Universidad Nacional de San Martín Instituto de Investigaciones

Universidad Nacional de San Martín
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas
GENÉTICA MOLECULAR 2011
GUíA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
Docentes
Dra. Paula ALVAREZ
Dra. Vanina CAMPO
Dr. Alejandro CASSOLA
Dra. Alejandra D’ANTUONO
Dr. Javier DE GAUDENZI
Lic. Georgina MORETTI
Lic. Ana GONZÁLEZ WUSENER
Lic. Diana WEHRENDT
CONDICIONES DE CURSADA Y APROBACIÓN DEL TP
El horario de los TP será los martes y viernes de 14:00 a 19:00 hs.
Los TPs y clases de Seminarios y Problemas, son de asistencia obligatoria.
Durante el cuatrimestre los alumnos serán evaluados por medio de: (1) Un seminario de
bibliografía, (2) Un parcialito después de cada clase de seminarios, (3) Un parcialito antes
de cada práctico, (4) Un informe de cada Trabajo Práctico donde se explique la labor
realizada y los resultados obtenidos, y (5) Un parcial práctico.
Régimen de aprobación•
Se deberá asistir como mínimo al 80% de las clases de seminarios y
laboratorios. Dos asistencias computadas como TARDE equivalen a un
AUSENTE.
•
Se deberán aprobar TODOS los informes de laboratorio con nota ≥ 5. De ser
desaprobado un informe, el mismo DEBERÁ ser presentado hasta su
aprobación.
•
Los parcialitos se deberán aprobar con una nota ≥ 5.
•
Se deberá aprobar un examen práctico con nota ≥ 5. Este parcial puede ser
recuperado.
Composición de la nota- Nota final de TP = 15% Nota de parcialitos + 10% Nota de
Seminario de bibliografía + 15% Nota de los informes + 60% Nota de Parcial
práctico. Los TP se aprobarán con una nota final ≥ 5, mientras que para
promocionar será necesaria una nota ≥ 7. Es condición para promocionar la materia
la aprobación de todos los parcialitos, y no haber recuperado el parcial práctico ni
el informe final.
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 2
ALGUNAS REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS
Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas
destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios
derivados de la actividad, y a evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su
ámbito de trabajo, como hacia el exterior. Las reglas básicas aquí indicadas son un
conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma rutinaria. El elemento clave
es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información, que permitan reconocer y
combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental la realización
meticulosa de cada técnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede
sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja.
1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo,
tales como: matafuegos, salidas de emergencia, accionamiento de alarmas, etc.
2. No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse.
3. No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que contengan
drogas.
4. Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello
recogido (guardapolvo preferentemente de algodón y de mangas largas, zapatos
cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes).
5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable
directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de
laboratorio y antes de retirarse del mismo.
7. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o
material biológico. Ninguna persona cuyos guantes se encuentren contaminados deberá
tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas,
cuadernos, etc.
8. No se permitirá pipetear con la boca.
9. No se permitirá correr en los laboratorios.
10. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos, se
utilizarán anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos de
protección. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o puedan
provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto.
11. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, máquinas u otros
elementos que entorpezcan la correcta circulación.
12. Todo material corrosivo, tóxico, inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo
deberá estar adecuadamente etiquetado.
12. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, y aquellas que
pueden ser riesgosas por inhalación deben llevarse a cabo bajo campana.
13. Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente
de ignición. No se operará con materiales inflamables o solventes sobre llama directa o
cerca de la misma. Para calentamiento, sólo se utilizarán resistencias eléctricas o
planchas calefactoras blindadas. Se prestará especial atención al punto de inflamación y
de autoignición del producto.
14. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será
conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plásticas.
El que sea necesario reparar se entregará limpio al lavadero.
15. Será necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y deba
ser descartado, sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente apropiado y
luego con agua varias veces.
16. Está prohibido descartar líquidos inflamables, tóxicos, corrosivos o material biológico
por los desagües de las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. En cada
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 3
caso se deberán seguir los procedimientos establecidos para la gestión de residuos.
Consultar al Servicio de Higiene y Seguridad.
17. No almacenar en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas, debe hacerse en
estantes bajo mesadas y, en caso de ácidos o álcalis concentrados (mayor de 2 N), deben
ser mantenidas dentro de lo posible en bandejas de material adecuado.
18. En la entrada al Ed. 24 se encuentra un botiquín de primeros auxilios con los
elementos indispensables para atender casos de emergencia.
Procedimientos ante emergencias
Emergencias médicas:
Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o ingestión
accidental de algún producto químico, tóxico o peligroso, proceder de la siguiente manera:
1. A los accidentados se les proveerán los primeros auxilios.
2. Avisar al Jefe de Laboratorio o autoridad a cargo, quienes solicitarán asistencia médica.
3. Centros para requerir ayuda médica:
S.A.M.E. Teléfono 107
Hospital Pirovano
Av. Monroe 3555 Tel. 4542-5552 / 9279
INTOXICACIONES:
Hospital de Niños. Dr. R. Gutiérrez
Sánchez de Bustamante 1399. Capital Federal. Tel: 4962-6666.
Hospital de Niños. Dr. P. de Elizalde
Av. Montes de Oca 40 Tel. 4307-7491 Toxicología 4300-2115
QUEMADURAS:
Hospital de Quemados
P. Goyena 369 Tel. 4923-4082 / 3022
OFTALMOLOGÍA:
Hospital Santa Lucía
San Juan 2021 Tel. 4941-7077
Hospital Dr. P. Lagleyze
Av. Juan B. Justo 4151 Tel. 4581-0645 / 2792
En caso de incendio:
1. Mantenga la calma. Lo más importante es ponerse a salvo y dar aviso a los demás.
2. Si hay alarma, acciónela. Si no, grite para alertar al resto.
3. Avise inmediatamente al docente informando el lugar y las características del
siniestro.
4. Si el fuego es pequeño, y sabe utilizar un extintor, úselo. Si el fuego es de
consideración, no se arriesgue y, manteniendo la calma, ponga en marcha el plan de
evacuación.
5. Si debe evacuar el sector, apague los equipos eléctricos y cierre las llaves de gas y
ventanas.
6. Evacue la zona por la salida más próxima.
7. No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas.
No utilice ascensores. Descienda siempre que sea posible.
8. No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida.
9. Si pudo salir, por ninguna causa vuelva a entrar.
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 4
Teléfonos útiles:
BOMBEROS Teléfono 100
Derrame de productos químicos
1. Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada.
2. Notificar a las personas que se encuentren en las áreas cercanas acerca del derrame.
Colocar la cinta de demarcación para advertir el peligro.
3. Evacuar a toda persona no esencial del área del derrame.
4. Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignición, y las fuentes de
calor.
5. Debe evitarse la inhalación de los vapores del material derramado. Si es necesario,
utilizar una máscara respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame.
6. Ventilar la zona.
7. Utilizar los elementos de protección personal tales como: equipo de ropa resistente a
ácidos, bases y solventes orgánicos, y guantes.
8. Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para ello, extender los
cordones en el contorno del derrame.
9. Luego absorber el derrame con piedras sanitarias.
10. Dejar actuar y luego recoger con pala. Colocar el residuo en una bolsa identificada y
cerrarla.
11. Comunicarse con el Servicio de Higiene y Seguridad para disponer la bolsa con los
residuos.
12. Si el derrame es de algún elemento muy volátil dejar dentro de la campana hasta que
lo retire para su disposición.
13. Lavar el área del derrame con agua y jabón. Secar bien.
14. Cuidadosamente retirar y limpiar todos los elementos que puedan haber sido
salpicados por el derrame.
15. Lavar los guantes, la máscara y ropa.
CUPÓN PARA ENTREGAR AL DOCENTE:
El alumno .......................................................................................... de la materia
Genética Molecular ha leído minuciosamente la guía de Normas Mínimas de
Seguridad que acompaña esta guía.
Fecha: ...............................................
Firma: ...............................................
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 5
CRONOGRAMA GENETICA 2010
TP #1. Subclonado del gen gfp en plásmido de expresión pGEX (Alejandra
D’Antuono)
Explicación general del TP. Clonado y sub-clonado de DNA. Restricción del DNA.
Vectores de expression procariotas y eucariotas. Desfosforilación de DNA.
TP #2. Subclonado de GFP en plásmido de expresión pGEX (Paula Alvarez)
Gel de agarosa. Purificación de DNA (QUIAEX). Cuantificación del DNA por gel. Ligación
de DNA.
TP #3: Transformación bacteriana (Ana González Wusener)
Transformación bacteriana y armado de placas.
TP #4: Screening (Vanina Campos)
Selección de colonias bacterianas recombinantes por PCR. Corrida gel PCR.
TP #5: Minipreparación de DNA plasmidico (Diana Wehrendt)
Preparación de DNA plasmídico. Análisis por restricción de colonias bacterianas
recombinantes.
TP #6: Inducción de la expresión génica (Alejandro Cassola)
Inducción de la expresión génica y visualización de la expresión de GFP en cultivos
bacterianos.
TP #7: Proteinas de fusión. Purificación de proteínas recombinantes (Alejandro
Cassola)
Procesado de cultivos que sobreexpresan GFP. Purificación de proteínas recombinantes
utilizando glutation agarosa.
TP #8: Electroforesis de proteinas en geles de poliacrilamida (Alejandro Cassola)
Evaluación de la inducción de GFP en geles de proteínas. Identificación de la proteína de
fusión (GFP-GST) en geles nativos y desnaturalizantes.
TP #9: Western blot (Georgina Moretti)
Evaluación de la expresión de GFP utilizando un anticuerpo policlonal específico.
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 6
(Martes 14-19.30hs)
29-Mar
(Viernes 14-19.30hs)
01-Abr
TP 1 (Clonado/Sub-clonado)
Alejandra D'Antuono
05-Abr
TP 1 (Clonado/Sub-clonado)
Alejandra D'Antuono
08-Abr
Bibliotecas/Problemas
Vanina Campos ( 1a 8 )
12-Abr
TP 2 (Clonado/Sub-clonado)
Paula Alvarez
15-Abr
TP 3 (Transformación)
Ana
Problemas
Georgina (9a 14 y 15-19)
Seminarios I
Santiago Carmona
19-Abr
22-Abr
Seminarios II
Santiago Carmona
26-Abr
Feriado
29-Abr
TP 4 (Screening-PCR)
Vanina Campos
03-May
TP 4 (Screening-PCR)
Vanina Campos
06-May
TP 5 (Screening- MP)
Diana
10-May
TP 5 (Screening- MP)
Diana
13-May
Seminarios III
Alejandro Cassola
Problemas
Paula Alvarez (20-27)
Seminarios IV
Alejandro Cassola
17-May
20-May
TP 6
Alejandro Cassola (Proteinas I)
24-May
TP 6
Alejandro Cassola (Proteinas I)
27-May
TP 7
Alejandro Cassola (Proteinas II)
31-May
TP 7
Alejandro Cassola (Proteinas II)
03-Jun
TP 8
Alejandro Cassola (Proteinas III)
07-Jun
TP 8
Alejandro Cassola (Proteinas III)
10-Jun
TP 9
Georgina Moretti (Westen Blot)
GENÉTICA MOLECULAR
TP 9
Georgina Moretti (Westen Blot)
GUÍA DE TP - 7
Guía para la confección de un informe de Trabajos Prácticos
Informe Trabajo Práctico Nº X
Autores:
Objetivo.
LA “PREGUNTA” del TRABAJO PRACTICO
• Expresar muy claramente el objetivo primario y secundarios, si los hubiera.
Materiales y Métodos.
• Mencionar en forma secuencial los pasos metodológicos (sin detalle de protocolo,
esto está en la guía de TP)
• Fundamentar los métodos relevantes utilizados.
Resultados obtenidos.
• Datos colectados;
Utilizar tablas y gráficos (si corresponde)
• Análisis de los datos (resultados):
Debe ser claro y conciso (La figura XX muestra….)
No repetir todos los datos, solo aquellos necesarios para explicar los resultados
obtenidos
Un tópico por párrafo
Seguir un orden (Cronológico)
No sacar conclusiones
Ir de lo descriptivo, a la asociación simple, a la interacción multivariada
Datos = Hechos (números, mediciones)
Resultados = Significado de los datos
Discusión y conclusiones
Interpretación de los resultados que se obtuvieron.
Análisis de los posibles errores y de las limitaciones del estudio.
Recuerde los tiempos verbales a utilizar en la escritura de un trabajo científico:
–Introducción: presente
–Objetivos: infinitivo
–Materiales y métodos: pasado (Ya se hizo)
–Resultados: pasado (condiciones particulares)
–Discusión: ambos
•resultados propios: pasado
•resultados de otros: presente
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 8
TP #1 y 2
CLONADO y SUBCLONADO
Cada grupo recibirá un plásmido recombinante que porta el gen gfp completo. A partir
de este plásmido, y mediante una restricción del mismo, se purificará el fragmento
correspondiente al inserto gfp (de aproximadamente 700 pares de bases) y se lo ligará al
vector pGEX. Los productos de ligación serán introducidos por transformación en
bacterias E. coli DH5α competentes. Las colonias portadoras del plásmido recombinante
serán identificadas por digestión y PCR.
El vector de expresión de la línea pGEX, permite obtener una proteína de fusión a
Glutatión-S-transferasa (GST). Utilizando los mapas de ambos vectores y del inserto (ver
apéndice) se determinarán los sitios de restricción a utilizar.
DIA 1
A) Digestión con enzimas de restricción
1) Colocar en un tubo Eppendorf:
DNA (1 µg/µl)
____ µl
Buffer de reacción 10X
____ µl
BSA 10X
____ µl
Enzima 1 (10 UE/µl)
____ µl
Enzima 2 (10 UE/µl)
____ µl
H20 csp
____ µl
2) Incubar a 37 °C por 2 horas. Transcurrido este t iempo, guardar los tubos a -20°C hasta
el próximo TP.
NOTA. Los manuales de laboratorio recomiendan la utilización de 1 U de enzima de restricción por
µg de ADN a digerir. En la práctica, debido a las concentraciones en que vienen las enzimas y a
que las enzimas no se pueden guardar diluídas, se suele utilizar un exceso de las mismas (5 - 10
U/µg). Realizar las reacciones de acuerdo a los protocolos elaborados en la clase.
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 9
DIA 2
B) Desfosforilación ADN
Las fosfatasas alcalinas catalizan la eliminación de un grupo fosfato 5’ de una cadena de
ADN. Es conveniente desfosforilar un vector que ha sido digerido con una enzima de
restricción con la finalidad de evitar la religación del mismo. Esto impediría la ligación del
fragmento de ADN que se quiere ligar. En este caso el ADN doble cadena del inserto
aporta dos grupos fosfatos 5’ para participar en dos de los cuatro enlaces que serían
necesarios para formar 1hebra de ADN doble cadena recombinante circular cerrado.
Procedimiento
Agregar al mismo tubo donde se hizo la reacción de digestión del plásmido pGEX, 1U
de CIP (Calf Intestinal Phosphatase) por pmol de terminales de ADN.
El alumno deberá calcular la cantidad de enzima necesaria y las condiciones exactas
de reacción de acuerdo a los manuales de laboratorio.
C) Electroforesis preparativa - Purificación de fragmentos de ADN utilizando QIAEX
II
1 Sembrar en un gel de agarosa la reacción de digestión del plásmido pGEM-T-GFP, así
como el vector pGEX desfosforilado;
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 10
2 Correr hasta obtener una buena resolución de los fragmentos;
3 Terminar la electroforesis y poner el gel sobre un transiluminador UV.
Comprobar que la digestión fue total. ¿Qué espera obtener para cada caso?
¡Protegerse los ojos de la radiación UV!
4 Cortar la porción de gel correspondiente al fragmento de ADN deseado usando un
escalpelo (cuidado de no rayar el transiluminador), colocarla dentro de un tubo eppendorf
de 1,5 ml y pesarla;
5 Purificar utilizando el kit comercial QIAEX II.
Procedimiento QUIAEX II
1 Agregar 3 volúmenes de una solución NaI 6M (buffer QX1) e incubar durante 5 min a
52ºC para derretir la agarosa
2 Controlar el pH de la solución mediante el indicador coloreado de la solución QX1.
Debe permanecer amarillo (ácido), en caso de virar al rojo, reajustar el pH agregando 10µl
AcONa 3M pH 5.2
3 Agregar 10 µl de resina Qiaex II, resuspender bien con vórtex e incubar por 10 min a
52ºC agitando ocasionalmente
4
Centrifugar durante 1 min a 14000 rpm
5 Descartar el sobrenadante y resupender el pellet en 500 µl de solución de lavado
(buffer PE). Para el caso del inserto, proveniente de gel, repetir el lavado con QX1, previo
al lavado con PE
6 Repetir el lavado 2 veces
7 Extraer la solución del último lavado y dejar secar 5 min en un bloque a 37ºC.
8 Resuspender el pellet en 15 µl de agua, vortexear e incubar 10 min a 50ºC agitando
ocasionalmente.
9 Centrifugar durante 1 min a 14000 rpm y guardar el sobrenadante.
10 Cuantificar el rendimiento en gel de agarosa con Bromuro de etidio.
Alternativa. Purificación de fragmentos de ADN por precipitación con etanol
1
1
Realizar una extracción con cloroformo y centrifugar (conservar la fase acuosa)
Agregar 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M pH 5,2 y luego 3 volúmenes de etanol 100%
frío
2
Incubar a -20C° 30 min
3
Centrifugar durante 30min en microcentrífuga a 14.000 rpm.
4
Secar el pellet y resuspender en 500 µl de buffer TE
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 11
5
Cuantificar una alícuota en un contador para radiación.
¿En qué propiedades se basa cada método para la separación?
D) Ligación de fragmentos de ADN
El fragmento purificado por cada grupo se ligará al vector pGEX en diferentes relaciones
molares.
Se incluirán dos controles de “background”, uno de vector solo sin ligasa (para conocer la
cantidad de vector no cortado por ninguna enzima) y otro de vector solo con ligasa (para
conocer la cantidad de vector capaz de recircularizarse sin inserción, es decir cortado con
sólo una de las dos enzimas utilizadas).
¿Podría realizar un control adicional?
Los componentes de la mezcla de ligación son:
•
Inserto y Vector (usar de 20-50 ng)
Recuerde que:
ng Inserto = ng Vector x kb Inserto x relación molar Inserto:Vector
kb Vector
•
Buffer T4 ADN ligasa 10X: 50 Mm Tris pH7.5, 10 Mm Cl2Mg, 10 Mm DTT, 1 Mm
ATP, 25 µg/ml BSA
•
T4 ADN ligasa: se usan 20 a 40U/por reacción de ligación (1 µl de una dilucion
1/10)
•
Agua: csp 10 µl
1) Rotular tubos eppendorf como A, B, C, D, E y F y agregarles (las cantidades están en
µl):
Componentes
A
B
C
D
Inserto(0,7kb – X ng/µl)
Vector (5,6kb – 20 ng/µl)
E
F
--------
---------
--------
Buffer 10X
1
1
1
1
1
1
T4 ligasa (40U/µl)
1
1
1
1
1
----------
H2Odd csp
10 µl
10 µl
10 µl
10 µl
10 µl
10 µl
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 12
Nota. Si los volumenes de inserto a agregar lo permiten, se sugiere realizar la reacción de ligación utilizando 50
ng de vector en vez de 20 ng y ajustar las cantidades de inserto acorde a esta modificación. Discutir esta opción
con los docentes.
2) Incubar a temperatura ambiente durante 4 horas. Alternativamente puede dejarse toda
la noche a 16 ºC.
3) Guardar a -20 °C hasta el momento de la transfor mación bacteriana.
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 13
TP #3
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
A) Transformación baceriana
1 Descongelar las bacterias y dejarlas inmediatamente en hielo 10 min. Cada tubo
contiene 200 µl de bacterias E. coli competentes por el método de Cl2Ca.
2
Agregar 10 µl de la reacción de ligación
3 Incubar en hielo 30 min
4 Incubar 30-45 segundos a 42°C y luego reposar 2 m inutos en hielo (shock térmico)
5 Inocular tubos conteniendo 1 ml de LB y agitar 1 hora a 37°C ( recuperación)
6 Sembrar 200 µl en placas de petri con LB agar conteniendo ampicilina 100 µg/ml final.
B) Preparación de placas de LB agar
1 Se derrite una solución de LB agar en el microondas y se deja enfriar hasta que pueda
ser tocada con la mano (aprox. 50ºC).
2 Agregar ampicilina 100 µg/ml concentración final
3 Alicuotar en esterilidad (aproximadamente 15 ml/placa) y dejar solidificar
4 Incubar a 37ºC en forma invertida para secarlas
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 14
TP #4
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
A) Reacción de PCR
1. Colocar en un tubo Eppendorf una mezcla de reacción considerando volúmenes
suficientes para ____ tubos de PCR
Discutir que controles se deben incluir en este u otro ensayo y que dato puede aportar.
Concentración
x 1 (µl)
Mix ______x (µl)
final
Templado
Buffer Taq Polimerasa (sin Mg) 10X
MgCl2 (50 mM)
dNTP's (10mM c/u)
Primer I (100 ng/µl)
Primer II (100 ng/µl)
Enzima Taq Polimerasa (5U/µl)
H2O csp
•
•
•
Enzima. Taq ADN polimerasa, aislada de Thermus aquaticus.
Buffer: 200 mM Tris-HCl (pH 8,4), KCl 500 mM.
MgCl2. Concentración final: entre 1 y 5 mM. ¿En que fenómeno de la reacción está actuando este
ion? ¿En qué afectan los extremos de este rango?
•
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Concentración final 100 µM. Discutir en que fenómeno de la
reacción está actuando
•
Oligonucleótidos: Llevar a concentración final: 1 ng/µl. Discutir diseño y especificidad. Cálculo de
Tm para cada uno de los oligos de acuerdo a la secuencia nucleotídica de los mismos y al Tm que
usted utilizaría para la PCR.
•
Templado: pBlueScript II conteniendo el gen de la GFP.
¿Tiene alguna importancia la topología del ADN molde en el rendimiento de la reacción?
2 Llevar a cabo la reacción de PCR bajo las siguientes condiciones:
a) 1 ciclo
94°C
3 minutos (desnaturalización )
b) 35 ciclos
94°C
30 segundos (desnaturalizac ión)
c) 1 ciclo
X°C
30 segundos (apareamiento)
72°C
45 segundos (elongación)
72°C 10 minutos (elongación final)
¿En que se basa para elegir las T° y tiempos de des naturalización, annealing de los primers y
polimerización?
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 15
B) Análisis de los productos obtenidos en geles de agarosa
1 Colocar la solución de agarosa (aproximadamente 50 ml/gel) por 1 minuto en
microondas. Esta solución contiene: Agarosa 1-2% TBE 0,5 X
2 Cuando la solución se encuentre fundida y homogénea dejarla enfriar hasta que se
pueda tocar con la mano y agregar Bromuro de etidio 0,5 µg/ml.
¡El Bromuro de Etidio es un potente mutágeno, manejar todas las soluciones que
lo contengan con guantes!
3 Volcar la solución de agarosa en la cuba, que debe tener colocados el peine y los
separadores. Evitar la formación de burbujas. Esperar hasta que gelifique completamente
antes de usar
4 Agregar TBE 0,5 X hasta cubrir el gel y retirar cuidadosamente el peine y los
espaciadores.
Preparación de las muestras y siembra del gel
1 Mezclar la solución de ADN con el buffer de siembra (que se encuentra preparado 6
veces por encima de su concentración de uso; esto es, 6X en la jerga)
2 Cargar la pipeta con la muestra. Apoyar con delicadeza en uno de los bordes del
pocillo (calle, en la jerga). Descargar lentamente la pipeta hasta el primer tope. No llevar
al segundo tope aunque no haya descargado por completo para evitar la formación de
burbujas.
3 Conectar la fuente teniendo cuidado de que el polo positivo este en el lado opuesto al
sitio de siembra. Correr a voltaje constante (se usan unos 5 Volt/cm, midiendo la distancia
entre los polos de la cuba) hasta lograr una buena resolución de fragmentos.
4
Apagar la fuente. Colocar el gel sobre un transiluminador de luz ultravioleta.
¡Observar manteniendo en todo momento los ojos protegidos de la radiación UV!
Soluciones utilizadas
TBE 1X
Tris Base
135mM
Ac. Bórico
45mM
EDTA
2,5mM
Buffer de siembre 6X:
Orange G o Azul de bromofenol 0,25%
Glicerol
GENÉTICA MOLECULAR
30%
GUÍA DE TP - 16
TP #5
PURIFICACION DE ADN PLASMIDICO. SCREENING
A) Purificación de ADN plasmídico por el método de lisis alcalina
1 Inocular las colonias aisladas de las transformaciones en 4 ml de medio LB con
ampicilina (100µg/ml), dejar crecer ON a 37 °C con agitación
2 Centrifugar el cultivo bacteriano (3 ml total) durante 2 minutos a 6000 rpm a
temperatura ambiente en microcentrífuga
3
Descartar el sobrenadante por inversión
4
Resuspender completamente el pellet bacteriano en 200 µl de buffer P1
5 Agregar 200 µl de buffer P2. Mezclar suavemente por inversión del tubo (4-6 veces).
Incubar a temperatura ambiente 5 minutos exactos!
6 Agregar 200 µl de buffer P3 frío. Mezclar inmediatamente y muy suavemente. Incubar
en hielo 10 minutos.
7
Centrifugar 15 minutos a 10000 rpm.
8 Transferir el sobrenadante a otro tubo eppendorf y mezclar con 0.7 volúmenes de
isopropanol. Agitar por inversión 4-5 veces y centrifugar inmediatamente a 14000 rpm
durante 30 minutos
9
Descartar el sobrenadante cuidadosamente
10 Lavar el ADN con 200 µl de etanol 70 % (no agitar ni resuspender)
11 Centrifugar 5 minutos a 14000 rpm
12 Descartar el sobrenadante cuidadosamente
13 Secar el pellet durante 5 minutos a 37ºC y resuspender en 30 µl de H2O o Tris/HCl
10mM pH 7
14 Cuantificar en gel de agarosa el rendimiento de la purificación por comparación de la
intensidad de fluorescencia con cantidades conocidas de ADN del fago λ.
Buffer P1 (buffer de resuspensión)
RNasa A100 µg/ml; Tris/HCl pH 8 50 mM; EDTA pH 8.0 10 mM
Buffer P2 (buffer de lisis)
NaOH 200 mM; SDS 1 %
Buffer P3 (buffer de neutralización)
AcK pH 5.5
3.0 M
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 17
B) Identificación de clones positivos por restricción
1) Colocar en un tubo Eppendorf:
DNA (1 µg/µl)
____ µl
Buffer de reacción
____ µl
BSA 10X
____ µl
Enzima 1 (10 UE/µl)
____ µl
Enzima 2 (10 UE/µl)
____ µl
H20 csp
____ µl
2) Incubar a 37 °C por 2 horas;
3) Analizar en gel de agarosa.
¿Qué otras metodologías podría emplear para determinar los clones que contienen el
inserto de interés?
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 18
TP #6
PROTEINAS RECOMBINANTES
DIA 1
A) Inducción de la expresión proteica
1 Tomar 0,3 ml del cultivo crecido O.N. (pGEX-gfp) e inocular 3 ml de caldo Terrific
Broth. Realizar la operación por duplicado (uno será el control sin inducir).
2 Incubar 1 h a 37ºC con agitación.
3 Inducir uno de los cultivos por agregado de IPTG a una concentración final de 0.2 mM,
e incubar 2 h a 37ºC con agitación.
4 Cosechar 3 ml de cada cultivo, centrifugando 1,5 ml por 5 min a 5000 rpm. Descartar el
sobrenadante por volcado y volver a cosechar 1,5 ml en el mismo tubo. Descartar el
sobrenadante.
5 Observar al UV y comparar los pellets de cultivos inducidos y no inducidos. Guardar los
pellets congelados a –20ºC hasta el próximo TP.
DIA 2
A) Purificación de proteinas recombinantes fusionadas a GST
1 Resuspender los pellets congelados en 500 µl de TBS conteniendo inhibidores de
proteasas (PMSF 1 mM y EDTA 3 mM).
2 Sonicar las muestras con 3 pulsos de 20 segundos, realizando intervalos de 30
segundos en hielo.
3 Agregar a cada muestra Triton X-100 1% final e incubar en hielo por 10 minutos.
4 Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm.
5 Tomar el sobrenadante e incubarlo con la resina de glutation agarosa (previamente
hidratada en TBS) durante 1 hora en cámara fría (4° C).
6 Centrifugar 1 min a 3000 rpm, sacar el sobrenadante y guardarlo en tubo nuevo en
hielo.
7 Realizar 3 lavados con 500 µl TBS-Triton X-100 1%, resuspendiendo la resina
gentilmente por inversión. Se centrifuga 1 min a 3000 rpm entre lavados. Descartar los
lavados.
8 Realizar la elución en dos pasos:
8.1 Incubar la resina en presencia de Trombina (1 Unidad), durante 1 hora con agitación,
en un volumen final de 100 µl de TBS-CaCl2 3 mM. Esta es una proteasa que corta
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 19
específicamente en la secuencia de reconocimiento presente en la proteína de fusión
(Donde cree usted que está ubicada la secuencia de corte para la Trombina en la proteína
de fusión? Para que cree usted que se incluye un sitio de corte para una proteasa como
parte de esta proteína de fusión?). Luego guardar el sobrenadante en hielo (4ºC).
8.2 Lavar la resina con 1 ml de con TBS-Triton X100 1%.
8.3 Incubar la resina con 100 µl de glutation reducido 15 mM por 10 minutos en agitación
a temperatura ambiente y guardar el sobrenadante.
9 Congelar los tubos hasta el próximo TP.
DIA 3
A) Electroforesis en condiciones desnaturalizantes
A.1) Preparación de la muestra para geles desnaturalizantes (SDS-PAGE )
1 Mezclar 14 µl de cada muestra con DTT (0.1M final) y Cracking buffer 5X (1X final) e
incubarlo por 3 minutos a 100° C.
2 Centrifugar 2 min a 14.000rpm.
3 Sembrar las muestras en geles 10% acrilamida-bisacrilamida 29:1 de acuerdo a la
indicación del docente.
A.2) Preparación geles desnaturalizantes y electroforesis
Gel Separador 10% (10ml gel)
Acri: Bis (29:1)
Agua
3.33 ml
2.76 ml
SDS 10%
0.1 ml
Tris-HCl 1M pH 8.8
3.75ml
APS 10%
100 µl
Temed
10 µl
Gel Stacking 5% (5 ml gel)
Acri: Bis (29:1)
Agua
0.83 ml
3.45 ml
SDS 10%
0.05 ml
Tris-HCl 1M pH 6.8
0.625 ml
APS 10%
50 µl
Temed
5 µl
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 20
Running Buffer 5X (1litro)
Glicina
72g
Tris
15g
SDS
5g
A.3) Coloración
Una vez corrido el gel, se lo separa de los vidrios cuidadosamente (¡utilice guantes!).
Colorear el gel con Coomasie Blue R-250 (0.2% Coomasie, 50% Metanol y 10% Acético)
durante 1 hora. Decolorar realizando varios cambios de solución fijadora (20% Metanol,
10% ácido acético, 70% agua).
B) Electroforesis en condiciones nativas
B.1) Preparación de la muestra para geles nativos
1 Mezclar 14 µl de cada muestra con Cracking buffer nativo hasta 1X final. ¡NO HERVIR!
2 Sembrar los geles PAGE nativos 8% y correrlos a 120V constantes.
B.2) Preparación geles nativos
Gel Separador 8% (10ml gel)
Acri: Bis (29:1)
Agua
2.5 ml
3.6 ml
Tris-HCl 1M pH 8.8 3.75
APS 10%
100 µl
Temed
10 µl
Gel Stacking 5% (5 ml gel)
Acri: Bis (29:1)
Agua
0.83 ml
3.45 ml
Tris-HCl 1M pH 6.8 0.625 ml
APS 10%
50 µl
Temed
5 µl
B.3) Visualización de GFP en geles nativos
Una vez corridos los geles, se los separa de los vidrios cuidadosamente utilizando
guantes. Los geles nativos se irradian con luz UV onda corta (~245nm) con el objetivo de
identificar la proteína de fusión con GFP producida y purificada.
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 21
TP #7
TRANSFERENCIA Y WESTERN BLOT
A) Transferencia
Materiales
- dos casetes de transferencia (son parte del set de transferencia);
- cuatro papeles Whatman (3MM o similar);
- filtro de nitrocelulosa o nylon, cortados del tamaño del gel a transferir (levemente más
grandes).
Precauciones I
•
Todo el material a utilizar debe equilibrarse en el buffer de transferencia. En el
caso de la membrana primero se humedece en agua destilada y recién después se
equilibra en el buffer de transferencia;
•
El sandwich de transferencia debe armarse siempre sumergido en el buffer para
evitar burbujas de aire;
•
UTILIZAR EN TODO MOMENTO GUANTES (el contacto con la piel puede
engrasar la membrana y/o el gel de poliacrilamida y evitar la transferencia).
Una vez embebido el material en el buffer de transferencia colocar por orden:
1. Tapa plástica negra (se ubicará
en el electrodo negativo)
2. dos unidades de papel Whatman
3. gel de electroforesis (pasarlo con
cuidado)
4. membrana de nitrocelulosa o
nylon
5. dos unidades de papel Whatman
6. cerrar con la tapa plástica blanca
(será el positivo)
Precauciones II
Cuidar que no queden burbujas de aire en ningún lugar del sandwich, pues no pasará
corriente eléctrica en ese punto. RECOMENDACION: entre el paso 5 y 6 anteriores (es
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 22
decir, antes de cerrar la segunda tapa de plástico) ayudarse con una varilla de vidrio o
pipeta para sacar todas las burbujas que pudieran haber quedado.
Condiciones de transferencia
•
200 mA en 1 hs (corriente limitante), o 30 mA O.N..
Hecha la transferencia, desarmar el dispositivo y secar la membrana sobre un papel de
filtro (este filtro se puede guardar o pasar directamente a su procesado).
NOTA: En este punto se pueden teñir las membranas de nitro o nylon para ver todas las
proteínas que se han transferido, con el colorante rojo Ponceau en TBS.
B) Inmunodetección
Todo el procesamiento se lleva a cabo a temperatura ambiente.
a) Bloquear un mínimo de 30 min. en TBS - 5% leche descremada - 0,3% Tween;
b) Incubar con el anticuerpo primario diluido en TBS - 2% leche descremada - 0,3%
Tween por el lapso de una hora (la dilución a usar depende de la calidad y título del
anticuerpo; se definirá en el momento de hacerlo) (todo a temperatura ambiente).
c) Lavar
TBS
10min
TBS + Tween 0,3%
10min
TBS
10min;
d) Incubar con el anticuerpo secundario (anti-Ig de conejo conjugado con fosfatasa
alcalina) diluido 1:2000 en TBS - 2% leche descremada - 0,3% Tween, una hora.
e) idem punto c)
Revelado
a) Pasar el filtro a recipiente con 10 ml de solución de DAB
(di-amino benzidina);
b) Detener la reacción cambiando el filtro a un recipiente con abundante agua.
Soluciones
Buffer transferencia Tris
9.09 g Tris
Glicina 43.2 g
Metanol 600 ml
llevar a 3 litros con agua deionizada
TBS (Tris buffered saline):
50mM Tris.HCl pH 7.6; 150mM NaCl
Solución de revelado (DAB). 6mg en 10ml de PBS + 10 µl de peroxido de hidrógeno.
GENÉTICA MOLECULAR
GUÍA DE TP - 23