protocolo corte con enzima de restriccion

PROTOCOLO CORTE CON ENZIMA DE RESTRICCION
La restricción de plásmidos, tiene dos propósitos uno es diagnóstico, el otro es preparativo.
El corte de diagnóstico, me permite determinar si el fragmento de DNA que cloné esta al
derecho, o al reves.
El corte preparativo, me sirve para extraer el fragmento que cloné con el fin de subclonarlo,
utilizarlo como sonda, etc.
¿Cuándo puede ocurrir que el fragmento se clone al revés?
Cuando se clona en un sitio “blunt end”, o producto del corte con una sola enzima de
restricción.
Corte diagnóstico
a) al “derecho”
Enzima Y
cabeza
cola
Enzima X
O
P pares de bases
b) al “revés”
Enzima X
Enzima Y
cola
cabeza
P + n pares de bases
Porque pasa esto, dado que los sitios de restricción son fijos en cada fragmento, si varia la
orientación espacial, entonces la distancia se incrementará (como en el dibujo).
En un gel de agarosa entonces podré ver la diferencia entre un tipo de banda y otro.
Según sea el uso que vaya a darle al fragmento, será necesario optar por uno u otro.
Si es para secuenciar, no importa la orientación del fragmento, si es un plásmido de
expresión, o debo extraer la banda para subclonar entonces si importa la orientación.
Se cortarán ~ 2 ug de plásmido por reacción.
Elementos:
4 tubos eppendorf rotulados A, B, C y D
Micropipetas 1-20 uL.
Tips
H2O deionizada.
Plásmidos A, B, C y D.
React Buffer según cada reacción
Enzima necesarias.
Procedimiento:
En cada tubo rotulado se coloca:
DNA plásmido:…………………………csp 1ug.
Buffer React 10X…………………….. 2 uL.
Enzimas ………………………………... 1 uL c/u
H20 deionizada csp……………………..20 uL.
Se pone a incubar en baño a 37º C durante 3 h.
Se guarda hasta próxima clase en freezer – 20ºC.