TESIS de Maestría en “Tecnología de los Alimentos” "ESTUDIO DE

TESIS de Maestría en
“Tecnología de los Alimentos”
"ESTUDIO DE LA VIDA ÚTIL DE QUESO CREMA
UTILIZANDO MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA"
Tesista: Miryam Siciliano
Director: Sandra Guerrero
Codirector: Stella Alzamora
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 2010
A mi marido, Guillermo, por alentarme siempre en mi superación como
profesional.
A mis hijas,Bárbara y Cecilia, a quienes dediqué principalmente mi vida.
A mi nietito, Juani , rey de mi corazón.
A mi madre y a la memoria de mi padre.
INDICE
1-INTRODUCCIÓN, 2
1.1 Origen del queso, 2
1.2 Producción y consumo nacional e internacional del queso, 3
1.3 Proceso de elaboración del queso, 5
1.3.1 Preparación de la leche, 6
1.3.2 Cuajado, 7
1.3.3 Corte de la cuajada, 7
1.3.4 Moldeado, 8
1.3.5 Prensado, 8
1.3.6 Salado, 9
1.3.7 Madurado, 9
1.3.8 Acabado, 10
1.4 Producción de queso untable sin conservante (sorbato de potasio)
efectuada por Danone para el presente estudio, 10
1.5 Variedades de quesos, 13
1.6 Clasificación de quesos, 14
1.7 El queso y la salud, 16
1.8 El queso como alimento nutritivo,16
1.8.1 Aporte de macronutrientes, 17
1.8.2 Aporte de micronutrientes, 18
1.9 El queso como alimento seguro, 19
1.10 Tecnologías combinadas de preservación, 22
1.10.1 Efecto de la reducción de la aw, 23
1.10.2 Efecto de la reducción de pH, 24
1.10.3 Efecto del sorbato de potasio, 26
1.10.4 Utilización de antimicrobianos naturales, 26
1.10.4.1 Timol, 27
1.11 Calidad, vida útil y seguridad, 28
1.12 Microbiología predictiva, 29
1.12.1 Generalidades, 29
2-OBJETIVOS, 36
2.1 Objetivo general, 36
2.2 Objetivos específicos, 36
3- MATERIALES Y MÉTODOS, 39
3.1 Matriz utilizada, 39
3.1.1 Elaboración del queso untable base, 39
3.1.2 Medición del pH, 40
3.1.3 Medición de la actividad de agua (aw),40
3.2 Reactivos utilizados, 41
3.2.1 Medios líquidos de enriquecimiento selectivo y no selectivo, 41
3.2.2 Medios sólidos de aislamiento diferencial y selectivo, 42
3.2.3 Otros reactivos utilizados, 43
3.3 Microorganismos utilizados, 43
3.3.1 Caracterización de los microorganismos utilizados en este
estudio, 45
3.4 Metodología, 46
3.4.1 Preparación de los inóculos, 46
3.4.2 Preparación de la solución de timol.Evaluación sensorial,46
3.4.3 Inoculación del queso untable base, 46
3.4.4 Recuento de los microorganismos, 47
3.5 Estudios realizados, 47
3.5.1 Estudio del efecto de la temperatura de almacenamiento, 47
3.5.2 Estudio del efecto de la ausencia de sorbato de potasio (queso
untable base), 48
3.5.3 estudio sobre el efecto del pH, 48
3.5.4 Estudio de reto microbiano, 50
3.5.5 Utilización de timol, 50
3.6 Obtención de las curvas de crecimiento o supervivencia.Modelado
matemático, 51
3.6.1 Modelado primario, 51
3.6.1.1 Modelo para caracterizar curva de crecimiento, 51
3.6.1.2 Modelo para caracterizar curva de supervivencia, 53
3.6.2 Modelado terciario, 54
3.7 Análisis estadístico, 56
4- RESULTADOS, 58
4.1 Estudio de la microbiología predictiva en queso untable base. Efecto
de la temperatura de almacenamiento, 58
4.2 Estudio en queso untable base, 64
4.3 Efecto combinado del pH y la temperatura de almacenamiento, 68
4.4 Estudio de reto microbiano en queso untable base utilizando cepas
responsables de ETAS, 86
4.4.1 S.aureus, 86
4.4.2 E.coli, 96
4.4.3 S.Enteritidis, 105
4.4.4 L.monocytogenes, 113
4.5 Uso de antimicrobianos naturales:timol, 121
5-CONCLUSIONES, 132
6-APÉNDICE, 136
6.1 Definiciones y fórmulas, 137
6.1.1 Población estadística, 137
6.1.2 Distribución normal, 137
6.1.3 Parámetros y estimadores, 138
6.1.4 Significancia estadística, 140
6.2 Análisis de la varianza (ANOVA), 141
6.2.1 Test F de significación de la regresión, 143
6.2.2 Coeficiente de determinación R2, 144
6.2.3 Análisis de residuales, 145
6.2.3.1 Versus valores predichos,Y1, 145
7- BIBLIOGRAFÍA, 147
RESUMEN
En microbiología predictiva los modelos matemáticos son utilizados para
predecir el comportamiento de los microorganismos bajo diferentes condiciones.
Antes de ser utilizados en una situación práctica, estos modelos matemáticos
deben ser validados con el propósito de demostrar que las bacterias se comportan
de igual modo tanto en los alimentos reales como en los sistemas modelo que se
utilizaron para generar dichos modelos. En este trabajo se estudió el crecimiento
o la inactivación de diferentes microorganismos pátogenos de relevancia en
queso untable (S.aureus; E. coli; S. Enteritidis y L. monocytogenes) bajo
diferentes condiciones microambientales (pH; temperatura; presencia de sorbato
de potasio; presencia de timol). Dichas respuestas fueron caracterizadas por los
modelos primarios de Gompertz y Gompertz modificado para muerte obteniendo
los parámetros característicos. También se utilizó para la predicción el programa
terciario de modelado de patógenos PMP. Los modelos fueron validados
estadísticamente y también por los estudios de reto microbiano en queso untable.
El modelo de Gompertz, utilizado para describir el crecimiento microbiano no
presentó limitaciones estadísticas. No ocurrió lo mismo con el modelo de
Gompertz modificado para muerte, el cuál sobreestimó la caída global al final del
almacenamiento en muchas situaciones. El programa de simulación modelado de
patógenos mostró debilidades al momento de predecir la conducta microbiana en
el queso untable debido seguramente a las limitaciones biológicas imperantes en
el queso. Este estudio resaltó la necesidad de validar los modelos matemáticos en
un alimento real.
RECONOCIMIENTOS
• A la Dra. Sandra Guerrero por el tiempo que me ha dedicado y por su excelente
dirección y dedicación .
• A la Dra. Stella Alzamora por su valiosa co-dirección.
• Al Director Municipal de Salud Ambiental de la Secretaría de Salud Pública de la
Municipalidad de Lomas de Zamora quien comprendió , incentivó y avaló
siempre y desde un principio
toda la capacitación
que enriquece
profesionalmente a las personas, Ingeniero Arturo Villafañe.
• A los Ingenieros Jorge Orlandini y Jorge Millosi de la empresa Danone-La
Serenísima por proveerme gentilmente el queso expresamente preparado para
esta Tesis y toda la información necesaria.
• A los técnicos y auxiliares del Laboratorio de Control de Alimentos de la
Municipalidad de Lomas de Zamora ,Sra. Hilda Alvarez, Srita.María Victoria
Alves Fernandes y Sra.Nelly Santillán, por asistirme con la preparación de
medios y material en todo momento que fuera necesario.
• A mis compañeros de trabajo por amenizar largas horas de trabajo.
LISTADO DE FIGURAS Y TABLAS
INTRODUCCIÓN Y MATERIALES Y MÉTODOS
Cuadro 1. Principales variables del mercado internacional (año 2002)
(PAG.3)
Figura 1. Consumo mundial de quesos per cápita (PAG.4)
Figura 2.Producción nacional de quesos (PAG.4)
Figura 3. Consumo nacional per cápita de diferentes quesos (PAG.5)
Figura 4: Diagrama de flujo de la elaboración de Queso (PAG.6)
Figura 5: Preparación de la leche (PAG.7)
Figura 6: Proceso de cuajado (PAG.7)
Figura 7: Corte de la cuajada (PAG.8)
Figura 8: Moldeado (PAG.8)
Figura 9: Prensado (PAG.9)
Figura 10: Salado (PAG.9)
Figura 11: Madurado (PAG.10)
Figura 12: Acabado (PAG.10)
Figura 13. Pirámide nutricional (PAG.17)
Figura 14. Parámetros matemáticos de la ecuación de Gompertz
(PAG.52)
Figura 15. Parámetros de la ecuación de Gompertz modificada para
muerte (PAG.53)
Figura 16: Ejemplo de curva de crecimiento bacteriano (PAG.55)
Figura 17: Ejemplo de curva de supervivencia bacteriana (PAG.55)
RESULTADOS
Figura 1: Efecto de la temperatura de almacenamiento : 5°C (-■- ) y
15°C ( -■- ) en el desarrollo de S.aureus inoculado en caldo BHI (a) y en
queso untable (b); (I) desvío estándar. (PAG.59)
Figura 2: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.aureus en queso untable almacenado a 5ºC, () valores
experimentales; (—) predicción (PAG.61)
Tabla 1: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable almacenado a 5 ºC. (PAG.61)
Figura 3 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación
de S.aureus en queso untable almacenado a 5ºC: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; (—) predicción. (PAG.62)
Figura 4 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.aureus en queso untable almacenado a 15ºC, ()
valores experimentales; (—) predicción. (PAG.63)
Tabla 2 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable almacenado a 15 ºC. (PAG.64)
Figura 5: Validación interna del modelo propuesto para la inactivación
de S.aureus en queso untable almacenado a 15 ºC: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; (—) predicción. (PAG.64)
Figura 6: Comportamiento de S.aureus a 15ºC en queso untable sin
(base, -▲-) y con agregado de 1000 ppm de sorbato de potasio (-■-); (I)
desvío estándar. (PAG.65)
Figura 7
: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.aureus en queso untable base almacenado a 15ºC, ()
valores experimentales; (—) predicción . (PAG.66)
Tabla 3 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base almacenado a 15 ºC. (PAG.66)
Figura 8 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación
de S.aureus en queso untable base almacenado a 15 ºC: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
() valores experimentales; (—) predicción. (PAG.67)
Figura 9
: Comportamiento de S. aureus en el queso untable base
almacenado a 10ºC (-♦- ), 15ºC ( -■- ) y 22ºC
( -▲-).
(a) pH 5,0; (b) pH
4,3; (I): desvío estándar. (PAG.69)
Figura 10 : Comportamiento de S.aureus en el queso untable base a pH
5,0 y diferentes temperaturas de almacenamiento. (a): 10º C, (b): 15ºC y
(c): 22ºC . ( ▬ ) predicción , ( --- ) limite de confianza superior predicho,
( --- ) limite de confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales;
(I) desvío estándar. (PAG.71)
Figura 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a
10ºC, () valores experimentales; (—) predicción . (PAG.73)
Tabla 4: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base almacenado a 10 ºC. (PAG.73)
Figura 12 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación
de S.aureus en queso untable base almacenado a 10 ºC: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
() valores experimentales; (—) predicción. (PAG.74)
Figura 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a
22ºC, () valores experimentales; (—) predicción (PAG.75)
Figura 14 : Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22 ºC: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . () valores experimentales; (—) predicción (PAG.76)
Tabla 5: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos
experimentales y sus respectivos parámetros característicos,
correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 22 ºC (PAG.76)
Figura 15: Comportamiento de S.aureus a pH 4,3 y 10º C(a), 15ºC (b) y
22ºC (c): (▬) predicción , ( --- ) límite de confianza superior predicho, (
--- ) límite de confianza inferior predicho ,(-♦- ) datos experimentales.
(PAG.78)
Figura 16 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a
10ºC, () valores experimentales; (—) predicción . (PAG.79)
Tabla 6: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos
experimentales y sus respectivos parámetros característicos,
correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable base
(pH 4,3) almacenado a 10 ºC (PAG.80)
Figura 17: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto
para el crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3)
almacenado a 10 ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b)
Residuales vs. valores
predichos . () valores experimentales; (—)
predicción (PAG.80)
Figura 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a
15ºC, () valores experimentales; (—) predicción . (PAG.81)
Tabla 7: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos
experimentales y sus respectivos parámetros característicos,
correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable base
(pH 4,3) almacenado a 15 ºC (PAG.82)
Figura 19: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 ºC: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . () valores experimentales; (—) predicción.(PAG.82)
Figura 20 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.aureus en queso untable base ( pH 4.3) almacenado a
22ºC, () valores experimentales; (—) predicción . (PAG.83)
Tabla 8: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos
experimentales y sus respectivos parámetros característicos,
correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable base
(pH 4,3) almacenado a 22 ºC (PAG.84)
Figura 21: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 ºC: Valores
observados vs valores predichos (PAG.84)
Figura 22: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento
de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22
ºC:Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—)
predicción (PAG.85)
Figura 23: Evaluación del comportamiento de S.aureus en queso untable
base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ),
17ºC ( -■- ) y 25ºC ( -▲-); (I) desvío estándar. (PAG.87)
Figura 24: Comportamiento predicho de S.aureus a pH 5,0 y 6º C (a),
17ºC (b) y 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior
predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦-)
datos
experimentales. (PAG.88)
Figura 25: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.aureus en queso untable base almacenado a 6ºC, ()
valores experimentales; (—) predicción (PAG.89)
Tabla 9: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC (PAG.90)
Figura 26: Validación del modelo propuesto para la inactivación de
S.aureus en queso untable base almacenado a 6 ºC: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; (—) predicción (PAG.90)
Figura 27: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.aureus en queso untable base almacenado a 17ºC, ()
valores experimentales; (—) predicción. (PAG.91)
Tabla 10: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base almacenado a 17 ºC. (PAG.91)
Figura 28 : Validación del modelo propuesto para la inactivación de
S.aureus en queso untable base almacenado a 17 ºC: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
() valores experimentales; (—) predicción. (PAG.92)
Figura 29: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a
25ºC, () valores experimentales; (—) predicción (PAG.94)
Tabla 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC (PAG.94)
Figura 30: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos. () valores experimentales; (—) predicción (PAG.95)
Figura 31: Evaluación del comportamiento de E.coli en queso untable
base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦),17ºC ( -■- ) y 25ºC (-▲- ); (I):desvío estándar. (PAG.97)
Figura 32: Comportamiento predicho de E.coli a pH 5,0 y 6º C (a),
17ºC (b) y 25ºC (c): ( ▬ ) predicción , ( --- ) límite de confianza superior
predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦- )
experimentales (PAG.98)
datos
Figura 33: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de E.coli en queso untable base almacenado a 6ºC, ()
valores experimentales; (—) predicción (PAG.99)
Tabla 12: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli
en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC (PAG.99)
Figura 34: Validación interna del modelo propuesto para la
supervivencia de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6
ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . () valores experimentales; (—) predicción. (PAG.100)
Figura 35: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de E.coli en queso untable base almacenado a 17ºC, ()
valores experimentales; (—) predicción. (PAG.100)
Tabla 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli
en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 17 ºC. (PAG.101)
Figura
36: Validación interna del modelo propuesto para el
comportamiento de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a
17 ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs.
valores
predichos . () valores experimentales; (—) predicción
(PAG.101)
Figura 37: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25ºC,
() valores experimentales; (—) predicción (PAG.102)
Tabla 14: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli
en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC (PAG.103)
Figura 38: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento
de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
() valores experimentales; (—) predicción. (PAG.104)
Figura 39: Evaluación del comportamiento de S.Enteritidis en queso
untable base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (♦- ),17ºC ( -■- ) y 25ºC ( -▲- ); (I):desvío estándar. (PAG.105)
Figura 40 : Comportamiento predicho de S.Enteritidis a pH 5,0 y 6º C
(a), 17ºC (b) , 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza
superior predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦- )
datos experimentales. (PAG.106)
Figura 41 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado
a 6ºC, () valores experimentales; (—) predicción (PAG.107)
Tabla 15: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC
(PAG.108)
Figura 42: Validación interna del modelo propuesto para S.Enteritidis en
queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6 ºC: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . () valores
experimentales; (—) predicción (PAG.108)
Figura 43: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado
a 17ºC, () valores experimentales; (—) predicción (PAG.109)
Tabla 16: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 17 ºC
(PAG.109)
Figura 44: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 ºC: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . () valores experimentales; (—) predicción (PAG.110)
Figura 45: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a
25ºC, () valores experimentales; (—) predicción (PAG.111)
Tabla 17 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
(PAG.112)
Figura 46: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto
para el crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0)
almacenado a 25 ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b)
Residuales vs. valores
predichos . () valores experimentales; (—)
predicción (PAG.112)
Figura 47: Evaluación del comportamiento de L.monocytogenes en
queso untable base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento:
6ºC (-♦- ),17ºC ( -■- ) y 25ºC ( -▲- ); (I): desvío estandar (PAG.113)
Figura 48: Comportamiento predicho de L.monocytogenes a pH 5,0 y 6º
C (a), 17ºC (b) y 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza
superior predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦- )
datos experimentales. (PAG.114)
Figura 49 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0)
almacenado a 6ºC (a),17°C (b) y 25°C (c) () valores experimentales;
(—) predicción (PAG.116)
Tabla 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC
(PAG.117)
Tabla 19: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 17 ºC
(PAG.117)
Tabla 20: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
(PAG.118)
Figura 50: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto
para el crecimiento de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0).
a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . () valores experimentales; (—) predicción (PAG.119)
Figura 51: Comportamiento de S.aureus en queso untable base con (-♦-)
y sin agregado de (-♦-) timol (0,3% p/p), pH 5,0, almacenado a tres
temperaturas: (a) 6ºC, (b) 17ºC, (c) 25ºC
; (I):desvío estándar.
(PAG.122)
Figura 52: Comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base con
(-♦-) y sin agregado de (-♦-)
timol (0,3% p/p), pH 5,0 almacenado a
17ºC; (I): desvío estandar. (PAG.123)
Figura 53: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivación de S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0)
almacenado a 6ºC (a); 17°C (b); y de S. Enteritidis en igual matriz
almacenada a 17°C (c) () valores experimentales; (—) predicción
(PAG.126)
Tabla 21: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) con timol almacenado a 6 ºC
(PAG.127)
Tabla 22 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) con timol almacenado a 17 ºC.
(PAG.127)
Tabla 23: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5.0) con timol almacenado a 17
ºC. (PAG.128)
Figura 54: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) con timol almacenado a 6ºC ;
17°C; y de S. Enteritidis en igual matriz almacenada a 17°C: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
() valores experimentales; (—) predicción. (PAG.129)
Figura 55: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de S.aureus en queso untable base con timol almacenado a
25ºC, () valores experimentales; (—) predicción (PAG.130)
Tabla 24: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base con timol (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
(PAG.130)
Figura 56: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 25
ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos. () valores experimentales; (—) predicción (PAG.131)
1. INTRODUCCIÓN
1
1.1 Origen del queso
Según el Código Alimentario Argentino (C.A.A.), queso es el producto fresco
ó madurado que se obtiene por separación del suero de leche ó leche reconstituída
(entera, parcial ó totalmente descremada), ó de sueros lácteos , coagulados por la
acción física, del cuajo, de enzimas específicas, de bacterias específicas, de ácidos
orgánicos, solos ó combinados, todos de calidad apta para uso alimentario; con ó sin
el agregado de sustancias alimenticias y/o especias y/o condimentos, aditivos
específicamente indicados, sustancias aromatizantes y materiales colorantes (Art
605, C.A.A.)
La elaboración de quesos es una actividad que comenzó aproximadamente
8000 años atrás y en la actualidad existen cerca de 1000 variedades diferentes de
queso cada uno de los cuales resulta ser único con respecto a sus características
organolépticas.
La elaboración del queso seguramente fue descubierta por diversas
comunidades al mismo tiempo. En el antiguo Egipto se cuidaban vacas y se les
ordeñaban para tener la leche por lo que se piensa que también esas comunidades
elaborarían quesos. La leche se conservaba en recipientes de piel, cerámica porosa o
madera, pero como era difícil mantenerlos limpios, la leche fermentaba con rapidez.
El siguiente paso fue el de extraer el suero de la cuajada para elaborar algún tipo de
queso fresco, sin cuajo, de sabor fuerte y ácido. Cuenta la leyenda que un pastor
árabe volvía a su morada con la leche de las ovejas dentro de una bolsa hecha con la
tripa de uno de sus corderos y que después de caminar a pleno sol, al abrir la bolsa la
leche estaba cuajada, sólida y hecha queso. Los romanos lo incluían en su dieta
condimentándolo con tomillo, pimienta, piñones y otros frutos secos, cuando sus
soldados se asentaban en un campamento, elaboraban queso. Con el auge del
comercio y el aumento de la población urbana, el queso se convirtió en producto
importante para la economía, empezó a comercializarse con queso, fuera de las zonas
de producción y más allá de las fronteras y cuando se colonizó el Nuevo Mundo, se
llevaron sus tradiciones queseras.
Al principio se utilizaba leche cruda, pero en la década de 1850 el
microbiólogo Louis Pasteur estableció el proceso de pasteurización como una
herramienta fundamental en la preservación de alimentos, hecho que cambió
2
radicalmente el proceso de elaboración de este producto. Empezó a mezclarse leche
de distinta procedencia y distintos rebaños para obtener un producto homogéneo y de
ese modo disminuyó considerablemente el riesgo de aparición de organismos que
pudieran contaminar el producto.
1.2. Producción y consumo nacional e internacional de quesos
El queso tiene una producción anual superior a otros productos del mundo
muy importantes tales como café, té, cacao y tabaco. Estados Unidos es el mayor
productor mundial y casi la totalidad de esa producción está dirigida al mercado
local, siendo casi nula su exportación. Alemania es el mayor exportador en cuanto a
cantidad y Francia el mayor exportador en cuanto a valor monetario. Así mismo,
siguen a Estados Unidos en cuanto a producción. Dentro de los países productores
en cuarta posición encontramos a Italia y en décimo lugar a la Argentina. Los países
importadores de quesos por excelencia son: Alemania, Reino Unido e Italia. El
mayor consumo per cápita lo registra Grecia, seguido de Francia y en tercera
posición, Italia. Luego siguen Suiza, Alemania, Países Bajos, Austria, Suecia,
etc.(SAGyP, MINAGRI,2010)
En el cuadro 1 se presenta un resumen de los volúmenes producidos,
consumidos y los stocks finales de los principales productos comercializados en el
mercado mundial.
Cuadro 1. Principales variables del mercado internacional (año 2002)
Producción
Consumo
Stocks
3.473
3.116
12.470
6.211
(tonelada)
3.127
2.438
12.091
5.854
970
186
716
310
Productos
Leche en Polvo descremada
Leche en Polvo entera
Quesos
Manteca
Fuente: United States Department of Agriculture ( 2009) USDA
3
La Argentina se encuentra dentro de los países cuyas costumbres dietarias
incluyen el consumo de este producto alimenticio tal como se evidencia en la Figura
1.
Figura 1. Consumo mundial de quesos per cápita
Fuente: SAGPyA, (2000).
Según la Food and Agriculture Organization FAO, en 2004, Argentina fue el
9º país productor mundial de quesos (con una participación del 2,4%) con una
estadística que se describe en el gráfico de la Figura 2.
Figura 2.Producción nacional de quesos
Fuente: Dir. de Industria Alimentaria y Agroindustrias
..sobre la base de datos del Convenio SAGPyA-CIL-FIEL (2009)
4
La producción nacional de quesos según el tipo de pasta se puede observar en
la Figura 3. Si se observan los datos estadísticos de elaboración de quesos de pasta
blanda, se denota un aumento progresivo en los últimos años (2004-2008). Luego de
alcanzar el récord histórico de casi 455.000 toneladas en 1999, la producción
argentina acusó una merma del 27% hasta 2003. En 2004 se produjo un interesante
repunte del 20%, hasta ubicarse en las 398.000 toneladas. Mientras que los quesos
blandos crecieron el 13% en 2004, los quesos semiduros y duros exhibieron ritmos
superiores al promedio general del grupo, con alzas del 28 y 31%, respectivamente.
El crecimiento de la elaboración de quesos verificado en 2004 fue impulsado
principalmente por la demanda interna –alrededor del 80% de la producción
adicional respecto de 2003 fue absorbido por el consumo doméstico- y en menor
medida por las exportaciones, que se llevaron el 20% restante (SAGyP, MINAGRI,
2010).
Figura 3. Consumo nacional per cápita de diferentes quesos
Fuente: Dir. de Industria Alimentaria y Agroindustrias
sobre la base de datos del Convenio SAGPyA-CIL-FIEL (2009).
1.3. Proceso de elaboración de queso
Son numerosas las recetas queseras tradicionales con las que se cuenta
actualmente y que dan lugar a la gran variedad de quesos artesanales. Pero
independientemente del tipo de leche y del lugar de procedencia, hay un proceso
general (Figura 4) que a continuación se describe (ICMSF, 1980):
5
Figura 4: Diagrama de flujo de la elaboración de Queso
Leche
↓
Filtrado
↓
Pasteurización
↓
Enfriamiento
↓
Inoculación con fermentos lácticos
↓
Adición de CaCl2 y cuajo
↓
Cuajado
↓
Corte de la cuajada
↓
Moldeado
↓
Prensado
↓
Salado
↓
Maduración, previo oreado, volteado y limpieza de los quesos
↓
Acabado
1.3.1 Preparación de la leche
Una vez que la leche llega a la quesería, procedente del establecimiento
lácteo, es sometida a una serie de análisis químicos y microbiológicos (Figura 5)
para asegurar la calidad inicial de la misma. En esta etapa, la leche es filtrada y/o
higienizada para eliminar cualquier tipo de impurezas que hayan podido pasar a la
leche durante el ordeño. Posteriormente se almacena en los tanques de refrigeración
donde permanece a una temperatura de 4ºC. En el caso de las queserías que elaboran
quesos con leche pasteurizada, la leche es sometida a temperaturas superiores de
70ºC durante unos segundos.
6
Figura 5: Preparación de la leche
1.3.2 Cuajado
Una vez la leche en la cuba de cuajado (Figura 6), se añaden los fermentos
lácticos, bacterias que contribuirán a la posterior maduración del queso. Es en esta
fase donde se le adiciona el cuajo, que dependiendo del tipo de queso podrá ser
vegetal, animal o microbiano, formándose “la cuajada”. Físicamente, consiste en la
precipitación de las micelas de caseína formando un gel que retiene además los
glóbulos de grasa, agua y sales.
Figura 6: Proceso de cuajado
1.3.3 Corte de la cuajada
Una vez transcurrido el tiempo de coagulación, el cuál será distinto
dependiendo del tipo de queso, se procede al corte de la cuajada (Figura 7). Esta
fase consiste en la división de la cuajada mediante las liras en granos más pequeños
para favorecer el desuerado. El tamaño del grano viene determinado por el queso a
7
elaborar. Luego se trabaja el grano mediante agitación y elevación de la temperatura
favoreciendo todavía más la expulsión del suero.
Figura 7: Corte de la cuajada
1.3.4. Moldeado
El moldeado consiste en el llenado de los moldes con los granos de cuajada
(Figura 8).
Figura 8: Moldeado
1.3.5. Prensado
Una vez llenados los moldes se pasa a la etapa de prensado, la cual en la
actualidad se realiza con unas prensas neumáticas en la mayoría de las queserías.
Debido a la presión, que variará dependiendo del tipo de queso que estemos
elaborando, se facilita la unión entre los granos de la cuajada y el desuerado (Figura
9).
8
Figura 9: Prensado
1.3.6. Salado
Una vez finalizado el tiempo de prensado, se procede al salado del queso a
mano ó bien, sumergiéndolo en salmuera (Figura 10). Con la fase de salado, se
consigue realzar el sabor del queso; preservar del crecimiento de microorganismos
indeseables, favorecer la pérdida de suero y la formación de la corteza.
Figura 10: Salado
1.3.7. Madurado
A esta fase pasan los quesos tiernos, semicurados y curados. Son mantenidos
en cámaras donde se controla la temperatura y la humedad. Durante esta fase los
quesos son volteados frecuentemente para evitar que se deformen y la corteza se
forme de forma uniforme. La maduración comprende una serie de cambios en las
9
propiedades físicas y químicas adquiriendo el queso su aspecto, textura y
consistencia así como aromas y sabores característicos (Figura 11).
Figura 11: Madurado
1.3.8. Acabado
La fase de acabado se refiere a las distintas presentaciones en las que podemos
encontrar algunos de los quesos, por ejemplo, quesos al pimentón, al romero,
etc.(Figura 12)
Figura 12: Acabado
VBCV
1.4. Producción de queso sin conservante (base) efectuada por Danone para el
presente estudio.
El proceso de elaboración del queso untable base utilizado en el presente
estudio y realizado por la empresa Danone posee varios pasos alguno de los cuales
son específicos para esta variedad.
Como primer paso se realizó la pasteurización con el fin de destruir flora
indeseada.
Posteriormente al tratamiento térmico se dió comienzo a un proceso
bioquímico pero de decisiva importancia: se adicionaron el cuajo, los cultivos
10
iniciadores o fermentos lácticos (fermentación) y cloruro de calcio (por tratarse de
leche pasteurizada) (Johnson,1997).
La función principal de este paso es la de producir ácido, principalmente
ácido láctico, destinado a: a) favorecer la formación de la cuajada por enzimas
coagulantes, como el cuajo; b) favorecer el drenaje del suero de los granos de
cuajada; c) impedir o inhibir el crecimiento de los microorganismos patógenos y de
los causantes de alteraciones, y d) gobernar las actividades de las enzimas que
inducen los cambios organolépticos deseados. Los cultivos lácticos iniciadores
producen ácido láctico a partir de la lactosa propia de la leche rindiendo
componentes del sabor y aroma como diacetilo. Estos cultivos solo son adecuados
para aquellos quesos en los que la temperatura de esta etapa no supera los 40ºC
durante algunos minutos. El cuajo ,con la colaboración del ácido formado, precipita
la caseína (proteína principal de la leche) y forma un gel.
La termización se realizó a 65ºC durante 6 minutos a un pH < 4,6
y tiene tres aspectos tecnológicos:
•
Aumentar la tasa de recuperación de proteínas solubles, por
insolubilización de algunas lacto albúminas en medio ácido y mejorar el
rendimiento del proceso.
•
Ajustar la temperatura óptima de separación de la masa magra del suero.
•
Disminuir la carga microbiológica del fermento presente en la cuajada la
cual pasa aproximadamente de 1 x 107 UFC/mL (unidades formadoras de
colonias por mililitro) a valores del orden de 1 x 103 / 1 x 104 UFC/mL.
Esta disminución es necesaria para reducir la pos-acidificación del
producto.
Cuando la masa misma (luego de la adición del resto de los ingredientes como el
cloruro de sodio
cuyo objetivo es
potenciar el sabor y ayudar a controlar el
crecimiento de microorganismos alterantes)
adquirió la firmeza adecuada se
sometió al proceso de homogenización y envasado. Esta operación puede ir
acompañada por la aplicación de una determinada presión (acondicionamiento). El
enfriamiento se realizó a una temperatura de aproximadamente 40ºC. Finalmente se
almacenó en cámara fría (0-5ºC).
11
Proceso de elaboración del queso untable base utilizado en el presente trabajo.
Recepción, descarga
y pasteurización de la
leche cruda
Pasteurización
Incorporación de
cloruro de calcio,cuajo y
fermento
Fermentación
Fermentación
Termización
Inyección de crema
Inyección de
ingredientes
Homogeneización
Envasado
Acondicionamiento
Enfriamiento
Homogeneización
Almacenamiento en
cámara fría
12
1.5 Variedades de quesos
Aunque es casi imposible realizar una lista única de quesos, sólo en Francia
hay más de 400 variedades de quesos, y en España encontramos, por ejemplo, queso
Burgos, Cabrales, Cebreiro, Mató, Quesaillas, Roncal (por sólo nombras algunos) y
el queso manchego, típico de la región de La Mancha . En Argentina, existen
numerosas variedades de queso (http://www.todoagro.com.ar). Una clasificación
muy general comprende:
Quesos blandos: son los que tienen abundante materia grasa y humedad. La textura
de ellos es muy cremosa, Eso hace que se los pueda extender con facilidad. Son
elásticos al tacto y tienen un aroma similar al de las nueces. Los quesos que
pertenecen a esta variedad son: el Camembert, el Cuartirolo y el Fontina. En esta
categoría entran los semiblandos como el Port Salut y el Mozzarella. Las
características de estos quesos los hacen ideales para ser usados en pizzas, budines,
terrinas, arroces, polentas y fondues.
Quesos duros y semiduros: son muy grasos pero con muy poca humedad. Son de
sabores suaves ó fuertes y texturas flexibles ó desmenuzadas. Algunos quesos de este
tipo tienen agujeros producidos por bacterias lácticas durante la maduración. En esta
categoría están: el Emmenthal, el Parmesano, el Reggianito, el Sardo, el Provolone y
el Pecorino. En esta categoría también se incluyen los quesos semiduros, como el
Cheddar, el Fontina y el Pategrás. Los quesos duros son apropiados para rallar,
preparar salsas y gratinar carnes, y los semiduros para fondue.
Quesos azules: son aquellos a los que se les introduce un cultivo fúngico (p.e.
Penicillium roquefortii) para generar las características vetas azules. Son intensos.
No deben oler a amoníaco ni tener sabor terroso ni muy salado. En esta variedad se
encuentran : el Azul y el Cabrales.
Quesos frescos: Estos quesos comprenden un proceso de elaboración sin la etapa de
maduración. Carecen de corteza. Su consistencia puede ser desde cremosa y
homogénea hasta otra mucho más densa. El queso fresco tiene que ser húmedo,
blando y sin moho. En esta variedad encontramos: el queso Crema, el Mascarpone, la
13
Ricota y el Fundido. Estos quesos son muy aptos para ser incorporados en ensaladas
y para elaborar salsas livianas y frías para acompañar carnes.
1.6. Clasificación de quesos
Los criterios para la clasificación de quesos son múltiples, ya que pueden basarse en
cuestiones documentales, jurídicas o tecnológicas. Sin embargo, los criterios de
clasificación más utilizados son los siguientes:
:
-
Contenido en materia grasa expresado en porcentaje de grasa / masa sobre el
extracto seco total ( % G/ES). De acuerdo a este criterio puede ser: Extra graso;
Graso; Semi graso; Bajo contenido de grasa y Magro.
-
Consistencia de la pasta teniendo en cuenta el porcentaje del queso sin
considerar su grasa, ó lo que es igual, la humedad del queso desgrasado (
%HSMG o HQD, contenido de humedad sin extracto seco). De acuerdo a este
criterio puede ser: Extraduro; Duro; Semiduro; Semiblando y Blando.
-
Período de maduración atendiendo a su maduración ó ausencia de ella. Pueden
ser frescos o madurados. Queso fresco es el que está dispuesto para el consumo al
finalizar el proceso de fabricación. Queso madurado es el que, tras el proceso de
elaboración, requiere mantenerse durante cierto tiempo a una temperatura y en
condiciones tales que se produzcan los cambios físicos y químicos característicos
del mismo.
-
Tipo de leche utilizada. Aparte de su clasificación por el origen de la leche del
animal, también se clasifica por los diferentes tratamientos que tiene la leche
antes de empezar el proceso de elaboración del queso. Pueden utilizar leche
cruda (leche que no ha sido calentada a una temperatura superior a 40º C
térmicamente, ni sometida a un tratamiento de efecto equivalente); pasteurizada
(se obtiene al calentar la leche a una temperatura entre 71,3°C - 73°C durante 15
segundos o 61°C - 63º C durante 30 minutos, seguido de un enfriamiento
inmediato); termizada (leche que ha tenido un tratamiento térmico consistente en
elevar la leche a una temperatura entre 57°C - 62°C durante 15 a 20 segundos,
14
seguido de un enfriamiento inmediato ó microfiltrada (leche que ha sufrido una
micro-filtración. Este proceso consiste inicialmente en separar la nata de la leche,
posteriormente se filtra la leche desnatada a través de unas membranas muy
delgadas que retienen las bacterias y finalmente a esta leche filtrada se le
incorpora la nata en proporciones adecuadas).
-
Tipo de Elaboración atendiendo al método de elaboración de los mismos. Pueden
ser Quesos "Fermier" ó de Granja (son elaborados con métodos tradicionales y en
la propia granja); Artesanales (elaborados siguiendo métodos tradicionales y en
general mediante estructuras pequeñas que suelen oscilar entre 1 y 5 personas);
Quesos "Latiere" (elaborados en forma semi-automatizada con leche de los
propios tambos de la cooperativa) y Quesos Industriales (producto industrial
obtenido a partir de leche adquirida a diferentes granjas, a veces muy distantes
unos de otras, con un proceso de fabricación automatizado que se realiza a gran
escala. De ahí su necesidad de estandarizar la materia prima, con el indispensable
uso de la pasteurización, termización o micro-filtración).
-
Intensidad del sabor o gusto. Es una clasificación que se expresa en términos de
intensidad: Fresca ó Dulce (quesos de Burgos, cuajadas, petit suisse, y quesos de
cabra lácticos); Poco Pronunciada (quesos cuya maduración es corta; p.e.
Camembert, Brie, Coulommiers); Pronunciada (quesos donde su maduración
está en su punto y predominan sabores a leche cocida, cereales, frutos secos,
vegetales; p.e. Gruyère o los Beaufort y los de pasta azul blandos como el Cashel
Blue y de cabra de pasta prensada semicurados); Fuerte (quesos con toque
picante además de tener un punto de salado razonable; p.e. quesos de pasta
blanda y de corteza lavada- Livarot, Maroilles , Epoisses , Munster; quesos
azules - Fourme d'Ambert ó Montbrison); Muy Fuerte (quesos algo más picantes
y salados que la intensidad fuerte; p.e. azules y de doble fermentación).
15
1.7 El queso y la salud
Todos los tipos de queso aportan a nuestra dieta un gran valor nutritivo. El ser
humano puede vivir sin sufrir enfermedades causadas por carencias vitamínicas
consumiendo únicamente queso, pan y fruta, puesto que el conjunto de estas tres
llevan las vitaminas, sales minerales y proteínas necesarias para vivir. Según pasa el
tiempo el queso aumenta el aporte de calorías y mejora su calidad bacteriológica. El
queso también contiene la proporción adecuada de ácidos grasos. Es un alimento
fácilmente digerible a su vez. El conjunto de moho, bacterias que confiere puede
actuar de forma favorable en nuestra flora intestinal.
El queso combinado con pan se convierte en una dieta equilibrada para
nuestra salud porque se complementan, el primero con las proteínas y los lípidos y el
segundo con los hidratos de carbono. Los quesos frescos por su alto contenido en
agua son más adecuados para una dieta con inferior número de calorías que uno
semicurado ó ya curado (Mahaut y col.,2003).
1.8 El queso como alimento nutritivo
Los alimentos lácteos a los cuales acudimos como fuente de calcio nos
aportan mucho más a nuestra nutrición y salud. En una dieta, los productos lácteos
contribuyen aproximadamente sólo con el 9% de las calorías disponibles. En cambio
proveen el 73% del calcio, el 31% de la riboflavina, el 33% del fósforo, el 19% de
las proteínas, el 16% del magnesio, el 21% de la vitamina B12, el 17 % de la
vitamina A, el 10% de la vitamina B6, 6% tiamina, apreciables cantidades de
vitamina D y niacina equivalentes. De hecho los productos lácteos se reconocen
como “ricos” o “fuentes de muchos nutrientes” en sí mismos sin tener que ser
modificados (Mahaut y col.,2003).
En la pirámide nutricional que especifica el Departamento de Agricultura de
los Estados Unidos (USDA, por sus siglas en Inglés) (Figura 13), se reconocen a los
alimentos lácteos como uno de los grupos de mayor relevancia, recomendando un
consumo de los mismos de 2 a 3 porciones/día (leche, yogur, quesos). Las nuevas
16
recomendaciones previstas por el MERCOSUR, recogiendo los consejos mundiales,
establecen 1000 mg de calcio como Ingesta Diaria Recomendada o Ingesta Adecuada
para mayores de 18 años. Teniendo en cuenta los hábitos locales, ese requerimiento
es alcanzable sólo consumiendo no menos de 4 porciones/día de leche ó su
equivalente en derivados. Esta cantidad representa la cantidad que al menos el 97%
de la población necesita (Portela, 2007) .
1.8.1 Aporte de macronutrientes
El contenido de los quesos sobresale ante otros productos ya que posee
proteínas de alto valor biológico y calcio de fácil asimilación, fósforo, magnesio,
vitaminas del grupo B y liposolubles.
Proteínas - A la proteína de la leche se la califica de alta calidad, con alto valor
biológico y alta digestibilidad, usada como estándar para evaluar el valor nutritivo de
las proteínas de los alimentos.
Figura 13. Pirámide nutricional
Carbohidratos- La lactosa es el azúcar principal en leche. En los niños se ha
comprobado que mejora la absorción de calcio y una porción pasa al colon y
funciona como prebiótico en la flora intestinal.
17
Grasas- Aparte de ser fuente de energía (42% de la energía de la leche entera) aporta
a la textura, sabor y al poder de saciedad de este alimento. . Los lácteos son la fuente
natural más rica en ácido linoleico conjugado siendo identificado este producto como
potencial fuente benéfica para la salud, teniendo propiedades antioxidantes habiendo
evidencias
de
tener
propiedades
anticarcinogénicas
(colon
mama)
antiarteroesclerosis, estimular el sistema inmune.
1.8.2 Aporte de micronutrientes
Es bien sabido que el calcio y la vitamina D contribuyen de manera esencial a
mantener la buena salud y el bienestar nutricional en el curso de la vida. Sin
embargo, aunque gran parte del interés por estos nutrientes sigue centrándose en su
importancia para el buen estado de los huesos, recientes investigaciones han arrojado
interesantes resultados sobre una amplia variedad de cuestiones nutricionales y
sanitarias relacionadas con ellos.
Las variaciones en los procedimientos utilizadas en su línea de producción
tales como diferentes temperaturas y diferentes técnicas de obtención de la cuajada
juegan un papel decisivo en determinar las características organolépticas del
producto final, pero los microorganismos o bacterias ácido lácticas (BAL) utilizadas
juegan un papel crítico en el desarrollo de sus características distintivas (Beresford y
col., 2001; Lars 2004). La primera función de las BAL es producir ácido durante el
proceso fermentativo a partir de la lactosa, hidrato de carbono mayoritario de la
leche. Ellas también contribuyen en la proteólisis y conversión de los aminoácidos en
componentes responsables del flavour (aroma + sabor) del queso (Lars, 2004).Las
BAL producen suficiente ácido láctico como para descender el pH a < 5.3 en 6 hs. a
30-37ºC. Estas bacterias, también llamadas “starters” pueden ser agregadas al
comienzo del proceso de producción de quesos o pueden ser contaminantes naturales
de la leche como en el caso de muchos quesos artesanales fabricados con leche
cruda. Una vez presentes junto al resto de los ingredientes comienzan su proceso de
crecimiento y logran alcanzar recuentos aproximados de 1 x 108 UFC/gr. en pocas
horas. Según su temperatura óptima de crecimiento se clasifican en mesófílas 30ºC45ºC o termófílas 55ºC-75ºC.
18
Las BAL más comúnmente usadas desde el punto de vista de la tecnología
alimentaria pertenecen a los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus,
Leuconostoc
,
Enterococcus,
Aerococcus,
Carnobacterium,
Oenococcus,
Pediococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella (Axelsson, L. 2004). Se
utilizan también cultivos “mixtos” como Lactococcus lactis ssp. cremoris y L. lactis
ssp. lactis (ambos mesófilos), Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus ,
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus,
Lb.delbrueckii ssp. lactis o Lb. helveticus.
Otro de los roles de las BAL es proveer un ambiente óptimo con respecto al
potencial redox, pH y contenido de humedad del queso (Wood, 1995).
1.9 El queso como alimento seguro
La principal causa de deterioro de los alimentos es causada por la presencia
de diferentes tipos de microorganismos. El deterioro microbiano de los alimentos
tiene pérdidas económicas sustanciales, tanto para los fabricantes (pérdida de
materias primas y de productos elaborados antes de su comercialización, deterioro de
la imagen de marca, etc.) como para distribuidores y consumidores (deterioro de
productos después de su adquisición y antes de su consumo).
La producción de alimentos seguros está basada en la implementación de
medidas generales de Buenas Prácticas de Higiene (BPH) y Buenas Prácticas de
Manufactura (BPM). Estos conocimientos son esenciales para contar con productos
alimenticios seguros, corregir errores y si fueran necesarias tomar medidas
preventivas. Es conocido que en la práctica la recontaminación con patógenos es una
causa frecuente de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAS).
Se ha establecido que los riesgos microbiológicos en quesos
están más
vinculados con quesos blandos, de humedad superior al 46%. En cambio, los quesos
duros, de humedad menor al 36% pueden ser elaborados con leche termizada
(tratamiento térmico más suave que la pasteurización), la larga maduración requerida
para alcanzar esos niveles de humedad dificulta el desarrollo de los patógenos que
19
pudieran haber contaminado inicialmente, aunque de no haberse respetado las
Buenas Prácticas de Elaboración podrían presentar enterotoxina estafilocóccica.
La demanda creciente del consumo de quesos y su consecuente elaboración
ha incrementado el interés en obtener más información acerca de su calidad y
estabilidad. Muchos de los estudios realizados sobre la calidad microbiológica de los
quesos de pasta blanda y pasta semiblanda fueron ya publicados (Scott y col., 2002).
Diferentes microorganismos tales como Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, Salmonella spp. y Listeria monocytogenes son microorganismos asociados
desde 1970 con brotes asociados a quesos (Roberts, 2002). Muchos de estos
microorganismos
están
distribuidos
en
el ambiente
y pueden
ocasionar
contaminaciones naturales durante la producción, maduración y almacenamiento así
como contaminaciones cruzadas en restaurantes y hogares debido a un inapropiado
uso.
La distribución ubicua de Salmonella spp,, su prevalencia, su virulencia y su
potencial impacto económico en la industria alimentaria predice la necesidad de un
continuo control (Iurlina y Fritz, 2004).
La contaminación de S.aureus, coco Gram positivo (Jablonsky, 1997), en
productos lácteos puede tener lugar en varias etapas del proceso.
E.coli, bacilo Gram negativo asporógeno, es usualmente considerada un
habitante no patógeno del tracto intestinal humano y es utilizada como indicador de
un inadecuado proceso de sanitización de agua y comidas. A pesar de ésto en los
años recientes algunas cepas de E.coli halladas han sido implicadas en enfermedades
trasmitidas al hombre por alimentos (Doyle,1997).
Salmonella spp. es un bacilo Gram negativo no formador de esporas, aerobio
facultativo, que puede sobrevivir en condiciones favorables. Hay mas de 2000
serotipos basados en la presencia de antígenos somáticos (O) y flagelares (H)
(Daoust, 1997). A pesar de ésto solo un pequeño número son patógenos para el
hombre .Su crecimiento está favorecido por la temperatura (20 a 45ºC ) y el pH (4.5
a 9.0). Su tolerancia al pH convierte a este microorganismo en sobreviviente en
comidas fermentadas como quesos y salsas Salmonella spp. crece también
en
ambientes con aw 0.94 pero no puede tolerar altas concentraciones de sal o
temperaturas elevadas.
20
La dosis infectiva depende del estado inmunológico del individuo y ha sido
demostrado que alimentos ricos en grasa tienden a dar un ambiente protector al
microorganismo (Eley, 1996). Salmonella spp. se distingue de otros patógenos por su
frecuente presencia en alimentos, su habilidad para crecer en una gran variedad de
alimentos, su fácil diseminación y contagio persona a persona y su prolongado
período de excreción (10 semanas).
L.monocytogenes es un bacilo Gram positivo, asporógeno, anaerobio
facultativo y sobrevive a temperaturas de 0 a 45ºC. Su aw óptima de crecimiento es
de 0,97 con un mínimo de 0,93 y su pH óptimo de crecimiento está en el rango 5,69,6 (Rocourt, 1997). La dosis infecciosa no está bien establecida pero
L.monocytogenes no representa un problema hasta tanto no alcance altos niveles de
contaminación, en personas sanas. Este microorganismo es ubicuo y puede
contaminar diferentes alimentos y bebidas. Aunque la listeriosis humana es
esporádica, se han reportado en algunos casos consecuencias severas a partir del
consumo de productos crudos, inadecuadamente calentados, y recontaminación de
alimentos tratados (Yuste y col., 2002). Ha sido asociada con varios brotes en los
cuales estaban implicados los quesos
y consecuentemente su ocurrencia ha sido
muy bien estudiada. L. monocytogenes es un importante microorganismo asociado a
enfermedades transmitidas por alimentos debido a la severidad de la infección
causada y a la mortalidad que produce (30%). La contaminación de muchos
alimentos con L. monocytogenes es casi inevitable debido a su naturaleza ubicua en
el medio ambiente. Mas aún su inusual habilidad por sobre otros patógenos de crecer
a temperaturas de refrigeración la asocia con productos normalmente almacenados
en estas condiciones (Smith-Palmer y col., 2001). Ha sido detectada en numerosos
alimentos incluyendo paté( Mc Lauchlin ,1991), comida lista para consumo y
particularmente en quesos blandos ( Linnan y col., 1999). La supervivencia de este
patógeno a valores de pH muy bajos (3,0 a 4,5) ha recibido poca atención,
probablemente debido a que se asume su rápida muerte bajo estas condiciones, pero
resultados obtenidos por Parish y col. (1989) indican que en productos de bajo pH
puede encontrarse Listeria y se puede producir una masiva contaminación si estos
alimentos son consumidos en un período corto de tiempo. Su crecimiento a pH <4,4
está influenciado por la temperatura y el tipo de ácido (McLauchlin, 1990).
21
1.10 Tecnologías combinadas de preservación
La estabilidad microbiológica y la calidad sensorial de la mayoría de los
alimentos, están basados en la combinación de factores de preservación. Esto es
cierto, tanto para alimentos tradicionales con factores empíricos inherentes, como
para productos nuevos para los cuales se han seleccionado racionalmente los factores
de estrés y se han aplicado intencionalmente (Alzamora y col., 2000).
El objetivo de las tecnologías de obstáculos es seleccionar y combinar
factores de preservación o barreras de forma tal que la estabilidad y seguridad
microbiológica puedan ser garantizadas, reteniendo las características nutritivas y la
aceptación sensorial (Leistner, 1992). Este método usa varias barreras que
separadamente pueden no dar una adecuada preservación, pero que cuando se las
combina pueden brindar la protección necesaria. Las barreras pueden incluir la
disminución de la temperatura, pH o actividad de agua (por adición de por ejemplo
NaCl o azúcares); el calentamiento mínimo; o la adición de antimicrobianos
(Buchanan y Phillips, 1990; Leistner, 1992; Leistner, 1995). Para que este concepto
sea aplicado exitosamente, es necesario cuantificar la influencia de los distintos
factores sobre el crecimiento microbiano.
La aplicación de este concepto ha sido muy exitosa en los últimos años,
dentro del conjunto de tecnologías de preservación de mínimo procesamiento, y ello
ha sido posible debido a los grandes avances ocurridos en el conocimiento del modo
de acción de los distintos factores de preservación y de su interacción en los
microorganismos (Sajur, 1985; Alzamora y col., 1989; Guerrero y col., 1993; Rojas y
col., 1994).
La estabilidad u homeostasis del medio interno (composición y volumen de
los fluidos) es vital para la supervivencia y el crecimiento de los microorganismos.
En los alimentos preservados por factores combinados, la homeostasis activa de los
microorganismos vegetativos y la homeostasis refractaria pasiva de las esporas se
interfieren en “un número de sitios” o de “manera cooperativa”, utilizando una
combinación de factores de conservación, aplicando cada uno de ellos en forma no
letal, disminuyendo la severidad de los tratamientos. Por ejemplo, en el caso de
células vegetativas, se reduce la disponibilidad de energía (removiendo O2, limitando
nutrientes, reduciendo la temperatura) y/o se incrementa la demanda de energía
22
(reduciendo aw y pH, añadiendo compuestos activos a nivel de membrana). Para
esporas, la idea es dañar estructuras claves (por ataque químico, enzimático o físico
sobre el cortex) o provocar la germinación de las mismas (con “falsos disparadores”,
por aplicación de altas presiones, etc.) (Gould y col., 1983; Gould, 1995).
Este concepto de combinación no sólo se aplica a la estabilidad
microbiológica, sino que se hace extensivo a la calidad total. También desde el punto
de vista microbiológico, el concepto se ha tornado más abarcativo y se refiere no sólo
a la interferencia de la homeostasis por barreras sinérgicas o aditivas sobre un mismo
microorganismo, sino a la aplicación selectiva de factores de conservación que
puedan ser efectivos contra un organismo específico o un grupo de microorganismos
solamente. Es así, que en los últimos años, un gran número de publicaciones en la
literatura internacional se refiere a la utilización de este concepto con distintas
finalidades: optimizar tecnologías tradicionales; desarrollar nuevos productos y como
medida de seguridad o “back-up” para asegurar la calidad microbiológica de
alimentos mínimamente procesados (Alzamora, 1997).
La adopción de altos estándares en el control de calidad, buenas prácticas de
manufactura y el sistema HACCP son esenciales para asegurar la calidad
microbiológica del producto. Más aún, debido a los reducidos márgenes de
seguridad, los distintos organismos de contralor internacionales han recomendado el
uso de “obstáculos” adicionales en el diseño de los sistemas de preservación tal que
procesos, distribución y almacenamiento no adecuados puedan todavía garantizar
productos microbiológicamente seguros. Así, el uso de factores combinados juega un
importante rol en la seguridad microbiológica de aquellos productos donde los
puntos críticos de control sean imposibles o difíciles de controlar.
Los valores altos de aw en quesos blandos no son suficientes para garantizar la
seguridad microbiológica de este tipo de alimentos, por lo que es necesaria la
combinación con otros factores y/o formas tradicionales de preservación.
Varios factores de preservación, cuyos efectos se describen a continuación, son
frecuentemente utilizados en estas tecnologías. Algunos de ellos han sido empleados
en este trabajo.
1.10.1 Efecto de la reducción de la aw
23
Cuando la aw del medio externo se reduce, los microorganismos tienden
rápidamente a alcanzar el equilibrio osmótico con el medio que los rodea,
principalmente a través de la pérdida de agua, produciéndose plasmólisis de la
célula con pérdida de la turgencia de membrana. Inmediatamente se pone en
marcha un mecanismo osmoregulador que les permite recuperar el agua pérdida y
mantener la homeostasis con respecto de su contenido de agua. Se produce la
acumulación intracelular de solutos “compatibles” por síntesis y/o por transporte
activo desde el medio extracelular hasta balancear la osmolalidad externa (Gould,
1995).
El modo de acción de estos solutos “compatibles” no sólo se explica por su
papel de osmolitos, sino que se cree, tienen una propiedad molecular fundamental:
estabilizar la estructura proteica (y por lo tanto sus funciones) preservando las
funciones de la capa de hidratación (Leistner y Russell, 1991). En las bacterias,
los solutos compatibles de mayor importancia son los aminoácidos (ácido
glutámico, glicilbetaína, ácido γ-aminobutírico, prolina, etc.) y en las levaduras y
los hongos, los polioles (manitol, arabitol, sorbitol, glicerol, etc.).Las diferencias
en la capacidad de biosíntesis o de mecanismos de transporte son responsables de
la diferencia en los valores de aw límite de crecimiento de las varias especies y
géneros de microorganismos.
También se puede producir una alteración de la composición de los lípidos
de la membrana, incrementándose la proporción de lípidos aniónicos de forma tal
de impedir el pasaje de la fase lamelar (o bicapa) a la fase no lamelar (hexagonal)
(Bygraves y Russel, 1988). La disrupción de la conformación lipídica normal de
la membrana, destruiría sus propiedades de permeabilidad pasiva y alteraría las
interacciones lípido-proteína, influenciando las actividades proteíno-mediadas de
la misma (por ej. metabolismo intermedio, bombeo de iones, sistemas de
transporte) (Leistner y Russell, 1991).
1.10.2 Efecto de la reducción del pH
24
El pH es otro factor básico en la preservación de alimentos, afectando la
conformación de las proteínas, el camino de síntesis enzimática y los productos
finales
del
metabolismo.
El
crecimiento
y
la
supervivencia
de
los
microorganismos están fuertemente influenciados por el pH y el contenido de
ácidos orgánicos del alimento. Éstos determinan, de acuerdo a su valor, floras
contaminantes diferentes y de distinta resistencia a los factores de conservación.
Las bacterias, en general, requieren un rango de pH externo entre 4 y 9 para poder
crecer, mientras que los hongos y las levaduras exhiben mayor tolerancia,
pudiendo desarrollarse en los rangos de pH externo 1,5-11,0 y de 1,5-8,0,
respectivamente (Alzamora, 1997).
Los microorganismos necesitan mantener su pH intracelular (pHi) dentro
de cierto rango muy estrecho y cercano a la neutralidad para poder crecer. Éste
valor óptimo de pH depende de la especie: las bacterias acidófilas tienen pHi
comprendidos entre 4,5-6,0, al igual que hongos y levaduras; las neutrófilas entre
7,5-8,0 y las alcalófilas, entre 8,4-9,0. Los organismos tienen distintas
capacidades para regular su pH, y por lo tanto, exhiben también diferente
tolerancia a la perturbación del pH externo. Los microorganismos que son más
resistentes a valores bajos de pH (hongos, levaduras y bacterias acidófilas),
poseen también valores menores de pHi, lo que indicaría una adaptación
específica al medio ácido (Booth y Kroll, 1989).
Existen tres formas en que puede actuar el pH como factor de
conservación (Corlett y Brown, 1980; Brown y Booth, 1991), si bien todavía no se
conoce totalmente el mecanismo por el cual los microorganismos interactúan con
el pH:
Vía ácidos fuertes: éstos disminuyen el pH externo, pero no permean a través de
las membranas celulares y ejercerían su acción alterando la conformación y la
actividad de una o más enzimas esenciales presentes en las capas externas de la
célula, y por lo tanto disminuyendo la efectividad de los sistemas de transporte de
iones esenciales y nutrientes. Tales niveles de acidez son generalmente
inaceptables en los alimentos y sólo permisibles en bebidas carbónicas, en las que
se emplea el ácido fosfórico como acidulante.
Vía ácidos débiles lipofílicos (ácidos cítrico, sórbico, benzoico, propiónico, etc.):
las formas no disociadas de estos ácidos débiles, permean a través de las
25
membranas y actúan como transportadores de protones, ionizándose en el
citoplasma y acidificando el medio interno. El efecto primario es disminuir el
pHi, pero además, el anión del ácido no disociado puede tener efectos inhibitorios
específicos en el metabolismo, incrementando el efecto del pH (ej: ácido acético,
fórmico, sórbico).
Vía iones ácido-potenciados: el bajo pH potencia la actividad de compuestos
tales como bicarbonato, sulfito y nitrito, incrementando la acción de la especie
antimicrobiana; es decir, que el efecto del pH es indirecto.
1.10.3 Efecto del sorbato de potasio
El sorbato de potasio es principalmente efectivo contra mohos y
levaduras, aunque tiene cierta efectividad sobre algunas bacterias. El efecto sobre
los hongos, se debe a la inhibición de los sistemas de enzimáticos de
deshidrogenasas, las cuales intervienen en el mecanismo de oxidación de los
ácidos grasos (Jay, 1991) y enzimas sulfihidrílicas tan importantes como
aspartasas, succinodeshidrogenasas y fumarasas. Es altamente efectivo en la
inhibición de la producción de micotoxinas por algunas cepas (Ryu y col., 1993).
Su efectividad depende de muchos factores tales como pH, aw, presencia
de otros aditivos, procesamiento y envasado, temperatura y condiciones de
almacenamiento (Sofos y Busta, 1983). La cantidad a utilizar depende del tipo de
microorganismo, la aw del alimento y de la carga inicial considerados. En general,
concentraciones de sorbato añadidas en el orden de 0,05 – 0,10 %, inhiben el
desarrollo de hongos y levaduras en una amplia gama de alimentos.
1.10.4 Utilización de antimicrobianos naturales
La incidencia creciente de enfermedades transmitidas por alimentos, junto
con las implicancias socio-económicas moviliza a una constante necesidad de
producir alimentos seguros y desarrollar nuevos agentes antimicrobianos.
Considerando la seguridad de ciertos conservantes químicos y la reacción negativa
26
de los consumidores quienes los perciben como artificiales, ha surgido un creciente
interés en alternativas más naturales. Particular interés se ha planteado en la potencial
aplicación de aceites esenciales de plantas. La propiedades antimicrobianas están
bien establecidas contra un gran espectro de microorganismos incluyendo bacterias
(Smith-Palmer y col., 1998) ,levaduras ( Lachowicz y col.,1998; Mangena y
Muyima, 1999) y hongos (Paster y col., 1990; Mishra y Dubey 1994).
Diversos autores han estudiado el efecto de aceites esenciales como agentes
bactericidas (Smith-Palmer, 2001). Skandamis y col. (2001) testearon, por ejemplo,
la efectividad del aceite esencial del orégano contra E.coli en caldo BHI hallando
resultados positivos en cuanto a su efecto inhibitorio. Azzous y Bullerman (1982)
encontraron que el clavo de olor era un eficiente antimicótico contra Aspergillus
flavus, A. parasiticus y A. ochradeus y cuatro cepas de Penicillium demorando su
crecimiento por más de 21 días. Cerrutti y col. (1997) evaluaron el potencial uso de
vainillina como antimicrobiano (en lugar de sorbato de potasio y bisulfito de sodio)
en la formulación para obtener puré de frutillas mínimamente procesado. Vrinda
Menon y Garg (2001) estudiaron el efecto bactericida del aceite del clavo de olor
sobre Listeria monocytogenes en carnes y quesos. Wilkins y Board (1989) reportaron
que más de 1389 plantas son potencialmente fuente de agentes antimicrobianos como
es el caso del timol obtenido del tomillo y orégano, el aldehído cinámico de la canela
y el eugenol de clavos de olor.
Sin embargo la actividad antimicrobiana de algunos aditivos, combinados o
no, en sistemas como agua o medios de cultivo reflejan pobremente, en general, su
comportamiento en sistemas más complejos como los alimentos (Alzamora y col.,
2005).
En algunos casos, el responsable de la reducción de su actividad
antimicrobiana es la interacción con los diferentes nutrientes del alimento (proteínas,
grasas, etc.) y otros factores de preservación (Sofos y col., 1998). Así y todo, los
mecanismos por los cuales se podría explicar cierta toxicidad o resistencia
antimicrobiana a determinados preservantes son menos conocidos.
1.10.4.1 Timol
27
El aceite de tomillo es obtenido por destilación por arrastre de vapor de las
hojas de Thymus vulgaris. Sus componentes mas importantes son los alcoholes
fenólicos los que expresados como timol se encuentran en una concentración
superior al 35%. Otros componentes observados lo constituyen el p-cimeno y el
terpineno los que junto al timol le imparten su aroma y sabor característico.
El timol es empleado para aromatizar todo tipo de alimentos. Dentro de la
industria farmacéutica el timol es un conocido antiséptico, su color es amarillo
intenso, olor agradable, densidad 0,91 - 0,94 e índice de refracción 1,492 - 1,499.
El mismo es reconocido también
como conservante natural contra
Staphylococcus aureus y Salmonella Enteritidis (Juven y col. 1994; Lambert y col.,
2001). Algunos de los sinónimos con los que se lo puede encontrar en la bibliografía
son: ácido tímico, alcohol timólico, fenol timólico, isopropilmetacresol, etc. Medina
y col. (2004) estudiaron la actividad bactericida “in vitro”, por el método de difusión
en agar, frente a cultivos puros de cinco bacterias patógenas (Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis, Enterococcus sp. y
Escherichia coli) y seis cepas de bacterias lácticas que alteran alimentos. Los
resultados encontrados destacan la efectividad del aceite de tomillo frente a cultivos
puros de bacterias patógenas así como frente a bacterias lácticas (Alzamora y
col.,2003).
1.11 Calidad, vida útil y seguridad
La falta de calidad en los alimentos puede ser la consecuencia de cambios
físico-químicos, enzimáticos o microbiológicos. Los microorganismos desempeñan
un papel clave en la pérdida de calidad a través de las actividades de bacterias,
hongos y levaduras pero también a través del crecimiento o supervivencia de
especies patógenas. Por lo tanto, si se quieren obtener juicios confiables sobre la
calidad del alimento, su vida útil y su seguridad, es necesario disponer de datos
cuantitativos sobre los efectos de los factores que afectan el crecimiento, la
supervivencia y/o la inactivación. Recientemente, con el avance informático, las
técnicas para desarrollar modelos predictivos se han mejorado enormemente y es
posible pensar en una Base de Datos para Predicciones Microbiológicas a ser usada
por la industria y otros organismos relacionados a esta temática.
28
Los quesos presentan problemas de vida útil en heladera asociados al hábito
de consumo (alimentos de abre y cierre) que provocan un deterioro prematuro por
desarrollo de microorganismos. Estos productos pasteurizados poseen un pH
relativamente elevado (5,1- 6,2) y una actividad de agua (aw) óptima para el
desarrollo microbiano. Numerosos estudios han establecido que el deterioro de los
mismos depende de
factores intrínsecos tales como
variedad del queso, aw,
contenido de sal, contenido y tipo de emulsificante, pH y de factores extrínsecos, de
los cuales los más importantes resultan la temperatura de almacenamiento y la
contaminación post-pasteurización. Datos de bibliografía muestran que Listeria
monocytogenes, Salmonella spp, y Staphylococcus coagulasa positivo representan a
los patógenos
de mayor incidencia en quesos (Ahmed y col.,1988; Abdalla y
col,1992; Altekrus y col.,1998; Larson y col.,1999; Jorgensen y col.,2005). Si se
quieren obtener juicios confiables sobre la calidad de este alimento, su vida útil y su
seguridad, es necesario disponer de datos cuantitativos sobre los efectos de los
factores que afectan el crecimiento, la supervivencia y/o la inactivación.
Los modelos matemáticos son la mejor manera de hacer predicciones bajo
estas circunstancias.
Una herramienta para el desarrollo de tecnologías para poder estimar la
conducta microbiana, es la aplicación de la microbiología predictiva (Mc Meekin y
col., 1993).
1.12 Microbiología Predictiva
1.12.1 Generalidades
La microbiología predictiva consiste en el desarrollo de modelos matemáticos
para predecir la velocidad de crecimiento o de declinación de los microorganismos
bajo un dado conjunto de condiciones ambientales (Walls y Scott, 1997). El
conocimiento detallado de las respuestas de crecimiento de los microorganismos
frente a las condiciones ambientales, es decir, el conocimiento de la ecología
microbiana, permite evaluar objetivamente el efecto del procesamiento, la
distribución y el almacenamiento en la seguridad microbiológica y la calidad de los
alimentos. Utilizando diseños experimentales adecuados y modelos matemáticos
29
apropiados, la microbiología predictiva permite la selección de los factores de
preservación para alcanzar la vida útil deseada de diversos alimentos.
Antes de ser usados estos modelos matemáticos en la práctica deben ser
validados a los fines de demostrar que el comportamiento bacteriano es el mismo
tanto en el laboratorio como en el alimento real.
El testeo de todo modelo es su habilidad para predecir respuestas en nuevas
situaciones. En microbiología de alimentos esto significa la habilidad del laboratorio
de generar modelos para predecir el comportamiento de los microorganismos
concernientes al alimento en preparaciones comerciales, almacenamiento y
distribución. Claramente la validación en este nivel debe ser realizada antes que los
modelos predictivos puedan ser usados en la práctica con cierto grado de certeza.
Existen potenciales consecuencias de un prematuro uso comercial de un modelo
predictivo. Desde el punto de vista de la seguridad de los consumidores y la
aceptación de la industria de los conceptos de microbiología predictiva un fracaso de
un modelo no validado puede ser serio (Mc Meekin y col., 1993).
Draper y Smith (1981) indicaron que una vez que el modelo fue validado en
la práctica es todavía necesario realizar algún procedimiento para mantener el
modelo y reconocer cuando deviene en obsoleto. Ellos recomiendan que por rutina el
modelo debe ser periódicamente chequeado mediante análisis estadísticos que deben
permitir discernir mas formas de desviaciones sutiles.
No es un problema cuán bien un modelo puede ajustar una serie de datos, el
verdadero valor de un modelo recae en cuán bien ese modelo puede predecir la
respuesta microbiana bajo nuevas condiciones que no son las que fueron
específicamente testeadas. Es decir, cuán bien ese modelo funciona en el mundo real.
El modelado microbiano comenzó aproximadamente en 1920 con los cálculos
del tiempo de muerte térmica y el uso de los valores D (tiempo de reducción
decimal) y z (grados de variación en la temperatura, necesarios para reducir el valor
de D en un 90%), para describir la resistencia térmica bacteriana. En la década del
‘70, se profundizó principalmente en el modelado de la probabilidad de producción
de toxinas de C. botulinum, principalmente en USA y en el Reino Unido (Roberts e
Ingram, 1973). En los años ’80 el marcado incremento en la incidencia de brotes de
enfermedades producidas por alimentos, llevó a tomar conciencia pública de la
necesidad de un abastecimiento seguro de alimentos. En ese momento, los
30
microbiólogos de alimentos comenzaban a aceptar que los métodos microbiológicos
tradicionales para determinar la calidad y seguridad alimenticia, estaban limitados
por el tiempo requerido para obtener los resultados y que los métodos indirectos
basados en cambios químicos, físicos o fisicoquímicos, no proporcionaban una
respuesta hasta que un gran número de células se encontraba presente. Lo mismo
ocurría con varios métodos rápidos que necesitaban, o bien un alto nivel de
contaminación para que la respuesta sea evidente, o dependían del uso de
equipamiento muy sofisticado y oneroso.
Antes del advenimiento de la microbiología predictiva, la mayor parte de la
bibliografía definía las condiciones ambientales limitantes del crecimiento, cuando
los demás factores ambientales se encontraban en los valores óptimos. Además, sólo
ocasionalmente los efectos de dos o más factores de conservación se estudiaban de
tal forma que permitieran cuantificar la interacción de los mismos. A consecuencia
de ello, muchos de estos datos no eran de utilidad o bien no permitían predecir la
respuesta microbiana.
Si bien el modelado no revela comportamientos microbianos extraños o poco
esperados, los modelos se pueden usar para predecir, por interpolación, el
crecimiento
bajo una combinación de condiciones que no fueron específicamente
testeadas en el protocolo experimental (Whiting, 1995).
Se han propuesto varios esquemas para categorizar los modelos, uno de ellos
propone
dividirlos
en
modelos
de
crecimiento
y
modelos
de
inactivación/supervivencia. Dentro de cada categoría se subdividen en modelos
primarios, secundarios y terciarios (Whiting y Buchanan, 1994; Alzamora y col.,
1995; López-Malo, 2000; Alzamora y col.,2010).
Los modelos primarios describen cambios en la respuesta microbiana con el
tiempo en un ambiente específico. El modelo puede cuantificar unidades formadoras
de colonia por mililitro o por gramo (UFC/mL), formación de toxinas, niveles de
sustrato o productos metabólicos (que son medidas directas del crecimiento);
absorbancia e impedancia (medidas indirectas de la respuesta). Una vez generada la
curva de crecimiento o muerte microbiana, se utiliza una función o ecuación
matemática para describir el cambio de la respuesta en función del tiempo. Ejemplos
de modelos primarios son: la función de Gompertz para crecimiento exponencial; el
modelo de Gompertz modificado para describir la inactivación microbiana; modelos
para describir la declinación no lineal de esporas sobrevivientes con el tiempo; el
31
modelo logístico aplicado a destrucción térmica; el modelo de Stannard; el modelo
de Schnute; la ecuación de Fermi; etc. (Mc Meekin y col., 1993). El valor D (tiempo
necesario a una determinada temperatura para reducir en un 90% la población
microbiana ) es también ejemplo de un modelo primario (Whiting y Buchanan,1994).
Los modelos secundarios describen las respuestas de los parámetros de los
modelos primarios frente a cambios en uno o más factores ambientales como
temperatura, pH o aw. Ejemplos de modelos secundarios son el modelo de Arrhenius
y el modelo de la raíz cuadrada (Bělehrádek), que describen la dependencia con la
temperatura, y el modelo polinómico. El valor z (ºC necesarios para disminuir el
valor D un ciclo logarítmico) utilizado en procesos térmicos es también un ejemplo
de modelo secundario (Whiting y Buchanan, 1994). Los mismos no serán objeto de
estudio en el presente trabajo.
Los modelos terciarios son rutinas de software para computadora menos
difundidas que convierten a los modelos primarios y secundarios en programas
amigables. Estos programas pueden calcular las respuestas microbianas frente a
condiciones que no fueron evaluadas inicialmente, comparar el efecto de diferentes
condiciones o contrastar el comportamiento de varios microorganismos, por lo que
permiten elegir a el o los microorganismos blanco de ataque en situaciones
específicas de formulación-procesamiento de alimentos. Ejemplos de modelos
terciarios son el programa “USDA Pathogen Modeling Program” realizado por el
Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, disponible gratuitamente en
Internet (http://www.arserrc.gov) y el “Food Micromodel” avalado por el Ministerio
de Agricultura Pesca y Alimentación del Reino Unido (Wilson y col., 2002).
Es necesario remarcar que llevando a cabo este modelado se puede describir
exitosamente el comportamiento microbiano en la mayoría de los alimentos pero hay
ocasiones en las que se encuentran discrepancias entre el modelo y el crecimiento
observado . Estas discrepancias son descriptas como “fallas”. Un ejemplo sería que
el crecimiento observado es más lento que el predicho por el modelo (Wilson y col.,
2002).
La validación de los modelos matemáticos es esencial para demostrar su
aplicabilidad en alimentos. Si bien buenas coincidencias son observadas también
suelen observarse algunas debilidades.
32
Una de las debilidades mayormente encontradas está dada por la severidad
del medio que representa la matriz alimentaria con respecto a los medios de cultivos
que se utilizan en los ensayos de laboratorio. Otra debilidad observada está
relacionada con cuanto de rápido se adapte el microorganismo a su nuevo medio
ambiente. Si en los experimentos se utilizan los mismos microorganismos a los
utilizados en el programa PMP, medios similares y las mismas condiciones de
crecimiento es de esperar que el alimento en estudio provea condiciones más
favorables aún para el crecimiento bacteriano que el medio utilizado en Laboratorio
(Walls y Scott ,1997).
Otra consideración a tener en cuenta es que muchos modelos utilizan una
mezcla de cepas es decir cepas de rápido crecimiento junto con cepas de lento
crecimiento .Idealmente la mezcla de cepas representarían lo que normalmente se
podría encontrar en los alimentos o al menos lo más parecido. Existen cepas como
Salmonella senftenberg termoresistente que debería tener un modelo de inactivación
separado del resto. Los microbiólogos deben chequear ambos modelos y aplicar su
propio criterio (Whiting y Buchanan ,1997).
Recientes estudios han indicado que las condiciones bajo las cuales el inóculo
utilizado debe crecer tienen un impacto importante en el crecimiento o inactivación
bacteriana. Los datos utilizados para generar los modelos están basados en el
crecimiento de cepas a su vez crecidas en ambientes favorables antes de ser usadas
en el medio de cultivo. Estas células pueden tener diferencias en sus tiempos de fase
lag , en sus características de crecimiento, etc., con respecto a células que no fueron
pre-adaptadas.
Los modelos matemáticos microbianos proveen información sumamente útil
para tomar decisiones en determinadas situaciones. Estas situaciones pueden
resumirse en (Whiting y Buchanan, 1994) :
•
Predicción en seguridad y tiempo de vida útil: Crecimiento y
supervivencia microbiana permiten estimar peligros potenciales
provocados por microorganismos patógenos en alimentos luego de un
normal o abusivo tiempo de almacenamiento.
33
•
Control de Calidad: Los modelos pueden brindar ayuda en desarrollar
programas HACCP mostrando que condiciones permiten crecer o
sobrevivir y así identificar los puntos críticos de control. Esto es
particularmente importante en alimentos en donde pueden existir
interacciones de diferentes factores que influyen en el crecimiento
microbiano.
•
Desarrollo de nuevos productos; Cambios en la composición del
alimento o una nueva formulación pueden ser rápidamente evaluadas
en cuanto a posible crecimiento o supervivencia de microorganismos.
Los modelos muestran que factores tienen más influencia en la
población microbiana y permite comparar nuevas versus viejas
formulaciones.
•
Educación: a través de la generación de gráficos o estimando el
tiempo de generación de una población microbiana crítica, los
modelos permiten demostrar drásticamente la importancia de
mantener la correcta temperatura o los beneficios que representa
trabajar con materias primas de alta calidad con bajos contenidos
microbianos iniciales.
•
Planeamiento en Laboratorio y análisis de bases de datos: Ahorra
recursos, tiempo y dinero permitiendo al laboratorio a concentrar sus
esfuerzos en los puntos críticos. El modelado representa cada vez más
una técnica de rutina para análisis de datos de comportamientos
bacterianos. Estos datos pueden ser manipulados matemáticamente y
estimas así los errores.
34
2. OBJETIVOS
35
2.1 Objetivo general
En microbiología predictiva los modelos matemáticos son utilizados para
predecir el comportamiento de los microorganismos bajo diferentes condiciones.
Antes de ser utilizados en una situación práctica, estos modelos matemáticos deben
ser validados con el propósito de demostrar que las bacterias se comportan de igual
modo tanto en los alimentos reales como en los sistemas modelo (p.e. medio de
laboratorio) que se utilizaron para generar dichos modelos. La presente propuesta
tiene como objetivo general la aplicación de una estrategia que integra el concepto de
factores combinados de preservación y la microbiología predictiva para contribuir al
aseguramiento de la calidad microbiológica de un derivado lácteo mediante la
validación de diferentes tipos de modelos matemáticos.
2.2 Objetivos específicos
1)
Obtener respuestas microbiológicas de crecimiento, supervivencia y/o
inactivación de microorganismos de interés a distintos factores de conservación
utilizados y potenciales (temperatura: presencia de distintos aditivos; pH) y a sus
combinaciones en queso untable comercial.
2)
Modelar
y
validar
internamente
la
cinética
de
crecimiento/supervivencia/inactivación de un microorganismo clave utilizando como
herramienta fundamental a la microbiología predictiva a fin de establece la matriz a
utilizar.
3)
Realizar
estudios
de
reto
microbiano
utilizando
pátógenos
comúnmente causantes de ETAS en este tipo de alimento. Modelar y validar
internamente la cinética de crecimiento/supervivencia/inactivación utilizando como
herramienta fundamental a la microbiología predictiva.
36
4)
Una vez validados los modelos, evaluar la influencia de los factores de
estrés aplicados de uso corriente o potenciales (p.e. uso de antimicrobianos naturales)
a través del análisis de los parámetros obtenidos para los distintos modelos.
5)
Predecir la conducta microbiana y evaluar el riesgo ante situaciones de
abuso térmico.
6)
Cuando sea posible, comparar la aplicabilidad y concordancia de los
diferentes modelos utilizados primarios y terciarios en la predicción de la conducta
microbiana en queso untable.
37
3. MATERIALES Y MÉTODOS
38
3.1- Matriz utilizada
Para el presente estudio se han utilizado dos matrices que responden a la
denominación de queso (Introducción, sección 1.1) con la única diferencia de
poseer o no (1000 ppm) sorbato de potasio.
A los fines prácticos llamaremos queso untable base al queso untable sin
sorbato de potasio y queso untable al que posee sorbato de potasio (1000 ppm) y
que es el que se adquiere para consumo masivo.
3.1.1 Elaboración del queso untable base
El queso untable base fue elaborado a escala piloto y provisto por la
empresa Danone S.A. El mismo fue fraccionado en potes comerciales flexibles
(capacidad ≅ 150 gramos), usualmente usados para el envasado de yogures.
El proceso de elaboración del queso incluyó como primer paso la
elaboración de un producto intermedio: la masa magra descremada, a base de leche
descremada, fermento, cuajo y cloruro de calcio. En un segundo paso, se adicionó a
la masa magra, crema, gelatina, cloruro de sodio y citrato de sodio en los siguientes
porcentajes:
•
Masa magra
54,3%
•
Crema
44,5%
•
Gelatina
0,7%
•
Cloruro de sodio
0,2%
•
Citrato de sodio
0,3%
La composición porcentual del producto final resultó:
Leche seleccionada descremada pasteurizada
84%
39
Crema
15,98%
Gelatina (textura)
0,002%
Citrato de Sodio (estabilizante de proteínas)
0,0008%
Cloruro de Sodio
0,0006%
Cloruro de Calcio
0,004%
Fermento(cultivo iniciador)
0,02%
Cuajo
0,0001%
El fermento mencionado anteriormente estaba compuesto por
una
mezcla de cultivos de las siguientes bacterias lácticas: Lactococcus lactis subsp.
lactis, Lactococcus lactis biovar. diacetylactis y Leuconostoc mesenteroides ssp.
cremoris los cuales generan ácido láctico hasta pH ~ 4,5. Estos cultivos lácticos
generan diacetilo a partir del citrato (Axelsson, L., 2004), producto que le confiere al
queso un sabor amargo característico.
El pH del producto final se ajustó a ~ 5,0. Una vez alcanzado este valor,
el porcentaje final de ácido láctico en el queso untable base
tuvo un valor
aproximado de 0,6-0,7%.
3.1.2 Medición de pH
Para la medición de pH se utilizó un equipo marca Orion, ión selectivo,
modelo 710 (Orion, Inc, USA) calibrado con soluciones buffer (Hanna Instruments,
Italia)
de pH 4,01 +/- 0,01 y pH 7,01 +/- 0,01. Las determinaciones se realizaron
por duplicado informándose el valor promedio.
3.1.3 Medición de actividad de agua (aw )
La actividad de agua se midió con un higrómetro de punto de rocío AquaLab CX-2
(Decagon Devices, Inc., Pullman, WA) calibrado con soluciones saturadas de NaCl,
(NH4)2SO4, KCl y BaCl2; como lo describen Roa y Tapia de Daza (1991). Las
determinaciones se realizaron por duplicado informándose el valor promedio.
40
3.2- Reactivos utilizados
Tanto para el enriquecimiento como para el aislamiento de las bacterias se
usaron medios selectivos y diferenciales entendiéndose por “selectivo” aquel medio
de cultivo que posee en su composición algún ingrediente con capacidad de inhibir el
crecimiento de la flora acompañante permitiendo “seleccionar” el crecimiento de la
bacteria deseada. Bajo el término de diferencial se entiende aquel medio que posee
algún componente que acentúa alguna característica “exclusiva” de la bacteria en
estudio de tal forma de poder “diferenciarla” del resto de las bacterias que pueda
crecer.
3.2.1- Medios líquidos de enriquecimiento selectivos y no selectivos
Caldo BHI (Merck, Darmstadt, Alemania), composición:
Extracto de cerebro, corazón y peptona
D-glucosa
27,5 gr,
2,0 gr
Cloruro sódico
5,0 gr
Hidrógenofosfato di sódico 2,5 gr
Agar-agar
15,0 gr
Caldo FDA (Merck, Darmstadt, Alemania), composición:
Peptona de caseína
17,0 gr
Peptona de harina de soja
D-glucosa
3,0 gr
2,5 gr
Cloruro sódico
5,0 gr
Hidrógenofosfato di potásico
2,5 gr
Extracto de levadura 6,0 gr,
Suplemento: acriflavina, cicloheximida, ac.nalidíxico.
Agua peptonada ( Britania, Buenos Aires, Argentina), composición:
Peptona
10,0 gr
Cloruro de sodio
5,0 gr
Fosfato disódico
3,5 gr
41
Fosfato monopotásico
1,5 gr
3.2.2-Medios sólidos de aislamiento diferenciales y selectivos
Agar Baird Parker (Merck, Darmstadt, Alemania), composición:
Peptona de caseína
10,0 gr
Extracto de carne
5,0 gr
Extracto de levadura 1,0 gr
Cloruro de litio
Glicina
5,0 gr
12,0 gr
Piruvato de sodio
10,0 gr
Agar 17,0 gr.
Aditivos : emulsión de yema de huevo con telurito.
Agar Oxford ( Difco, Detroit, USA),composición:
Agar base Columbia 39,0 gr
Esculina
1,0 gr
Citrato de amonio férrico
Cloruro de litio
0,5 gr
15,0 gr
Agar 2,0 gr
Suplemento: cycloheximida, colistina, cefotetán, fosfomicina,acriflavina.
Agar BPL ( Merck, Darmstadt, Alemania), composición:
Peptona de carne
5,0 gr
Peptona de caseína
5,0 gr
Extracto de carne
5,0 gr
Cloruro de sodio
3,0 gr
Hidrógenofosfato disódico
Lactosa
10,0 gr
Sacarosa
10,0 gr
2,0 gr
Rojo de fenol 0,08 gr
Verde brillante
Agar-agar
0,0125 gr
12,0 gr
42
Agar Levine ( Difco, Detroit, USA), composición:
Peptona
10,0 gr
Lactosa
10,0 gr
Fosfato dipotásico
2,0 gr
Eosina 0,4 gr
Azul de metileno
Agar-agar
0,065 gr
15,0 gr
3.2.3- Otros reactivos utilizados
Solución fisiológica (Rivero SRL, Buenos Aires, Argentina).
Timol en polvo (Firmenich, Buenos Aires, Argentina)
3.3- Microorganismos utilizados
Se utilizaron para este estudio cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Listeria monocytogenes ATCC 19114D, Salmonella Enteritidis obtenida de material
clínico y Escherichia coli de igual procedencia.
Las cepas fueron conservadas a 5ºC en pico de flauta de agar nutritivo y
repicadas periódicamente con el propósito de
mantener su viabilidad .Los
aislamientos iniciales fueron realizados en un medio sólido diferencial y selectivo
apropiado para cada microorganismo.
S. aureus fue aislado en agar Baird Parker (protocolo en estándar
internacionales:
United
States
Pharmacopea
XXI,1995;Internacional
Organization for Standarization-ISO, 1977/1978; Federación Internacional de
Lechería,1978) .
L. monocytogenes fue aislada en agar Oxford (Protocolo 143 de IDF-FIL
para productos lácteos , 1990).
S. Enteritidis fue aislada en agar Verde brillante-rojo de fenol-lactosa (BPL)
(protocolo sugerido por Kauffmann-1935) .
E .coli fue aislada en agar Levine (Protocolo sugerido por Standard Methods
for the examination of Water and Wastewater-1975; United Status
Pharmacopoeia XXI-1985).
43
El enriquecimiento de cada colonia pura fue realizado en los caldos o medios
líquidos correspondientes: S. aureus en caldo cerebro-corazón (BHI), L.
monocytogenes en caldo de enriquecimiento FDA (Food and Drug Administration) y,
S. Enteritidis y E. coli en agua peptonada.
Aislamiento de S.aureus ATCC 25923 utilizados en este estudio, medio agar Baird
Parker.
Aislamiento de L.monocytogenes ATCC 19114D utilizados en este estudio, medio
agar
Oxford.
44
Aislamiento de S.Enteritidis aislada de material clínico utilizada en este estudio,
medio agar Verde brillante-rojo de fenol-lactosa.
Aislamiento de E.coli aislada de material clínico utilizada en este estudio, medio
agar Levine.
3.3.1 Caracterización de los microorganismos utilizados en este estudio
Las cepas provenientes de material clínico (materia fecal humana) fueron
tipificadas por el Instituto Nacional de Microbiología “Carlos G. Malbran”. Allí se
realizaron todas las pruebas microbiológicas y serológicas necesarias para su
clasificación taxonómica.
Las cepas de colección S.aureus ATCC 25923 (ATCC) y L.monocytogenes
ATCC
19114D fueron adquiridas comercialmente (Medicatec SRL, Bs As,
Argentina ).
45
3.4-Metodología
3.4.1- Preparación de los inóculos
Para cada una de las cepas, se aisló una colonia a partir del agar diferencial y
selectivo correspondientes (Figuras 2a, b, c y d). Dicha colonia se inoculó en 10 ml
de caldo de enriquecimiento (Materiales y Métodos, sección 3.2), el cual se incubó
durante 24 hs a 37ºC.
Para la elaboración de un inóculo madre, se tomó 0,5ml del inóculo de cada
microorganismo y se diluyó en 500 ml de agua peptonada alcanzando en todos los
casos una solución con un recuento aproximado de entre 105 y 107 UFC/ml .
3.4.2-Preparación de la solución de timol. Evaluación sensorial
Se hizo una prueba piloto de aceptación organoléptica con un panel de 5
personas (provenientes del laboratorio de trabajo) para establecer la máxima
concentración de timol aceptable desde el punto de vista sensorial. La preparación de
la solución de timol se realizó utilizando etanol como diluyente. Se evaluaron las
siguientes concentraciones en el queso untable base: 0,2; 0,3; 0,5 y 1 %.
Para cada concentración de timol, se pesaron 100 gr de queso untable base en
bolsas estériles (Whirl-pack, Nasco, U.S.A). Posteriormente, se añadió la solución
de timol necesaria para alcanzar la concentración deseada en el queso untable base y
se homogeneizó en stomacher durante dos minutos a baja velocidad. La degustación
de las muestras de queso untable base adicionadas con distintos niveles del
antimicrobiano se realizó en el sentido de concentraciones crecientes neutralizando
entre muestra y muestra con agua y en caso de ser necesario con grisines sin sal
(Lawless y Heymann, 1999). Se descartaron aquellas concentraciones que resultaban
inaceptables organolépticamente. Se seleccionó, para la realización del estudio, la
máxima concentración promedio aceptada por el panel de degustadores.
3.4.3- Inoculación del queso untable base
Se pesaron 160 gr. de en bolsa estéril (Whirl-Pack, Nasco, U.S.A) y se
agregaron 3,25 ml del inóculo madre, se homogeneizó en stomacher durante 2
46
minutos a baja velocidad. Las bolsas, conteniendo los 160 gr de queso inoculado y
0,48 gr de timol, se cerraron manualmente sacando todo el oxígeno remanente y se
almacenaron a las distintas temperaturas correspondientes en cada ensayo (5ºC25ºC) para su posterior análisis.
3.4.4- Recuento de microorganismos
De cada bolsa inoculada y almacenada a la temperatura correspondiente a la
experiencia se tomaron en los días de recuento10 gr de la muestra de queso, por
duplicado (duplicado de experiencia). Se agregaron 90 ml de agua peptonada a cada
bolsa y se homogeneizaron 2 minutos a baja velocidad en stomacher (Seward
Medical,Londres,UK) para asegurar un correcto mezclado.
A partir de dichos homogenatos se calcularon las diluciones correspondientes
como para lograr un recuento de no más de 100 colonias por placa y minimizar el
error de conteo. Se inocularon las placas de Petri, por duplicado (duplicado de placa)
realizando la metodología de recuento combinado.
Para la metodología del recuento combinado se tomó 1 ml del homogenato
presente en las bolsas agitadas en el stomacher, se distribuyó homogéneamente en 3
placas de Petri (0,33 ml en cada placa), se esparció con espátula de Drigalsky hasta
absorción total y se puso a incubar. El medio utilizado para las placas fue el agar de
aislamiento específico para cada microorganismo (Materiales y Métodos, sección
3.2.2). La incubación se llevo a cabo en incubadoras (Velp, Italia) a 37ºC ,el tiempo
correspondiente a cada experiencia. Se realizó el recuento informando UFC/gr.
3.5 Estudios realizados
3. 5.1 Estudio del efecto de la temperatura de almacenamiento
Se estudió el comportamiento de S. aureus en el queso untable (conteniendo
1000 ppm de sorbato de potasio) a temperatura de refrigeración: 5ºC y temperatura
de abuso térmico: 15ºC y se comparó con el comportamiento a las mismas
temperaturas pero en caldo nutritivo (BHI) a modo de tener un parámetro mas de
referencia.
47
La experiencia se llevó a cabo tal como se indica en el siguiente cuadro:
Matriz
Temperatura de
Días de recuento
almacenamiento
Queso untable
5ºC
0,7,12,17 y 21
Queso untable
15ºC
0,3,5,7,10,12,14,17 y 19
BHI
5ºC
0,1,2,3,10,12 y 14
BHI
15ºC
0,2,5,9,12,13,y 14
3. 5.2 Estudio del efecto de la ausencia de sorbato de potasio (queso untable
base)
Matriz
Temperatura de
Días de recuento
almacenamiento
Queso untable
15ºC
0,3,5,7,10,12,14,17 y 19
Queso untable base
15ºC
2,4,6,8,10,12,14 y 16
3. 5.3 Estudio sobre el efecto del pH
El pH del queso untable base se ajustó mediante la utilización de diferentes
volúmenes de jugo de limón. Se realizó de modo complementario una prueba de
aceptación organoléptica con un panel de 5 personas evaluando muestras de queso
untable base con su pH original (5,0-5,1) y en el rango de pH 4,1- 5.
Según el volúmen de jugo de limón agregado a 10 gr de queso untable base
se llegó a los siguientes valores de pH:
48
Volumen de jugo de limón agregado
pH final medido
(ml)
0,1
5,0
0,3
4,6
0,5
4,5
0,7
4,4
0,9
4,3
1,1
4,2
1,3
4,1
El valor de pH seleccionado fue el de menor valor organolépticamente
aceptado. Una vez ajustado el pH se procedió a preparar la matriz sobre la cual se
desarrollaría el estudio .Para dicho propósito se trabajo con el queso untable base a
dos pH: 5,0 y 4,3. Las condiciones de temperatura y pH y en las que se desarrolló
el presente estudio se detallan en la siguiente tabla:
Temperatura/pH
Días de recuento
10ºC/ 5,0
0,5,7,12,20,25,30 y 40
15ºC/ 5,0
0,2,4,6,8,11,13,15 y 17.
22ºC/5,0
0,2,5,7,12,16,19,26,28,30,33 y 38
10ºC/ 4,3
0,20,40,50,60 y 65.
15ºC/ 4,3
0,3,7,11,14,17 y 19.
22ºC/ 4,3
0,2,6 y 20
49
3. 5.4 Estudio de reto microbiano
De acuerdo a la información aportada por la microbiología predictiva que
describe el comportamiento de los microorganismos en medio de cultivo en
determinadas
condiciones de pH y temperatura, se intentó estudiar el
comportamiento de cuatro bacterias seleccionadas. En base a esta información se
elaboraron programas de estudio a 6, 17 y 25ºC.
La matriz utilizada fue queso untable base y las bacterias fueron S.aureus,
E.coli, S. Enteritidis y L.monocytogenes
A
Temperatura/pH
Días de recuento
6ºC/ 5,0
0, 6, 13, 20, 27, 30, 33 y 36
17ºC/ 5,0
0, 2, 5, 8, 11, 12, 13 y 14
25ºC/ 5,0
0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7
cada día de recuento fueron removidas 2 bolsas de la cámara de
incubación y cada una fue sometida al estudio microbiológico descripto (Materiales
y Métodos, sección 3.4)
3. 5.5 Utilización de timol
Considerando el comportamiento observado en el apartado anterior se intentó
estudiar el comportamiento de los mismos microorganismos adicionando al queso
untable base un antimicrobiano natural compatible con este tipo de productos, timol,
componente principal del aceite esencial de orégano y observar así el efecto que el
mismo produce sobre su desarrollo.
El queso untable base fue adicionado con timol (0,3% p/p) y luego inoculado
con S.aureus ó S. Enteritidis (Materiales y Métodos, sección 3.4.3) y almacenados a
diferentes temperaturas. Los días de recuento (y temperaturas de almacenamiento)
fueron similares a los establecidos en el mismo ensayo pero en ausencia de timol a
50
los fines de poder realizar una comparación del comportamiento del microorganismo
ensayado. Se realizó el siguiente esquema de muestreo:
Matriz
Microorganismo
Temperatura/pH
Días de recuento
Queso untable
S.aureus
6ºC/ 5,0
0,7,14,21,31,33 y 35
17ºC/ 5,0
0,4,7,11,12,18 y 21
base + 0,3%timol
Queso untable
S.Enteritidis
25ºC/ 5,0
0,3,4,10,12,14 y 17
17 ºC/ 5,0
0,2,7,9,13,14,15 y 20
base + 0,3%timol
3. 6 Obtención de curvas de crecimiento o supervivencia. Modelado matemático
En los casos en donde experimentalmente se observó crecimiento bacteriano
se graficó Log N en función del tiempo y en donde se observó muerte bacteriana se
graficó Tiempo en función de declinación logarítmica (Log decline) con el objeto de
obtener una mejor comparación con la información brindada por el programa
predictivo de modelado terciario Pathogen
Modeling Program (Agricultural
Research Service, USDA; 2010).
3. 6. 1 Modelado primario
Se describe a continuación los modelos primarios utilizados en esta tesis.
3.6.1.1 Modelo para caracterizar curvas de crecimiento
La ecuación de Gompertz y su forma modificada fue usada primariamente en
el modelado de curvas asimétricas sigmoideas de crecimiento microbiano (Mc
Meekin y col. 1993). La ecuación de Gompertz (Zwietering y col., 1990; Gibson y
col. , 1987; Gibson y col., 1994) para describir crecimiento bacteriano se describe
como:
Log N = A + C exp (-exp ( - B (t – M )))
eq (1)
donde:
51
Log N: Log. decimal del recuento bacteriano a tiempo t
Los parámetros matemáticos estimados (A, B, C y M ) representan las
diferentes regiones de la curva pero no tienen un significado biológico (Figura 14).
Con el propósito de un mejor entendimiento y caracterización de la curva de
crecimiento, dichos parámetros pueden manipularse con el propósito de recalcular a
partir de ellos los parámetros biológicos tiempo de generación (TG): tiempo en que
se duplica la
Log N (UFC/g)
Figura 14. Parámetros matemáticos de la ecuación de Gompertz
Tiempo (día)
población; velocidad de crecimiento exponencial (VCE):velocidad en el punto de
inflexión de la curva y tiempo de fase lag (LAG): tiempo a partir del cual comienza
el crecimiento, según:
TG (día ) =
Log10 (2 ) ⋅ exp(1)
BC
VCE((Log10 UFC / g ) / día ) =
LAG(día ) = M −
1
B
eq(2 )
BC
exp(1)
eq(3)
eq(4)
52
Los valores de los parámetros se pueden determinar por el ajuste de la función de
Gompertz a los datos experimentales por un procedimiento de estimación iterativa
que determine el mejor ajuste de acuerdo al criterio de los cuadrados mínimos.
3.6.1.2. Modelo para caracterizar curvas de supervivencia
La ecuación de Gompertz modificada para describir supervivencia o
inactivación bacteriana se describe como:
Log [Nt/N0] = C exp (-exp(A + Bt)) – C exp ( -exp(A))
eq (5)
donde
Log [Nt/N0]: fracción logarítmica de supervivencia
Los parámetros estimados (A, B y C) representan las diferentes regiones de
la curva de supervivencia ó inactivación (Figura 15). A: hombro de la curva de
muerte (día); B: velocidad máxima de muerte (1/día) y C: cambio total en el número
de sobrevivientes (-).
Figura 15. Parámetros de la ecuación de Gompertz modificada para muerte
53
3.6.2 Modelo terciario
El progreso logrado en el modelado microbiano ha sido importante y los
modelos presentados han logrado ser una herramienta de mucho valor para evaluar y
diseñar diferentes procesos en la industria alimentaria. Sin embargo no es posible aún
contar únicamente con estos modelos para determinar la seguridad de los alimentos y
sistemas. Las validaciones en
laboratorio son aún necesarias para determinar
inequívocamente el crecimiento posible de microorganismos patógenos o su
supervivencia en los alimentos.
El Programa de modelado de patógenos ó su sinónimo en el habla inglesa,
Pathogen Modeling Program (PMP) fue desarrollado por los científicos Whiting y
Buchanan del Departamento de Agricultura de USDA. El mismo es de acceso
gratuito y ofrece una serie de menúes (Figuras 16 y 17) para la entrada del
microorganismo cuya conducta se desea evaluar; la selección de la atmósfera
(aeróbica ó anaeróbica); la población bacteriana inicial; pH; el nivel de cloruro de
sodio; la temperatura y la concentración de nitrito. Luego se puede elegir si se
quieren obtener los parámetros cinéticos, el tiempo estimado para alcanzar una dada
población ó un gráfico mostrando la curva. Las variables pueden ser modificadas
fácilmente permitiendo al usuario estimar que sucedería si las condiciones variaran.
Este
modelos de
programa
provee un formato amigable que permite disponer de
respuestas para Salmonella, S.aureus, L.monocytogenes, S.flexneri,
B.cereus, A.hydrophila y E.coli O157:H7 (Buchanan, 1993).
El Servicio de Inspección y Seguridad Alimentaria de USDA ha utilizado
este modelo para asesorar sobre el crecimiento de microorganismos patógenos en
formulaciones de alimentos a base de carne. Los modelos, sin embargo, no
reemplazan completamente el test microbiológico experimental. Ellos permiten
realizar asesoramiento en cuanto a respuestas microbiológicas esperadas, objetivas y
más eficientes en cuanto a costos posibles.
54
Figura 16: Ejemplo de curva de crecimiento bacteriano
Figura 17: Ejemplo de curva de supervivencia bacteriana
55
3. 7 Análisis estadístico
Los ajustes del modelo de Gompertz y del modelo de Gompertz modificado
para muerte a los datos experimentales se validaron internamente mediante el
análisis de varianza y la aplicación de los siguientes tests (ver Apéndice ).
•
Test F de significación de la regresión
•
Cálculo del coeficiente de determinación corregido por grados de libertad
del sistema ( R2 aj.)
•
Análisis de residuales
Todas las regresiones no lineales se analizaron utilizando el software
Statgraphics plus para Windows, versión 5.1 (Statistical Graphics corp., USA)
56
4. RESULTADOS
57
4.1 Estudios de microbiología predictiva en queso untable. Efecto de la
temperatura de almacenamiento
En el presente estudio se evaluó mediante modelado primario la respuesta de
S.aureus en función del tiempo a 2 temperaturas 5 y 15°C, tal como se detalla en
Materiales y Métodos, sección 3.5.1. Una vez realizada la inoculación del queso
untable se almacenó a temperatura de refrigeración (5°C ) y temperatura de abuso
térmico (15°C ) durante 20 días. Cabe aclarar que en este primer estudio no se
evaluó la utilización del programa terciario de modelado de patógenos, PMP dado
que la matriz contenía sorbato de potasio, hecho que no es contemplado por dicho
programa. La Figura 1b muestra los resultados obtenidos. Adicionalmente, con el
propósito de disponer de un control se obtuvieron las curvas de respuesta de S.aureus
en caldo nutritivo (BHI) (Figura 1a).
El desarrollo de S. aureus en caldo BHI a 5°C y 15 °C durante 15 días de
almacenamiento (Figura 1a) resultó predecible dado que dichas temperaturas no son
óptimas para el desarrollo de este microorganismo.
Pudo observarse que la
población se mantuvo aproximadamente constante a 5°C durante el almacenamiento,
con leve crecimiento a 15°C durante los primeros días para luego mantenerse
constante.
La población de S.aureus en queso untable (valor inicial ~ 1 x 10
7
UFC/g)
decreció conforme aumentó el tiempo de almacenamiento a las dos temperaturas
ensayadas (Figura 1b). En el caso de almacenamiento del producto a temperatura de
refrigeración (5°C), la inactivación alcanzó 2,0 ciclos logarítmicos en 19 días. En el
caso de almacenamiento del producto inoculado a temperatura de abuso térmico
(15°C), la inactivación fue menos pronunciada, alcanzando solo 1,5 ciclos
logarítmicos en aproximadamente 19 días.
Las curvas de supervivencia fueron modeladas con la versión modificada de
la ecuación de Gompertz para muerte microbiana (Linton y col., 1995) donde los
parámetros obtenidos A, B y C representan las diferentes partes de la curva: hombro
de la curva de muerte ( A), máxima velocidad de muerte (B) y cambio total en el
número de sobrevivientes (C) (Materiales y Método, sección 3.6.1.2).
58
Figura 1: Efecto de la temperatura de almacenamiento : 5°C (-■- ) y 15°C ( -■- ) en
el desarrollo de S.aureus inoculado en caldo BHI (a) y en queso untable (b); (I)
desvío estándar.
a
b
59
Este modelo se ha venido aplicando con éxito para caracterizar el
comportamiento de una variada gama de microorganismos y alimentos. Bhaduri y
col. (1991) fueron los primeros en demostrar que la curva descripta por la ecuación
de Gompertz modificada podía describir el comportamiento no lineal de curvas de
supervivencia
en
el
caso
de
L.monocytogenes
en
pasta
de
salchichas.
Posteriormente, Linton y col. (1995) utilizaron exitosamente esta ecuación para
describir el comportamiento no lineal de L.monocytogenes y encontraron que esta
ecuación era efectiva para modelar curvas de supervivencia lineales y curvas de
supervivencia con región de hombro y cola.
Char (2006) estudió la respuesta de L.innocua en jugo de naranja combinando
tratamientos térmicos a diferentes temperaturas (57 a 61ºC) y adicionando diferentes
niveles de vainillina (0 a 1100 ppm). La ecuación de Gompertz modificada explicaba
más del 98% de las variaciones observadas .En general altas concentraciones de
vainillina combinada con tratamientos térmicos se traducían en curvas cercanas a la
linealidad con pequeños o ausentes hombros (con consecuentes bajos valores del
parámetro A) y altas tasa de muerte caracterizadas a través del parámetro B. Un
descenso en el parámetro B refleja una disminución en la resistencia microbiana.
Chhabra y col. (2002) obtuvieron similares respuestas cuando estudiaron la
respuesta de L.monocytogenes en cuanto a resistencia térmica (50, 60 y 65ºC) en
diferentes condiciones de pH y niveles de grasa en leche. Ellos también encontraron
que este modelo era muy versátil describiendo diferentes tipos de curvas de
inactivación (curvas cercanas a la linealidad, curvas con región de hombro y curvas
sigmoideas) con altos niveles de correlación.
Como puede observarse en la Figura 2, en el caso de S.aureus inoculado en
queso untable almacenado a 5ºC,
el modelo ajustó correctamente con valores
predichos muy cercanos a los obtenidos experimentalmente. El análisis de la
varianza (Tabla 1) arrojó un coeficiente de determinación ajustado por grados de
libertad elevado, con lo cual se evidencia que el modelo pudo explicar un 73% de las
variaciones observadas en las repuesta con un valor del estadístico F significativo (α
< 0,05%). El análisis de valores observados vs. valores predichos mostró una
distribución homogénea alrededor
60
Figura 2: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable almacenado a 5ºC, () valores experimentales; (—)
predicción .
0
LogN/N0
-0,4
-0,8
-1,2
-1,6
-2
-2,4
0
4
8
12
16
20
24
Tiempo (día)
Tabla 1: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
almacenado a 5 ºC.
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
1,21
0,08
B
-0,35
0,03
C
-8,6
8,1
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
Fuente
SS
gl
MODELO
10,12
3
RESIDUAL
0,005
2
R2 ajustado
FISHER
1348*
99,70
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
de la diagonal mientras que la distribución de los residuales no mostró anomalías de
conos o herraduras (Apéndice)(Figura 3a y b).
61
Este modelo predijo un hombro inicial (A) de ~ 1 día; una velocidad de
muerte (B ) de 0,35 día-1 y un cambio global en el número de sobrevivientes que
cuadriplica al observado (C= 8,6), hecho que probablemente se deba a la ausencia de
una cola marcada en la curva de muerte (Alzamora y col,2010).
Ferrante y col. (2007) utilizó el modelo de Gompertz modificado para
modelar supervivencia de L.monocytogenes en jugo de naranja fresco (pH 3.5)
ultrasonicado (600 W,2 0 KHz, 95.2 µm de amplitud de onda; 45ºC). Este modelo
representó exitosamente las curvas de supervivencia de L.monocytogenes que
resultaron
completamente
sigmoideas
y
semi-sigmoideas
dependiendo
del
tratamiento. Estos autores también describieron la sobreestimación del parámetro C
para las condiciones más severas en donde combinaban 1000
y 1500 ppm de
vainillina mas tratamiento con ultrasonido dado que la población microbiana
disminuía muy rápidamente describiendo una curva sin cola.
Figura 3 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus
en queso untable almacenado a 5ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b)
0
(b)
(a)
0,06
-0,4
residuales
valores observados
Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—) predicción.
-0,8
-1,2
-1,6
-2
0,04
0,02
0
-0,02
-0,04
-2,4
-2,4
-2
-1,6
-1,2
-0,8
-0,4
0
-0,06
valores predichos
-2,4
-2
-1,6
-1,2
-0,8
-0,4
0
valores predichos
Cuando este modelo se utilizó para caracterizar la curva de supervivencia de
S. aureus en queso untable almacenado a 15°C, se observó que el mismo ajustó
correctamente
con
valores
predichos
muy
cercanos
a
los
obtenidos
experimentalmente (Figura 4). El análisis de la varianza (Tabla 2) arrojó
un
coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad elevado (98,6 %) , con
lo cual se evidencia que el modelo pudo explicar un importante % de las variaciones
observadas en las repuesta con un valor del estadístico F significativo (α < 0,05%).
El análisis de valores observados vs. valores predichos mostró una
62
distribución homogénea alrededor de la diagonal mientras que la distribución de los
residuales no mostró anomalías de conos o herraduras (Figura 5 a y b). Este
modelo predijo para S. aureus inoculado en queso untable base almacenado a 15°C
un hombro inicial (A) de 4,55 días; una velocidad de muerte (B) de 0,39 día-1 y un
cambio global (C) de 1,55 ciclos, el cual es muy cercano al valor observado
experimentalmente.
Figura 4 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable almacenado a 15ºC, () valores experimentales; (—)
predicción.
0
LogN/N0
-0,3
-0,6
-0,9
-1,2
-1,5
-1,8
0
4
8
12
16
20
Tiempo (día)
63
Tabla 2 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
almacenado a 15 ºC.
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
4,55
0,17
B
-0,39
0,04
C
-1,65
2,97
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
Fuente
SS
FISHER
gl
MODELO
6,49
3
RESIDUAL
0,03
6
432
R2 ajustado
98,59
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
Figura 5: Validación interna del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus
en queso untable almacenado a 15 ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b)
0,16
0
(a)
-0,3
Residuales
Valores observados
Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—) predicción.
-0,6
-0,9
(b)
0,11
0,06
0,01
-0,04
-1,2
-0,09
-1,5
-1,8
-0,14
-1,8
-1,5
-1,2
-0,9
-0,6
-0,3
0
-1,8
valores predichos
-1,5
-1,2
-0,9
-0,6
-0,3
0
Valores predichos
4.2 Estudio en queso untable base
Con el propósito de estudiar si la presencia de sorbato de potasio en el queso
untable afectaba el crecimiento de S. aureus,
se trabajó con la misma matriz
alimentaria pero sin la presencia de este aditivo. La experiencia se realizó tal como se
64
detalla en Materiales y Métodos, sección 3.5.2. Para ello se trabajó con la misma
cepa de S.aureus y una vez inoculado el queso untable base (sin agregado de 1000
ppm de sorbato de potasio) se procedió a incubarlo a 15ºC.
En este caso se observó un leve
decaimiento de la población (1 ciclo
logarítmico en ~ 18 días). Este comportamiento fue similar al observado en queso
untable con la presencia de sorbato de potasio a igual temperatura de
almacenamiento (Figura 6).
Estos datos experimentales podrían estar indicando la falta de relación entre
el comportamiento observado de S. aureus en el queso untable y la presencia del
sorbato de potasio ya que en ausencia del mismo el perfil de supervivencia de la
población se mantuvo.
Figura 6: Comportamiento de S.aureus a 15ºC en queso untable sin (base, -▲-) y
con agregado de 1000 ppm de sorbato de potasio (-■-); (I) desvío estándar.
Con el propósito de caracterizar dichas curvas y de realizar una comparación
más cuantitativa, se aplicó el modelo de Gompertz modificado a las curvas de
inactivación de S. aureus en queso untable base (sin agregado de sorbato de potasio)
almacenado a 15°C, obteniendo los parámetros característicos del mismo, según la
metodología descripta en Materiales y Métodos, sección 3.6.1.2. La Figura 7
presenta las curvas de supervivencia predichas por el modelo, junto a los respectivos
datos experimentales. La Tabla 3 exhibe los parámetros estimados que representan
65
las diferentes regiones de la curva de supervivencia: el hombro inicial (A~ 5,9 días),
la máxima velocidad de muerte (B~ 0,5 día-1) y el cambio global en el número de
sobrevivientes (C~ 1,4 ciclos), junto a los estadísticos de ajuste del modelo. Se
obtuvo un R2 ajustado por grados de libertad 99%. El valor de F muy significativo
(α<0,01), demostró que el modelo fue apropiado para describir el comportamiento
observado. La validación interna determinó concordancia entre los valores
observados y predichos y una adecuada distribución de residuales (Figura 8 a y b).
Figura 7
: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación
de S.aureus en queso untable base almacenado a 15ºC, () valores experimentales;
(—) predicción .
0,1
Log N/N0
-0,1
-0,3
-0,5
-0,7
-0,9
-1,1
0
3
6
9
12
15
18
Tiempo (día)
Tabla 3 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base almacenado a 15 ºC.
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
5,88
1,84
B
-0,43
0,15
C
-1,35
0,22
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
Fuente
SS
gl
MODELO
1,95
3
RESIDUAL
0,006
3
R2 ajustado
FISHER
325**
99,08
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
66
Figura 8 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus
en queso untable base almacenado a 15 ºC: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—)
predicción.
0,1
(X 0,001)
55
-0,1
35
Residuales
Valores observados
(a)
-0,3
-0,5
-0,7
-0,9
-1,1
-1,1
(b)
15
-5
-25
-45
-0,9
-0,7
-0,5
-0,3
-0,1
0,1
Valores predichos
-1,1
-0,9
-0,7
-0,5
-0,3
-0,1
0,1
Valores predichos
El modelo de Gompertz modificado permitió mediante la adecuada
caracterización de las curvas de supervivencia establecer que la presencia de sorbato
de potasio no tuvo una influencia notoria en modificación de los parámetros A, B y
C que caracterizan a las curvas de supervivencia (Tablas 2 y 3).
Un estudio realizado utilizando diferentes bacterias patógenas tales como
E.coli O157:H7,Salmonella , L .monocytogenes y S. aureus (Roberts y col.,2002)
inoculadas en diferentes tipos de queso (mozzarella y cheddar) durante un período de
almacenamiento que rondó entre los 14 y los 50 días demostró que, en general, se
observó un decaimiento significativo de recuento bacteriano en el producto lácteo
(queso) con respecto al control que se puso de manifiesto a partir del día 14.
Roberts y col. (2002) describen que el sorbato (aditivo generalmente
reconocido como seguro) es uno de los más usados en la industria láctea como
preservante debido a su poder inhibitorio sobre microorganismos patógenos, no así
sobre flora fermentativa. También hace mención a situaciones en donde se observó
una ineficiente protección del mismo.
Si bien no se observaron diferencias notorias en la respuesta del
microorganismo de prueba (S. aureus) inoculado en ambas matrices, se decidió
evaluar los resultados posteriores de este trabajo utilizando como matriz, queso
untable base con el propósito de evitar introducir un agente de stress microbiano (tal
como es el uso de sorbato de potasio) y así poder estudiar la influencia de distintos
factores evaluados.
67
4.3 Efecto combinado del pH y la temperatura de almacenamiento
Con el objeto de evaluar la influencia que el pH ejerce sobre el crecimiento
de S.aureus en el queso untable base se estudió su comportamiento a pH original
del queso (5,0) y un pH más bajo (4,3) pero organolépticamente aceptable tal como
se detalla en Materiales y Métodos, sección 3.5.3. Esta experiencia se llevó a cabo a
10, 15 y 22 °C.
En la Figura 9a se puede observar que hubo un decaimiento de la población
de S. aureus en queso untable base con pH 5,0 durante el almacenamiento a 10 y
15ºC pero se observó crecimiento de la misma a 22ºC. Puede observarse que la
reducción de pH a 4,3 (Figura 9b) provoca la muerte del microorganismo a las tres
temperaturas estudiadas siendo este descenso más pronunciado conforme aumenta la
temperatura.
Los resultados obtenidos muestran que el efecto a
pH 4,3
resultó
desfavorable para el normal crecimiento de S. aureus coincidiendo con lo descripto
por Freitas
y
Malcata (2000), tanto a 10ºC ,como a 15ºC
y 22ºC, quienes
observaron que tanto en quesos semi-duros como en quesos blandos elaborados con
leche de oveja la flora microbiana contaminante compuesta por diferentes géneros
de la familia Enterobacteriaceae y el género Staphylococcus disminuía lentamente.
La única flora constitutiva que se encontraba presente era la correspondiente a
Bacterias Ácido Lácticas
(BAL) (predominantemente los géneros Lactococcus,
Lactobacillus y Leuconostoc) la cual, aumentaba
su concentración desde un
recuento inicial aproximado de 106-107 UFC/g en el día 0 hasta aproximadamente
108 UFC/g luego de 20 días de maduración. Estos autores observaron también que
las BAL aumentaron su concentración desde el día 7 al 21 aproximadamente y luego
se estabilizaron a los 35 días de almacenamiento. Por el contrario,
el género
Staphylococcus disminuía 2 ciclos logarítmicos a los 140 días.
Con un propósito predictivo y de comparación con los resultados
experimentales, se utilizó el programa
de modelado de patógenos Pathogen
Modeling Program (PMP), tal como se describe en Materiales y Métodos, sección
3.6.2. En el queso untable base (pH 5,0) y almacenado a 10ºC se observó una
disminución de aproximadamente 4,5 ciclos logarítmicos en 40 días (Figura 9a).
Esta situación se contradice con lo predicho por el programa PMP, el cual
68
Figura 9
: Comportamiento de S. aureus en el queso untable base almacenado a
10ºC (-♦- ), 15ºC ( -■- ) y 22ºC ( -▲-). (a) pH 5,0; (b) pH 4,3; (I): desvío estándar.
a
b
69
establece crecimiento de S. aureus (en un caldo de cultivo) con una fase de latencia
de 10 días, aumento exponencial de la población hasta el día 35 y fase estacionaria a
partir de allí (Figura 10a).
En queso untable base almacenado a 15ºC, la respuesta de S.aureus fue
nuevamente de muerte a lo largo del tiempo de almacenamiento pero con una
reducción de 1 ciclo logarítmico en 22 días contradiciéndose nuevamente con lo
predicho por el programa PMP (Figura 10 b).
La Figura 10c muestra la curva de crecimiento de S. aureus en queso untable
base (pH 5,0) a 22ºC junto a los datos predichos mediante la aplicación del
programa predictivo PMP. En la misma se observa que el comportamiento de S.
aureus a 22°C, predicho por el programa PMP determina que la fase de crecimiento
exponencial comienza inmediatamente (sin período de fase lag) y termina en el día 5,
mientras que experimentalmente se observó que el crecimiento exponencial
comienza a partir del día 12 (tiempo de fase lag) y termina aproximadamente el día
28. Es decir que, si bien hay coincidencia en los valores observados y predichos para
este microorganismo en las condiciones estudiadas, se produce un corrimiento en el
tiempo ya que el comportamiento en la matriz alimentaria presenta un período de
adaptación inicial que retrasa el crecimiento exponencial.
Si bien este software predictivo es de muchísima utilidad en sistemas simples
(como los sistemas modelo y medios de cultivo), en alimentos reales podría fallar
dado que
los factores intrínsecos propios del alimento así como también las
interacciones que pudieran derivar entre ellos y los microorganismos (se trate de
sinergismos o antagonismos) alteran la respuesta observada y la alejan de la
predicción. En todo modelo predicho el comportamiento bacteriano está descripto
para un medio de cultivo con los nutrientes óptimos para permitir, si fuera factible, el
crecimiento bacteriano. Esta es posiblemente la causa por la que no se observó
concordancia con la predicción (Whiting, 1997).
70
Figura 10 : Comportamiento de S.aureus en el queso untable base a pH 5,0 y
diferentes temperaturas de almacenamiento. (a): 10º C, (b): 15ºC y (c): 22ºC . ( ▬ )
predicción , ( --- ) limite de confianza superior predicho, ( --- ) limite de confianza
inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales; (I) desvío estándar.
a
b
c
71
Los modelos matemáticos usualmente se realizan con una mezcla de 3 a 5
cepas “típicas” (Whiting, 1997). De esta forma estos modelos predichos se traducen
muchas veces en rápido crecimiento o por decirlo de otra forma en cepas de fácil
desarrollo. Este mecanismo tiene la ventaja de que el modelo se convierta en un
sistema “seguro”. Pero existe una diversidad natural en los tiempos de crecimiento o
supervivencia de cepas de microorganismos patógenos. La otra fuente de variación
no incluída en los modelos existentes es el estado fisiológico de la cepa y su historia
previa. Hudson (1993) ha demostrado que la duración de la fase lag de Aeromonas
hydrofila depende de la temperatura a la cual la cepa estaba sometida o mantenida en
su estadío previo y de la nueva temperatura en la cual la cepa se encuentra en el
alimento que ha contaminado. En cambio la fase de crecimiento exponencial
posterior a la finalización de la fase lag no es afectada por la temperatura previa. Un
patógeno en un determinado alimento adaptado a temperatura de refrigeración en una
planta de procesamiento a 10ºC presentará una fase lag más corta y un comienzo más
temprano del crecimiento exponencial ,si accidentalmente contamina ese mismo
alimento refrigerado, que la que debería observarse en un modelo corriente. Baranyi
y Roberts (1994) consideraron que la fase lag es una consecuencia de dos procesos,
el primero reflejado por el estado previo en el que se encontraba la bacteria (por
ejemplo temperatura) y el segundo dependiente del grado de ajuste de un ambiente
(fisiológica y bioquímicamente) al siguiente ambiente o medio intrínseco.
Con el propósito de determinar estadísticamente la influencia de la variable
temperatura se realizó un análisis cuantitativo. Dado que a pH 5,0 se observó
decaimiento de la población durante el almacenamiento a 10 y
15 °C se
caracterizaron dichas curvas mediante la utilización del modelo primario antes
descripto: Gompertz modificado.
En el caso en donde se trabajó con queso untable base (pH 5,0) inoculado y
almacenado a una temperatura de almacenamiento de 10ºC se observó que el modelo
ajustó adecuadamente a los datos experimentales (Figura 11) con un coeficiente de
determinación R2 de 99%. La Tabla 4 muestra los parámetros A, B y C que
caracterizan a la curva así como también la significación del modelo (F = 927 muy
significativo, α<0,01). La validación interna (Figura 12a y b) del modelo propuesto
mostró concordancia entre los datos experimentales y predichos así como también
72
una distribución homogénea de los residuales. Como puede analizarse el modelo
predijo la ausencia de hombro inicial (A= - 0,16 días); una velocidad de muerte de
0,05 día-1 y un cambio global (C) de 9,4 ciclos. Al parecer este modelo falló en la
predicción de la caída total observada y esto pudiera deberse a la ausencia de una
cola marcada en los datos experimentales, hecho que ya ha sido comentado.
Figura 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0)
almacenado a 10ºC,
() valores
experimentales; (—) predicción .
Log N/N0
0,6
-0,4
-1,4
-2,4
-3,4
-4,4
0
10
20
30
40
Tiempo (día)
Tabla 4: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base almacenado a 10 ºC.
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
-0,16
1,17
B
-0,05
0,03
C
-9,38
8,64
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
Fuente
SS
gl
MODELO
55,61
3
RESIDUAL
0,12
5
R2 ajustado
FISHER
927**
99,01
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
73
Figura 12 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación de
S.aureus en queso untable base almacenado a 10 ºC: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales;
(b)
(a)
0,6
0,32
0,22
-0,4
Residuales
Valores observados
(—) predicción.
0,12
-1,4
0,02
-2,4
-0,08
-3,4
-0,18
-4,4
-4,4
-0,28
-3,4
-2,4
-1,4
-0,4
0,6
-4,4
Valores predichos
-3,4
-2,4
-1,4
-0,4
0,6
Valores predichos
El análisis correspondiente a queso untable base (pH 5,0) inoculado y
almacenado a 15ºC fue efectuado en el ítem anterior (sección 4.2, Tabla 3) en donde
se obtuvo en comparación con la temperatura anterior evaluada, 10 °C, un hombro
inicial mayor (A= 5,9 días), una velocidad de muerte similar (B = - 0,43 d-1) y un
cambio global en el numero de sobrevivientes significativamente menor (C = 1,4),
hecho que está de acuerdo con el establecimiento de una temperatura más propicia
para el desarrollo del microorganismo.
A 22°C se observó crecimiento de S. aureus en queso untable base (pH 5,0).
Dado que el comportamiento observado no fue lineal, se caracterizó la curva
mediante el modelo de Gompertz (Figura 13), obteniendo los parámetros
matemáticos característicos del mismo: A, B, C y M.
Tal como se describió en Materiales y Métodos, sección 3.6.1.1 con los
valores matemáticos de los parámetros correspondientes a la curva se obtuvieron los
parámetros biológicos tiempo de generación (TG); velocidad de crecimiento
exponencial (VCE) y tiempo de fase lag (LAG). La Figura 13 muestra una adecuada
correlación entre los datos experimentales y los predichos por este modelo primario.
74
Figura 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22ºC,
() valores
experimentales; (—) predicción
9,1
Log N
8,1
7,1
6,1
5,1
4,1
0
10
20
30
40
Tiempo (dia)
La Tabla 5 resume el análisis de la varianza para el modelo propuesto. El
valor de F para la regresión completa resultó muy significativo (α< 0,01) indicando
que existe una relación estadísticamente significativa entre la respuesta observada y
el modelo. El valor del coeficiente de determinación (R2) ajustado por grados de
libertad indica que casi el 95,8 % de la variación de la respuesta ha sido explicada
por el modelo propuesto. La Tabla 5 también presenta a los fines comparativos los
valores de TG; VCE y LAG predichos por el programa terciario PMP para el
microorganismo y condiciones estudiadas.
Se realizó también validación interna del modelo mediante métodos gráficos,
los cuales se presentan en la Figura 14. El gráfico de valores observados versus los
valores predichos (Figura 14 a) presenta una distribución homogénea alrededor de
la diagonal, con puntos muy cercanos a la misma, indicando alta correlación entre los
mismos. Cuando se graficaron los residuales en función de los valores predichos
(Figura 14b) se observó una distribución homogénea de los mismos en una banda
horizontal alrededor de la predicción sin detectar conos o herraduras. Por todo lo
expuesto, se concluyó que no existe razón para dudar que el modelo propuesto sea
adecuado para describir la respuesta observada.
75
Figura 14 : Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22 ºC: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos . () valores
experimentales; (—) predicción
(b)
0,4
(a)
Residuales
Valores observados
0,6
9,1
8,1
7,1
6,1
0,2
0
-0,2
-0,4
5,1
-0,6
4,1
4,5
5,5
6,5
7,5
8,5
4,1
9,5
5,1
6,1
7,1
8,1
9,1
Valores predichos
Valores predichos
Tabla 5: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 22 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
4,54
0,18
B
0,14
0,05
C
4,43
0,73
M
18,60
1,70
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
gl
MODELO
510,35
4
RESIDUAL
1,02
8
R2 ajustado
95,85
FISHER3
981**
PARAMETROS BIOLÓGICOS2
Gompertz
PMP
TG (día)
1,17
0,10
VCE (Log UFC/g/día)
0,26
1,35
LAG (día)
18
0,67
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generación; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%.
1
76
El análisis de la
Tabla 5
determina que comparando los parámetros
biológicos característicos de la curva de crecimiento de S. aureus en queso base (pH
5,0; 22 °C) adecuadamente estimados por el modelo de Gompertz con la estimación
del programa PMP puede verse que, este programa predice escaso tiempo de latencia
(0,7 días vs. 18 días); triplica la velocidad de crecimiento exponencial respecto de la
observada (1,4 Log UFC/g/día vs 0,3 Log UFC/g/día) y disminuye notoriamente el
tiempo de generación respecto del observado (0,1 día vs 1,2 días). Si bien la
temperatura favorece el crecimiento del microorganismo el alimento real no ofrece
en este caso condiciones tan favorables como el medio de cultivo probablemente
debido a la presencia de flora competitiva y/o posibles inhibidores.
El análisis del comportamiento predicho por el programa PMP para la
supervivencia de S. aureus en queso untable base con pH reducido (4,3) a 10, 15 y 22
°C se exhibe en la Figura 15 junto a los datos experimentales observados.
Se observa que a 10ºC los datos experimentales siguen un comportamiento
similar que el predicho por el programa PMP considerando los límites de confianza
superior e inferior (Figura 15a). Hasta el día 20, la caída en ciclos logarítmicos en
función del tiempo es perfectamente coincidente con el modelo. A partir de allí y
hasta el día 40 se observa que experimentalmente el decrecimiento de la población se
detiene registrándose una mayor pendiente lo que significa que
la muerte del
microorganismo se desacelera. Aún así el comportamiento bacteriano experimental
entra dentro del rango predicho por el modelo. Para el tiempo de almacenamiento
evaluado (~ 40 días) el programa PMP predice, en promedio, una declinación de 4
ciclos logarítmicos.
A 15ºC (Figura 15 b) se observa que el programa PMP no predice
decaimiento hasta el día 10 (1 ciclo logarítmico). Los datos experimentales
demostraron que hubo un decaimiento de 3 ciclos logarítmicos en 14 días mientras
que el programa PMP predice un decaimiento igual en 29 días. Esta tendencia se
mantuvo conforme fue transcurriendo el tiempo de almacenamiento.
Algo similar se observó a 22ºC (Figura 15 c) en donde los datos
experimentales demostraron una caída de 4 ciclos logarítmicos en 18 días mientras
que el programa PMP predice la misma caída en 30 días.
77
Figura 15: Comportamiento de S.aureus a pH 4,3 y 10º C(a), 15ºC (b) y 22ºC (c):
(▬) predicción , ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- ) límite de
confianza inferior predicho ,(-♦- ) datos experimentales.
a
b
c
78
Si bien en las experiencias de reto microbiano realizadas en queso untable
base con pH reducido (pH 4,3) se dispuso de escasos puntos experimentales se
realizó un modelado primario solo con el fin de orientar sobre los parámetros
característicos de las curvas obtenidas a 10, 15 y 22 °C y comparar con la predicción
del programa PMP.
A 10ºC se observó que el modelo de Gompertz modificado para
supervivencia
ajustó adecuadamente los datos experimentales (Figura 16). El
análisis de la varianza (Tabla 6) estimó un valor de coeficiente de determinación R2
de 99,99% con un valor de F muy significativo (F = 8,4x108; α<0,001). El modelo
fue validado internamente observando una distribución homogénea en torno a la
línea diagonal de valores experimentales vs. valores predichos y desestimando
anomalías en la distribución de residuales (Figura 17 a y b). En estas condiciones, el
modelo estimó un hombro inicial de 3 días (A); una velocidad de muerte (B) de 0,17
día-1 y un cambio global en el número de sobrevivientes al final del almacenamiento
de 3,6 ciclos logarítmicos (C), siendo este valor algo inferior a la caída predicha por
el PMP (~ 4 ciclos logarítmicos, Figura 15a).
Figura 16 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación
de S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a 10ºC,
() valores
experimentales; (—) predicción .
Log N/N0
0,5
-0,5
-1,5
-2,5
-3,5
0
10
20
30
40
Tiempo (día)
79
Tabla 6: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
2,91
1,0x104
B
-0,17
0,9x103
C
-3,56
0,5x104
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
Fuente
SS
gl
MODELO
25,25
3
RESIDUAL
1,0x10-8
1
FISHER
8,4x108**
R2 ajustado
99,99
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -)
1
Figura 17: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto para el
crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 ºC: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ()
-0,5
-1,5
-2,5
-3,5
-3,5
(b)
(X 0,00001)
8
(a)
0,5
Residuales
Valores observados
valores experimentales; (—) predicción
4
0
-4
-8
-2,5
-1,5
-0,5
Valores predichos
0,5
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
Valores predichos
A 15ºC el modelo primario de Gompertz modificado ajustó adecuadamente
con un valor de R2 de 94% con un F muy significativo (Figura 18 y Tabla 7) .Esto
indicaría que el modelo explica el 94% de las diferencias encontradas.
80
Figura 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable base
(pH 4.3) almacenado a 15ºC,
() valores
experimentales; (—) predicción .
0
Log N/N0
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0
3
6
9
12
15
Tiempo (día)
El análisis de validación interna (Figura 19 a y b), mostró una distribución
homogénea de los datos experimentales alrededor de los datos predichos y una
distribución sin alteraciones de los residuales en torno a una banda horizontal.
Este modelo predijo un hombro inicial (A) cercano a los 2 días mientras que
en la práctica éste resulto de aproximadamente 3 días. El parámetro C en ambos
casos rondó los 3 ciclos logarítmicos en 15 días de almacenamiento y no se observó
cola ya que la predicción es que la caída en ciclos logarítmicos continúa conforme
transcurre el tiempo.
81
Tabla 7: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
1,60
0,90
B
-0,20
0,17
C
-3,89
2,14
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
Fuente
SS
gl
MODELO
14,76
3
RESIDUAL
0,20
2
R2 ajustado
FISHER
49**
94,12
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
Figura 19: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 ºC: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales;
0
(b)
0,34
(a)
-0,5
Residuales
Valores observados
(—) predicción.
-1
-1,5
-2
0,24
0,14
0,04
-0,06
-2,5
-0,16
-3
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
Valores predichos
0
-0,26
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
Valores predichos
El análisis de la aplicación del modelo de Gompertz modificado a la curva de
supervivencia de S. aureus en queso untable base con pH reducido (pH 4,3) y 22°C
mostró que el mismo ajustó adecuadamente a los datos experimentales (Figura 20 y
Tabla 8). El modelo representó en un 99,9 % la variación en la respuesta observada
con la obtención del estadístico F muy significativo (α<0,01). La validación interna
82
realizada no mostró anomalías (Figuras 21 y 22). El modelo no predijo, tal como se
observó experimentalmente, un hombro inicial (A); predijo una velocidad de muerte
de 0,3 día-1 y un cambio global en el número de sobrevivientes (C) en 18 días de
almacenamiento muy superior al observado experimentalmente (9 vs 4). Ya se ha
comentado la debilidad de este modelo para predecir un salto en el número de
sobrevivientes cuando la curva de supervivencia carece de cola marcada. Otros
autores han observado igual
desenvolvimiento del modelo en otros sistemas
alimenticios estudiados.
Figura
20 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación
de S.aureus en queso untable base ( pH 4.3) almacenado a 22ºC,
() valores
experimentales; (—) predicción .
Log (N/N0)
0
-1
-2
-3
-4
0
4
8
12
16
20
Tiempo (día)
83
Tabla 8: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
-0,49
0,25
B
-0,27
0,01
C
-8,80
1,62
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
Fuente
SS
gl
MODELO
26,95
3
RESIDUAL
0,0004
1
FISHER
22458**
R2 ajustado
99,98%
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
Figura 21: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 ºC: Valores observados vs valores
Valores observados
predichos;
0
-1
-2
-3
-4
-4
-3
-2
-1
0
Valores predichos
84
Figura 22: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 ºC:Residuales vs. valores predichos
. () valores experimentales; (—) predicción
Residuales
(X 0,001)
23
13
3
-7
-17
-4
-3
-2
-1
0
Valores predichos
Ferrante y col. (2007) observaron que el valor del parámetro C estaba
sobreestimado para las condiciones más severas de su experiencia en jugo de naranja
tratado con ultrasonido y crecientes concentraciones de vainillina a modo de inhibir
el crecimiento de L.monocytogenes.
Linton y col. (1995) evaluaron la resistencia térmica de L.monocytogenes en
fórmulas de alimentos infantiles tratadas a 50, 55 y 60ºC, pH cuyos valores
ascendían de 5 a 7 y a concentraciones crecientes de NaCl (0,2 a 4 %).Estos autores
observaron que conforme al aumento de temperatura se producía aceleración de la
muerte bacteriana describiendo curvas con escasa o nula región de hombro y cola. El
modelo sobreestimó el parámetro C.
85
4.4 Estudio de reto microbiano en queso untable base utilizando cepas
responsables de ETA.
4.4.1 S.aureus
Una vez evaluado el comportamiento de S.aureus en queso untable base
frente a las diferentes variables estudiadas (temperatura, presencia de conservante y
pH) se procedió a
bacterias
estudiar de manera análoga
el comportamiento de cuatro
distribuidas en el medio ambiente, fuertemente relacionadas con
enfermedades transmitidas por alimentos y frecuentemente encontradas en productos
lácteos: S.aureus, E.coli, S. Enteritidis y L.monocytogenes (Araujo y col., 2002). La
experiencia se llevó a cabo tal como se describe en Materiales y Métodos, sección
3.5.4, en primer lugar, inoculando S.aureus en queso untable base y almacenando
dicho producto a 6, 17 y 25°C para su posterior análisis.
Se observó un decrecimiento no lineal de la población de S. aureus a 6ºC y
17ºC (Figura 23). A 25ºC, el comportamiento del mismo fue de neto crecimiento
describiendo una curva algo sigmoidea. Todos estos datos resultaron coincidentes
con los ensayos anteriormente descriptos a temperaturas similares (10°C; 15ºC y
22ºC) (Figura 9a ).
La Figura 24a muestra la predicción por modelado terciario (programa PMP)
del comportamiento de este microorganismo en un medio de cultivo pH 5,0
almacenado a 6°C,
junto a los datos experimentales. El programa predice, en
coincidencia con lo observado, un decrecimiento de la población. La muerte de este
microorganismo en el queso untable base fue más rápida que la predicción promedio
en un medio de cultivo a un dado tiempo de almacenamiento, más cercana al límite
inferior predicho.
De la misma manera la Figura 24b muestra que en queso untable base
almacenado a 17ºC y pH 5.0, mientras experimentalmente se observó muerte de este
microorganismo, el programa de modelado de patógenos, PMP predice el
crecimiento del mismo.
Las bacterias ácido-lácticas presentes en quesos son
generalmente inhibitorias del crecimiento de S.aureus (Jorgensen y col., 2005). El
pH y la presencia de flora láctica competitiva son factores importantes que
probablemente afecten la presencia del patógeno ensayado (Ercolini y col., 2005).
86
Figura 23: Evaluación del comportamiento de S.aureus en queso untable base, pH
5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ), 17ºC ( -■- ) y 25ºC ( ▲-);
(I) desvío estándar.
La eficacia de los organismos competidores para controlar el crecimiento
depende de la proporción del competidor con respecto a las células de
microorganismo en cuestión (en este caso, S.aureus), del tipo de competidor, de la
temperatura y del sustrato de crecimiento. El efecto de los competidores en la
inhibición del crecimiento de S.aureus es muy variable, dependiendo del organismo
y de la cepa. Las interacciones de los factores extrínsecos e intrínsecos sobre el
crecimiento, sobre la supervivencia y sobre la muerte de S.aureus limitan el
crecimiento a temperaturas sub-óptimas y retardan el crecimiento a temperaturas
óptimas (ICMSF, 1996)
A 25ºC, se observó que los datos experimentales describían un
comportamiento similar al predicho por el programa PMP pero con una fase de
latencia mayor, dato concordante con la necesidad de las células de S.aureus de
llegar a una situación de equilibrio o situación amigable con los factores intrínsecos
de la matriz alimentaria (Figura 24c).
87
Figura 24: Comportamiento predicho de S.aureus a pH 5,0 y 6º C (a), 17ºC (b) y
25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- ) límite
de confianza inferior predicho, (-♦-) datos experimentales.
a
b
c
88
Dado que las curvas cinéticas obtenidas exhibieron un comportamiento no
lineal, se realizó una evaluación cuantitativa de las mismas mediante la aplicación
de modelado primario (Materiales y Métodos 3.6.1). Se aplicó los modelos de
Gompertz en el caso en donde se observó crecimiento (25°C) y de Gompertz
modificado en los casos de muerte (6 °C y 17°C).
En las Figuras 25 y 27 se observa que la aplicación del modelo de Gompertz
modificado representó adecuadamente el comportamiento de S.aureus en queso
untable base
almacenado a 6ºC y 17°C, respectivamente. Las Tabla
9 y 10
exhiben los parámetros A, B y C característicos del modelo junto a los estadísticos
relacionados. Los ajustes logrados fue satisfactorios, obteniéndose valores de R2
ajustado entre 93% y 96 % con valores de F significativos (α<0.05). El análisis de
los valores observados vs valores predichos (Figuras 26a y 28a) demostró que hubo
una adecuada correlación entre los mismos. La distribución de residuales en torno a
los valores predichos (Figuras 26b y 28b) fue homogénea no detectando
esparcimiento en forma de herradura ó cono.
Figura 25: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable base almacenado a 6ºC, () valores experimentales; (—)
predicción
Log(N/N0)
0,6
-0,4
-1,4
-2,4
-3,4
0
10
20
30
40
Tiempo (día)
89
Tabla 9: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
-1,17
0,43
B
-0,06
0,006
C
-14,43
1,27
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
gl
MODELO
39,38
3
RESIDUAL
0,38
4
FISHER2
146*
R2 ajustado
93,00
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad. 2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
Figura 26: Validación del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus en
queso untable base almacenado a 6 ºC: a) Valores observados vs valores predichos;
(b)
(a)
0,6
0,51
Residuales
Valores observados
b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—) predicción
-0,4
-1,4
0,11
-0,09
-2,4
-3,4
-3,4
0,31
-0,29
-2,4
-1,4
-0,4
Valores predichos
0,6
-0,49
-3,4
-2,4
-1,4
-0,4
0,6
Valores predichos
90
Figura 27: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable base almacenado a 17ºC, () valores experimentales; (—)
predicción.
0,1
Log(N/N0)
-0,3
-0,7
-1,1
-1,5
-1,9
0
4
8
12
16
20
Tiempo (día)
Tabla 10: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base almacenado a 17 ºC.
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
-0,39
0,096
B
-0,46
0,073
C
-3,44
0,74
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
gl
MODELO
15,65
3
RESIDUAL
0,07
4
R2 ajustado
FISHER2
261**
96,00%
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
91
Figura 28 : Validación del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus en
queso untable base almacenado a 17 ºC: a) Valores observados vs valores predichos;
(a)
0,1
0,18
-0,3
0,08
-0,7
-0,02
-1,1
-0,12
-1,5
-1,9
-1,9
(b)
0,28
Residuales
Valores observados
b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—) predicción.
-1,5
-1,1
-0,7
-0,3
0,1
-0,22
-1,9
Valores predichos
-1,5
-1,1
-0,7
-0,3
0,1
Valores predichos
Nuevamente el modelo de Gompertz modificado falló en predecir la caída
global del numero de sobrevivientes a 6 °C (C=14,4 ciclos) donde la curva
experimental no presenta cola marcada con un descenso final a 34 días de
almacenamiento de ~3,4 ciclos logarítmicos. Esto no ocurrió a 17°C donde la
predicción de la caída global (C=3,4) fue más cercana a la observada
experimentalmente (~ 2 ciclos) debido a la presencia de una fracción importante de
microorganismos resistentes. Roberts (2002) observó
caídas similares de la
población de S. aureus en queso cheddar (pH 5,4) y en mozzarella (pH 5,3) sin
agregado de sorbato de potasio y almacenados a 10°C, de entre 2,4 y 4 ciclos
logarítmicos, respectivamente.
Ambas condiciones de almacenamiento provocaron que la curva de muerte de
este microorganismo no presentara hombro inicial (valores negativos de A). La
velocidad de muerte fue algo mayor a 17°C
(B = - 0,46 día-1) , hecho que
probablemente se atribuya a que a esta temperatura se observó un descenso constante
de la población durante todo el período de almacenamiento ensayado, hecho que
podría atribuirse a una mayor proliferación a esta temperatura de flora competitiva.
En el caso del comportamiento de S.aureus en queso untable base
almacenado a 25ºC se observó crecimiento. Se aplicó el modelo de Gompertz
modificado (Figura 29) obteniendo los parámetros característicos del mismo,
92
encontrándose que la aplicación de este modelo representó adecuadamente su
comportamiento.
Tal como se describió en Materiales y Métodos, sección 3.6.1.1 con los
valores matemáticos de los parámetros correspondientes a la curva se obtuvieron los
parámetros biológicos. Se determinaron por el ajuste de datos a la función de
Gompertz por un procedimiento de estimación iterativa que determinó el mejor
ajuste (Tabla 11). Al observarse una correcta representación del modelo se
asimilaron dichos parámetros biológicos como los característicos de la curva
experimental. El
elevado valor de R2 ajustado, indica que el modelo ajustó
adecuadamente a los datos experimentales, pudiendo explicar el 98,5 % de las
variaciones en la respuesta observada. Asimismo, el estadístico F resultó muy
significativo (α≤0,01) lo que confirma que las variaciones de la información
explicada por el modelo es significativamente mayor que la variación debida a
causas no identificables y que el efecto observado no se debió al azar. En el gráfico
de valores observados vs valores predichos (Figura 30a) se observa que hubo una
adecuada correlación .Los distribución de residuales (Figura 30 b) también fue
homogénea entorno a los valores predichos.
Se realizó finalmente el estudio comparativo de los datos biológicos tiempo
de generación (TG), fase de latencia (LAG) y crecimiento exponencial (VCE),
calculados a partir de los parámetros extraídos de la ecuación de Gompertz con los
valores predichos por el programa de modelado terciario, PMP.
En el caso de S.aureus inoculado en queso crema base almacenado a 25ºC, se
observa que el tiempo de generación, predicho por PMP fue 0,07 días mientras que
el predicho por el modelo primario fue 0,54 días. Ambos modelos, en concordancia,
predijeron TG inferiores a 1 día aunque, como es de esperar algo menor en el caso de
la predicción medio de cultivo donde no se considera la presencia de flora
competitiva y/o inhibidores (Tabla 11). Ambos modelos coincidieron en la
predicción de la velocidad de crecimiento. La fase de latencia predicha por el modelo
primario fue superior (5días) a la estimación del programa PMP (0,42 días). La fase
de latencia representa el tiempo de ajuste que necesita el inóculo desde la fase de preincubación en su medio de cultivo
93
Figura 29: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25ºC,
() valores
experimentales; (—) predicción
9
Log N
8
7
6
5
0
3
6
9
12
15
18
Tiempo (dia)
Tabla 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
5,11
0,12
B
1,41
0,30
C
2,79
0,18
M
6,42
3,29
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
MODELO
RESIDUAL
R2 ajustado
SS
313,63
0,09
98,46
FISHER3
gl
4
3
2613**
PARAMETROS BIOLÓGICOS2
TG (día)
VCE (Log UFC/g/día)
Gompertz
0,54
0,55
PMP
0,07
0,59
LAG (día)
5,0
0,42
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.
1
94
Figura 30: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos. () valores experimentales;
(a)
9
(b)
0,21
Residuales
Valores observados
(—) predicción
8
7
6
0,11
0,01
-0,09
-0,19
5
5,1
5,6
6,1
6,6
7,1
Valores predichos
7,6
8,1
5
6
7
8
9
Valores predichos
óptimo y la nueva fase, probablemente menos favorable, con otras condiciones
intrínsecas (pH, nutrientes, flora extra, etc) .La duración de la fase de latencia
depende de ambas situaciones : la primera situación de crecimiento en el medio de
cultivo y la nueva situación de crecimiento en el queso (Hudson,1993).
95
4.4.2 E. coli
Los datos experimentales correspondientes al desarrollo de E. coli en queso
unatble base a 6ºC; 17ºC
y a 25ºC mostraron
un comportamiento similar al
observado con S.aureus (Figura 31).
Utilizando el programa de modelado terciario PMP se observó que, en el caso
de temperatura de almacenamiento 6ºC, el mismo predice una disminución de la
población de E. coli en medio de cultivo, de forma coincidente con los datos
experimentales observados pero con un perfil muy diferente (Figura 32a). Mientras
el programa PMP predice un hombro inicial de aproximadamente 7 días, para luego
inmediatamente caer 3 ciclos logarítmicos y a partir de allí un descenso progresivo,
la curva experimental no presenta hombro y exhibe una declinación muy escasa de la
población.
A 17ºC, la población de E.coli disminuyó conforme aumentó el tiempo de
almacenamiento, resultados que no condicen con la predicción del programa PMP,
el cual, propone crecimiento para dichas condiciones y en medio de cultivo (Figura
32b). Las diferencias observadas se deben posiblemente a que se trata de una
temperatura sub-óptima y que E.coli patógena no desarrolla en los quesos
fermentados a pH <5,4 (ICMSF,1996). Ya se ha comentado que también podría
deberse a la presencia de algún componente inhibidor de crecimiento en el queso.
Montville (1997) describió que el crecimiento bacteriano está gobernado al
menos por tres factores (pH, aw y temperatura) y en muchos casos existen
interacciones entre ellos. Estos autores mencionaron también que estas interacciones
o sinergismos describen como diferentes factores extrínsecos e intrínsecos del
alimento afectan la habilidad del microorganismo de sobrevivir o iniciar su fase de
crecimiento. Ciertas investigaciones (Roberts e Ingram, 1973) observaron la
necesidad de estudiar los efectos interactivos de varios parámetros influyentes en el
crecimiento bacteriano sumado a la producción de metabolitos tóxicos. Esto podría
explicar la no coincidencia con lo predicho por el programa PMP.
A 25ºC, temperatura cercana a la temperatura óptima de crecimiento (35ºC40ºC) definida en la bibliografía (ICMSF,1996), se observó que los datos
experimentales son coincidentes con lo predicho por el programa de modelado de
patógenos, PMP con la diferencia de una fase de latencia de mayor duración (3 días
96
aproximadamente), una fase de crecimiento exponencial que va desde el día 3 al día
8 (con una pendiente ó velocidad de crecimiento menos pronunciada que la predicha)
,para finalmente, a partir del día 8, llegar al período de crecimiento estacionario,
perfil que es coincidente con lo comentado en los párrafos anteriores (Figura 32c ).
Figura 31: Evaluación del comportamiento de E.coli en queso untable base, pH 5,0
a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ),17ºC ( -■- ) y 25ºC
(-▲-
);
(I):desvío estándar.
Dado que las curvas de inactivación presentaron desviaciones significativas
de la linealidad, se consideró apropiado aplicar regresión no lineal, teniendo en
cuenta todas las partes de la curva de inactivación (Linton y col., 1995).
Se aplicó el modelo de Gompertz modificado a las curvas de inactivación de E. coli
obtenidas a 6°C y 17°C, calculando los parámetros característicos del mismo, según
la metodología descripta en Materiales y Métodos, 3.6.1.2 Las Figuras 33 y 35
muestran un correcto ajuste del modelo a los datos experimentales. Las tablas 12 y
13 exhiben los parámetros característicos A; B y C
junto a los estadísticos
relacionados. El modelo ajustó correctamente en ambos casos, tal como se evidencia
por los elevados coeficientes de determinación obtenidos (R2 = 99,9 y 98,1%,
respectivamente); la adecuada correlación entre valores observados y predichos y
una homogénea distribución de residuales (Figuras 34 y 36).
97
Figura 32: Comportamiento predicho de E.coli a pH 5,0 y 6º C (a), 17ºC (b) y 25ºC
(c): ( ▬ ) predicción , ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- ) límite de
confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales
a
b
c
98
Figura 33: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
E.coli en queso untable base almacenado a 6ºC, () valores experimentales; (—)
predicción
Log(N/N0)
0,07
-0,03
-0,13
-0,23
-0,33
-0,43
0
4
8
12
16
20
Tiempo (día)
Tabla 12: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 6 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
2,39
0,06
B
-0,10
0,01
C
-1,84
0,37
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
gl
MODELO
0,28
3
RESIDUAL
0,00002
3
R2 ajustado
FISHER2
13283**
99,98
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
99
Figura 34: Validación interna del modelo propuesto para la supervivencia de E.coli
en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6 ºC: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—)
(a)
-0,03
-0,13
-0,23
-0,33
-0,43
-0,43
-0,33
-0,23
(b)
(X 0,0001)
48
0,07
Residuales
Valores observados
predicción.
-0,13
-0,03
28
8
-12
-32
-0,43
0,07
-0,33
-0,23
-0,13
-0,03
0,07
Valores predichos
Valores predichos
Figura 35: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
E.coli en queso untable base almacenado a 17ºC, () valores experimentales; (—)
predicción.
Log(N/N0)
0,6
0,1
-0,4
-0,9
-1,4
-1,9
-2,4
0
3
6
9
12
15
18
Tiempo (día)
100
Tabla 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 17 ºC.
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
2,88
2,00
B
-0,25
0,20
C
-2,80
0,89
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
FISHER2
gl
MODELO
8,02
3
RESIDUAL
0,04
2
133**
R2 ajustado
98,12
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día); B: máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
Figura 36: Validación interna del modelo propuesto para el comportamiento de
E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 ºC: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales;
(b)
(a)
0,6
0,2
0,1
Residuales
Valores observados
(—) predicción
-0,4
-0,9
-1,4
-1,9
-2,4
-2,4
-1,9
-1,4
-0,9
-0,4
0,1
Valores predichos
0,6
0,1
0
-0,1
-0,2
-2,4
-1,9
-1,4
-0,9
-0,4
0,1
0,6
Valores predichos
El análisis del comportamiento de E.coli que permite el modelo de Gompertz
modificado define a 17 °C una curva sigmoidea con un hombro extenso en función
del tiempo (~ 3 días) para luego exhibir una caída mayor que la estimada a 6°C.
101
Esto sugiere la presencia de otros factores influyentes en el comportamiento ó
adaptación de las células bacterianas al alimento.
Roberts y col. (2002) describieron que no hubo diferencias significativas en
el recuento bacteriano de E. coli O157:H7 entre el sistema control (0% sorbato de
potasio) y sistemas con concentraciones crecientes de sorbato de potasio (0.1, 0.15,
0,20 y 0.30 %) en queso cheddar y mozzarella, durante 70 días de almacenamiento a
10°C. Esto podría ser una evidencia de que la muerte observada de E.coli en queso
con humedad media y alta no estaría relacionada al poder inhibitorio de un
conservante químico.
Se ajustó con éxito el modelo de Gompertz a la curva de crecimiento de
E.coli en queso crema base a 25ºC (Figura 37). La Tabla 14 exhibe los parámetros
característicos del modelo junto a los estadísticos relacionados evidenciando que el
ajuste logrado fue muy satisfactorio (α< 0,01) obteniéndose un R2 ajustado de
94,5%; adecuada distribución de valores observados en torno a los predichos y de
residuales vs. valores predichos (Figura 38 a y b).
Figura 37: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25ºC,
() valores
experimentales; (—) predicción
8,4
Log N
7,4
6,4
5,4
4,4
3,4
0
2
4
6
8
10
Tiempo (dia)
102
Tabla 14: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 25 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
3,93
0,19
B
0,56
0,05
C
5,33
1,63
M
6,77
1,00
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
FISHER3
gl
MODELO
239,77
4
RESIDUAL
0,60
4
R2 ajustado
94,51
399 **
PARAMETROS BIOLÓGICOS2
Gompertz
PMP
TG (día)
0,26
0,04
VCE (Log UFC/g/día)
1,18
5,9
LAG (día)
5,75
0,22
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *: significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.
1
El estudio comparativo entre los parámetros biológicos que caracterizan el
crecimiento de E.coli almacenado a 25ºC entre y los valores predichos por PMP
evidencian que el PMP predice LAG y TG menores, concordantes con una VCE
mayor que los correspondientes estimados por Gompertz (Tabla 14).
103
Figura 38: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de E.coli en
queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—)
8,4
0,55
(a)
7,4
Residuales
Valores observados
predicción.
6,4
5,4
4,4
3,4
3,9
4,9
5,9
6,9
7,9
Valores predichos
8,9
(b)
0,35
0,15
-0,05
-0,25
-0,45
3,4
4,4
5,4
6,4
7,4
8,4
Valores predichos
Con lo anteriormente observado se puede deducir que el microorganismo en
queso precisó mayor adaptación al medio y asimismo creció a menor velocidad que
la predicha en un sistema ideal.
Datos bibliográficos (Lars, 2004) indican que ciertas especies de los géneros
más usados en la industria láctea, Lactococcus y Leuconostoc, desarrollan a
temperatura de refrigeración (~ 10ºC) y no desarrollan a mayores temperaturas (~
40ºC) hecho que podría relacionarse con su mayor y menor poder inhibitorio,
respectivamente.
Si bien en el presente estudio se utilizaron 2 temperaturas cercanas a 10ºC (6
y 17 ºC) y una temperatura mayor (25ºC) el comportamiento observado no se
contradice con lo anteriormente explicado ya que E.coli presentó muerte conforme
transcurrió el tiempo (6 y 17ºC) y neto crecimiento a mayor temperatura (25ºC). Su
comportamiento frente a las temperaturas estudiadas es justamente inverso al
comportamiento de las bacterias lácticas; dicho de otra manera mientras a bajas
temperaturas algunas bacterias lácticas desarrollan el patógeno E.coli muere. Lars
(2004) afirma que las bacterias lácticas tienen un importante rol en la preservación de
alimentos. Sería causa de otros estudios para explicar la mayor caída (aunque leve)
en ciclos log observada a 17ºC con respecto a lo observado a 6°C.
104
4.4.3. S. Enteritidis
En la Figura 39 puede observarse el desarrollo de S.Enteritidis en queso
untable base almacenado a 6ºC, 17ºC y 25ºC. Al igual que con S. aureus y E. coli; la
población de S.Enteritidis decreció en función del tiempo a 6ºC y 17ºC pero mostró
crecimiento neto a 25°C.
El programa PMP predijo a 6ºC y 17ºC muerte bacteriana coincidente con los
resultados obtenidos, pero si se observan los gráficos superpuestos (Figura 40 a y b)
se evidencia la curva de muerte de S.Enteritidis en el queso untable base a una
velocidad muy inferior (2 ciclos logarítmicos en 37 días) a la predicha por el
programa PMP, el cual estimó una caída de 5 ciclos logarítmicos en 2,5 días.
A 25ºC experimentalmente se comprobó crecimiento a pesar que la
predicción por el PMP es de muerte bacteriana Figura 39 c) ; PMP predice
crecimiento de S.Enteritidis a 25ºC a un pH > 5.4 (en caldo nutritivo).
Figura 39: Evaluación del comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base,
pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ),17ºC ( -■- ) y 25ºC
( -▲- );
(I):desvío estándar.
105
Figura 40 : Comportamiento predicho de S.Enteritidis a pH 5,0 y 6º C (a), 17ºC (b)
, 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- )
límite de confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales.
a
b
c*
*en este caso no se superpuso la respuesta observada ya que se registró crecimiento (ver figura 39)
106
Datos bibliográficos indican que Salmonella spp. en medios ligeramente ácidos
(pH 5.5) (prechoque) seguida de la exposición de las células adaptadas al valor
de pH menor (choque ácido) desencadenan una compleja respuesta de
ácidotolerancia que potencia la supervivencia del microorganismo en medios
ácidos (pH< 5,4). La respuesta se traduce en una síntesis de de 43 proteínas de
choque ácido en la fase logarítmica de crecimiento y de 15 proteínas de choque
ácido en la fase estacionaria. Probablemente estos sistemas actúan en los medios
ácidos que predominan en los alimentos fermentados y acidificados. El estrés
ácido también puede desencadenar resistencia bacteriana aumentada frente a
otras condiciones ambientales adversas (Daoust, 1997).
Las curvas de supervivencia obtenidas a 6 y 17°C se caracterizaron utilizando
el modelo de Gompertz modificado. Las Figura 41 y 43 muestra un adecuado ajuste
del modelo a los datos experimentales. El análisis de la varianza (Tablas 15 y 16)
arrojó valores de R2 entre 99,2% y 97,3% con F muy significativo (α < 0,01). La
validación interna realizada (Figuras 42 y 44) mostró que en los gráficos de valores
observados vs predichos así como en el gráfico de residuales vs. valores observados
los datos experimentales y los predichos presentaron distribución homogénea.
Figura 41 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación
de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6ºC, () valores
experimentales; (—) predicción
Log(N/N0)
0
-0,4
-0,8
-1,2
-1,6
-2
0
10
20
30
40
Tiempo (día)
107
Tabla 15: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
1,12
0,28
B
-0,12
0,02
C
-2,17
0,16
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
gl
MODELO
15,23
3
RESIDUAL
0,02
4
2
FISHER2
1016**
99,23
R ajustado
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
Figura 42: Validación interna del modelo propuesto para S.Enteritidis en queso
untable base (pH 5,0) almacenado a 6 ºC: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—)
Valores observados
predicción
(b)
(a)
0,3
0,1
-0,1
Residuales
0,06
-0,5
0,02
-0,9
-0,02
-1,3
-1,7
-2,1
-2,1
-0,06
-1,7
-1,3
-0,9
-0,5
-0,1
Valores predichos
0,3
-0,1
-2
-1,6
-1,2
-0,8
-0,4
0
Valores predichos
108
Figura 43: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17ºC,
() valores
experimentales; (—) predicción
Log(N/N0)
0,9
-0,1
-1,1
-2,1
-3,1
0
4
8
12
16
20
24
Tiempo (día)
Tabla 16: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 17 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
0,94
0,03
B
-0,16
0,06
C
-3,65
0,07
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
gl
MODELO
29,90
3
RESIDUAL
0,15
4
R2 ajustado
FISHER2
249**
97,29
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
109
Figura 44: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 ºC: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; (—) predicción
(b)
0,33
0,9
Residuales
Valores observados
(a)
-0,1
-1,1
-2,1
0,23
0,13
0,03
-0,07
-0,17
-0,27
-3,1
-3,1
-2,1
-1,1
-0,1
0,9
Valores predichos
-3,1
-2,1
-1,1
-0,1
0,9
Valores predichos
De acuerdo a los parámetros estimados, S. Enteritidis en queso untable base
almacenado presentó perfiles de supervivencia similar a 6° C y 17°C con valores de
hombro inicial (A) cercanos a 1 día; velocidades de muerte similares (B) entre 0,12 y
0,16 día-1 y una caída global algo mayor a 17°C que a 6°C, tal como se observó con
los otros microorganismos estudiados.
Dado que S. Enteritidis creció en el queso untable base almacenado a 25°C,
se caracterizó dicha curva mediante el modelo de Gompertz. En la Figura 45, puede
observarse que hubo un buen ajuste con el modelo propuesto ya que la predicción es
coincidente con los valores experimentales. El análisis de la varianza (Tabla 17)
arrojó un R2 de 96,5% con F significativo (α < 0,05). La validación interna del
modelo no mostró tampoco en este caso anomalías (Figura 46 a y b).
110
Figura 45: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25ºC,
() valores
experimentales; (—) predicción
8,7
Log N
7,7
6,7
5,7
4,7
3,7
0
2
4
6
8
10
Tiempo (dia)
Varios estudios han subrayado la capacidad aumentada de los
microorganismos que crecen en condiciones ácidas (pH~5) o en medios de salinidad
elevada (>2% NaCl) a temperaturas óptimas para su crecimiento o cercanas
(Ferreira, 1987;Thomas, 1992). El género Salmonella está integrado por
microorganismos resistentes que se adaptan fácilmente a las condiciones extremas
del medio. Además, la capacidad de adaptación fisiológica de Salmonella spp. se
demuestra por su capacidad de multiplicarse a valores de pH desde 4.5 a 9.5 con un
pH óptimo de crecimiento de 6.5 hasta 7.5 al igual a lo observado con respecto a la
temperatura de almacenamiento (temperatura óptima de crecimiento 37ºC con un
rango que va desde 2ºC a 54ºC), tal como se ha observado en el presente estudio.
111
Tabla 17 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
4,14
0,16
B
0,82
0,16
C
4,42
0,71
M
7,04
0,40
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
FISHER3
gl
MODELO
213,98
4
RESIDUAL
0,24
3
R2 ajustado
96,50
668**
PARAMETROS BIOLÓGICOS2
Gompertz
TG (día)
0,27
VCE (Log UFC/g/día)
1,10
LAG (día)
5,33
PMP
-------
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generación; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%.
1
0,06
8,7
(a)
7,7
(b)
0,04
Residuales
Valores observados
Figura 46: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto para el
crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ()
valores experimentales; (—) predicción
6,7
5,7
4,7
0,02
0
-0,02
-0,04
3,7
-0,06
4,1
5,1
6,1
7,1
Valores predichos
8,1
4,4
5,4
6,4
7,4
8,4
Valores predichos
112
4.4.4. L.monocytogenes
La Figura 47 exhibe el comportamiento de L.monocytogenes inoculada en el
queso untable base a pH 5,0 y almacenado a 6ºC, 17ºC y 25ºC. Esta experiencia se
llevó a cabo tal como se describe en Materiales y Métodos, sección 3.4.5.4. Puede
observarse una disminución de la población, con similar perfil de inactivación en
todos los casos aunque a 6°C, se observó una leve recuperación parcial de la
población a partir de los 23 días de almacenamiento.
Figura 47: Evaluación del comportamiento de L.monocytogenes en queso untable
base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ),17ºC ( -■- ) y
25ºC ( -▲- ); (I): desvío estandar.
Haciendo un estudio comparativo entre los datos experimentales y los
predichos por el programa de modelado de patógenos PMP se observó (Figura 48)
que mientras a las tres temperaturas estudiadas el programa PMP predice crecimiento
en caldo de cultivo, los datos experimentales confirmaron muerte de la población
bacteriana. Debe considerarse una vez más, que la inhibición del crecimiento
encontrada experimentalmente en el queso untable base no es contemplada por el
programa de
modelado terciario PMP ya que están presentes ciertas variables
propias del queso untable que no son consideradas en el modelo predicho.
113
Figura 48: Comportamiento predicho de L.monocytogenes a pH 5,0 y 6º C
(a), 17ºC (b) y 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior
predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales.
a
b
c
114
Una de las bacterias lácticas utilizadas en la elaboración del queso
es
Lactococcus lactis subsp.lactis, productor de nisina. La nisina, fue la primer
bacteriocina aislada a partir de la bacteria ácido láctica Lactococcus lactis subsp
lactis. Es la bacteriocina mejor caracterizada y es utilizada como conservador de
alimentos .Es la única reconocida por la FDA con categoría GRAS (Generally
Recognized as Safe). Se produce de forma natural en algunos productos lácteos y se
utiliza en la producción de alimentos como un aditivo en dichos productos para
prevenir la descomposición ocasionada por bacterias Gram positivas, especialmente
de los géneros Clostridium, Staphylococcus, Bacillus y Listeria ( Delves-Broughton,
1990 ; Gonzalez y col.,2003). Esta podría ser la razón de la diferencia observada
entre los datos experimentales y los predichos por el programa de modelado de
patógenos PMP.
Con el propósito de caracterizar las curvas de muerte obtenidas se aplicó el
modelo de Gompertz modificado a las tres temperaturas estudiadas. Las Tablas 18;
19 y 20 exhiben los parámetros estimados que representan las diferentes regiones de
la curva de supervivencia junto a los estadísticos de ajuste del modelo. El ajuste del
modelo resultó altamente satisfactorio a las 3 temperaturas de almacenamiento,
obteniéndose valores de R2 ajustado por grados de libertad entre 94 y 98%.El mismo
describió a las 3 temperaturas curvas sigmoideas donde la temperatura pareció no
tener influencia en el cambio global de numeró de sobrevivientes. Los valores de F
muy significativos (α<0,01), demostraron que el modelo fue apropiado para describir
el comportamiento observado tal como se observa en la Figura 49. La validación del
modelo fue correcta tal como puede observarse en los gráficos de valores observados
y predichos (Figuras 50).
115
Figura 49 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6ºC (a),17°C (b) y
25°C (c) () valores experimentales; (—) predicción
0,8
(a)
-0,3
LogNN0
LogNN0
0,7
-1,3
-2,3
(b)
-0,2
-1,2
-2,2
-3,2
-3,3
0
10
20
30
40
0
50
4
8
12
16
20
24
Tiempo (día)
Tiempo (día)
LogNN0
0,7
-0,3
(c)
-1,3
-2,3
-3,3
0
10
20
30
40
Tiempo (día)
A 6ºC y 25°C el modelo primario de Gompertz modificado estimó valores
de los parámetros característicos similares: una región de hombro (A) muy poco
marcada coincidiendo con los datos experimentales observados. El cambio global en
el número de sobrevivientes (C) en los 3 ciclos logarítmicos observando una cola
larga (Figura 49 a). El modelo, como ocurre generalmente, no pudo caracterizar la
leve recuperación observada luego de 27 días de almacenamiento.
A 17ºC el modelo estimó un mayor tiempo de latencia antes de comenzar la
inactivación del microorganismo (hombro). Tal como ocurrió en los apartados
anteriores, el mismo sobrestimó el cambio global en el número de sobrevivientes (C)
en comparación con los valores observados.
El parámetro B, el cual indica la velocidad de muerte máxima, fue similar a
las 3 temperaturas estudiadas, demostrando que la temperatura no tuvo influencia en
al inactivación observada. Este
hecho confirma, junto con la predicción de
crecimiento a estas temperaturas del programa PMP la posible presencia de un
agente inhibidor en el queso untable base.
116
Tabla 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
1,64
0,27
B
-0,25
0,10
C
-3,02
0,18
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
gl
MODELO
51,77
3
RESIDUAL
0,41
5
R2 ajustado
FISHER2
215**
94,26
Tabla 19: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 17 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
1,78
0,50
B
-0,11
0,05
C
-4,76
1,65
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
gl
MODELO
21,18
3
RESIDUAL
0,12
4
R2 ajustado
FISHER2
235**
98,14
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -)
1
117
Tabla 20: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
1,34
0,65
B
-0,22
0,08
C
-3,36
0,37
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
gl
MODELO
18,83
3
RESIDUAL
0,33
4
R2 ajustado
FISHER2
76**
94,23
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
118
Figura 50: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto para el
crecimiento de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0). a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; (—) predicción
-
6°C
(b)
3
-0,3
Residuales
Valores observados
(a)
0,7
-1,3
-2,3
2
1
0
-1
-2
-3,3
-3,3
-2,3
-1,3
-0,3
-3
0,7
-3,3
Valores predichos
-0,3
0,7
17°C
0,8
0,4
-0,2
-1,2
-2,2
-3,2
-3,2
-2,2
-1,2
-0,2
0,2
0
-0,2
-0,4
0,8
-3,3
Valores predichos
-
-2,3
-1,3
-0,3
0,7
Valores predichos
25°C
6
0,7
Residuales
Valores observados
-1,3
Valores predichos
Residuales
Valores observados
-
-2,3
-0,3
-1,3
-2,3
4
2
0
-2
-4
-3,3
-3,3
-2,3
-1,3
-0,3
Valores predichos
0,7
-6
-3,3
-2,3
-1,3
-0,3
0,7
Valores predichos
La bibliografía reporta resultados contradictorios en cuanto al desarrollo de L.
monocytogenes en quesos.
119
Roberts (2002) encontró que este microorganismo no se desarrollaba cuando
se lo inoculaba en queso mozzarella (pH 5,3) y cheddar (pH 5,0) almacenado a 10°C
y sin la presencia de sorbato de potasio siguiendo, en concordancia con este trabajo,
una cinética no lineal. Por otro lado,
Urlich y col. (2006) estudiaron el
comportamiento de L.monocytogenes en queso Blanco (queso blanco, semi-blando
elaborado con leche pasteurizada ,sal, enzimas y cultivos lácticos, sin aditivos) y
observaron que a las diferentes temperaturas de almacenamiento (5ºC, 10ºC, 15ºC,
20ºC y 25ºC) el microorganismo describía una marcada curva de crecimiento de
forma típicamente sigmoidea.
La leche y los quesos fueron los alimentos investigados primero y se
encuentran entre los alimentos estudiados más extensamente. Pueden estar
contaminada una gran variedad de quesos, pero son de interés máximo los quesos
blandos con una frecuencia de contaminación con L.monocytogenes del 2 al 10%.
Rocourt (1997) vió que existe una correlación significativa del crecimiento
de L.monocytogenes con los valores de pH (>5.5) y con la ausencia de cultivos
iniciadores durante la fabricación del queso. El yogur (los cultivos lácticos termófilos
inhiben el crecimiento de Listeria) rara vez está contaminado
Queda por evaluar si la única recuperación observada experimentalmente
luego de los 35 días de almacenamiento a 6ºC no responde al patrón descripto por
Urlich y col. (2002) luego de superado un período de stress traducido en muerte
bacteriana.
Los resultados de reto microbiano con patógenos relevantes obtenidos en esta
tesis están en concordancia con otros resultados reportados en bibliografía. Smittle y
Flowers (1994) observaron que el programa PMP falló en predecir el
comportamiento de Salmonella spp. y L. monocytogenes en una ensalada con jamón.
Hudson y Mott (1993) observaron que L. monocytogenes, Aeromonas hydrophila; y
Yersinia entercolítica creció más lentamente a 4°C y 10°C en paté que lo que predijo
el programa PMP. Estudios realizados por Buchanan y Bagi (1994) han demostrado
que este programa puede proveer una buena primera estimación del comportamiento
de E. coli O157:H7 en alimentos. Walls y Scott (1997) encontraron discrepancias
entre la predicción del tiempo de fase lag en este programa y el crecimiento de
Listeria spp en un alimento infantil estéril evaluado a diferentes temperaturas (1235°C), pH (5,3-6,8) y niveles de sal agregada (2,9%-4,1% NaCl).
120
4.5 Uso de antimicrobianos naturales: timol
Con el objetivo de evaluar la posible capacidad antimicrobiana del timol se
estudió el comportamiento a lo largo del tiempo de S.aureus en queso untable base
con el agregado de (0,3% p/p) timol y almacenado a 6ºC, 17ºC y 25ºC y de
S.Enteritidis en la misma matriz alimenticia, almacenada a 17ºC. La experiencia se
llevó a cabo tal como se describió en Materiales y Métodos, sección 3.4.5.5. La
concentración de timol utilizada resultó ser la más apropiada desde el punto de vista
organoléptico (Materiales y Métodos, sección 3.4.2).
Los datos experimentales muestran que a 6 y 17ºC (Figura 51 a y b) S.aureus
y a 17ºC S.Enteritidis (Figura 52) respectivamente la pendiente de la curva de
inactivación descripta fue mayor en ausencia de timol.
La experiencia observada fue diferente conforme aumentó la temperatura de
almacenamiento (Figura 51 c). Tal es así, que a 25ºC la curva descripta por S.aureus
demostró crecimiento pero llamativamente el crecimiento observado fue mayor en
ausencia de timol.
En muchos estudios se ha observado una rápida acción germicida del timol.
Zhou y col. (2006), Viuda-Martos y col.(2006) investigaron la actividad
antimicrobiana de cinamaldehido, timol y carvacrol contra S. typhimurium en un
medio de cultivo. Ellos encontraron que concentraciones de estos compuestos entre
0,02 y 0,04% p/p fueron suficientes para inhibir a este microorganismo. Sokmeny
col. (2004) demostraron la capacidad del aceite esencial de tomillo en para inhibir el
crecimiento de hongos como Alternaria spp, A. flavus, Fusarium spp. y Penicillium
spp. Esta capacidad antifúngica del aceite esencial de tomillo también ha sido
demostrada por Montes y Carvajal (1998) y Basilico y Basilico (1999) sobre los
hongos, tales como A. flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus,
Aspergillus fumigatus y Fusarium spp. Según Soliman y Badeea (2002), este efecto
antifúngico podría ser causada por el contenido de b-pineno de aceite esencial de
tomillo, ya que puede alcanzan valores de 30 a 37.6%.
En el presente estudio el tratamiento con timol en una concentración superior
(0,3% p/p) no resultó en una mayor inactivación bacteriana sino que por el contrario,
el mismo ejerció una acción protectora.
121
Figura 51: Comportamiento de S.aureus en queso untable base con (-♦-) y sin
agregado de (-♦-) timol (0,3% p/p), pH 5,0, almacenado a tres temperaturas: (a)
6ºC, (b) 17ºC, (c) 25ºC ; (I):desvío estándar.
a
b
c
122
Figura 52: Comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base con (-♦-) y sin
agregado de (-♦-) timol (0,3% p/p), pH 5,0 almacenado a 17ºC; (I): desvío estandar.
Juven y col. (1994) sugirieron que los alimentos con cierto tenor de grasa
(Materiales y Métodos, sección 3.1.1) podrían formar una barrera protectora
alrededor de las bacterias protegiéndolas de los agentes antimicrobianos. Estos
estudios sugirieron también que la fracción lipídica del alimento absorbe el agente
antimicrobiano, reduce su concentración en la fase acuosa y por ende su acción
bactericida. El contenido proteico del alimento podría también ser un factor
influyente en la inefectividad del timol ya que la albúmina de suero bovino
neutralizaba la acción antimicrobiana del timol sugiriendo formación de complejos
entre los componentes fenólicos del timol y las proteínas del alimento. Estas
reacciones podrían haber prevenido toda otra formación de complejos similares entre
compuestos fenólicos y proteínas u otros componentes de la membrana celular
bacteriana que es considerada el sitio de acción blanco de los aceites esenciales
(Peter, 2004).
Es necesario evaluar también el comportamiento de la flora láctica frente al
timol. Nuevos estudios serían necesarios para evaluar si el timol tiene algún tipo de
efecto sobre su crecimiento lo que provocaría que el accionar metabólico de las BAL
se vea alterado así como también su capacidad competitiva. Esto, de comprobarse,
podría explicar la causa por la cual la muerte bacteriana observada tanto en S. aureus
123
como en S. Enteritidis a las temperaturas ensayadas es menor con timol que sin la
presencia del mismo. Es decir, el timol en cierta forma altera la capacidad
biopreservativa y competitiva de las BAL permitiendo mayor desarrollo de otra flora
acompañante.
El análisis de modelado terciario no se pudo incluir en el estudio del
comportamiento microbiano en queso con y sin timol ya que el programa PMP no
contempla, dentro de las variables que ofrece, el agregado de este producto. Esta es
la razón por la cual no fue posible comparar las respuestas observadas y las
predichas.
Con el propósito de caracterizar las curvas de supervivencia de los
microorganismos estudiados en queso untable base adicionado con aceite esencial de
timol se
aplicó el modelado primario utilizando la ecuación de Gompertz
modificado.(Materiales y Métodos,3.6.1.2).
Las Tablas 21; 22 y 23 exhiben los parámetros estimados que representan
las diferentes regiones de la curva de supervivencia junto a los estadísticos de ajuste
del modelo. El ajuste del modelo resultó altamente satisfactorio, obteniéndose
valores de R2 ajustado por grados de libertad entre 89,3% y 99,1%. Los valores de F
muy significativos (α<0,01), demostraron que el modelo fue apropiado para describir
el comportamiento observado tanto para S. aureus a 6°C y 17°C como para S.
Enteritidis a 17°C tal como se observa en la Figura 53. La validación del modelo fue
correcta tal como puede observarse en los gráficos de valores observados y predichos
y la distribución de residuales (Figuras 54).
En el caso del comportamiento de S.aureus en queso untable base
almacenado a 6ºC, el perfil de las curvas de supervivencia difiere escasamente, sobre
todo en los primeros días de almacenamiento donde la caída de la población es más
acelerada en el caso del queso sin adición de timol (Figura 51a). El modelo de
Gompertz modificado caracterizó correctamente el cambio global observado dada la
presencia de una cola marcada (C= 4,2 ciclos; Tabla 21), mientras que en ausencia
de timol, la falta de cola marcada hizo que el modelo sobrestimara dicho valor(C=
14,4 ciclos; Tabla 9); cuando en realidad el cambio observado experimentalmente
fue de
3,4 ciclos logarítmicos
(Figura 51a). Aunque finalmente este
microorganismo termina muriendo en un nivel similar al observado en queso base sin
124
timol, la presencia de timol aumentaría levemente su resistencia a esta temperatura o
bien, actuaría indirectamente, inhibiendo la flora competitiva.
A 17°C, se observó que las curvas de supervivencia de S. aureus en queso
untable base con timol presentaron un perfil de curva quebrada similar al observado
para la curva de supervivencia en igual sistema sin agregado de timol, aunque la
inactivación fue mucho menor. Ello queda evidenciado en los parámetros
característicos de ambas curvas. En el caso de la presencia de timol (Tabla 22), la
curva no presentó hombro inicial (A ~ - 4 días) al igual que en ausencia de timol
(Tabla 10). La velocidad de muerte y el cambio global en el numero de
sobrevivientes fueron significativamente mayores (Bc/
timol=1,3
día-1 ; Bs/
timol=
0,5
-1
día ; Cc/ timol= 3,4 ciclos; Cs/ timol =0,07 ciclos). Tal como se comentó anteriormente,
son varios los factores que en combinación podrían estar generando este efecto
protector observado.
Estos estudios debieran intensificarse evaluando varias
concentraciones de este antimicrobiano con el propósito de arribar a una conclusión
más definitiva.
En el caso de S. Enteritidis en queso untable base con agregado de timol
almacenado a 17°C, la misma fue más indiferente a la presencia de este
antimicrobiano natural generando una curva de inactivación de perfil similar a la
obtenida en ausencia del mismo. Ello se evidencia también en la concordancia de los
parametros característicos de las mismas. En presencia de timol (Tabla 23), el
parámetro A (hombro inicial) indica un valor predicho de 1,76 días. El cambio global
en el numero de sobrevivientes (C) en 20 días de almacenamiento fue de 3,3 ciclos
logarítmicos y la velocidad de muerte (B), 0,20 día-1. Cuando se caracterizó la
respuesta de este microorganismo en iguales condiciones pero en ausencia de timol
(Tabla 16) se obtuvieron similares valores de hombro inicial (A~ 1 día); de
velocidad de muerte (B= 0,16 día-1) y de caída global predicha en 20 días (C=3,7
ciclos).
125
Figura 53: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 6ºC (a); 17°C (b); y
de S. Enteritidis en igual matriz almacenada a 17°C (c) () valores experimentales;
(—) predicción
(a)
(b)
0,19
Log (N/N0)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-0,01
-0,21
-0,41
-0,61
-0,81
-3
0
10
20
30
0
40
4
8
12
16
20
24
Tiempo (día)
Tiempo (día)
(c)
0
Log (N/N0)
Log (N/N0)
0
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0
4
8
12
16
20
Tiempo (día)
126
Tabla 21: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 6 ºC.
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
1,43
0,30
B
0,08
0,02
C
-4,19
0,82
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
Fuente
SS
gl
MODELO
30,97
3
RESIDUAL
0,06
4
R2 ajustado
FISHER
516**
99,07
Tabla 22 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 17 ºC.
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
-4,17
102,50
B
-1,33
27,11
C
-0,07
0,31
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
Fuente
SS
gl
MODELO
1,67
3
RESIDUAL
0,03
4
R2 ajustado
FISHER
55**
89,29
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
127
Tabla 23: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 17 ºC.
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
1,76
0,47
B
-0,20
0,06
C
-3,28
0,34
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
Fuente
SS
gl
MODELO
26,44
3
RESIDUAL
0,12
5
R2 ajustado
FISHER
367**
98,27
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
1
En el caso de S. aureus inoculado en queso untable base con ó sin agregado
de timol y almacenado a 25°C se observó crecimiento por lo que las curvas se
caracterizaron mediante el modelo de Gompertz, obteniendo los parámetros
matemáticos (A;B;C y M) a partir de los cuales se calcularon los parámetros
biológicos TG;VCE y LAG. En la Figura 54, puede observarse que hubo un buen
ajuste con el modelo propuesto ya que la predicción es coincidente con los valores
experimentales. El análisis de la varianza (Tabla 24) arrojó un R2 de 99,1% con F
muy significativo (α < 0,01). La validación interna del modelo no mostró tampoco
en este caso anomalías (Figura 55 a y b). Los perfiles de las curvas de supervivencia
predichas en este caso fueron similares , del tipo sigmoideo con valores semejantes
(Tablas 11 y 24) de tiempo de generación (TGc/timol=0,51días;TGs/timol=0,54 días);
velocidad de crecimiento (VCEc/timol=0,59 LogUFC/gr /día ; VCEs/timol= 0,55
LogUFC/gr/día) y tiempo de fase lag (LAGc/timol=5,5 días; LAGs/timol=5,0 días)
aunque con una tendencia a mayor crecimiento en el caso del sistema con timol. La
observación de las curvas experimentales de crecimiento (Figura 51c) evidencian que
S. aureus en queso untable
128
Figura 54: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 5,0) con timol almacenado a 6ºC ; 17°C; y de S.
Enteritidis en igual matriz almacenada a 17°C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales;
(—)
predicción.
0,8
0,22
Residuales
Valores observados
S.aureus- 6°C
-0,2
-1,2
-2,2
-3,2
0,12
0,02
-0,08
-0,18
-3,2
-2,2
-1,2
-0,2
0,8
-3
-2,5
Valores predichos
-2
-1,5
-1
-0,5
0
Valores predichos
0,12
0,19
Residuales
Valores observados
S.aureus- 17°C
-0,01
-0,21
-0,41
-0,61
-0,81
-0,81
0,08
0,04
0
-0,04
-0,08
-0,61
-0,41
-0,21
-0,01
-0,12
-0,81
0,19
-0,61
Valores predichos
-0,41
-0,21
-0,01
0,19
Valores predichos
0,21
0
-0,5
Residuales
Valores observados
S.Enteritidis- 17°C
-1
-1,5
-2
0,11
0,01
-0,09
-2,5
-0,19
-3
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
Valores predichos
-0,5
0
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
Valores predichos
129
Figura 55: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base con timol almacenado a 25ºC,
() valores
experimentales; (—) predicción
8,9
Log N
7,9
6,9
5,9
4,9
3,9
0
3
6
9
12
15
18
Tiempo (dia)
Tabla 24: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base con timol (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
Parámetro
Estimador
Error Estándar
A
4,01
0,20
B
0,26
0,46
C
5,24
0,05
M
7,49
0,61
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente
SS
gl
MODELO
314,25
4
RESIDUAL
0,12
3
2
R ajustado
FISHER3
1964**
99,14
PARAMETROS BIOLÓGICOS2
Gompertz
PMP
TG (día)
0,51
---
VCE (Log UFC/g/día)
0,59
---
LAG (día)
5,5
---
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generación; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%
1
130
Figura 56: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos. () valores
experimentales; (—) predicción
(b)
8,9
0,33
7,9
0,23
Residuales
Valores observados
(a)
6,9
5,9
0,13
0,03
-0,07
4,9
-0,17
3,9
4
5
6
7
Valores predichos
8
9
-0,27
3,9
4,9
5,9
6,9
7,9
8,9
Valores predichos
con agregado de timol creció aproximadamente 2 ciclos logarítmicos más que en
queso untable sin agregado de (0,3%p/p) timol y con una tendencia hacia el final del
almacenamiento estudiado de seguir incrementándose la población mientras que, en
el caso de la ausencia de timol, la población alcanzó un estado estacionario a los 11
días de almacenamiento, el cuál mantuvo hasta el final del mismo (17 días).
Estos estudios coincidentes, si bien deben profundizarse con más condiciones
de prueba y ensayando más microorganismos, permiten inferir una posible acción
protectora de este antimicrobiano natural presente en la esencia de orégano y pone
atención en la necesidad de tener en cuenta este hecho al momento de elaborar
quesos untables saborizados.
131
5. CONCLUSIONES
132
La microbiología predictiva se ha convertido en los últimos años en una
herramienta muy valorable y necesaria para un correcto diseño de los procesos de
preservación de alimentos. Los modelos matemáticos generales que se utilizan para
describir el crecimiento ó la inactivación microbiana generalmente se derivan de
estudios en sistemas modelo con factores ambientales controlados tales como el pH;
el nivel de sal; la temperatura; etc.
La comparación de las predicciones brindadas
por estos modelos con el comportamiento de los microorganismos en un alimento
real puso en evidencia en este estudio las limitaciones de los mismos. En particular,
cuando no todas las condiciones ensayadas quedaron bien descriptas este análisis
permitió determinar qué factores adicionales (ó consideraciones del microambiente)
se necesitan incluir en el modelo o considerar para aumentar su aplicabilidad. En
particular este estudio permitió arribar a las siguientes conclusiones:
La aplicación de modelos matemáticos no lineales conceptualmente diferentes
como modelos primarios y terciarios , resultó muy útil para explicar de forma más
completa el crecimiento ó lasupervivencia/ inactivación microbiana
en queso
untable, brindando información complementaria para la industria para la selección de
las combinaciones más efectivas y seguras desde el punto de vista microbiológico.
La observación de una respuesta de crecimiento/supervivencia no lineal y su
caracterización mediante modelos primarios (Gompertz y Gompertz modificado),
especialmente en los niveles de factores de estrés más críticos, resultó de destacada
importancia.
El modelo de Gompertz, utilizado para describir el crecimiento microbiano no
presentó limitaciones estadísticas. No ocurrió lo mismo con el modelo de Gompertz
modificado para muerte, el cuál sobreestimó la caída global al final del
almacenamiento debido a la ausencia en esos casos
de una verdadera curva
sigmoidea con cola marcada.
La presencia de sorbato de potasio (1000 ppm) no generó diferencias en las
curvas de supervivencia obtenidas con el microorganismo de prueba (S. aureus) en el
queso, hecho por el cuál no se lo consideró responsable de la diferencia de respuesta
133
observada entre el medio de cultivo (crecimiento) y el alimento real (supervivencia
/inactivación)
La reducción del pH del queso untable base (pH 5,0) hasta un valor
organolépticamente aceptable (pH 4,3) generó una alternativa interesante ya que
aumentó notoriamente la inactivación observada del microorganismo de prueba (S.
aureus) sobretodo en situaciones de abuso térmico (15 y 22°C), donde este efecto se
ve incrementado. Es posible que al aumentar la temperatura, la flora acidoláctica, que
no se ve afectada por el descenso de pH, incremente su población por tener una
temperatura más propicia y por lo tanto aumente su poder biopreservante eliminando
al microorganismo de prueba que es más sensible al microambiente imperante.
El programa de simulación modelado de patógenos mostró debilidades al
momento de predecir la conducta microbiana
en el queso untable debido
seguramente a las limitaciones biológicas imperantes en el queso. En algunos casos
(p.e S.aureus ; pH 5,0 y T: 6, 10; 15;17; 22 y 25°C; E. coli pH 5,0 T: 17 y 25°C
L.monocytogenes; pH 5,0 T: 6,17 y 25°C) realizó una predicción errada pero
conservativa ya que predijo un crecimiento más acelerado del realmente observado o
de modo más extremo predijo crecimiento y se observó muerte bacteriana. En otros
casos su predicción fue de riesgo (p.e. E.coli pH 5,0 T: 6°C; S.Enteritidis pH 5,0 T:
6 y 17 °C) pues predijo muerte a velocidades más rápidas que las observadas y en el
peor de los casos predijo muerte y se observó crecimiento (S.Enteritidis pH 5,0
T:25°C). La posible presencia de inhibidores en el queso así como también el
establecimiento de flora competitiva, factores no considerados en la predicción de
este programa, podrían ser los causantes de las diferencias observadas y ponen en
alerta sobre una cautelosa utilización de este programa.
La inclusión de timol (0,3%) con el posible propósito de su utilización como
agente antimicrobiano y a su vez saborizante no condujo a los resultados esperados.
No se observó actividad antimicrobiana adicional contra S.aureus y S. Enteritidis
presentes en queso untable, sino que por el contrario se incrementó la resistencia de
los mismos en presencia de este compuesto en todas las condiciones ensayadas. Este
134
resultado fue relevante pues señala un punto de inicio para futuras investigaciones y
aspectos a tener en cuenta al momento de desarrollar quesos untables saborizados.
Actualmente y por ahora, no es posible basarse solamente en la predicción de los
modelos matemáticos para determinar la seguridad de los alimentos y los procesos.
Los estudios de reto microbiano en el alimento son aun inequívocamente necesarios
para determinar la propensión al crecimiento de patógenos en el alimento.
135
6. APÉNDICE
136
Este capítulo incluye información con respecto a los métodos estadísticos que se
utilizaron para el análisis de los resultados, definiciones y fórmulas.
6.1
Definiciones y Fórmulas
6.1.1- Población estadística
Una población estadística se define como un conjunto completo de elementos
de interés. La medidas tomadas sobre los elementos de una población están
gobernadas por una distribución de probabilidad, usualmente expresada en forma de
ecuación matemática, la cual relaciona la ocurrencia de un valor específico con la
probabilidad de dicha ocurrencia.
6.1.2-Distribución normal
Distribución normal es el tipo de distribución que más comunmente se
encuentra. En general cuando se procesan los datos estadísticamente se asume que su
distribución es normal. La siguiente fórmula es la función de la distribución normal y
se puede usar para
verificar si realmente una serie de mediciones sigue tal
distribución
(
f ( x) = 1 / 2πσ
) ∗ exp[ (Y − Y ) 2 / 2σ 2 ]
(6.1)
Donde:
exp = función exponencial con base e
Y= medición realizada
Y = media del total de las mediciones
σ = desviación estándar
σ² = varianza
137
6.1.3- Parámetros y estimadores
Un parámetro estadístico es una función definida sobre los valores numéricos
de la población. Es un valor representativo de una población que provee
información sobre su distribución como la media aritmética o su desviación típica.
En estadística aplicada se asume que la forma de la distribución aplicada es
conocida pero no así los parámetros que la representan. Los mismos deben ser
estimados mediante la aplicación de funciones matemáticas a las mediciones
obtenidas. Los datos estadísticos extraídos de dichas funciones se denominan
estimadores.
Media de la distribución ( Y ); es el promedio aritmético de las mediciones
realizadas:
N
Y=
donde
∑Y
i
i=1
(6.2)
N
Yi : valor individual del sistema i
N: número total de datos
Desviación estándar (σ) o desviación típica; es una medida de dispersión de
las variables con respecto a su media y es de gran utilidad en la estadística
descriptiva. Es en realidad la raíz cuadrada de la varianza:
N
∑ (Y − Y )
2
i
σ=
i=1
(N − 1)
(6.3)
Varianza ( σ2 ); la varianza de una variable es una medida de la dispersión.
Corresponde al promedio del cuadrado de la distancia de los distintos valores de la
variable con respecto a su media .
138
N
σ =
2
∑ (Y − Y )
2
i
i =1
N −1
(6.4)
Error estándar de la media (SE); está relacionado a la desviación estándar y
el número de los casos con los cuales se trabaja. Su fórmula es:
SE =
σ
(6.5)
N
Intervalos de confianza; es siempre aconsejable que un analista determine los
intervalos de confianza de los parámetros que dermina. Los intervalos de confianza
dan información sobre la precisión de los cálculos realizados. Habitualmente se
utiliza el intervalo de confianza a dos colas, es decir el que precisa el límite superior
e inferior. Se calcula con la siguiente formula utilizando la media Y :
Y ± t α 2,n−1 ⋅
σ2
N
(6.6)
Donde
tα/2,n-1 = el estadístico t de Student de nivel de confianza α/2 y de n-1 grados
de libertad del sistema.
Grados de libertad (gl) ;se usan para estimar el número de categorías
independientes en un test o experimento.
gl=n-r
(6.7)
donde:
n= el número de sujetos en la muestra
r=el número de sujetos estadisticamente dependientes.
Cuando se trata de ajustar modelos estadísticos a un conjunto de datos, los
residuos se encuentran habitualmente en un espacio de menor dimensión que aquél
139
en el que se encontraban los datos originales. Los grados de libertad del error los
determina, precisamente, el valor de esta menor dimensión.
6.1.4 - Significancia estadística
Un resultado se denomina estadísticamente significativo cuando no es probable
que haya sido debido al azar. Una "diferencia estadísticamente significativa"
significa que hay evidencias estadísticas de que hay una diferencia. El nivel de
significación muchas veces se asocia con los test a los cuales se someten los datos
con fin de verificar una hipótesis. En cuanto al test de la hipotesis nula, el nivel de
significación es nada más que la probabilidad de tomar la decision de rechazar la
hipotesis nula cuando ella es verdad (cometiendo el error tipo I o α) o de aceptar la
hipótesis nula cuando la última no es cierta (cometiendo el error tipo II o β). En la
toma de la esa decisión muchas veces se usa el valor P donde P= 1- α. Entonces el
valor experimental se compara con el valor correspondiente a la tabla (para dado
nivel de significación y dados grados de libertad). Si el valor experimental es
superior al número de la tabla la hipótesis nula se rechaza mientras que al ser
superior el número de la tabla la hipótesis nula se tiene que aceptar para dado nivel
de significación. Cuanto mayor sea el valor experimental , más significativo será el
resultado y más fuerte será la evidencia de que el resultado no se debe a una mera
coincidencia. El nivel de significación es comunmente representado por el símbolo
griego α (alpha). Cuando se hacen este tipo de comparaciones es importante tomar en
cuenta si el ensayo es unilateral o bilateral. Por ejemplo si el ensayo es unilateral y
se trabaja en un nivel de significación α = 0,05 en realidad 5 valores en cada cien se
pueden dar por azar y entonces la probabilidad de que sean no debidos al azar es P=
1-0,05=0,95. Si, en cambio, el ensayo es bilateral en el mismo caso P= 1-2α = 0,90.
En muchos trabajos el nivel de significación se denota con una , dos o tres
estrellitas. Existen tres niveles; cuando P ≥ 0,95 (α ≤ 0,05); P ≥ 0,99 (α ≤ 0,01 ) y P
≥ 0,999 (α ≤ 0,001 ) cuya mención indica la significación de las conclusiones que se
formulan. Cuando el valor experimental obtenido es inferior al tabulado se concluye
que "no hay significación" y se indica con (-) ó (NS); cuando dicho valor supera al
valor tabulado para P ≥ 0,95 y no al tabulado para P ≥ 0,99 se indica con (*); si el
140
valor experimental es mayor que el tabulado para P ≥ 0,99 la conclusión es (**) y
para P ≥ 0,999 (***). Cuando :
VE < VT
(NS)/(-)
VE> VT(P 0,95)
*
VE > VT(P O,99)
**
VE > VT(P 0,999)
***
Siendo VE=valor experimental; VT=valor tabulado
Generalmente, en el caso de los alimentos lod niveles (*) y (**) se consideran
suficientes.
6.2 - Análisis de varianza (ANOVA )
Análisis de varianza (ANOVA )es un método general con aplicaciones muy
variadas y que puede llegar a ser complejo de acuerdo a las derivaciones que tome.
Se utiliza en reemplazo del uso de una batería de test t-Student cuando se poseen
varias muestras. Cuanto mayor es el número de sistemas de análisis, realizar una
batería de test t no solo resulta dificultoso sino que ofrece pocas ventajas. Esta
técnica compara las medias de varias muestras y verifica si todas ellas pertenecen a
la misma población o si, unao más son significativamente diferentes y provienen de
poblaciones diferentes. El ANOVA debe ser considerado en la práctica un test de
diferencias de medias a dos colas (ya que las medias en sí mismas pueden aumentar o
decrecer) que opera vía un test de cambio de varianza a una cola, el cual se describirá
más adelante (test F).
La variación total que existe en una distribución global de valores o medidas
puede ser segregada en categorías representando por un lado los efectos
identificables y por otro lado la variación debida a causas no identificables. La
variación total del conjunto de datos es llamada Suma de Cuadrados Totales (SST).
Dicha suma puede dividirse en dos contribuciones: una Suma de Cuadrados debida
a la Regresión (SSR) y una Suma de Cuadrados Residual (SSE).
141
Suma de Cuadrados Totales (SST) se obtiene sumando los cuadrados de las
desviaciones del valor observado en cada sistema Yi respecto de la media Y .
N
(
i =1
)
2
SST = ∑ Yi − Y
(6.9)
La Suma de cuadrados Totales tiene asociados N-1 grados de libertad ya que
existe la restricción
N
∑Y − Y = 0
(6.10)
i
i =1
Suma de Cuadrados debida a la Regresión (SSR) es una expresión de la
variación que resulta tomando en cuenta por un lado la relación de la variable
independiente con la dependiente a partir del modelo de regresión aplicado y por
otro lado la medición de la variable dependiente que se obtiene experimentalmente.
En otras palabras es la suma para N elementos de la población de los cuadrados de
la diferencia entre la media Y muestreal y el valor predicho del modelo Ŷi para una
corrida i.
(
SSR = ∑ Ŷi − Y
)
2
(6.11)
Los grados de libertad en este caso se definen a partir del número de
parámetros p que usa el modelo para relacionar la variable medida y la variables
independientes del experimento. Esta suma de cuadrados tiene asociados p-1 grados
de libertad.
Dividiendo la SSR por p-1 obtenemos la Media de Cuadrados debida a la
Regresión (MSR):
MSR =
SSR
p −1
(6.12)
Suma de Cuadrados Residual(SSE) es la variación debida a causas no
identificables y representa el error observado de las variables medidas (dado que el
modelo es correcto). Se define como la suma de los cuadrados de las diferencias
142
entre los valores medidos de N elementos de la población y los valores de los
mismos elementos tal como son predichos por el modelo.
N
(
SSE = ∑ Yi − Ŷi
i=1
) = ∑r
2
N
i
2
(6.13)
i=1
En el caso de la Suma de Cuadrados Residual se asocian N-p grados de
libertad
La SSE se usa para calcular la Media de Cuadrados Residual(MSE) al
dividirla por los grados de libertad asociados a ella, según la siguiente fórmula:
MSE =
SSE
N−p
(6.14)
Los residuales se usan para evaluar el ajuste del modelo a los valores
experimentales. La suma de los residuales de cada corrida teóricamente es siempre
cero, sin embargo, en la práctica puede no serlo exactamente pero debería
aproximarse.
Modelo de los parámetros de un ANOVA
Fuente
gl
DEBIDO A
LA REGRESION
RESIDUAL
TOTAL
p-1
N-p
Suma de Cuadrados
SSR
SSE
N-1
Media de cuadrados
SSR
MSR = 
p-1
SSE
MSE = 
N-p
SST
6.2.1- Test F de significación de la regresión
Un test que comunmente se realiza para verificar la significancia de la
regresión es el test F. Si el valor calculado de F > F tablas nos permite inferir que
143
la variación de la información explicada por el modelo o relación propuestos es
significativamente mayor que la variación debida a causas no identificables
(residuales) y que el efecto observado no se debió al azar . Es de destacar que los
test t-Student y F son esencialmente los mismos . Para un diseño completamente
aleatorio donde se estudian sólo dos tratamientos y dos test t a dos colas para
muestras independientes se verifica que:
F = t²
F=
MSR SSR (p − 1)
=
MSE SSE (N − p )
(6.15)
(6.16)
Una vez calculado el F se busca en las correspondientes tablas el valor de F
para el nivel de significación con el cual se trabaja para grados de libertad p-1 y N1.
El F de las tablas se compara con el F calculado. Si el valor del F calculado es
mayor que el de las tablas la hipótesis nula se rechaza para α nivel de significación,
y significa que por lo menos un parámetro de los que describen la regresión tiene
efecto sobre la respuesta. Cuanto más grande sea el F calculado mejor describirá la
regresión el modelo propuesto ya que también significa que aumenta la razón de la
varianza debida a la regresión sobre la viarianza debida a causas no identificables.
6.2.2 -Coeficiente de determinación (R2)
El coeficiente de determinación nos informa sobre la proporción de la
variación que existe entre los valores experimentales y lo propuesto por el modelo.
Es un estadístico que evalúa cuán bien se ajusta el modelo estadístico aplicado. En
la regresión, en particular, el coeficiente de determinación es una medida de cuánto
la linea de regresión se aproxima a los datos experimenteles. Su expresión
porcentual se da por la fórmula:
R2 =
SSR
⋅ 100
SST
(6.17)
144
También se usa el coeficiente de determinación ajustado por los grados de
libertad del modelo:
Raj2 = 1 −
SSE (N − p )
SST (N − 1)
(6.18)
Siempre se busca que tanto R2 como R2aj se acercan a lo posible al 100 ya
que es una medida del ajuste del modelo. Cabe añadir que por mucho que se
acerque el coeficiente de deteriminación al cien nunca lo será, ya que en este caso
se trabajaría sin error.
6.2.3 - Análisis de residuales
En el análisis de los residuales siempre se asume que los errores:
• son normalmente distribuídos con media igual a cero
• tienen varianza constante
• son independientes entre ellos
Existen herramientas gráficas y pruebas estadísticas se usan con fin de
comprobar la validez de las suposiciones recién mencionadas.
∧
6.2.3.1- Versus valores predichos, Yi
Se grafican los valores de los residuales (ri) versus los valores predichos por
el modelo. Dichos residuales no se grafican en función de los valores observados
(Yi) debido a que ambos grupos de valores están correlacionados. Debe observarse
una distribución uniforme horizontal de los residuales en torno a los valores
∧
predichos, Yi (homocedasticidad). Pueden manifestarse algunos comportamientos
anormales tales como los que se describen a continuación.
•
Si la varianza del modelo no es constante y se incrementa, es necesario
realizar un análisis de cuadrados mínimos especial o bien una
transformación (Ln (Y);
Y ; 1/Y; etc.) en la respuesta de interés :
145
ri
∧
Yi
•
Si el término independiente β0 no fue incluido en el análisis, la banda se
desplaza:
ri
∧
Yi
•
Si falta incluir algunos términos lineales y/o cuadráticos en el modelo
postulado la banda se curva:
ri
∧
Yi
Estas desviaciones, además de detectarse visualmente, pueden medirse
mediante parámetros definidos, los cuales no se detallarán en este apéndice.
146
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