Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional

Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología
Laboratorio de Biotecnología Molecular
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA
MANUAL DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
MOLECULAR
ELABORADO POR:
M. en C. Paola Berenice Zárate Segura
I. Bt. César A. Jiménez Sierra
México D. F. Abril 2009
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Laboratorio de Biotecnología Molecular
PRÁCTICA 1. BIOSEGURIDAD
DEFINICIONES OPERACIONALES
1) BIOSEGURIDAD: Debe entenderse como una doctrina de comportamiento
encaminada a lograr actitudes y conductas que disminuyan el riesgo del trabajador de la
salud de adquirir infecciones en el medio laboral. Compromete también a todas aquellas
otras personas que se encuentran en el ambiente asistencial, ambiente éste que debe
estar diseñado en el marco de una estrategia de disminución de riesgos.
Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:
A) Universalidad: Las medidas deben involucrar a todos los pacientes de todos los
servicios, independientemente de conocer o no su serología.Todo el personal debe seguir
las precauciones estándares rutinariamente para prevenir la exposición de la piel y de las
membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes,
estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal del
paciente.Estas precauciones, deben ser aplicadas para TODAS las personas,
independientemente de presentar o no patologías.
B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a sangre y
otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, mediante la utilización de
materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos.La utilización de
barreras (ej. guantes) no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero
disminuyen las consecuencias de dicho accidente.
C) Medios de eliminación de material contaminado: Comprende el conjunto de
dispositivos y procedimientos adecuados a través de los cuales los materiales utilizados
en la atención de pacientes, son depositados y eliminados sin riesgo.
LEY DE BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS
V. Bioseguridad: Las acciones y medidas de evaluación, monitoreo, control y prevención
que se deben asumir en la realización de actividades con organismos genéticamente
modificados, con el objeto de prevenir, evitar o reducir los posibles riesgos que dichas
actividades pudieran ocasionar a la salud humana o al medio ambiente y la diversidad
biológica, incluyendo los aspectos de inocuidad de dichos organismos que se destinen
para uso o consumo humano.
VI. Biotecnología moderna: Se entiende la aplicación de técnicas in vitro de ácido
nucleico, incluidos el ácido desoxirribonucleico (ADN y ARN) recombinante y la inyección
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directa de ácido nucleico en células u organelos, o la fusión de células más allá de la
familia taxonómica, que supera las barreras fisiológicas naturales de la reproducción o de
la recombinación y que no son técnicas utilizadas en la reproducción y selección
tradicional, que se aplican para dar origen a organismos genéticamente modificados, que
se determinen en las normas oficiales mexicanas que deriven de esta Ley. (LEY DE
BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS Nueva Ley
DOF 18-03-2005)
Principios de Bioseguridad
El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales
infecciosos en el medio ambiente del laboratorio donde son manipulados o conservados.
El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en
laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentespotencialmente
peligrosos.
La contención primaria, la protección del personal y del medio ambiente inmediato
del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos, es provista tanto mediante buenas
técnicas microbiológicas como a través del uso de equipos de seguridad adecuados. El
uso de vacunas puede brindar un mayor nivel de protección del personal. La contención
secundaria, la protección del medio ambiente externo al laboratorio de la exposición a
materiales infecciosos, se logra a través de una combinación del diseño de la instalación y
prácticas operativas. Por lo tanto, los tres elementos de contención incluyen prácticas y
técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación
del riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación
apropiada de estos elementos.
Equipos de Seguridad (Barreras Primarias).
Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes
cerrados, y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar las
exposiciones a materiales biológicos
peligrosos
Un ejemplo de otra barrera primaria es la cubeta centrífuga de seguridad, un
recipiente cerrado destinado a prevenir la liberación de aerosoles durante el centrifugado.
Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Secundarias)
El diseño y la construcción de la instalación contribuyen a la protección de quienes
trabajan en el laboratorio, proporcionan una barrera para proteger a las personas que se
encuentran fuera del laboratorio, y protegen a las personas o animales de la comunidad
de agentes infecciosos que pueden ser liberados accidentalmente del laboratorio.
Niveles de Bioseguridad. Existen cuatro niveles de bioseguridad (BSLs), que constan de
combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad e
instalaciones de laboratorio. Cada combinación es específicamente apropiada para las
operaciones llevadas a cabo, las vías de transmisión documentadas o sospechadas de
los agentes infecciosos, y la función o la actividad del laboratorio (tabla 1).
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Tabla 1. Niveles de bioseguridad recomendados para el trabajo con agentes infecciosos
NIVE
L
Grupo de
Riesgo
Agentes
Prácticas
Barrera Primaria
(Equipos)
I
Riesgo
Individual
Bajo, Riesgo
Comunitario
Bajo
Que no causen enfermedad
en individuos adultos
saludables (Cepas
silvestres)
Prácticas microbiológicas
comunes
Campana de flujo
laminar
Moderado
riesgo
individual,
Riesgo
comunitario
limitado
Asociados con enfermedad
en humanos, en donde haya
riesgo de infección por
heridas percutáneas,
ingestión y exposición de
membrana mucosa
(Shigella, Staphylococcus,
Sporotrix)
NBS 1. Acceso Limitado.
Deben utilizarse
señalamientos, se deben
tomar medidas de precaución
en material punzo cortante.
Debe contar con manual de
Bioseguridad definiendo
procedimientos y políticas de
confinamiento, desinfección
de zonas y materiales y
atención médica.
Gabinetes de
Bioseguridad Clase I
o II, equipo para
prevenir derrames o
difusión de
aerosoles. El
personal debe
utilizar Bata, guantes
y cubre bocas o
careta, de ser
necesario.
Alto riesgo
individual,
Bajo riesgo
comunitario
Agentes autóctonos o
exóticos con riesgo de
transmisión por aerosoles y
que causen enfermedades
serias o letales (Brucella,
Hystoplasma)
NBS 2. Acceso controlado.
Procedimientos rutinarios de
desinfección de ropa,
desechos y material previo al
lavado.
Todas las anteriores,
incluyendo
protección del
sistema respiratorio.
Alto riesgo
Individual,
Alto riesgo
Comunitario
Agentes peligrosos o
exóticos con alto riesgo de
causar enfermedad mortal
por transmisión por
aerosoles o agentes
similares con forma de
transmisión desconocida
(EBOLA, SARS, B. Antracis)
NBS 3. Ropa (trajes)
individuales, equipados en
cuartos previos al área de
trabajo. Regadera a la salida
del Laboratorio. Mecanismo
de descontaminación de el
área de trabajo.
Gabinetes de
Bioseguridad Tipo 3.
Trajes individuales
sellados con sistema
de respiración
autónomo y presión
de aire positiva
II
III
IV
NBS = Nivel de Bioseguridad
Barrera Secundaria
(Instalaciones)
Mesa de Laboratorio con
servicio de agua y drenaje.
NBS 1. Además, debe
existir autoclave.
NBS 2, Separación de los
corredores de acceso,
puertas dobles (sistema de
exclusa). Debe evitarse la
recirculación del aire.
Presión de aire negativa en
el área de trabajo
NBS 3. Debe ser una zona
aislada, con sistemas
individuales de obtención y
liberación de vacío,
sistema de suministro y
descontaminación de aire,
generador de energía
auxiliar.
Tipo de
Laboratorio
Enseñanza
Básica
Servicios de
salud, Hospital
de nivel primario,
laboratorios de
diagnóstico y
Laboratorios de
nivel
Universitario
Laboratorios de
Diagnóstico
Especializado.
Laboratorios que
trabajan con
agentes
patógenos
peligrosos
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Objetivo:
Informar y motivar a los alumnos sobre principios y normas de bioseguridad para su
aplicación activa en el trabajo de laboratorio
Actividades:
Actividad dinámica por los alumnos
Identificación y descripción de equipo en el laboratorio
Referencias
http://www.cdc.gov/od/ohs/pdffiles/bmbl4_spanish.pdf
LEY DE BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS Nueva
Ley DOF 18-03-2005
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PRÁCTICA 2. CUANTIFICACIÓN DE ADN
La cuantificación del ADN se puede estimar por visualización en geles de agarosa
en el que el ADN es teñido por algún colorante com Bromuro de Etidio, Syber Green o Gel
Red y mediante espectrofotómetro
La estimación de ADN por método espectrofotométrico a 260 mn y 280 nm en una
celda de cuarzo, para que la lectura sea adecuada se requiere la habilidad de medir de
manera exacta y reproducible, el transferir volúmenes pequeños de líquidos son críticos
para obtener resultados útiles. Para los volúmenes menores de 1 mL, el método más
común para medir líquidos requiere el uso de un dispositivo conocido como micropipeta.
Para el uso adecuado de la micropipeta asegúrese que está usando la micropipeta
correcta para el volumen que necesita. También, asegúrese que la micropipeta está
realmente lista para el volumen que necesita revisando la “ventana de volumen”, y, si es
necesario, cambiando el volumen mediante el “dispositivo” del control o mando del
volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la micropipeta no lee su mente;
varias personas usarán las pipetas, no siempre se encontrará como usted la necesita).
No Trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para
volúmenes menores del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta.
OBJETIVOS
Objetivo General
El alumno determinará la cantidad de ADN por método espectrofotométrico,
Objetivos específicos
Conocerá las partes y el funcionamiento de las micropipetas,
Adquirirá destreza en la utilización de pipetas para la medición de volúmenes
entre 1 y 1000 μL.
Determinará algunos límites de confianza para el uso de micropipetas
Cuantificará el ADN por espectrofotometría
MATERIALES
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
Agua desionizada
Balanzas granataria que detectan 0,0001 g
Tapas de cajas de petri de plástico
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Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µL)
ADN de concentración desconocida
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
MANEJO DE LA MICROPIPETA
1. Partes de micropipeta
2. Llenado de la pipeta
Colocar una punta según corresponda
Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado.
Oprimir el émbolo hasta el primer un punto de resistencia “alto” o "tope". Si continúa
presionando encontrará un punto donde el émbolo ya no se mueve hacia abajo, este
corresponde al segundo punto de resistencia “alto” o "tope".
Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta una
profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la presión del
émbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo abruptamente, al
permitirlo causará que el líquido pueda salpicar dentro de la punta produciendo
volúmenes inexactos y generando contaminación de la pipeta. Una vez el émbolo se haya
desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el líquido durante un segundo, esto
evita que se aspire aire en la parte final.
3. Expulsión de la muestra
Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL. Se apoya la punta en la pared
inferior del tubo. Oprima el émbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope.
Haga este procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rápido hará que queden
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gotas de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces notará que al oprimir
hasta el segundo alto se expele todo el líquido de la punta.
Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las soluciones
de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la micropipeta
transferirá volúmenes inexactos.
4. Calibración de Micropipeta
La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta
es un procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos.
En esta práctica aprenderá a usar la micropipeta de tamaños diversos medir su exactitud,
precisión y calibración.
Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación
(CV%) en todo el rango usando al menos dos volúmenes diferentes; por
ejemplo: Para la micropipeta P1000 revisar los volúmenes de 300 μL y 1000 μL. Para
P200 revisar los volúmenes de 60 y 200 μL. Para P10 revisar 3 y 10 μL.
1. Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.
2. Colocar la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero.
3. Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispénselo en la tapa de la
caja de petri. Registre el peso del agua añadido. La densidad del agua es 1 g/mL a 25 º C,
por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a una masa de 1 g, 300
μL a 0.3 g, 200 μL a 0.2 g, 60 μL a 0.06 g, 10 μL a 0.01 g y 3 μL a 0.003 g.
4. Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen.
5. Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de 1,2656
g/mL a 25 ° C. Calcular la masa esperada para cada volumen.
5. CALCULO DE LA EXACTITUD (E%) Y DEL COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV%)
Valor medio
X = Σ Xi /n donde
Xi= pesadas, n= numero de pesadas
Volumen medio
V=X.Z
donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad)
Valore del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032)
Exactitud
E(%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100
Desviación estándar
S = Z .  Σ(Xi – X)2
n–1
Coeficiente de Variación
CV= (S*100)/V
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Límites de tolerancia para micropipetas
Volumen (μL)
E% nominal
CV% nominal
5-10
20-50
100-1000
1
0.7
0.5
0.8
0.4
0.2
Una vez determinadas la exactitud y el coeficiente de variación de las micropipetas
proporcionadas, realice la cuantificación de las muestras proporcionadas.
CUANTIFICACIÓN DE ADN
6. Preparación de las muestras.
- Realice diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 de las muestras proporcionadas por triplicado
con agua Milli Q estéril, en tubos de polipropileno estériles.
- Encienda el espectrofotómetro al menos 15 minutos antes de iniciar las lecturas.
-Mantenga las muestras en hielo o en refrigeración hasta ser cuantificadas
-Cuantifique las muestras a 260 y 280mn
-Realice los cálculos correspondientes
Muestra
Dilución
Lectura 260
Lectura
280
Relación
260/280
ADN
(ng/µL)
ADN
(fg/µL)
ADN
(mg/µL)
ADN 1
ADN 2
Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
Molecular cloning
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PRÁCTICA 3. EXTRACCIÓN DE ADN
OBJETIVOS
Objetivo General
El alumno extraerá ADN de diferentes muestras por métodos físico-químicos
Objetivos específicos
Conocerá la metodología básica para extracción de ADN,
Adquirirá destreza la manipulación de diversas muestras.
Determinará la integridad del ADN por electroforesis en Agarosa
MATERIALES
Reactivos y Materiales
Acetato de Sodio (3 M)
Etanol absoluto
Etanol 70%
Fenol
Cloroformo
Agua desionizada
TE (pH 8.0)
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
Gradillas
Medio LB líquido
Termobloques
Tubos de polipropileno 1.5 mL
Centrifuga
Vortex
Muestras:
-E. coli
-Suelo
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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Condiciones de trabajo:
Uso de bata obligatoria, zapatos cerrados, cubreboca, guantes de látex o vinilo,
Extracción de ADN de E. coli
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
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10.
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12.
13.
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15.
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17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
Crecer E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche.
Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
Centrifugar el tubo a 7000 G durante 2 min.
Decantar el sobrenadante.
Agregar 250 L de agua desionizada estéril al paquete celular.
Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células
(aproximadamente 30 s).
Agregar 250 L de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).
Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
Agregar 250 L de cloroformo.
Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s.
Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 L) y colocarla en otro tubo de
1.5 mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este
precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar
la muestra e inhibir reacciones posteriores.
Agregar 225 L de cloroformo.
Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 L) y colocarla en otro tubo de
1.5 mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.
Agregar 20 L de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
Agitar en vortex 20 s.
Agregar 440 L de etanol Absoluto frío a la fase acuosa.
Centrifugar a 19000 G durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma
orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado.
Mientras se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de
agarosa.
Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del
experimento.
Agregar 500 L de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado, evitando resuspender
la pastilla.
Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del
experimento.
Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo,
hasta que todo el etanol haya sido evaporado.
Resuspender el ADN en 50 L de TE pH 7.8 o agua desionizada.
GUARDAR A -20°C DEPENDIENDO DEL AVANCE CONTINUAR
Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (práctica 4).
Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260
nm.
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Extracción de ADN de Suelo
29. Pesar 0.1 mg de suelo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
30. Agregar 250 L de agua desionizada estéril.
31. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células
(aproximadamente 30 s).
32. Agregar 250 L de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).
33. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
34. Agregar 250 L de cloroformo.
35. Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s.
36. Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
37. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 L) y colocarla en otro tubo de
1.5 mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este
precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar
la muestra e inhibir reacciones posteriores.
38. Agregar 225 L de cloroformo.
39. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
40. Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
41. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 L) y colocarla en otro tubo de
1.5 mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.
42. Agregar 20 L de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
43. Agitar en vortex 20 s.
44. Agregar 440 L de etanol Absoluto frío a la fase acuosa.
45. Centrifugar a 19000 G durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma
orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado.
Mientras se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de
agarosa.
46. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del
experimento.
47. Agregar 500 L de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado.
48. Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
49. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del
experimento.
50. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo,
hasta que todo el etanol haya sido evaporado.
51. Resuspender el ADN en 50 L de TE pH 7.8 o agua desionizada.
GUARDAR A -20°C DEPENDIENDO DEL AVANCE CONTINUAR
52. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (práctica 4).
53. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260
nm.
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CUANTIFICACIÓN DE ADN
Considerando 1Abs 260nm= 50 µg/µL
Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
Molecular cloning
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PRÁCTICA 4. CUANTIFICACIÓN DE ADN EN GEL DE ELECTROFORESIS
Una vez que se ha realizado la extracción de cualquier tipo de ácido nucleico es necesario
revisar la integridad y la cantidad del mismo, esto se efectúa mediante el corrimiento
electroforético en geles de agarosa o de poliacrilamida. La agarosa es más comúnmente
utilizada puesto que no es tóxica. Los geles son teñidos con diferentes colorantes para
visualizar el ADN. Los más comunes son: el bromuro de etidio, el nitrato de plata, y
recientemente el SYBR FAFE, Gel Red, Syber green, Syber Gold, etc. Después de ser
teñidos se visualizan utilizando un transiluminador o una lámpara UV.
OBJETIVOS
Objetivo General
El alumno determinará la cantidad de ADN por densitometría
Objetivos específicos
Adquirirá destreza el corrimiento de muestras en geles de agarosa
Cuantificará el ADN por densitometría
MATERIALES
Materiales y Reactivos
 Solución de Agarosa 0.5% w/v
 Solución para teñir ADN
 Regulador para electroforesis TBE 1X
 Regulador de carga 6x
 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
 Agua desionizada
 Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µL)
 Muestras de ADN
 Cámara de Electroforesis
 Fuente de Poder
 Marcador de Peso Molecular (100pb)
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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
1.
2.
3.
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5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Colocar 20 mL de TBE en un vaso de precipitado de 100 mL (para un volumen de gel
de 20 mL, si es mayor hacer los cálculos conservando la proporción de la
concentración del gel)
Agregar 100 mg de agarosa
Calentar en parrilla de calentamiento hasta fundir completamente
Adicionar 0.5L de reactivo para teñir ADN (Rojo Texas, Cyber green, etc.)
Mezclar
Verter la solución en una canastilla para electroforesis
Colocar el formador de pozos (peine) en la canastilla
Dejar gelificar (cubrir el gel con papel aluminio)
Colocar la canastilla adentro de la cámara de electroforesis
Agregar buffer de corrimiento (TBE)
Preparar las muestras a analizar (mezclar con regulador de carga, no más de 10 L
en total)
Colocar las muestras adentro de los pozos
Llevar a cabo la electroforesis a 100 V durante 30 a 45 min
Visualizar el gel en el transiluminador y cuantificar según instrucciones.
REFERENCIAS
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
Molecular cloning
ANEXOS
6x Gel-loading Buffer (Amortiguador de carga)
Azul de bomofenol 0.25% (w/v)
Glicerina en agua 30% (v/v)
TBE
Prepare una solución madre 5x en 1 litro deH2O
Tris base 54 g
Ácido Bórico 27.5 g
EDTA 0.5 M (pH 8.0) 20 ml
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PRÁCTICA 5. EXTRACCIÓN DE ARN
En una técnica sencilla de extracción de ARN, las células son homogenizadas en
tiocianato de guanidina y posteriormente purificado por fenol-cloroformo a pH reducido. El
rendimiento del ARN total extraído depende del tipo de muestra y generalmente esta en
un rango de 4-7 μg/mL iniciando de 5-10 μg de tejido o 106 células.
OBJETIVOS
Objetivo General
El alumno extraerá ADN de diferentes muestras por métodos físico-químicos
Objetivos específicos
Conocerá la metodología básica para extracción de ARN,
Adquirirá destreza en la manipulación de diversas muestras.
Determinará la integridad del ARN por electroforesis en gel de Agarosa
MATERIALES
Cloroformo : alcohol isoamílico (49:1, v/v)
Etanol
Isopropanol
Nitrógeno liquido
Fenol
Acetato de sodio (2 M, pH 4.0)
Solución D (solución desnaturalizante)
Agua desionizada
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
Gradillas
Termobloques
Tubos de polipropileno 1.5 mL
Centrifuga
Vortex
Muestras:
-E. coli
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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Condiciones de trabajo:
Uso de bata obligatoria, zapatos cerrados, cubre boca, guantes de látex o vinilo,
Extracción de ARN de E. coli
Muestra
1.
2.
3.
4.
Crecer E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche.
Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
Centrifugar el tubo a 12 000 rpm durante 2 min.
Decantar el sobrenadante.
Tratamiento de la muestra
1. Preparar las células o tejido
2. Colocar el tejido en un mortero estéril libre de RNAsas y adicionar Nitrógeno
líquido
3. Usando el pistilo macerar el tejido hasta obtener polvo fino
4. Transferir el macerado a un tubo nuevo estéril y adicionar 3 mL de solución D
5. Homogenizar 15-30 segundos a temperatura ambiente en un homogenizador (en
caso de no tener pasar el macerado en una jeringa de 1mL 3 veces)
6. Transferir el homogenizado a un tubo Nuevo y adicionar 0.1 mL de Acetato de
sodio 2M, 1mL de fenol y 0.2 mL de cloroformo-alcohol isoamílico por cada
mililitro de solución D.
7. Mezclar en el Vortex vigorosamente por 10 s e incubar en hielo por 15 minutos
8. Centrifugar a 9000 rpm por 20 minutos a 4°C
9. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo
10. Adicionar un volumen de isopropanol e invertir el tubo 5 veces para mezclar e
incubar a -20°C mínimo 1 hr
11. Centrifugar a 10,000g (9000 rpm) por 30 minutos a 4°C
12. Cuidadosamente decantar y disolver el ARN en 0.3 mL de la solución D.
13. Adicionar un volumen de isopropanol e incubar 1 h a -20°C
14. Centrifugar 10 minutos a 4°C
15. Decantar y adicionar un volumen de etanol al 70%
16. Centrifugar a máxima velocidad durante 3 minutos.
17. Adicionar 50-100 μl de H2O. Almacenar la solución de ARN a -70°C.
18. Estimar la concentración de ARN por lectura a 260nm y correr 5µL en un gel de
agarosa al 1% (práctica 4)
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Anexos
Solución D
4 M Tiocianato de guanidina
25 mM citrato de sodio
0.5% (w/v) Lauril sarcosianato de sodio
0.1 M -mercaptoetanol
Disolver 250 g de tiocianato de guanidina en 293 ml de H2O, 17.6 ml de 0.75 M de citrato
de sodio(pH 7.0), y 26.4 ml de 10% (w/v) lauril sarcocianato de sodio. En una parrilla a
65°C mezclar los ingredientes con ayuda de agitación magnética, guardar a temperatura
ambiente y adicionar 0.36 ml de 14.4 M mercaptoetanol por cada 50 mL de la solución D
justo antes de usar.
Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
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PRÁCTICA 6. Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina
OBJETIVOS
Objetivo General
El alumno extraerá ADN plasmídico.
Objetivos específicos
Conocerá la metodología básica para extracción de ADN plasmídico.
Determinará la integridad del ADN plasmídico por electroforesis en gel de Agarosa.
MATERIALES
Soluciones
Solución de lisis alcalina I
Solución de lisis alcalina II
Solución de lisis alcalina III
Ampicilina
Etanol
Fenol:cloroformo
TE (pH 8.0)
Medios
Cajas con LB ampicilina
Cajas con medio LB
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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Condiciones de trabajo:
Uso de bata obligatoria, zapatos cerrados, cubreboca, guantes de látex o vinilo,
METODOLOGÍA
1. Inocular 2 mL de medio rico LB ampicilina con una colonia con plásmido. Incubar toda
la noche a 37°C con agitación.
2. Centrifugar a velocidad máxima por 30 segundos los 2 mL del cultivo a temperatura
ambiente.
3. Remover el sobrenadante dejando la pastilla libre del medio.
4. Resuspender la pastilla en 100 μL de solución Alcalina I fría, mezclar vigorosamente
con ayuda del vortex.
5.Adicionar 200 μL de solución de lisis II recién preparada, cerrar el tubo y mezclar
invirtiendo el tubo cinco veces, “No usar vortex”. Poner el tubo en hielo
6.Adicionar 150 μL de solución alcalina III fría, cerrar el tubo e invertir el tubo cinco veces
para mezclar. Guardar el tubo en hielo 3-5 minutos (NO CONGELAR).
7. Centrifugar a máxima velocidad por cinco minutos a 4°C. Transferir el sobrenadante a
un tubo limpio.
8. Adicionar un volumen de fenol : cloroformo (1:1 v/v), mezclar en vortex y centrifugar a
velocidad máxima por 2 min a 4°C. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
9. Precipitar el ADN plasmídico con adición de 2 volúmenes de etanol absoluto, incubar a
-20ºC 20 minutos.
10. Centrifugar a máxima velocidad 5 minutos a 4°C.
11. Remover el sobrenadante.
12. Adicionar 1 mL de etanol al 70% (cuidar no resuspender la pastilla), centrifugar a
máxima velocidad por 2 minutos a 4°C.
13. Remover el sobrenadante e invertir el tubo sobre una superficie limpia para permitir
que la pastilla quede lo más seca posible.
14. Resuspender la pastilla en 50 μL de agua desionizada estéril, guardar a -20°C.
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Anexos
Solución de lisis alcalina I
50 mM glucosa
25 mM Tris-Cl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
Guardar a 4°C
Solución de lisis alcalina II
0.2 N NaOH
1% (w/v) SDS
Preparar la solución al momento.
Solución de lisis alcalina III
5 M acetato de potasio, 60.0 mL
Ácido acético glacial, 11.5 mL
H2O, 28.5 ml
Guardar a 4°C
Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
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PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un vector plasmídico.
La ligación de fragmentes de interés en plásmidos ha sido una metodología presente en
casi todos los estudios que tienen que ver con técnicas de Biología Molecular. Se han
utilizado este tipo de sistemas como el pUC 19 linearizado con enzimas de restricción
específicas, una vez hecho esto se realiza una reacción de ligación plásmido-inserto con
la enzima ligasa.
Objetivo General
El alumno realizará la inserción de material genético dentro de un vector
plasmídico.
Objetivos específicos
Conocerá la metodología básica para cortar un vector por medio de enzimas de
restricción.
Conocerá la metodología básica para insertar material genético de interés dentro
de un plásmido previamente tratado con enzimas de restricción.
MATERIALES
-
Plásmido
Enzimas de restricción
Material genético de interés (máximo xxx pdb).
T4 ADN Ligasa
Buffer de restricción.
Buffer de Ligación.
Termo-Bloque
MÉTODO
A. Restricción
1.
2.
3.
4.
5.
Adicionar n
profesor.
Incubar a la temperatura indicada para la enzima durante 30 min en el termobloque.
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B. Ligaciòn
6. Colocar 2 L de buffer de ligación en un tubo estéril.
7.
T4 ADN ligasa.
8. Añadir (x
9. Agregar (x
10.
11. Incubar a 22ºC durante 2 horas en el termobloque.
12. Almacenar a -20ºC hasta el momento de su uso.
Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
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PRÁCTICA 8. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).
La Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener más de 10
millones de copias de una cadena de ADN de interés a partir de pocas moléculas de ésta.
La sensibilidad de ésta técnica requiere de cuidados para que la muestra no esté
contaminada previamente con otras cadenas de ADN que pudieran generar amplificados.
Existen numerosas técnicas que emplean la PCR (RAPD, RFLP, RTPCR) con
diferentes aplicaciones en campos de diagnóstico, criminología, e investigación.
Objetivo General
Obtener un producto amplificado por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR).
Objetivos específicos
Conocerá la metodología básica para amplificar una cadena de interés por medio
de la reacción en cadena de la polimerasa.
Identificará la correcta o incorrecta inserción de una cadena de interés en un
vector en base al tamaño del amplificado por medio de PCR.
MATERIALES
-Termociclador.
-ADN molde
-Tubos de polipropileno de 200 µL.
-Oligonucleótidos iniciadores (primers): sentido y anti sentido
-Taq DNA polimerasa
-Micro pipetas de diferentes capacidades (1000-100, 200-20 y 10-0.5 µL
-10X PCR buffer
-MgCl2
-dNTPs: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP.
MÉTODO
1. En condiciones de esterilidad colocar dos tubos de polipropileno de 200µL de
capacidad en hielo.
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2. Adicionar lo que se indica en la tabla 1.
Tabla 1. Reacción en cadena de la Polimerasa
Concentración final
Muestra (µL) Control negativo(µL)
ADN
10pg-1 µg
1 µL*
-----
Iniciador Sentido 10 µM
0.1-1 µM
2.5 µL
2.5 µL
Iniciador Antisentido10 µM
0.1-1 µM
2.5 µL
2.5 µL
Amortiguador PCR 10X
1X
5 µL
5 µL
25 mM MgCl2
1-4 mM
6 µL*
6 µL*
dNTPs
0.2 mM de cada uno
5 µL
5 µL
27.6 µL *
28.6 µL *
0.2 µL**
0.2 µL**
Agua MilliQ estéril
Taq polimerasa (5U/ µL)
1.25 u / 50 µL
*El volumen depende de la concentración final requerida.
** Se coloca al final en la reacción en frío.
3. Mezclar y bajar en el tubo (centrifugar unos segundos en caso de ser necesario)
4. Colocar en el termociclador con el siguiente programa:
a) 95ºC 2 min
b) 95°C 30s (desnaturalización),
c) 55°C 30 s (alineamiento),
d) 72°C 1 min (elongación)
e) Repetir los pasos b a d 30 veces
f) 72ºC 4 min.
g) 4ºC (refrigerar hasta el momento de uso)
5. Correr el amplificado en gel de agarosa por electroforesis durante 30 – 45 minutos.
Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
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PRÁCTICA 9. Método para hacer células competentes de Escherichia coli con CaCl2
Uno de los pasos cruciales en cualquier metodología de Biología Molecular es la
obtención de células competentes, listas para poder sobre producir el gen de interés
insertado en un plásmido. El método para hacer células competentes por cloruro de calcio
es uno de los más rutinarios y eficientes, además de ser extremadamente barato.
OBJETIVOS
Objetivo General
El alumno aprenderá a hacer células competentes de Escherichia coli con
CaCl2.
Objetivos específicos
Conocerá la metodología básica para de hacer células competentes de
Escherichia coli con CaCl2.
Determinará la vialbilidad de hacer células competentes de Escherichia coli con
CaCl2.
MATERIALES
-
CaCl2 (0.1 M)
Espectrofotómetro
Gradillas para tubos
Hielo
Medio LB líquido
Micropipetas de 200 μL y 1000 μL
Puntas para micropipetas de 200 μL y 1000 μL
Termo-bloques
Tubos de polipropileno 1.5 mL estériles
Ultracentrífuga
MÉTODO
1.
2.
3.
4.
5.
Incubar E. coli a 37°C por 16 horas en placas de agar LB
Inocular 100 mL de medio LB e incubar a 37°C con agitación, hasta que la densidad
óptica a 590 nm sea de 0.3 a 0.4 (aproximadamente 3 horas)
Transferir 45 mL de células a un tubo de propileno frío y estéril y mantenerlo por 10
min a 4°C.
Centrifugar a 6000 rpm por 4 min
Decantar el sobrenadante
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6.
7.
8.
9.
10.
Resuspender el paquete celular en 5 mL de CaCl2 estéril (0.1 M, frío)
Colocar el tubo en hielo durante 10 min a 4°C.
Centrifugar a 6000 rpm por 4 min a 4°C.
Decantar el sobrenadante
Resuspender el paquete celular en 1 mL de CaCl2 estéril (0.1 M, frío). En este
momento se pueden guardar la células competentes a -70ºC o se puede proseguir
con el protocolo de transformación.
Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
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PRÁCTICA 10. Transformación de células competentes
La ligación de fragmentes de interés en plásmidos ha sido una metodología presente en
casi todos los estudios que tienen que ver con técnicas de Biología Molecular. Se han
utilizado este tipo de sistemas como el pUC 19 linearizado con enzimas de restricción
específicas, una vez hecho esto se realiza una reacción de ligación plásmido-inserto con
la enzima ligasa.
Objetivo General
El alumno realizará la transformación de de células competentes con vector
plasmídico.
Objetivos específicos
Conocerá la metodología básica para transformar células competentes con un
vector plasmídico
Determinará la transformación de células competentes de Escherichia coli con
CaCl2.
MATERIALES
-
Células competentes
Incubadora
Placas de agar LB-Ampicilina
Reacción de PCR
Termo-Bloque
plásmido
MÉTODO
C. Muestra
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Adicionar 4 L de reacción de PCR a un tubo de polipropileno.
Adicionar 1 L del buffer de ligación.
Adicionar 1 L del Plásmido.
Mezclar la reacción suavemente.
Incubar por 16 h a 4°C.
Adicionar todo el contenido del tubo a un tubo que contiene células competentes.
Mezclar el tubo suavemente.
Incubar a -20ºC durante 20 min.
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21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
Colocar el tubo en un baño o Termo-bloque a 42ºC durante 1 min.
Colocar el tubo a -20ºC durante 2 min.
Adicionar 800 L de medio LB.
Colocar el tubo en un baño o un Termo-bloque a 37ºC durante 1 hora.
Agregar 200 L en una placa con medio LB Ampicilina
Espátular las células.
Incubar la caja durante 16 horas a 37ºC
D. Control de viabilidad y control negativo
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
Colocar 200 L de células competentes.
Mezclar el tubo suavemente.
Incubar a -20ºC durante 20 min.
Colocar el tubo en un baño o Termo-bloque a 42ºC durante 1 min.
Colocar el tubo a -20ºC durante 2 min.
Adicionar 800 L de medio LB.
Colocar el tubo en un baño o un Termo-bloque a 37ºC durante 1 hora.
Agregar 200 L en una placa con medio LB Ampicilina y 200 L a una caja LB
Espátular las células.
Incubar la caja durante 16 horas a 37ºC
Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
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PRÁCTICA 11. Western Blot.
El western blot es una técnica inmuno enzimática utilizada en biología molecular para la
detección de proteínas en muestras crudas o extractos celulares. Esta técnica tiene
múltiples aplicaciones, tanto en el área de investigación como en la de diagnóstico clínico,
en donde es utilizada ya sea independiente o conjuntamente con ELISA.
La técnica consiste en realizar la separación de las proteínas de la muestra por
electroforesis en del de poli acrilamida (PAGE) y posteriormente transferirlas a una
membrana, ya sea por gravedad, difusión o un campo eléctrico.
Una vez en la membrana, la proteína es identificada mediante un inmunoensayo, en
donde se liga a la proteína de interés un anticuerpo específico contra ella ligado a una
enzima, la cual permite la detección.
Objetivo General
El alumno conocerá y realizará la técnica de westtern blott para detección de
antigeno o anticuerpo.
Objetivos específicos
Conocerá la metodología básica para correr un SDS-PAGE
Conocerá la metodología básica para realizar una electrotransferencia.
Conocerá la metodología básica para detectar proteínas por medio de un
inmunoensayo.
MATERIALES
-
Plásmido
MÉTODO
E. Tratamiento de la muestra.
38. A una muestra de concentración conocida de proteína (ya sea antígeno o anticuerpo)
39.
40. Incubar en baño maría a ebullición durante 5 minutos.
-mercaptoetanol.
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B. Preparación del Gel.
41. Se limpia con etanol al 70% las placas de vidrio para remover contaminantes.
42. Colocar las placas de vidrio y los separadores en la base para preparar el gel.
43. Preparar el gel separador de acuerdo a lo indicado en la tabla 1 del anexo,
adicionando el persulfato e amonio y el temed al final.
44. Vaciar el gel separador en los vidrios evitando la formación de burbujas, y
alcanzando un nivel 3cm por debajo del borde superior. Dejar polimerizar por 20 a 30
minutos.
45. Preparar el gel concentrador de acuerdo a la tabla 2 del anexo.
46. Vaciar en la parte superior y colocar el peine, evitando la formación de burbujas.
Dejar polimerizar por 20 a 30 minutos.
C. Montaje de la cámara de electroforesis y corrimiento del gel.
47. Montar las placas de vidrio conteniendo el gel en su base, y esta en la cámara.
48. Preparar amortiguador decorrida 1x.
49. Llenar con amortiguador de corrida la cámara interna hasta el límite y la externa
hasta cubrir los electrodos.
50. Retirar con cuidado el peine.
de peso molecular en los pozos.
51. Colocar la tapa de la cámara y conectar a la fuente de poder.
52. Correr a 50 V mientras las muestras se encuentren en el gel concentrador.
53. Correr a 100 V una vez alcanzado el gel separador y hasta que el frente de corrida
alcance el final del gel.
54. Detener la fuente de poder, recuperar el amortiguador de corrida y desmontar la
cámara.
55. Cuidadosamente recuperar el gel de los vidrios y colocar en amortiguador de
transferencia.
NOTA: En caso de existir un duplicado del gel, este puede ser teñido para observar el
corrimiento del gel antes de proseguir con la siguiente etapa.
D. Montaje de la cámara de electro transferencia y electro transferencia.
56. Incubar fibras scotch y papel whatmann (0.16 mm de espesor) en amortiguador de
transferencia 30 min. antes de iniciar el montaje de los cartuchos.
57. Cortar la membrana de nitrocelulosa a un tamaño ligeramente mayor al de los geles.
Este procedimiento debe ser llevado a cabo con guantes. Colocar en un recipiente
con amortiguador de transferencia.
58. Colocar el gel sobre la membrana de nitrocelulosa, y cuidadosamente, marcar sobre
la membrana, con lápiz, el frente decorrida y el número de carril del gel.
59. Para el armado de los cartuchos se colocan dos fibras scotch, dos papeles filtro, el
gel, la membrana de nitrocelulosa, dos papeles filtro más y dos fibras scotch más.
Hay que eliminar cualquier burbuja que se forme al ir adicionando las diferentes
capas.
60. Colocar el cartucho en la cámara de electrotransferencia de manera que el gel quede
hacia el ánodo (-) y la membrana hacia el cátodo (+).
61. Llenar la cámara con amortiguador de transferencia hasta el nivel indicado.
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62. Cerrar la cámara, conectar a la fuente de poder y transferir a 100 V por una hora,
cuidando que la temperatura del amortiguador no sobrepase los 60ºC.
63. Al terminar la transferencia, recuperar, con guantes, la membrana del cartucho.
NOTA: En caso de tener duplicado de la membrana, teñir una de ellas para observar
la transferencia de las proteínas antes de proseguir con el siguiente paso.
E. Reacción inmunoenzimática
64. Colocar la membrana de nitrocelulosa en un recipiente, y agregar l solución de
bloqueo, de manera que cubra completamente la membrana. Incubar 2 horas a
temperatura ambiente con agitación continua.
65. Retirar la solución de bloqueo y realizar 3 lavados con PBS-Twen de 5 min. cada
uno, con agitación continua.
66. Incubar la membrana con la solución de proteína complementaria a aquella en la
membrana (si se tiene antígeno en la membrana, incubar con solución e anticuerpo, y
viceversa) durante 2 horas.
67. Retirar la solución de proteínas y repetir el paso 28.
68. Se adiciona a la membrana la solución de avidita – HRP (peroxidada de rábano) y se
incuba por 2 horas con agitación continua.
69. Retirar la solución de conjugado y repetir el paso 28.
70. Se incuba la membrana en la solución de cromógeno / sustrato en agitación continua
hasta que aparezcan las bandas.
71. Se enjuaga la membrana con agua desionizada y se deja secar.
Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
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ANEXO I
Tabla 1. Gel separador (para un volumen de 15 mL)
Sol. stock (mL) / Conc. gel (%)
5
6
7
8
9
10
12
13
15
Sol. Acrilamida – bisacrilamida
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
6.0
6.5
7.5
Amortiguador pH 8.8
3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
Agua desionizada
8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75
Persulfato de amonio
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED
0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
Tabla 2. Gel concentrador (para un volumen de 2 mL)
Sol. Acrilamida – bisacrilamida
0.26 mL
Amortiguador pH 6.8
0.5 mL
Agua desionizada
1.22 mL
Persulfato de amonio
0.01 mL
TEMED
0.02
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%
Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) más 0.8 g de bis-acrilamida. Disolver en agua
bidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco ámbar a 4°
C. Usar guantes al pesar ya que la acrilamida es un compuesto neurotóxico.
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
Amortiguador del gel separador pH 8.8
Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar
el pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.

Amortiguador del gel separador pH 6.8
Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el
pH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.

Amortiguador de corrida 5X / SDS
Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada
y aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.

Amortiguador de muestra pH 6.8
Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y
ajustar el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el
volumen a 100 mL.

Persulfato de amonio al 10%
Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mínimo necesario.

Solución de azul de bromofenol 10 mg/mL
Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardar
en refrigeración.

Solución teñidora
Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de ácido acético y 40 mL de
agua desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Coomassie en el
metanol y adicionar el ácido acético. Aforar con el agua desionizada.

Solución desteñidora
Para preparar 500 mL se usan 25 mL de ácido acético, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de
agua desionizada.

Amortiguador de transferencia
(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2
M y agregar 14.49 g de glicina, añadir 200 mL de metanol, aforar a 1000 mL con agua
bidestilada. Guardar a 4 ºC. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de la
calidad del tris, el metanol debe ser grado analítico, este amortiguador se puede usar
hasta 3 veces, después de cada uso filtrar con papel Whatman nº 1.

Solución salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)
Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl.
Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solución de PB
se prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobásico monohidratado y 11.5 g de fosfato
de sodio dibásico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L con
agua desionizada.
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
Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)
A un litro de PBS pH 7.2 añadir 500 µL de Tween 20.

Solución de bloqueo.
Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20.
Guardar a –20 °C.

Rojo de Ponceau 0.2% en ácido tricloroacético 3%
Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y añadir 3 g de ácido tricloroacético. Aforar a 100 ml
con agua desionizada. Mantener a 4° C en frasco color ámbar.

Solución cromógeno / sustrato
Pesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, añadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de PBS,
agregar 25 l de peróxido de hidrógeno al 3%. Nota: esta solución se prepara
inmediatamente antes de usarla.
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ANEXO II
PURIFICACIÓN DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE
AMONIO.
INTRODUCCIÓN.
Tiselius y Kabat demostraron que la actividad de anticuerpos está principalmente presente
en la fracción gamma de las proteínas del suero. Desde entonces se han diseñado
diferentes métodos para la obtención de esta fracción sérica.
Los anticuerpos pueden purificarse por métodos específicos e inespecíficos. Los métodos
específicos se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos para reaccionar con sus
antígenos. Así, los anticuerpos pueden ser precipitados por la adición del antígeno en
estado soluble, o ser adsorbidos al antígeno previamente insolubilizado. En ambos casos,
el complejo resultante puede disociarse por modificación del pH a valores entre 2.5 y 4.0 ó
9.5 y 11.0, o bien por aumento en la concentración de sales o la concentración del
antígeno soluble. Después, los anticuerpos se recuperan por alguno de los métodos de
separación inespecífica.
Las separaciones inespecíficas están basadas en las propiedades fisicoquímicas de los
anticuerpos. Entre estos métodos, los más utilizados son la precipitación con etanol, con
sulfato de amonio o sulfato de sodio, electroforesis en diversos soportes (papel, acetato
de celulosa, gel de almidón, etc.), cromatografía de intercambio iónico y filtración en
tamices moleculares.
Uno de los métodos inespecíficos más empleados de purificación de gamma globulina es
la precipitación con sulfato de amonio a una concentración final de 33%. Generalmente,
se considera que con tres precipitaciones se obtiene una gamma globulina con un alto
grado de pureza.
La precipitación de la gamma globulina por este método se debe al fenómeno conocido
como “salting out”, el cual consiste en que las moléculas de agua que solvatan a la
molécula de anticuerpo son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que además
neutralizan los grupos cargados de la proteína, con lo que se insolubiliza y precipita.
OBJETIVO.
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Purificar gamma globulinas de conejo y de humano por precipitación con sulfato de
amonio a una saturación final del 33% y detección por medio de un gel de SDS-PAGE.
MATERIALES Y MÉTODO.
Material por grupo:
1 centrífuga clínica.
6 agitadores magnéticos
5.0 mL de BaCI2 al 10%.
1 parrilla con agitación.
Material por equipo:
10 mL de suero de conejo
10 mL de suero de humano.
20 mL de solución sobresaturada de sulfato de amonio.
5.0 mL de NaOH 2N.
50 mL de solución de salina al 0.85% (SS), pH 7.8.
20 mL de salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8.
Papel indicador de pH.
Tubo para diálisis.
10 cm de hilo grueso.
2 tubos falcón de 15 mL, graduados.
2 vasos de p.p. de 100 mL
2 pipetas serológicas de 5.0 mL.
1 pipeta serológicas de 1.0 mL.
2 pipetas Pasteur y bulbo de hule.
1 matraz Erlenmeyer de 25 mL.
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Método:
1. Ajustar a 7.8 el pH de la solución saturada de sulfato de amonio, con NaOH 2N.
2. Adicionar a un volumen de suero, contenido en un vaso de p.p., medio volumen de la
solución sobresaturada de sulfato de amonio, LENTAMENTE Y CON AGITACIÓN
CONSTANTE. De esta forma, el sulfato de amonio queda a una saturación final del 33%.
3. Continuar con la agitación durante 10-15 min después de terminar la adición del sulfato
de amonio.
4. Traspasar el contenido del vaso de p.p. a un tubo falcón y centrifugar los tubos a
temperatura ambiente a 3500 rpm durante 15 min.
5. Decantar y disolver el sedimento en SS pH 7.8, hasta alcanzar el volumen original del
suero.
6. Repetir los pasos 2, 3, 4 y 5.
7. Repetir nuevamente los pasos 2, 3 y 4.
8. Disolver en SSRB el sedimento después de la última centrifugación hasta alcanzar la
mitad o un tercio del volumen original del suero.
9. Dializar contra SSRB en frío (4° C) y con agitación, durante 2 días, realizando 2
cambios diarios de solución de diálisis hasta eliminar completamente al sulfato de amonio.
Para saber si efectivamente se eliminó el sulfato de amonio, a 5.0 mL de la solución de
diálisis se le agregan unas gotas de cloruro de bario al 10%. La diálisis se considera
completa si ya no se observa la formación de un precipitado blanco de sulfato de bario.
10. Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y centrifugar en frío a 2500 rpm
durante 10 min para eliminar el precipitado que se hubiera formado.
11. Guardar las gamma globulinas para la separación de isotipos.
12. Determinar la concentración de proteínas por el método de Bradford.
13. Correr un gel de SDS-PAGE para observar las gamma globulinas.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
Campbell, D.H.; Garvey, LS.; Cremer, N.E.; Sussdorf, D.H. 1970. Methods in Immunology.
2. ed. W.A. Benjamin. Editor.
Kabat, E.A.; Mayer, M.M. 1968. Inmunoquímica Experimental. 1a. ed. Editorial La Prensa
Médica Mexicana.
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PRÁCTICA 12. Inmuno ensayo Ligado a enzimas (ELISA)
El inmunoensayo enzimático, conocido como ELISA por sus siglas en inglés (enzyme
linked immunosorbant assay) fue descrito en 1971 por Engvall y Perlman.
En este método se utilizan anticuerpos conjugados a una enzima. El anticuerpo conserva
su capacidad de unión específica al antígeno, mientras la enzima es capaz de catalizar
una reacción de oxido-reducción, en la cual el sustrato se transforma en un producto
colorido. En este sistema el antígeno o el anticuerpo se adsorbe a una fase sólida
insoluble (micro pozos, tubos o perlas de polivinilo o estireno)
Existen diversas variantes del método de ELISA, como son los métodos directo, indirecto
y en “sándwich”, y el método de ELISA competitivo. Estos permiten la determinación de
antígenos en fluidos biológicos, a excepción del método indirecto con que se detectan
anticuerpos.
En los métodos directos, el anticuerpo dirigido específicamente contra el antígeno es el
que lleva unida la enzima. En cambio en los métodos indirectos, el conjugado enzimaanticuerpo reacciona con el primer anticuerpo, el cual ya reaccionó con el antígeno. En el
método de sándwich, el conjugado antígeno anticuerpo reacciona con el antígeno que se
ha unido antes a un primer anticuerpo, adsorbido a la fase sólida. El o los componentes
que no reaccionaron se eliminaron por lavados; por último se adiciona el sustrato de la
enzima y se mide la intensidad del color desarrollado, el cual es proporcional a la
magnitud de la reacción antígeno-anticuerpo.
El método de ELISA tiene aplicaciones muy variadas, lo cual lo hace muy versátil:
diagnóstico de enfermedades infecciosas, virales o parasitarias, cuantificación de
hormonas, cuantificación de haptenos, titulación de anticuerpos en bajas concentraciones,
determinación de anticuerpos no precipitantes.
Objetivo General
El alumno conocerá y realizará la técnica de ELISA para detección de antígeno o
anticuerpo.
Objetivos específicos
Conocerá la metodología básica para adsorber antígenos en micro placas de
ELISA.
Ligará antígenos o anti anticuerpos conjugados a antígenos adsorbidos en placas
de ELISA.
Determinará la presencia del antígeno deseado por la reacción de una enzima
conjugada a anticuerpo.
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MATERIALES
Estufa regulada a 37 °C.
Placas de ELISA de poliestireno. (fase sólida)
Antígeno “H” u “O”, solución al 5% en solución salina 0.85%.
Pipetas automáticas de 20-200 ml
Anticuerpo anti-IgG purificado y conjugado con HRP
Suero humano control positivo y suero humano control negativo
Sustrato: 4 mg de orto-fenilen diamina, 4 ml de H2O2 al 30% (v/v) en 10 ml de regulador de citratos
0. XM pH 5.0
Regulador de bloqueo: 0.25 % de gelatina ó 2% de albúmina sérica bovina (BSA), en regulador de
fosfato borato sal (PBS) 0.1M pH 9.6
Regulador de lavado: regulador de salina-fosfatos 0.01M pH 7.2 adicionado de 0.05% Tween 20.
Diluyente del suero (PBSG): regulador de salina-fosfatos 0.01M, pH 7.2 adicionado de 0.25% de
gelatina.
MÉTODO
Método de ELISA indirecto.
1. Adicionar 0.2 ml de antígeno en los pozos de poliestireno. Incubar la placa a 4°C durante 24
horas para permitir la adsorción del antígeno a la fase sólida.
2. Eliminar las soluciones por inversión de la tira de pozos, y desechar el líquido remanente
sacudiendo fuertemente la tira sobre papel absorbente.
3. Lavar los pozos con 0.1 ml de solución de lavado. Dejar los pozos llenos con esta solución
durante 3 minutos. Al cabo de este tiempo, eliminar la solución de la manera descrita en el
paso 2. Repetir dos veces más con el fin de eliminar todo el antígeno no adsorbido.
4. Bloquear con 0.1 ml de una solución de 0.25% de BSA en PBS e incubar los pozos a 37°C
durante 30 min para permitir el bloqueo de los sitios a los que no se adsorbió el antígeno.
5. Repetir el paso 2.
6. Adicionar 0.1ml de los sueros control negativo, positivo y problema uno en cada pozo. Si lo
requiere puede hacer diluciones del suero. Incubar a 37°C durante 30 minutos para permitir la
reacción antígeno-anticuerpo.
7. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de suero que no reaccionó.
8. Adicionar 0.1ml de conjugado diluido en PBSG, a todos los pozos. Incubar a 37°C durante 30
min. Para permitir que el conjugado reaccione con los anticuerpos humanos que se hayan
unido al antígeno en la fase sólida.
9. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de conjugado que no haya reaccionado.
10. Adicionar 0.1 ml de una solución recién preparada del sustrato de la enzima: H2O2 al 0.04% en
regulador de salina-fosfatos pH 5.0 y adicionado de ortofenilendiamina al 0.04% (como
cromógeno). Incubar en oscuridad para permitir la reacción enzimática y el consecuente
desarrollo de color (Nota: el cromógeno es fotosensible)
11. Detener la reacción enzimática adicionando 12 l de H2SO4 8N en cada pozo.
12. Determinar la presencia o ausencia del antígeno de interés contra los controles de manera
visual, o de contarse, con un lector de placas de ELISA.
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Referencias
1. Avrameas S. (1971) Immunochemistry 6:43
2. Kemeny D. M. (1991) A practical Guide to ELISA. Pergamon Press. Oxford. Pp 21-215.
3. Voller A., Bidwell D.E. y Bartlett A. (1979) The enzyme linked immunosorbet assay (ELISA). A
guide with abstracts of microplate application. Dynatech Laboratories, Inc.
4. Profesores del Departamento de Inmunología (1992) Manual de Prácticas de Inmunología.
ENCB, IPN pp.47-51.
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PRÁCTICA 13. Transformación de plántulas de tabaco (Nicotiana tabacum) mediada
por Agrobacterium tumefaciens
La transformación de plantas es una técnica que permite la inclusión de ADN de
interés dentro el genoma de una planta. Esto puede realizarse por diversas técnicas,
como son la bobalística, electroporación, microinyección o por Agrobacterium
tumefaciens.
El empleo de plantas sobre bacterias para la producción de proteínas de interés
presenta ciertas ventajas. Una de las principales es la capacidad de las plantas para
hacer modificaciones post traduccionales en las proteínas de interés, ya que al ser
organismos eucariontes, poseen la maquinaria celular necesaria para estos procesos.
Sin embargo, también presentan desventajas. Entre ellas el hecho de poseer
diferentes tejidos. Debido a esto, si la transformación no está bien dirigida, el producto de
interés puede ser sintetizado en órganos u organelos no deseados, dificultando de esta
manera la recuperación y purificación del producto.
Agrobacterium es un simbionte natural de las plantas. Se vale de las heridas en las
plantas, para infestarlas, y de esta manera aprovechar la maquinaria celular de la planta
para sintetizar los metabolitos que requiere. Agrobacterium cuanta con el plásmido Ti, que
introduce en la planta para desencadenar ciertos procesos que permiten la invasión de la
planta por parte de la bacteria.
Objetivo General
El alumno obtendrá plántulas te tabaco (Nicotiana tabacum) transformadas por
Agrobacterium tumefaciens.
Objetivos específicos
Conocerá la metodología básica para obtener explantes de plántulas de tabaco.
Conocerá la metodología para transformar explantes por medio de A. tumefaciens.
Conocerá la metodología básica para seleccionar explantes transformados.
Conocerá la metodología básica para regenerar plántulas a partir de explantes.
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MATERIALES
-
Plásmido
Enzimas de restricción
MÉTODO
F. Preparación de materiales (Día 1)
1. En una placa de agar LB antibióticos sembrar por estría simple la cepa de
Agrobacterium tumefaciens e incubar a 28ºC por 24 horas.
2. Preparar 5 placas petri y esterilizarlas.
3. Preparar 200 ml dem medio MS estéril.
4. Preparar 10 cajas de petri con papel filtro whatmann en su interior.
5. Preparar 20 cajas de medio NBM estéril.
6. Preparar 20 cajas de medio NBM antibióticos estéril.
G. Propagación de Agrobacterium (Día 2).
7. Tomar una colonia de A. tumefaciens e inocular 5 ml de LB antibióticos, incubar en
agitación a 28ºC por 24 horas.
C. Propagación de Agrobacterium (Día 3).
A. tumefaciens e inocular 50 ml de LB antibióticos. Incubar
en agitación a 28ºC por 24 horas.
D. Recuperación de la cepa (Día 4).
9. Centrifugar el cultivo de A. tumefaciens a
10. Decantar y resuspender la pastilla en 5 ml de MS0.
7500
rpm
por
10
min.
E. Cosecha de explantes.
11. Disectar las hojas de plántulas axénicas de tabaco.
12. Colocar las hojas en las cajas estériles conteniendo papel filtro.
13. Obtener explantes de 0.5 cm x 0.5 cm aproximadamente con hojas de bisturí estériles.
14. Recuperar los explantes e incubar en la suspensión de A. tumefaciens por 30 minutos.
F. Siembra y Recuperación de explantes.
15. Recuperar los explantes, secar en papel filtro estéril y colocar en las cajas con medio
NBM con la epidermis inferior hacia arriba (haz en contacto con le medio).
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16. Incubar los explantes a 25ºC con un fotoperiodo de 16h luz durante 5 -7 días.
18. Transferir los explantes resistentes a kanamicina (aqueyos que no hayan muerto o se
ANEXO
Medio Luria Bertani (LB) Antibióticos.
Extracto de Levadura
Triptona de Caseína
Cloruro de Sodio
Medio Base Murashigue y Skoog (MS)
MS I ( Macronutrientes )
mg/L
NH4NO3
1650
KNO3
1900
CaCl2.2H2O
440
MgSO4.7H2O
370
KH2PO4
170
MS II ( Micronutrientes )
IK
0.83
H3BO3
6.2
MnSO4.4H2O
22.3
ZnSO4.7H2O
8.6
NaMoO4.2H2O
0.25
CuSO4..5H2O
0.025
CoCl2.6H2O
0.025
MS III ( Fe- EDTA )
EDTA
37.3
FeSO4.7H2O
27.8
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MS0
Medio Base MS
Sacarosa
pH
30 g/L
5.5
MSB5
Medio MS0
Inositol
Piridoxina
Tiamina
Ácido Nicotínico
pH
1 mg/L
0.1 mg/L
2 mg/L
0.1 mg/L
6
NBM
Medio MSB5
Ácido Naftalen Acético (NAA)
Benzil Aminopurina (BAP)
pH
0.1 mg/L
1 mg/L
5.9
Referencias
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed
Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.