“Estudios sobre la participación de AtFH en la biogénesis de

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Universidad Nacional de General San Martín
UNSAM
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas
Instituto Tecnológico de Chascomús
IIB-INTECH-CONICET
“Estudios sobre la participación de AtFH en la
biogénesis de proteínas Fe-S y hemoproteínas en
mitocondrias de plantas”
Tesis para optar al título de
Doctor en Biología Molecular y Biotecnología
Bioquímica María Victoria Maliandi
Director: Dr. Diego F. Gómez-Casati
Co-Directora: Dra. MaríaVictoria Busi
2009
Indice
Indice
Indice
I
Agradecimientos
VI
Publicaciones
VIII
Abreviaturas
IX
1. Introducción
1.1. Estructura y función de la mitocondria
2
1.2. Fosforilación oxidativa
5
1.3. Comunicación núcleo-mitocondria
11
1.4. Biogénesis de los grupos Fe-S
13
1.4.1. Biogénesis de grupos Fe-S en plantas
17
1.5. Producción de especies reactivas de oxígeno
23
1.6. Hierro y daño oxidativo
26
1.7. Frataxina: estructura y función
30
1.8. Biogénesis de hemoproteínas
36
2. Hipótesis y Objetivos
Hipótesis y Objetivos
42
3. Materiales y Métodos
3.1. Material vegetal y condiciones de crecimiento
45
3.2. Cepas bacterianas
45
3.3. Vectores plasmídicos
46
3.4. Medios de cultivo, antibióticos y otros reactivos
3.4.1. Medios de cultivo bacteriano
46
3.4.2. Medios líquidos y soluciones buffer
46
3.4.3. Antibióticos y otros compuestos relacionados
47
3.5. Oligonucleótidos
47
I
Indice
3.6. Preparación y análisis de ADN
3.6.1. Propagación de ADN plasmídico
3.6.1.1. Preparación de bacterias Escherichia coli competentes
50
3.6.1.2. Transformación de bacterias competentes de E. coli
50
3.6.2. Aislamiento de ADN plasmídico
3.6.2.1. Aislamiento de ADN plasmídico (kit comercial)
51
3.6.2.2. Aislamiento de ADN plasmídico mediante lisis alcalina
51
3.6.3. Electroforésis de ADN en geles de agarosa
52
3.6.4. Purificación de ADN a partir de geles de agarosa
52
3.7. Manipulación enzimática de ADN
3.7.1. Reacción de ligación
52
3.7.2. Reacciones de digestión con enzimas de restricción
52
3.8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
53
3.9. Extracción de ARN total
53
3.10. Cuantificación de ARN total
54
3.11. RT-PCR semicuantitativa
54
3.12. PCR en tiempo real (QPCR)
55
3.13. Extracción de ADN genómico
56
3.14. Cuantificación de ADN
56
3.15. Hibridación de ácidos nucleicos (Southern-blot)
56
3.16. Preparación y análisis de proteínas
3.16.1. Extracción de proteínas
58
3.16.2. Determinación del contenido proteico
58
3.16.3. Electroforesis de proteínas
58
3.17. Obtención de anticuerpos policlonales
59
3.18. Análisis por western blot
59
3.19. Aislamiento de plantas mutantes homocigotas
60
3.20. Construcción de vectores binarios para transformación de
plantas de A.thaliana
60
II
Indice
3.21. Preparación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens
y su transformación
3.21.1. Preparación de células competentes
61
3.21.2. Transformación de las células de A. tumefaciens
61
3.21.3. Obtención de ADN plasmídico de A. tumefaciens
62
3.22. Transformación de plantas de A. thaliana utilizando el método de
infiltración por floral dip
63
3.23. Esterilización de semillas de Arabidopsis
63
3.24. Selección de plantas transformadas
64
3.25. Clonado, expresión y purificación de proteínas
3.25.1. Clonado molecular de AtFH de A. thaliana
64
3.25.2. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes
AtFH-His6 y AtFH- STOP de A. thaliana
64
3.26. Ensayo de degradación oxidativa de 2-deoxiribosa
66
3.27. Determinación de Fe
66
3.28. Determinación de la concentración de ATP
67
3.29. Medidas de respiración
67
3. 29.1. Tratamiento con Rotenona
68
3.30. Aislamiento de mitocondrias y determinaciones enzimáticas
3.30.1. Aislamiento de mitocondrias
68
3.30.2 Medida de la actividad enzimática de aconitasa,
succinato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa
69
3.31. Infiltración de hojas con H2O2
69
3.32. Detección histoquímica de superóxido en hojas de Arabidopsis
70
3.33. Detección histoquímica de especies reactivas de oxígeno en hojas y
raíces de plantas de Arabidopsis thaliana
3.34. Determinación del contenido de hemo y actividad catalasa
3.34.1. Determinación de la concentración de hemina
70
70
70
3.34.2. Medida de la actividad catalasa en hojas, flores y mitocondrias
aisladas y recuperación de la actividad catalasa por el agregado
de hemina exógena
71
III
Indice
3.35. Métodos bioinformáticos
72
4. Resultados y discusión
74
Capítulo I
4.1. Caracterización de plantas de Arabidopsis thaliana deficientes
en la expresión de AtFH
4.1.1. Estructura del gen AtFH de Arabidopsis thaliana
75
4.1.2. Selección de plantas mutantes homocigotas de A. thaliana
con inserción de T-ADN en el gen AtFH
76
4.1.3. Construcción de líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana
que expresan AtFH en orientación antisentido y sentido
80
4.1.4. Efecto de la deficiencia de AtFH en plantas de Arabidopsis
4.1.4.1. Análisis fenotípico de plantas de Arabidopsis
deficientes en la expresión de AtFH
4.1.5. Análisis fenotípico de las líneas mutantes atfh-2 y atfh-3
82
86
4.1.6. Caracterización de las plantas de Arabidopsis thaliana que
expresan el gen AtFH en orientación sentido (s-AtFH)
4.1.6.1. Fenotipo de plantas transgénicas s-AtFH
87
Capítulo II
92
5.1. Clonado, expresión y purificación de AtFH recombinante
92
5.2. Atenuación de la reacción de Fenton por AtFH
95
Capítulo III
99
6.1. Efecto de la deficiencia de AtFH sobre la función mitocondrial en
Arabidopsis thaliana
101
6.2. Efecto de AtFH sobre la transcripción y actividad del CI mitocondrial
6.2.1. Determinación de los niveles de expresión de genes del CI
en plantas con deficiencia en AtFH
6.2.2. Efecto de la deficiencia de AtFH sobre la actividad del CI
104
108
IV
Indice
115
Capítulo IV
7.1. Efecto de AtFH sobre la transcripción de genes que codifican
proteínas Fe-S mitocondriales
117
7.2. AtFH y stress oxidativo
7.2.1. Plantas deficientes en frataxina muestran un aumento en el
contenido de Fe y en la producción de especies reactivas
de oxígeno (ROS)
121
7.2.2. Análisis molecular de marcadores de estrés oxidativo
125
7.2.3. Respuesta de AtFH frente a agentes oxidantes
128
Capítulo V
8.1. Participación de AtFH en la biogénesis de hemoproteínas
131
8.1.1. La deficiencia de AtFH provoca una disminución en el
contenido de hemo
8.1. 2. Efecto de la deficiencia de AtFH sobre la actividad catalasa
131
134
8.1.3. Efecto de la deficiencia de AtFH en enzimas claves de la
síntesis del hemo
139
9. Conclusiones
145
10. Resumen
148
11. Referencias
151
V
Agradecimientos
Agradecimientos:
A mi director de tesis, Dr. Diego Gómez Casati, por estimularme día a día,
por ensañarme a pensar y por haberme dado las herramientas necesarias para
desarrollarme en el área de la investigación y haber podido llevar a cabo este trabajo
de tesis.
A mi codirectora, Dra. María Victoria Busi, por haberme abierto las puertas
en el laboratorio aquel febrero de 2004. Por haberme guiado y enseñado desde mis
comienzos y por su constante predisposición tanto en lo laboral como en lo personal.
Al Consejo Directivo y al Director del Instituto de Investigaciones
Biotecnológicas- Instituto Tecnológico de Chascomús (IIB-INTECH) Dr. Alberto
Carlos Frasch, por permitirme realizar este trabajo de tesis en este Instituto.
A la Universidad Nacional de General San Martín por haberme dado la
oportunidad de cursar la carrera de Doctorado en esta importante casa de estudios.
A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) y
al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), por
otorgarme la beca de iniciación y finalización respectivamente, que posibilitaron la
realización de este trabajo de tesis.
Al Dr. Eduardo Zabaleta, que me dio la posibilidad de realizar una pasantía
en el laboratorio y así poder comenzar a trabajar en investigación.
A José Luis Burgos por el apoyo técnico prestado durante el desarrollo de
toda esta tesis.
Al instituto INFIVE, UNLP y al instituto IFISE, UNR,
por haberme
permitido realizar las medidas de respiración y de niveles de ATP respectivamente,
informadas en este trabajo de tesis.
VI
Agradecimientos
Al Dr. Alejandro Araya, por su asesoramiento en la discusión de los
resultados de la PCR en tiempo real.
A todos los que componen la “UB6” por crear un muy lindo ambiente de
trabajo y compañerismo.
A Vale, por su excelente calidad humana y por siempre estar predispuesta a
ayudar.
A mis amigos, Colo, Huguito, y José Luis, por habernos permitido distraer
minutos de trabajo para realizar nuestras típicas charlas, por apoyarnos en momentos
en los que lo hemos necesitado y por la buena relación que siempre nos ha
acompañado.
A todos mis amigos del INTECH que he ido conociendo durante todos estos
años y con los cuales he pasado momentos que siempre recordaré.
A Diego y Vicky, porque siempre me han brindado tanto en lo personal
como en lo laboral, un gran apoyo y no tengo más que agradecimientos hacia ellos.
A mis amigos de la vida, del cole y de la facu, con los que cuento
incondicionalmente.
A mi familia, que siempre me acompañan y apoyan en todas las decisiones
que tomo en mi vida, y que sin ellos no hubiese podido lograr nada de lo que he
realizado hasta ahora.
VII
Publicaciones
Parte de estos resultados fueron presentados en:
Publicaciones:
1- Busi, M.V.; Maliandi, M.V.; Valdez, H.; Clemente, M.; Zabaleta, E.J.; Araya, A. and
Gomez-Casati, D.F. (2006) Deficiency of Arabidopsis thaliana frataxin alters
mitochondrial Fe-S proteins activity and induces oxidative stress. The Plant Journal
48, 873-882.
2- Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Clemente, M.; Zabaleta, E.J.; Araya, A. and GomezCasati, D.F. (2007) Expression and one-step purification of recombinant Arabidopsis
thaliana frataxin homolog (AtFH). Protein Expression and Purification 51, 157-161.
3- Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Araya, A. and Gómez Casati, D.F. Role of frataxin in
the biogenesis of hemoproteins in Arabidopsis. Enviado para su publicación.
Presentaciones a Congresos
1- Busi MV, Clemente M, Maliandi MV, Rius S, Burgos JL, Valdez H, Zabaleta E, Araya A and GómezCasati D. Oxidative stress and A. thaliana Frataxin homolog (AtFH). XL Reunión SAIB, Posadas,
Misiones, Argentina, 2004.
2- Busi, MV; Valdez, H; Clemente, M; Maliandi, MV; Zabaleta, E; Araya, A and Gómez-Casati, D.
Arabidopsis thaliana frataxin homolog (AtFH) deficiency increases oxidative stress and modulates Fe-S
protein activity in mitochondria. International Congress on Plant Mitochondrial Biology, Obernai,
France, jun 2005.
3- Martín, M.; Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Lamattina, L.; Gómez-Casati, D.; Zabaleta, E. Arabidopsis
thaliana frataxin (AtFH) is involved in oxidative stress and iron homeostasis. XLI Reunión SAIB,
Pinamar, Argentina, 2005.
4- Maliandi, M.V.; Valdez, H.;, Clemente, M.; Busi, M.V.; Zabaleta, E.; Araya, A. and Gomez-Casati, D.
Molecular Cloning, Expression and Purification of Arabidopsis thaliana Frataxin homolog (AtFH). XLI
Reunión SAIB, Pinamar, Argentina, 2005.
5- Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Zabaleta, E.J.; Araya, A. y Gomez-Casati, D.F. Caracterización funcional
de frataxina de Arabidopsis thaliana. XXVI Reunión Argentina de Fisiología Vegetal (SAFV) ,
Chascomús, Argentina, 2006.
6- Rodriguez Colman, M.; Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Graziano, M.; Gomez-Casati, D.; Lamattina, L.;
Zabaleta, E.; Martin, M. A. thaliana frataxin is involved in iron homeostasis and oxidative stress. XLII
Reunión SAIB, Rosario, Argentina, 2006.
7- Maliandi, M.V.; Rius, S.P.; Busi, M.V. y Gómez-Casati, D. A simply method for the addition of
rotenone in Arabidopsis leaves. XLII Reunión SAIB, Rosario, Argentina, 2006.
8- Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Valdez, H.A.; Clemente, M.; Zabaleta, E.; Araya, A. and Gomez-Casati,
D.F. Deficiency of Arabidopsis thaliana frataxin alters activity of mitochondrial Fe–S proteins and
induces oxidative stress. XXXVII Annual Meeting of SBBq (Brazilian Biochemistry and Molecular
Biology Society) and XI PABMB Congress (Pan- American Association for Biochemistry and
Molecular Biology), San Pablo, Brasil, 2008.
9- Maliandi, M.V.; Busi, M.V y Gómez-Casati, D. Participation of AtFH in the biogenesis of hemecontaining proteins. XLIII Reunión SAIB, Carlos Paz, Argentina, 2008
VIII
Abreviaturas
Abreviaturas:
ácido desoxiribonucleico
ADN copia
ADN genómico
ADN mitocondrial
ácido ribonucleico
ácido ribonucleico mensajero
adenosina trisfosfato
albumina sérica bovina
bromuro de cetil trimetil amonio
5-bromo-4-cloro-indolil-fosfato
buffer (tomada del inglés)
buffer fosfato salino
cantidad suficiente para
2ƍ,7ƍ-diclorodihidrofluoresceina diacetato
densidad óptica
ADN
ADNc
ADNg
ADNmt
ARN
ARNm
ATP
BSA
CTAB
BCIP
sc. amortiguadora de pH
PBS
c.s.p
H2DCFDA
D.O
diclorofenol indofenol
DCPIP
dietil pirocarbonato
docecil sulfato sódico
electroforesis en gel de poliacrilamida
especies reactivas de oxigeno
flavina adenina dinucleótido
fluoruro de fenilmetilsulfonil
frataxina homólogo de Arabidopsis thaliana
frataxina homólogo de levaduras
gentamicina
higromicina
isopropil ȕ-D-tiogalactopiranosido
kanamicina
kilodalton
levaduras mutantes deficientes en frataxina
milimolar
nicotinadamida adenina dinucleótido reducido
nitroblue tetrazolium
pares de bases
peróxido de hidrógeno
peso fresco
peso seco
peso/peso
peso/volumen
Reacción en cadena de la polimerasa
DEPC
SDS
PAGE
ROS
FAD
PMSF
AtFH
YFH
gem
hig
IPTG
kan
kDa
ǻyfh
mM
NADH
NBT
pb
H 2 O2
PF
PS
P/P
P/V
PCR
IX
Abreviaturas
porción del plásmido Ti
retro-transcripción
rifanpicina
volumen/volumen
wild type (tomado del inglés), tipo salvaje
T-ADN
RT
rif
V/V
wt
X
Introducción
Introducción
1.1.
Estructura y función de la mitocondria:
Las mitocondrias son organelas dinámicas y pleomórficas de las células
eucariotas involucradas en distintos procesos como por ejemplo la fosforilación
oxidativa, el metabolismo del carbono y del nitrógeno, la termorregulación, la
homeostasis del calcio y hierro (Mackenzie and McIntosh, 1999; Orrenius et al., 2003),
la regulación de la apoptosis (Youle and Karbowski, 2005) y la síntesis de grupos Fe-S
y hemo (Muhlenhoff et al., 2002; Lange et al., 1999). Estas organelas poseen una doble
membrana y difieren en tamaño, forma y cantidad, dependiendo del tipo celular, función
tisular y la actividad metabólica del tejido donde se encuentran. Se ha informado que en
los tejidos metabólicamente más activos, las mitocondrias ocupan una gran proporción
del volumen celular (Lehninger et al., 1993).
La membrana externa mitocondrial no forma pliegues y rodea completamente
la organela. Esta membrana es permeable a iones y pequeñas moléculas. La membrana
interna presenta invaginaciones denominadas crestas mitocondriales que proporcionan
una gran área superficial y es impermeable a la mayoría de las moléculas pequeñas e
iones, incluido los protones (H+). En general, las únicas especies que pueden atravesar
la membrana interna son aquellas para las que existen proteínas transportadoras
específicas. Es en las crestas de la membrana interna, donde se encuentran los
complejos multiproteicos de la cadena de transporte de electrones y el complejo ATP
sintasa (Lehninger et al., 1993; Taiz and Zeiger, 1998).
El espacio interno situado entre la membrana externa y la interna se denomina
espacio intermembrana. En este compartimento se acumulan altas concentraciones de
protones que provienen de la matriz mitocondrial. El mecanismo detallado que acopla la
transferencia de electrones a la translocación de protones es poco conocido. El flujo de
protones a través de canales proteicos y a favor de su gradiente electroquímico provee la
energía libre necesaria para la síntesis de ATP, catalizado por el complejo ATP sintasa.
El
compartimento
interno
de
la
mitocondria,
denominado
matriz
mitocondrial, contiene diferentes complejos proteicos y enzimas como el complejo
2
Introducción
piruvato deshidrogenasa, las enzimas del ciclo del ácido cítrico, enzimas relacionadas
con la oxidación de ácidos grasos y metabolismo de aminoácidos, ribosomas y ADN
mitocondrial (Lehninger et al., 1993; Logan, 2006) (Figura 1).
Figura 1: Estructura esquemática de la mitocondria. Tomada de Proyecto biosfera, www.
recursos.cnice.mec.es.
A diferencia de otras estructuras membranosas como los lisosomas, el
complejo de Golgi o la envoltura celular, las mitocondrias tienen naturaleza
semiautónoma: deben dividirse para pasar a la siguiente generación a partir de
mitocondrias previamente existentes. Esta división se logra por fisión como ocurre en la
mayoría de los procariotas (Lenhinger., 2005).
Debido su origen endosimbiótico y por encontrarse en algunas algas
inferiores, podría esperarse que la mitocondria utilice la maquinaria de fisión heredada
de bacterias progenitoras. FtsZ es una GTPasa, estructuralmente homóloga a la tubulina
que media la división celular en bacterias al ensamblarse a un anillo en el sitio medio de
la división celular (McFadden and Ralph, 2003). En cloroplastos de plantas superiores, se
conocen dos genes FtsZ codificados a nivel nuclear, FtsZ1 y FtsZ2 (Vitha et al., 2001).
Dichos genes se
han encontrado a su vez en procariotas relacionados con las
mitocondrias y presumiblemente participen en la división mitocondrial de algas y otros
3
Introducción
protistas (Beech and Gilson, 2000; Beech et al., 2000; Takahara et al., 2000). Sin
embargo, y en contraste con lo que ocurre en cloroplastos, no se han encontrado
homólogos del gen FtsZ en el genoma mitocondrial de Arabidopsis, humanos, ratones,
C. elegans y levaduras. En su lugar, en plantas superiores, se ha descripto la existencia
de dos proteínas denominadas “dynamin-like proteins”, ADL2a y ADL2b, las cuales
participarían en el proceso de división mitocondrial (Arimura and Tsutsumi, 2002;
Arimura et al., 2004).
Cada una de las mitocondrias presentes en la célula contiene su propio ADN,
ARN y ribosomas. Este hecho da soporte a la teoría que supone que las mitocondrias
descienden de bacterias aeróbicas que vivían simbióticamente con las células eucariotas
primitivas (Lenhinger., 2005). Normalmente, el ADN presente en el total de
mitocondrias de una célula somática no llega al 0.1 % del ADN celular total. El ADN
mitocondrial codifica ciertas proteínas específicas de la membrana mitocondrial interna
y algunos ARNt y ARNr mitocondriales. Si bien la mitocondria tiene su propio material
genético, más del 98% de las proteínas que se localizan en esta organela están
codificadas en el genoma nuclear que luego son sintetizadas en el citosol e importadas
dentro de la mitocondria (Leaver, 1983; Unseld et al., 1997; Gray et al., 1999; Duby et
al., 2002; Whelan and Glaser, 1997).
El primer informe sobre el importe de proteínas hacia la mitocondria de
plantas fue realizado en 1987 (Boutry et al., 1987). Estudios posteriores determinaron la
existencia de dos maquinarias en la membrana externa de mitocondrias: (i) la traslocasa
general de membrana externa (TOM, Translocase of the Outher Membrane) y (ii) la
maquinaria de ensamblaje SAM (Sorting and Assembly Machinery”) (Rapaport, 2002;
Stojanovski et al., 2007). Además las mitocondrias contienen una tercera maquinaria de
importe y ensamblado de proteínas del espacio intermembrana (MIA, Machinery for
Intermembrane space import and Assembly”) (Neupert and Herrmann, 2007; Bolender
et al., 2008).
4
Introducción
1.2.Fosforilación oxidativa
La fosforilación oxidativa es la síntesis de ATP impulsada por la transferencia
de electrones al oxígeno, y la fotofosforilación, que es la síntesis de ATP impulsada por
la luz, son los dos mecanismos más importantes de producción de ATP en las células, y
generan conjuntamente la mayor parte del ATP sintetizado en los organismos aeróbicos
(Lehninger et al., 1993; Hüttemann et al., 2008).
En la fosforilación oxidativa, se produce la reducción de O2 a H2O con
electrones cedidos por el NADH y el FADH2 que captan los electrones de las reacciones
oxidativas del complejo de la piruvato deshidrogenasa, del ciclo del ácido cítrico, de la
ruta de la ß-oxidación de ácidos grasos y de reacciones del catabolismo de aminoácidos.
Estos electrones son canalizados en forma de pares electrónicos hacia los complejos
proteicos que forman la cadena respiratoria o cadena de transporte de electrones
mitocondrial (Lehninger et al., 1993).
La cadena respiratoria mitocondrial está compuesta por cuatro complejos
enzimáticos y dos transportadores electrónicos que en general son proteínas integrales
de membrana, con grupos prostéticos capaces de aceptar y donar uno o dos electrones.
Cada componente de la cadena puede aceptar electrones del transportador precedente y
transferirlo al siguiente en una secuencia específica. Los complejos que forman esta
cadena son: NADH deshidrogenasa (complejo I, CI), succinato deshidrogenasa
(complejo II, CII), citocromo bc1 (complejo III, CIII), citocromo oxidasa (complejo IV,
CIV), coenzima Q (ubiquinona) y el citocromo c (Hüttemann et al., 2008) (Figura 2).
5
Introducción
Figura 2: Representación esquemática de la cadena de transporte de electrones de la membrana interna
mitocondrial (Lenhinger., 2005).
El CI se encuentra en la membrana interna mitocondrial y transfiere los
electrones desde el NADH hacia la ubiquinona vía varios centros redox (FMN y centros
Fe-S). Este complejo está formado por múltiples subunidades, alrededor de 30 a 46 en
hongos y mamíferos. La mayoría de ellas están codificadas a nivel nuclear, mientras
que algunas pocas subunidades están codificadas en el ADN mitocondrial. Por esto, se
postula que es necesaria una fina regulación entre ambos genomas a fin de asegurar el
correcto ensamblado y estequiometría del complejo (Rasmusson et al., 1998). En
Arabidopsis, un total de 30 proteínas forman parte del CI, muchas de las cuales son
homólogas a las encontradas en otros organismos. Recientemente han sido identificadas
cuatro subunidades codificadas a nivel del genoma mitocondrial (ND1, ND5, ND7 Y
ND9) y 17 subunidades codificadas a nivel nuclear (Heazlewood et al., 2003 ).
La succinato deshidrogenasa (CII), es una enzima que participa tanto en el
ciclo del ácido cítrico como en la cadena de transporte de electrones. Cataliza la
reacción de oxidación de succinato a fumarato y la reducción de ubiquinona a ubiquinol.
(Scheffler, 1998; Ackrell, 2000). El CII ha sido caracterizado en bacterias, protozoos,
hongos y animales y en todos ellos se ha encontrado que está compuesto por cuatro
subunidades: una flavoproteina (SDH1), una subunidad Fe-S (SDH2), y dos
6
Introducción
subunidades de anclaje a membrana (SDH3 y SDH4) (Horsefield et al., 2004; Millar et
al., 2004b). El sitio de unión al succinato está formado por el polipéptido SDH1, el cual
se une covalentemente al FAD, actuando como aceptor de protones en el paso inicial de
la oxidación del succinato. Esta subunidad flavoproteica, interactúa con la subunidad
Fe-S que contiene tres centros Fe-S no hemínicos, [Fe2-S2], [Fe4-S4] and [Fe3-S4], que
actúan como conductores de electrones desde la flavoproteína hacia la membrana
(Scheffler, 1998; Ackrell, 2000; Hüttemann et al., 2008).
En Arabidopsis se ha podido separar el CII de los otros complejos por la
técnica de “Blue-native Page”, y se demostró que está compuesto por al menos 8
subunidades proteicas. Así, el CII de Arabidopsis contiene las cuatro subunidades
clásicas, las cuales poseen secuencias similares a las encontradas en otros organismos y
4 subunidades específicas de este organismo (Eubel et al., 2003). Las cuatro
subunidades adicionales fueron denominadas SDH5, SDH6, SDH7 y SDH8, y serían
subunidades específicas de plantas (Millar et al., 2004b). Las ocho subunidades de
SDH se encuentran codificadas en el genoma nuclear (Scheffler, 1998; Figueroa et al.,
2001; Millar et al., 2004b), encontrándose que varias de ellas están codificadas por más
de un gen. Por ejemplo, la subunidad SDH1, está codificada por dos genes nucleares
SDH1-1 y SDH1-2; SDH2, está codificada por tres, llamados, SDH2-1, SDH 2-2 y
SDH2-3; SDH3 está codificada por otros tres, la subunidad SDH4 está codificada por
un único gen nuclear y SDH7 se encuentra codificada por dos genes nucleares (Millar
et al., 2004b).
La
ubiquinona-citocromo
c
oxidoreductasa
(CIII),
consiste
en
10
subunidades, incluídas las peptidasas mitocondriales, codificadas por 16 genes, ya que
seis de estas subunidades, están codificadas por más de un gen en A. thaliana (Braun
and Schmitz, 1992; Eubel et al., 2003). La mayoría de las subunidades que forman este
complejo, están codificadas por el genoma nuclear (Kruft et al., 2001; Werhahn and
Braun, 2002; Meyer et al., 2008), aunque existe una única subunidad, el citocromo b,
que está codificada en el genoma mitocondrial (Unseld et al., 1997).
7
Introducción
La citocromo c oxidasa (COX, CIV) está formada por 13 subunidades en
mamíferos, tres de las cuales están codificadas en el genoma mitocondrial y diez son
nucleares. Previamente se había informado la existencia de 7 u 8 subunidades de este
complejo en plantas (Peiffer et al., 1990). Estudios recientes llevados a cabo por Eubel y
col. (Eubel et al., 2003) y Millar y col. (Millar et al., 2004) han dilucidado la presencia
de al menos 12 subunidades del CIV en plantas de Arabidopsis. En estos trabajos se han
identificado ocho proteínas homólogas a las subunidades conocidas de COX de otros
organismos y otras seis subunidades específicas de plantas (Millar et al., 2004).
La mitocondria de plantas posee una bifurcación de la cadena de transporte de
electrones clásica, dada por la presencia de cinco enzimas accesorias que no translocan
protones: cuatro NADH deshidrogenasas insensibles a rotenona (NDH-DHS) y una
oxidasa alternativa (Moller, 2001a) (Figura 3).
Figura 3: Organización de la cadena de transporte de electrones de mitocondria de plantas y el complejo
ATP sintasa (CV). Adicionalmente a los complejos respiratorios CI al CIV encontrados en mitocondrias
de otros organismos, la mitocondria de plantas contiene una oxidasa alternativa y NAD(P)H
deshidrogenasas en el lado interno y externo de la membrana interna de la organela. (Tomado de Taiz y
Zeiger, Plant Physiology, 2ª Edición).
La vía alternativa de respiración está compuesta por una única proteína
llamada oxidasa alternativa (AOX) (Elthon and McIntosh, 1987), la cual existe como
homodímero en la membrana mitocondrial interna (Umbach and Siedow, 1993), y se
presenta en dos formas, una oxidada o menos activa, y otra reducida o activa (Umbach
8
Introducción
and Siedow, 1993) (Figura 3). Cuando ocurre alguna inhibición de los complejos
respiratorios, especialmente CIV, como así también alguna saturación en la cadena de
citocromos, produciendo un aumento de la relación ATP/ADP y NADH/NAD+, los
electrones se desvían de la cadena de transporte clásica hacia la vía alternativa, al nivel
del pool de ubiquinona (Lambers, 1982; Laties, 1983).
La enzima AOX cataliza la reducción de cuatro electrones del oxígeno hacia
el agua, salteándose dos centros de conservación de energía (CIII y CIV) y, por lo tanto,
no se genera el gradiente de protones que llevaría a la síntesis de ATP.
Consecuentemente, la energía que es conservada como ATP en la vía clásica, se pierde
como calor cuando los electrones pasan a través de la vía alternativa (Lambers, 1982).
En Arabidopsis, AOX,
esta codificada por cinco genes, cuatro de los cuales se
denominan tipo AOX1 y uno tipo AOX2 (Considine et al., 2002). Se observó que la
expresión de los diferentes genes que codifican para AOX depende del tipo tisular y el
estadío de desarrollo del mismo (Saisho et al., 1997; Saisho et al., 2001; ThirkettleWatts et al., 2003). AOX1a se expresa en la mayoría de los tejidos, aunque AOX1c lo
hace en cotiledones jóvenes y flores, teniendo mayores niveles de expresión en estas
últimas. AOX1b, AOX1d y AOX2 se expresan en todos los tejidos pero en menores
niveles. Se ha informado que AOX, tiene un papel antioxidante en la mitocondria de
plantas, encontrándose mayores niveles de expresión en situaciones de estrés como el
ocasionado por frío, ataque de patógenos, sequía, y daño celular. En estas situaciones
los genes más afectados son los AOX1a y AOX1d (Millar et al., 2008 ).
La otra bifurcación de la cadena de transporte clásica, se da a nivel del
complejo I por la presencia de NADH y NADPH deshidrogenasas insensibles a
rotenona. Estas enzimas transfieren los electrones a la ubiquinona desde la matriz o el
espacio intermembrana donde se encuentra el pool de NAD(P)H (Rasmusson et al.,
2004). Como hemos mencionado, estas deshidrogenasas son insensibles a rotenona
(inhibidor del CI) y consecuentemente la respiración en las plantas puede continuar en
presencia de este compuesto (Roberts et al., 1995). Sin embargo, bajo estas condiciones
el CI no puede translocar protones y por lo tanto habría una deficiencia en la producción
de ATP.
9
Introducción
Por otro lado, se han identificado 7 genes de NDH-DHs en Arabidopsis y se
los han dividido en tres clases: NDA (NDA1 y NDA2), NDB (NDB1, NDB2 y NDB4) y
NDC (NDC1) (Michalecka et al., 2003). Usando experimentos de importe de proteínas
marcadas radiactivamente, se reveló que NDA1, NDA2 y NDC1 están localizadas en el
interior de la membrana interna, mientras que NDB1, NDB2 y NDB4 están localizadas
en la parte externa de la membrana interna (Elhafez et al., 2006 ). A través de estudios
de caracterización bioquímica en mitocondrias aisladas de plantas, se ha demostrado
que las NADH deshidrogenasas internas, operan en paralelo con el CI (Rasmusson and
Moller, 1991). Del lado externo de la membrana interna, el NADH y el NADPH, son
oxidados por deshidrogenasas dependientes de Ca+2 (Roberts et al., 1995). A su vez, el
NADPH interno puede oxidarse de una manera dependiente de Ca+2, mientras que la
oxidación del NADH interno es la única actividad independiente de Ca+2 (Moller,
2001b). La diferente especificidad de cada una de las deshidrogenasas le permite a la
planta poder oxidar el NAD(P)H durante distintas situaciones .
Algunos de los complejos de la cadena transportadora de electrones están
compuestos por centros Fe-S, formando proteínas ferro – sulfuradas, en las cuales el
hierro está presente no en la forma de hemo (como en los citocromos), sino en
asociación con átomos de azufre inorgánico, con residuos de cisteína de la proteína, o
con ambos (Lenhinger., 2005). Así, el complejo NADH deshidrogenasa contiene 8
centros Fe-S (Herald et al., 2003), el Complejo II posee 3 centros Fe-S (Elorza et al.,
2004) y el citocromo c un grupo (Millar et al., 2004a). Además se ha descripto la
presencia de otras proteínas Fe-S en la matriz mitocondrial como la enzima aconitasa
(Elorza et al., 2004), que interviene en el ciclo de Krebs .
Uno de los tópicos de estudio en este trabajo de Tesis está relacionado con la
caracterización de genes y sus productos proteicos que participan en el ensamblado de
los centros Fe-S y biogénesis de ferrosulfoproteínas en plantas. Dado que la mayoría de
las proteínas Fe-S mitocondriales está codificada por genes nucleares, el ensamblado de
las mismas constituye un buen modelo para el estudio de los mecanismos de
comunicación entre el núcleo y la mitocondria.
10
Introducción
1.3. Comunicación núcleo-mitocondria
La coordinación de funciones entre diferentes compartimentos y organelas
celulares es esencial para el crecimiento y desarrollo de la planta. En estos últimos años,
se ha incrementado el estudio y los conocimientos sobre las señales generadas por
organelas como el cloroplasto y la mitocondria y la adaptación de la respuesta
transcripcional nuclear a esas señales. A este proceso se lo denomina señalización
retrógrada (Pogson et al., 2008).
Las mitocondrias y cloroplastos de plantas, tienen un origen bacteriano y un
genoma propio y único. Sin embargo, durante la evolución, la mayoría de los genes
endosimbióticos originales, han sido transferidos al núcleo, necesitando una señal que
permita que la proteína sea sintetizada en el citosol y luego dirigida a la organela
(Giege´ et al., 2005).
Como se mencionó anteriormente, más del 98% de las proteínas
mitocondriales están codificadas en el ADN nuclear y son importadas dentro de la
mitocondria, donde cumplen su función (Leaver, 1983; Unseld et al., 1997; Whelan and
Glaser, 1997; Gray et al., 1999; Duby et al., 2002). Para ello, los genes nucleares que
codifican para proteínas mitocondriales han adquirido señales de transcripción
adecuadas (promotores) y secuencias de importe necesarias para que los productos sean
dirigidos a la organela (Margulis, 1995; Figueroa et al., 1999). Aproximadamente de las
1000 o más proteínas que se estiman que constituyen la mitocondria funcional de
plantas (Millar et al., 2004a), únicamente 33 proteínas, 3 ARNr y 20 ARNt son
codificadas en el genoma mitocondrial en Arabidopsis thaliana (Unseld et al., 1997;
Duchêne and Maréchal-Drouard, 2001).
Por lo descripto más arriba, debe existir una comunicación y regulación
precisa entre el núcleo y la mitocondria para asegurar la expresión coordinada de ambos
genomas. Esto es particularmente importante en la biogénesis de los complejos
respiratorios de la membrana mitocondrial interna. Es claro, que la interrelación entre
los factores de transcripción y coactivadores contribuyen a la expresión de genes
11
Introducción
respiratorios tanto nucleares como mitocondriales. Además, la regulación de la
biogénesis mitocondrial depende de proteínas que al interaccionar con el ARN de
proteínas mitocondriales, influencian su metabolismo y expresión (Cannino et al.,
2007).
Estudios desarrollados por Brennicke y col. en Arabidopsis, han demostrado
que la regulación de la expresión génica de mitocondrias, incluye un complejo proceso a
nivel transcripcional y posttranscripcional, como el procesamiento del 5´y 3´ ARN,
splicing de intrones, edición del ARN y regulación de la estabilidad del ARN (Binder
and Brennicke, 2003). Estudios comparativos entre actividad transcripcional y los
niveles de varios ARN codificados en el genoma mitocondrial de Arabidopsis, revelan
una baja correlación entre la actividad relativa de los promotores y la abundancia de los
transcriptos, sugiriendo una fuerte regulación a nivel postraduccional (Giegé et al.,
2000).
Con el objeto de ampliar los conocimientos sobre los mecanismos de
comunicación núcleo – mitocondria, en nuestro laboratorio se ha desarrollado un
modelo de estudio basado en la construcción de plantas que presentan una disfunción
mitocondrial generada por la expresión de un gen "no-editado" u-ATP9 (Hernould et al.,
1993; Zabaleta et al., 1996; Gómez-Casati et al., 2002). La deficiencia mitocondrial
indujo la expresión de tres genes nucleares que codifican proteínas Fe-S del complejo
CI (PSST, TYKY y NADHbp), como así también otros factores asociados a este
complejo, como es ARR2 (Arabidopsis Response Regulator 2). Este gen se expresa
predominantemente en granos de polen y activaría la transcripción de algunos genes que
codifican subunidades del CI como PSST (Lohrmann et al., 2001). El modelo de
disfunción mitocondrial de las plantas u-ATP9 mostró también la inducción en los
niveles de expresión de algunos genes nucleares relacionados con la síntesis de
proteínas Fe-S en mitocondrias, como el homólogo de frataxina de Arabidopsis (AtFH)
(Busi, et al., 2004).
12
Introducción
1.4 Biogénesis de los grupos Fe-S
La biogénesis de grupos Fe-S es una de las funciones esenciales de la
mitocondria. Los grupos Fe-S son moléculas inorgánicas que forman parte de
ferrosulfoproteínas celulares (Beinert et al., 1997). En los organismos vivos estos
grupos se encuentran formando diferentes estructuras: (i) diméricas ([Fe2-S2]) que
tienen estructura rómbica y (ii) tetraméricos ([Fe4-S4]), de estructura cúbica. Aunque los
dos grupos descriptos son los más abundantes entre las proteínas Fe-S, también existen
formas de mayor complejidad estequiométrica como por ejemplo el grupo [Fe8-S7] en la
enzima nitrogenasa. En general, los grupos Fe-S están unidos a las cadenas
polipeptídicas mediante enlaces que se establecen entre las cisteínas de la proteína y los
átomos de azufre del cofactor (Figura 4). Una excepción la constituye la proteína Rieske
(una de las subunidades del CIII mitocondrial) en la cual el átomo de Fe coordina con
dos residuos de histidina en lugar de dos residuos de cys (Rieske et al., 1964; Iwata et
al., 1996).
Figura 4: Esquema de la estructura de los grupos Fe-S unidos a un polipéptido. (a) Estructura simple con
un único átomo de Fe coordinado con cuatro residuos de cys. Existen algunos centros que incluyen dos S
inorgánicos y dos átomos de S de cisteínas (b) Fe2-S2 y (c) Fe4-S4 (Lenhinger., 2005).
Las ferrosulfoproteínas están involucradas en una gran cantidad de procesos
celulares como reacciones enzimáticas, respiración celular, biogénesis de ribosomas,
regulación de la expresión génica, fijación de nitrógeno y las respuestas a estrés. Una de
las funciones más importantes está relacionada con la transferencia de electrones en los
13
Introducción
complejos respiratorios mitocondriales y en el aparato fotosintético de cloroplastos
(Balk and Lobréaux, 2005; Lill and Muhlenhoff, 2008). Las ferrosulfoproteínas, pueden
participar en estos procesos debido al amplio rango de potencial redox que presentan, ya
que varía de -0.65 V hasta +0.45 V. Durante el proceso de transferencia de electrones,
un átomo de Fe del centro Fe-S es oxidado o reducido dependiendo del microambiente
en que se encuentre y el tipo de proteína a la cual esté unido (Beinert, 2000). Algunos
ejemplos de proteínas Fe-S son los complejos respiratorios mitocondriales CI, CII y
CIII; la aconitasa, presente en la matriz mitocondrial y relacionada con el ciclo de Krebs
(Beinert et al., 1997); la nitrogenasa, relacionada con la fijación de N2 (Peters et al.,
1995; Rees and Howard, 2000); la aldehído oxidasa, involucrada en la biosíntesis de
ácido indolacético y ácido absícico (Andrade et al., 2000), la ferredoxina que participa
en el proceso fotosintético (Hall et al., 1966; Palmer and Sands, 1966); la Iron
Responsive Protein IRP1, de localización citosólica (Lill et al., 2005); y la endonucleasa
Ntg2p presente en el núcleo celular (Lukianova and David, 2005) (Tabla 1).
14
Introducción
Tabla 1: Proteínas Fe-S y localización sub-celular en plantas superiores
Proteína
Aconitasa
Adenosina 5´fosfosulfato reductasa (APS
reductasa)
Adrenodoxina (ferredoxina mitocondrial)
Aldehído oxidasa
Amidofosforibolsiltransferasa
Biotina sintasa
Clorofila a oxigenasa
Colina monooxigenasa
Cnx2 (síntesis molibdopterina)
Acido dehidroxi dehidratasa
ADN glicosilasa
Endonucleasa III (NTH1)
Ferredoxina
Ferredoxina-tioredoxina reductasa
Glutamato sintasa (Fd-GOGAT)
Lipoato sintasa (relacionado con biotin sintasa)
NADH- plastoquinona oxidoreductasa subunidades
K, I, H (PsbG, NdhI, NdhH)
NADH- ubiquinona oxidoreductasa (CI)
Homólogo NBP35 (P-loop NTPasa)
NAR1 (tipo hidroxilasa)
Nitrito reductasa
Feofórbido a oxigenasa (LLS1)
Fotosistema I subunidades PsaA y PsaB
Fotosistema I subunidade PsaC
Proteína Rieske (PetC)(complejo citocromo b6f)
Proteína Rieske (ubiquinol-citocromo c reductasa)
Tipo inhibidor RNAsaL
Sirohidroclorin ferroquelatasa
Succinato deshidrogenasa subunidad 2
Sulfito reductasa
Tic55, proteína plástidica de maquinaria de
importe
Xantina deshidrogenasa
Centro Fe-S
[Fe4-S4]
[Fe4-S4]
Localización a
Mitocondria, citosol
Plástido
[Fe2-S2]
2[Fe2-S2]
[Fe4-S4]
[Fe2-S2], [Fe4-S4]
[Fe2-S2] (tipo Rieske)
[Fe2-S2] (tipo Rieske)
Mitocondria
Citosol
Plástido
Mitocondria
Plástido
Plástido
Citosol (P)
Plástido
Núcleo
Núcleo
Plástido
Plástido
Plástido
Mitocondria, plástido
Plástido
b
[Fe4-S4]
[Fe4-S4]
[Fe4-S4]
[Fe2-S2]
[Fe4-S4]
[Fe3-S4]
[Fe2-S2], [Fe4-S4]?
b
b
b
b
[Fe4-S4]
[Fe2-S2], (tipo
Rieske)
[Fe4-S4]
2[Fe4-S4]
[Fe2-S2] (tipo Rieske)
[Fe2-S2] (tipo Rieske)
b
[Fe2-S2]
[Fe2-S2], [Fe3-S4],
[Fe4-S4]
[Fe4-S4]
[Fe2-S2] (tipo Rieske)
2[Fe2-S2]
Mitocondria
Citosol (P)
Citosol (P)
Plástido
Plástido
Plástido
Plástido
Plástido
Mitocondria
Citosol (P)
Plástido
Mitocondria
Plástido
Plástido
Citosol
a
Fe-S proteínas encontradas en varias vías metabólicas en plantas, incluidas fotosíntesis, respiración,
asimilación de nitrógeno y azufre, reparación al DNA y cofactores de biosíntesis. La mayoría de las
proteínas Fe-S se encuentran en cloroplastos (plástidos) y mitocondria.
(P) Predicho en base a secuencias u otra información
b
Tipo de centro Fe-S todavía no determinado.
Tomada de Balk and Lobréaux, (2005).
Los centros Fe-S se pueden ensamblar a apoproteínas in vitro en presencia de
S=, Fe+2 y Fe+3 y ditiotreitol (Balk and Lill, 2004). Esta reacción no puede llevarse a
cabo in vivo, ya que el azufre y el hierro en sus formas libres son extremadamente
tóxicos para la célula. Por este motivo, es necesario que la biosíntesis de los grupos Fe15
Introducción
S y su inserción a apoproteínas se lleve a cabo bajo un proceso controlado. In vivo, el
ensamblado de los grupos Fe-S está asistido por una compleja maquinaria proteica de
ensamblado que utiliza el aminoácido cisteína como fuente de sulfuro y se combina con
el Fe, asociado a numerosas proteínas molde o scaffold, para formar los grupos Fe-S
(Lill and Muhlenhoff, 2008).
La maquinaria de ensamblado está representada en la naturaleza por tres
sistemas, estructural y funcionalmente relacionados: NIF, SUF e ISC (Balk and
Lobréaux, 2005). El sistema NIF fue el primero en ser descripto en la bacteria fijadora
de nitrógeno Azotobacter vinelandii, asociado con la biogénesis de la nitrogenasa, de
allí su nombre (NItrogen Fixation) (Zheng et al., 1993). La maquinaria SUF, llamada así
por su participación en la movilización de sulfuro, se encuentra en numerosas bacterias,
arqueas y en cloroplastos de plantas, pero está ausente en hongos y metazoos. Este
sistema se encuentra estrechamente relacionado al estrés oxidativo y al sensado de
hierro en la célula (Takahashi and Tokumoto, 2002; Loiseau et al., 2003). La
maquinaria ISC (Iron-Sulfur Cluster) representa el sistema más utilizado para la
biogénesis de los grupos Fe-S y maduración de ferrosulfoproteínas de las células vivas,
y ha sido descripto en cianobacterias, hongos, insectos, plantas y animales. En algunas
bacterias, incluida Escherichia coli, el sistema ISC y SUF están presentes en paralelo,
mientras que en otras especies existe solamente uno de estos sistemas. En eucariotas la
maquinaria ISC está localizada en las mitocondrias aunque en los últimos años se ha
postulado la existencia de un sistema paralelo en el citosol y en núcleo (Kispal et al.,
1999; Mühlenhoff and Lill, 2000). La localización del sistema ISC en la mitocondria
estaría asociada al ambiente reductor provisto por estas organelas (evidenciado por la
ausencia de puentes disulfuros en las proteínas), condiciones que favorecen el ensamblado
de los grupos Fe-S.
El mecanismo básico de biosíntesis de los grupos Fe-S requiere la presencia
de 3 ó 4 proteínas claves, aunque en algunos organismos se han descripto hasta 10 y 12
polipéptidos involucrados (Balk and Lobréaux, 2005). Dentro de las proteínas claves se
encuentra una cisteína desulfurasa y dos o tres proteínas scaffold, que actuarían como
molde o soporte para la síntesis de los grupos Fe-S. En la Figura 5 se muestra un
esquema de las etapas que serían comunes en los sistemas NIF, ISC y SUF.
16
Introducción
Figura 5: Representación esquemática de los pasos básicos en la biosíntesis de centros Fe-S. Tomado de
Balk y Lobreaux (2005)
1.4.1. Biogénesis de grupos Fe-S en plantas
Recientemente, se ha descripto en Arabidopsis thaliana la existencia de genes
homólogos a los que participan en la biogénesis de grupos Fe-S en otros organismos
como levaduras y mamíferos (Balk and Lobréaux, 2005). Se postuló que en plantas
existiría compartamentalización de las vías metabólicas que llevan a la síntesis de estos
grupos y que dicho proceso está adaptado a las necesidades específicas de las células de
organismos fotosintéticos. Los plástidos y las mitocondrias contienen vías genéticas y
bioquímicamente diferentes para el ensamblado de centros Fe-S, sin embargo, se han
encontrado numerosas proteínas homólogas en ambos compartimentos, sugiriendo que
mecanismos similares estarían conservados en los pasos básicos del proceso de
ensamblado (Balk and Lobréaux, 2005) (Figura 6, Tabla 2).
17
Introducción
Figura 6: Compartamentalización de la biogénesis de proteínas Fe-S en la célula vegetal. Las proteínas
cuya localización no ha sido confirmada experimentalmente se encuentran en gris. Por analogía con
levaduras, la mitocondria podría importar un componente (X) que sería requerido para la biogénesis de
proteínas Fe-S en el citosol y el núcleo (flechas discontinuas) (Balk and Lobréaux, 2005).
18
NFU, CNFU-V
NFU3, CNFU-IVa
NFU4, NFU-III
NFU5, NFU-I
NAP1, SUFB,ABC1
NAP7, SUFC
At5g49940
At4g25910
At3g20970
At1g51390
At4g04770
At3g10670
Plástido(E)
Plástido(E)
Mit(E)
Mit(E)
Plástido(E)
Plástido(E)
Plástido(E)
NFU, CNFU-IVb
At4g01940
Plástido
Mit(P)
ISCA, SUFA
At1g10500
Mit(E)
At5g03905
ISU3
At3g01020
Mit(E)
Citosol(P)
ISU2
At4g04080
Mit(E)
At2g36260
ISU1
At4g22220
Plástido(P)
Plástido(E)
Mit(E)
Localización
Mit(P)
SUFE
At4g26500
e
At2g16710
NFS2, CpNifS
At1g08490
Nombre de la proteína
NFS1
a
At5g65720
Locus Arabidopsis
b
Isa
Isa1
Isa1
Isa
Isu1,2
Isu1,2
Isu1,2
----
SufC
SufB
----
----
NP_312283 Nfu1
NP_312283 Nfu1
NP_312283 Nfu1
NP_312283 Nfu1
NP_312283 NFU1
Isc/SufA
Isc/SufA
Isc/SufA
Isc/SufA
IscU
IscU
IscU
SufE
SufS/CsdB ----
c, e
Homologos
E.coli
Levadura
IscS
Nfs1
d
Slr0075(Sy)
Slr0074 (Sy)
C-term, NifU (Av)
Ssl2667 (Sy)
Slr1417 (Sy)
N-term, NifU(Av)
Slr1419 (Sy)
Slr0077 (Sy)
SII0387,Slr0704 (Sy)
NifS(Av),
Otros
Tabla 2: Proteínas confirmadas y candidatas de ensamblado de proteínas Fe-S en Arabidopsis thaliana
ABC/ATPasa
ABC/ATPasa
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Co-enzima de SufS
Cys desulfurasa grupo II
Cys desulfurasa grupo I
Función Molecular
ADX1, MFDX2
ADX2, MFDX1
ADXR, MFDR
At4g21090
At4g05450
At4g32360
ATM1, STA2
ATM2
ATM3, STA1
ERV1
HCF101
HCF101-L2
HCF101-L1
APO1
At4g28630
At4g28620
At5g58270
At1g49880
At3g24430
At5g50960
At4g19540
At1g64810
Plástido(P)
At1g54500?
-----
----------
Nar1
------
Cfd1
Mrp
-----
-----
Nbp35
-----
Erv1
Atm1
Atm1
Atm1
Yfh1
Jac1
Ssq1
Arh1
Yah1
Yah1
----
Mrp
Mrp
Mrp
-----
-----
-----
-----
CyaY
HscB
HscA
Fdx
Fdx
SufD
RubA(Syc)
NifH (Av)
Slr0067 (Sy)
Frataxina (Hs)
Slr0076(Sy)
Rubredoxina
Tipo hidrogenasa
Desconocida
P-loop NTPasa
P-loop NTPasa
P-loop NTPasa
P-loop NTPasa
Sulfidril oxidasa
Transportador ABC
Transportador ABC
Transportador ABC
Chaperona Fe
Co-Chaperona
Chaperona (HSP70)
Reductasa
Ferrodoxina
Ferrodoxina
Proteína ABC
Proteínas componentes de la maquinaria de ensamblado de proteínas Fe-S en plantas, por evidencia experimental o por homología con proteínas de levaduras o
bacterias.
b
Localización subcelular está basada en resultados experimentales (E) o predichos por programas bioinformáticos (P) o alguna otra evidencia.
a
Citosol(P)
Plástido(E)
Mit(P)
Citosol (P)
Plástido (E)
Mit(E)
Mit(E)
Mit(P)
At4g16440
Rubredoxina
Mit(P)
FH
At4g03240
Mit(E)
Mit(P)
Mit(P)
Mit(E)
Mit(E)
Mit(E)
Plástido(E)
At5g06410
At5g09590
At4g37910 o
NAP6, SUFD
At1g32500
Todas las proteínas plastídicas excepto APO1 tienen homólogos in la cianobacteria Synechocystis , sugiriendo que la maquinaria de ensamblado de centros Fe-S es
heredada de sus ancestros comunes, de acuerdo con la teoría endosimbiótica. El homologo de las proteínas IscS y IscU en E.coli están localizadas en mitocondria
(Mit). Notar que la mitocondria no tiene homólogos de SUF, de acuerdo con su ausencia en el genoma de levaduras y mamíferos.
d
Homólogos seleccionados en otros organismos: Av, bacteria fijadora de nitrógeno Azotobacter vinelandii ; Sy, la cianobacteria Synechocystis sp. .PCC 6803; Syc la
cianobacteria Synechochoccus sp. PCC 7002; Hs, Homo sapiens; C-term., C-terminal; N-term., N-terminal.
e
Indica ausencia de homólogos; las celdas vacías en las columnas significan que los loci o las proteínas no han sido anotadas o nombradas por el momento
Tomada de Balk and Lobreaux (2005).
c
Introducción
Takahashi y colaboradores han demostrado la existencia del proceso de
ensamblado de centros Fe-S en el estroma del cloroplasto, dependiente de ATP y de
NADPH (Takahashi et al, 1991). Se han identificado además, en el genoma de
Arabidopsis dos genes que codifican para cisteínas desulfurasas: NFS1 y NFS2 (Kushnir
et al., 2001; Pilon-Smits et al., 2002). Recientemente se inició la caracterización parcial de
AtNfs1, AtNfs2 y AtSUFE, que codifican para las cisteínas desulfurasas mitocondrial y
plastídica, y para el activador de estas enzimas, respectivamente (Pilon-Smits et al., 2002b;
Xu and Møller, 2006).
Otro de los genes descriptos en el genoma de Arabidopsis a partir de análisis
bioinformáticos es el homólogo de Suf. Este gen codifica para una proteína de plástidos
y se ha descripto como activador de las cisteínas desulfurasas cloroplásticas (Balk and
Lobréaux, 2005; Ye et al., 2006). Por otra parte, también se han encontrado cinco genes
NFU, tres de los cuales codifican para proteínas localizadas en plástidos (Léon et al.,
2003).
Hasta el momento no existen estudios in vivo donde se haya demostrado el
ensamblado de proteínas Fe-S en mitocondrias de plantas, sin embargo, estas organelas
contienen varios componentes que son homólogos a la maquinaria ISC de bacterias y
levaduras. Por ejemplo, dos de las cinco proteínas NFU y la proteína “scaffold”
IscA/Isa de Arabidopsis se encuentran localizadas en mitocondria. Por otro lado, el
genoma de Arabidopsis contiene tres genes con alta similitud de secuencia con IscU/Isu
que codifican proteínas con localización mitocondrial (Léon et al., 2005).
Otra de las proteínas asociadas con la síntesis de grupos Fe-S es la proteína
frataxina. Mediante análisis bioinformáticos, Huynen y col. (2001) predijeron la
participación de frataxina en el ensamblaje de los grupo Fe-S a proteínas. Se postuló
también que esta proteína estaría relacionada con daño oxidativo y disfunción
mitocondrial (Koutnikova et al., 1997; Rotig et al., 1997). Recientemente en nuestro
laboratorio se ha aislado y caracterizado el gen AtFH que codifica para la frataxina de
Arabidopsis thaliana (Busi et al., 2004). La función y estructura de esta proteína en
mitocondrias de plantas será objeto de estudio en este trabajo de Tesis.
22
Introducción
Con lo mencionado hasta el momento, se postula que los componentes claves
de la maquinaria ISC mitocondrial, como fue identificada en levaduras, estarían
presentes también en la mitocondria de plantas, indicando que esta organela sería capaz
de ensamblar sus propias proteínas Fe-S.
A pesar de que las proteínas Fe-S son más abundantes en cloroplastos y
mitocondrias, un gran grupo de proteínas Fe-S desarrollan sus funciones en el citosol y
el núcleo. Cómo estas proteínas obtienen sus cofactores Fe-S es un punto de gran interés
e investigación en este momento. Ya hemos mencionado la presencia, en eucariotas no
fotosintéticos, de un sistema de ensamblado para proteínas Fe-S citosólicas (CIA),
posiblemente las plantas cuenten con un sistema similar (Balk and Lobréaux, 2005).
1.5. Producción de especies reactivas de oxígeno
Las especies reactivas del oxígeno (ROS) son un conjunto de moléculas
derivadas del metabolismo celular en el cual el oxígeno cumple un papel fundamental.
.-
Entre las ROS se encuentran: (i) el anión superóxido (O2 ) que es un potente oxidante;
(ii) el peróxido de hidrógeno (H2O2), que es el más estable de las ROS, pudiendo
difundir a través de la membrana y causar daño oxidativo a proteínas distantes a la zona
.
de producción (Moller, 2001a); y (iii) el radical hidroxilo ( OH) que es la especie más
reactiva. La alta reactividad de las ROS se debe a que poseen electrones desapareados
que les hace reaccionar con otras moléculas orgánicas en procesos redox.
El estrés oxidativo incluye una serie de procesos deletéreos que resultan del
desbalance entre la formación excesiva de ROS y/o de especies reactivas de nitrógeno
(RNS) y la limitada defensa antioxidante. Mientras que pequeñas fluctuaciones en los
niveles de concentración de ROS juegan un papel importante en la señalización
intracelular (Droge and 2002; Balaban et al., 2005), un aumento descontrolado de estos
oxidantes lleva a una liberación de especies reactivas provocando daño a proteínas
(Stadtman and Levine, 2000), lípidos (Rubbo et al., 1994), polisacáridos (Kaur and
23
Introducción
Halliwell, 1994;) y ADN (LeDoux et al., 1999; Richter et al., 1988). Esta producción de
ROS provoca daño mitocondrial, ocasionando un amplio rango de patologías que
pueden llevar a apoptosis (Figura 7).
Figura 7: Esquema de la producción de ROS mitocondrial (Murphy M., 2009). La producción de ROS por
la mitocondria puede causar daño a proteínas mitocondriales, membrana y DNA, imposibilitando a la
mitocondria a sintetizar ATP y otra gran cantidad de funciones metabólicas que se llevan a cabo en ella.
El daño oxidativo en la mitocondria puede aumentar la tendencia de la mitocondria a liberar proteínas del
espacio intermembrana como con la citocromo c (cyt c), al citosol, permeabilizando la membrana externa
y de esta manera activar la maquinaria apoptótica de la célula. Además, la producción de ROS en la
mitocondria produce la inducción de poros de permeabilidad transitoria (PTP), produciendo daño en la
permeabilidad de la membrana. Por otro lado, la producción de ROS puede mediar la señalización redox,
afectando reversiblemente las funciones de mitocondria, citosol y núcleo. Mitochondrion: mitocondria.
Intermembrane space: espacio intermembrana. Outer membrane: membrana externa. Inner membrane:
membrana interna. Respiratory chain: cadena respiratoria. Lipid peroxidation: peroxidación lipídica.
Oxidative damage: daño oxidativo. Defective proteins: proteínas defectuosas. Mutations and deletions:
mutaciones y deleciones.
En 1966, se dio a conocer el primer trabajo en donde se involucraba a la
cadena de transporte de electrones como productora de ROS (Jensen, 1966). Otros
estudios demostraron que mitocondrias aisladas tenían la capacidad de producir H2O2
(Loschen et al., 1971; Chance et al., 1979; Jensen, 1966). Sin embargo, las mitocondrias
no son el único sitio de producción de ROS en las células, se informó que también
existe producción de ROS en cloroplastos, peroxisomas, retículo endoplásmico, núcleo
y citosol (Moller, 2001a; del Río et al., 2003 ;Andreyev et al., 2005).
24
Introducción
Dentro de las mitocondrias, los complejos CI y CIII de la cadena de
transporte de electrones son dos de los principales sitios de producción de ROS. Se
describió también, que la inhibición del CI por rotenona o del CIII por antimicina A
lleva a un aumento en los niveles de ROS (Sugioka et al., 1988; Chen et al., 2003 ). Sin
embargo, se ha descripto en células de mamíferos, que en algunas condiciones
patológicas existiría una disminución de ROS en CI luego del tratamiento con rotenona
(Becker et al., 1999).
Existen diversos mecanismos para disminuír los niveles de ROS en las
células. Las superóxido dismutasas (SODs), constituyen la primera línea de defensa
contra las ROS, catalizando la dismutación del radical superóxido a peróxido de
hidrógeno y oxígeno (Fridovich, 1995; del Río et al., 2003 ). De acuerdo al metal que
utiliza la enzima como cofactor, las SODs se clasifican en tres grupos: Fe-SOD, la cual
está localizada en los cloroplastos, Mn-SOD, localizada en mitocondrias y peroxisomas,
y la Cu-Zn-SOD, localizada en el cloroplasto, citosol y espacio extracelular (Fridovich,
1986 ; Bannister et al., 1991; Kanematsu and Asada, 1991; Smith and Doolittle, 1992).
El peróxido de hidrógeno producido se descompone a agua y oxígeno por acción de una
enzima que contiene hemo, la catalasa (Kwon and Sun An, 2007). La catalasa, está
localizada mayoritariamente en los peroxisomas, aunque se ha reportado la existencia de
isoformas mitocondriales y apoplásticas (Scandalios et al., 1980).
El peróxido de hidrógeno se remueve además por otros mecanismos en la
mitocondria de plantas. Uno de estos mecanismos, es el ciclo glutatión – ascorbato el
cual está compuesto por la ascorbato peroxidasa, la dehidroascorbato reductasa y la
glutatión reductasa (Jimenez et al., 1997 ; Chew et al., 2003). La ascorbato peroxidasa
reduce el peróxido de hidrógeno a agua usando ascorbato, que es reducido por una
secuencia de reacciones a cargo de la monohidroascorbato reductasa y la
dehidroascorbato reductasa que utilizan glutatión reducido. Por último la glutatión
reductasa regenera el glutatión reducido (GSH) a su forma oxidada (GSSG) para
continuar el ciclo.
25
Introducción
Otras proteínas que intervienen en la respuesta a daño oxidativo son las
peroxiredoxinas. Las peroxiredoxinas mitocondriales regulan los eventos de traducción
de señales mediados por peróxido a la vez que lo reducen, pudiendo también detoxificar
alquilhidroperóxidos y peroxinitrito (Dietz et al., 2006; Finkemeier et al., 2005). Debido
a esta actividad, estas proteínas modularían la oxidación lipídica y la señalización
relacionada con NO (Baier and Dietz, 2005; Rhee et al., 2005). Las peroxiredoxinas
utilizan tioredoxina o glutatión como fuente de poder reductor. Además, en estas
reacciones también intervienen las enzimas tioredoxina reductasa o la glutatión
reductasa y el NADPH mitocondrial (Gelhaye et al., 2004; Sweetlove and Foyer, 2004).
Se informó también que la actividad de la AOX cumple un papel importante en la
reducción de los niveles de ROS en las células vegetales (Maxwell et al., 1999).
Por otro lado, además de los procesos enzimáticos que hemos descripto, las
plantas poseen otros mecanismos para contrarrestar los efectos del estrés sobre las
proteínas como la sobreexpresión de chaperonas y otras proteínas estabilizadoras, como
así también la acumulación de moléculas orgánicas de bajo peso molecular conocidas
como osmolitos o solutos compatibles (Chen and Murata, 2002; Wang et al., 2004).
Estos mecanismos influyen sobre el aumento de la estabilidad y la prevención de la
agregación de las proteínas y la degradación irreversible de la molécula dañada.
1.6. Hierro y daño oxidativo.
Una porción significativa del hierro intracelular en las células de mamíferos
es dirigido a la mitocondria, dependiendo de los requerimientos metabólicos celulares
(Schueck et al., 2001). La captación citosólica de hierro ocurre cuando el transportador
extracelular transferrina se une al receptor de alta afinidad de superficie y es endocitado
(Napier et al., 2005). El receptor de transferrina (TfR) es expresado ubicuamente en
todas las células (Klausner et al., 1993.). Una vez que el complejo transferrina-TfR es
internalizado en los endosomas, el hierro es liberado en el citosol y reducido del estado
Fe3+ a Fe2+ soluble utilizando el transportador de metales divalentes (DMT-1) (Garrick
et al., 2003). Este transportador está ampliamente expresado como una proteína integral
26
Introducción
de membrana que transporta cationes de metales divalentes, incluido el Fe+2 (Gunshin
et al., 1997; Fleming et al., 1998). Los mecanismos específicos que determinan y
facilitan la captación de hierro por la mitocondria siguen sin definirse (Carraway et al.,
2006).
Para mantener la homeostasis celular del hierro, la expresión de
transportadores citosólicos y de proteínas de almacenamiento (ferritina, DMT-1 y TfR)
es rápidamente regulada por cambios en los niveles de hierro celular. El control posttranscripcional de la estabilidad del ARNm y su traducción ocurre a través de la
interacción entre proteínas regulatorias de hierro (IRP) y elementos regulatorios de
hierro (IRE) ubicados en regiones no transcriptas del ARNm. Cuando los niveles de
hierro aumentan, estas interacciones causan un rápido descenso en la expresión de TfR
y un aumento de la ferritina (Klausner et al., 1993.; Gunshin et al., 1997; Fleming et al.,
1998; Carraway et al., 2006).
El hierro es un nutriente esencial para las plantas. Su función es donar y
aceptar electrones, hecho fundamental en la cadena de transporte de electrones de la
respiración y fotosíntesis. Sin embargo, es tóxico cuando se acumula a altos niveles:
puede actuar vía la reacción de Fenton generando radicales hidroxilo que dañan lípidos,
proteínas y ácidos nucleicos (Figura 8). Las plantas deben entonces ser capaces de
responder ante dos situaciones, la sobrecarga y la deficiencia de hierro (Connolly and
Guerinot, 2002,).
27
Introducción
Figura 8: Vía metabólica de formación de especies reactivas de oxígeno en plantas. La figura muestra la
participación de otras enzimas importantes en esta vía metabólica: APX, ascorbato peroxidasa; GSH
glutatión peroxidasa; SDO, superóxido dismutasa. (Tomado de Mori y colaboradosres (Mori and
Schroeder, 2004)).
Debido a la potencial toxicidad asociada a los altos niveles de hierro, las
células lo almacenan en la proteína especializada ferritina. Las múltiples subunidades
(más de 24) que componen la ferritina forman una estructura hueca que puede albergar
más de 4.500 átomos de hierro en su interior. Así, la ferritina juega un papel importante
en la homeostasis de hierro. Los estudios de las ferritinas de plantas han revelado
diferencias importantes en su estructura, localización y regulación respecto a las de
animales. Mientras que éstas últimas son encontradas en el citosol, las de plantas
contienen péptidos tránsito que las dirigen a organelas (Proudhon et al., 1996). Además,
mientras que la expresión regulada por hierro de la ferritina animal es controlada
principalmente a nivel de traducción mediante el sistema IRE-IRP, los experimentos
realizados en maíz y soja demostraron que la expresión está regulada tanto a nivel
transcripcional (Lescure et al., 1991; Lobréaux et al., 1992; Wei and Theil, 2000; Petit
et al., 2001) como post transcripcional (Fobis-Loisy et al., 1996). Un detalle
significativo es que no se han encontrado regiones regulatorias IRE en las ferritinas de
plantas (Briat et al., 1999).
La mayor cantidad de hierro requerida en una célula eucariota es consumido
en su gran mayoría por la vía de síntesis del grupo hemo y la biosíntesis de centros FeS. Estos dos procesos son llevados a cabo por la mitocondria y necesitan del transporte
28
Introducción
activo del hierro reducido a través de la membrana interna mitocondrial (Lange et al.,
1999). Hace varias décadas se ha postulado la presencia de proteínas capaces de captar
hierro en la mitocondria (Flatmark and Romslo, 1975) y estudios recientes han
identificado proteínas de la membrana mitocondrial interna que estarían involucradas en
transporte activo de hierro mitocondrial (Kispal et al., 1997 ; Foury and Roganti, 2002;
Park et al., 2002).
Como se comentó más arriba, altas concentraciones de Fe pueden favorecer la
producción de radicales ·OH, un potente oxidante que causa daño de moléculas
incluyendo al ADN y proteínas. Por el contrario, la deficiencia de Fe interrumpe el
normal ensamblado de ferro- y hemoproteínas de la cadena respiratoria mitocondrial
(Attama et al, 2001; Lin et al, 2001; Nihei et al, 2001) hecho que conduce también a un
desbalance de especies del oxígeno. Una deficiencia en el proceso de síntesis de grupos
Fe-S puede provocar la acumulación de Fe3+ y S2-, tóxicos metabólicos que generan
daño celular. La mitocondria contiene concentraciones micromolares de Fe
biodisponible y uno de los mayores retos biológicos en la célula es mantener este hierro
en forma soluble (Fe+2) y no tóxica dado al pH alcalino y la alta producción de anión
superóxido y peróxido de hidrogeno que posee la mitocondria (Tangerås, 1985; Mori
and Schroeder, 2004). Es esencial, entonces, que exista una fina regulación de la
formación y el correcto ensamblado del hierro a las ferrosulfo- y hemoproteínas para
que no se acumule hierro a niveles tóxicos.
Se ha descripto que en levaduras y animales la proteína frataxina es esencial
para la homeostasis celular de hierro y la supervivencia ante el daño oxidativo mientras
que en plantas, este fenómeno no había sido abordado hasta el momento. A principios
de 2009, se presentaron resultados que vinculan los niveles de hierro intracelulares y el
aumento de óxido nítrico (NO) con la deficiencia de frataxina y estrés oxidativo (Martin
et al., 2009).
29
Introducción
1.7. Frataxina: estructura y función
El primer hallazgo de la existencia de frataxina, surgió a partir de los
conocimientos de una enfermedad humana denominada Ataxia de Friedreich (FRDA).
Ésta es una enfermedad cardio-neurodegenerativa con baja sobrevida, causada por la
deficiencia de frataxina, una proteína codificada a nivel nuclear y de localización
mitocondrial. La proteína proveniente de humanos contiene 169 aminoácidos y está
codificada por un gen de 507 pb ubicado en el cromosoma 9 (Campuzano et al., 1996;
Schapira, 1998; Becker et al., 2001).
La deficiencia en la expresión del gen de frataxina es consecuencia de la
presencia de una expansión del triplete GAA en el primer intrón (Campuzano et al.,
1996). Esta expansión intrónica provoca una conformación inusual en la
heterocromatina dando una estructura ȕ –ADN (triple hélice) poco común, que
determina el silenciamiento y la subsecuente reducción de la expresión de frataxina
(Sakamoto et al., 1999). La mayoría de los pacientes son homocigotas para la expansión
GAA, aunque se han encontrado también algunos heterocigotas con una mutación
puntual en uno de los alelos y una expansión del triplete GAA en el otro alelo del gen
(Cossée et al., 1999).
Esta enfermedad es progresiva y en los tejidos especializados de alta demanda
energética, (neuronas de los ganglios de la raíz dorsal, células de músculo cardíaco y
células ȕ del páncreas) se observa una disfunción mitocondrial y muerte celular (Puccio
et al., 2001). La ataxia progresiva de los miembros, la hipertrofia cardíaca y la diabetes
mellitus encontrada en estos pacientes se atribuyen a los bajos niveles de ATP
producidos en estos tejidos (Lodi et al., 1999). Cuanto mayor sea la expansión del
triplete GAA, se produce mayor deficiencia en la expresión de frataxina determinando
mayor gravedad de la enfermedad (Campuzano et al., 1997).
La frataxina es una proteína que ha sido ampliamente conservada a través de
la evolución en bacterias, levaduras, mamíferos y plantas sin presentar mayores cambios
estructurales. Esta conservación secuencial, y la presencia de un único y novedoso
30
Introducción
plegamiento proteico (llamado dominio frataxina), sugiere que puede cumplir un papel
similar en todos estos organismos (Dhe-Paganon et al., 2000; Musco et al., 2000). El
dominio frataxina parece ser característico de esta proteína (y los homólogos
relacionados) y no se han encontrado hasta la fecha otras proteínas en banco de datos
con este dominio particular (Cho et al., 2000; Musco et al., 2000). La Figura 9 muestra
la conservación de los elementos correspondientes a la estructura secundaria de
frataxinas de diferentes organismos. No existen deleciones o inserciones significativas
entre las regiones de Į hélice predichas y las láminas ȕ.
31
Figura 9: Alineamiento de la secuencia de la frataxina humana con homólogos procariotas y eucariotas. En verde agua se muestran los segmentos responsables de la
estructura secundaria Į hélice, y en verde brillante los correspondientes a láminas ȕ. Los alineamientos fueron realizados por el programa Multalin. Los residuos iguales se
encuentran en rojo. Los residuos altamente conservados en azul. Los residuos en mayúsculas en las secuencias consenso ocurren con una frecuencia de un 83%, los
residuos en minúsculas ocurren entre un 67% y 83% de frecuencia (Dhe-Paganon et al., 2000).
Introducción
El dominio frataxina de la proteína de humanos (residuos 88-210, sin la
secuencia N-terminal de importe a mitocondria) presenta una conformación de Įȕsandwich (Figura 10A). Doce residuos acídicos de la hélice Į1 y de la hoja ȕ1 forman
una larga y continua zona de alta densidad de carga negativa en la superficie de la
proteína creando un dipolo (Figura 10B) (Dhe-Paganon et al., 2000). Debido al tamaño
y naturaleza de este dipolo, se postula una potencial interacción de esta proteína con
otros ligandos u otras proteínas. Tanto la estructura global como su superficie aniónica,
se encuentra conservada en todos los organismos estudiados (Gibson et al., 1996;
Cañizares et al., 2000). Nueve de los 12 residuos con carga negativa, descriptos para la
frataxina humana, están conservados en AtFH (homologo de frataxina en Arabidopsis
thaliana). La presencia de esta superficie con carga negativa, más la conservación de
residuos aminoacídicos, sugieren dos cosas: (i) frataxina podría interaccionar con otras
proteínas para ejercer su función biológica y (ii) los aminoácidos cargados
negativamente podrían ser claves en determinar esta función.
Figura 10 A: Estructura de la frataxina. El diagrama muestra el plegamiento de la frataxina, una estructura
compacta Įȕ-sandwich. Las Į-hélices están mostradas verde agua y láminas ȕ en verde brillante. Las
láminas desde ȕ1 a ȕ5, forman un piso de láminas ȕ antiparalelo, que interacciona con las dos Į hélices.
Las dos hélices están cercanamente en paralelo entre ellas y con el plano de la larga lámina ȕ formada. Se
forma una pequeña lámina ȕ en el extremo C-terminal de ȕ5 y las láminas ȕ6 y ȕ7 (Dhe-Paganon et al.,
2000).
33
Introducción
Figura 10 B: Representación de la superficie molecular de frataxina. La superficie molecular fue
calculada y sombreada de acuerdo con los potenciales electrostáticos (-10 kt/e, rojo y +10 kt/e, azul) con
el programa GRASP (Nicholls et al., 1991). Los residuos individuales en la superficie acídica están
marcados (Dhe-Paganon et al., 2000).
Se han propuesto diversas funciones en las cuales frataxina podría intervenir,
incluyendo homeostasis del hierro y respiración (Babcock et al., 1997), metabolismo del
hemo (Lesuisse et al., 2003), ensamblado de centros Fe-S (Chen et al., 2002),
fosforilación oxidativa y estrés oxidativo (Ristow et al., 2000) y acumulación de Fe en
mitocondria bajo una forma hidrosoluble y no tóxica (Babcock et al., 1997; Isaya et al.,
2004). Sin embargo, hasta el momento no está clara su función precisa.
En eucariotas, frataxina es necesaria para el normal funcionamiento de la
mitocondria (Wilson and Roof, 1997; Koutnikova et al., 1998). Levaduras deficientes
en la expresión del homólogo de frataxina, YFH, presentaron una disminución en la
respiración (Wilson and Roof, 1997), pérdida de DNA mitocondrial (Koutnikova et al.,
1997) y acumulación de hierro en la mitocondria (Babcock et al., 1997). En extractos de
mitocondrias de levaduras que carecen de frataxina, la formación de proteínas Fe-S está
severamente reducida, sugiriendo su participación en la biogénesis de proteínas Fe-S
(Huynen et al., 2001; Muhlenhoff et al., 2002). Se ha descripto recientemente que la
frataxina actuaría como una chaperona de hierro y modularía la actividad de proteínas
mitocondriales como por ejemplo, la aconitasa (Bulteau et al., 2004). Zhang y col
(2005) han sugerido que frataxina jugaría un papel importante en la protección del Fe
34
Introducción
biodisponible dentro de la mitocondria, facilitando su utilización no sólo en el
ensamblaje de Fe-S proteínas, sino también para síntesis del grupo hemo.
Otros trabajos sugieren que frataxina estaría involucrada en la conversión
energética mitocondrial y la fosforilación oxidativa. Se informó que la sobreexpresión
de frataxina en células de mamíferos causa una inducción del flujo del ciclo de Krebs
con un incremento en la actividad respiratoria, aumento del potencial de membrana
mitocondrial y elevado contenido de ATP celular (Ristow et al., 2000).
La mayoría de los trabajos realizados sobre frataxina fueron llevados a cabo
en bacterias, levaduras y mamíferos, no habiendo ninguna descripción de esta proteína
en plantas. Como mencionamos más arriba, se aisló recientemente en nuestro
laboratorio el gen de frataxina de Arabidopsis thaliana (AtFH, At4g03240). AtFH se
encuentra codificado en el cromosoma 4, y está compuesto por cinco exones y cuatro
intrones, dando un ARNm de 564 pb que codifica una proteína de 187 aminoácidos y de
masa molecular 14kDa. El análisis con el programa PSORT o MITOPROT II sobre la
secuencia aminoacídica de AtFH, permitió identificar un posible péptido tránsito para la
localización mitocondrial, compuesto por los primeros 31 aminoácidos (Busi et al.,
2004). Este resultado coincide con los resultados obtenidos con el homólogo de
frataxina de levaduras, ya que estudios de localización celular mostraron que YFH se
encuentra en mitocondrias (Cavadini et al., 2000). Además se describió que YFH es
procesado por proteasas para dar luego la forma madura y funcional de la proteína
(Branda et al., 1999). Es importante destacar que el homólogo de frataxina de humanos
es doblemente procesado, dando lugar también a la forma madura de la proteína con
posible localización en el espacio intermembrana mitocondrial (Cavadini et al., 2000).
Se llevaron a cabo también ensayos de complementación con AtFH de células
de Saccharomyces cerevisiae mutantes nulas para la expresión de frataxina (ǻyfh). La
cepa mutante nula muestra baja tasa respiratoria y alta sensibilidad a agentes oxidantes.
Los resultados de complementación mostraron que AtFH restauró la tasa respiratoria y
provocó una disminución a la sensibilidad a agentes oxidantes en levadura
complementada (Busi et al., 2004). Estos datos permiten postular que AtFH sería una
35
Introducción
proteína funcional y que podría estar involucrada en la respiración mitocondrial y en
respuesta a estrés oxidativo. Por lo tanto, aunque se han sugerido diversas funciones
para frataxina, su función precisa queda aún por dilucidarse. Hasta el momento no
existían reportes sobre la presencia o función de esta proteína en organismos vegetales.
1.8. Biogénesis de hemoproteínas
Como describimos más arriba, la función de la mitocondria, depende de un
continuo suministro de hierro para la formación de centros Fe-S (ISC) y para la vía de
biosíntesis del hemo (O'Neill et al., 2005). Estos dos procesos son llevados a cabo
dentro de la organela (Muhlenhoff et al., 2002; Lange et al., 2004).
Los tetrapirroles son compuestos que juegan un papel vital en varios procesos
celulares, incluídos la
fotosíntesis y respiración. Las plantas superiores contienen
cuatro clases de tetrapirroles: clorofilas, hemo, sirohemo y fitocromobilinas. Se ha
descripto que todos los tetrapirroles derivan de una vía fotosintética común (Tanaka and
Tanaka, 2007) (Figura 11).
La vía de biosíntesis de tetrapirroles presenta numerosas ramificaciones. Las
etapas que van desde glutamato a uroporfirinógeno III son comunes para la síntesis en
plantas superiores de los cuatro tetrapirroles antes mencionados. Los tres pasos
siguientes, hasta la producción de protoporfirina IX son comunes para la biosíntesis de
clorofila, hemo y fitocromobilina. Finalmente, las últimas etapas son únicas para cada
uno de los tetrapirroles descriptos (Tanaka and Tanaka, 2007).
36
Introducción
37
Introducción
Figura 11: Biosíntesis de tetrapilloles. Los números indican las enzimas que catalizan cada reacción. 1:
glutamil t-RNA sintetasa, 2: glutamil t-RNA reductasa, 3: glutamato 1- semialdehído aminotransferasa, 4:
ALA dehidratasa o porfobilinógeno sintasa, 5: porfobilinógeno deaminasa, 6: uroporfirinógeno III
sintasa, 7: uroporfirinógeno III decarboxilasa, 8: coproporfirinógeno III oxidasa (CPOX), 9:
protoporfirinógeno IX oxidasa (PPOX), 10: magnesio quelatasa, 11: magnesio protoporfirina IX
metiltransferasa, 12: magnesio protoporfirina IX monometilester ciclasa, 13: protoclorofilina
oxidoreductasa, 14: divinilclorfilina reductasa, 15: clorofila sintasa, 16: clorofilina a oxigenasa,
17:clorofilasa, 18 y 19: clorofila b reductasa, 20: metiltransferasa, 21: oxidasa no identificada hasta el
momento, 22: sirohidroclorin ferroquelatasa, 23: ferroquelatasa (FeCh), 24: hemo oxigenasa, 25:
fitocromobilin sintasa.
La mayor parte de la síntesis de tetrapirroles en plantas ocurre en los
cloroplastos. Esta localización no es sorprendente para la rama de bifurcación de la
biosíntesis de sirohemo y clorofilas, ya que los productos finales de esta rama funcionan
exclusivamente en plástidos. A su vez, todos los pasos metabólicos identificados para la
síntesis de fitocromobilina, también están localizados en el cloroplasto a pesar que la
unión del cromóforo a la apoproteína ocurre en el citosol (Kohchi et al., 2001; Terry et
al., 2002).
La síntesis del grupo hemo es bastante más compleja, y su localización exacta
es todavía incierta, particularmente en organismos vegetales. Se ha sugerido que las
últimas tres enzimas de la vía de biosíntesis de hemo, CPOX (coproporfirinógeno
oxidasa III), PPOX (protoporfirinógeno oxidasa IX) y FeCh (ferroquelatasa) se
localizan tanto en cloroplastos como en mitocondrias, pero hasta el momento no existe
un consenso al respecto (Tanaka and Tanaka, 2007). Recientemente, Williams y col.
han reportado la presencia de dos isoformas de CPOX en maíz, una de localización
cloroplástica y la otra mitocondrial (Williams et al., 2006). Por otro lado, Santana y col.
describieron que uno de los dos genes homólogos de CPOX de Arabidopsis thaliana
(At4g03205) contiene una deleción que causa un cambio en el marco abierto de lectura
del gen, concluyendo que se trata de un pseudogen (Santana et al., 2002); mientras que
la otra isoforma de CPOX (At1g03475) se localiza exclusivamente en el cloroplasto.
Estos datos son consistentes con las observaciones realizadas por Smith y col. que
muestran que la actividad de CPOX está localizada en cloroplastos de hojas etioladas de
arvejas y no en mitocondrias (Smith et al., 1993). En contraste, la actividad de PPOX,
fue detectada tanto en cloroplastos como en mitocondrias de arvejas y cebada (Jacobs
38
Introducción
and Jacobs, 1987; Smith et al., 1993). De acuerdo con estos resultados, la presencia de
al menos dos isoformas de PPOX ha sido informada en A. thaliana y tabaco (Narita et
al., 1996; Li et al., 2003).
A diferencia de lo que ocurre con PPOX, existen algunas controversias sobre
la exacta localización de las isoformas de FeCh en mitocondrias de plantas. Cornah y
col. han reportado que la mayor actividad de la ferroquelatasa en arvejas, ha sido
asociada a cloroplastos (Cornah et al., 2002). Masuda y col., han encontrado que dos
isoformas FeCh de pepino, fusionadas a GFP, se dirigían al cloroplasto y no a
mitocondria (Masuda et al., 2003). Lister y col. describieron que dos isoformas de la
ferroquelatasa de A. thaliana son importadas hacia el cloroplasto in vitro (Lister et al.,
2004). Otros trabajos realizados por van Lis y col., informaron sobre la existencia de un
único gen de FeCh en C. reinhardtii con localización cloroplástica, sugiriendo que en
este organismo el hemo se produciría únicamente en el cloroplasto y se exportaría al
citosol y a la mitocondria (van Lis et al., 2005).
La información detallada en el párrafo anterior indicaría que la FeCh se
localizaría únicamente en el cloroplasto, pero que una fracción de FeCh o una proteína
no identificada aún, presentaría una actividad mínima en mitocondria. Por otro lado, si
la proteína ferroquelatasa no existiera en mitocondria, no debería haber una necesidad
biológica para que exista PPOX en esta organela (Tanaka and Tanaka, 2007).
El grupo hemo es una de las moléculas más importantes en las células de
plantas superiores. Aunque es menos abundante que las clorofilas, el hemo posee
funciones muchos más diversas. Constituye el grupo prostético de citocromos
fotosintéticos y respiratorios involucrados en traducción de energía; de oxidasas como
la catalasa, peroxidasa y NADPH oxidasa; de hemoglobinas incluídas leghemoglobinas,
involucradas en homeostasis del oxígeno; así como también se lo encuentra en los
citocromos P450 interviniendo en la biosíntesis de varios metabolitos secundarios (Pal
Singh et al., 2002). Por otro lado el hemo está implicado en el fino control de la síntesis
de los tetrapirroles, a través de la inhibición de la enzima glutamil-tRNA reductasa,
39
Introducción
involucrada en la producción de la primer molécula de la vía, ácido 5- aminolevulínico
(Terry and Kendrick, 1999).
Hemos discutido que la última enzima de la vía de biosíntesis del hemo es la
ferroquelatasa, que cataliza la incorporación de Fe en estado ferroso dentro del anillo
porfirínico, y es el último intermediario común entre la vía del hemo y de clorofilas. Es
por esto, que FeCh sería importante en la regulación de esta bifurcación metabólica
entre las dos vías, y tendría un papel relevante en la coordinación de la producción de
hemo y aproproteínas (Lange et al., 2004).
Diferentes trabajos asociaron a la proteína mitocondrial frataxina en el
ensamblado de centros Fe-S (Rotig et al., 1997; Huynen et al., 2001; Duby et al., 2002;
Puccio and Kœnig, 2002). Sin embargo, hasta el momento no está clara la participación
de frataxina en la biosíntesis de hemo. El nexo entre el metabolismo de Fe y la proteína
frataxina se estableció originalmente por la caracterización de unas cepas de levaduras a
las cuales se les había delecionado el homologo de frataxina (YFH1) (Babcock et al.,
1997). En estas levaduras mutantes se acumulaba Fe dentro de las mitocondrias
formando un precipitado tóxico inorgánico (Lesuisse et al., 2003); al mismo tiempo,
proteínas que contenían Fe, incluyendo las Fe-S proteínas y hemoproteínas decrecían o
eran inactivas.
Se informó que levaduras deficientes en frataxina contienen bajos niveles de
citocromos. Además, los niveles de ferroquelatasa (Hem15) también están reducidos,
posiblemente por una represión transcripcional, pero sin alterar los niveles de hemo
celulares (Lesuisse et al., 2003). En células de mamíferos, se describió que la
deficiencia de frataxina lleva a la regulación en menos de algunos transcriptos que
codifican enzimas de la vía de síntesis del hemo (Schoenfeld et al., 2005).
Recientemente, Zhang y col reportaron que levaduras mutantes en frataxina mostraban
defectos en la síntesis de hemo (Zhang et al., 2005). A partir de los resultados
mencionados se postuló que frataxina jugaría un papel importante en la protección del
Fe biodisponible dentro de la mitocondria, facilitando su utilización no sólo en el
ensamblaje de Fe-S proteínas, sino también para síntesis del grupo hemo.
40
Hipótesis y Objetivos
Hipótesis y Objetivos
Hipótesis de trabajo:
En los últimos años se intensificó el estudio del ensamblaje de los centros FeS y su inserción en polipéptidos para producir proteínas funcionales. Sin embargo,
existe muy poca información sobre la ocurrencia de estas vías en organismos
vegetales, siendo los organismos más estudiados las levaduras, bacterias y
mamíferos. Investigaciones recientes sugieren que en plantas, tanto la mitocondria
como los plástidos tendrían su propia maquinaria para la producción de
ferrosulfoproteínas.
La proteína mitocondrial, AtFH de Arabidopsis thaliana estaría involucrada
en múltiples funciones tales como conversión energética y fosforilación oxidativa,
participaría en ensamblaje de clusters Fe-S a proteínas, biosíntesis de hemoproteínas
y en el metabolismo del hierro.
Objetivo:
El objetivo general de este trabajo es identificar y caracterizar proteínas y
ligandos que participan en la biogénesis de proteínas Fe-S y hemoproteínas
mitocondriales. El estudio está enfocado a las proteínas que regularían el ensamblaje
de los complejos respiratorios de la membrana interna de la mitocondria (debido a
que muchos de ellos contienen ferrosulfoproteínas y hemoproteínas) que están poco
caracterizadas, especialmente en plantas.
Objetivos específicos:
1-
Determinar el papel fisiológico de AtFH a través de pruebas de pérdida y
ganancia de función: Caracterizar plantas deficientes en AtFH (mutantes
insercionales por T-DNA y plantas transgénicas que expresan el gen de AtFH en
orientación antisentido, as-AtFH) y plantas que sobreexpresen AtFH (s-AtFH).
42
Hipótesis y Objetivos
2- Clonar, expresar y purificar AtFH recombinante y determinar su función
bioquímica in vitro.
3- Analizar el efecto de la deficiencia de AtFH sobre la respuesta transcripcional
nuclear, especialmente de genes que codifican proteínas relacionadas con la
biogénesis de mitocondrias. Determinar su papel en la biogénesis de proteínas que
contienen grupos Fe-S, particularmente las de localización mitocondrial.
4- Evaluar la participación de AtFH en la respuesta a estrés oxidativo en plantas.
5- Estudiar la participación de AtFH en la síntesis del grupo hemo y su participación
en la biogénesis de hemoproteínas
43
Materiales y Métodos
Materiales y Métodos
3. Materiales y Métodos
3.1. Material vegetal y condiciones de crecimiento
Plantas de A. thaliana var. Columbia-0 (Col-0) fueron utilizadas como línea tipo
salvaje (wild type, wt). Las tres líneas mutantes, atfh-1 (SALK_021263), atfh-2 (SALK_
094203) y atfh-3 (SALK_122008) fueron obtenidas de la T-DNA Express Collection en el
Salk Institute (http://signal.salk.edu/cgibin/tdnaexpress). Las mismas contienen una
inserción de T-DNA dentro de la secuencia del gen AtFH. En la línea atfh-1, el T-DNA se
encuentra en la región no traducida (5´UTR), por delante del codón ATG de iniciación de
la traducción. Las otras dos líneas atfh-2 y atfh-3 contienen la inserción de T-DNA en el
primer intrón y el cuarto exón respectivamente.
Las semillas de cada una de las líneas fueron germinadas directamente en tierra
y mantenidas a 4°C al menos por 72 h. Las plantas fueron crecidas en condiciones de
invernadero a 25°C bajo luz fluorescente (Grolux, Sylvania y Cool White, Philips) con
una intensidad de 150 ȝmol m-2 s-1 utilizando un fotoperíodo de 16 h. luz/8 h. oscuridad.
3.2. Cepas bacterianas
En este trabajo se utilizaron diferentes cepas de Escherichia coli y
Agrobacterium tumefaciens:
1) E. coli XL1-Blue: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’proAB lacIZ
ǻM15 Tn10 (Tet r)].
2) E. coli BL21 CodonPlus-RIL: F- ompT hsdSB (r B- m-B) dcm+ Tetr Gal endA Hte [argU
ileY leuW Camr.
3) A. tumefaciens: cepa GV3101; plásmido Ti: pTiC58; chromo C58; opines:Nopalina.
45
Materiales y Métodos
3.3. Vectores plasmídicos
Los vectores utilizados en este trabajo y sus características se detallan en la Tabla M 1.
Tabla M 1. Características de vectores utilizados
pET24a
Novagen
Expresión de proteínas
nºcatálogo: 69749-3
pDH51
(Pietrzak y col., 1986)
Casete
promotor
terminador
CaMV35S , ampR.
y
Cedido por el lab.
Dr. Carrillo, UNR,
Argentina
pCAMBIA 1302
CAMBIA
Expresión de proteínas en
plantas, hyg R (plantas),
KanR (bacteria)
Cedido por el lab.
del Dr. Araya,
REGER, CNRS,
Francia
3.4. Medios de cultivo, antibióticos y otros reactivos
3.4.1. Medios de cultivo bacteriano
Medio LB (Luria Bertani) líquido: Tripteína 10 g; Extracto de levadura 5 g; NaCl
10 g; agua c.s.p. 1 litro.
Medio LB agar: Idem medio LB líquido con el agregado de 15 g/l de agar.
Medio MS (Murashige y Skoog): (Murashige y Skoog, 1962). Nº catálogo: M0404
(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).
Medio MS cultivo de células: Murashige y Skoog shoot multiplication médium A
(MSMA) (Murashige y Skoog, 1962). Nº catalogo: M7024 (Sigma-Aldrich, St. Louis,
USA).
3.4.2. Medios líquidos y soluciones buffer
10 X TBE buffer: TRIZMA base 108 g; ácido bórico (H3BO3) 55 g; 0.5 M EDTA, pH 8
40 ml; agua c.s.p. 1 litro.
TE buffer: TRIZMA base 10 mM; EDTA pH 8.0 1 mM; agua c.s.p. 800 ml; ajustar pH 8
con HCl; agua c.s.p. 1 litro.
46
Materiales y Métodos
20 X SSC: NaCl 3 M; acetato de sodio (C6H5Na3O7.2H2O) 0.3 M; agua c.s.p. 800 ml; HCl
1 M hasta pH 7.0; agua c.s.p. 1 litro.
10 X PBS: NaCl 80 g; KCl 2 g; Na2HPO4.7H2O 26.8 g; KH2PO4 2.4 g; agua c.s.p. 800 ml;
HCl hasta pH 7.4; agua c.s.p. 1 litro.
3.4.3. Antibióticos y otros compuestos relacionados
Los antibióticos, así como algunos compuestos usados en la selección de
clones positivos, se detallan en la Tabla M 2.
Tabla M 2. Antibióticos y otros compuestos relacionados utilizados en el estudio
Compuesto
Concentración stock
Concentración en cultivo
ampicilina
50 mg / ml
50 mg/l
gentamicina
25 mg / ml
25 mg / l
kanamicina
50 mg / ml
50 mg / l
rifampicina
100 mg / ml
100 mg / l
cloranfenicol
25 mg / ml
25 mg / l
higromicina
50 mg/ ml
20 ȝg/ ml ( en placa)
1M
250 ȝM – 1 mM
Isopropil
ȕ-D-tiogalacto-
piranósido (IPTG)
3.5. Oligonucleótidos
Los oligonucleótidos fueron sintetizados por Sigma-Aldrich, St. Louis, USA.
En la Tabla M3 se describe la secuencia de los distintos cebadores utilizados,
el gen sobre el cual fueron diseñados y el sitio de restricción (si corresponde).
47
Materiales y Métodos
Nombre
Secuencia (5´-3´)
Gen
Sitio
restricción
NPTII Fw
TGGATTGCACGCAGGTTCTCCG
NPTII
NPTII Rv
CGAGGAAGCGGTCAGCCCATTC
Oligo dT
pd (T)12-18
Act2 Fw
AATCTCCGGCGACTTGACAG
Actina
Act2 Rv
AAACCCTCGTAGATTGGCACAG
At3g18780
*Act2Fw
TGCTGGAATCCACGAGACAACCTA
Actina
Act2Rv
TGCTGAGGGAAGCAAGAATGGAAC
At3g18780
*cbp Fw
CCGGCCTATTCGTGTGGATTTTGA
CBP
cbp Rv
CATAATTCGTTGGCGCAGCTTGAG
At5g44200
*ucb Fw
GACTCCTTACGAAGGCGGTGTTTT
UCB
ucb Rv
GCTCAGGATGAGCCATCAATGCTA
At5g25760
p-CaMV35S
ATGTGATATCTCCACTGACGTAA
p-CaMV 35S
35StermFw
ATTTCAGCGGGCATGCCTGCAG
t-CAMV35S
CAL Fw
AATTCGAAGATGGATGGG
Calreticulina
CAL Rv
AACATAATGCTGTAAGGA
At1g56340
AOX Fw
ATTTTTTCAGAGACGATA
Oxidasa
AOX Rv
GCGAATGTCAGAAGCAAA
alternativa
At5g64210
PEROX Fw
ATCTTCAAGGGGAAGAAA
Peroxirredoxina
PEROX Rv
GCCGACCATCTCTCAGAC
At3g06050
Aco Fw
GAAGTGATTCCAACAAAATCAA
Aconitasa
Aco Rv
AACACCAGGCAATACCATACTC
At4g26970
SDH21 Fw
AAACATATGGCGGAGGCGGAAACAAAA
Succinato
SDH21 Rv
AAACTCGAGACGCTGAAGTTGCTTGAT
deshidrogenasa
At2g18450
Fra5New
AAACATATGGCTACAGCTTCAAGG
Fw
AtFH
At4g03240
FRATEN Fw
AAAGGATCCATGCTTTGTGTATTT
At4g03240
fra2X Fw
GGGCATATGGAGGAAGAGTTTCACAAA
At4g03240
NdeI
48
Materiales y Métodos
AtFH
Fra-his Rv
AAACTCGAGTGAGAGTTGGATTGGTTC
XhoI
At4g03240
Fra-stop Rv
AAACTCGAGTTATGAGAGTTGGATTGGTTC
At4g03240
XhoI
as-AtFHbam Fw
AAAGGATCCATGGCTACAGCTTCAAGG
At4g03240
BamHI
5´UTR Fw
GTGACAGAACCGCCATGGCTACA
At4g03240
Sma I
TGTTTTAAAGCCTTCTTTATGAGA
At4g03240
PSST Fw
GCCTAGTCCTCGCCAGTCTG
PSST
PSST Rv
GCTGGAGTAGTCCATAGAGC
At5g11770
TYKY Fw
GATTTTGGCTCGCAGGTCACTG
TYKY
TYKY Rv
GCGGACCATTTCTGTGAGGAAC
At1g79010
NADH BP Fw
GAAAGCTGTGGGCAGTGCAC
NADH BP Rv
TCTCGAGCTCTGGCCTAAAG
3´UTR
Rv
NADH binding
protein
At5g08530
Catalasa1
CAT1 Fw
GATAAGCTACTCCAGACCCGGA
CAT1 Rv
CTGAGACCAGTAAGAGATCCA
CAT2 Fw
GATAAGCTGCTTCAAACCCGTG
CAT2 Rv
CTGAGACCAGTAAGAGATCCA
CAT3 Fw
ACGACAAGCTGCTCCAGTGTA
CAT3 Rv
CTGAGACCAGTAAGAGATCCA
*AtFEQ1 Fw
CAGTCAGTTTCGTGAGTGAGCACA
Ferroquelatasa1
AtFEQ1 Rv
TCTGAGTCAACCACTGCATTTGGG
At5g26030
*AtFEQ2 Fw
CAAACCTTGAAGCTCGACAGTCGT
AtFEQ2 Rv
CAAGATGCCCCACTGATGCAGAAA
At1g20630
Catalasa2
At4g35090
Catalasa3
At1g20620
Ferroquelatasa2
At2g30390
Porfobilinógeno
*AtHemB1 Fw
TGCTGACGTAGTTAGTCCGAGTGA
sintasa1
AtHemB1 Rv
TCACGTGCCTCAATCAATGCCT
At1g69740
*AtHemB2 Fw
AGGCATTGCTAGAAGCACGAGAAG
AtHemB2 Rv
GGCGGATGCATAACAATGACTCCA
Porfofilinógeno
sintasa2
At1g44318
Coproporfirinógeno
*AtHEMF2 Fw
AACCTGGTCCGATTCCGTTCTTTG
AtHEMF2 Rv
ACGACCGAATGAAAGTGCTTGACG
sintasa2
At4g03205
* Oligonucleótidos utilizados para la técnica de PCR en tiempo real.
49
Materiales y Métodos
3.6. Preparación y análisis de ADN
3.6.1. Propagación de ADN plasmídico
3.6.1.1. Preparación de bacterias Escherichia coli competentes
Reactivos y soluciones utilizados: Medio LB-agar y LB-liquido. Solución A
(MgCl2 100 mM), Solución B (CaCl2 100 mM) y Solución C (CaCl2 100 mM, 15%
V/V glicerol). Se crecieron células de Escherichia coli en una placa de LB-agar
durante 12 h. a 37°C. A partir de una de las colonias crecidas, se inoculó en 3 ml de
medio LB. El cultivo se creció a 37°C con agitación durante 12 h. Posteriormente, 1
ml de este cultivo se utilizó para inocular 100 ml de medio LB y se incubó a 37°C
con agitación hasta alcanzar la fase logarítmica de crecimiento (determinada por
cuantificación de la absorbancia a 600 nm). Posteriormente, se centrifugó el cultivo a
4°C y 3000 × g durante 10 min. El precipitado resultante se resuspendió en 50 ml de
solución B y se incubó en hielo durante 20 min. Posteriormente se centrifugó a 4°C y
2100 × g durante 10 min. Finalmente el precipitado se resuspendió en 1 ml de
solución C y el homogenado conteniendo las células competentes se fraccionó en
alícuotas de 100 ȝl que fueron guardadas a -80°C hasta su uso.
3.6.1.2. Transformación de bacterias competentes de E. coli.
Se transformaron 100 ȝl de células de E. coli (XL1-Blue o BL21, según
corresponda), con 10 ȝl de ADN proveniente de las reacciones de ligación o con 2 ȝl
de ADN plasmídico (10-20 ng/μl). Las células se incubaron durante 30 min. a 4ºC.
Posteriormente, la mezcla fue sometida a un shock térmico (45 s a 42ºC seguido de
15 min. en hielo). Se agregaron 600 ȝl de medio LB y se incubó por 1 h. a 37ºC con
agitación. Finalmente, las bacterias transformadas fueron crecidas en medio LB-agar
con el antibiótico correspondiente, durante 18 h a 37ºC.
50
Materiales y Métodos
3.6.2. Aislamiento de ADN plasmídico
3.6.2.1. Aislamiento de ADN plasmídico (kit comercial)
Para la obtención de ADN plasmídico se utilizó el equipo comercial
“GenElute™ Plasmid Miniprep Kit” (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), según las
instrucciones del fabricante, obteniéndose ADN libre de ARN. Este método se utilizó
para obtener ADN plasmídico con el que se llevaron a cabo procesos de
secuenciación, clonado o digestión con enzimas de restricción.
3.6.2.2. Aislamiento de ADN plasmídico mediante lisis alcalina
La extracción de ADN plasmídico para el análisis rutinario de colonias se
realizó según el método de Sambrook con algunas modificaciones (Sambrook et al.,
1989). Se centrifugó 3 ml de cultivo de células en fase estacionaria de crecimiento
durante 1 min. a 12000 × g. A continuación, se resuspendió el precipitado en 200 ȝl
de solución P1 (Glucosa 50mM, Tris-HCl 25mM, pH 8.0, EDTA 10mM, pH 8.0).
Posteriormente se adicionó 300 ȝl de solución P2 (NaOH 0.2N, SDS 1% P/V) y se
mezcló por inversión, hasta lograr la clarificación de la solución y se incubó durante
5 min. en hielo. Se agregó 300 ȝl de solución P3 (acetato de potasio 3M, pH 4.8), se
mezcló rápidamente por inversión y se incubó durante 5 min. en hielo.
Posteriormente se centrifugó durante 20 min. a 12000 × g. El sobrenadante fue
transferido a otro tubo, se agregó 5 ȝl ARNasa A (1 ȝg/ȝl) y se incubó a 37ºC
durante 30 min. Luego se agregó 400 ȝl de cloroformo, se agitó por inversión y se
centrifugó a 13400 rpm durante 5 min. La fase superior se transfirió a otro tubo. Para
lograr la precipitación del ADN plasmídico se agregó igual volumen de isopropanol,
se mezcló por inversión y la mezcla fue incubada en hielo durante 25 min. Luego de
centrifugar a 13400 rpm durante 25 min. se retiró el sobrenadante y se agregó 500 ȝl
de etanol 70% y se centrifugó durante 5 min. Finalmente, se retiró el sobrenadante,
se dejó secar el precipitado y el ADN se resuspendió en un volumen adecuado de
agua estéril (aprox 40 μl).
51
Materiales y Métodos
3.6.3. Electroforésis de ADN en geles de agarosa
Las moléculas de ADN con un tamaño comprendido entre 0.2 y 10 Kb se
separaron en geles de agarosa 0.8% P/V con bromuro de etidio (5 mg/ml). Estos
geles fueron sometidos a electroforesis horizontal en un campo eléctrico de dirección
constante, utilizando el Buffer TBE 1 X. Los fragmentos fueron visualizados en un
transiluminador UV y sus tamaños fueron determinados por comparación con
marcadores de masa molecular comerciales (400 bp, 100 bp, Productos bio-Lógicos,
UNQ)
3.6.4. Purificación de ADN a partir de geles de agarosa
Los fragmentos de ADN de interés se aislaron de los geles de agarosa y se
purificaron utilizando el kit comercial “GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification
kit” (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden). El ADN se purificó siguiendo
las instrucciones del fabricante.
3.7. Manipulación enzimática de ADN
3.7.1. Reacción de ligación
Las reacciones de unión de los fragmentos aislados de ADN a los vectores
plásmídicos se llevó a cabo de la siguiente manera: Se utilizó una relación
inserto:vector 3:1. Se mezcló el inserto con el vector más 1 ȝl de buffer de ligación
10X (Tris-HCl 60 mM pH 7.8, MgCl2 20 mM, DTT 20 mM, ATP 2 mM y PEG 10 %
V/V) y 1 ȝl de T4 ADN ligasa. A continuación, se agregó H2O destilada c.s.p. 10 ȝl y
por último, se incubó la reacción en un baño a 16°C durante 18 h.
3.7.2. Reacciones de digestión con enzimas de restricción
Todas las reacciones de digestión realizadas siguieron un mismo
procedimiento que consistió en tratar 50-100 ng de ADN lineal y el vector
plasmídico con 10-15 U de enzima de restricción, 2 ȝl de buffer 10X específico para
cada enzima, según las indicaciones del fabricante, y H2O destilada estéril c.s.p. 20
52
Materiales y Métodos
ȝl. La mezcla de reacción se incubó durante 1 h. a la temperatura correspondiente
para cada enzima. En el caso de las digestiones realizadas con dos enzimas de
restricción el tiempo de incubación se incrementó a 3 h.
3.8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Todas las reacciones de PCR realizadas se llevaron a cabo utilizando buffer
de PCR 1X (Promega, WI, USA), dNTPs 0.4 mM, 0.4 ȝM de cada oligonucleótido,
MgCl2 2 mM, Taq Polimerasa 1 U, H2O c.s.p. 25 ȝl y ADNg (ADN genómico) o
ADNc (ADN copia) como molde. El protocolo general de amplificación constó de un
ciclo de desnaturalización inicial a 94°C durante 4 min., un número determinado de
ciclos: fase de desnaturalización a 94°C 30 seg; fase de hibridación a la temperatura
óptima para cada juego de oligonucleótidos determinado por gradiente de
temperatura; fase de elongación 1 min. por cada 1000 pb a amplificar, a 72°C, más
una extensión final de 10 min. a la misma temperatura. El número de ciclos se
estableció en función del objetivo buscado en cada experimento.
3.9. Extracción de ARN total
El ARN total de diferentes tejidos fue extraído usando el reactivo Trizol
(Invitrogen Corp. Carlsbad, CA, USA), compuesto por una mezcla de fenol y
tiocianato de guanidina. Cada muestra se homogeneizó con nitrógeno líquido, según
la relación 50-100 mg de tejido: 1 ml de Trizol. Se agregó 200 μl de cloroformo y se
agitó vigorosamente de forma manual durante 15 s. La mezcla se dejó reposar
durante 3 min. a temperatura ambiente y luego se centrifugó 15 min. a 12000 × g a
4°C. Luego de esta etapa se observa una separación en la mezcla de dos fases, una
inferior orgánica de color rojo y otra superior, acuosa e incolora, que contiene al
ARN. Se transfirió la fase superior a otro tubo y se agregó 188 μl de alcohol
isopropílico. Luego de agitar, se dejo reposar a temperatura ambiente durante 10 min.
Posteriormente se centrifugó a 12000 × g durante 10 min. a 4°C y se descartó el
sobrenadante (el ARN precipita en el fondo del tubo). Se lavó exhaustivamente el
precipitado con etanol 70% y se agitó utilizando un vortex durante 2 min. Se
53
Materiales y Métodos
centrifugó a 7000 × g durante 5 min. a 4°C y se descartó el sobrenadante. El ARN se
resuspendió en agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato, para la inactivación de
ARNasas). El material así obtenido se encuentra en condiciones de ser procesado por
RT-PCR.
3.10. Cuantificación de ARN total
La cantidad de ARN total se determinó espectrofotométricamente a 260 nm
(1 unidad de absorbancia equivale a 40 μg de ARN). La pureza de las muestras
obtenidas se determinó mediante la relación de absorbancia 260 nm/280 nm.
3.11. RT-PCR semicuantitativa
La RT-PCR es un método específico y sensible muy utilizado para medir
transcriptos de ARN y la detección de cambios en sus niveles de transcripción bajo
diferentes condiciones experimentales, utilizando como referencia un gen
constitutivo. El ARN de hojas y flores fue extraído según se detalló en la Sección
3.9. Para los estudios de RT-PCR, el ARN fue sometido a un tratamiento con
ADNasa I para eliminar las impurezas de ADN, según se detalla a continuación: 5 μg
ARN; 1 μl Buffer reacción; 2 U ADNasa I (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). La
mezcla se incubó durante 25 min. a temperatura ambiente y luego se adicionó 1 μl de
EDTA 25 mM y se incubó 20 min. a 70°C. Posteriormente, se realizó la síntesis de
ADNc utilizando una transcriptasa reversa M-MLV RT (Moloney Murine Leukemia
Virus Reverse Transcriptase, USB Corp. Cleveland, OH, USA). Para ello se
cuantificó espectrofotométricamente el ARN y se procesó según el siguiente
protocolo:
54
Materiales y Métodos
Hexámeros Random pd(N)6 (Amersham Biosciences, UK) (1 μg/ul)
1 μl
ARN
5 μg
Buffer 5X M-MLV
5 μl
dNTPs (10 mM)
0.5 μl
Inhibidor de ARNasas (Amersham Biosciences, UK)
25 U
M-MLV RT
H2O DEPC c.s.p.
200 U
Vol.final
25 μl
La mezcla de reacción se incubó durante 1 h. a 42°C y luego a 70°C durante
15 min. Una vez terminada la RT se realizó la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) a fin de evaluar los niveles de ARNm de cada gen. Los genes de ȕ-ACTINA o
ARNr 18S (Ambion Inc. Austin, TX, USA) se utilizaron como control interno. El
número de ciclos mínimo de PCR para los genes constitutivos fue de 24. Para poder
comparar las muestras entre sí se hicieron distintas diluciones de las mismas a fin de
tener en todas la misma cantidad de partida de ADNc.. En el caso del ARNr 18S se
utilizó una relación de primers 18S: competímeros de 2:9, respectivamente, para
modular la eficiencia de amplificación del ARNr 18S, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Para evaluar los niveles de los diferentes transcriptos, se
realizaron reacciones de PCR a 16, 20, 24 y 28 ciclos utilizando como molde ADNc.
Para cada ADNc se determinó el número apropiado de ciclos a fin de obtener los
datos durante la fase exponencial de la reacción de PCR.
3.12. PCR en tiempo real (QPCR)
A partir de ARN total extraído con Trizol (ver sección 3.9) se realizó una
transcripción reversa para obtener ADNc utilizando el kit Superscript II Reverse
transcriptase. El medio de reacción contenía ARN (2 a 20 μg), 2 μl de dNTPs 10
mM, 2 μl de oligo dT (23mer), 2.5 μg/ul y H2O csp 26 μl. El medio se incubó a
65°C por 10 min. y luego se enfrió en hielo. Posteriormente se agregó 8 μl de Buffer
5X, 4 μl de DTT y 2 μl de Superscript II en un volumen final de 40 μl. La mezcla de
reacción se incubó 1h. a 42°C y luego 10 min. a 70°C. El ADNc se purificó
utilizando el kit QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc. Valencia, CA, USA).
55
Materiales y Métodos
La PCR cuantitativa se realizó en placas de 96 pocillos. El medio de reacción
contenía 4.3 μl de primers fw y rv (7.5 μM), 10 ng de ADNc y 12.5 μl de mezcla de
reacción (Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 2X, Fermentas). Las reacciones
se llevaron a cabo en un termociclador iCycler (BioRad, Hercules, CA, USA). Como
control interno se utilizaron los genes de ȕ-ACTINA, CBP y UCB.
3.13. Extracción de ADN genómico
El ADN genómico (ADNg) extraído de hojas de A. thaliana fue utilizado para
la caracterización genotípica de las líneas mutantes por T-ADN. Se partió de
aproximadamente 100 mg de tejido vegetal, el cual se trituró en N2 (l) en microtubos.
Se agregó 200 μl de buffer bromuro de cetil-trimetil-amonio (CTAB) y se trituró
hasta lograr la completa homogeneización del tejido. Posteriormente, se agregó 100
μl más de buffer CTAB y se incubó a 60ºC durante 30 min. Se centrifugó a 13400
rpm durante 5 min. y al sobrenadante se le agregó 300 μl de cloroformo. Después de
agitar, se centrifugó nuevamente a 13400 rpm por 5 min. La fase acuosa (superior)
fue transferida a otro tubo al que se le agregó un volumen igual de isopropanol y se
precipitó el ADN por 20 min. a temperatura ambiente. El precipitado obtenido luego
de centrifugar a 7000 × g por 10 min. fue lavado etanol 70% V/V y secado.
Finalmente, el precipitado se resuspendió en 20 μl de agua destilada estéril y se
cuantificó espectrofotométicamente.
3.14. Cuantificación de ADN
La cantidad de ADN total se determinó espectrofotométricamente a 260 nm
(1 unidad de absorbancia equivale a 50 μg/μl de ADN). La pureza de las muestras
obtenidas se determinó mediante la relación de absorbancia 260 nm/280 nm.
3.15. Hibridación de ácidos nucleicos (Southern-blot)
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa 0.8% P/V en TBE 1X a 100 V.
Los geles fueron tratados a 254 nm por 2 min. en un horno UV Crosslinker (BioRad
56
Materiales y Métodos
Laboratories, Munich, Germany). Posteriormente, los geles se incubaron durante 30
min. en solución desnaturalizante (NaOH 0.5 N, NaCl 1.5 M) con agitación. Se lavó
3 veces con agua destilada y luego se incubaron durante 30 min. en solución de
renaturalización (Tris-HCl 0.5 M, pH 7.4, NaCl 1.5 M) con agitación. Después de
lavar con agua destilada los geles se colocaron sobre un puente de papel Whatman
(Whatman Int. Ltd., Maidstone, England), embebido con buffer SSC 10X y en
contacto con el mismo. Sobre el gel de agarosa se ubicó una membrana de nylon
(Hybond N+, Amersham Biosciences, UK) y sobre ella, tres hojas de papel de filtro
Whatman, más una pila de papel secante y se dejó transfiriendo 16 h. Finalmente, la
membrana de nylon conteniendo el ADN fue irradiada a 254 nm por 2 min. en horno
UV Crosslinker. El fragmento de ADN escogido como sonda se obtuvo por PCR
utilizando oligonucleótidos específicos para el gen de interés. Cada sonda de ADN
(aprox 100 ng, cc. final 10 ng/μl) fue desnaturalizada a 100°C durante 5 min. y luego
enfriada 5 min. en hielo. Se agregó 10 μl del reactivo de marcado (conteniendo la
enzima peroxidasa) ECL Gold (Amersham Biosciences, UK) y 10 μl de solución de
glutaraldehído. La mezcla fue incubada 10 min. a 37°C y usada inmediatamente para
la hibridación. La membrana de nylon conteniendo los fragmentos de ADN fue prehibridada a 42°C durante 1 h. en buffer ECL Gold (Amersham Biosciences, UK),
NaCl 0.5M, agente bloqueante 5% (P/V) en agitación. Luego se agregó la sonda
marcada y se mantuvo en agitación durante 18 h. a la misma temperatura.
Posteriormente la membrana se lavó dos veces con una solución SSC 0.5X, SDS
0.5% P/V a 55°C durante 20 min. A continuación se lavó la membrana dos veces con
solución SSC 2X durante 5 min. a temperatura ambiente. La membrana fue
sumergida en solución de detección (mezcla de sc. 1, productor de peróxido de
hidrogeno y sc. 2, luminol), durante 1 min. Luego de escurrido el exceso de solución,
la membrana de nylon fue expuesta a una película fotográfica durante diferentes
períodos de tiempo.
57
Materiales y Métodos
3.16. Preparación y análisis de proteínas
3.16.1. Extracción de proteínas
Los diferentes tejidos de A. thaliana se cortaron en pequeños trozos, se
congelaron en N2 (l) y se homogeneizaron con un émbolo hasta lograr un polvo. Se
agregó un medio de extracción conteniendo: Tris-HCl 20 mM, pH 6.8; EDTA 1 mM;
PMSF 1 mM. Las fracciones solubles se obtuvieron por centrifugación a 10000 x g
durante 30 min., a 4ºC.
3.16.2. Determinación del contenido proteico
La concentración de proteína total se determinó por el método de Bradford
(1976). Se utilizó BSA como testigo.
3.16.3. Electroforesis de proteínas
Tanto los extractos de tejido vegetal como bacterianos o proteínas purificadas
se sometieron a una electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE),
utilizando un equipo Mini Protean II Cell (BioRad, Hercules CA, USA) y siguiendo
la técnica descripta por Laemmli (1970). La concentración de acrilamida en el gel de
separación fue de 12-15% P/V según la muestra a analizar y en el gel de
concentración fue de 5% P/V. Las muestras se incubaron a 100ºC durante 2 min. en
presencia del siguiente buffer de muestra: Tris-HCl pH 6.8 12 mM; 5% V/V glicerol;
0.4% P/V SDS; 2.88 mM 2-mercaptoetanol y 0.02 % P/V azul de bromofenol. La
electroforesis se realizó a 120 V (voltaje constante). Las bandas de proteína se
revelaron por tinción con azul brillante de Coomassie R-250, seguido de desteñido
con una solución de etanol: ácido acético: agua (3:1:6).
58
Materiales y Métodos
3.17. Obtención de anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales contra AtFH recombinante de A. thaliana fueron
obtenidos mediante inmunización de conejo luego de la inyección de cuatro dosis de
100 μg de la proteína recombinante purificada (Harlow and Lane, 1988).
3.18. Análisis por western blot
Los extractos proteicos o proteínas purificadas se sometieron primero a una
electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) y luego a una electrotransferencia
utilizando la celda Bio-Rad Mini-Trans-Blot transfer siguiendo el protocolo
desarrollado por Burnette (Burnette, 1981). Los geles se transfirieron a membranas
de nitrocelulosa durante 16 h. a 4°C y a 30 V (voltaje constante) en presencia del
siguiente buffer de transferencia: Tris-HCl 20 mM; glicina 150 mM; 20 % V/V
metanol; pH 8.0. Las membranas se incubaron en una solución de bloqueo
compuesta por 3 % P/V BSA en PBS (NaCl 137 mM; KCl 2.7 mM; Na2HPO4 4.3
mM; KH2PO4 1.4 mM) durante 1 h. Luego, se realizaron 2 lavados de 15 min. con
H2O y se incubó las membranas 1 h. con el anticuerpo primario correspondiente. Los
anticuerpos primarios que se utilizaron fueron (i) anticuerpos policlonales de conejo
anti-AtFH de Arabidopsis thaliana (Maliandi et al., 2007); (ii) anticuerpos
monoclonales anti-Histag (Qiagen Inc, Valencia, CA, USA); (iii) anticuerpos
policlonales anti-catalasa (cedidos gentilmente por el Profesor Mikio Nishimura,
Department of Cell Biology, National Institute for Basic biology, Okazaki, Japan);
(iv) anticuerpos policlonales anti-NAD9 (cedidos por el Dr. Daniel Gonzalez, UNL).
Luego de la incubación con el anticuerpo primario correspondiente, las membranas
se lavaron 3 veces con una solución 2 % P/V BSA en PBS durante 15 min., y se
incubaron 1 h. con anti-IgG conjugada con la enzima fosfatasa alcalina. (Para los
anticuerpos primarios monoclonales, se utilizaron anticuerpos secundarios anti-ratón
y para los anticuerpos primarios policlonales se utilizaron anticuerpos secundarios
anti-conejo). Finalmente, las membranas se lavaron 2 veces con PBS durante 10 min.
y fueron incubadas por 5 min. con buffer sustrato conteniendo: Tris-HCl 100 mM pH
9,5; NaCl 100 mM; MgCl2 5 mM. La presencia de las bandas proteicas se reveló
59
Materiales y Métodos
mediante el agregado de 66 μl de azul de nitrotetrazolio (NBT, 50 mg/ml) y 33 μl de
5-bromo-4-cloro-3-indoilfosfato (BCIP, 50 mg/ml) en 10 ml de buffer sustrato (la
reacción se desarrolló al resguardo de la luz hasta la aparición de bandas de color
púrpura y se detuvo con lavados de H2O destilada). Para estimar la abundancia
relativa de cada banda proteica, en algunos casos se realizó un análisis
densitométrico utilizando el programa Gel PRO Analyzer Version 3.0
(Media
Cybernetics, Inc. Bethesda, MD, USA).
3.19. Aislamiento de plantas mutantes homocigotas
A fin de aislar plantas homocigotas de las mutantes insercionales atfh-1, atfh2 y atfh-3, se comprobó en primer lugar, la ubicación del inserto en el gen AtFH
mediante una reacción de PCR sobre ADNg y utilizando oligonucleótidos
específicos flanqueando el lugar de inserción del T-DNA (Fraten Fw/ Fra-Sma Rv y
Fra 5 New Fw / FraSma Rv para las líneas atfh-1 y Fra 5 New Fw/ FraSma Rv y
NPTII Fw y Rv para las líneas atfh-2 y atfh-3). El ADNg fue extraído a partir de
hojas utilizando el método modificado de extracción con CTAB (Sambrook et al.,
1989) (ver sección 3.13).
3.20. Construcción de vectores binarios para transformación de plantas de A.
thaliana
A partir de ADNc obtenido por retrotranscripción utilizando ARN total, se
realizó un ensayo de PCR con oligonucleóticos
secuencia
de
AtFH
en
orientación
específicos para amplificar la
sentido
(AtFHBam
up:
AAAGGATCCATGGCTACAGCTTCAAGG el sitio BamHI esta subrayado;
Frastop:
subrayado)
AAACTCGAGTTATGAGAGTTGGATTGGTTC, el sitio XhoI esta
y
AtFH
en
orientación
AAAGGATCCATGGCTACAGCTTCAAGG,
FraSma:
antisentido
(AtFH
Bamup:
el sitio BamHI esta subrayado;
AAACCCGGGTGAGAGTTGGATTGGTTC,
el
sitio
SmaI
esta
subrayado). El fragmento de interés fue aislado y purificado y se sometió a digestión
(ver sección 3.7.2) con las endonucleasas BamHI y XhoI para la construcción s-
60
Materiales y Métodos
AtFH. Para la construcción as-AtFH se utilizaron las endonucleasas SmaI y BamHI.
El vector pDH51, se sometió a digestión con las endonucleasas BamHI y SalI para
la construcción s-AtFH. El sitio de clonado múltiple dentro del vector no contiene el
sitio XhoI, por consiguiente se digirió con SalI ya que ambas generan extremos
cohesivos compatibles. Para la construcción as-AtFH el vector se digirió con las
endonucleasas SmaI y BamHI. El fragmento de DNA resultante para cada
construcción, fue clonado en el vector pDH51 dentro del sitio de clonado múltiple,
entre el promotor y terminador del CaMV35S. Se transformaron células de E. coli y
se analizaron los clones positivos, que contienen el casete con el fragmento AtFH en
orientación sentido (s-AtFH) o el fragmento AtFH en orientación antisentido (asAtFH). Estos casetes fueron liberados con EcoRI y clonado en el vector binario
pCAMBIA 1302 que previamente había sido digerido con EcoRI.
3.21. Preparación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens y su
transformación
3.21.1. Preparación de células competentes
Una colonia de A. tumefaciens GV3101 fue crecida 16 h. en medio LB
líquido suplementado con antibióticos (rifanpicina 100 μg/ml y gentamicina, 25
μg/ml) a 30°C. Luego, utilizando 2 ml de este cultivo se inoculó 200 ml de medio LB
y antibióticos y las células se crecieron con agitación hasta alcanzar una OD600 = 0.3
– 0.4. Posteriormente el cultivo se centrifugó a 3000 × g durante 20 min. a 4°C. El
precipitado se lavó con 10 ml de buffer TE frío y se resuspendió en 5 ml de LB y
antibióticos. La suspensión de células competentes se fraccionó en alícuotas de 500
ȝl, se congeló en N2 (l) y se mantuvieron a –70°C hasta su utilización o hasta tres
meses.
3.21.2. Transformación de las células de A. tumefaciens
A una alícuota de 500 ȝl células competentes se le agregó 0.5-1.0 ȝg de
ADN plasmídico. Se incubó sucesivamente 5 min. en hielo, 5 min. en N2 (l) y 5 min.
a 37°C. La suspensión se diluyó a 1 ml con medio LB y antibióticos rif-gen-kam y se
61
Materiales y Métodos
incubó con agitación a 28°C durante 2- 4 h. Posteriormente, se inocularon 200 ȝl del
cultivo en medio LB-agar y antibióticos y se incubaron las placas a 28°C durante 48
h. La transformación fue verificada por PCR sobre ADN plasmídico obtenido
mediante minipreparaciones a partir de diferentes colonias (ver seccion 3.21.3).
3.21.3. Obtención de ADN plasmídico de A. tumefaciens
Células de A. tumefaciens fueron inoculadas en 5 ml de medio LB
suplementados con los antibióticos correspondientes y se crecieron por 16 h. a 30°C.
Los cultivos se centrifugaron a 1500 × g por 15 min. a 4°C. Se descartó el
sobrenadante y se resuspendió el precipitado en 200 ȝl de Solución I (glucosa 50
mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8.0 y lisozima 5 mg/ml de) agitando en un
vortex y luego se incubó durante 10 min. a temperatura ambiente. Se agregó 400 μl
de Solución II (SDS 1% V/V, NaOH 0.2 N) preparada en el momento y se mezcló
por inversión cuatro veces. El homogenado se incubó 10 min. a temperatura
ambiente. Posteriormente, se agregó 60 μl de fenol alcalino (2 volúmenes de NaOH
0.2 N más 1 volumen de fenol equilibrado en Tris-HCl 1M, pH 8.0 y mezclado en el
instante previo al uso). Se mezcló por inversión, por lo menos 16 veces. Se agregó
300 μl de acetato de sodio 3 M, pH 5.0 y se mezcló por inversión 20 veces. Se
incubó durante 20 min. a –20°C y luego se centrifugó 5 min. a temperatura ambiente
a 1500 × g. El sobrenadante fue recolectado y se adicionó un volumen igual de fenol
equilibrado con Tris-HCl, 1M, pH 8.0. Luego se procedió a la extracción del ADN
por separación de fases tras agitación por inversión aproximadamente 20 veces.
Después de centrifugar a 12000 × g por 5 min., se tomó la fase superior y se agregó
un volumen igual de cloroformo. Se agitó y luego se centrifugó a 12000 × g por 5
min. Luego de decantar, se separó la fase superior, se agregó 0.7 volúmenes de
isopropanol para precipitar el ADN y se incubó a –20°C por 20 min. Después de
centrifugar 10 min. a 12000 × g se descartó el sobrenadante y se lavó el precipitado
con 500 μl de etanol 70% V/V. Finalmente se centrifugó 5 min. a 12000 × g, se
descartó el sobrenadante y se dejó secar. El precipitado fue resuspendido en un
volumen adecuado de agua destilada (aprox 40 μl).
62
Materiales y Métodos
3.22. Transformación de plantas de A. thaliana utilizando el método de
infiltración por floral dip
La transformación de plantas de Arabidopsis se realizó mediante la técnica de
floral dip (Clough and Bent, 1998). Brevemente, se cultivaron plantas de Arabidopsis
wt (var. Col-0) a 23ºC hasta alcanzar el estadio de floración (aprox 6 semanas). Para
tener un buen número de brotes florales, las inflorescencias primarias fueron cortadas
aproximadamente 4 días antes de la transformación para eliminar la dominancia
apical y posibilitar la emergencia de múltiples botones florales secundarios. Dos días
antes de la transformación se inició un cultivo de 3 ml de células de A. tumefaciens
GV3101, transformadas con el plásmido binario con la construcción correspondiente.
El cultivo se realizó a 28ºC en medio LB (gen-rif) y el antibiótico que permita la
selección del plásmido de interés. Con estos pre-inóculos se inocularon 250 ml de
medio LB suplementado con los antibióticos antes mencionados. Se crecieron en
agitación a 30ºC por 24 h. Al día siguiente, las bacterias se cosecharon por
centrifugación a 7000 × g por 10 min. y se resuspendieron en 250 ml de medio de
infiltración (sacarosa 5% P/V, detergente SILWET® L-77-Ag 0.005% V/V) hasta
lograr una OD600 = 0.8. El medio de infiltración se colocó en vasos de precipitado, y
se sumergieron los brotes florales durante 15 s. Las macetas se colocaron en forma
horizontal en bandejas de plástico y cubiertas con plástico transparente, de forma tal
de mantener la humedad y posibilitar el paso de luz. Luego de dos días, las plantas se
colocaron de forma vertical y se retiró la cubierta plástica. Aproximadamente luego
de 3 a 5 semanas se cosecharon las semillas que fueron mantenidas a 4ºC hasta ser
utilizadas.
3.23. Esterilización de semillas de Arabidopsis
Las semillas de Arabidopsis fueron esterilizadas en Solución de Bleach
(NaClO 5% V/V, SDS 1% P/V) mediante agitación en vortex durante 8 min. y luego
se realizaron 3 lavados sucesivos con H2O destilada estéril. Las semillas fueron
resuspendidas en TOP-agar (0.2 % P/V agar) y luego sembradas en placas con medio
MS y cuando corresponda, con el antibiótico de selección.
63
Materiales y Métodos
3.24. Selección de plantas transformadas
Las semillas esterilizadas se inocularon en placas de Petri conteniendo medio
MS, agar 0.8% P/V, sacarosa 1% P/V y el/los antibióticos correspondientes, y se
incubaron durante 48 h. a 4ºC en oscuridad. A los dos días, las placas se pasaron a
invernadero y se crecieron a 23°C con iluminación. Las plantas transgénicas serán
aquellas que crezcan en presencia de los antibióticos (resistentes). Luego de la
aparición de las primeras hojas verdaderas, las plantas fueron pasadas a tierra
(rusticación).
3.25. Clonado, expresión y purificación de proteínas
3.25.1. Clonado molecular de AtFH de A. thaliana
El ADNc correspondiente al gen AtFH (564 pb) fusionado a histidina y con
codón de terminación, fueron obtenidos por RT-PCR usando los oligonucleótidos:
fra2x y Fra-his; fra2x y Fra-stop, respectivamente. Los productos de PCR resultantes
fueron digeridos usando endonucleasas de restricción (ver sección 3.7.2) y clonados
en el vector pET24a (Novagen, EMD Biosciences Inc, Madison, WI, USA). Los
clones positivos fueron verificados por secuenciación de ADN. Así, se generaron los
plásmidos recombinantes pATF01 (que codifica para AtFH-His6, conteniendo en el
extremo C-terminal la fusion a histidina y pATF02 que codifica para AtFH-STOP,
conteniendo el codón de terminación.
3.25.2. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes AtFH-His6 y
AtFH- STOP de A. thaliana
Los plásmidos pATF01 y pATF02, se utilizaron para transformar células
competentes de E.coli BL21 (DE3) y BL21 (DE3)-RIL (ver sección 3.6.1.2). Se
inoculó medio LB suplementado con kanamicina (30 mg/l), con las células
transformadas. Se crecieron a 37ºC en agitación (160 rpm) hasta obtener una DO600=
0.4-0.6. La expresión de la proteína recombinante se indujo con el agregado 1 mM de
IPTG por aproximadamente 4-5 h. a 30 ºC. El tiempo óptimo de expresión fue
64
Materiales y Métodos
seleccionado luego del análisis por SDS-PAGE de muestras tomadas a diferentes
tiempos luego de la inducción con IPTG. Para realizar la purificación, los cultivos
conteniendo las células transformadas fueron colectados por centrifugación a 3000 ×
g por 20 min. a 4ºC, se lavaron dos veces y se resuspendieron con 2 ml de buffer A
(Na2HPO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM) por cada gramo de células.
Luego los cultivos se sonicaron (130 Watt Ultrasonic Processor, Vibra Cell, Sonics
& Materials UK) y centrifugaron a 12000 × g por 10 min. a 4°C. El extracto crudo se
filtró a través de una membrana de acetato de celulosa de 0.2 μm. Para la
purificación se utilizaron columnas comerciales de afinidad de 1 ml cargada con Ni+2
como ligando (Hi Trap chelating HP, Amersham Biosciences, UK) y una bomba
peristáltica (Biologic LP, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). En primer lugar, se lavó la
columna con 10 ml de agua destilada y 10 ml de buffer A (flujo 1 ml/min).
Posteriormente se cargó la muestra en la columna y se equilibró con 10 ml de buffer
de unión, B (NaH2PO4 0.02 M, NaCl 0.5 M, imidazol 20 mM, pH 7.4). La elución de
la proteína se realizó en un volumen de 25 ml utilizando un gradiente de imidazol 20
mM inicial (buffer de unión) - 500 mM final en buffer de unión. Las fracciones que
contenían AtFH eluyeron a una concentración de imidazol de alrededor de 250 mM.
Estas fracciones se recolectaron, se concentraron hasta 1 mg/ml y se guardaron a 20ºC. En estas condiciones la proteína fue estable por lo menos por 2 meses.
Para la expresión y purificación de AtFH-STOP, células de E.coli BL21
(DE3)-RIL conteniendo el plásmido pATF02 fueron crecidas en medio LB a 37ºC
hasta llegar a una DO600 = 0.5. La expresión de la proteína se indujo con 1 mM de
IPTG. Las células se cultivaron con agitación por 4 h a 30 ºC, se centrifugaron y
luego se resuspendieron en buffer C (Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM).
Posteriormente las células se sonicaron (130 Watt Ultrasonic Processor, Vibra Cell,
Sonics & Materials UK). La fracción soluble del extracto celular se cargó en una
columna comercial de DEAE-Sepharosa fast flow (Amersham Biosciences, UK)
equilibrada con buffer C. Luego se lavo con 5ml del mismo buffer. La proteína se
eluyó usando un gradiente de buffer D (Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, y
KCl 600 mM). La fracción que contenía AtFH-STOP, se recolecto y concentró y
luego diluyó 10 veces con buffer C. La nueva solución se sembró en una columna
65
Materiales y Métodos
Mono–Q (Amersham Biosciences, UK) y se eluyó con un gradiente lineal de KCl (0450 mM) en buffer E (Tris-HCl 50 mM, pH 8.0 y EDTA 1 mM). La fracción
conteniendo la proteína se recolectó y concentró. Luego se realizó una cromatografía
en una columna de filtración molecular (Superosa 12) usando buffer E con KCl 150
mM. La proteína purificada fue concentrada y almacenada a – 20 ºC.
3.26. Ensayo de degradación oxidativa de 2-deoxiribosa
Una mezcla de Fe (II) 15 μM, H2O2 8 μM, 2- deoxyribosa 5 mM (Fluka, St.
Louis, USA) en buffer Hepes-KOH 10 mM, pH 7.0, fue incubada en ausencia o en
presencia de AtFH-His6 y AtFH-STOP recombinantes por 30 min. a 25 ºC (vol. final
100 ȝl). Posteriormente, se agregó 50 μl de ácido fosfórico 4 % V/V y 50 μl de
ácido tiobarbitúrico 1% P/V. La mezcla de reacción fue incubada por 10 min. a 100
ºC y posteriormente enfriada en hielo. Después de este procedimiento se agrego 75
μl de SDS 10% V/V. La cantidad de malondialdehído producida fue determinada
espectrofotométricamente a 532 nm.
3.27. Determinación de Fe
Se partió de 60-100 mg de hojas de Arabidopsis de plantas wt y atfh-1 de 6 semanas.
Se homogeneizó el material con 500 μl de acetato de sodio 0.1 M y luego se
centrifugó a 13400 rpm por 5 min. Se utilizó 250 μl de sobrenadante y al mismo se le
agregó 100 μl hidroxilamina 10% P/V, 500 μl de acetato de sodio 0.1 M, 1.4 ml
H2O y 250 μl fenantrolina 2 mM. Se dejo incubando la mezcla de reacción a
temperatura ambiente por 10 min. hasta desarrollo de color y se cuantificó la
absorbancia a 510 nm. La curva de calibración se realizó utilizando soluciones de
distintas concentraciones de Fe (NH4)2(SO4)2 (2.10-6 M, 3.6.10-6 M, 7.2.10-6M,
1.44.10-5M, 2.88.10-5M, 3.6.10-5M, 7.2.10-5M, 1.44.10-4M, 2.88.10-4M) (Greenbers,
et al., 1992).
66
Materiales y Métodos
3.28. Determinación de la concentración de ATP
Se cuantificó el contenido total de ATP en hojas de roseta y flores de plantas
wt, mutantes y transgénicas de 6 semanas (Teixeira et al., 2005). Las mismas fueron
congeladas en N2 (l) y trituradas hasta lograr un polvo. Se utilizó aproximadamente
20 mg de tejido para cada determinación y cada muestra se homogeneizó con 60 μl
de HCl 0.1 M en microtubos de 1.5 ml. El homogenado fue centrifugado a 20000 × g
por 10 min. a 4°C. El sobrenadante se cargó en un micro-concentrador Microcon
YM-3 (Millipore Corp, Bedford, MA, USA) a 14000 × g a 4°C a fin de concentrar y
desalar la muestra, ya que altas concentraciones de sales en la muestra pueden causar
un efecto inhibitorio en la actividad luciferasa y disminuir la sensibilidad de la
técnica. Luego de neutralizar con buffer Tris-HCl pH 7.4, la solución filtrada fue
usada para la medida del contenido de ATP por luminiscencia mediante la utilización
del ATP bioluminescent assay kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
El
fundamento de la reacción se basa en la medida de la emisión de luz cuando el ATP
es consumido al reaccionar con la D-luciferina, a través de una reacción catalizada
por la enzima luciferasa. La cantidad de luz fue cuantificada utilizando un
luminómetro (LD-400 Luminescence Detector-Beckman Coulter, Inc.) y es
proporcional al ATP presente en la muestra. Los niveles de ATP se expresaron en
nmol .g–1 PF. Todos los datos fueron sometidos a análisis de t-Student, con un nivel
de probabilidad P <0.05.
3.29. Medidas de respiración
El consumo de oxígeno fue medido a 25°C usando una cámara de aire cerrada
unida a un electrodo tipo Clark (Hansatech Leaf Disc Electrode Unit, Hansatech,
UK). Se cortaron hojas de plantas de aproximadamente 6 semanas de A. thaliana
(entre 200 a 300 mg) y éstas fueron colocadas en la cámara en presencia del
electrodo de oxígeno. La calibración se realizó mediante 2 puntos: para el límite
superior se utilizó el pasaje de aire ambiental (21% O2) y el límite inferior se logró
con el pasaje de N2 (g) (0% O2) a través de la cámara. El consumo de oxígeno fue
monitoreado durante 15 min.
67
Materiales y Métodos
3. 29.1. Tratamiento con Rotenona
Se cortaron entre 100-200 mg de hojas de plantas wt, atfh-1 y as-AtFH, y se
sumergieron en 40 μM de rotenona. Se realizaron dos tiempos de incubación, 2 h y
15 h, y luego se midió el consumo de O2 como se detalla en la sección 3.29. La
solución de trabajo de 40 μM de rotenona, se preparó a partir de una solución madre
de 1 mM de rotenona, disuelta en agua, 0.5% metanol y 0.5 % etilenglicol para
favorecer su solubilización.
3.30. Aislamiento de mitocondrias y determinaciones enzimáticas
3.30.1. Aislamiento de mitocondrias
Las mitocondrias fueron aisladas como se describió previamente (Werhahn et
al., 2001) con modificaciones (Kruft, 2001). Las muestras de tejido vegetal (aprox. 5
g. de hojas) fueron trituradas en mortero en buffer de extracción conteniendo:
sacarosa 450 mM, EGTA 1.5 mM, BSA 0.2 % P/V, PVP (polivinilpolipirrolidona)
0.6 % P/V, DTT (ditiotreitol) 10 mM y MOPS (ácido 3-N-morpholinopropanesulfonico) 15 mM, pH 7.4. Luego se realizó una centrifugación diferencial
consistente en 5 pasos: 4 pasos para purificar la mitocondria de las partículas con alto
coeficiente de sedimentación (10 min. a 3500 x g, 2 veces, 5 min. a 3500 x g y 5
min. a 6000 x g) y un paso final para colectar la fracción enriquecida de mitocondrias
luego de la centrifugación por 10 min. a 17000 x g. Posteriormente se realizaron 3
pasos de centrifugación en gradiente de Percoll, 18%, 29% y 45% V/V de Percoll en
0.3 M sacarosa y 10 mM MOPS, pH 7.2. Luego de la centrifugación por 45 min. a
70000 x g, la fracción enriquecida en mitocondria se aisló de la interfase entre 29% y
45% V/V de Percoll. Bajo estas condiciones la fracción de mitocondrias está
deprivada esencialmente de contaminación citoplasmática o plastídica. Las
mitocondrias aisladas fueron homogeinizadas en buffer conteniendo 300 mM manitol
y 10 mM K2HPO4 (pH 7.4) y 0.5 % V/V Tritón X-100 a fin de solubilizar las
organelas para determinación de actividades enzimáticas.
68
Materiales y Métodos
3.30.2 Medida de la actividad enzimática de aconitasa, succinato deshidrogenasa
y malato deshidrogenasa
La actividad aconitasa fue determinada mediante el aumento de la
absorbancia a 240 nm. El medio de reacción contenía: D-Isocitrato 20 mM y TrisHCl 100 mM, pH 8 y mitocondrias solubilizadas (1 μg/μl de proteína total), en un
volumen final de 500 μl. Las determinaciones se llevaron a cabo a 25°C durante 20
min., a intervalos de 30 s. (Li, et al., 1999).
La actividad succinato deshidrogenasa se determinó mediante el descenso de
la absorbancia a 600 nm. El medio de reacción fue el siguiente: succinato 100 mM,
diclorofenol indofenol (DCPIP) 0.5 mM, azida 40 mM, buffer fosfato 10 mM, CaCl2
10 mM y BSA 0.5 mg/ml y mitocondria solubilizadas (1μg/μl de proteína total), en
un volumen final de 500 μl. Las determinaciones se llevaron a cabo a 25°C durante
20 min., a intervalos de 30s. (Schirawski and Unden, 1998).
La actividad malato deshidrogenasa fue cuantificada por descenso de la
absorbancia a 340 nm. El medio de reacción contenía: imidazol 50 mM pH 6.9,
NADH 0.15 mM y ácido oxálico 1 mM y una suspensión de mitocondrias (1μg/μl de
proteína total), en un volumen final de 500 μl. Las determinaciones se llevaron a
cabo a 25°C durante 20 min., a intervalos de 30 s. (Tripodi and Podesta, 2003).
3.31 Infiltración de hojas con H2O2
Aproximadamente 20 hojas de roseta de A. thaliana wt fueron infiltradas con
una solución 500 ȝM de H2O2, con la ayuda de una jeringa de 1 ml (sin aguja). Se
extrajo ARN a diferentes tiempos de incubación (t0, 2, 4, 8 y 24 h.), según el
protocolo descripto en la sección 3.9. Como control, se usaron plantas infiltradas con
agua destilada, procesadas de forma similar.
69
Materiales y Métodos
3.32. Detección histoquímica de superóxido en hojas de Arabidopsis
La detección histoquímica de superóxido, se realizó en hojas de roseta de
plantas de A. thaliana de 6 semanas, las cuales fueron infiltradas por vacío con una
solución 6 mM NBT (Nitroblue Tetrazolium, Promega, WI, USA), 1 mM azida de
sodio (Na3N) (Flohé and Otting, 1984; Beyer and Fridovich, 1987; Laloi et al.,
2004). El NBT de color amarillo pálido reacciona con anión superóxido, produciendo
formazán, el cual forma un precipitado de color azul oscuro aproximadamente a los
20 min. de iniciada la reacción. La clorofila fue removida de las hojas mediante
calentamiento por 10 min. en presencia de etanol 95% V/V (Laloi et al., 2004).
3.33. Detección histoquímica de especies reactivas de oxígeno en hojas y raíces
de plantas de Arabidopsis thaliana
La detección histoquímica de ROS fue realizada de acuerdo a Hempel y col.
(Hempel et al., 1999). Brevemente, hojas de roseta y raíces de plantas de Arabidopsis
wt, mutantes y transgénicas de 6 semanas, fueron sumergidas en solución buffer
fosfato salino (PBS) 1X conteniendo 5 μM H2DCFDA (dihidro-cloro fluoresceína diacetato). El tejido fue incubado por 2 min. a temperatura ambiente en oscuridad, y
luego lavado 2 veces por 3 min. en PBS 1X. La fluorescencia fue visualizada
inmediatamente utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E800.
3.34. Determinación del contenido de hemo y actividad catalasa
3.34.1. Determinación de la concentración de hemina:
Se partió de aproximadamente 1 g. de hojas de roseta de plantas de A.
thaliana wt, atfh-1 y as-AtFH. El tejido se homogenizó utilizando un mortero.
Posteriormente se agregó 2 ml de Na2HPO4 50 mM, pH 7.4 y se centrífugo a 11000 x
g, a 4ºC por 10 min. Al sobrenadante se le agregó 1 ml de glicina-HCl 50 mM, pH 2;
0.2 ml de HCl 4N; 0.2 ml de NaCl 5M y 1 ml de cloroformo acidificado (pH 1-2).
Se midió la concentración de hemina extraída en fase clorofórmica a través de un
método espectrofotométrico. Para ello, se determinó la absorbancia a tres longitudes
70
Materiales y Métodos
de onda, 388, 450 y 330 nm, y se obtuvo la absorbancia corregida (Lombardo et al.,
2005). Se utilizó una solución de hemina (Sigma , St. Lousi, USA) como Standard.
3.34.2. Medida de la actividad catalasa en hojas, flores y mitocondrias aisladas y
recuperación de la actividad catalasa por el agregado de hemina exógena.
Se partió de 170 mg de hojas o aproximadamente 50 mg de flores de A.
thaliana wt, plantas mutantes (atfh-1) y plantas transgénicas (as-AtFH) de 6
semanas, o una fracción de mitocondrias aisladas como se describió en la sección
3.30.1. El material vegetal fue triturado en N2 líquido para facilitar la ruptura del
mismo, posteriormente se homogenizó en relación 1:10 P/V con el buffer de
extracción (KH2PO4 50 mM, pH 7.8, Tritón X-100 0.5 % V/V, EDTA 0.5 mM) y se
le adicionó PMSF 1 mM como inhibidor de proteasas. Luego de centrifugar el
sobrenadante se utilizó para la determinación de la actividad catalasa, como se
describió previamente (Aebi, H, 1984). Se tomó 5 ȝl de muestra del sobrenadante
obtenido en la etapa anterior y se le adicionó 475 ȝl de buffer de determinación
(KH2PO4 50mM, pH 7), y 20 ȝl H2O2 10 mM-50 mM (Coeficiente de extinción 38
M-1.cm-1, debe estar a una absorbancia de 0.38 a 1.9). Cada uno de los tratamientos
se realizó por triplicado. La actividad catalasa se determinó como la disminución de
absorbancia a 240 nm debido al consumo de H2O2 a 25ºC.
La recuperación de la actividad catalasa se determinó luego de la incubación
de una suspensión de mitocondrias aisladas en presencia de hemina 50 μM por 1h
con agitación, a 25°C. El medio de reacción contenía 250 mM manitol, 50 mM KCl,
2 mM MgCl2, 20 mM HEPES pH 7.4, 1 mM K2HPO4, 1 mM DTT, 10 mM ATP, 20
μM ADP, 10 mM succinato de sodio, 50 μM hemina y 10 μl de suspensión de
mitocondrias (aprox 10 mg/ml de proteína total). Luego de la incubación, las
muestras se centrifugaron 20 min. a 3000 x g a 4ºC, se solubilizaron las mitocondrias
en buffer 20 mM K2HPO4 pH 7 y agitación con vortex y se determinó la actividad
catalasa en el sobrenadante.
71
Materiales y Métodos
3.35. Métodos bioinformáticos
Los niveles de ARNm obtenidos a partir de los experimentos de RT-PCR se
cuantificaron utilizando el programa Gel Pro Analyzer 3.1 (Media Cybernetics,
Silver Spring, MD, USA). Las secuencias de nucleótidos y proteínas fueron
analizadas usando los programas BLAST (Altschul y col., 1990; Altschul y col.,
1997).
72
Resultados y discusión
Capítulo I
Resultados y discusión
Capítulo I
La mayor parte de la investigación sobre frataxina ha sido llevada a cabo en
levaduras, bacterias y mamíferos (Babcock et al., 1997; Ristow et al., 2000). Esta
proteína fue inicialmente descripta en humanos, en pacientes portadores de una
enfermedad autosómica recesiva denominada Ataxia de Friedrich (Campuzano et al.,
1996; Schapira, 1998; Becker et al, 2001).
Como mencionamos anteriormente, la frataxina es una proteína mitocondrial
codificada en el núcleo. El gen codificante ha sido conservado en bacterias y animales
sin haber sufrido grandes cambios estructurales, hecho que sugiere una función
similar en todos los organismos (Huynen et al., 2001). Se ha propuesto su
participación en el ensamblado de centros Fe-S (Huynen et al., 2001), en la
homeostasis mitocondrial del hierro, metabolismo del hemo, fosforilación oxidativa
(Ristow et al., 2000) y estrés oxidativo (Park et al., 2002). La deficiencia de la misma
provoca un inadecuado influjo de hierro hacia la mitocondria, pérdida de síntesis de
ATP y una deficiencia en la defensa antioxidante, ocasionando una acumulación de
hierro mitocondrial y como consecuencia mayor daño oxidativo (Lill and Kispal,
2000; Park et al., 2002). Sin embargo, a pesar de tener asignadas múltiples funciones
en la mitocondria, su función específica queda aún por elucidarse.
Aunque su función parece ser indispensable en varios procesos celulares,
hasta hace siete años, no existía información sobre esta proteína en organismos
fotosintéticos, a excepción de la anotación de una secuencia relacionada en el banco
de datos del proyecto genoma de Arabidopsis thaliana. Fue en nuestro laboratorio
donde se identificó por primera vez el gen de frataxina de un organismo vegetal
(AtFH, homólogo de frataxina de A. thaliana) y su producto proteico (AtFH). La
expresión heteróloga de AtFH en una cepa de Saccharomyces cerevisiae, mutante
nula para la expresión de frataxina, permitió comprobar su funcionalidad a través de
la complementación del fenotipo (Busi et al., 2004).
74
Resultados y discusión
4.1. Caracterización de plantas de Arabidopsis thaliana deficientes en la
expresión de AtFH
4.1.1. Estructura del gen AtFH de Arabidopsis thaliana
La función de un gen puede estudiarse a partir de ensayos bioquímicos,
celulares o de desarrollo. Para confirmar la presencia y función de un gen, debe
recurrirse a la confirmación experimental, por ejemplo realizando supresión o
sobreexpresión del mismo. Esto nos permite asociar la secuencia génica a un fenotipo
a partir del cual puede deducirse el papel de dicho gen en el metabolismo o en el
desarrollo de un organismo (Bouchez et al., 1998).
El genoma de A. thaliana contiene un único locus (At4g03240) para el
homólogo de frataxina (Busi et al., 2004) y el mismo se encuentra en el cromosoma 4.
Estructuralmente está compuesto por cinco exones y cuatro intrones, originando un
ARNm de 564 pb, y que codifica una proteína de 187 aminoácidos de masa molecular
estimada de 14 kDa (Figura 12). El análisis bioinformático realizado con los
programas
PSORT
(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/)
y
MITOPROT
II
(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html) sobre la secuencia aminoacídica deducida de
AtFH, permitió identificar una corta secuencia de 31 aminoácidos que sugiere una
localización mitocondrial (Busi et al., 2004). Estos resultados están de acuerdo con la
localización descripta para la frataxina humana y de levaduras.
Primer
Fraten
5´UTR
Primer
Fra-Sma
Primer Fra 5 New
intrón
exón
Figura 12: Estructura del gen que codifica el homólogo de frataxina de Arabidopsis thaliana (AtFH).
AtFH está compuesto por 5 exones y 4 intrones. Las flechas corresponden a los sitios de unión de los
oligonucleótidos utilizados en los análisis moleculares. 5’UTR corresponde a la región 5’ no
traducida.
75
Resultados y discusión
4.1.2. Selección de plantas mutantes homocigotas de A. thaliana con inserción de
T-ADN en el gen AtFH
Solamente un pequeño porcentaje de proteínas codificadas en los genomas de
plantas y animales está suficientemente caracterizado respecto a su función celular. El
papel de muchas de estas proteínas permanece completamente desconocido
(aproximadamente 40%) o parcialmente comprendido (Gollery et al 2006, 2007;
Horan et al 2008).
A partir del conocimiento de la secuencia de ADN de diversos organismos
vegetales se generaron diferentes bases de datos que contienen información de un
gran número de genes. Sin embargo, en Arabidopsis thaliana todavía existe un grupo
de genes a los cuales no se les ha identificado su función (Goodman et al., 1995;
Cooke et al., 1996 ).
Las comparaciones de secuencia en busca de homología pueden utilizarse para
sugerir funciones similares en varios de los genes referidos, sin embargo, para poder
asociar un gen a un determinado fenotipo y a partir de ahí poder dilucidar su función
en el metabolismo o en el desarrollo de un organismo, se debe realizar la supresión o
sobreexpresión de su secuencia codificante (Martienssen, 1998). El silenciamiento de
genes vía la supresión sentido y antisentido ha sido un método bastante empleado
durante los últimos 20 años (Baulcombe, 2007). Sin embargo, este método requiere
que se generen para cada gen, varias líneas transgénicas independientes, debido a que
la supresión de genes esenciales podría llevar a un fenotipo letal.
En plantas, fue necesario desarrollar una técnica en la cual se pudiese insertar
una secuencia conocida dentro de su genoma para ocasionar la mutación (Figura 13).
La mutagénesis utilizando la inserción de trasposones y de T-ADN (porción del
plasmido Ti inductor de tumores), aporta varias ventajas como es el uso de genes
reporteros o genes marcadores de selección presentes en el plásmido que permiten
rápidamente la selección de los individuos mutantes (Fedoroff and Smith, 1993;
76
Resultados y discusión
Wilson et al., 1996). Esta técnica fue utilizada inicialmente para levaduras pero
actualmente se utiliza también en plantas y organismos animales (Hayes, 2003).
La técnica de mutagénesis insercional permitió obtener plantas de
Arabidopsis con genes knockout para más del 70% de su genoma (Alonso et al.,
2003). Una de las desventajas de esta técnica es que aún no se conoce el mecanismo
preciso de integración del T-ADN dentro del genoma de plantas (Iida and Terada,
2004).
Elemento insertado
Gen de interés
ATG
STOP
Figura 13: Mutagénesis por inserción. La inserción de un elemento móvil de ADN dentro de un gen
interrumpe la actividad del mismo a nivel transcripcional, a nivel de la traducción o ambos. Los
insertos pueden ser directamente elegidos para usar como marcadores de selección (por ejemplo,
confiriendo resistencia a kanamicina o Basta), por la secuencia de inserción (transposones o T-ADN).
La presencia de un gen o enhancer con un casete reportero permite que la expresión del gen en el sitio
de inserción pueda ser monitoreada.
A fin de identificar las posibles funciones del gen de frataxina en plantas
superiores, se obtuvieron del “Arabidopsis Biological Resourse Center” (ABRC) tres
líneas de plantas mutantes insercionales en el gen de AtFH: SALK_ 021263,
SALK_094203 y SALK_ 122008. Estas líneas se denominaron como atfh-1, atfh-2 y
atfh-3, respectivamente. La línea atfh-1 tiene la inserción del T-DNA en la región no
traducida (5´UTR) por delante del codón ATG de iniciación de la traducción (Figura
14A), de acuerdo con el sitio de inserción predicho por secuenciación
(http://www.arabidopsis.org). Las otras dos líneas mutantes, atfh-2 y atfh-3 tienen la
inserción en el primer intrón y cuarto exón, respectivamente (Figura 14B y C).
77
Resultados y discusión
(A)
intrón
T-DNA
exón
5´UTR
(B)
5´UTR
T-DNA
intrón
exón
(C)
5´UTR
intrón
exón
T-DNA
Figura 14: Esquema de la estructura del gen AtFH de plantas atfh-1 (SALK_021263) (A); líneas atfh-2
(SALK_094203) (B) y plantas atfh-3 (SALK_122008) (C). En cada una de las líneas se muestra en
gris claro la inserción del T-ADN: región 5’UTR (en las líneas atfh-1); 1er. intrón (líneas atfh-2) y 4to.
exón (líneas atfh-3).
La ubicación del inserto en el gen AtFH en las diferentes líneas fue
comprobada por análisis de PCR con oligonucleótidos específicos para los sitios
flanqueantes al lugar de inserción del T-ADN (primer 5’ Fraten, Fra 5 New y 3’
FraSma) (Figura 13 y 15).
Las plantas mutantes homocigotas atfh-1 fueron identificadas fácilmente
(Figura 15A). Utilizando los primers Fraten y FraSma se obtuvo la amplificación de
una banda de ADN de aproximadamente 1740 pb en las plantas wt, mientras que en
78
Resultados y discusión
las plantas atfh-1 no se obtuvo ninguna amplificación. La presencia de una banda de
ADN de 1086 pb luego de la amplificación utilizando los primers Fra5New y FraSma
en las plantas wt como en la línea atfh-1 nos permitió corroborar que la inserción del
T-ADN se encuentra en la región 5’UTR del gen AtFH (Figura 15A).
En contraste con estos resultados, no pudimos obtener plantas homocigotas
para las líneas atfh-2 y atfh-3 (Figura 15B). Para comprobar si estas dos líneas
efectivamente contenían la inserción de T-ADN en su genoma, se realizó un análisis
por PCR utilizando primers específicos para amplificar el gen de NPTII (de
resistencia a Kanamicina) perteneciente a la secuencia del T-ADN. Los resultados en
ambas líneas mostraron la amplificación de un producto de PCR del tamaño esperado
(710 pb), confirmando que todas las plantas analizadas eran mutantes insercionales de
T-ADN (Figura 15C). La presencia del producto de amplificación del gen AtFH y de
NPTII, sugiere que solo uno de los alelos del gen AtFH se encuentra interrumpido por
el T-ADN en el genoma de las líneas analizadas. Los resultados obtenidos indican
que las plantas atfh-2 y atfh-3 son heterocigotas para el gen de AtFH.
79
Resultados y discusión
(A)
Fraten
Fra Sma
Fra5 New
Fra Sma
1086bp
1740bp
wt
atfh-1
wt
(B)
atfh-1
(C)
Fra5 New
Fra Sma
NPTII up
NPTII down
710 pb
1086 pb
1
atfh-2
2
atfh-2
3
atfh-2
1
atfh-2
wt
2
atfh-2
3
atfh-2
wt
710 pb
1086 pb
1
atfh-3
2
atfh-3
3
atfh-3
wt
1
atfh-3
2
atfh-3
3
atfh-3
wt
Figura 15: (A) Análisis de los productos de amplificación por PCR sobre el ADN de la línea mutante
atfh-1, utilizando los primers Fraten/FraSma (panel izquierdo) y Fra5New/FraSma (Panel derecho).
(B) Análisis por PCR de los productos de amplificación sobre ADN de las líneas mutantes atfh-2 y
atfh-3 (plantas 1-3), usando los primers Fra5New/FraSma y (C) utilizando los primers NPTII up/down.
El tamaño del ADN amplificado está indicado en cada figura.
4.1.3. Construcción de líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan
AtFH en orientación antisentido y sentido
Con el objeto de obtener otra línea de plantas con expresión disminuida de
AtFH construimos una línea transgénica que expresa el transcripto en orientación
antisentido (denominada as-AtFH). Además, a fin de sobreexpresar el gen de AtFH
generamos otra línea con el gen en orientación sentido (denominada s-AtFH).
A partir del ADNc de AtFH, se realizaron las reacciones de PCR con
cebadores específicos conteniendo sitios para las enzimas de restricción BamHI y
XhoI para la construcción sentido, y SmaI y BamHI para la antisentido (ambos
fragmentos de 564bp). Estos fragmentos fueron clonados en el vector pDH51 (Figura
80
Resultados y discusión
16A) dentro de un casete que contiene al promotor y terminador CaMV35S,
generando así los vectores pDH51-as-AtFH y pDH51-s-AtFH (Figura 16 B y C,
respectivamente).
Los casetes de expresión CaMV35S-as-AtFH y CaMV35S-s-AtFH obtenidos
de esta última construcción fueron subclonados en el vector pCAMBIA 1302 entre los
sitios EcoRI, obteniéndose de esta manera los vectores pCAMBIA-as-AtFH y
pCAMBIA-s-AtFH (Figura 16 D). Ambos vectores se utilizaron para la
transformación de plantas wt mediante la técnica de floral dip (ver Materiales y
Métodos), utilizando Agrobacterium tumefaciens (Clough et al., 1998).
(A)
KpnI SmaI BamHI XbaI lI Sal I Pst I Sph I
(B)
as- AtFH
Sma I Sma I
Bam HI
BamH I
(C)
s- AtFH
BamH I BamH I
Xho Sal I
81
Resultados y discusión
(D)
SMC
NPTII
CaMV35S
pCAMBIA 1302
Eco RI
Eco RI
CaMV35S
as-AtFH
Eco RI
Eco RI
CaMV35S
Casete CaV35S-as-AtFH
t- CaMV35S
s-AtFH
t- CaMV35S
Casete CaV35S-s-AtFH
Figura 16: (A) Esquema de la región del plásmido pDH51 conteniendo el promotor CaMV35S, el sitio
de múltiple clonado y el sitio terminador t-CAMV35S. (B) y (C) Esquema del vector plasmídico
pDH51 conteniendo la secuencia correspondiente a as-AtFH y s-AtFH, respectivamente. Plac : promotor
lac de pUC18. Cajas “CAT” y “TATA” en la región promotora de la unidad de expresión están
marcadas por la secuencia original CAAT y TATATAA y la secuencia señal de poliadenilación por
AATAAA. Las flechas marcadas (ARN) muestran el sitio de inicio de la transcripción. SMC: sitio de
múltiple clonado derivado de pUC18. (D) Esquema del vector pCAMBIA-as-AtFH y pCAMBIA-sAtFH. NPTII gen de resistencia a kanamicina.
Las plantas transgénicas de Arabidopsis que contenían la construcción asAtFH o s-AtFH se seleccionaron por crecimiento en medio solido MS- higromicina
(antibiótico para la selección de plantas). De esta forma, se pudo obtener otra línea de
plantas independiente (as-AtFH) que junto a la línea homocigota atfh-1 nos
permitirán realizar experimentos de pérdida de función. La línea s-AtFH, será
necesaria como prueba positiva de las funciones del gen y complementa los
experimentos de pérdida de función.
4.1.4. Efecto de la deficiencia de AtFH en plantas de Arabidopsis
4.1.4.1. Análisis fenotípico de plantas de Arabidopsis deficientes en la expresión
de AtFH
Nuestro conocimiento de la biología básica de las plantas y la habilidad para
manipularlas genéticamente, dependen de la investigación sobre el desarrollo, la
genética y los procesos metabólicos fundamentales de estos organismos. Uno de los
mayores desafíos en la biología molecular de plantas es el aislamiento e identificación
82
Resultados y discusión
de genes de los cuales no se conocen las funciones bioquímicas (Goodman et al.,
1995).
Desde hace unos años, Arabidopsis thaliana, ha ganado popularidad como
sistema modelo para el estudio de la biología de plantas, debido a que posee un ciclo
de crecimiento rápido, relativamente bajo contenido de repeticiones de DNA, un
genoma chico, y es una planta de un tamaño pequeño (Meyerowitz, 1987, 1994).
En primer lugar, con el objeto de determinar si existe expresión de ARNm de
AtFH en las plantas atfh-1 y as-AtFH, se realizó una reacción RT-PCR con cebadores
específicos sobre ARN total extraído de hojas de ambas líneas y se comparó con la
línea wt. Los resultados mostraron una disminución en la expresión del AtFH de
aproximadamente un 70% en las plantas atfh-1 y as-AtFH (Figura 17A). Estos
resultados indican que en la línea atfh-1, la inserción del T-ADN en la región 5’UTR
del gen AtFH no bloquea la expresión del mismo, pero sí reduce significativamente su
transcripción. Así, la línea atfh-1 no es una mutante nula para la expresión de AtFH,
sino que es una mutante deficiente (knockdown).
Los niveles proteicos de AtFH se determinaron mediante análisis por western
blot y revelado con anticuerpos específicos anti-AtFH (ver Materiales y Métodos
Sección 3.17). Los resultados muestran una disminución de aproximadamente un
50% en los niveles de proteína AtFH tanto en extractos provenientes de mitocondrias
de plantas atfh-1 (Figura 17B) como en extractos totales provenientes de hojas de
plantas atfh-1 y as-AtFH (Figura 17C).
83
Resultados y discusión
(A)
wt
atfh-1
wt
as-AtFH
AtFH
AtFH
ȕ-ACTINA
18 S
(B)
(C)
wt
atfh-1
as-AtFH
kDa
17
AtFH
Figura 17: (A) Análisis por RT-PCR de la expresión del gen de AtFH en plantas atfh-1 (panel
izquierdo) y as-AtFH (panel derecho). El RNA total fue obtenido de hojas de plantas de A. thaliana
de 22 días. La expresión del gen ARNr 18S y ȕ-ACTINA fueron utilizados como control interno. (B)
Análisis de western blot de la proteína AtFH de extractos mitocondriales de plantas wt y mutantes atfh1 usando anticuerpos anti-AtFH recombinante de A. thaliana. (C) Análisis por western blot de los
niveles de proteína AtFH en extractos de hojas de roseta de plantas wt, atfh-1 y as-AtFH.
Las plantas deficientes en AtFH mostraron un retardo en el crecimiento en las
distintas etapas del desarrollo. Sin embargo, no se observaron diferencias
significativas en la morfología de raíces, tallos, hojas y flores (Figura 18).
84
Resultados y discusión
wt
atfh-1
a
wt
as-AtFH
atfh-1
as-AtFH
c
b
Figura 18: Análisis fenotípico de plantas de A. thaliana deficientes en la expresión de AtFH, atfh-1 y
as-AtFH comparadas con la línea tipo salvaje (wt). (a) Plantas de 14 días crecidas en medio MS; (b)
Plantas de 21 días; (c) Plantas de 45 días.
En cuanto al desarrollo reproductivo, las plantas atfh-1 y as-AtFH mostraron
alteraciones significativas en la morfología de silicuas y semillas. Se observó una
disminución en el peso fresco de las silicuas de alrededor de 30% y 60% para atfh-1 y
as-AtFH respecto a la wt. Ambas líneas deficientes también presentaron un menor
número de semillas por silicua, 32 ± 5 en las plantas atfh-1 y 19 ± 7 en la línea asAtFH, mientras que las plantas wt mostraron alrededor de 45 ± 6 semillas por silicua
(Figura 19).
wt
atfh-1
as-AtFH
Figura 19: Morfología de las silicuas de plantas de A. thaliana wt, atfh-1 y as-AtFH de 60 días.
Estos resultados están de acuerdo con los descriptos previamente por
nuestro laboratorio, en donde se informó que los niveles de expresión de AtFH se
encuentran inducidos entre 3 a 4 veces en órganos reproductivos (Busi et al., 2004).
85
Resultados y discusión
Es importante mencionar que los órganos reproductivos de organismos vegetales
tienen una alta demanda energética y que dependen de la correcta función
mitocondrial. Cabe destacar que la mitocondria tiene un papel central en procesos de
alto requerimiento energético como la esporogénesis y la maduración del polen y en
procesos como la floración y fructificación (Brennicke et al., 1999). Los resultados
obtenidos también concuerdan con el aumento en los niveles de ARNm de frataxina
observado en tejidos de alta demanda energética de mamíferos, como el hígado,
riñón, tejido adiposo y células cardíacas (Koutnikova et al., 1997).
Nuestros resultados revelan además que la mutación en la región 5’UTR del
gen AtFH correlaciona con una deficiencia en el proceso de fructificación y
formación de semillas. A partir de los datos mencionados, y teniendo en cuenta que
frataxina es una proteína mitocondrial, se puede inferir que la deficiencia de AtFH
podría causar un desequilibrio energético, provocando una disfunción mitocondrial
que afectaría algunos procesos de alta demanda energética, como lo es la
fructificación en plantas. Esto avalaría una de las posibles funciones postuladas para
frataxina, que es su participación en el metabolismo energético mitocondrial.
4.1.5. Análisis fenotípico de las líneas mutantes atfh-2 y atfh-3
Como mencionamos previamente, no se pudieron aislar plantas
homocigotas de las líneas atfh-2 y atfh-3. El análisis fenotípico de las silicuas de las
plantas heterocigotas reveló la existencia de aproximadamente un 25% de óvulos
abortados distribuidos a lo largo de la silicua (Figura 20). Por otro lado el genotipo de
las plantas provenientes de semillas viables no es significativamente diferente a la
relación 2:1 (plantas resistentes: plantas sensibles a kanamicina). Estos resultados
sugieren que la disrupción de AtFH resultaría en una letalidad a nivel del cigoto o
embrión. Este resultado coincide con la letalidad embrionaria informada en ratones
knockout que presentaban
una deleción en el cuarto exón del gen de frataxina
(Cossée et al., 1999).
86
Resultados y discusión
wt
atfh-2
atfh-3
Figura 20. Silicuas inmaduras de plantas wt y plantas heterocigotas atfh-2 y atfh- 3. Las flechas
indican los óvulos abortados en el estado de cotiledón durante el desarrollo embrionario.
Estudios posteriores llevados a cabo en plantas de A. thaliana (mutantes S594203 y S-622008), que contienen la inserción de T-ADN en la región codificante
de AtFH, en el 2º intrón y 4º intrón respectivamente, revelaron que la deleción de
este gen causa la detención del desarrollo del embrión en el estadio globular (4 días
post polinización) (Vazzola et al., 2007). Estos datos, junto con la variación de los
niveles de expresión de AtFH a lo largo del crecimiento y desarrollo del embrión,
permiten sugerir además que AtFH cumple un papel importante durante la
embriogénesis. A partir de los datos obtenidos, podemos postular que AtFH es una
proteína esencial en plantas, cuya función es fundamental en procesos de alto
requerimiento energético como la embriogénesis, floración y fructificación.
4.1.6. Caracterización de las plantas de Arabidopsis thaliana que expresan el gen
AtFH en orientación sentido (s-AtFH)
4.1.6.1. Fenotipo de plantas transgénicas s-AtFH
El análisis fenotípico de las plantas s-AtFH reveló un retardo marcado en el
crecimiento respecto a las líneas wt en distintas etapas del desarrollo vegetativo
87
Resultados y discusión
(Figura 21 A). Este retardo en el crecimiento fue más evidente que el observado para
las líneas deficientes atfh-1 y as-AtFH (Figura 21 B). Además, luego de 15 días de
vida, las plantas s-AtFH mostraron un aspecto clorótico, no pudiendo sobrevivir más
allá de los 20 días. Estos resultados fueron llamativamente diferentes a los observados
para las líneas deficientes ya que a pesar de tener un crecimiento más retrasado
respecto a las wt, éstas alcanzan el estadio adulto y la etapa reproductiva.
(A)
(B)
wt
wt
atfh-1
as-AtFH
s-AtFH
s-AtFH
Figura 21: (A) Fenotipo de plantas wt y s-AtFH luego de 20 días de crecimiento.
(B) Comparación del fenotipo de plantas wt, atfh-1, as-AtFH y s-AtFH luego de 20 días de
crecimiento.
Luego del análisis fenotípico, se llevó a cabo la determinación de los niveles
de transcripción de AtFH por PCR en tiempo real (Figura 22A). El análisis de AtFH
en plantas de 5, 10, 15 y 20 días reveló una disminución progresiva en sus niveles de
expresión, lo que sugiere la existencia de algún mecanismo de represión a nivel
transcripcional . Por otra parte, los niveles de proteína AtFH analizados por western
blot mostraron una disminución de aproximadamente 30% (Figura 22B).
88
Resultados y discusión
(A)
(B)
wt
s-AtFH
AtFH
Figura 22: (A) Análisis por PCR en tiempo real de la expresión de AtFH (endógeno) en plantas wt
(barras blancas) y s-AtFH (barras negras) de 5, 10, 15 y 20 días. (B) Análisis por western blot de los
niveles de AtFH en extractos de hojas de plantas wt y s-AtFH de 10 días.
Los resultados obtenidos muestran que no hubo sobreexpresión de AtFH en
las plantas s-AtFH. En contraste, se observó una disminución en los niveles de AtFH
endógeno, con una disminución de la cantidad de proteína al igual que las líneas atfh1 y as-AtFH. Sin embargo, el fenotipo de la línea s-AtFH fue más marcado que las
líneas deficientes en AtFH, ya que las plantas tuvieron una sobrevida de no más de 20
días.
El silenciamiento de genes por ARN (“RNA silencing”) se refiere
colectivamente a diversos eventos basados en el procesamiento del ARN que resultan
en una inhibición secuencia específica de la expresión génica, ya sea a nivel
transcripcional, de la estabilidad del ARNm o de la traducción. Estos procesos cursan
a través de tres eventos bioquímicos característicos: la formación de dobles hebras de
89
Resultados y discusión
ARN (dsARN), el procesamiento de ellas generando pequeñas unidades de dsARN de
20 – 26 nucleótidos con extremos cohesivos (“staggered”) y la acción inhibitoria de
ARN simple hebra seleccionadas que actúan interfiriendo la complementariedad de
forma parcial o total entre ARN y ADN (Brodersen and Voinnet, 2006).
El
silenciamiento generado por ARN exógenos provoca la ruptura de los transcriptos,
posterior a la formación de dsARN. El silenciamiento post-transcripcional (PTGS)
fue descubierto en plantas transgénicas de Petunia y se evidenció como una pérdida
de la expresión de ambos transgenes, ya sea en orientación sentido o antisentido,
como así también de la del gen endógeno homólogo (Napoli et al., 1990 ). A la vista
de los resultados obtenidos con las plantas s-AtFH, podemos sugerir la existencia de
un mecanismo de silenciamiento ante la expresión del transgen en orientación
sentido, generando la menor expresión de AtFH endógeno y menor cantidad de
proteína, efecto contrario al buscado.
90
Capítulo II
Resultados y discusión
Capítulo II:
En los últimos años se han realizado numerosos trabajos basados en modelos
animales y de levaduras que mostraban deficiencia en la expresión de frataxina (Rötig et
al., 2002). De esta forma, a partir de estudios in vivo se sugirió que frataxina es
requerida para la homeostasis del hierro, producción de proteínas Fe-S, fosforilación
oxidativa y protección contra agentes oxidantes (Rötig et al., 2002). Sin embargo, son
pocos los estudios bioquímicos sobre la caracterización de esta proteína. La alta
similitud secuencial y estructural de frataxinas de diversos orígenes permite sugerir que
cumpliría la misma función en todos los organismos. Recientemente, Park y col.
describieron que la frataxina recombinante de levaduras (YFH) posee actividad
Ferrooxidasa (Park et al., 2002). Se informó además que YFH y la frataxina humana se
ensamblan en un oligómero de aproximadamente 840 kDa que acumula hierro en forma
soluble. A partir de estos datos se postuló que la frataxina sería una chaperona de Fe2+
(O'Neill et al., 2005). Sin embargo, no está claro el papel que cumpliría esta proteína en
la protección al daño oxidativo causado por metales.
Para tener un mayor conocimiento acerca de la actividad biológica de frataxina,
es necesario llevar a cabo también la caracterización bioquímica de la proteína. Para ello,
hemos desarrollado un método eficiente para la producción de AtFH recombinante de
Arabidopsis thaliana.
5.1. Clonado, expresión y purificación de AtFH recombinante
El ADNc de AtFH se obtuvo por RT-PCR utilizando cebadores específicos, como
se detalla en Materiales y Métodos. El ADNc fue digerido con enzimas de restricción y
clonado en el vector pET24a, generando el plásmido pATF01 que codifica para AtFH
fusionada a un fragmento de 6 histidinas (AtFH-His6). Así, el vector pATF01 se utilizó
para la transformación de diferentes cepas de E. coli.
92
Resultados y discusión
La expresión de proteínas funcionales en células heterólogas, es el principio
básico de la biotecnología moderna. Desafortunadamente, muchas proteínas son
dificultosas para ser expresadas fuera de su contexto original (Gustafsson et al., 2004).
La expresión de proteínas recombinantes en células de E. coli es el sistema más
ampliamente usado para la obtención de proteínas heterólogas debido a su alta tasa de
crecimiento, capacidad para el cultivo continuo, bajo costo y amplia caracterización
(Swartz, 2001).
Con el objeto de determinar el huésped adecuado para la expresión de AtFH-His6
se transformaron dos tipos de células competentes de E. coli: BL21 (DE3)-RIL y BL21
(DE3). Las células BL21 (DE3)-RIL, llamadas también Codon-plus, contienen copias
extras de genes que codifican para los ARNst argU, ileY y leuW. Estos ARNst tienen la
capacidad de reconocer los codones raros AGA/AGG (arginina), AUA (isoleucina), y
CUA (leucina), respectivamente, representados con baja frecuencia en las células de E.
coli. La utilidad de esta cepa radica en que se ha reportado que la presencia de codones
raros en la construcción recombinante tiene una influencia significativa en los niveles de
expresión, afectando la cantidad y calidad de las proteínas producidas en el huésped (Yan
et al., 2004 ; Gustafsson et al., 2004).
En las células BL21 (DE3)-RIL se detectó una proteína de masa molecular
aparente de 15 kDa, de acuerdo con la masa molecular esperada para AtFH-His6,
mientras que no se detectaron niveles de expresión significativos de la proteína
recombinante en la cepa BL21 (DE3) (Figura 23). Esto puede deberse a que el mRNA de
AtFH contiene 12 codones raros (2AGG, 2 CUA, 4 AGA, y 4 AUA). De esta forma, la
presencia de los ARNst adicionales en la cepa BL21 (DE3)-RIL podría ser responsable
de los altos niveles de expresión de AtFH.
93
Resultados y discusión
Figura 23. Análisis de la expresión de AtFH recombinante en células BL21 (DE3) (A) y BL21 (DE3)-RIL
(B). Las proteínas solubles totales fueron corridas en un gel de SDS-PAGE y reveladas por tinción con
Coomasie blue. Fila 1, proteínas bacterianas antes de la inducción con IPTG; filas 2, 3 y 4, corresponden a
proteínas bacterianas luego de 3, 6 y 18 hs. de la inducción con IPTG; fila 5, marcado de peso molecular.
El análisis densitométrico usando el programa Gel Pro analyzer reveló que los
niveles de expresión de AtFH en las células BL21 (DE3)-RIL fue de aproximadamente
un 22 % de la proteína celular total (Figura 23B).
El procedimiento de aislamiento de AtFH-His6, se llevó a cabo mediante la
purificación en un paso, usando columnas de afinidad comerciales, HiTrap Chelating HP
column, equilibradas con 0.1 M NiSO4. La proteína se eluyó utilizando un gradiente de
Imidazol 20 – 500 mM. El análisis por SDS-PAGE de las diferentes fracciones eluidas de
la columna cromatográfica reveló la presencia de una única banda proteica de 15 kDa en
el rango 200-250 mM de imidazol (Figura 24A). A partir de 500 ml de medio de cultivo
se obtuvieron aproximadamente 1.5 g de células de E. coli y 3.2 mg de la proteína
recombinante purificada. La presencia de AtFH-His6 se comprobó mediante análisis por
western blot utilizando anticuerpos tetra-His comerciales, que reaccionan contra el tag de
histidinas C-terminal de la proteína (Figura 24B). Utilizando este procedimiento de
cromatografía en un solo paso, hemos logrado purificar el homólogo de frataxina en
Arabidopsis con alto rendimiento y sin productos de degradación.
94
Resultados y discusión
Figura 24. (A) Análisis por SDS-PAGE de las fracciones eluidas de la cromatografía en columna de Ni++.
Los números en la parte superior de la figura indican la concentración de imidazol de cada una de las
fracciones. (B) Análisis por western blot de la fracción eluida a 200 mM de imidazol usando anticuerpos
anti-His6.. Los números indican la masa molecular de las proteínas marcadoras utilizadas.
5.3. Atenuación de la reacción de Fenton por AtFH
Para analizar la funcionalidad de la proteína recombinante AtFH producida en
bacterias decidimos evaluar su capacidad para atenuar la reacción de Fenton. Como se
sugirió previamente, frataxina podría funcionar como chaperona de hierro y de esta
forma, su presencia podría atenuar el daño oxidativo por metales. Así, se llevó a cabo el
ensayo de atenuación midiendo la inhibición de la producción de malondialdehído luego
de la adición de ácido tiobarbitúrico como se describió previamente (Park et al., 2002).
En la Tabla 3 se muestra que en presencia de AtFH-His6 recombinante la producción de
malondialdehído disminuye aproximadamente un 55 % respecto al control en ausencia de
AtFH. Los controles que se utilizaron fueron analizados y procesados de igual manera
que la muestra incógnita. La concentración de proteína que se utilizó en este experimento
estaba en exceso respecto al Fe y H2O2 (en ambos casos relación 2:1).
Con este resultado, se evaluó la posibilidad que la disminución en la producción
de malondialdehído se deba a que la proteína recombinante secuestrara el Fe a través del
95
Resultados y discusión
tag de histidinas y de esta manera atenuara la reacción de Fenton. Para descartar esta
hipótesis, se expresó AtFH recombinante con codón de terminación (AtFH-STOP) en
células BL21 (DE3)-RIL, y se purificó usando cromatografía de DEAE-sepharose y
columna de intercambio iónico Mono-Q, seguida de filtración en gel (Superose 12).
Bajo estas condiciones, se obtuvo la proteína ATFH-STOP con una pureza de un 95%
estimada por electroforesis de SDS-PAGE (Figura 25).
1
2
3
kDa
-48
-24
-18
-14
Figura 25: Análisis por SDS-PAGE de la proteína AtFH-stop. Las calles 1, 2 y 3 indican distintas
fracciones de elución de la columna Superose12. Los números en la columna derecha indican la masa
molecular (kDa) de los marcadores utilizados.
De esta manera, utilizando estos tres pasos cromatográficos se obtuvieron 0.2 mg
de AtFH-stop por litro de medio de cultivo, de la proteína purificada a partir de
aproximadamente, 3 g de células.
Cuando la proteína AtFH-STOP purificada se adicionó al medio de reacción, la
producción de malondialdehído se inhibió aproximadamente dos veces como se había
visto para el caso de la proteína recombinante AtFH- His6 (Tabla3). Esto indicó que la
presencia de la secuencia de fusión a histidina no tuvo ningún efecto sobre la reacción de
atenuación.
96
Resultados y discusión
Tabla 3: Degradación oxidativa de 2- deoxíribosa a malondialdehído
Condición a
MDA (nmol)
dRibosa + Fe(II)
0.093 +/- 0.018
dRibosa + Fe(II) + AtFH- His6
0.078 +/- 0.012
dRibosa + Fe (II) + AtFH-stop
0.062 +/- 0.008
dRibosa + Fe(II) + H2O2
0.365 +/- 0.042
dRibosa + Fe(II) + H2O2 + AtFH- His6
0.171 +/- 0.031
dRibosa + Fe(II) + H2O2 + AtFH-stop
0.152 +/- 0.020
dRibosa + H2O2
0.031 +/- 0.005
a
La mezcla de reacción se incubó en presencia o ausencia de frataxina recombinante fusionada a histidina
(AtFH-His6) o con codón de terminación (AtFH-STOP)
Por lo tanto la proteína AtFH-His6 no solamente es útil para el procedimiento de
purificación en un solo paso, sino también para ser utilizada en estudios funcionales sin
necesidad de cortar el péptido de fusión His6.
Los resultados obtenidos indican que AtFH es una proteína funcional, con
capacidad de atenuar la reacción de Fenton in vitro. A partir de estos datos, podemos
postular que AtFH estaría involucrada en la homeostasis de Fe, la protección contra el
daño oxidativo por metales y en el mantenimiento del estado redox celular.
97
Capítulo III
Resultados y discusión
Capítulo III:
En las mitocondrias se llevan a cabo procesos fundamentales para la vida
celular, como la respiración a través de la cadena de transporte de electrones de la
membrana interna, que genera el gradiente electroquímico necesario para la
producción de ATP (fosforilación oxidativa) y la oxidación de ácidos tricarboxílicos
o ciclo de Krebs.
Tres de los cuatro complejos respiratorios mitocondriales, CI, CIII y CIV,
están formados por proteínas codificadas en el genoma nuclear y mitocondrial, a
diferencia del CII que es el único que posee todas sus subunidades codificadas en el
núcleo (Scheffler, 1998; Figueroa et al., 2001; Heazlewood et al., 2003; Millar et al.,
2004). Para el correcto ensamblado de estos complejos multiproteicos, la expresión
de los respectivos genes nucleares y mitocondriales debe estar finamente regulada
(Brennicke et al., 1999). Parte de este control y la responsabilidad ante demandas
energéticas específicas son llevadas a cabo a nivel transcripcional.
El complejo I de la cadena respiratoria (CI, NADH:ubiquinona oxidoreductasa) tiene como función, transferir electrones desde el NADH generado en la
matriz hacia la ubiquinona a través de los centros redox (FMN y centros Fe-S). En
este proceso, los protones son translocados a través de la membrana interna para
generar la fuerza protón-motriz necesaria para la síntesis de ATP. Esta es una función
importante dentro de la mitocondria, ya que sirve para mantener los niveles normales
de tasa respiratoria y para una producción de ATP eficiente durante el desarrollo de la
planta (Rasmusson et al., 1998).
De las 30 subunidades que componen el CI en Arabidospsis, 17 se encuentran
codificadas en el genoma nuclear, y luego son traducidas en el citoplasma e
importadas hacia la mitocondria, y otras 4 subunidades están codificadas a nivel del
genoma mitocondrial (Heazlewood et al., 2003 ). Además, el CI posee una subunidad
que une un grupo flavin mononucleótido y 5 ferrosulfoproteínas que en combinación
resultan en un total de 8 centros Fe-S (Heazlewood et al., 2003 ).
99
Resultados y discusión
Como describimos previamente, se creó en el laboratorio un modelo de
disfunción mitocondrial basado en la utilización de líneas con deficiencia en la
subunidad 9 de la ATP sintasa mitocondrial (u-ATP9) (Gómez-Casati et al., 2002;
Busi et al., 2006). Utilizando este modelo, se informó la inducción de tres genes
nucleares que codifican proteínas Fe-S mitocondriales del CI, PSST, TYKY y
NADHbp, además del aumento en los niveles de expresión de AtFH (Gómez-Casati
et al., 2002); (Busi et al., 2004).
Diversos trabajos han descripto la utilización de mutantes e inhibidores del
CI y la deficiencia de distintas subunidades de este complejo ha sido asociado a
disfunción mitocondrial (Duarte and Videira, 2000; Noctor et al., 2004; Garmier et
al., 2008a). Asimismo, se informó que la deficiencia de frataxina provoca una pérdida
de la función mitocondrial en células de mamíferos (fibroblastos, células neuronales),
levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y nematodos (Caenorhabditis elegans)
(Schapira, 2000; Pandolfo, 2002; Rea et al., 2007). Recientemente se resolvió la
estructura cristalina del dominio hidrofílico del CI de Thermus thermophilus
(Sazanov and Hinchliffe, 2006). Los resultados mostraron la presencia de 9 centros
Fe-S y una subunidad nueva llamada Nqo15, de estructura similar a frataxina. A
partir de estos datos se ha propuesto que Nqo15 estaría involucrada en la reparación
de los grupos Fe-S del CI. Si bien no se describió que frataxina forme parte del CI en
otros organismos, recientemente se describió que en E. coli, el homólogo de frataxina
(CyaY) no es un componente estructural del CI pero interactúa de forma transitoria
con el mismo (Pohl et al., 2007). Además se determinó que en células mutantes de E.
coli con deficiencia en CyaY la cantidad de proteína correspondiente al CI está
disminuída en un 70%.
Estos resultados están de acuerdo con la posible función de frataxina en la
biogénesis de proteínas Fe-S, sin embargo, son escasos los trabajos sobre la posible
asociación de frataxina con el CI o el efecto de la deficiencia de frataxina sobre el
mismo en organismos eucariotas. A partir de lo expuesto, decidimos investigar el
efecto de la deficiencia de AtFH sobre el CI en plantas de Arabidopsis.
100
Resultados y discusión
6.1. Efecto de la deficiencia de AtFH sobre la función mitocondrial en
Arabidopsis thaliana
A fin de evaluar el estado energético en las plantas de Arabidopsis
deficientes en AtFH, se decidió medir los niveles de ATP y el consumo de oxígeno
en hojas y flores de plantas atfh-1 y as-AtFH. Encontramos una disminución marcada
del contenido de ATP total en ambos tejidos. Las plantas atfh-1 mostraron un
descenso en los niveles de ATP de aproximadamente 32 % en hojas y flores; mientras
que la línea as-AtFH mostró niveles 46% y 50% menores también en hojas y flores,
respectivamente, respecto a la línea wt (Figura 26).
(A)
(B)
Figura 26. Determinación de niveles de ATP en hojas (A) y flores (B) de plantas wt, atfh-1 y as-AtFH
de Arabidopsis. PF: peso fresco. El contenido de ATP total se determinó por bioluminiscencia.
101
Resultados y discusión
Se determinó además la tasa respiratoria de las plantas atfh-1 y as-AtFH.
Los resultados mostraron un descenso de 28% y 26% en el consumo de oxígeno en
hojas de plantas atfh-1 y as-AtFH, respectivamente (Figura 27A), mientras que se
observó una disminución de aproximadamente 40% en el consumo de oxígeno en
flores de ambas líneas deficientes (Figura 27B). Estos datos se correlacionan con los
menores niveles de ATP total observados.
(A)
(B)
Figura 27. Determinación del consumo de O2 (ȝmol O2. min-1. g-1 PS) en hojas (A) y flores (B) de
plantas wt, atfh-1 y as-AtFH.
102
Resultados y discusión
En conjunto, la menor tasa respiratoria y la disminución en los niveles de
ATP en las plantas atfh-1 y as-AtFH, sugieren que la deficiencia de AtFH lleva a una
disfunción mitocondrial. Estos datos están de acuerdo con las alteraciones
morfológicas observadas en ambas líneas en los órganos reproductivos, que son
dependientes de la correcta función de la mitocondria. Nuestros datos coinciden con
lo descripto para pacientes o modelos celulares de Ataxia de Friedreich, que exhiben
bajos niveles de ATP en distintos tipos de células (musculares y hepáticas) (Ristow et
al., 2000; Thierbach et al., 2005; Koutnikova et al., 1997; Wilson and Roof, 1997).
Los resultados obtenidos refuerzan lo postulado previamente, sobre la
posible función de frataxina como activadora de la conversión energética y la
fosforilación oxidativa (Ristow et al., 2000). Estudios realizados en mutantes en
frataxina de Saccharomyces cerevisiae y Caenorhabditis elegans permitieron asociar
la deficiencia de esta proteína a una disminución en la respiración celular (Babcock et
al., 1997; Zarse et al., 2007); mientras que trabajos realizados en líneas
sobreexpresantes de frataxina, han demostrado que actúa como un activador de la
fosforilación oxidativa, provocando un aumento en el potencial de membrana
mitocondrial y un aumento en el contenido celular de ATP (Ristow et al., 2000). En
nuestro laboratorio, se comprobó la recuperación de la tasa respiratoria en mutantes
nulas ¨yfh de Saccharomyces cerevisiae cuando se complementaron con el gen AtFH,
lo que sugiere un aumento en la actividad de la cadena de transporte de electrones
generada por esta proteína (Busi et al., 2004).
La disfunción mitocondrial en las líneas de Arabidopsis deficientes en AtFH,
representada por la baja tasa respiratoria y bajos niveles de ATP, podría deberse a una
alteración en la actividad de los complejos respiratorios que contienen grupos Fe-S
(CI, CII y CIII), ya que una de las posibles funciones de frataxina es su participación
en la biogénesis de estos grupos (Chen et al., 2002). Esto avalaría la participación de
AtFH como activador de la fosforilación oxidativa también en organismos vegetales.
103
Resultados y discusión
6.2. Efecto de AtFH sobre la transcripción y actividad del CI mitocondrial
6.2.1. Determinación de los niveles de expresión de genes del CI en plantas con
deficiencia en AtFH
Con el objeto de evaluar la respuesta del genoma nuclear frente a la
disfunción mitocondrial inducida por la deficiencia de frataxina decidimos analizar
los niveles de expresión de tres genes nucleares que codifican para subunidades Fe-S
del CI: PSST, TYKY, NADHbp en las plantas atfh-1 y as-AtFH. También se evaluó la
expresión del gen Nad9, que forma parte del CI y también codifica para una
subunidad con centro Fe-S, pero se diferencia de los anteriores en que está codificada
en el genoma mitocondrial. Luego de la extracción de ARN total y la reacción de
retrotranscripción utilizando hexámeros, se llevaron a cabo reacciones de PCR
semicuantitativa con oligonucleótidos específicos para cada gen (ver Materiales y
Métodos).
La Figura 28A muestra los niveles de expresión de: Nad9, PSST, TYKY,
NADHbp. La cuantificación por densitometría de la abundancia relativa de los
transcriptos para cada uno de estos genes muestra una inducción de Nad9 (entre 1.5 y
2.1 veces) en las plantas atfh-1 y as-AtFH. Se observó también inducción en los
niveles de transcripción de PSST (alrededor de 2.8 y 2.5 veces, respectivamente).
Además, los niveles de NADHbp se encontraron aumentados entre 4.1 y 4.9 veces en
las plantas atfh-1 y as-AtFH, respectivamente. En contraste, se observó una leve
disminución del transcripto que codifica para TYKY en las plantas atfh-1 y as-AtFH
(Figura 28 B).
104
Resultados y discusión
(A)
wt
atfh-1 as-AtFH
Nad9
PSST
TYKY
NADHbp
E-ACTINA
(B)
Figura 28: (A) Análisis de la expresión de los genes del CI, Nad9, PSST, TYKY, NADHbp a partir de
hojas de plantas mutantes atfh-1, transgénicas as-AtFH y wt . La expresión del gen de ȕ-ACTINA, se
utilizó como control. (B) Análisis de la expresión relativa de los genes mostrados en (A) por
densitometría utilizando el programa Gel-Pro Analyzer. Barras blancas: líneas wt, barras grises,
plantas atfh-1 y barras negras, plantas as-AtFH.
También realizamos el análisis de expresión de los genes descriptos en la
figura anterior en órganos florales. En general, el comportamiento fue similar a lo
observado previamente en hojas. Los niveles de transcripción de Nad9 fueron 2.3 y
1.5 veces superiores en las plantas atfh-1 y as-AtFH, respectivamente. Se encontró
una inducción de 1.6 veces de PSST en plantas atfh-1, mientras que la expresión de
NADHbp fue 2.3 y 2.9 veces superior en las plantas atfh-1 y as-AtFH,
105
Resultados y discusión
respectivamente. Por otra parte no se observaron diferencias significativas en la
transcripción del ARNm de TYKY (Figura 29).
(A)
wt
atfh-1 as-AtFH
Nad9
PSST
TYKY
NADHbp
E-ACTINA
(B)
Figura 29: (A) Análisis de la expresión de los genes del CI, Nad9, PSST, TYKY, NADHbp a partir de
flores de plantas mutantes atfh-1, transgénicas as-AtFH y wt. La expresión del gen de ȕ-ACTINA, se
utilizó como control. (B) Análisis de la expresión relativa de los genes mostrados en (A) por
densitometría utilizando el programa Gel-Pro Analyzer. Barras blancas: líneas wt, barras grises plantas
atfh-1 y barras negras plantas as-AtFH.
Los resultados mostrados en las Figura 28 y 29, están de acuerdo con lo
observado previamente en plantas u-ATP9 que tienen una disfunción mitocondrial
106
Resultados y discusión
(Gómez-Casati et al., 2002). Se postuló que en estas plantas la disfunción
mitocondrial podría generar alguna señal induciendo de esta forma la transcripción de
ciertos genes nucleares del CI que codifican proteínas relacionadas con la biogénesis
de la organela. Resultados recientes obtenidos en el laboratorio con microarreglos de
ADNc sobre plantas u-ATP9 mostraron también la inducción de algunos factores
como ARR2 (Arabidopsis Response Regulator 2) (Busi y col, manuscrito enviado).
Además resultados preliminares de PCR en tiempo real mostraron también una
inducción de ARR2 en plantas atfh-1 y as-AtFH (Gómez Casati y col, resultados
inéditos). Se describió que ARR2 es un activador transcripcional de algunos genes
como PSST, una de las subunidades Fe-S del CI de arabidopsis (Lohrmann et al.,
2001). Se propuso además que ARR2 estaría involucrado en un sistema complejo de
dos componentes modulando un gran número de vías de transducción de señales
relacionadas con estímulos hormonales (Hass et al., 2004). Por lo tanto, la inducción
de la expresión de los genes nucleares PSST y NADHbp y el gen mitocondrial Nad9
puede ser interpretada como una compensación nuclear y una adaptación
mitocondrial, respectivamente, en respuesta a la disfunción de la organela, asociada a
alteraciones en la respiración y menor contenido de ATP.
Por otro lado, mencionamos que el gen Nad9 es de codificación mitocondrial,
sin embargo, tiene similar comportamiento que los genes codificados en el núcleo. A
fin de cuantificar los niveles de la proteína NAD9, llevamos a cabo un análisis de
western blot con anticuerpos específicos contra esta subunidad (cedidos por el Dr.
Daniel González, UNL). Los resultados muestran que no existe una alteración
significativa en los niveles de NAD9 en plantas atfh-1 y as-AtFH respecto a los
niveles de NAD9 encontrados en plantas wt (Figura 30).
wt
atfh-1
as-AtFH
NAD9
Figura 30: Análisis de western blot de la proteína NAD9 en extractos mitocondriales de plantas wt y
líneas deficientes atfh-1 y as-AtFH utilizando anticuerpos anti-NAD9 recombinante.
107
Resultados y discusión
Se postuló que la biogénesis mitocondrial depende de la fina coordinación
de la transcripción en los genomas nuclear y mitocondrial en respuesta a señales de
desarrollo, ambientales y metabólicas. Sin embargo, recientemente se llevaron a cabo,
estudios sobre el papel de ambos genomas en la biogénesis de los complejos
respiratorios (Giege´ et al., 2005). Se observó que dicha coordinación ocurre a nivel
del ensamblaje de los complejos más que a nivel transcripcional. Si bien nuestros
resultados mostraron una inducción en la transcripción de Nad9, los niveles similares
de proteína NAD9 observados por western blot pueden explicarse por la existencia de
un alto control a nivel postranscripcional sobre las proteínas codificadas en la
mitocondria (Giegé et al., 2000; Giege´ et al., 2005).
6.2.2. Efecto de la deficiencia de AtFH sobre la actividad del CI
El uso de mutantes o de inhibidores del CI es importante para lograr
entender en profundidad la función de este complejo respiratorio. Se ha descripto que
varios compuestos químicos como la rotenona y otros insecticidas inhiben la
actividad del CI (Teeter et al., 1969). Estos inhibidores bloquean la cadena de
transporte de electrones entre un centro Fe-S y la ubiquinona (Lümmen, 1998). Se ha
informado también que la inhibición de la actividad del CI produce un aumento en la
biogénesis de proteínas mitocondriales (Lister et al., 2004; Millar et al., 2004).
Con el propósito de averiguar si la deficiencia de AtFH produce
modificaciones en la actividad del CI, se midió el consumo de O2 en plantas
deficientes en AtFH (atfh-1 y as-AtFH) y plantas wt con y sin el agregado de
rotenona (Figura 31). De esta forma, se estimó la actividad del CI como la diferencia
entre el consumo de O2 total y el consumo de O2 en presencia de rotenona como se
describió previamente (Sabar et al., 2000).
La Figura 31 muestra que luego del agregado de rotenona, las plantas wt
muestran una tasa de consumo de O2 de alrededor de 1.7 μmol. min-1. g-1 PS
(aproximadamente 60% del consumo de O2 en ausencia de rotenona). De esta forma,
108
Resultados y discusión
se determinó que el consumo de O2 sensible a rotenona es de 1.1 μmol. min-1. g-1 PS
(Tabla 4). Estos datos coinciden con datos previos obtenidos en diferentes organismos
vegetales que reflejaron una inhibición de la respiración por rotenona en el rango del
40-60% (Menz et al., 1992; Polygalova et al., 2007; Garmier et al., 2008b). De esta
forma, estimamos que la actividad del CI corresponde a la actividad sensible a
rotenona y sería aproximadamente del 40% del consumo total de O2 (Barras grises,
Figura 31).
Se determinó también el consumo de O2 en las líneas deficientes en AtFH,
atfh-1 y as-AtFH. Los resultados están de acuerdo con los datos obtenidos
previamente en hojas sin tratamiento (Figura 27), donde se observa una disminución
de alrededor de 40% en la tasa respiratoria. La incubación de hojas de Arabidopsis en
presencia de rotenona provocó una disminución de alrededor de 20% en el consumo
de O2 en ambas líneas deficientes en AtFH. Así, estimamos que la actividad
respiratoria sensible a rotenona es de alrededor de 0.4 y 0.3 μmol. min-1. g-1 PS para
las líneas atfh-1 y as-AtFH respectivamente (Figura 31, Tabla 4). Estos resultados
permiten deducir que la actividad del CI respiratorio está disminuida alrededor de 4
veces en las plantas atfh-1 y as-AtFH respecto a las plantas wt, lo que sugeriría una
disfunción (al menos parcial) de la actividad del CI mitocondrial causada por la
deficiencia de AtFH.
109
Resultados y discusión
Figura 31. Determinación del consumo de O2 (ȝmol O2. min-1. g-1 PS) en hojas de plantas wt, atfh-1 y
as-AtFH (barras negras). Las barras grises representan la velocidad de consumo de O2 sensible a
rotenona. PS: peso seco.
Tabla 4: Determinación de la velocidad de consumo de O2 en ausencia y presencia de
rotenona
_____________________________________________________________________
Línea
velocidad de consumo de O2
(μmol . min-1. g-1 PS)
- rotenona
+ rotenona
Diferencia
_____________________________________________________________________
wt
2.8 ± 0.2
1.7 ± 0.2
1.1 ± 0.4
atfh-1
2.0 ± 0.2
1.6 ± 0.1
0.4 ± 0.3
as-AtFH
2.1 ± 0.1
1.8 ±0.1
0.3 ± 0.2
_____________________________________________________________________
110
Resultados y discusión
En resumen, observamos en las hojas de plantas con deficiencia en AtFH un
aumento en los niveles de transcripción de dos genes nucleares, PSST, NADHbp y
el gen mitocondrial Nad9, encontrándose niveles similares de NAD9. Sin embargo
estos datos no se correlacionan con la disminución observada en la actividad del CI.
Tomados juntos estos datos indican que a nivel bioquímico, la ausencia de frataxina
sería equivalente al tratamiento con rotenona, ya que ambas alteraciones provocan un
funcionamiento anormal del CI con las consecuencias respiratorias ya detalladas.
El CI es el más complicado y menos comprendido de los complejos
participantes de la fosforilación oxidativa, debido a que es el que tiene mayor
cantidad de subunidades y las mismas se encuentran codificadas a nivel nuclear y
mitocondrial (Schulte, 2001; Videira and Duarte, 2002; Brandt, 2006; Duarte and
Videira, 2007; Maas et al., 2008).
La búsqueda de homología ha revelado un alto grado de conservación de
ciertos módulos del CI entre varios organismos que se ve reflejada en una gran
semejanza estructural entre el complejo proveniente de arqueas, cianobacterias,
bacterias y animales, aunque la unidad de entrada de los electrones varíe (Vogel et al.,
2007 ). El CI bacteriano está compuesto por 14 subunidades muy conservadas y que
son consideradas la estructura mínima requerida para ser funcional (Friedrich et al.,
1993; Leif et al., 1993). Los estudios filogenéticos realizados han generado modelos
que describen la evolución modular del CI (Leif et al., 1993; Friedrich and Weiss,
1997; Finel, 1998; Friedrich and Scheide 2000; Mathiesen and Hagerhall, 2003;
Friedrich and Bottcher, 2004). En estos modelos se propone que este complejo se
origina por fusión de ensamblados proteicos preexistentes constituyendo módulos
para la transferencia de electrones y el transporte de protones. En más detalle, se
postula que CI tiene su origen en una hidrogenasa soluble dependiente de niquelhierro (con homología a PSST/NuoB y NuoD). Esta hidrogenasa ganó un sitio de
unión a quinonas (NuoH) y por la adquisición de NuoC (de función desconocida), de
una ferredoxina (TYKY/NuoI) y de un translocador de iones (NuoL) se transformó en
una proteína de membrana. Esta estructura fue posteriormente expandida por la
triplicación de las subunidades translocadoras, NuoM y NuoN. Después que el
111
Resultados y discusión
complejo perdió el sitio activo para níquel-hierro y su habilidad para reaccionar con
la molécula de hidrógeno, se adquirió el módulo deshydrogenasa (compuesto por
NuoE, NuoG y NuoF/NADHbp) y las subunidades de membrana NuoA, NuoK y
NuoJ (Vogel et al., 2007 ) (Figura 32).
E. coli
A. thaliana
NuoB
PSST
NuoF
NADHbp
NuoI
TYKY
NuoC
NAD9
Bacterias
Plantas
Figura 32: Esquema del ensamblado del CI bacteriano y de plantas desde el punto de vista de la
evolución modular (Modificado de Vogel et al., 2007 ).
Como mencionamos antes, además de las subunidades descriptas en el
párrafo anterior, el genoma mitocondrial vegetal codifica a NAD7 y NAD9,
homólogos a NuoD y NuoC respectivamente (Rasmusson et al., 1998). El
conocimiento sobre la formación y ensamblaje del CI mitocondrial en plantas
superiores se basó principalmente en estudios realizados en mutantes de maíz, tabaco
y Arabidopsis (Vogel et al., 2007 ). Plantas con mutaciones en distintas subunidades
112
Resultados y discusión
presentaron un incorrecto funcionamiento del CI. Aunque sólo un gen estuviera
afectado y originara la disfunción, y que no se observaran variaciones significativas
en los niveles de trasncripción de genes mitocondriales, numerosos polipéptidos
fueron detectados solamente en trazas o con falencias en el ensamblado y la unión a
la membrana, demostrando que es fundamental la presencia de todos los componentes
del CI para la estabilidad de las proteínas (Marienfeld and Newton, 1994; Brangeon
et al., 2000). En plantas de tabaco mutantes CMSI y CMSII (cytoplasmic male sterile
I and II) está ausente la subunidad mitochondrial NAD7 (Pla et al., 1995; Gutierres et
al., 1999). El fenotipo presente en estas plantas es similar y es provocado por la
ausencia de niveles detectables de otras subunidades, tanto mitocondriales como
nucleares. Aunque al momento de evaluar estos transcriptos se observaron niveles
normales o inducidos, al igual que en las plantas deficientes en frataxina, el hecho de
no obtener proteínas o complejos funcionales sugiere la proteólisis de las proteínas no
integradas (Gutierre et al., 1997) (Pineau et al., 2005). Por lo tanto, es posible suponer
que el correcto ensamblado de los complejos respiratorios (en este caso CI)
dependería de mecanismos post-transcripcionales, y en ellos frataxina cumpliría un
papel fundamental.
113
Capítulo IV
Resultados y discusión
Capítulo IV
Como mencionamos anteriormente, otro de los complejos mitocondriales que
posee centros Fe-S es el complejo respiratorio II, CII, que cataliza la reducción de
ubiquinona a ubiquinol. Este complejo multiproteico, también llamado succinato
dehidrogenasa, está asociado a la membrana interna mitocondrial y es parte también
del ciclo del TCA, catalizando la oxidación de succinato a fumarato. El CII ha sido
caracterizado en bacterias y eucariotas (Lemire and Oyedotun, 2002; Yankovskaya et
al., 2003). Se ha demostrado que contiene cuatro subunidades: dos proteínas
periféricas de membrana, una flavoproteína (SDH1), una proteína Fe-S (SDH2) y dos
proteínas pequeñas integrales de membrana (SDH3 y SDH4).
En Arabidopsis
thaliana, todas las subunidades de SDH están codificadas en el genoma nuclear
(Scheffler, 1998; Figueroa et al., 2001; Figueroa et al., 2002; Millar et al., 2004), y
sorprendentemente, varias de las subunidades del CII están codificadas por más de un
gen. Por el momento se han reportado que tres de los genes, llamados SDH2-1,
SDH2-2 y SDH2-3, codifican para la subunidad Fe-S, y dos genes nucleares,
designados como SDH1-1 y SDH1-2, codifican para la flavoproteína (Figueroa et al.,
2001; Figueroa et al., 2002). SDH2-1 y SDH2-2 tienen estructuras similares,
codifican proteínas cercanamente idénticas y tienen patrones de expresión similares,
encontrándose su mayor expresión en flores (Figueroa et al., 2001; Elorza et al.,
2004). Este resultado, estaría de acuerdo con que SDH2-1 y SDH2-2 probablemente
provengan de un reciente evento de duplicación y serían redundantes. A diferencia de
esto, se ha reportado una alta expresión tejido específico para SDH2-3. Este gen es
estructuralmente diferente y ha divergido hace tiempo de SDH2-1 y SDH2-2; se
expresa altamente en embriones durante el desarrollo de la semilla y sus transcriptos
se acumulan en semillas secas (Elorza et al., 2006).
El sitio de unión de succinato, está formado por la proteína SDH1 que está
covalentemente unida a la molécula de FAD, actuando como receptor de iones
hidrógenos en el paso inicial de la oxidación del succinato. Esta subunidad de
flavoproteína interactúa con la subunidad SDH2, que transfiere electrones hacia la
membrana, a través de los tres centros Fe-S. Las dos proteínas integrales de
115
Resultados y discusión
membrana, SDH3 y SDH4, anclan los subcomplejos SDH1 y SDH2 del lado de la
matriz de la membrana mitocondrial interna, y contienen sitios de unión para la
ubiquinona y hemo (Yankovskaya et al., 2003).
Otra de las ferrosulfoproteínas encontradas en mitocondrias es la aconitasa,
enzima que participa en el ciclo de Krebs catalizando la conversión de citrato a
isocitrato en la matriz mitocondrial. Esta proteína pertenece a la familia de las
deshidratasas que contienen centros Fe-S, cuya actividad depende de que dicho centro
se encuentre en la forma cubana de [Fe4-S4] (Beinert et al., 1996; Gardner, 2002). La
enzima purificada es altamente susceptible a la inactivación por formación de centros
[Fe3-S4] (Flint et al., 1993). La pérdida de la actividad aconitasa es un indicador de
la generación de superóxido y de daño oxidativo en gran variedad de enfermedades
degenerativas y envejecimiento (Yan et al., 1997; Schapira, 1999). Esto sugiere que
aconitasa funcionaría como un sensor del estado redox celular.
Hemos mencionado que una de las posibles funciones de frataxina es su
participación en la biogénesis de proteínas Fe-S (ISCs). Esta hipótesis fue
recientemente confirmada en levaduras mutantes en frataxina (¨yfh) en las cuales la
función de varias proteínas Fe-S se ve severamente afectada (Chen et al., 2002). Sin
embargo, poco se conoce acerca del mecanismo por el cual estos grupos inorgánicos
se ensamblan en proteínas biológicamente activas (Napier et al., 2005).
De acuerdo a esta hipótesis, nosotros postulamos que es posible que la
deficiencia de frataxina altere la función de los complejos respiratorios (y
posiblemente de otras proteínas mitocondriales) que contienen centros Fe-S en
plantas. Previamente demostramos, que AtFH es necesaria para la actividad del CI
mitocondrial. A fin de conocer la posible participación de AtFH en la biogénesis de
otras ferrosulfoproteínas y complejos de la cadena respiratoria, decidimos investigar
el efecto de la deficiencia de AtFH sobre el CII y la aconitasa.
116
Resultados y discusión
7.1. Efecto de AtFH sobre la transcripción de genes que codifican proteínas Fe-S
mitocondriales.
Para conocer más sobre la posible participación de AtFH en la biogénesis de
proteínas Fe-S mitocondriales, se llevó a cabo la determinación de los niveles de
expresión de los ARNm que codifican para SDH2-1 y la enzima aconitasa (ACO) en
las plantas wt y atfh-1. La Figura 33 muestra el análisis por RT-PCR de ambos
transcriptos. Los resultados reflejan que ACO se encuentra inducido en las plantas
atfh-1 alrededor de 1.5 veces. Asimismo, se observó un incremento en los niveles de
transcripción de SDH2-1 de alrededor de 2 veces en la línea deficiente en AtFH,
respecto a las plantas wt (Figura 33).
(A)
(B)
2,5
atfh-1
ACO
SDH2-1
18 S
Expresión relativa
wt
2
1,5
1
0,5
0
ACO
SDH2-1
Figura 33: (A) Análisis por RT-PCR de la expresión del gen de aconitasa (ACO) y subunidad SDH2-1
del CII en plantas wt y atfh-1. El RNA total aislado fue retrotranscipto y luego amplificado usando
primers específicos. El producto de PCR fue separado en una electroforesis en gel de agarosa y
transferido a membrana de nitrocelulosa e hibridado usando sondas específicas. La expresión del gen
ARNr 18S fue utilizado como control interno. (B) Análisis de la expresión relativa de los genes
mostrados en (A) por densitometría utilizando el programa Gel-Pro Analyzer.
Como se mencionó más arriba, existen 3 genes en Arabidopsis que codifican
para la subunidad SDH2: SDH2-1, SDH2-2 y SDH2-3. Con el objeto de determinar si
existen diferencias en la expresión de los tres genes, se evaluó la transcripción de los
mismos por PCR en tiempo real (Figura 34). Los resultados confirman la inducción
117
Resultados y discusión
del gen SDH2-1 observada por RT-PCR. Además se observó una inducción de
alrededor de 2 veces en los niveles de transcripción de SDH2-2. Los niveles de
expresión del gen SDH2-3 fueron indetectables (no mostrado), lo que está de acuerdo
con su expresión en tejido embrionario, durante la maduración de la semilla (Elorza et
al., 2006).
4
Expresión relativa
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
SDH2-1
SDH2-2
Figura 34. Análisis por PCR en tiempo real de los niveles de SDH2-1 y SDH2-2 en plantas wt (barras
blancas) y atfh-1 (barras grises).
Para evaluar si el aumento en la expresión del ARNm de ACO y SDH2-1
en las plantas atfh-1 se correspondía con un aumento en la actividad proteica,
determinamos la actividad enzimática aconitasa y SDH en mitocondrias aisladas de
las líneas wt y atfh-1 (Figura 35). Los resultados mostraron una disminución en la
actividad de ambas enzimas en la línea deficiente en AtFH. En particular, la actividad
aconitasa de la línea mutante fue prácticamente indetectable, mientras que la
actividad SDH se encontró disminuida alrededor de un 30 % respecto a la actividad
SDH mostrada por la línea wt.
Para comprobar si la reducción en los niveles de actividad de estas dos
ferrosulfoproteínas se correlacionaba con la disminución en la actividad de otras
enzimas mitocondriales, se ensayó además la actividad malato dehidrogenasa (MDH)
en las preparaciones de mitocondrias aisladas. La MDH es una enzima que participa
118
Resultados y discusión
en una de las reacciones del ciclo del TCA y no contiene grupos Fe-S en su
estructura. La Figura 35 (panel izquierdo) muestra que la actividad MDH medida fue
similar en mitocondrias provenientes de plantas wt y atfh-1. Así, los resultados
indican que la deficiencia de AtFH se correlaciona con la menor actividad de dos
ferrosulfoproteínas (aconitasa y SDH), mientras que la actividad de otra enzima que
no posee centros Fe-S no se encontró alterada ante la deficiencia de AtFH. Los
resultados sugieren que AtFH estaría involucrada en la modulación de la actividad de
Actividad relativa
proteínas mitocondriales con centros Fe-S.
Aconitasa
wt
atfh-1
SDH
wt
atfh-1
MDH
wt
atfh-1
Figura 35: Determinación de la actividad enzimática de proteínas con centros Fe-S: aconitasa (ACO) y
succinato dehydrogenasa (SDH) y como control de proteína mitocondrial sin centro Fe-S, malato
dehidrogenasa (MDH). En cada ensayo enzimático se utilizaron 10μg de proteína total de extractos
mitocondriales de las líneas wt y atfh-1. La actividad de cada enzima en plantas wt fue utilizada como
valor de referencia.
Los datos mostrados indican niveles aumentados de ARNm de ACO y
SDH2-1 en las plantas deficientes en AtFH; sin embargo no se corresponden con un
aumento en la actividad enzimática aconitasa y SDH. A partir de estos datos se puede
postular que AtFH podría tener un rol en el proceso de maduración de la proteína
como por ejemplo, la biogénesis de los centros Fe-S o en el ensamblado de estos
grupos a las apoproteínas. Así, los datos obtenidos en el presente trabajo, concuerdan
con una de las funciones postuladas para frataxina como es su participación en la
biogénesis de grupos Fe-S y ferrosulfoproteínas en mitocondrias. Cabe destacar que
este trabajo de Tesis constituye el primer informe sobre el requerimiento de frataxina
119
Resultados y discusión
para la actividad completa de dos proteínas con centros Fe-S en organismos
vegetales.
Nuestros resultados están de acuerdo con lo descripto recientemente sobre
la función activadora de la frataxina de levaduras sobre la aconitasa (Bulteau et al.,
2004). Se describió que YFH interactúa con la aconitasa de una manera dependiente
de citrato, reduciendo así los niveles de oxidación que ocasionan la inactivación de la
enzima. De esta forma, frataxina convierte la forma inactiva de la aconitasa [Fe3-S4]
en la forma activa [Fe4-S4] de la proteína proveyendo un cuarto átomo de Fe para
completar el cluster. Así, frataxina funcionaría como una chaperona de Fe,
protegiendo el desensamblado del grupo [Fe4-S4] y promoviendo la reactivación de la
enzima (Bulteau et al., 2004).
Por otra parte, la participación de frataxina parecería ser importante pero no
esencial para la actividad SDH, ya que la misma disminuyó solamente un 30%.
Recientemente se ha informado la interacción física existente entre la frataxina de
levaduras y la SDH (Gonzalez-Cabo et al., 2005). Además se ha observado una
reducción en la actividad del complejo succinato deshidrogenasa en levaduras
mutantes que carecían de frataxina. Estos resultados sugieren un posible rol de
frataxina en la regulación de la entrada de los electrones a la cadena respiratoria a
través del CII. Entonces, frataxina podría afectar la estabilidad o ensamblado del
complejo SDH regulando de esta manera su actividad (Gonzalez-Cabo et al., 2005).
Finalmente, la respuesta diferencial observada en la disminución de la actividad de
aconitasa y SDH, podría reflejar que el proceso de ensamblado de los centros Fe-S o
su regulación, ocurre de manera diferente para cada una de estas proteínas.
120
Resultados y discusión
7.2. AtFH y stress oxidativo
7.2.1. Plantas deficientes en frataxina muestran un aumento en el contenido de
Fe y en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)
El estrés oxidativo es un estado de la célula en el cual se encuentra alterada
la homeostasis óxido-reducción intracelular, es decir el balance entre pro-oxidantes y
antioxidantes, resultando en una excesiva formación de especies reactivas de oxígeno
(ROS) y /o especies reactivas de nitrógeno (RNS) (Moller, 2001a).
La producción de especies reactivas del oxigeno (ROS) es una inevitable
consecuencia de la vida en condiciones aeróbicas. Los cloroplastos y los peroxisomas
de plantas son los sitios de mayor producción de ROS y probablemente en células no
fotosintéticas esto lo realiza la mitocondria (Moller and Kristensen, 2004). Durante la
vida celular, ocurren pequeñas fluctuaciones en los niveles de concentración de ROS,
debido a una producción endógena durante determinadas situaciones del desarrollo,
como es la maduración de semillas, o como resultado normal del metabolismo de la
fotosíntesis y la respiración. Estas ROS producidas en baja concentración actuarían
como posibles moléculas señales (Droge, 2002), mientras, que un aumento
descontrolado de las mismas puede causar la liberación de más radicales libres como
.
el radical hidroxilo ( OH) que se forma en presencia de iones metálicos como Fe o Cu
.
(II), el radical superóxido (O2 -), y el oxígeno singlete. Existen varios mecanismos de
defensa en la mitocondria, que incluyen moléculas antioxidantes, enzimas de
detoxificación y sistemas de reparación que limitan la producción de ROS. Cuando
estos mecanismos se encuentran sobrepasados, se produce el daño celular.
En general los ROS juegan un papel importante en la inactivación de
endonucleasas y consecuentemente producen daño al DNA (Hagar et al., 1996),
pueden modificar proteínas, haciéndolas más susceptibles a ataques proteolíticos
(Stadtman and Levine, 2000) y atacar lípidos (Rubbo et al., 1994) y polisacáridos
(Kaur and Halliwell, 1994;).
121
Resultados y discusión
Se ha informado que frataxina normalmente forma complejos multiméricos
con Fe, y que la ausencia de la misma, causa un aumento en los niveles de Fe
mitocondrial. El Fe cataliza la reacción de Fenton produciendo radical hidroxilo a
partir de peróxido de hidrógeno, con el consecuente daño a las macromoléculas
mitocondriales (Babcock et al., 1997; Karthikeyan et al., 2002; Puccio and Kœnig,
2002). En trabajos realizados en levaduras mutantes en frataxina, se ha visto un
aumento de 10 veces la concentración de Fe mitocondrial, acompañado
de un
aumento en la producción de ROS (Babcock et al., 1997). Esto llevó a la aparición de
un fenotipo “petite “en la mayoría de las colonias examinadas con pérdida de la
función mitocondrial, (Foury and Cazzalini, 1997; Wilson and Roof, 1997; Puccio
and Koenig, 2000). Otros estudios reportaron además la presencia de daño a nivel del
ADN mitocondrial (Bidichandani et al., 1999; Karthikeyan et al., 2002; Lesuisse et
al., 2003). Estudios realizados en pacientes con Ataxia de Friedreich, mostraron
depósitos de hierro en corazón, sugiriendo una sobrecarga del mismo (Lamarche et
al., 1980), como así también signos de daño oxidativo incluyendo múltiples defectos
en proteínas Fe-S y pérdida del ADN mitocondrial (Rotig et al., 1997; Bradley et al.,
2000).
Previamente demostramos que AtFH recombinante fue capaz de atenuar la
reacción de Fenton in vitro (ver capítulo II). A partir de esta observación y de lo
mencionado más arriba, decidimos evaluar si la deficiencia de AtFH puede provocar
un aumento en el contenido de Fe en plantas de Arabidopsis. Para ello, llevamos a
cabo la determinación del contenido de Fe soluble total en hojas de plantas wt y atfh1. Los resultados indican que el contenido de Fe en las plantas deficientes en AtFH es
aproximadamente 55% mayor que en plantas wt (Figura 36). Así nuestros resultados
sugieren que AtFH podría tener un papel importante en el metabolismo del Fe
también en organismos vegetales.
122
Resultados y discusión
200
% μmol Fe . g -1 PF
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
wt
atfh-1
Figura 36: Determinación espectrofotométrica del contenido de Fe soluble en muestras de hojas de
plantas wt y atfh-1. La cantidad de Fe se expresa en μmol Fe soluble . g-1 de peso fresco (PF).
A fin de evaluar si la deficiencia de AtFH produce una mayor cantidad de
ROS en los tejidos vegetales, se determinó por histoquímica la producción del radical
.
superóxido (O2 ) y de ROS totales en plantas de Arabidopsis wt y en las mutantes
atfh-1. Para determinar la presencia de anión superóxido se infiltraron hojas de
ambas líneas con Nitrobluetetrazolium (NBT) que produce un precipitado de color
azul en presencia de radical superóxido (Beyer and Fridovich, 1987; Jakubowski and
Bartosz, 2000).
Luego de la incubación de hojas wt con NBT no se observa tinción alguna,
mientras que la incubación de hojas provenientes de la mutante atfh-1 con NBT
produjo una precipitación de color azul, especialmente en tricomas (Figura 37A). Los
resultados indican que la deficiencia de AtFH lleva a una acumulación de radical
superóxido, especialmente en tricomas, estructuras utilizadas para la detoxificación y
eliminación de ROS.
Por otra parte, se determinó la cantidad de ROS total en hojas y raíces de
plantas wt y atfh-1. Los resultados muestran un incremento en la fluorescencia en
ambos tejidos provenientes de plantas mutantes luego de la incubación con 2´,7´-
123
Resultados y discusión
diclorofluorescein diacetato (H2DCFDA) (Figura 37 B). Estos datos indican que
tanto en raíces como en hojas (especialmente en tricomas) de plantas deficientes en
AtFH, existe un incremento en los niveles de ROS totales.
wt
(A)
atfh-1
Raíces
(B)
wt
atfh-1
Tricomas
wt
atfh-1
Figura 37: (A) Determinación histoquímica de anión superóxido en hojas de plantas wt y atfh-1 luego
de la infiltración con NBT. (B) Determinación de la acumulación de ROS total en raíces y hojas de
plantas wt y atfh-1 utilizando la sonda fluorescente H2CFDA.
En conjunto, los resultados permiten postular que AtFH tendría un papel
importante en la prevención de la acumulación de altos niveles de Fe y ROS dentro
de la célula. Como se describió previamente, el aumento del contenido de Fe (u otros
metales) podría causar daño oxidativo vía la reacción de Fenton. Esta hipótesis está
de acuerdo con los resultados que muestran que AtFH recombinante tiene la
capacidad de atenuar la reacción de Fenton in vitro (Ver Tabla 3, página 99).
124
Resultados y discusión
Se ha sugerido que la deficiencia de frataxina sería responsable de la
alteración del influjo de hierro (Radisky et al., 1999), defecto en la biosíntesis de
centros Fe-S (Foury, 1999; Muhlenhoff et al., 2002), pérdida de la síntesis de ATP
(Ristow et al., 2000), y /o inadecuada defensa antioxidante (Chantrel-Groussard et al.,
2001), todas condiciones que al final conducen a la acumulación de hierro y al
aumento del daño oxidativo. Así, la participación de frataxina en procesos tan
diversos podría explicarse únicamente si la función básica de esta proteína fuese la de
proveer un mecanismo de almacenamiento de hierro de manera biodisponible y no
tóxica (Patel and Isaya, 2001).
7.2.2. Análisis molecular de marcadores de estrés oxidativo
Las plantas son especialmente susceptibles a daño oxidativo ya que se
produce un aumento en la producción de ROS cuando están sometidas, por ejemplo,
a estrés ambiental como altas temperaturas, escasez de agua, polución, etc. (Smirnoff,
1998). Posiblemente las plantas han desarrollado una red dinámica de defensa
antioxidante para poder reducir la acumulación de ROS, eliminarlas y detoxificar, y
reparar moléculas oxidadas.
La red de defensa antioxidante en plantas mejor caracterizada se encuentra
en cloroplastos, donde la cadena de transporte electrónico fotosintética puede generar
una gran cantidad de ROS por una disipación incompleta de energía (Sweetlove et al.,
2002). Las mitocondrias de plantas también producen ROS como resultado del
metabolismo aeróbico y por ello, han desarrollado mecanismos que tratan de limitar
su acumulación (Millar et al., 2001; Moller, 2001b; Moller and Kristensen, 2004).
Como ya se describió, dos de los principales sitos de producción de ROS en
mitocondrias son el CI y CIII. Además, un incremento de ROS puede darse por la
presencia del radical ubisemiquinona, que puede transferir un único electrón hacia el
oxígeno para producir anión superóxido (Gutteridge and Halliwell, 1989). La
actividad de la oxidasa alternativa (AOX) reduce la acumulación de ROS
mitocondrial disminuyendo los niveles del pool de quinonas (Maxwell et al., 1999).
125
Resultados y discusión
En Arabidopsis, AOX, está codificada por 5 genes, cuatro del tipo AOX1 y
uno del tipo AOX2 (Considine et al., 2002). La expresión de diferentes genes se ha
visto que es tanto tejido como desarrollo específicos (Saisho et al., 1997; Saisho et al.,
2001; Thirkettle-Watts et al., 2003). AOX1 se expresa en la mayoría de los tejidos,
con la expresión de AOX1c en cotiledones jóvenes y en tejido floral. AOX1b, 1d y
AOX2 presentan menores niveles de expresión. La naturaleza de AOX de inducirse
por estrés en una amplia variedad de plantas estaría dada, en Arabidopsis, por la
mayor respuesta frente a estrés de los genes AOX1a y AOX1d. Análisis por
microarreglos en donde se evalúa la respuesta a varios tratamientos de estrés que
alteran la función mitocondrial y/o plantas con niveles de AOX alterados, revelan que
las AOXs co-expresan con genes que típicamente funcionan afuera de la mitocondria.
Existen varias vías de inducción de AOX y cada una de ellas produce una magnitud
diferente de inducción; a su vez esa inducción depende de los niveles endógenos de
AOX, y por último, puede deberse no solamente al estrés oxidativo sino también ser
independiente del mismo, según los genes de AOX que se investiguen y el tejido
analizado (Clifton et al., 2006).
Por otro lado, se ha descripto que otros dos genes, peroxiredoxina
(At3g06050) y calreticulina (At1g56340) estarían involucrados en respuesta a estrés y
daño oxidativo en mitocondrias de plantas (Sweetlove et al., 2002).
La peroxirredoxina (At3g06050), pertenece a la familia de las tiorredoxinas
dependientes de peroxidasas. Esta proteína ha sido observada en el proteoma
mitocondrial de Arabidopsis y posee una secuencia de importe a mitocondria (Kruft
et al., 2001). Recientemente ha sido enfocada en la investigación en plantas y
animales, en el contexto de desarrollo, adaptación, y enfermedad, debido a que sus
funciones están involucradas en la defensa antioxidante, reduciendo los peróxidos
tóxicos dentro de la célula y en señalización redox (Finkemeier et al., 2005). La
peroxirredoxina, es una proteína muy ubicua, encontrada en bacterias (Tartaglia et al.,
1990), levaduras (Chae et al., 1994), animales (Kim et al., 1988) y plantas superiores
(Baier and Dietz, 1996; Baier and Dietz, 1997).
126
Resultados y discusión
La calreticulina (At1g56340), generalmente, ha sido considerada como una
proteína no mitocondrial, ya que no posee secuencia de importe a mitocondria, pero
sin embargo se la encuentra inducida en condiciones de estrés. Esta proteína ha sido
implicada en la homeostasis del Ca+2 mitocondrial en mamíferos, llevando el Ca +2 a
mitocondria desde el retículo endoplasmático (Simpson et al., 1997). Durante el
estrés oxidativo se producen cambios en la homeostasis del Ca+2 mitocondrial
alterando la permeabilidad de la membrana, lo cual genera poros de transición
comprometidos en muerte celular programada observados en mamíferos (Pfeiffer et
al., 2001).
A partir de estos datos, decidimos investigar los niveles de expresión de estos
tres marcadores (oxidasa alternativa, peroxiredoxina y calreticulina) en plantas wt y
las mutantes deficientes atfh-1. Los resultados mostraron una inducción en la
transcripción del ARNm de los tres marcadores en las plantas atfh-1 (Figura 38).
Paralelamente se llevó a cabo el análisis por la técnica de PCR en tiempo real, y los
resultados reflejaron una inducción de 5 veces en el ARNm de AOX; mientras que
PEROX y CAL se encontraron inducidos 3 y 3.5 veces, respectivamente, en las
plantas deficientes en AtFH (Figura 39).
Figura 38. (A) Determinación de los niveles de ARNm genes de respuesta a estrés por RT-PCR en
plantas wt y atfh-1: oxidasa alternativa (AOX, At5g64210), peroxiredoxina (PEROX, At3g06050) y
calreticulina (CAL, At1g56340). Las muestras fueron separadas por electroforesis en gel de agarosa, y
transferida e hibridadas usando sondas específicas. La expresión del gen RNAr 18S fue utilizada como
control interno.
127
Resultados y discusión
7
Expresión relativa
6
5
4
3
2
1
0
AOX
PEROX
CAL
Figura 39. Análisis por PCR en tiempo real de los niveles de AOX, PEROX y CAL en hojas de plantas
wt (barras blancas) y atfh-1 (barras grises).
El aumento de los transcirptos de AOX y de PEROX, estarían indicando que
se estaría registrando la presencia de ROS y sería necesaria una activa producción de
proteínas antioxidantes para tratar de minimizar la formación de las mismas. A su
vez, el aumento de los niveles de ARNm de CAL, reflejaría el mayor estado de estrés
oxidativo en que se encuentra la célula. Estos resultados son consistentes con los
mostrados previamente, los cuales se muestra aumento de la producción de ROS y
por lo tanto con el estado de estrés oxidativo que ocasiona la deficiencia de AtFH.
7.2.3. Respuesta de AtFH frente a agentes oxidantes
Se ha reportado que la adición de H2O2, menadiona y antimicina A a
suspensiones de cultivos celulares causan cambios significativos en el proteoma
mitocondrial (Sweetlove et al., 2002). Estos cambios se habrían originado por un
aumento de proteínas blancos mitocondriales con función antioxidante o de respuesta
a estrés, o una asociación selectiva con proteínas que poseen un rol potencial en estrés
o en la degradación de proteínas mitocondriales (Sweetlove et al., 2002).
Para investigar el papel de frataxina en el estrés oxidativo, hojas de roseta de
plantas de 25- 30 días fueron tratadas con concentraciones sub-letales de H2O2 (500
μM). Luego de 4 h. de tratamiento, se determinaron los niveles de ARNm de AtFH
128
Resultados y discusión
mediante RT-PCR. Los resultados muestran un incremento en los niveles de
transcripción de AtFH de 4 a 5 veces en las plantas tratadas respecto a los controles
(Figura 40).
(B)
(A)
5
Expresión relativa
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
C
H 2 O2
Figura 40. (A) Expresión de AtFH en plantas wt luego del tratamiento con concentraciones sub-letales
de H2O2. Los análisis de expresión se realizaron por RT-PCR, seguidos por hibridación con sondas
específicas para AtFH. El RNA total fue extraído de hojas luego de 4 horas de infiltración con 0.5 mM
de H2O2. Como control se infiltraron hojas con agua destilada. La expresión del gen RNAr 18 S fue
usado como control interno. (B) Análisis de la expresión relativa de los genes mostrados en (A) por
densitometría utilizando el programa Gel-Pro Analyzer.
Este aumento en los niveles de ARNm de AtFH sugiere su posible
participación en la defensa oxidante en plantas, de acuerdo con los resultados en los
que se encontró que la deficiencia de AtFH va acompañada de un aumento de la
producción de ROS y de marcadores de estrés oxidativo. Los resultados concuerdan
con lo observado previamente en levaduras, donde la complementación de células de
S. cerevisiae ¨yfh con AtFH restaura parcialmente la sensibilidad a agentes oxidantes
(Busi et al., 2004). En conjunto, nuestros resultados refuerzan la hipótesis del papel
de frataxina en la protección ante el daño oxidativo causado por metales y reparación
de los grupos Fe-S.
129
Capítulo V
Resultados y discusión
Capítulo V:
8.1. Participación de AtFH en la biogénesis de hemoproteínas
A pesar de que inicialmente no se detectaron síntomas de porfirias
(patologías asociadas a anomalías en la síntesis del hemo) en pacientes con Ataxia de
Friedreich, cuando el gen de frataxina no había sido aun identificado, se reportó un
defecto en la conversión de protoporfirina IX hacia la formación del hemo (Morgan et
al., 1979). Posteriormente se observó que en pacientes con esta patología el fenotipo
de la serie roja era normal, y por lo tanto, se sugirió que la síntesis del hemo puede
ocurrir en ausencia de frataxina (Becker et al., 2002).
Más recientemente Lesuisse y colaboradores (2003), demostraron que los
niveles de Fe- protoporfirina IX se encontraban reducidos en levaduras mutantes
deficientes en frataxina (ǻyfh). Investigaciones realizadas por Lange y su grupo
(2004), mostraron una disminución en la síntesis del hemo en levaduras portadoras de
mutaciones en varios componentes de la vía de biosíntesis de ISC, incluída frataxina.
En otros trabajos realizados en células de ratones deficientes en frataxina, se observó
un aumento en los niveles de protoporfirina IX, una reducción en los niveles de hemo
a y hemo c y una disminución de la actividad de la citocromo oxidasa, sugiriendo un
defecto entre la protoporfirina IX y el hemo a (Schoenfeld et al., 2005).
A partir de ésto se postuló que frataxina podría tener un papel en la
regulación del Fe biodisponible dentro de las células. La alteración de la
biodisponibilidad del Fe tendría alguna influencia sobre la síntesis del grupo hemo y
la biogénesis de hemoproteínas celulares. Así, utilizando nuestro modelo de plantas
atfh-1 y as-AtFH, decidimos investigar el efecto de la deficiencia de frataxina sobre el
metabolismo del grupo hemo y la biogénesis de hemoproteínas en plantas.
8.1.1. La deficiencia de AtFH provoca una disminución en el contenido de hemo
La forma más funcional del hierro encontrada en la naturaleza es el grupo
hemo, el cual juega un rol catalítico y regulatorio dentro de la célula (Zhu et al.,
131
Resultados y discusión
2002). Se informó que el hemo puede controlar la actividad específica de factores de
transcripción y otras proteínas en una variedad de vías metabólicas (McCoubrey et
al., 1997; Goessling et al., 1998; Ogawa et al., 2001; Tang et al., 2003). Este control
podría ocurrir por unión del cofactor a “motivos regulatorios de hemo” (HRM)
presentes en estos factores. Es por este motivo que fluctuaciones endógenas en el
hemo pueden ser muy importantes en la regulación del metabolismo celular (Zhang
and Guarente, 1995; Atamna et al., 2002; Zhu et al., 2002).
El grupo hemo es el quelato formado por la protoporfirina IX con un átomo de
Fe (II). Sufre autooxidación rápidamente dando como producto ferri-protoporfirina.
Este complejo férrico tiene un residuo cargado positivamente que se puede neutralizar
con un ión cloruro, formando un complejo piramidal – cuadrado pentacoordinado
usualmente llamado hemina (Batlle, 1997).
Se ha informado que el hemo, bajo la forma de hemina actúa como un sistema
regulador intracelular de utilización de oxígeno (Pal and Joshi-Purandare, 2001). Por
lo tanto se ha sugerido que el hemo controla la síntesis, transporte y ensamblado de
proteínas mitocondriales de origen nuclear que están involucradas en respiración
(Lombardo et al., 2005).
La cuantificación de los niveles de hemo en las líneas deficientes en la
expresión de AtFH reveló una disminución en la concentración del mismo de
aproximadamente un 60% (Figura 41).
132
Resultados y discusión
Figura 41. Determinación del contenido de hemo en plantas wt, atfh-1 y as-AtFH. El contenido de
hemo se determinó cuantitativamente a partir de la extracción con cloroformo acidificado en extractos
de hojas de plantas de Arabidopsis.
Estos resultados son consistentes con otros trabajos en los que se ha informado
que la deficiencia de hemo mitocondrial puede ser una consecuencia de la deficiencia
de frataxina (Lesuisse et al., 2003; Yoon and Cowan, 2004; Schoenfeld et al., 2005),
que ocasionaría la disminución de la actividad de enzimas ISC en la mitocondria.
Cabe aclarar que dos de las enzimas que intervienen en la síntesis del hemo en
mamíferos, ferroquelatasa y adrenodoxina, requieren cofactores ISC para su actividad
(Lu and Cortopassi, 2007).
En mamíferos, se describió que la síntesis de hemo y la actividad
ferroquelatasa se encuentran claramente asociadas a mitocondrias (Lange et al.,
1999). En contraste, la síntesis de hemo y la localización de la ferroquelatasa en
mitocondrias de plantas están bastante discutidas. Algunos trabajos informaron de la
presencia de actividad de esta enzima en mitocondrias de plantas (Porra and Jones,
1963; Little and Jones, 1976) y de la existencia de una actividad biosintética de hemo
en estas organelas en arvejas (Cornah et al., 2002) y tabaco (Papenbrock et al., 2001).
Se demostró por experimentos de importe de proteínas a organelas, que la
ferroquelatasa I de Arabidopsis es importada a mitocondrias y cloroplastos, mientras
que la ferroquelatasa II sólo tendría localización cloroplástica (Smith et al., 1994;
Chow et al., 1998). Sin embargo experimentos de localización por fusión a GFP
(green fluorescent protein) mostraron que ambas ferroquelatasas de Arabidopsis
133
Resultados y discusión
tendrían localización plastídica (Masuda et al., 2003). A partir de estos datos se
sugirió la existencia de otra proteína responsable de la producción de hemo
mitocondrial.
Como hemos descripto, la localización de las enzimas involucradas en la
síntesis de tetrapirroles en plantas está siendo investigada y es un área de debate que
ayudará a explicar la vía de biosíntesis de hemo en plantas.
8.1. 2. Efecto de la deficiencia de AtFH sobre la actividad catalasa.
A partir de los datos donde se encontraron menores niveles de
protoporfirina IX en mutantes de levadura ǻyfh y deficiencias en la síntesis de hemo
en mutantes en los genes de la vía de biosíntesis de ISC (Lesuisse et al., 2003; Lange
et al., 2004), decidimos investigar el papel de AtFH en la biogénesis de catalasa, una
proteína con grupo hemo.
La catalasa, como ya hemos mencionado en la introducción, es un tetrámero
que contiene grupo hemo, está localizada principalmente en peroxisomas y cataliza la
dismutación del H2O2 a H2O y O2. La familia multigénica de catalasas en Arabidopsis,
está representada por 3 genes codificantes de subunidades individuales, que se
asocian para formar al menos seis isoenzimas (Zhong and McClung, 1996; Michael
and McClung, 2002). Las isoenzimas y los ARNm muestran patrones de expresión
diferentes (órgano específico). Los tres ARNm se expresan en hojas de plantas wt de
acuerdo a lo informado por Frugoli y colaboradores (1996), siendo la isoforma CAT2
(citosólicas y/o peroxisoma/glioxisoma) la más abundante, mientras que CAT1
(citosólicas y/o peroxisoma/glioxisoma) y CAT3 (mitocondrial) lo hacen con niveles
de expresión inferiores (Frugoli et al., 1996).
A fin de evaluar el efecto de la deficiencia de AtFH sobre la actividad de
esta hemoproteína, se midió actividad catalasa total en hojas y flores de plantas wt,
mutantes atfh-1 y transgénicas as-AtFH. En ambas líneas deficientes se observó un
134
Resultados y discusión
descenso del 20% en la actividad catalasa en extractos de hojas, mientras que en los
extractos de flor se observó una reducción de un 14% para la línea atfh-1 y un 40 %
para la línea as-AtFH. (Figura 42).
(A)
(B)
Figura 42. Actividad específica de catalasa en hojas de roseta (A) y flores (B) de Arabidopsis thaliana
wt, atfh-1 y as-AtFH. Una unidad (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza el consumo de
1 ȝmol min -1 de H2O2
A partir de estos resultados, decidimos analizar los niveles de transcripto de
cada uno de los genes que codifican las catalasas de Arabidopsis mediante RT-PCR.
Así, medimos la expresión de CAT1, CAT2 y CAT3 en hojas y flores de la línea wt y
las plantas deficientes en AtFH. Los resultados no mostraron modificaciones
significativas en los niveles de expresión del ARNm para cada isoforma, en ambos
tejidos analizados (Figura 43A y B). Por lo tanto, los datos indicarían que AtFH
tendría algún papel en el control de la actividad catalasa, y que posiblemente este
control no ocurra a nivel transcripcional, sino a nivel de la proteína.
135
Resultados y discusión
(A)
Hoja
1
2
Flor
3
1
2
3
CAT1
CAT2
CAT3
ȕ- ACTINA
1,2
1,2
1
1
Expresión relativa
Expresión relativa
(B)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
CAT1
CAT2
CAT2
CAT1
CAT2
CAT3
Figura 43: (A) Análisis por RT-PCR de la expresión de CAT1 (At1g20630), CAT2 (At4g35090) y
CAT3 (At1g20620), en plantas wt (calle1), atfh-1 (calle 2) y as- AtFH (calle 3). Se utilizó como
molde ADNc proveniente de hojas de roseta y flores. La expresión del gen ȕ-ACTINA fue usada como
control interno. (B) Análisis de la expresión relativa de los genes mostrados en (A) por densitometría
utilizando el programa Gel-Pro Analyzer (gráfico de la derecha hoja e izquierda flor). Barras blancas:
wt, barras grises: atfh-1, barras negras as-AtFH.
Para determinar si las variaciones observadas en la actividad catalasa total se
deben a diferencias en el contenido de proteína, realizamos un análisis por western
blot utilizando anticuerpos anti-catalasa (cedidos por el Profesor Mikio Nishimura,
Department of Cell Biology, National Institute for Basic biology, Okazaki, Japan).
Los ensayos se llevaron a cabo en hojas y flores de plantas wt, atfh-1 y as-AtFH. Los
datos no mostraron diferencias significativas en el contenido proteico de cada una de
136
Resultados y discusión
las líneas ensayadas (Figura 44). Así, los resultados sugieren que no habría
diferencias en el contenido total de proteína catalasa ante la deficiencia de AtFH.
Hoja
wt
atfh-1 as-AtFH
Flor
wt
atfh-1 as-AtFH
Figura 44. Análisis por western-blot revelado con anticuerpos anti-catalasa de A. thaliana. Se sembró
100 ȝg de proteína en cada calle a partir de extractos de hoja y flor. La flecha señala la banda
correspondiente a la masa molecular de 55 kDa.
Con el objetivo de confirmar que la disminución en la actividad catalasa es
debida a una deficiencia del grupo hemo, se suplementaron suspensiones de
mitocondrias aisladas con 0.025 μmoles de hemina y se determinó nuevamente la
actividad de esta enzima. La Figura 45 muestra que la actividad catalasa en
mitocondrias de plantas atfh-1 y as-AtFH se recupera con el agregado de hemina
exógena (Figura 45). Los resultados indican que la actividad catalasa en plantas atfh1 y as-AtFH disminuye aproximadamente un 40% y 51%, respectivamente, mientras
que luego del agregado de hemina, la actividad catalasa total se recupera a valores
cercanos a los mostrados por la línea wt.
137
Resultados y discusión
Figura 45. Actividad catalasa en mitocondrias aisladas de plantas wt, atfh-1 y as-AtFH en ausencia
(barras blancas) y presencia (barras negras) de 50 μM de hemina. Una unidad (U) se define como la
cantidad de enzima que cataliza el consumo de 1 ȝmol min -1 de H2O2.
Estos resultados sugieren que la disminución en la actividad catalasa se debe
a la ausencia de un grupo hemo funcional en las plantas deficientes en AtFH.
Asimismo, nuestros datos permiten pensar en una alteración de la actividad de la
catalasa 3, que es la isoforma que tiene localización mitocondrial. Por ello, nuestros
datos permiten avalar la hipótesis que AtFH tendría un papel importante en la
producción del grupo hemo interviniendo así en la biogénesis de hemoproteínas como
la catalasa. Estos resultados coinciden con lo postulado previamente a partir de
estudios en levaduras, donde se sugirió que la frataxina mantendría el Fe
biodisponible para su utilización en la síntesis de grupos Fe-S y hemo en el interior
celular (Lesuisse et al., 2003). Recientemente se informó que el agregado exógeno de
hemina, rescató el fenotipo de deficiencia de frataxina en células neuronales
incrementando la actividad de algunas Fe-S proteínas y de la citocromo oxidasa
(hemoproteína) (Napoli et al., 2007). Esto además está de acuerdo con reportes
recientes donde se informó que la eritropoyetina, que es sabido estimula la síntesis de
hemo, puede recuperar el fenotipo observado en células deficientes en frataxina
(Sturm et al., 2005).
138
Resultados y discusión
8.1.3. Efecto de la deficiencia de AtFH en enzimas claves de la síntesis del hemo
Mediante el análisis de microarreglos de ADNc de linfoblastos humanos
derivados de pacientes con FRDA y ratones mutantes en frataxina se informó una
deficiencia en los niveles de ARNm de la enzima coproporfirinógeno oxidasa
(CPOX). Además se detectó un aumento en los niveles de protoporfirina IX,
indicando la existencia de deficiencias en la síntesis del grupo hemo (Schoenfeld et
al., 2005). Posteriormente, se sugirió que la frataxina podría afectar la especificidad
de la ferroquelatasa hacia los iones hierro o zinc, alterando la incorporación de los
mismos dentro de la protoporfirina IX (Lesuisse et al., 2003; Schoenfeld et al., 2005).
El aumento de la actividad Zn- quelatasa en células deficientes en frataxina, sugieren
que una posible función para esta última podría ser la de ceder hierro hacia la
ferroquelatasa, y que bajo las condiciones de deficiencia de frataxina, la
ferroquelatasa se vuelve menos selectiva hacia la incorporación de hierro dentro de la
protoporfirina IX (Schoenfeld et al., 2005). Otros estudios han demostrado por
análisis de QRT PCR la disminución significativa de los trascriptos de ALAS1 (Ala
dehydratasa), CPOX (coproprfirinógeno oxidasa) y ferroquelatasa en células de
miocardio de ratas deficientes en frataxina (Puccio et al., 2001).
Para comprender mejor el efecto de la deficiencia de AtFH sobe la vía de
biosíntesis del hemo, evaluamos los niveles de transcriptos de varias enzimas claves
de esta vía metabólica. En primer lugar, investigamos los niveles de ARNm de los
dos genes que codifican para las ferroquelatasas de Arabidopsis: ferroquelatasa I
(AtFeCh1, At5g26030) y ferroquelatsa II (AtFeCh2, At2g30390). AtFeCh1, se
expresa en todos los tejidos de la planta, sin embargo su mayor expresión se
encuentra en raíces y flores y aumenta notablemente en presencia de sacarosa, daño
del tejido y estrés oxidativo (Pal Singh et al., 2002). Por otro lado, AtFeCh2 se
expresa en toda la parte aérea de la planta, en mucho mayor medida en flores y no se
expresa en raíces. Su expresión se ve reducida notablemente en tejidos dañados y en
estrés oxidativo (Pal Singh et al., 2002).
139
Resultados y discusión
Los niveles de AtFeCh1 y 2 se encontraron inducidos alrededor de 1.5 a 2
veces en las hojas de plantas atfh-1 y as-AtFH (Figura 46). En contraste, el ARNm de
AtFeCh1 no mostró variaciones significativas en flores de ambas líneas deficientes,
mientras que se observó una disminución de alrededor de 25% y 50% en flores de las
plantas atfh-1 y as-AtFH, respectivamente (Figura 46).
7
Expresión relativa
6
5
4
3
2
1
0
wt
atfh-1
as-AtFH
AtFeCh1
wt
atfh-1
AtFeCh2
as-AtFH
wt
atfh-1
as-AtFH
AtFeCh1
Hoja
wt
atfh-1
as-AtFH
AtFeCh2
Flor
Figura 46: Análisis por Q-PCR de la expresión de genes implicados en la síntesis del hemo:
ferroquelatasa I (AtFeCh1, At5g26030) y ferroquelatsa II (AtFeCh2, At2g30390) en hojas y flores de
plantas wt (barras blancas), atfh-1 (barras grises) y as-atfh (barras negras). El ARN total fue
retrotranscripto y amplificado usando primers específicos. Los datos se normalizaron a los niveles de
expresión de AtFeCh1 y AtFeCh2 en hojas de plantas wt.
Los resultados indican diferencias a nivel de la transcripción de los genes
AtFeCh1 y 2 en los órganos estudiados ante la deficiencia de AtFH. Esto puede
deberse a diferencias a nivel de la regulación transcripcional de estos dos genes, que
podrían responder a factores tejido u órgano específicos.
Por otro lado, también se midieron los niveles de transcripto para otras
enzimas que participan en la síntesis de hemo, porfobilinógeno sintasa-I (AtHemB1,
At1g69740) y porfobilinógeno sintasa-II (AtHemB2, At1g44318). Esta enzima
cataliza la síntesis de porfobilinógeno mediante la condensación asimétrica de dos
moléculas de ácido aminolevulínico. Todos los tetrapirroles incluído el hemo,
140
Resultados y discusión
clorofilas y vitamina B12, comparten como precursor común el porfobilinógeno
(Tanaka and Tanaka, 2007).
La Figura 47 muestra los resultados del análisis de la expresión de
AtHemB1 y AtHemB2. En hojas, se encontró una disminución de alrededor del 30% y
del 70% en los niveles de AtHemB1, en plantas atfh-1 y as-AtFH, respectivamente.
De forma similar, los niveles de AtHemB2 disminuyeron alrededor de 60% en ambas
líneas deficientes en AtFH. En contraste, no se observaron diferencias significativas
en la cantidad de AtHemB1 en las flores de las diferentes líneas, mientras que los
niveles de AtHemB2 se incrementaron 4 y 12 veces en las plantas atfh-1 y as-AtFH,
respectivamente (Figura 47).
5
4,5
Expresión relativa
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
wt
atfh-1
as-AtFH
AtHemB1
wt
atfh-1
AtHemB2
as-AtFH
wt
atfh-1
as-AtFH
AtHemB1
Hoja
wt
atfh-1
as-AtFH
AtHemB2
Flor
Figura 47: Análisis por Q-PCR de Porfobilinogeno sintasa-I (AtHemB1, At1g69740), y
Porfobilinogeno sintasa-II (AtHemB2, At1g44318) en plantas wt (barras blancas), atfh-1(barras grises)
y as-AtFH (barras negras) tanto en hojas como en flor. El RNA total fue retrotranscripto y amplificado
usando primers específicos. Los datos se normalizaron a los niveles de expresión de AtHemB1 y
AtHemB2 en hojas de plantas wt.
Los resultados reflejan la alteración de la expresión de los dos genes que
codifican para AtHemB e indican que esta alteración es tejido específica, de forma
similar a lo que ocurre con los genes que codifican para AtFeCh.
141
Resultados y discusión
Finalmente, decidimos investigar otro de los genes claves en la biosíntesis
del hemo, el de la coproporfirinógeno oxidasa (AtHemF2, At4g03205). Esta enzima
ha sido identificada como uno de los pasos regulatorio de la vía (Woodarda and
Dailey, 2000). Utilizando PCR en tiempo real, se observó una disminución de
alrededor del 60% y 80% en los niveles de transcripto AtHemF2 en hojas de plantas
atfh-1 y as-AtFH, respectivamente. En contraste, en órganos florales se encontró una
leve disminución en los niveles de AtHemF2 en plantas atfh-1, mientras que no se
encontraron diferencias significativas en los niveles de este transcripto en las plantas
as-AtFH cuando se comparó con las plantas wt (Figura 48).
3,5
Expresión relativa
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
wt
atfh-1
as-AtFH
wt
atfh-1
AtHemF2
AtHemF2
Hojas
Flores
as-AtFH
Figura 48: Coproporfirinógeno oxidasa (AtHemF2, At4g03205.2) en plantas wt(barras blancas), atfh1(barras grises) y as-atfh (barras negras), tanto en hojas (A) como en flor (B). El RNA total fue
retrotranscripto y amplificado usando primers específicos. La expresión relativa igual a 1 corresponde
al nivel de transcripción de AtHemF2 en hojas de plantas wt.
En conjunto, los resultados presentados muestran que la deficiencia de AtFH
en Arabidopsis conduce a una alteración en varios transcriptos de la vía de síntesis de
hemo. Esto sugeriría que al menos en hoja, la acumulación de este compuesto podría
generar una retroinhibición hacia la coproporfirinógeno oxidasa reduciendo de esta
manera los niveles de transcripción de AtHemF2 como se observa en la Figura 48.
Existiría entonces una vía de síntesis de hemo mitocondrial? Una posibilidad
es que la distribución dual o no de las ferroquelatasas sea diferente entre las distintas
142
Resultados y discusión
especies de plantas (Papenbrock et al., 2001, Masuda et al., 2003). Otra posibilidad es
la existencia de otra enzima mitocondrial que catalize la inserción de los metales
divalentes en la protoporfirina IX. Es sabido que dicha inserción puede llevarse a
cabo por reacciones tanto enzimáticas como no enzimáticas. Por ejemplo, los iones
ferrosos pueden ser insertados de manera no enzimática en la porfirina en presencia
de tiol reductores y ácidos grasos, pero estas reacciones no ocurrirían in vivo
(Taketani and Tokunaga, 1984). Si asumimos la presencia de otra proteína
mitocondrial, con baja afinidad por los metales como la ferroquelatasa (Papenbrock et
al., 2001; Cornah et al., 2002), es posible que tal enzima sea la responsable de la
menor producción de hemo en la mitocondria. En este caso, la secuencia nucleotídica
y aminoacídica de esta proteína podría ser significativamente diferente de la
ferroquelatasas conocidas (Masuda et al., 2003).
Como se mencionó en párrafos precedentes, si bien hay discrepancias sobre la
localización de algunas de las enzimas de la vía de síntesis del hemo en plantas,
nuestros datos nos permiten postular que la deficiencia de AtFH mitocondrial
provocaría la alteración de la transcripción de genes del metabolismo hemo, lo que
concuerda con los menores niveles de hemo encontrados en las plantas atfh-1 y asAtFH. La deficiencia de hemo funcional, alteraría también la actividad de algunas
hemoproteínas como la catalasa, hecho reflejado en la menor actividad catalasa total
que encontramos en diferentes tejidos como hojas y flores de las plantas atfh-1 y asAtFH, como así también en extractos de mitocondrias aisladas. En conjunto, nuestros
resultados permiten postular que AtFH tendría un rol importante en la biogénesis de
hemoproteínas dentro de la célula.
143
Conclusiones
Conclusiones
Conclusiones
x
La caracterización fenotípica de las plantas mutantes insercionales atfh-1, atfh-2,
atfh-3 y transgénicas as-AtFH y s-AtFH, reveló que frataxina es una proteína
esencial en plantas. A partir de los resultados expuestos podemos inferir que
AtFH sería indispensable en procesos de alto requerimiento energético como por
ejemplo la embriogénesis, la floración y la fructificación, avalando una de las
posibles funciones postuladas para ella, que es su participación en el
metabolismo energético mitocondrial.
x
Con el objeto de caracterizar la proteína a nivel bioquímico, se clonaron,
expresaron y purificaron las proteínas AtFH-His6 y AtFH-STOP de Arabidopsis
thaliana. Los estudios funcionales de ambas proteínas recombinantes mostraron
que tienen la capacidad de atenuar la reacción de Fenton in vitro. Los resultados
nos permiten concluír que AtFH es una proteína funcional y que estaría
involucrada en la homeostasis del Fe a través de la protección contra el daño
oxidativo causado por este metal y que tendría un papel importante en el
mantenimiento del estado redox celular.
x
La deficiencia de AtFH induce un aumento de los niveles de ROS tanto en hojas
como en raíz, generando modificaciones en la expresión de genes vinculados con
detoxificación y respuesta a estrés oxidativo. Este resultado está de acuerdo con
el aumento en la concentración del Fe presente en estas plantas, con capacidad
para catalizar la reacción de Fenton y así aumentar la producción de ROS. Por
otro lado, hemos visto un aumento en la expresión de AtFH
luego del
tratamiento con H2O2. En conjunto, estos datos nos permiten confirmar que AtFH
está comprometida en la respuesta a estrés oxidativo en organismos vegetales.
x
La disminución en la concentración de ATP, junto con un descenso en el
consumo de O2 de las plantas atfh-1 y as-AtFH indican que la deficiencia de
frataxina lleva a una disfunción mitocondrial, acorde al papel propuesto para
AtFH en el metabolismo energético celular y la fosforilación oxidativa.
145
Conclusiones
Conjuntamente, se observó una inducción en la expresión de dos genes nucleares,
PSST y NADHbp y del gen mitocondrial Nad9, que codifican para subunidades
Fe-S del CI respiratorio. Ésto sugeriría que existe una compensación nuclear y
una adaptación mitocondrial, respectivamente, en respuesta a la disfunción de la
organela. Si bien los genes mencionados mostraron una inducción ante la
deficiencia de AtFH y no se observaron cambios en la cantidad de proteína
NAD9, se encontró que la actividad del CI mitocondrial en las plantas AtFH
deficientes estaba disminuída. Por ésto, frataxina sería una proteína
indispensable, posiblemente involucrada en el correcto ensamblaje de los grupos
Fe-S a apoproteínas o tendría un papel relevante en la reparación de los grupos
Fe-S dañados. Los resultados indican que AtFH cumple un papel importante en el
correcto funcionamiento de la cadena de transporte electrónico mitocondrial.
x
En las líneas mutantes para AtFH se observaron bajos niveles de actividad de las
proteínas Fe-S mitocondriales SDH y aconitasa, y altos niveles en la expresión de
los ARNm que codifican para SDH2-1, SDH2-2 y ACO, mientras que no se
encontró alterada la actividad de proteínas sin grupos Fe-S como la MDH. Estos
resultados indican que AtFH estaría involucrada en la modulación de la actividad
y biogénesis de algunas ferrosulfoproteínas mitocondriales como el CII y la
aconitasa.
x
Si bien en plantas existen discrepancias sobre la localización de algunas de las
enzimas de la vía de síntesis del hemo, nuestros datos nos permiten postular que
la deficiencia de AtFH mitocondrial provocaría la alteración de la transcripción
de genes de la biosíntesis de hemo, lo que concuerda con los menores niveles de
este último encontrados en las plantas atfh-1 y as-AtFH. La deficiencia de hemo
alteraría también la función de algunas hemoproteínas como la catalasa, hecho
reflejado en los menores niveles de actividad de esta enzima medidos en hojas y
flores, como así también en extractos de mitocondrias aisladas de las plantas atfh1 y as-AtFH. En conjunto, nuestros resultados permiten postular que AtFH
tendría un papel importante en la biogénesis del grupo hemo y de hemoproteínas
dentro de la célula vegetal.
146
Resumen
Resumen
Resumen
Dos procesos fundamentales que llevan a cabo los organismos vegetales son
la fotosíntesis y la respiración. Dichos procesos requieren la participación de
diferentes proteínas y complejos multiproteicos, muchos de ellos formados por
ferrosulfoproteínas y hemoproteínas. La maduración de ferro-sulfoproteínas es una
de las funciones esenciales de la mitocondria, ya que las proteínas Fe-S constituyen
una familia de moléculas involucradas en varias funciones celulares de gran
importancia. Son constituyentes de los complejos respiratorios mitocondriales CI,
CII y CIII y también están presentes en la matriz mitocondrial (aconitasa). En los
últimos años se intensificó el estudio del ensamblaje de los centros Fe-S y su
inserción en polipéptidos para producir proteínas funcionales. Sin embargo, existe
muy poca información sobre la ocurrencia de estas vías en organismos vegetales.
A partir de estudios en células de mamíferos y levaduras, se postuló la
participación de frataxina en el ensamblado de centros Fe-S, metabolismo energético
mitocondrial, respiración y homeostasis del hierro. Frataxina es una proteína
mitocondrial y está altamente conservada desde bacterias hasta mamíferos y plantas,
sin presentar mayores cambios estructurales, especialmente en el dominio Cterminal. Esto sugiere que esta proteína cumpliría funciones similares en todos estos
organismos.
El objetivo de este trabajo de Tesis es la caracterización de proteínas que
participarían en la biogénesis de proteínas Fe-S y hemoproteínas mitocondriales. El
estudio está enfocado a investigar la función del homólogo de frataxina de
Arabidopsis thaliana (AtFH).
El análisis fenotípico y molecular de plantas deficientes en AtFH reveló que
esta proteína es esencial en plantas y está involucrada en diferentes procesos de alto
requerimiento energético como son la embriogénesis, la floración y la fructificación.
La deficiencia de AtFH conduce a una disfunción mitocondrial asociada con una
menor tasa respiratoria y la disminución del contenido de ATP celular. Por otro lado,
148
Resumen
AtFH es requerida para la actividad completa de proteínas Fe-S mitocondriales como
el CI, CII y la aconitasa, sugiriendo que esta proteína está involucrada en la
respiración mitocondrial y la fosforilación oxidativa. Estudios bioquímicos
realizados con la proteína AtFH recombinante in vitro, sugirieron su participación en
la protección contra daño oxidativo, homeostasis del Fe y mantenimiento del estado
redox celular. Estos datos están de acuerdo con el aumento de especies reactivas de
oxígeno observado en las plantas deficientes en AtFH.
Además, las plantas
deficientes en AtFH mostraron una alteración en la transcripción de ARNm de genes
involucrados en la biosíntesis de hemo, como así también menores niveles de hemo
total. Estos datos confluyen con los menores niveles de actividad catalasa
encontrados en las plantas con deficiencia en AtFH. En conjunto, nuestros resultados
nos permiten sugerir que AtFH está involucrada además en la biosíntesis del grupo
hemo y la biogénesis de hemoproteínas en plantas.
149
Referencias
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