus. Antes de realizar las pruebas de
antagonismo, se verificó su pureza y se hizo un recuento en placa de las cepas. Para
esto, las cepas de Bacillus congeladas se inocularon en CST, se incubaron a durante
24h a 30+2ºC sembrándolas posteriormente en placas de AST en forma de estrías con
la ayuda de un asa estéril, con el propósito de comprobar que el cultivo se encontrara
completamente puro. A partir de una la colonia aislada, de cada cepa que creció en
cultivo puro, con un asa estéril se inocularon en tubos con CST y se incubaron durante
24h a 30+2ºC. Terminada la incubación se les midió su densidad óptica a 620 nm en el
espectrofotómetro Multiskan Fc. La muestra original se diluyó en forma seriada en
buffer BPS, transfiriendo 1mL de cultivo en 9mL de buffer BPS y de este 1mL a 9mL
BPS, siguiendo así sucesivamente hasta llegar a la dilución 10-6. Enseguida se
sembraron 0,1mL en placas de AST, esparciéndolo sobre la superficie uniformemente
con la ayuda de un rastrillo, se incubó durante 24h a 30+2ºC. Pasadas las 24h se
realizó el recuento en placas, contando la dilución que presentó recuento de entre 25 a
250 colonias.
De acuerdo a los recuentos obtenidos, se ajustó el inóculo de las cepas y se tomaron
300µL de la suspensión bacteriana en tubos con 10mL de medio semisólido de AST al
0,75% (dos tubos por placa) agitando en vortex y se depositó en placas estándar. Una
vez gelificado el agar, con la ayuda de un sacabocado (Nº 4) se hicieron orificios en el
césped, para inocular en ellos 50µL de un cultivo de 24-48h a 30+2ºC en CST, de las
cepas de Bacillus mezcladas y por separadas. Después de inocular las placas, se
incubaron durante 24h a 30ºC.
30
Transcurrida la incubación, se observó la presencia de halos de inhibición, producidos
por los antagonistas. Aquellas en que había inhibición se tomaron tres mediciones al
halo y se sacó un promedio.
En la FIGURA 10 se muestra un esquema donde se resume la metodología utilizada
en las pruebas de antagonismo entre las cepas de Bacillus.
FIGURA 10 Pasos para prueba de antagonismo entre cepas del genero Bacillus.
FUENTE: Elaboración propia.
3.3.10.2 Antagonismo de cepas de Bacillus, frente a P. larvae. Para las pruebas
de inhibición frente a P. larvae, la preparación del césped se realizó para las dos cepas
de P. larvae (previamente activadas en caldo MYPGP), esta cepa objetivo se inoculó
en 2mL caldo MYPGP desde una colonia aislada de una placa con agar MYPGP, placa
que fue incubada a 37+2ºC durante 72h en condiciones de anaerobiosis, obteniendo
31
de esta manera una suspensión bacteriana de 10 7 UFC/mL. Posteriormente se
tomaron 300µL de esta suspensión y se introdujeron en 10mL de Agar MYPGP (dos
tubos por placa) al 0,75% y luego se vertió en una placa estándar. Con la ayuda de un
sacabocado se hicieron orificios en el césped de P. larvae para inocular en ellos 50µL
de un cultivo de 24h a 30+2ºC (incubado en anaerobiosis) en CST de los posibles
antagonistas, analizados en el punto anterior 3.3.10.1.
En las placas que presentaron halos de inhibición frente a P. larvae, se tomaron tres
mediciones al halo y se sacó un promedio.
En la FIGURA 11 se presenta un esquema donde se resume los procedimientos
utilizados en las pruebas de inhibición frente al P. larvae.
FIGURA 11 Pasos para la prueba de antagonismo entre las cepas de P. larvae
contra las cepas del género Bacillus.
FUENTE: Elaboración propia.
32
4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Durante la investigación, se utilizaron ocho cepas pertenecientes al cepario del
Proyecto CAPI IDO 901 (Laboratorio de Microbiología, ICYTAL, Facultad de Ciencias
Agrarias, Universidad Austral de Chile). Las cepas fueron aisladas con anterioridad de
muestras de miel y material de colmenas (trozos de panal). Las muestras de miel
fueron facilitadas por la “Cooperativa Campesina Apícola Valdivia Limitada, APICOOP”,
ubicada en Paillaco, Región de los Ríos.
A continuación se presentan los resultados obtenidos, descritos en concordancia
secuencial a los experimentos realizados.
4.1 Preparación de la muestra
Para comenzar, se revivieron las cepas del género Bacillus que se encontraban
congeladas en Caldo Soya Tripticasa (CST) y posteriormente se sembraron en (AST),
con el objeto de verificar la pureza.
FIGURA 12 Colonias puras de las ocho cepas del género Bacillus en Agar Soya
Tripticasa.
33
En la FIGURA 12, se muestran los cultivos puros obtenidos en todas las cepas de
Bacillus, con lo cual se asegura que todos los individuos del mismo, tengan la misma
composición genética, para obtener una efectiva identificación.
Esta etapa es esencial para
tener mayor seguridad en la identificación de los
microorganismos.
4.2 Cuantificación del ADN genómico
Las cepas puras se inocularon en medio CST, desde el cual se extrajo el ADN
genómico. En el CUADRO 6 se observan las concentraciones de ADN genómico
aislado y medido por espectrofotometría, midiendo la absorbancia a 260 nm y utilizando
la razón de absorbancias 260nm/280nm para verificar la calidad y pureza del ADN
extraído.
CUADRO 6 Cuantificación del ADN genómico extraído de Bacillus.
Muestra
Concentración (ng/µl)
260nm/280nm
1g
55,9
2,02
20
76,9
2,04
22
8
2,22
67
-
-
87
59
1,75
92
98,1
1,7
95
-
-
97
-
-
34
De la medición obtenida en el equipo NANODROP 2000, se puede apreciar
cuantificación de ADN genómico extraído en las muestras de las cepas 1g; 20; 22; 87 y
92, mientras que en las muestras 67; 95 y 97, el equipo no logró obtener una medición,
lo cual pudo deberse al límite de detección que el equipo posee, el cual va de los 215.000ng/µl.
Debido a los anillos aromáticos que poseen las bases nitrogenadas del ADN, éste tiene
por absorbancia máxima 260nm, mientras que en las proteínas la absorbancia es
medida a 280nm, por ende la determinación de la pureza y calidad del ADN, se
determinó utilizando la razón de ambas absorbancias (260nm/280nm), con valores que
deben estar por sobre 1,7, como sucede con las cepas 1g; 20; 22; 87 y 92.
4.3 Amplificación del gen ARNr 16S por medio de PCR
El gen 16S fue amplificado por PCR a partir de ADN obtenido desde células
vegetativas de cepas del género Bacillus. Para ello se utilizaron partidores universales
UN y EB descritos por BARRY et al., (1990).
Producto de la amplificación se obtuvo un fragmento de 1.500 pb, correspondiente al
tamaño del gen ANRr 16S. Varias investigaciones han revelado que la secuencia del
gen ARNr 16S presenta regiones conservadas y entre ellas se encuentran regiones
que son variables, que han sido útiles para la diferenciación de género y especie en
bacterias (JENSEN et al., 1993).
En la FIGURA 13 se observa la separación en el gel de agarosa de los productos de la
amplificación del gen de ADNr 16S de cada cepa, los que en todos los casos, al ser
comparados con el estándar de ADN, corresponden a los 1.500 pb aproximadamente,
descritos en la literatura por BARRY et al., (1990).
Este producto PCR se obtuvo en todas las cepas en estudio, aún en las que no se
había obtenido cuantificación de concentración de ADN genómico en el equipo
NANODROP 2000, dando cuenta que no es necesario grandes cantidades de ADN
para realizar la amplificación. La especificidad de la reacción fue determinada al no
observar productos de amplificación inespecífica en el control negativo.
35
FIGURA 13
Electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, que muestra la
amplificación del ADNr 16S mediante PCR de ocho aislados de
Bacillus. Carriles: Est, marcador de peso molecular de 1003000pb; 1g; 20; 22; 67; 87; 92; 95 y 97, aislados de Bacillus; (+),
control positivo; (-), control negativo de F. psychrophilum.
4.4 Purificación del gen ARNr 16S
Realizada y verificada la amplificación del gen 16S, se preparó un nuevo gel (ANEXO
2), con el objetivo de purificar los productos de PCR de cada uno de los aislados.
Este procedimiento es indispensable para remover desde el producto de PCR obtenido
el exceso de partidores y nucleótidos (CLARRIDGE, 2004).
En la FIGURA 14 se muestran los resultados obtenidos y se aprecian los productos de
1.500pb, confirmando la obtención del gen 16S amplificado.
36
FIGURA 14 Electroforesis del gen ARNr 16S purificado. Carriles: Est, marcador
de peso molecular de 100-3000pb; 1g; 20; 22; 67; 87; 92; 95 y 97,
aislados de Bacillus.
4.5 Clonamiento del gen ARNr 16S de los aislados de Bacillus
La reacción de PCR permite la obtención de una gran cantidad del gen que se desea
clonar en vectores plasmidiales. Por esta razón se utilizó esta estrategia para clonar el
gen 16S de los aislados de Bacillus. Este proceso consta de la purificación del gen
amplificado por PCR, adición de nucleótidos de adenina en los extremos del producto
amplificado y posterior ligación al vector de clonamiento pGEMT - Easy, utilizando la
enzima T4 DNA ligasa.
El clonamiento de productos de PCR se ve facilitado al utilizar ADN polimerasa
termoestables como la Taq ADN polimerasa, la que dan lugar a productos con extremo
3´ conteniendo residuos de adenina, facilitando la inserción de los productos PCR en
37
vectores de clonamiento con extremos conteniendo timina (WILSON y WALKER,
2000).
4.5.1 Transformación bacteriana. El producto de la ligación 16S / pGEM-T Easy se
utilizó para la transformación de E. coli competentes cepa JM109. El proceso de
transformación bacteriana se refiere a la introducción de un ADN foráneo a una
bacteria por medio de un “shok” térmico lo que provoca un cambio en la permeabilidad
de la membrana de la E. coli, facilitando la entrada de este ADN, que en este caso
correspondía a un ADN plasmidial conteniendo el gen 16S de aislados de Bacillus.
Terminado el proceso de transformación, las bacterias son sembradas en placas con
medio LB/amp, donde se obtienen finalmente las colonias recombinantes con un alto
número de copias del vector con el inserto (LUQUE y HERRÁEZ, 2008).
Posteriormente se seleccionaron tres colonias (clones) transformantes formadas por
bacterias de E. coli que hayan incorporado el inserto, en este caso correspondiente a
las colonias blancas, como se muestra en la FIGURA 15.
FIGURA
15
Cultivo
de
E.
coli
transformantes
LB/ampicilina/IPTG y X-Gal.
en
placas
de
agar
38
En la FIGURA 15 se aprecian colonias de E. coli conteniendo al vector sin inserto
(colonias azules) y conteniendo el vector e inserto (colonias blancas). Esta coloración
es debido a que el inserto ubicado en el sitio de múltiple clonamiento del vector,
interrumpió la secuencia de parte del gen lacZ que codifica la proteína β-galactosidasa,
originando una enzima no funcional.
De esta manera, se seleccionan sólo las colonias que poseen el plasmidio e inserto,
que en este caso corresponden a aquellas colonias blancas, que no son capaces de
metabolizar el compuesto cromogénico X-Gal por parte de la enzima β-galactosidasa.
Este proceso de selección es denominado α-complementación (VOET y VOET, 2007).
Las tres colonias (clones) elegidos por placa, fueron cultivadas en medio líquido LB
suplementado con ampicilina para extraer el ADN plasmidial recombinante, el cual fue
digerido, en cada caso, con enzima de restricción EcoRI, para verificar la inserción de
los productos de PCR. Los productos de digestión fueron analizados en un gel de
agarosa al 1,5%, para finalmente seleccionar un clon plasmidial conteniendo el gen
16S por cepa de Bacillus.
En la FIGURA, 16 se puede apreciar los productos de la digestión de los clones
plasmidiales 92 y 20, donde se puede ver el plasmidio pGEM-T Easy sin inserto a las
altura de 3.000pb y los fragmentos de ADN correspondiente al inserto, que en este
caso son dos, ya que el gen 16S de Bacillus posee un sitio para la enzima EcoRI. Los
clones plasmidiales seleccionados fueron 92 3 y 201.
En las figuras del ANEXO 3 se aprecia el mismo análisis de restricción, donde los
clones plasmidiales seleccionados fueron 1g 3, 221, 673, 871, 973 y 951.
39
FIGURA 16 Análisis electroforético del ADN plasmidial recombinante digerido
con EcoRI. Carriles: Est, marcador de peso molecular de 1003.000pb; 921, 922, 923, 201, 202 y 203, aislados de Bacillus.
4.5.2
Purificación,
cuantificación
y
secuenciación
de
ADN
plasmidial
seleccionado. Posteriormente a partir de los clones seleccionados, se realizó una
segunda extracción de ADN plasmidial, esta vez con el kit comercial
para obtener un
ADN de mayor calidad para su secuenciación. Con el fin de visualizar el inserto de
ADN incorporado al vector, el plásmido purificado fue sometido a una digestión con la
enzima de restricción EcoRI y se procedió a visualizar el producto de la digestión en un
gel de agarosa al 1,5%, que permitió visualizar los insertos buscados, como se muestra
a continuación en las FIGURAS 17 y 18. En ambas figuras, se visualiza los 3.000pb del
vector de clonamiento pGEM-T Easy, el inserto de 1.500pb y los fragmentos de los
cortes de la enzima de restricción EcoRI para las muestras 97, 87, 67 y 95 (FIGURA
17) y las muestras 1g, 20, 22 y 92 respectivamente (FIGURA 18).
40
FIGURA 17 Análisis electroforético del ADN plasmidial conteniendo el gen 16S
con la enzima de restricción EcoRI. Carriles: Est, marcador de peso
molecular de 100-3000pb; 97; 87; 67 y 95, aislados de Bacillus.
FIGURA 18 Análisis electroforético del ADN plasmidial conteniendo el gen 16S
con la enzima de restricción EcoRI. Carriles: Est, marcador de peso.
41
La enzima de restricción EcoRI mostró 2 patrones de restricción, uno de los cuales
liberó un fragmento de aproximadamente 1.500 pb en los ocho aislados, exponiendo
así la existencia de la secuencia de reconocimiento de la enzima. El segundo patrón de
restricción mostró dos fragmentos de restricción de 900 y 600pb aproximadamente, en
promedio.
El ADN purificado fue cuantificado (CUADRO 7), y enviado a secuenciar de acuerdo a
las instrucciones señaladas en la página de la empresa Macrogen.
CUADRO 7 Cuantificación del ADN enviado a secuenciar.
Cepa
Concentración ng/µl
260nm/280nm
1g
266,4
1,98
20
159,2
1,98
22
464,3
2,03
67
320,2
2,03
87
279,7
2,00
92
232,0
2,00
95
184,4
2,02
97
201,1
2,04
4.6 Secuenciación e identificación de las cepas de Bacillus
La secuenciación se realizó por el método de didesoxinucleotido. Éste se llevó a cabo
utilizando partidores complementarios a la secuencia de los promotores SP6 y T7
contenidos en el plasmidio, las que flanquean la región de múltiple clonamiento del
vector. Las secuencias del gen 16S clonadas en el vector (ANEXO 4) se compararon
42
con las que se encuentran en la base de datos del GenBank mediante el software
BLAST del NCBI (National Center for Biotechnology Information, EUA).
El GenBank es parte de International Nucleotide Sequence Database Collaboration,
que comprende the DNA DataBank of Japan (DDBJ), the European Molecular Biology
Laboratory (EMBL), and GenBank at NCBI. Estas tres organizaciones intercambian
datos diariamente, siendo el objetivo común dar a conocer abiertamente la información
obtenida individualmente y formar un GenBank a nivel mundial cada día más amplio
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Esta base de datos dispone de una colección
de aproximadamente 126.551.501.141.135.440.924 bases en 135.440.924 expedientes
de secuencias en las divisiones tradicionales de GenBank y 191.401.393.188 bases en
62.715.288 expedientes de secuencia registradas con fecha abril de 2011.
En el CUADRO 8 se resume dicha comparación, donde se indican el origen bacteriano
de los genes 16S que presentaron un mayor porcentaje de identidad con las
secuencias 16S de los aislados de Bacillus de este estudio.
La miel puede contener un número pequeño y una variedad limitada de
microorganismos. Los microorganismos capaces de sobrevivir en la miel, son los que
soportan la concentración de azúcar, la acidez y otras características antimicrobianas
propias de la miel. Los microorganismos normalmente existentes en la miel se han
investigado y se ha demostrado que se encuentran mohos, levaduras y bacterias
formadoras de esporas. Esto se debe principalmente a las fuentes de contaminación
microbiológica, que incluyen el polen, el tracto digestivo de las abejas, la suciedad, el
polvo, el aire y las flores (LEE et al., 2008).
Analizando los resultados obtenidos en el CUADRO 8, las especies del género Bacillus
identificadas, resultan ser ubicuos de la miel. Estas bacterias son Gram positivas,
formadoras de endosporas inocuos para el ser humano, con excepción del Bacillus
cereus. Su hábitat principal es el suelo y debido a la formación de esporas, son
extremadamente resistente al calor, pueden colonizar diferentes ambientes, como la
miel, diversos alimentos, animales, insectos, etc. (MAHMOUND y ABOUWARDA,
2011).
Cabe señalar que los microorganismos que se encuentran naturalmente en la miel del
panal son incorporados por el néctar de las flores y por la abeja obrera. Las bacterias
43
(género Bacillus) provienen en gran parte solo de la abeja (SNOWDON y CLIVER,
1996).
CUADRO
8
Resumen
de
la
identificación
bacteriana
después
de
la
secuenciación.
Cepa
Gen 16S % de identidad
Código de acceso
1g
Bacillus cereus 99% ID
JQ435675.1
20
Bacillus cereus 79% ID
EF513610.1
22
Bacillus cereus 79% ID
EF428235.2
67
Bacillus pumilus 99% ID
JN315777.1
87
Bacillus pumilus 99% ID
EU620416.1
92
Bacillus subtilis 98% ID
HQ727971.1
95
Bacillus subtilis 99% ID
EU723210.1
97
Bacillus pumilus 99% ID
EU620416.1
4.7 Pruebas de antagonismo
Para realizar las pruebas de antagonismo, las cepas identificadas se volvieron a activar
en CST, después de 24h se sembraron por estrías en AST. Luego de 24h a 48h se
comprobó el desarrollo de colonias aisladas, verificando que el cultivo se encontrara
puro. A partir de este cultivo, se inoculó en CST y se midió su densidad óptica
(CUADRO 9).
44
CUADRO 9 Densidad óptica (Do) a 620nm de las cepas incubadas en CST.
Cepa
Do1
Do2
Do3
Promedio Do
1g
0,256
0,260
0,257
0,258 Dst
20
0,307
0,320
0,322
0,316 Dst
22
0,070
0,067
0,056
0,064 Dst
67
0,068
0,059
0,064
0,064 Dst
87
0,062
0,090
0,125
0,092 Dst
92
0,040
0,024
0,175
0,080 Dst
95
0,114
0,130
0,101
0,115 Dst
97
0,106
0,086
0,103
0,098 Dst
Posteriormente se seleccionaron tres cepas del género Bacillus, descartando las
identificadas como B. cereus, ya que esta especie es reconocida por ser causante de
intoxicaciones alimentarias, aunque cabe señalar que para el desarrollo de un
biocontrolador, se extrae la sustancias específica que actúa contra como antagonista
dejando de lado los demás componentes y características propias de la célula
bacteriana que son causante de las intoxicaciones (DWORKIN et al., 2006).
Las tres cepas seleccionadas fueron las identificadas con código 87, 95 y 97, a las que
se les realizaron diluciones seriadas en BPS (Buffer fosfato salino) a tres cepas
previamente seleccionadas. Pasado 12h se realizó el recuento de las diluciones que
presentaron entre 25-250 UFC/mL, como se muestra en el CUADRO 10.
45
CUADRO 10 Recuento a las 12h de incubación en AST.
Cepa
UFC/mL a las 12h
Do 620nm a las 48h
87
9,8x107
0,098
95
8,0x107
0,115
97
1,3x107
0,098
Obtenidos los recuentos de los tres cultivos, se inoculó una colonia para realizar
pruebas de antagonismo, entre las tres cepas y éstas frente a P. larvae.
4.7.1 Antagonismo entre las cepas de Bacillus identificadas. Previo a utilizar una
mezcla de las tres cepas de Bacillus contra P. larvae, se realizaron pruebas de
antagonismo entre las tres cepas de Bacillus, con el fin de observar su
comportamiento, dada la posibilidad que estando juntas, estas potencien su capacidad
para inhibir P. larvae, pero cuidando que no se inhiban entre ellas.
Como se aprecia en la FIGURA 19, la prueba de antagonismo reveló que las cepas 97
y 95 resultaron ser inhibidas por la cepa 87, presentando un posible problema al
ocuparla como mezcla en pruebas antagónicas posteriores.
FIGURA 19 Pruebas de antagonismo sobre agar soya tripticasa entre cepas de
Bacillus, con inhibición de las cepas 95 y 97 por la cepa 87.
46
A los halos obtenidos en las pruebas de inhibición, se les procedió a tomar tres
mediciones, las que se detallan a continuación en el CUADRO 11.
CUADRO 11 Halos de inhibición en las pruebas de antagonismo entre cepas del
género Bacillus.
Cepa césped
Cepa antagonista
Halo inhibición (mm)
Promedio
87
2,09
2,21
97
2,26
2,27
95
95
-
87
2,24
2,15
2,12
2,10
87
97
-
-
95
-
-
97
-
-
Como se puede observar en el CUADRO 11, el halo de inhibición promedio que se
obtuvo del antagonismo de la cepa 87 contra la 97, fue de 2,21mm y de 2,15mm contra
la cepa 95.
La cepa 87, identificada como B. pumilus, inhibió a las cepas 95 y 97, lo cual podría
explicarse debido a que esta especie es reconocida por producir componentes
antimicrobianos, que tienen una fuerte acción en contra de bacterias Gram positivas
(LEIFERTL et al., 1995).
47
4.7.2 Antagonismo de las cepas de Bacillus frente a P. larvae.
Analizado el comportamiento de antagonismo entre las cepas de Bacillus, se procedió
a realizar pruebas de inhibición de éstas, frente a las cepas de P. larvae ATCC 25745 y
de campo.
La FIGURA 20, ilustra las fotografías de las pruebas de antagonismo, las tres cepas
utilizadas, las 87, 95 y 97 inhibieron el P. larvae ATCC 25745, mientras que la cepa 87
no presento inhibición frente al P. larvae de campo. Por otro lado los mix (95+97),
(87+97), (87+95) y (87+95+97) inhibieron el P. larvae ATCC 25745, mientras que las
mezclas (87+97), (87+95), y (87+95+97) no presentaron halo de inhibición alguno
frente al P. larvae de campo.
FIGURA 20 Pruebas de antagonismo sobre agar MYPGP entre cepas del género
Bacillus frente a P. larvae ATCC 25745 y de Campo.
Observada la presencia de los halos, se procedió a tomar tres mediciones a cada halo.
Los resultados obtenidos de las mediciones, se muestran a continuación en el
CUADRO 12.
48
CUADRO 12 Tamaño de los halos de inhibición de la prueba de antagonismo de
las cepas 87, 95, 97 y mezclas de ellas, contra P. larvae ATCC
25745 y de Campo.
Cepa césped
Cepa antagonista
Halo inhibición (mm)
ATCC 25745
87+97
1,80
87+95
1,17
87+97
-
87+95
-
95
7,78
97
8,63
87
1,74
95
1,78
97
1,39
87
-
95+97
5,72
87+95+97
2,38
95+97
1,34
87+95+97
-
Campo
ATCC 25745
Campo
ATCC 25745
Campo
Como se puede observar en el CUADRO 12, los mayores halos de inhibición promedio
se obtuvieron en las cepas por individual, mientras que estando en mezcla no se
mejoraron su capacidad antagónica, descartando la posibilidad de que pudieran
potenciarse al estar en conjunto.
49
No es extraño que las cepas 87, 95 y 97, identificadas como B. pumilus, B. subtilis y
B. pumilus respectivamente, hayan logrado inhibición en casi todas las cepas de P.
larvae, pues estas son reconocidas por producir una gran variedad de antibióticos. Esto
se corrobora con los resultados obtenidos en las pruebas de inhibición de P. larvae por
ALIPPI y REYNALDI (2006), donde reconocen estas tres cepas como fuertes
inhibidores del patógeno.
El B. subtilis, es reconocida por producir una gran variedad de antibióticos con
diferentes estructuras. La producción de componentes antimicrobianos activos que
produce esta especie, incluye predominantemente péptidos, los que pueden o no ser
sintetizados ribosomalmente, así como también algunos componentes no peptídico
como fosfolípidos (LEIFERT et al., 1995; STEIN, 2005).
50
5 CONCLUSIONES
Se seleccionaron ocho cepas del género Bacillus, en base a su capacidad para
inhibir a P. larvae en pruebas de antagonismo en placa, las cuales fueron identificadas
hasta el nivel de especie, mediante la secuenciación del gen ARNr 16S.
Para la caracterización e identificación de las cepas se logró amplificar y clonar
en el plasmidio pGEMT-Easy, el gen ribosomal 16S de las ocho cepas del género
Bacillus, para su posterior secuenciación.
Se obtuvieron las ocho secuencias del gen 16S, las cuales al ser comparadas
con las secuenciaciones en la base de datos Gen Bank de NCBI, estas
correspondieron a Bacillus subtilis, Bacillus pumilus y Bacillus cereus.
Las pruebas de antagonismo entre las cepas de Bacillus, revelaron inhibición
de la cepa 87 (B. pumilus), frente a la cepa 95 (B. subtilis) y 97 (B. pumilus), lo cual
implica que al ser utilizadas en una mezcla frente a P. larvae, estas pueden inhibirse
entre sí, disminuyendo su eficiencia contra el patógeno.
Las cepas que presentaron mayor actividad antagónica contra la cepa de P.
larvae ATCC 25745 y de campo, fueron B. pumilus (97) y B. subtilis (95)
respectivamente.
51
6 BIBLIOGRAFÍA
ALBERT, B; BRAY, D; HOPKIN, K; JOHNSON, A; LEWIS, J; RAFF, M; ROBERTS, K y
WALTER, P. 2004. Editorial Panamericana. Segunda Edición.
ALIPPI, A y REYNALDI, F. 2006. Inhibition of the growth of Paenibacillus larvae, the
causal agente of American foulbrood of honeybees, by selected strains of
aerobic spore-forming bacteria isolated from apiarian sources. Jouernal of
Invertebrate Pathology 91: 141-146.
ALVIS, V; CALLEJA, L; PEREIRA, M; RUIZ, L y CALAHORRA, F. 2009. Visión Actual
de la Apicultura en España. Revista Complutense de Ciencias Veterinarias 3
(2): 139-148.
ANTÚNEZ, K.; D`ALESSANDRO, B.; PICCINI, C.; CORBELLA, E. y ZUMINO, P. 2004.
Paenibacillus larvae larvae Spores in Honey Samples from Uruguay: a
Nationwide Survey. Journal of Invertebrate Pathology 86: 56-58.
BARRY, T; POWELL, R y GANNON, F. 1990. A general method to generate DNA
probes for microorganisms. Biotechnology 8: 233-236.
BARRY, T; COLLERAN, G y GLENNON, M. 1991. The 16S/23S ribosomal spacer
region as a target for DNA probes to identify aubacteria. Genome Res 1: 51-56
CABALLERO, D. 2009. Manual de Enfermedades Apícolas. Editorial Instituto
Interamericano de Cooperación para la Agricultura. Honduras. 54p.
52
CHANTAWANNAKUL, P y DANCER. 2001. American Foulbrood in Honey. Iternational
bee research association 82 (4): 168-180.
CLARRIDGE, J. 2004. Impacto f 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification
of Bacterial on Clinical Microbiology and Infectious Diseases 17 (4): 840-862.
DWORKIN, M.;FALKOW, S.; ROSENBERG, E.; SCHLEIFER, K y STACKEBRANDT,
E. 2006. The prokaryots. A handbook on the biology of bacteria. Bacteria:
Firmicutes, Cynobacteria. 3 th de. Estados Unidos. Springer. 572p.
GENERSCH,
E.;
FORSGREN,
E.;PETIKA,
J.;ASHIRALIEVA,A.;
RAUCH,
S.;
KILWINSKI, J. y FIES, I. 2006. Reclassification of Paenibacillus larvae subsp.
pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsp. Larvae as Paenibacillus larvae
without subspecies differentiation. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology 56; 506-511.
GENERSCH, E. 2010. American Foulbrood in honeybees and its causative agent,
Paenibacillus larvae. Journal of Invertebrate Pathology 103: S10-S19.
GERDING, M y RODRIGUEZ, M. 2010. Valor de la apicultura y su relación con el
control biológico. Revista Consorcio Apícola. Segunda edición:
GÜRTLE, V y STANISICH, V. 1996. New approaches to typing and identification of
bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region. Microbiology 142: 3-16.
HARMSEN, D y KARCH, H. 2004. 16S rDNA for Diagnosing Pathogens: a Living Tree.
American Society for microbiology 70: 19-24.
53
HEYNDRICKX,
M;
VANDEMEULEBROECKE,
K;
HOSTE,
B;
JANSSEN,
P;
KERSTERS, K; DE VOS, P; LOGAN, N, ALI, N y BERKELEY, R. 1996.
Reclassification of Paenibacillus (Formely Bacillus) pulvifaciens (Nakamura
1984) Ash et al. 1994, a Later Subjective Synonym of Paenibacillus (Formely
Bacillus) larvae (While 1906) Ash et al. 1994, as a Subspecies of P. larvae as
P. larvae subsp. larvae and P. larvae subsp. pulvifaciens 46: 270-279.
HORNITZKY, M. 1998. The pathogenicity of Paenibacillus larave subsp. larave spores
and vegetative cells to honey bee (Apis mellifera) colonies and their
susceptibility to royal jelly. Journal of Apicultural Research 37 (4): 267-271.
JENSEN, M; WEBSTER, J y STRAUS, N. 1993. Rapid Identification of Bacteria on the
Basis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Ribosomal DNA Spacer
Polymorphisms. Applied and Environmental Microbiology 59 (4): 945-952.
KILIK, A.; SIMSEK, H y KALENDER, H. 2010. Detection of American Foulbrood
Disease (Paenibacillus larvae) By the PCR and Culture. Kafkas Univ Vet Fak
Derg 16 (5): 841-845.
LEE, H.; CHUREY, J y WOROBO, R. 2008. Antimicrobial activity of bacterial isolates
from different floral sources of honey. International Journal of Food
Microbiology 126; 240-244.
LEE, H.; CHUREY, J y WOROBO, R. 2009. Isolation and characterization of a
protective bacterial cultura isolated from honey active against American
Foulbrood disease. FEMS Microbiology letters 296; 39-44.
LEHNINGER, A.; NELSON, D y COX, M. 2009.Principios de Bioquímica. Editorial
Omega. Quinta edición. Barcelona. 1124p.
54
LESSER, R. 2004. Manual de Apicultura Modera. Editorial Universitaria. Chile. 170p.
LUQUE, J y HERRÁEZ, A. 2008. Biología molecular e Ingeniería genética. Editorial
Elsevier S.A. Madrid, España. 468p.
MAC-FADDIN, J. 2003. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de
Importancia Clínica. Editorial Médica Panamericana. España. Tercera Edición.
850p.
MAHMOUND, H y ABOUWARDA, A. 2011. Antimicrobial Activity of Bacterial Isolates
from Honey. International Journal of Microbiological Resarch 2: 82-85.
MATHEWS, J. 2002. Bioquímica. Editorial Addison Wesley. Tercera edición. España.
1335p.
MEDINA, L y MAY, W. 2005. Enfermedades de las abejas. Editorial Universidad
Autónoma de Yucatán. México. 93p.
MENDIZABAL, F. 2004. Abejas. Editorial Albatros. Aregentina. 259p.
MEVARECH, M; HIRSCH, S; GOLDMAN, S; YAKOBSON, E; EISENBERG, H y
DENNIS, P. 1989. Isolation and Characterization of the rRNA Gene Clusters of
Halobacterium marismortui. Jouernal of Bacteriology 171 (6): 3479-3485.
NEIRA, M. 2006. Sanidad apícola, principales enfermedades y enemigos de las abejas
en Chile. 139p.
55
NEIRA, M. 2009. Almanaque Apícola. Editorial APICAP Chile. Chile. 150p.
PADILLA, F y CUESTA, A. 2003. Zoología apicola. Editorial Díaz de Santos. España.
468p.
PICCINI, C y ZUNINO, P. 2001. American foulbrood in Uruguay: Isolation of
Paenibacillus larvae larvae from Larvae with Clinical Symptoms and Adult
Honeybees and Susceptibility to Oxytetracycline. Journal of Invertebrate
Pthology 78; 176-177.
PICCINI, C; D’ ALESSANDRO, B; ANTÚNEZ, K y ZUNINO, P. 2002. Detection of
Paenibacillus larvae subspecies larvae spores in naturally infected bee larvae
and artificially contaminated contaminated honey by PCR. Journal of
Microbiology y Biotechnology 18: 761-765.
PICCINI, C; ANTÚNEZ, K y ZUNINO, 2004. An approach to the characterization of the
Honey bee hive bacterial flora. Journal of Apicultural Research 43 (3): 101104.
PIERRE, J y YVES, L. 2006. Apicultura. Editorial Mundi Prensa. Cuarta Edición.
España. 790p.
RODICIO, M y MENDOZA, M. 2004. Identificación bacteriana mediante la
secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en
microbiología. Enferm Infecc Microbiol Clin 22 (4): 238-245.
56
SANAD, R y AL-BARRAK, A. 2010. Use of Clove and Watercress Oils for Controlling
the American Foulbrood Disease Attacking Honeybee Colonies at El-Gharbia
Governorate, Egypt 20: 33-36.
SÁNCHEZ, C. 2010. Aislamiento de bacterias con propiedades antagonistas a
Paenibacillus larvae subsp. Larvae a partir de fuentes apícolas. Valdivia.
Universidad Austral de Chile. Facultad de Ciencias Agrarias. 78p.
SANDOVAL, P. 2010. Aislamiento e identificación de especies del género Bacillus
desde miel para su empleo como antagonistas a Paenibacillus larvae.
Memoria de titulo Ing. en Alimentos. Valdivia. Universidad Austral de Chile,
Facultad de Ciencias Agrarias. 124p.
SHIMANUKI, H y KNOX, D. 2000. Diagnosis of Honey Bee Diseases. United States
Departament of Agricultura. 61p.
SNOWDON, J. y CLIVER, D. 1996. Microorganisms in honey. Journal International of
Food Microbiology 31:1-26.
STEIN, T. 2005. Bacillus subtilis antibiotics: Structures synthesis and specific functions.
Molecular Mycrobiology 56(4):845-857.
TORTORI, E. 2003. Impacto of Genotypic Studies on Mycobacterial Taxonomy: the
New Mycobacteria of the 1990s. Journal Clinical Microbiology Reviews 16 (2):
319-354.
TRESGUERRES, J; FERNAANDEZ, J y SERRANO, V. 2003. Biotecnología aplicada a
la medicina. Editorial Diaz de Santos. España. 321p.
57
TRHLIN, M y RAJCHARD, J. 2011. Chemical communication in the honeybee (Apis
mellifera L.): a review 56 (6): 265-273.
USABIAGA, J.; GALLARDO, J. y CAJERO, S. 2002. Patología apícola. IICA. Costa
rica. 80p.ç
VOET, D y VOET, J. 2004. Bioquímica. Editorial Panamericana. Tercera Edición.
1763p.
WILSON, K y WALKER, J. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemestry.
Editorial Cambridge University Press. Fifth Edition. 792p.
58
1 ANEXO
Medios de cultivos y buffer
1.1 Medios de cultivo
Caldo soya tripticasa (CST)
Ingrediente
Cantidad
Soya tripticasa
30g
Agua destilada
1000mL
Agar soya tripticasa (AST)
Ingrediente
Cantidad
Soya tripticasa
30
Agar
15g
Agua
1000mL
Agar MYPGP
Ingrediente
Cantidad
Extracto de lavadura
15g
Caldo Muller-Hinton
10g
Glucosa
2g
59
K2HPO4 anhidro
3g
Piruvato de sodio
1g
Agar-agar
15g
Agua destilada
1000mL
1.2 Buffer
Buffer fosfato salino 0,01M pH 7,2 (PBS)
Ingredientes
Cantidad
NaCl
4g
KCl
0,1g
Na2HPO4
0,72
KH2PO4
0,12
Agua destilada
500ml
* Ajustar pH 7,2
TAE
60
2 ANEXO
Electroforesis en gel de garosa para la purificación de los productos de PCR
A continuación se muestra la electroforesis en gel de garosa para la purificación de los
productos de PCR. Carriles: Est, marcador de peso molecular de 100-3000pb; 1g; 20;
22; 67; 87; 92; 95 y 97, aislados de Bacillus.
61
3
ANEXO
Análisis electroforético del ADN plasmidial recombinante digerido con EcoRI.
3.1 Análisis electroforético del ADN plasmidial recombinante digerido con EcoRI.
Carriles: Est, marcador de peso molecular de 100-3000pb; 1g1; 1g2; 1g3; 221; 222 y 223,
aislados de Bacillus.
62
3.2 Análisis electroforético del ADN plasmidial recombinante digerido con EcoRI.
Carriles: Est, marcador de peso molecular de 100-3000pb; 671; 672; 673; 871; 872 y 873,
cultivos.
63
3.3 Análisis electroforético del ADN plasmidial recombinante digerido con EcoRI.
Carriles: Est, marcador de peso molecular de 100-3000pb; 971; 972; 973; 951; 952 y 953,
cultivos.
64
4 ANEXO
Secuencias de las cepas del genero Bacillus.
A continuación se presentan las secuencias de las cepas del género Bacillus, estas se
compararon la base de datos del GenBank de NCBI.
1g
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAAT
GGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCC
CATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGT
TCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGG
TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGG
GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAA
GTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGG
AAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAA
CTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAA
GCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCAACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATT
GGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGT
AGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCG
AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA
GTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA
CGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT
TAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGG
GCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG
TTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTC
TAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTA
TGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGC
TAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAAT
CGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG
65
TCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTA
AGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAACTCGTAACAAGGTATCCGT
20
CCACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTAC
AGATACCTTGTGACTAATGCTGAACGCCATCTGTCCCACCTTAGGTGGCTGGCTCCCGAATGTA
ACCCCACGTTGAATGCTGGTGAGATTCAGCATGCAGAGGGCGGAAAGTCGTAATAACCACTGTA
GCAGCTGATGAAATACGGACGTGATACTGGACGGAAGTACCATAATCCGAGTGTGGTCTCTCAC
GCTTTGTAACCGACAGTGAGGGTTACAGAGCGTGAGAGATCACACTCGCCTAGATTGTTCTGGT
AGTATCTCGTACGCATTTCATGAGTTACACAGTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGT
CTCCCAGTTTACAGCACTCCCTCCTGGGGATGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGAATTAAGAAAC
CACGGGGCGCCGCACAAGCGCCCAATCATTCCGGATAACGCGAAGCCAACGCGAAGAACCCGCG
CAGGTTGGCACATCCTTAGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCGTCAAGGAGCCAGCTTATTCA
ACTAGCAATGGTTGTTCCCTAACAACAGAGTGAGATGACCGGAAAACCTTCATCACTCGCGCGG
CCTTGGTTCGTCAGACCCTTCTCCAATGTGGACGATTCCAGGTGGCTGCCTCCGGCAGGAGTGA
GGAAGGTGTGTCAGTCGCAAAATGATCGATCACCCTATCAGGTGGGCTACGCATGGTTTCCAAG
GGGAGCCGTTACGTCACCCAAGAGCTAGAGGGGGAGGGGTCCTTCCATAAGTGACATCAGAAGC
GACCGTTCAATTTAACTCCATGCAGTTCAAAATATTATCCTAGATTAGCCGGATGTTTCCCGGA
GTTATCCCAGTTTTATGGGCCGGTGTACACACGTGTTAGTCACCCCTCGAGAGTTAAAACACCC
GAGCAAGGTGGGGATCCATTCGCTAGCCAGCCATGTATTGGGCGGACAGCCAGCGGGGTCATGA
GTCACGATCAATCTGT
22
CGCCATGGCGGCCGCGGGATTCGATTACAGTTTGATCGTGGCTCATGACCCCGCTGGCTGTCCC
CCTTATACATGGCTGGCTCCCAAGAAGNCGGAAAGTGGTAATACCACTGAGTAGCTGATGGATT
ACGGACGTGGACTGGAGGGAGTATCAGAGGCGAATGTCGTCTTCACGCTCTGGAGCTGACAGTG
TCACTCGAAGAGCGTGAGAGAGCGCACAGGACTAGATAGTTCTGGTAGTATCTCTACGCATCGA
TGAGTTACTACAGTGTTAGAGGGTTTCCTCCTTTTCACTCAAGTGTTAACAGCATTACAGCACT
CCCTCCTGGGGAGTAGCGGGTGCAAGGCACATCTCAAAGGAGATTGACGGGGGCGCCGCACAAG
CGCTGGAGCATTCGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACGCAGGTCTTGACATCCTTA
GAAAACCCTAGAGATAGGGGTTCTCTTTCGGGAGCCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTTGT
66
CAGACAGCAGAGTGAGATGACGGGAAAAGTCTCGTCACGCGCGCGACCCTGGTTCTTCGTACCC
TTCTCCAAGTTGGACGATTTCAGGTGACTGCCTCCGACAAGCGTGAGGAAGGTGTGGCAGTCGC
AAAATCATCAATCCCCTTATCAGGTGGGCTACGCATGGTTTCCAAGGGGAGGTACAACGACACG
CAAGACCGAGAGGGGGAGGTAATCTTATAAAACCGTCATCAGTTCGGACTGTAGGATGCAACTC
CATGCCATGAAGCTGGAATTCCTAGTAAAGTCGGATCATCCCGGAGTTATGAACAGTTTTATGG
GCCGGTGTACACACGTGTTAGTCACACCTCGAGAGTTTGTAACAATAAGAGCAAGGTGGGGTAA
CCTTTTTGGAGCCAGCCACCTAAGGTGGGACAGCCAGCGGGGAGCATTAGTCACAAGGTATCTG
TAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGT
67
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGAC
AGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTG
TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTC
AAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTG
AGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA
CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT
CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAA
GAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTA
CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGG
CTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTTGGA
AACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA
GATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA
GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTG
TTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGG
TCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAA
TTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCT
TTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG
GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAA
GGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGA
CCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAA
TCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGC
TAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA
67
CACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGG
TGGGGCAGATGATTGGGGTGAACTCGTAACAAGGTATCCGT
87
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGAC
AGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTG
TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTC
AAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTGCAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTG
GGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA
CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT
CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAA
GAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTA
CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGG
CTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGGA
AACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA
GATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA
GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTG
TTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGTTGCAGCTAACGCATTAAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG
GTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA
ATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGC
TTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT
GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTA
AGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATG
ACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCAAGACCGCAAGGTTTAGCCA
ATCCCATAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCG
CTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC
ACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAG
GTGGGGCAGATGATTGGGGTGAACTCGTAACAAGGTATCCGT
92
68
AGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTAGAGTTTGATCCTG
GCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGC
TCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAA
CTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTG
GCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCAC
CAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC
AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG
CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTT
CAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC
GCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTT
TCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTGCTTCAACCGGGGAGTATCATTGGAAACTGGGGAT
GTTGAGTGCAGAAGAGGAGAAGTGAAATTACACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAG
GAACATCAGTGGCGAAGGCGACTCTGTGGTCTGTACCTGATGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGAGA
GCGAACAGGATTAGATACCTTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGATAAGTGTTAGGTGGT
TTCCGCCCTCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA
CTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC
AACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTC
GGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGT
CCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTG
CCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACATGGGGT
ACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAGACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAA
ATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATC
GCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGA
GAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAG
ATGATTGGGGTGAACTAGTAACAGAGGTATCCGTT
95
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGAC
AGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTG
TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTC
AGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTG
AGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA
69
CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT
CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAA
GAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACT
ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGG
GCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTTGG
AAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAG
AGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAA
AGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGT
GTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG
GTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA
ATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGAC
GTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT
GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTA
AGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATG
ACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCA
ATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCG
CTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC
ACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAG
GTGGGACAGATGACTGGGGTGAACTCGTAACAAGGTATCCGT
97
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGAC
AGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTG
TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTC
AAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTG
GGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA
CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT
CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAA
GAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTA
CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGG
CTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCCTCAACCCGGGGAGGGTCATTGA
AAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAG
70
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