tesis para formato pdf - Pontificia Universidad Javeriana
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VALIDACION E IMPLEMENTACION DE UNA METODOLOGIA PARA EL ANALISIS MICROBIOLOGICO DE UN PRODUCTO LÍQUIDO PRESERVADO ELABORADO EN UNA INDUSTRIA FARMACEUTICA AUTOR DIANA SOFIA ORTIZ GOMEZ PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA D.C. 10 DE ENERO DE 2008 1 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. 2 VALIDACION E IMPLEMENTACION DE UNA METODOLOGIA PARA EL ANALISIS MICROBIOLOGICO DE UN PRODUCTO LÍQUIDO PRESERVADO ELABORADO EN UNA INDUSTRIA FARMACEUTICA AUTOR DIANA SOFIA ORTIZ GOMEZ APROBADO ________________________ ________________________ Ana Maria González Acero Jannet Arias P Microbióloga Industrial Bacterióloga MSc Director Asesor ________________________ ________________________ Cindi C. Fernandez Jasmin Rivera Cantillo Microbióloga Industrial Química Farmacéutica Jurado Jurado 3 VALIDACION E IMPLEMENTACION DE UNA METODOLOGIA PARA EL ANALISIS MICROBIOLOGICO DE UN PRODUCTO LÍQUIDO PRESERVADO ELABORADO EN UNA INDUSTRIA FARMACEUTICA AUTOR DIANA SOFIA ORTIZ GOMEZ APROBADO ________________________ ____________________________ Angela Umaña MPh Jannet Arias Palacios. MSc Decana Académica Director de Carrera Microbiología 4 AGRADECIMIENTOS Agradezco infinitamente a Dios por estar presente en mi vida cada segundo, colocando siempre las personas mas indicadas para sacar adelante todos mis proyectos. Gracias a mi familia, a mi mamá sobre todo por la confianza y el eterno amor con que me ha apoyado SIEMPRE. A cada una de las personas de Merck S.A. cumplimiento de mi trabajo de grado. 5 Quienes fueron parte importante para el TABLA DE CONTENIDO Página 1 INTRODUCCION 1 2 MARCO TEORICO 2 2.1 Calidad en la Industria Farmacéutica 2 2.2 Control de Calidad 4 2.3 Buenas practicas de manufactura (BPM) 4 3 CONCEPTOS DE VALIDACIÓN 5 3.1 VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ALTERNATIVOS 5 3.2 TIPOS DE VALIDACIÓN 5 3.2.1 Validación Prospectiva 5 3.2.2 Validación Concurrente 6 3.2.3 Validación Retrospectiva 6 3.2.4 Revalidación 7 3.3 TIPOS DE PRUEBAS MICROBIÓLOGICAS 7 3.4 PARAMETROS A VALIDAR EN UNA PRUEBAS CUALITATIVA 7 3.4.1 Especificidad 8 3.4.2 Límite de Detección 8 3.4.3 Tolerancia 8 3.4.4 Robustez 8 6 3.5 PARAMETROS A VALIDAR PARA LA ESTIMACIÓN CUANTITATIVA DE MICROORGANISMOS VIABLES EN UNA MUESTRA 8 3.5.1 Exactitud 9 3.5.2 Precisión 9 3.5.3 Especificidad 10 3.5.4 Límite de Cuantificación 10 3.5.5 Linealidad 10 3.5.6 Límite de Detección 10 3.5.7 Intervalo 10 3.5.8 Tolerancia 10 3.5.9 Robustez 11 3.6 PRESERVANTES 11 3.6.1 PRESERVANTES CONTENIDOS EN EL PRODUCTO A VALIDAR 11 3.6.1.1 Metil-Parabeno 11 3.6.1.2 Descripción 12 3.6.1.3 Propiedades. 12 3.6.1.3.1 Actividad antimicrobiana 12 3.6.1.3.2 Incompatibilidad 13 3.6.1.3.3 Seguridad 13 3.6.2 Propilparabeno 14 3.6.2.1 Descripción 14 3.6.2.2 Propiedades 15 7 3.6.2.2.1 Actividad antimicrobiana 15 3.6.2.2.2 Incompatibilidad 16 3.6.2.2.3 Seguridad 16 4 FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 17 5 OBJETIVOS 18 5.1 Objetivo General 19 5.2 Objetivos Específicos 19 6 MATERIALES Y METODOS 19 6.1.1 Método cuantitativo para Recuento de Bacterias Mesofilos Aerobios y Recuento de Hongos y Levaduras 19 6.1.2 Método cualitativo Ausencia o Presencia de Escherichia coli 19 6.2 MATERIALES Y MÉTODOS CUANTITATIVOS 19 6.2.1 Medios de cultivo y reactivos 19 6.2.2 Estándares 20 6.3 METODOLOGIA 20 6.3.1 Preparación de inóculos Bacterianos 20 6.3.2 Preparación de inóculo Levadura 21 6.3.3 Preparación de inóculos Hongo Filamentoso 21 6.3.4 Preparación del Placebo (Medio Cultivo + Producto) 22 6.3.5 Preparación del Estándar 22 6.3.6 Preparación del Ensayo 22 6.3.7 Siembra 22 8 6.4 METODOLOGIA PARAMETROS CUANTITATIVOS 23 6.4.1 EXACTITUD (USP 30, 2007) 23 6.4.2 PRECISIÓN (USP 30, 2007) 23 6.4.2.1 Precisión del método 23 6.4.2.2 Precisión intermedia (Repetibilidad) 24 6.4.3 SELECTIVIDAD (USP 30, 2007) 24 6.4.4 ROBUSTEZ (USP 30, 2007) 24 6.5 MATERIALES Y MÉTODOS CUALITATIVOS 25 6.5.1 Reactivos y medios de cultivo 25 6.5.2 Estándares 25 6.6 METODOLOGÍA 26 6.6.1 Preparación del inóculo bacteriano 26 6.6.2 Preparación del Placebo (Medio Cultivo + Producto) 26 6.6.3 Robustez 26 6.6.4 Linealidad 27 6.6.5 Límite de detección 27 6.6.6 Especificidad 27 7 RESULTADOS Y DISCUSION 29 7.1 Verificación de Calibración de equipos utilizados en la Validación 29 7.2 Estandarización 29 7.2.1 Estandarización de curva 29 9 7.2.3 Estandarización de la Metodología 29 7.3 RESULTADOS PARAMETROS CUANTITATIVOS 30 7.3.1 Selectividad 30 7.3.2 Exactitud 34 7.3.2.1 Recuento de Bacterias Mesófilas Aerobias 34 7.3.2.2 Recuento de Mohos y Levaduras 37 7.3.3 Precisión 42 7.3.3.1 Precisión del Sistema 42 7.3.3.2 Precisión del método 43 7.3.3.3 Precisión Intermedia (Entre Analistas y entre días) 46 7.3.3.3.1 Precisión Entre Analistas. Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias 48 7.3.3.3.2 Precisión Entre Días. Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias 48 7.3.3.3.3 Precisión Entre Analistas. Recuento de Mohos y Levaduras 48 7.3.3.3.4 Precisión Entre Días. Recuento de Mohos y Levaduras 48 7.3.4. Robustez 50 7.4. RESULTADOS PARÁMETROS CUALITATIVOS 54 7.4.1 Linealidad 54 7.4.2. Limite de detección y especificidad 57 7.4.3. ROBUSTEZ 61 8. CONCLUSIONES 65 9. RECOMENDACIONES 66 10 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67 68 ANEXOS 11 INDICE DE TABLAS Página 1 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Bacillus subtilis ATCC 6633 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 30 2 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Escherichia coli ATCC 8739 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 31 3 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Staphylococcus aureus ATCC 6538 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 31 4 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 32 5 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Salmonella enterica ATCC 14028 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 32 6 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Aspergillus niger ATCC 16404 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 33 7 (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Selectividad 33 8 (%) Porcentaje de Recuperación de Bacterias Mesofilas Aerobias 35 9 (%) Porcentaje de Recuperación de Mohos y Levaduras 38 10 11 12 Promedios de los Recuentos de los microorganismo estándares: Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Precisión del Sistema. Promedios de los Recuentos de los microorganismo estándares: Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Precisión del método. Promedios de los Recuentos del microorganismo estándar: Staphylococcus aureus ATCC 6538 en la prueba Cuantitativa de Precisión del Intermedia. 12 42 44 47 13 Promedios de los Recuentos del microorganismo estándar: Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Precisión de Intermedia. 49 14 Robustez para el ensayo de Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias con la variación de Incubadora Memmert TV-30. 51 15 Robustez para el ensayo de Recuento de Mohos y Levaduras con la variación del medio de cultivo: Agar PDA 52 16 Concentración Vs UFC/mL para el microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. Parámetro Cualitativo: Linealidad. 54 17 Concentración Vs UFC/mL para el microorganismo Staphylococcus aures ATCC. Parámetro Cualitativo: Linealidad. 55 18 Concentración Vs UFC/mL para el microorganismo Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Parámetro Cualitativo: Linealidad. 56 19 Parámetro Cualitativo: Límite de Detección. Microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. 58 20 Parámetro Cualitativo: Límite de Detección. Microorganismo Staphylococcus aureus ATCC 6538. 58 21 Parámetro Cualitativo: Límite de Detección. Microorganismo Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. 58 22 Parámetro Cualitativo: Especificidad Microbiana. 60 23 Parámetro Cualitativo: Robustez. Para el Microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. 62 13 TABLA DE GRAFICAS Página GRAFICA 1 Curva de Regresión para el microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. Parámetro Cualitativo: Linealidad. 54 GRAFICA 2 Curva de Regresión para el microorganismo Sthapylococcus aureus ATCC 6538. Parámetro Cualitativo: Linealidad 55 GRAFICA 3 Curva de Regresión para el microorganismo Pseudomonas aeruginosa ATCC. Parámetro Cualitativo: Linealidad 56 14 RESUMEN En la presente tesis se desarrollo la validación e implementación de una metodología para el análisis microbiológico de un producto liquido preservado con parabenos, elaborado en una industria farmacéutica; basándose en las técnicas de análisis propuestas por la United States Pharmacopeia versión XXX año 2007. Para el desarrollo de la presente validación se procedió a trabajar con un producto farmacéutico líquido preservando con metilparabeno y propilparabenos, preservantes utilizados en las formulaciones de industrias farmacéuticas. Para el desarrollo de la validación se trabajo con microorganismos estándares sugeridos por la USP 30.2007; para los ensayos cuantitativos se trabajo con Staphylococcus aureus ATCC6538 y Candida albicans ATCC10231. Para los ensayos cualitativa se trabajó con Escherichia coli ATCC8739, Staphylococcus aureus ATCC6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027. Los resultados obtenidos estuvieron conforme a los esperados basándose en la teoría y con la metodología seguida de la Pharmacopea. The United States Phamacopeia logrando obtener resultados que dan cumplimiento a los criterios establecidos por la USP 30.2007. Confiriendo así la aprobación de la validación de la técnica de análisis microbiológico para el control de calidad de un producto liquido preservado, elaborado en un laboratorio farmacéutico. Se obtuvo una metodología exacta con un porcentaje de recuperación mayor del 70%, con la capacidad de ser específica para los diferentes microorganismos ensayados, evidenciando así la aptitud de la técnica para detectar un panel de microorganismos. La metodología descrita en este trabajo presento ser precisa evidenciando coeficientes de variación menores 35%; comprobando la metodología propuesta presenta un grado de coincidencia entre los resultados de las pruebas individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente por un mismo o diferente analista y aun metodología en días diferentes. 15 cuando se aplica la También se demostró ser robusta al indicar coeficientes de variación menores al 15% siendo sometida la técnica a variaciones como lo fueron el cambio de incubadora para el recuento bacteriano y el uso de un agar nutritivo diferente para el recuento de mohos y levaduras Se constata que la técnica posee la capacidad de detectar el microorganismo patógeno Escherichia coli ATCC9637 mostrando crecimientos proporcionales a las concentraciones establecidas en el parámetro de linealidad y también evidenciando el numero mas bajo de células viables en una muestra bajo condiciones experimentales establecidas como lo presento en el parámetro de limite de detección. Por tanto la metodología descrita se considera reproducible y robusta al tener la capacidad de no ser afectada por variaciones al desarrollar la técnica, generando así resultados confiables y precisos. 16 ABSTRACT In the present tesis, the validation and implementation of a methodology for microbiological analysis of a liquid product preserved with parabenos were developed. The analyzed product was produced by a pharmaceutical company, based on the analysis methods proposed by the United States Pharmacopeia, version XXX, year 2007. A liquid pharmaceutical product, preserved with metilparabeno and propilparabenos used by pharmaceutical companies, was used for the development of this validation. Standard microorganisms suggested in the USP 30.2007 were used during the validation work for carrying out quantitative tests for Staphylococcus aureus and Candida albicans , and qualitative tests for Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. The results were in agreement with those expected according to the theory and to the methodology followed from the United States Pharmacopeia, and therefore the obtained results were in compliance with the criteria established by the USP 30.2007. methodology, specific for each different microorganism, An accurate was achieved with recovery percentages that exceeded 70%. The methodology showed to be accurate, evidencing variation coefficients lower than 35%. It also proved to be robust since it showed variation coefficients lower than 15% when it was subject to different variation tests (individual tests, multiple tests, change of culture media, change of incubators, retesting performed by different analysts, and application of the methodology in different dates). It was proved that the methodology has enough acid properties to detect the patogen microorganism Escherichia coli, showing growths that were proportional to the etablished linearity concentrations; It was also evidenced that the lowest number of viable cells in a sample under pre-established experimental conditions was obtained, such as it was shown in the parameter of limit of arrest (detection limit). Consequently, the above described methodology is considered reproducible and robust because it has proven not to be affected by variations during the method development, therefore generating accurate and reliable results. 17 INTRODUCCION En la actualidad se ha generado una gran aceptación e interés por los temas relacionados con seguridad y calidad de los productos farmacéuticos, teniendo presente que estos son productos vitales dentro de la asistencia de la salud. Es por esto que día a día se recurre a la implementación de nuevas tecnologías y fórmulas farmacéuticas con el fin de desarrollar sistemas rigurosos de calidad que proporcionen y aseguren al consumidor un producto de alta calidad que cumpla con las especificaciones. Adicionalmente, la industria farmacéutica debe velar por el total cumplimiento de la normatividad nacional e internacional en casos de exportación de fármacos, teniendo presente que los procedimientos deben estar validados para su implementación y cumplimiento de la legislación, en el caso de la industria farmacéutica colombiana la normatividad se basa principalmente en BPM, FDA y USP. La validación de un proceso toma gran relevancia en el mismo, ya que es la demostración escrita y experimental con un alto grado de confianza que un transcurso específico arrojará de forma consistente y permanente productos que poseerán las características de calidad predefinidas. Para lograr obtener una producción de fármacos que cumpla con los requerimientos del consumidor se deben evaluar muchos aspectos importantes que intervienen en dicha producción como lo son la infraestructura, procedimientos, documentación y procesos como muestreo, fabricación, análisis y evaluación de todos los factores que intervienen en el proceso productivo, asegurando que sean bajo las condiciones que garantizan que los materiales y productos son liberados para su uso, venta o suministro con un alto nivel de calidad que ha sido juzgado como satisfactorio. La evaluación de calidad microbiológica de materias primas, material de envase y/o un producto farmacéutico terminado, juega un papel importante dentro de las características que le confieren la calidad a un fármaco, ya que la valoración de los microorganismos presentes reflejara la calidad de los mismos y el proceso de producción al cual fueron sometidos. Es indispensable conocer las especificaciones microbiológicas de cada uno de los productos farmacéuticos a analizar, ya que el recuento total de microorganismos presentes, o la ausencia o presencia de determinados microorganismos patógenos en el 18 producto pueden conferirle la conformidad o no al producto final, con el objetivo de liberar siempre productos de alta calidad que no atenten contra el paciente y/o pueda presentar carga microbiana que afecte las características fisicoquímicas del producto. Por lo anterior resulta útil la implementación y la validación de la técnica de análisis microbiológico para un producto liquido preservado, para así asegurar que el procedimiento utilizado para el recuento total de microorganismos y la Ausencia/Presencia de Escherichia coli, es el adecuado en el control de calidad del producto farmacéutico mencionado. 2. MARCO TEORICO 2.1 Calidad en la industria farmacéutica En la industria farmacéutica, existen aspectos fundamentales como lo son la infraestructura, procedimientos y procesos, necesarios para garantizar la producción de fármacos que cumplan con todos los requerimientos del consumidor, están convocadas dentro del sistema de garantía de calidad, la cual se caracteriza por ser una herramienta administrativa que apoya las diferentes etapas de producción generando así mismo productos de alta calidad y reconocimiento ante sus clientes. Los conceptos de garantía de la calidad, BPM, y control de la calidad constituyen aspectos de la administración de la calidad que se relacionan entre sí. (WHO, 1999) El desarrollo de la industria farmacéutica ha determinado que se realicen los mayores esfuerzos para optimizar los procesos productivos y los sistemas de control con el fin de garantizar que los productos farmacéuticos obtenidos son confiables y cumplen satisfactoriamente los requerimientos farmacológicos y terapéuticos. (Montalvo, 1989) 2. 2. Control De Calidad El control de calidad es una parte de las Buenas Practicas de Manufactura que agrupa las normas acerca de organización, documentación y procesos como muestreo, fabricación, análisis y evaluación de todos los factores que intervienen en el proceso productivo, asegurando que cada proceso es llevado a cabo bajo las condiciones que garantizan que los materiales y productos son liberados para su uso, venta o suministro con un alto nivel de calidad que ha sido juzgado como satisfactorio. El control de calidad no esta confinado a 19 operaciones de laboratorio, debe estar involucrado en todas las decisiones concernientes a la calidad del producto. (WHO, 1999) Debe existir un departamento de control de calidad independiente del departamento de producción, que permita realizar evaluaciones objetivas en pro del mejoramiento continuo. Los requerimientos básicos para el control de calidad son: a. Instalaciones adecuadas, personal entrenado y procedimientos aprobados. Los documentos deben encontrarse disponibles para cada etapa del proceso de calidad, muestreo, inspección y evaluación de materias primas, materiales de empaque, granel y producto terminado; y donde sea apropiado cuando se realiza monitoreo de condiciones ambientales para los propósitos de las buenas prácticas de manufactura. b. Los métodos de ensayo deben ser validados c. Los registros deben ser hechos demostrando que todos los muestreos, inspecciones y procedimientos de ensayo requeridos están siendo llevados a cabo y que cualquier desviación ha sido totalmente registrada e investigada. d. Los productos terminados deben ser evaluados para asegurar que contienen la composición cualitativa y cuantitativa de los componentes descritos en su envase de comercialización; los componentes deben ser de la pureza requerida, adquiridos de proveedores calificados, en recipientes adecuados y correctamente etiquetados. e. Los registros deben ser una fiel reproducción de los hechos, de los resultados de la inspección de producto terminado, granel e intermedio contra las especificaciones. La evaluación del producto debe incluir una revisión e inspección de la documentación y una evaluación de las desviaciones de los procedimientos especificados f. Los lotes de producto no pueden ser liberados para la venta o suministrados sin antes obtener la certificación del personal autorizado que esta acorde con los requerimientos de comercialización. g. Una muestra suficiente de materias primas y productos, deben ser retenidos para permitir la evaluación futura de estos, si fuera necesario; el producto retenido debe ser guardado en su empaque final. 20 El departamento de control de calidad como un todo, debe tener otras obligaciones tales como establecer, validar e implementar todos los procedimientos de control de calidad a evaluar, mantener y almacenar los estándares de referencia para sustancias; asegurar el correcto etiquetado de recipientes de materias y productos; asegurar que la estabilidad de los ingredientes activos y los productos estén monitoreados; participar en quejas relacionadas con la calidad del producto y participar en el monitoreo ambiental. Todas estas operaciones deben ser llevadas a cabo en concordancia con los procedimientos y registros escritos. La evaluación de producto terminado debe abarcar todos los factores relevantes, incluyendo las condiciones de producción, los resultados de inspección en proceso, la documentación de manufactura incluyendo el empaque, el cumplimiento con la especificación para el producto terminado y una evaluación del empaque final. (WHO, 1999). De esta forma el control de calidad se puede definir como el sistema que tiene como finalidad lograr una producción uniforme para colocar en el mercado productos cuyas especificaciones correspondan a lo ofrecido, siendo el elemento que en las plantas industriales favorece el incremento de la eficiencia y productividad. (Montalvo, 1989) 2.3. Buenas Prácticas De Manufactura (BPM) Buenas practicas de manufactura son una herramienta del aseguramiento de calidad mediante la cual se confirma o asegura que los productos están consistentemente controlados y producidos con estándares de calidad apropiados para su uso planeado y como es requerido para su comercialización. Las BPM son dirigidas primariamente a disminuir riesgos inherentes en cualquier etapa de la producción farmacéutica, que puedan alterar la calidad del producto final. La principal finalidad es llegar a la prevención de dos tipos principales de riesgo: Contaminación cruzada y confusiones causadas por mal etiquetamiento en los contenedores o recipientes. (WHO, 1999) 21 3. CONCEPTOS DE VALIDACION 3.1. VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ALTERNATIVOS La validación de un método microbiológico es un proceso importante para la implementación de una técnica analítica microbiológica, ya que por medio de la validación de dicho método se logra establecer de forma experimental que las características de desempeño del método cumplen con los requisitos para la aplicación prevista. (USP XXX, 2007) Para la recuperación e identificación microbiana, en análisis microbiológicos, son ajustadas a veces a métodos alternativos a los descritos en la USP por diversas razones, tales como económicas, de producción y conveniencia. Por tanto estos métodos requieren validación. (USP XXX, 2007) En los estudios de validación de métodos microbiológicos alternativos es importante tener en cuenta un importante grado de variabilidad. Cuando se llevan a cabo pruebas microbiológicas por conteo en placa convencional, el cual es el método a escogido para el presente trabajo; se puede llegar a encontrar resultados con porcentajes de desviación estándar relativa de 15 a 35 ya que muchos métodos microbiológicos convencionales están sujetos a errores de muestreo, de dilución, de incubación y del operador. (USP XXX, 2007) La importancia de la validación de las técnicas analíticas en el análisis de un producto es gran utilidad e importancia ya que ante todo es parte esencial de las BPM´v (Buenas Practicas de Manufactura Vigentes) ya que es una forma certera y consistente de afirmar cuando un proceso esta conforme, es exacto y reproducible. También es un gran aporte a la reducción de costos y la optimización de procesos ya que las técnicas se desarrollan con eficacia, rapidez y seguridad, disminuyendo el tiempo muerto en equipos. 3.2. TIPOS DE VALIDACION 3.2.1. Validación Prospectiva Este tipo de validación se basa en información obtenida antes de implementar los procesos de validación. Se realiza durante la etapa de desarrollo, mediante un análisis de riesgos del proceso de producción, que se divide en pasos individuales, estos se evalúan entonces a la 22 luz de la experiencia para determinar si podría concluir a situaciones criticas; se investigan posibles causas y se determina la probabilidad de que suceda y su magnitud, se trazan los planes de ensayo y se fijan las prioridades; a continuación se efectúa y se evalúan los ensayos y se hace una valoración general; si los resultados son aceptables al final, el procesos es satisfactorio. Los procesos no satisfactorios se deben modificar y mejorar hasta que una nueva validación demuestre su carácter satisfactorio. Este tipo de validación es importante para limitar el riesgo de errores que se producen a escala de producción, por ejemplo, en la preparación de productos inyectables. (Comisión Europea, 2001) 3.2.2. Validación Concurrente La información requerida en este tipo de validación se obtiene durante la implementación del mismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de la variable critica que demuestre que el proceso esta bajo control y el riesgo de datos sobre la marcha de los procesos en estado productivo. (Comisión Europea, 2001) Para otros autores la validación concurrente es el establecimiento de evidencia documentada para demostrar que un proceso cumple con su propósito, basados en información obtenida durante la implementación del mismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las variables criticas que demuestren que el proceso esta bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en estado productivo. Este es el tipo de validación aplicado al trabajo en curso. (Rojas.1997) 3.2.3. Validación Retrospectiva Este tipo de validación se lleva a cabo por medio de la revisión y análisis de la información histórica del proceso. Se deben tomar como mínimo 20 a 30 lotes que cuenten con reportes analíticos sólidos y confiables, documentación que muestre condiciones de los procesos y estudios de reclamos de los productos, entre otros. Dentro de este tipo de validación es necesario tener en cuenta el control de la materia prima, controles ambientales, controles microbiológicos, equipos, procedimientos, métodos analíticos y especificaciones; es aplicada para productos que se encuentran en el mercado y cuyo proceso de manufactura se considera estable, además cuando por las características del producto, económicamente no se justifica hacer una validación prospectiva. La validación retrospectiva también puede ser útil en el establecimiento de las prioridades en un programa de validación (Comisión Europea, 2001) 23 3.2.4. Revalidación Es la repetición de un procedimiento de validación o en parte del mismo. Se aplica cuando se presentan cambios de algunos de los componentes críticos de la formulación, cambio o reemplazo de una pieza critica en un sistema o equipo, cambio de instalaciones, cambio del tamaño del lote de fabricación y por unidades producidas fuera de especificaciones (Comisión Europea, 2001) 3.3. TIPOS DE PRUEBAS MICROBIÓLOGICAS Existen tres tipos principales de determinaciones propias de las pruebas microbiológicas, entre las que se incluyen pruebas para determinar si los microorganismos están presentes en una muestra (Ausencia/ Presencia), pruebas para cuantificar el número de microorganismos (o Recuento de microorganismos presentes en la muestra) y pruebas destinadas a identificar microorganismos. Este trabajo se basara en la determinación de Ausencia o Presencia de un microorganismo Bacilo Gram. Negativo (Escherichia coli) y la prueba de cuantificación de microorganismos presentes en la muestra, esto basado en la especificación analítica del producto farmacéutico. (USP XXX, 2007) El método de recuento en placa es el método escogido para la estimación del número de microorganismos viables presentes en una muestra. Teniendo en cuenta que existen otros métodos también usados como lo son el método de filtración por membrana y el Método del Numero Más Probable (NMP). 3.4. PARAMETROS A VALIDAR EN UNA PRUEBAS CUALITATIVA Con el fin de evaluar y demostrar la existencia de microorganismos viables en una muestra se deben tener en cuenta los parámetros descritos a continuación, aunque es importante tener presente que no todas las características son aplicables a cada procedimiento analítico o a cada material. Ello depende en gran medida del propósito al cual se desea aplicar el procedimiento. 24 3.4.1. Especificidad La especificidad de un método microbiológico es la capacidad, para detectar una gama de microorganismos que pueden estar presentes en la muestra. Este problema se enfrenta de manera adecuada a través de la promoción del crecimiento en los medios para métodos cualitativos que dependen del crecimiento para demostrar la presencia o ausencia de microorganismos. (USP XXX, 2007) 3.4.2. Límite de Detección El limite de detección es el número más bajo de microorganismos en una muestra que puede detectarse bajo las condiciones experimentales establecidas. (USP XXX, 2007) 3.4.3. Tolerancia La tolerancia de un método microbiológico cualitativo es el grado de precisión de los resultados de la prueba obtenidos mediante el análisis de las mismas muestras bajo diversas condiciones normales de prueba, tales como el empleo de analistas, instrumentos, lotes de reactivos y laboratorios diferentes. Se puede definir tolerancia como la resistencia intrínseca a influencias ejercidas por variables operativas y ambientales sobre los resultados del método microbiológico. (USP XXX, 2007) 3.4.4. Robustez La robustez de un método microbiológico cualitativo es la medida de su capacidad para no ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del método, representa un indicador de su confiabilidad durante uso normal. (USP XXX, 2007) 3.5. PARAMETROS A VALIDAR PARA LA ESTIMACIÓN CUANTITATIVA DE MICROORGANISMOS VIABLES EN UNA MUESTRA Existen dos técnicas disponibles y convenientes para datos microbiológicos. Los datos crudos de los recuentos pueden transformarse en datos normalmente distribuidos, ya sea tomando el valor del Log, para ese recuento o calculando la raíz cuadrada del recuento ±1. Esta última transformación es especialmente útil silos datos contienen recuentos de cero. (USP XXX, 2007) 25 3.5.1. Exactitud La exactitud es la proximidad de los resultados de la prueba obtenidos mediante el método de prueba respecto a los obtenidos por el método tradicional. Usualmente, la exactitud se expresa como el porcentaje de la recuperación de los microorganismos mediante el método de valoración. (USP XXX, 2007) La exactitud de un procedimiento empleado consiste en la proximidad de los resultados obtenidos al valor real. La exactitud puede determinarse aplicando el procedimiento a las muestras del material a examinarse, cuando han sido preparadas con exactitud cuantitativa. Siempre que sea posible, esas muestras deben contener todos los componentes del material, incluyendo el analito. Deben prepararse también muestras en las que el analito haya sido incorporado en cantidades de aproximadamente 10% por encima y por debajo de la gama de valores prevista. También es posible determinar la exactitud comparando los resultados con los obtenidos empleando otro procedimiento ya comprobado. (OMS, 1996) 3.5.2. Precisión La precisión de un método microbiológico cuantitativo es el grado de coincidencia entre los resultados de las pruebas individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a muestreos múltiples de suspensiones de microorganismos de laboratorio a lo largo del intervalo de la prueba. La precisión de un método microbiológico habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación). La desviación estándar relativa esperada en función de UFC/ Placa es la siguiente: (USP XXX, 2007) Tabla 1. Desviación Estándar Relativa en función de la Unidades Formadoras de Colonia por Placa UFC/Placa Desviación Estándar Relativa 30-300 <15% 10-30 <25% <10 <35% 26 3.5.3. Especificidad La especificidad de un método microbiológico cuantitativo es su capacidad para detectar un panel de microorganismos aptos para demostrar que el método sirve al objetivo propuesto. (USP XXX, 2007) 3.5.4. Límite de Cuantificación El límite de cuantificación es el número más bajo de microorganismos que pueden contarse con exactitud. (USP XXX, 2007) 3.5.5. Linealidad La linealidad de una prueba microbiológica cuantitativa es su capacidad para generar resultados que sean proporcionales a la concentración de microorganismos presentes en la muestra dentro de un intervalo dado. (USP XXX, 2007) Linealidad para otros autores es considerado también como un proceso analítico donde existe la posibilidad de que este produzca resultados que sean directamente proporcionales a la concentración de analito en la muestra (OMS, 1992) 3.5.6. Límite de Detección El limite de detección es el número más bajo de microorganismos en una muestra que puede detectarse bajo las condiciones experimentales establecidas. 3.5.7. Intervalo El intervalo operativo de un método microbiológico cuantitativo. Es el intervalo que existe entre los niveles superiores e inferiores de microorganismos que han demostrado poder determinarse con precisión, exactitud y linealidad. 3.5.8. Tolerancia La tolerancia de un método microbiológico cualitativo es el grado de precisión de los resultados de la prueba obtenidos mediante el análisis de las mismas muestras bajo 27 diversas condiciones normales de prueba, tales como el empleo de analistas, instrumentos, lotes de reactivos y laboratorios diferentes. Se puede definir tolerancia como la resistencia intrínseca a influencias ejercidas por variables operativas y ambientales sobre los resultados del método microbiológico. 3.5.9. Robustez La robustez de un método microbiológico cualitativo es la medida de su capacidad para no ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del método, representa un indicador de su confiabilidad durante uso normal. 3.6. PRESERVANTES Se entiende por preservante las sustancias que se añaden como ingredientes a los productos cosméticos y/o farmacéuticos principalmente para inhibir el desarrollo de microorganismos. (Arthur. 2000) Los parabenos son compuestos no mutagénicos, no teratogénicos y no generan carcinoma. (Arthur. 2000) 3.6.1. PRESERVANTES CONTENIDOS EN EL PRODUCTO A VALIDAR 3.6.1.1. Metil-Parabeno El Metilparabeno es comúnmente utilizado en las formulaciones en las industrias farmacéutica, cosmética, y alimentos como un preservante antimicrobiano. Este preservante puede ser utilizado de forma individual, en combinación con otros parabenos u otros agentes antimicrobianos. En la industria cosmética el metilparabeno es el agente antimicrobiano mas usado. Los parabenos son efectivos en un rango amplio de pH y tienen un amplio espectro en cuanto a Hongos y Levaduras, aunque también poseen actividad antimicrobiana. (Arthur. 2000) 28 Es usual la mezcla de diferentes parabenos ya que proporciona mejor efectividad preservante. Debido a la baja solubilidad de los parabenos, particularmente son sales de sodio que frecuentemente son usadas en las formulaciones. (Arthur. 2000) 3.6.1.2. Descripción El metilparabeno es incoloro cristalino. Este es in saboro o su sabor se hace casi despreciable. Fórmula empírica: C8H8O3 Peso molecular: 152,15 g Estructura molecular: 3.6.1.3. Propiedades. 3.6.1.3.1. Actividad antimicrobiana El preservante melitparabeno posee actividad antimicrobiana en presencia de pH entre 4-8. La eficacia del preservante disminuye con incrementos de pH debido a la formación de una unión fenolito. Los parabenos poseen mayor actividad en Hongos y Levaduras, aunque también bacteriana, entre estos son mas efectivos para las bacterias Gram Positivas, aunque también poseen actividad antimicrobiana para las bacterias Gram Negativas. 29 El metilparabeno es el preservante con menor efectividad de los parabenos. La actividad antimicrobiana se consigue con la combinación de otros agentes antimicrobianos. La combinación más usada de parabenos como agentes antimicrobianos son los metil, etil, propil y butilparabeno (Arthur. 2000) Tabla 2. Concentración mínima inhibitoria (MICs) de metilparabeno en soluciones acuosas. Microorganismos MIC (µg/mL) Aspergillus níger ATCC 9642 1000 Aspergillus níger ATCC 10254 1000 Bacillus subtilis ATCC 6633 2000 Candida albicals ATCC 10231 2000 Escherichia coli ATCC 8739 1000 Escherichia coli ATCC 9637 1000 Pseudomonas aeuroginosas ATCC 9027 4000 Pseudomonas aeuroginosas ATCC 15442 4000 Salmonella typhosa ATCC 6539 1000 Staphylococcus aureus ATCC 6538 2000 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 2000 (Arthur. 2000) 3.6.1.3.2. Incompatibilidad La actividad antimicrobiana del metilparabeno y otros parabenos es reducida considerablemente en presencia de surfactantes no nionicos como lo es el polisorbato 80, debido a una micelizacion. Existe incompatibilidad con otros compuestos como sorbitol, alginato de sodio, trisilica de magnesio entre otros reportados. (Arthur. 2000) 3.6.1.3.3. Seguridad El metilparabeno y otros parabenos son usados con frecuencia como preservantes antimicrobianos en cosméticos y en formulaciones farmacéuticas orales y tópicas. Los 30 parabenos no son usados como preservantes en inyecciones y en preparaciones oftalmológicas ya que no son apropiados para este tipo de formulaciones debido al potencial irritante de los parabenos. Estos efectos dependen de la actividad enzimática formada por los metabolitos de los parabenos en la piel. (Arthur. 2000) 3.6.2. Propilparabeno El propilparabeno es comúnmente utilizado en las formulaciones en las industrias farmacéutica, cosmética, y alimentos como un preservante antimicrobiano. Este preservante puede ser utilizado de forma individual, en combinación con otros parabenos u otros agentes antimicrobianos. En la industria cosmética el propilparabeno es el segundo preservante mas usado. Los parabenos son efectivos en un rango amplio de pH y tienen un amplio espectro en cuanto a Hongos y Levaduras, aunque también poseen actividad antimicrobiana. (Arthur. 2000) Es usual la mezcla de diferentes parabenos ya que proporciona mejor efectividad preservante. Debido a la baja solubilidad de los parabenos, estos antimicrobianos son particularmente sales de sodio que frecuentemente son usadas en las formulaciones. El pH alcalino de dichas formulaciones se debe a lo anteriormente mencionado. (Arthur. 2000) 3.6.2.1. Descripción El propilparabeno es un polvo blanco cristalino e inoloro. Fórmula empirica: C10H12O3 Peso molecular: 180,20 g 31 Estructura molecular: 3.6.2.2. Propiedades. 3.6.2.2.1. Actividad antimicrobiana El preservante propilparabeno posee actividad antimicrobiana en presencia de pH entre 4-8. La eficacia del preservante disminuye con incrementos de pH debido a la formación de un anion fenolito. Los parabenos poseen mayor actividad en Hongos y Levaduras, aunque también bacteriana, entre estos son mas efectivos para las bacterias Gram Positivas, aunque también poseen actividad antimicrobiana para las bacterias Gram Negativas. El propilparabeno es usado en preparaciones parenterales y es usado en combinación con otros parabenos en formulaciones tópicas y orales. (Arthur. 2000) Tabla 3. Concentración mínima inhibitoria (MICs) de propilparabeno en soluciones acuosas. Microorganismos Aspergillus níger Aspergillus níger Bacillus subtilis Candida albicals Escherichia coli Escherichia coli Pseudomonas aeuroginosas Pseudomonas aeuroginosas Salmonella typhosa Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis (Arthur. 2000) MIC (µg/mL) ATCC 9642 ATCC 10254 ATCC 6633 ATCC 10231 ATCC 8739 ATCC 9637 ATCC 9027 ATCC 15442 ATCC 6539 ATCC 6538 ATCC 12228 32 500 200 500 250 500 100 > 1000 > 1000 500 500 500 3.6.2.2.2. Incompatibilidad La actividad antimicrobiana del propilparabeno y otros parabenos es reducida considerablemente en presencia de surfactantes no nionicos, debido a una micelizacion. Existe incompatibilidad con compuestos como aluminio de magnesio silca, trisilica de magnesio, oxido de hierro amarillo y azul ultramarino, reportados como agentes reductores de la eficacia de preservante. El propilparabeno es incoloro en la presencia de hierro y puede ser débil a una hidrólisis en presencia alcalina y fuerte en presencia ácida. (Arthur. 2000) 3.6.2.2.3. Seguridad El propilparabeno y otros parabenos son usados con frecuencia como preservantes antimicrobianos en cosméticos y en formulaciones farmacéuticas orales y tópicas. Los parabenos no son usados como preservantes en inyecciones y en preparaciones oftalmológicas ya que no son apropiados para este tipo de formulaciones debido al potencial irritante de los parabenos. Estos efectos dependen de la actividad enzimática formada por los metabolitos de los parabenos en la piel. (Arthur. 2000) 33 4. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION La calidad en un producto farmacéutico debe comprobarse en su totalidad con sistemas confiables y seguros, con el fin de cumplir con las exigencias farmacopeicas y legislación farmacéutica vigente y sobre todo por ofrecer a sus clientes un producto eficaz y de alta calidad. Por tal motivo, la industria farmacéutica ha ido implementando y mejorando tecnología y metodologías que logren garantizar dicha calidad. Es así, que la validación de cualquier proceso a realizar toma relevancia y se convierte como indispensable para el aseguramiento de la calidad de los productos farmacéuticos. En cualquier tipo de industria el hecho de contar con procesos validados equivale no solo a producir productos de calidad que le confieran la capacidad de ser efectivos en sus pacientes, lograr posicionarse en el mercado farmacéutico, sino también obtener procesos que permitan ahorrar tiempo y dinero ya que se minimizan los riesgos de reproceso por errores generados durante la ejecución del procesos. La validación de una técnica analítica microbiológica es de gran importancia en cuanto a la implementación y desarrollo de la misma, ya que permite la aprobación de su ejecución teniendo en cuenta que bajo todas las circunstancias analizadas y validadas, arrojará datos con un alto nivel de confianza ya que en el procesos a validar, permite simular y evaluar determinadas situaciones posibles. La validación de una técnica permite generar resultados confiables en futuros análisis, gracias a un modelo generalizado a partir de datos disponibles de la validación. Por tal razón se busca validar un técnica analítica para un producto farmacéutico preservado, que se administra por vía oral; que logre arrojar resultados veraces en cuanto a sus especificaciones microbiológicas conferidas como lo son: el análisis cuantitativo de Recuento de Bacterias Aerobias y Recuento de Hongos y Levaduras, y el análisis cualitativo: Ausencia o Presencia de un microorganismo patógeno como es el caso del bacilo Gram Negativo; Escherichia coli. El criterio de escogencia para realizar dicha validación se basa en la exigencia de la USP 30 para realizar recuento de células viables en productos con aditivos preservantes. 34 5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo general Implementar y validar una técnica microbiológica para un producto líquido preservado, elaborado en una industria farmacéutica bajo las recomendaciones de la United States Pharmacopoeia. 5.2 Objetivos específicos - Evaluar la veracidad de los resultados obtenidos con la técnica analítica microbiológica actualmente utilizada para un producto líquido de administración oral, preservado con parabenos. - Comprobar la inactivación de los agentes antimicrobianos mediante la recuperación significativa de los microorganismos utilizados en el ensayo con la metodología propuesta. - Validar e implementar una técnica analítica microbiológica para un producto liquido de administración oral preservado con agentes parabenos. 35 6. MATERIALES Y METODOS Se realizó una validación de tipo concurrente teniendo en cuenta que la validación se baso en la información recopilada durante el desarrollo de la validación. 6.1.1. Método cuantitativo para Recuento de Bacterias Mesofilos Aerobios y Recuento de Hongos Y Levaduras • Exactitud • Precisión • Robustez • Selectividad • Linealidad 6.1.2. Método cualitativo Ausencia o Presencia de Escherichia coli • Linealidad • Robustez • Límite de detección • Especificidad. 6.2. MATERIALES Y METODOS CUANTITATIVOS 6.2.1. Medios de cultivo y reactivos • BHI (Infusión Cerebro-Corazón) • Caldo caseína digerida-soya-lecitina Polisorbato 20 • Diluyente MF (Peptona 0,1% + Cloruro de sodio 0,85%) • Agar CASO • Agar Glucosa al 4% según Sabouraud • Agar PDA (Agar Patata Dextrosa) • Solución TTC (cloruro de trifenil tetrazolio) al 1 % • Twen 80 36 6.2.2. Estándares Los microorganismos estándar utilizados para métodos cuantitativos en la validación fueron: Staphylococcus aureus ATCC 6538, para método de recuento de Mesófilos Aerobios. Candida albicans ATCC10231 para método de recuento de Mohos y Levaduras. 6.3. METODOLOGIA 6.3.1. Preparación de inóculos Bacterianos Se realizó aislamientos en Agar Caso, de cada uno de los microorganismos bacterianos utilizados en el ensayo, obteniendo colonias aisladas de cada uno de estos microorganismos a partir de Cryobank, (Merck, 2007) en un periodo de incubación de 24 horas en un rango de temperatura entre 30ºC-35ºC. Posteriormente se transfirió una colonia de las anteriormente aisladas en un frasco schott estéril de 50mL que contenía 30 mL de caldo BHI (Infusión Cerebro-Corazón) estéril, y se llevó a incubarlas a temperatura en un rango entre 30ºC - 35ºC en agitación continua por 24 horas. A partir de cada inóculo obtenido se realizó diluciones decimales seriados y se sembró 1mL en profundidad por duplicado por cada dilución, adicionando 15-20mL aproximadamente de Agar Caso. Para realizar el recuento con mayor facilidad se adicionó al medio nutritivo en su estado liquido 1mL de solución de trifenil tetrazolium cloruro al 1% (TTC) por cada 100mL de medio para evidenciar cada una de las colonias crecidas. El anterior procedimiento se realizó 3 veces en forma individual. Al final se tuvo en cuenta la dilución que presentó un recuento de >1600UFC/mL como -5 concentración (Dilución 10 ) y fue la establecida para el desarrollo de cada uno de los ensayos para el recuento de bacterias mesofilas aerobias. 37 6.3.2. Preparación de inóculo Levadura Se realizó aislamientos en Agar Sabouraud 4% de la levadura utilizada en el ensayo (Candida albicans ATCC 10231), y se obtuvo colonias aisladas de dicha levadura a partir de Cryobank, (Merck, 2007) en un periodo de incubación de 120 horas en un rango de temperatura entre 20ºC-25ºC. Posteriormente se transfirió una colonia de las anteriormente mencionadas, a un frasco schott estéril de 50mL que contenía 30mL de caldo BHI (Infusión Cerebro-Corazón) estéril, y se llevó a incubar a temperatura en un rango entre 30ºC - 35ºC en agitación continua por 24 horas. A partir de cada inóculo obtenido se realizó diluciones decimales seriados y se sembró 1mL en profundidad por duplicado por cada dilución, adicionando 15-20mL aproximadamente de Agar Sabouraud 4%. El anterior procedimiento se realizó 3 veces en forma individual. Al final se tuvo en cuenta la dilución que presentó un recuento de >1600UFC/mL como -2 concentración (Dilución 10 ) y fue la establecida para el desarrollo de cada uno de los ensayos para el recuento de mohos y levaduras. 6.3.3. Preparación de inóculos Hongo Filamentoso Se realizó siembra masiva en Agar Sabouraud 4% del hongo utilizado en el ensayo (Aspergillus niger ATCC 16404), obteniendo un crecimiento considerable del hongo formando un tapete sobre toda la superficie de la caja de petri a partir de Cryobank, (Merck, 2007) en un periodo de incubación de 120 horas en un rango de temperatura entre 20ºC25ºC. Posteriormente se realizó lavado con 15mL de diluyente MF al 0.1% Tween 80 (Anexo) y con la ayuda de perlas de vidrio estériles; a cada uno de las cajas de petri sembradas. A partir de cada inóculo obtenido se llevó a un volumen final de 30mL adicionando a cada uno 15mL mas de diluyente, se realizó diluciones decimales seriados y se sembró 1mL en profundidad por duplicado por cada dilución, adicionando 15-20mL aproximadamente de Agar Sabouraud 4%. 38 El anterior procedimiento se realizó 3 veces en forma individual. Al final se tuvo en cuenta la dilución que presentó un recuento de >1600UFC/mL como -1 concentración (Dilución 10 ) y fue la establecida para el desarrollo del ensayo de selectividad. 6.3.4. Preparación del Placebo (Medio Cultivo+Producto) Se transfirió 10 g de la muestra (producto) en condiciones asépticas a un frasco estéril el cual contenía 90mL de Caldo caseína digerida-soya-lecitina Polisorbato 20. 6.3.5. Preparación del Estándar Se tomó un inóculo con su respectiva concentración de microorganismo, del cual se adicionó 1mL a un frasco estéril que contenía 100mL de Caldo caseína digerida-soya-lecitina Polisorbato 20 estéril. 6.3.6. Preparación del Ensayo A partir del nivel de concentración apropiado de microorganismos de prueba, se transfirió 1mL a frasco estéril con 90mL de Caldo caseína digerida-soya-lecitina Polisorbato 20, y se adicionó en condiciones asépticas 10 g de la muestra del producto. 6.3.7. Siembra A partir deL caldo ensayado con la concentración apropiada para recuento del microorganismo se transfirió 1mL por triplicado a cajas de petri estéril. Posterior a esto se agregó un volumen aproximado de 15-20 mL de Agar CASO fundido y Glucosa 4% Sabouraud para Bacterias y Hongos respectivamente, a una temperatura no mayor de 45ºC. Se homogenizó la muestra, se dejó solidificar el agar y se llevó a incubar a una temperatura entre 30°-35ºC por 48 horas para mesófilos aerobios y 20-25ºC por 120 horas para hongos. Para la siembra del placebo se siguió la misma metodología anteriormente descrita. 39 6.4. METODOLOGIA PARAMETROS CUANTITATIVOS 6.4.1. EXACTITUD (USP 30,2007) A partir de 10 inóculos preparados cada uno de forma individual y previamente estandarizado, se procedió a trabajar con la concentración respectivas a cada inoculo, que se encontraba en el rango establecido. Se procedió a transferir 1mL de la concentración a trabajar en un frasco schott estéril, con 90mL de Caldo Caseína Digerida-Soya-Lecitina Polisorbato 20, seguido con la adición de 10g de muestra. Posteriormente a lo anterior se trabajó con un inoculo adicional denominado estándar en el cual se manejó la misma dilución trabajada en los 10 inóculos anteriormente mencionados. Al tiempo se realizó la preparación del placebo. Finalmente se hallaron las medias de cada replica o inóculos en las diferentes concentraciones, incluyendo a los estándares para la metodología, se realizó análisis de varianzas ANOVA y posteriormente t Student y se obtuvo el porcentaje de recuperación según los criterios que exige la USP 30 (2007). 6.4.2. PRECISION (USP 30,2007) 6.4.2.1. Precisión del método A partir de 10 inóculos preparados cada uno de forma individual y previamente estandarizado, se procedió a trabajar con la concentración respectivas a cada inoculo, que se encontraba en el rango establecido. Se tomó 10 inóculos para realizar 10 réplicas del ensayo, y se determino el recuento. Posteriormente se procedió a hallar las medias de cada una de las diluciones de las réplicas del ensayo y determinar el coeficiente de variación de las replicas. 40 6.4.2.2. Precisión intermedia (Repetibilidad) Se desarrolló la misma metodología de la precisión del método, con la variante de incluir en los ensayos de precisión entre analistas contando con el desarrollo de la metodología por parte de un analista No. 2 y entre días de análisis (7 días después del primer análisis) el cual corresponde al análisis realizado para precisión del método. Se determinó el recuento y se procedió a hallar las medias de las réplicas de cada uno de los analistas y entre días y se determinó su coeficiente de variación. 6.4.3. SELECTIVIDAD (USP 30,2007) Realizar la preparación de inóculo de las cepas de: • Bacillus subtilis ATCC 6633 (Dilucion 10 ) • Escherichia coli ATCC 8739 (Dilucion 10 ) • Staphylococcus aureus ATCC 6538 (Dilucion 10 ) • Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (Dilucion 10 ) • Salmonella enterica ATCC 14028 (Dilucion 10 ) • Aspergillus níger ATCC 16404 (Dilucion 10 ) • Candida albicans ATCC 10231 (Dilucion 10 ) -1 -5 -5 -5 -6 -2 -2 A partir de cada inóculo se realizó diluciones decimales seriadas hasta obtener un nivel de concentración establecido como optimo (contable). Se tomó 3 inóculos para realizar la preparación de los ensayos y simultáneamente se tomó 1 inoculo aparte para la realización del Estándar (control positivo); también se realizó la preparación del placebo. A partir de los resultados obtenidos se determino el porcentaje de recuperación como criterio exigido por la USP 30 (2007). 6.4.4. ROBUSTEZ (USP 30,2007) Con relación a la evaluación de este parámetro se realizaron las siguientes variables: • En el ensayo de recuento de bacterias mesofilas aerobias se llevó a incubación las replicas a dos incubadoras diferentes, ambas incubadoras calibradas en un rango de temperatura entre 30°C – 35°C. 41 En el ensayo de recuento de hongos y levaduras se realizo la siembra en dos agares nutritivos diferentes para hongos y levaduras; Agar Sabouraud al 4% y Agar PDA. Se realizó 3 inóculos para desarrollar la preparación del ensayo y otro inóculo para la preparación del Estándar. 6.5. MATERIALES Y METODOS CUALITATIVOS 6.5.1. Reactivos y medios de cultivo • Caldo caseína digerida-soya-lecitina Polisorbato 20 • BHI (Infusión Cerebro-Corazón) • Diluyente MF (Peptona/Cloruro de sodio) • Tween 80 • Agar MacConkey • Agar Baird Parker • Agar Cetrimide • Caldo MacConkey • Agar Citrato • Prueba bioquímica Urea • Prueba bioquímica MR-VP • Prueba bioquímica TSI • Prueba bioquímica SIM 6.5.2. Estándares Los microorganismos estándar utilizados para métodos cuantitativos en la validación fueron: • Escherichia coli ATCC 8739 • Staphylococcus aureus ATCC 6538 • Pseudomonas earuginosa ATCC 9027 42 6.6. METODOLOGIA 6.6.1. Preparación del inóculo bacteriano Se obtuvo una colonia aislada de cada uno de los microorganismos usados en el ensayo y se transfirió cada una a un frasco Schott con 30mL de Caldo BHI (Infusión CerebroCorazón), y se llevó a incubación a una temperatura en un rango de 30ºC-35ºC en agitación continua por 24 horas. 6.6.2. Preparación del Placebo (Medio Cultivo+Producto) Para la preparación del placebo se siguió la misma metodología utilizada en los ensayos de métodos cuantitativos citada en el numeral 6.3.3. 6.6.3. ROBUSTEZ -6 Se realizo tres inoculos del microorganismo Escherichia coli. Y se trabajo con la dilución 10 , suspensión considerada como la más apropiada por poseer un recuento aproximado entre 50 UFC/mL- 100 UFC/mL. Para la preparación de los dos ensayos (placebo), del estándar, se siguió la misma metodología ya explicada en el numeral 6.3.6. (Métodos cuantitativos). Posterior a esto se llevó 3 frascos con el Caldo del ensayo a incubación por 24 horas, otros 3 frascos a incubación por 17 horas y otros 3 frascos a incubación por 26 horas; simultáneamente se llevó para cada una de estas horas ensayadas los Caldos definidos como Estándares. Para la incubación del placebo se llevó incubación por un periodo de 24 horas. Todos los ensayos fueron llevados a una temperatura de incubación de 30°C - 35ºC. Se realizó resiembras en los medios selectivos para el microorganismo ensayado, Escherichia coli. De tal manera que se tomó 1mL del Caldo de enriquecimiento y se inoculó en 100mL de Caldo MacConkey el cual se llevó a incubación por 24 horas a temperatura en un rango de 30°C-35ºC. Posterior a la incubación se realizó un repique en Agar MacConkey y se llevó a incubación por un periodo de 48 horas a una temperatura de 30°C – 35°C. 43 6.6.4. LINEALIDAD Se realizó tres preparaciones de inoculo en forma individual de los microorganismos a ensayar. A partir de cada inoculo se procedió a realizar diluciones decimales seriadas en -1 -10 base 10 de la dilución 10 a 10 . A partir de cada nivel de concentración por cada inóculo se sembró 1mL por triplicado y se adiciono entre 15-20 mL de agar CASO con TTC al 1% fundido a una temperatura no mayor de 45ºC. Posteriormente se homogenizo el inóculo con el medio de cultivo y se llevó a incubación por un periodo de 48 horas a 30°C -35ºC. Para el análisis de datos realizó la curva de crecimiento UFC (unidades formadoras de colonias) vs. Niveles de concentración y se determino el coeficiente de correlación al cuadrado de cada uno de los microorganismos ensayados. Microorganismos a utilizar en el ensayo: • Escherichia coli ATCC 8533 • Staphylococcus aureus ATCC 6538 • Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 6.6.5. LÍMITE DE DETECCIÓN La preparación del ensayo se realizó a partir del frasco que contenía la concentración más baja de microorganismos evidenciada por el crecimiento en placa en las tres réplicas del inóculo y la subsiguiente dilución decimal en la cual no se registró crecimiento en alguna de las réplicas o en ninguna de estas (descrito en parámetro de linealidad) y se siguió la metodología de preparación del ensayo, del estándar y placebo como en los métodos cuantitativos. Simultáneamente se llevó los frascos del ensayo, del placebo y del estándar a incubación por un periodo de 24 horas a una temperatura de 30°C - 35ºC. Al completar el periodo de incubación se realizó la siembra de estos caldos por recuento en placa transfiriendo 1mL por triplicado y se llevó a incubación por un periodo de 48 horas a temperatura de 30°C - 35ºC. 6.6.6. ESPECIFICIDAD Al realizar este parámetro se tomó como base los resultados expresados en el parámetro descrito como límite de detección. Es así como, luego de llevar los caldos del ensayo a incubación por 24 horas donde se registró crecimiento del microorganismo se realizaron 44 resiembras en medios de cultivo selectivos para cada microorganismo a ensayar con asa redonda. Para el microorganismo de interés el cual es Escherichia coli se realizó resiembra tomando 1mL del Caldo de enriquecimiento y se inocula en 100 mL de Caldo MacConkey el cual debe se llevó a incubación por 24 horas a 30°C - 35ºC. P osterior a la incubación de este último se hizo una resiembra en Agar MacConkey y se llevó a incubar por un periodo de 48 horas a 30°C -35ºC. Para la validez de la prueba y evaluación del parámetro además de tomar el microorganismo prueba o de ensayo que es Escherichia coli, se tomó un microorganismo que posea las propiedades para ser un control negativo para demostrar que el método es especifico en la detección de Escherichia coli, por tal motivo se realizaron pruebas con los microorganismos Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, realizando el mismo procedimiento que para el microorganismo ensayado (Escherichia coli). 45 7. RESULTADOS Y DISCUSION 7.1. Verificación de Calibración de quipos utilizados en la Validación Se revisaron los planes de Verificación, Calificación y Calibración por parte del área de Metrología para cada uno de los equipos de ensayo y medición del área de Microbiología y se evidencio respecto a los equipos utilizados en la validación y etapa experimental que su vigencia con relación a la fecha de calibración, calificación y verificación, se encontraban vigentes; por consiguiente se puede asegurar que los equipos utilizados funcionan de acuerdo con sus especificaciones operacionales establecidas. Cabe también mencionar que el área de Microbiología posee un plan de verificaciones diarias de calificación y calibración de equipos como estufas de incubación, balanzas analíticas, cabina de flujo laminar, nevera e indicador de presión diferencial. 7.2. Estandarización 7.2.1. Estandarización de curva Se realizó estandarización de la curva de cada uno de los microorganismos estándares utilizados en la validación: Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella enterica ATCC 14028, Aspergillus níger ATCC 16404, Candida albicans ATCC 10231; con el fin de estimar en futuros ensayos las concentraciones aproximadas de cada uno de los inóculos y determinar la concentración apropiada para el desarrollo de la validación. (Ver anexo 1) 7.2.2. Estandarización de la Metodología Previamente a la validación de la técnica para el análisis microbiológico del producto liquido preservado con parabenos se considero necesario la estandarización de la técnica y la evaluación de toxicidad, especificidad y tolerancia presentada por parte de los microorganismos utilizados en los diferentes ensayos frente al caldo utilizado en la validación (Caldo Lecitina Polisorbato 20). Por tanto se realizaron ensayos previos utilizando los mismos estándares, medios de cultivo y reactivos empleados en la validación y siguiendo la metodología necesaria para este fin. Se determino que: 46 • Los medios de cultivo, reactivos y caldos de dilución con el inactivante (Polisorbato 20) escogidos no presentaron toxicidad alguna para los microorganismos. • Los medios de cultivo, reactivos y caldos de dilución con el inactivante acogidos, mostraron la capacidad de recuperar satisfactoria los microorganismos en prueba. • El inactivantes utilizado en los ensayos (Polisorbato 20), mostró la capacidad de neutralizar los preservantes parabenos presentes en el producto líquido preservado con parabenos, el cual fue evidenciado por la recuperación satisfactoria de los microorganismos de prueba. • Se evidencio la viabilidad de cada uno de los microorganismos utilizados en los ensayos gracias a su presencia en recuento en placa. 7.3. RESULTADOS PARÁMETROS CUANTITATIVOS 7.3.1. Selectividad En este parámetro se busca determinar la capacidad de la técnica para recuperar la cantidad de microorganismo inoculado inicialmente, siendo evaluado por el porcentaje de recuperación microbiano, haciendo relación entre el promedio obtenido en cada uno de los ensayos con el promedio del recuento del estándar multiplicado por 100%. (USP 30.2007) Tabla No. 1. (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Bacillus subtilis ATCC 6633 en la prueba Cuantitativa de Selectividad Estándar Placebo Replica No. 1 Placebo Replica No. 2 Placebo Replica No. 3 Recuentos Obtenidos UFC/mL 739 746 744 701 689 692 674 699 691 671 689 682 Promedio de Recuentos UFC Porcentaje de Recuperación (%) 743 47 694 93 688 93 681 92 Tabla No. 2. (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Escherichia coli ATCC 8739 en la prueba Cuantitativa de Selectividad Recuentos Obtenidos UFC/mL Promedio de Recuentos UFC Porcentaje de Recuperación (%) 185 Estándar 180 182 173 203 Placebo Replica No. 1 195 197 109 213 118 197 109 193 206 Placebo Replica No. 2 219 213 201 Placebo Replica No. 3 196 193 Tabla No. 3. (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Staphylococcus aureus ATCC 6538 en la prueba Cuantitativa de Selectividad Recuentos Obtenidos UFC/mL Promedio de Recuentos UFC Porcentaje de Recuperación (%) 459 Estándar 452 445 451 453 Placebo Replica No. 1 452 452 100 450 100 455 101 452 451 Placebo Replica No. 2 450 449 455 Placebo Replica No. 3 457 452 48 Tabla No. 4. (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 en la prueba Cuantitativa de Selectividad Recuentos Obtenidos UFC/mL Promedio de Recuentos UFC Porcentaje de Recuperación (%) 349 Estándar 349 345 353 323 Placebo Replica No. 1 329 329 94 325 93 330 95 336 319 Placebo Replica No. 2 325 331 326 Placebo Replica No. 3 329 335 Tabla No. 5. (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Salmonella enterica ATCC 14028 en la prueba Cuantitativa de Selectividad Recuentos Obtenidos UFC/mL Promedio de Recuentos UFC Porcentaje de Recuperación (%) 329 Estándar 332 331 337 324 Placebo Replica No. 1 321 321 96 324 97 320 96 317 323 Placebo Replica No. 2 327 321 324 Placebo Replica No. 3 319 316 49 Tabla No. 6. (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Aspergillus niger ATCC 16404 en la prueba Cuantitativa de Selectividad Recuentos Obtenidos UFC/mL Promedio de Recuentos UFC Porcentaje de Recuperación (%) 112 Estándar 116 122 113 101 Placebo Replica No. 1 107 105 90 111 96 108 93 106 114 Placebo Replica No. 2 106 112 111 Placebo Replica No. 3 103 109 Tabla No. 7. (%) Porcentaje de Recuperación del microorganismo: Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Selectividad Recuentos Obtenidos UFC/mL Promedio de Recuentos UFC Porcentaje de Recuperación (%) 223 Estándar 217 211 217 217 Placebo Replica No. 1 218 218 100 217 100 218 100 218 216 Placebo Replica No. 2 217 217 219 Placebo Replica No. 3 218 216 50 Se puede constatar según el porcentaje de recuperación para cada uno de los microorganismos obtenidos, que son capaces de crecer y expresarse en presencia del producto preservado con parabenos gracias a la acción inactivante del Polisorbato presente en el caldo nutritivo usado en la validación (Caldo Lecitina Polisorbato 20) Se puede observar en las tablas correspondientes a cada microorganismo de prueba un porcentaje de recuperación superior al 90%, obteniendo los menores porcentajes de recuperación, dos de las replicas de Aspergillus níger con un valor de 90% y 93%, aun así cumpliendo con lo establecido en la USP 30.2007, donde se establece un porcentaje mayor al 70% para dar cumplimiento a dicho parámetro. Esto se presento muy posiblemente a la acción de los preservantes parabenos ya que estos presentan con un amplio espectro en cuanto a Hongos y Levaduras, aunque también poseen actividad antimicrobiana. (Arthur. 2000) También se evidencio porcentajes de recuperación bajos para las tres replicas realizadas para el microorganismo Bacillus subtilis, correspondiendo a los valores 93%, 93% y 92%; aunque estos valores son aceptados por el criterio de la USP.30.2007, se observa que presentan una baja recuperación a comparación de los demás microorganismos ensayados los cuales muestran porcentajes de recuperación mayores al 95%. Por tanto se puede comprobar que la metodología posee la capacidad de detectar una gama de microorganismos presentes en la muestras. (USP.30.2007) 7.3.2. Exactitud 7.3.2.1. Recuento de Bacterias Mesófilas Aerobias Para todos los ensayos realizados en la validación se determinó como estándar cuantitativo: Staphylococcus aureus ATCC 6538 para ensayos de Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias. A continuación se presentan los promedios de porcentajes de recuperación obtenidos para la prueba de Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias, a partir de 10 réplicas del ensayo y 10 replicas del estándar realizadas. 51 Los porcentajes de recuperación se obtienen a partir de la relación del promedio del recuento del ensayo respecto al promedio del recuento de los estándares, esto expresado en porcentaje (USP 30. 2007) Tabla No. 8. (%) Porcentaje de Recuperación de Bacterias Mesofilas Aerobias Estándar Promedio Replica No. 1 Replica No. 2 Replica No. 3 Replica No. 4 Replica No. 5 Replica No. 6 Replica No. 7 Replica No. 8 Replica No. 9 Replica No. 10 Recuentos Promedio de Obtenidos Recuentos UFC/ mL UFC/ mL 461 465 467 469 466 459 462 463 465 466 469 469 471 453 455 459 452 464 460 454 461 444 450 456 451 451 457 453 467 459 461 468 457 467 465 466 463 452 454 455 455 % Recuperación Promedios Estándar UFC/mL 101 456 100 462 101 469 98 471 99 461 97 459 98 462 99 459 100 461 98 450 Observando la Tabla No. 8. (%) Porcentaje de Recuperación de Bacterias Mesofilas Aerobias; se logra evidenciar como la recuperación microbiana es satisfactoria en la prueba de exactitud para el Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias, utilizando como microorganismo estándar Staphyloccocus aureus ATCC 6538. 52 Se puede observar como los promedios de los recuentos obtenidos por parte de cada uno de los diez ensayos realizados (Microorganismo en presencia del producto y caldo nutritivo con inactivante) y los diez ensayos realizados denominados como estándares (Microorganismo en presencia del caldo nutritivo con inactivante sin producto); presentan gran similitud en sus recuentos obteniendo la mayor variación en UFC/mL en la replica No. 4., donde se obtuvo un promedio de recuento de 455 UFC/mL para el ensayo y un recuento de 471 UFC/mL en el promedio de recuento del estándar, indicando así una diferencia de tan solo 16 UFC/mL. Es importante resaltar que ambas pruebas realizadas en la Replica No. 4 (Ensayo y Estándar) provienen de un mismo inoculo, por lo cual se esperaría que los resultados en ambas casos arrojaran resultados iguales o como en este caso muy similares. Por lo anteriormente mencionado se puede comprobar que el microorganismo en presencia del producto preservado con parabenos; puede expresar su crecimiento gracias a la inactivación de los parabenos por la actividad del Polisorbato presente en el caldo nutritivo utilizado en la prueba (Caldo Lecitina Polisorbato 20) tal como lo señala la USP 30, 2007, donde indica la inactivación de los preservantes Parabenos por parte del Polisorbato. (Arthur. 2000; USP 30.2007) El requerimiento por parte de la USP 30. 2007. indica que el porcentaje de recuperación bacteriano debe ser mayor al 70%, el cual se cumple en la prueba realizada al obtener porcentaje de recuperación desde 97% al 101% siendo el menor y el mayor valor encontrado, los cuales están por encima del estipulado por la USP.30.2007, 70%. Con el fin de comprobar si los datos obtenidos en la prueba realizada para el recuento de bacterias mesofilas aerobias podían ser combinados entre sí gracias a su homogeneidad (varianza), se desarrollo la prueba estadística ANOVA, postulando como hipótesis: Ho: No existe diferencia estadísticamente significativa entre cada uno de los replicas obtenidas. Hi: Si existe diferencia estadísticamente significativa entre cada uno de los replicas obtenidas. Luego de realizar la prueba estadística ANOVA para el análisis de varianzas de dos muestras (Ensayo – Estándar) con un alfa del 0,05, se estableció que las réplicas no son 53 estadísticamente diferentes, teniendo en cuenta que el análisis estadístico arrojó un F observado igual a 1.00 y un F tabulado igual a 3.17; indicando así que no se rechaza la hipótesis de existir diferencia estadísticamente significativa entre cada una de las replicas del ensayo (Ho) (Ver anexo 2.) También se desarrollo la prueba estadística t Estudent con el propósito de determinar que el promedio de los porcentajes de resuperación no difieren significativamente del 100%, con un 95% de grado de confianza, por tanto se postuló como hipótesis: Ho: El promedio de los porcentajes de recuperación no difiere significativamente del 100%. Hi: El promedio de los porcentajes de recuperación si difiere significativamente del 100%. Luego de desarrollar la prueba estadística t Estudent, se estableció que el promedio de los porcentajes de recuperación no difieren significativamente del 100%; indicando a su vez que las medias y la homogeneidad (Varianza) entre los recuentos obtenidos en el ensayo como los de los estándares son similares y no existe diferencia aparente. Lo anterior se estableció teniendo en cuanta que el análisis estadístico arrojó un t observado igual a -0.37 y un t tabulado igual a 2.10; indicando así que no se rechaza la hipótesis de obtener un promedio de los porcentajes de recuperación que difieren entre sí significativamente del 100% (Ho) 7.3.2.2. Recuento de Mohos y Levaduras Para todos los ensayos realizados en la validación se determinó como estándares Candida albicans ATCC 10231 para las pruebas de Recuento de Mohos y Levaduras. A continuación se presentan los promedios de porcentajes de recuperación obtenidos para la prueba de Recuento de Mohos y Levaduras, a partir de 10 réplicas del ensayo realizadas y 10 replicas del estándar. Los porcentajes de recuperación se obtienen a partir de la relación del promedio del recuento del ensayo respecto al promedio del recuento de los estándares, esto expresado en porcentaje (USP 30. 2007) 54 Tabla No. 9. (%) Porcentaje de Recuperación de Mohos y Levaduras Recuentos Promedio de Obtenidos Recuentos UFC/mL UFC/mL Estándar Replica No. 1 Replica No. 2 Replica No. 3 Replica No. 4 Replica No. 5 Replica No. 6 Replica No. 7 Replica No. 8 Replica No. 9 Replica No. 10 215 211 209 210 216 213 217 222 221 225 218 219 223 216 216 218 214 215 217 218 216 216 221 219 216 219 223 219 216 225 219 % Recuperación Promedios Estándar UFC/mL 210 98 211 215 100 212 223 104 219 220 102 225 217 101 213 215 100 219 217 101 213 219 102 213 220 102 212 220 102 215 Observando la Tabla No. 9. (%) Porcentaje de Recuperación de Mohos y Levaduras; se evidencia como la recuperación microbiana es satisfactoria en el ensayo de exactitud para el Recuento de Mohos y Levaduras, utilizando como microorganismo estándar Candida albicans ATCC 10231. Se evidencia como los promedios de los recuentos obtenidos por parte de cada uno de los diez ensayos realizados (Microorganismo en presencia del producto y caldo nutritivo con 55 inactivante y los diez ensayos realizados denominados como estándares (Microorganismo en presencia del caldo nutritivo con inactivante sin producto); presentan similitud en sus recuentos, obteniendo la mayor variación de unidades formadoras de colonia por mililitro en la replica No. 8., donde se obtuvo un promedio de recuento de 220 UFC/mL para el ensayo y un recuento de 212 UFC/mL en el promedio de recuento del estándar, indicando así una diferencia de 8 UFC/mL. Es importante resaltar que ambos ensayos realizados en la Replica No. 8 (Ensayo y Estándar) provienen de un mismo inoculo, por lo cual se esperaría que los resultados en ambos ensayos arrojaran resultados iguales o como en este caso similares. Por lo anteriormente mencionado se puede comprobar que el microorganismo en presencia del producto preservado con parabenos; puede expresarse gracias a la inactivación de los parabenos por la actividad del Polisorbato presente en el caldo utilizado en la prueba (Caldo Lecitina Polisorbato 20) tal como lo señala la USP 30, 2007, donde indica la inactivación de los preservantes Parabenos por parte del Polisorbato. (Arthur. 2000; USP 30.2007) Teniendo en cuanta el valor en porcentaje de recuperación que exige la USP 30.2007 para otorgar cumplimiento al parámetro de exactitud, 70%, se puede concluir que al igual que en la prueba para recuento de bacterias mesofilas aerobias se encuentra conforme la prueba realizada para recuento de Mohos y Levaduras, teniendo presente los valores de porcentaje de recuperación mas bajo y alto; 98% y 104% respectivamente, los cuales están por encima del estipulado (70%) por la USP.30.2007. Con el fin de comprobar si los datos obtenidos en el ensayo realizado para el recuento de bacterias mesofilas aerobias podían ser combinados entre sí gracias a su homogeneidad (varianza), se desarrollo la prueba estadística ANOVA, postulando como hipótesis: Ho: No existe diferencia estadísticamente significativa entre cada uno de los replicas obtenidas. Hi: si existe diferencia estadísticamente significativa entre cada uno de los replicas obtenidas. Luego de proceder con la prueba estadística ANOVA para el análisis de varianzas de dos muestras (Ensayo – Estándar) y con un alfa del 0,05, se estableció que las réplicas no son estadísticamente diferentes, teniendo en cuenta que el análisis estadístico arrojó un F 56 observado (Valor calculado) igual a 0.44 y un F tabulado (Valor critico) igual a 0.79; indicando así que no se rechaza la hipótesis de existir diferencia estadísticamente significativa entre cada una de las replicas del ensayo (Ho.) (Ver anexo 3.) También se desarrollo la prueba estadística t Estudent con el propósito de determinar que el promedio de los porcentajes de resuperación no difieren significativamente del 100%, con un 95% de grado de confianza, por tanto se postuló como hipótesis: Ho: El promedio de los porcentajes de recuperación no difiere significativamente del 100%. Hi: El promedio de los porcentajes de recuperación si difiere significativamente del 100%. Luego de proceder con la prueba estadística t Estudent, se estableció que el promedio de los porcentajes de recuperación no difieren significativamente del 100%; indicando a su vez que las medias y la homogeneidad (Varianza) entre los recuentos obtenidos en el ensayo como los de los estándares son similares y no existe diferencia aparente. Lo anterior se estableció teniendo en cuanta que el análisis estadístico arrojó un t observado (t observado) igual a 1.58 y un t tabulado (valor critico) igual a 2.02; indicando así que no se rechaza la hipótesis de obtener un promedio de los porcentajes de recuperación que difieren entre si, significativamente del 100% (Ho.) (Ver anexo 3.) De esta manera se determina que el ensayo de exactitud para el recuento de bacterias mesofilas aerobias y el ensayo de exactitud para el recuento de mohos y levaduras son conformes a lo estipulado en la USP 30.2007. al obtenerse una recuperación mayor al 70%, el cual expresa la proximidad de los resultados del ensayo mediante el método aplicado respecto al obtenido en el control, y es acorde a lo que se reporta en literatura como exactitud (USP.30.2007) También se establece gracias a las pruebas estadísticas aplicadas en ambos ensayos; recuento de bacterias mesofilas aerobias y recuento de mohos y levaduras, que si existe homogeneidad entre cada uno de los grupos y entre grupos de ensayo, revelando así varianzas pequeñas y gran similitud entre los controles y los ensayos realizados correspondientemente en las réplicas realizadas con y sin presencia del producto 57 preservado con parabenos; evidenciando también la capacidad del inactivante contenido en el caldo nutritivo utilizado (caldo lecitina Polisorbato 20) de inactivar los parabenos presentes en le producto. Aunque los parabenos son efectivos en un rango amplio de pH y tienen un amplio espectro en cuanto a Hongos y Levaduras, y también poseen actividad antimicrobiana. (Arthur. 2000), se evidencia el poder inactivante del Tween o Polisorbato frente a los parabenos, hecho que se puede comprobar en los recuentos obtenidos para ambos ensayos aun cuando los parabenos poseen mayor acción frente a los hongos y levaduras. Simultáneamente se realizaron las siembras de los placebos para cada uno de los ensayos; presentando ausencia microbiana para el recuento de bacterias mesofilas aerobias y ausencia para el recuento de mohos y levaduras resultados correspondientes a <10 UFC/g. Esto demostrando que el producto no contiene carga microbiana interferente que pudiese afectar el resultado final generando falsos recuentos. El caso de los controles negativos (1mL de Caldo Caseína Lecitina Polisorbato 20 inoculado en 15-20mL de agar correspondiente: Agar CASO, Agar Sabouraud) presento el mismo resultado <10 UFC/g. Esto demostró que el caldo nutritivo y los diferentes agares utilizados en los ensayos no contenían carga microbiana interferente que pudiese afectar el resultado final generando falsos recuentos. Los controles ambientales también presentaron los resultados esperados 0 UFC/placa para bacterias mesofilas aerobias y 0 UFC/placa para mohos y levaduras; controles implementados por medio de la sedimentación en placas que contenían Agar Sabouraud y Agar Caso para evidenciar posible contaminación ambiental en el área de trabajo donde se llevo a cabo cada uno de los ensayos. La variación de los valores correspondientes al porcentaje de recuperación en cada uno de los 10 ensayos realizados ya sea en la prueba de exactitud para recuento de bacterias mesofilas aerobias y/o recuento de mohos y levaduras; se debe a la incorrecta manipulación del analista en el momento de inocular dichos ensayos, ya que se evidencian recuentos diferentes entre ensayos que fueron inoculados con un mismo inoculo. 58 7.3.3. Precisión 7.3.3.1. Precisión del Sistema Este parámetro pretende evaluar la capacidad de los microorganismos de crecer en el caldo nutritivo escogido para realizar la validación (Caldo Lecitina Polisorbato 20), siendo evaluado por el crecimiento de los microorganismos estándares en ausencia del producto preservado con parabenos; con el fin de evidenciar las posibles variaciones del sistema diseñado. Tabla No.10. Promedios de los Recuentos de los microorganismo estándares: Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Precisión del Sistema. PROMEDIO DE REPLICAS ESTANDAR UFC/mL No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.7 No.8 No.9 No.10 Staphylococcus aureus ATCC 456 6538 Candida albicans ATCC 10231 211 462 212 469 219 471 225 461 213 59 459 219 462 213 459 213 461 212 450 215 Promedio 461 DE 6.0 CV 1,3 Promedio 215 DE 4 CV 2,1 Para evaluar la precisión del sistema se determinaron los coeficientes de variación de los promedios de los recuentos estándares para cada prueba; recuento de bacterias mesofilas y recuento de mohos y levaduras. Al observar la tabla No.10. se puede constatar como los recuentos de las replicas para ambas pruebas de recuento arrojan resultados homogéneos entre sí y reflejan una vez mas la capacidad del Polisorbato de inactivar los parabenos presentes en el producto, esto gracias al crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Candida albicans ATCC 10231 en las diferentes condiciones de siembra e incubación. También se puede determinar a través de los coeficientes de variación de los promedios de los recuentos del estándar para la prueba de recuento de bacterias mesofilas aerobias y recuento de mohos y levaduras; que los dos valores correspondientes son valores pequeños concluyendo que el método microbiológico cuantitativo ensayado posee un alto grado de coincidencia y/o concordancia entre sus resultados individuales ya sea al realizar la prueba para recuento de bacterias mesofilas y/o recuento de mohos y levaduras. 7.3.3.2. Precisión del método La tabla descrita a continuación evidencian los promedios de las 10 réplicas realizadas del ensayo (Muestra inoculada con microorganismo) junto con el estándar (Control Positivo). A partir de los recuentos obtenidos se procedió a determinar la Desviación Relativa Estándar (%RSD) o Coeficiente de Variación (CV) para las pruebas mesofilas aerobias y recuento de mohos y levaduras. 60 de recuento de bacterias Tabla No. 11. Promedios de los Recuentos de los microorganismo estándares: Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Precisión del método. Staphylococcus aureus ATCC 6538 Recuentos Obtenidos UFC/mL Estándar Replica No. 1 Replica No. 2 Replica No. 3 Replica No. 4 Replica No. 5 Replica No. 6 Replica No. 7 Replica No. 8 Replica No. 9 Replica No. 10 Promedio DE CV Promedio de Recuentos UFC 436 446 442 439 516 489 462 475 455 455 452 450 477 456 465 455 468 465 522 514 532 413 411 423 498 473 488 475 472 459 512 534 544 441 503 464 452 466 463 523 416 486 469 530 476 34.2 7.2% 61 Candida albicans ATCC 10231 Recuentos Promedio de Obtenidos Recuentos UFC/mL UFC 286 285 293 276 268 272 278 269 257 245 233 246 245 252 256 255 231 236 241 236 255 248 231 259 214 215 215 217 218 208 205 202 221 236 243 245 256 236 234 217 256 255 267 243 242 21.4 8.9% Al observar la tabla No.11 se observa como el microorganismo Staphylococcus aureus ATCC 6538 en la prueba de recuento de bacterias mesofilas aerobias tuvo un promedio de 476 UFC/mL y un promedio de recuento en el estándar de 441 UFC/mL, con una diferencia de 35 UFC/mL entre dichos promedios, evidenciando una desviación estándar significativa de 34 UFC/mL y un coeficiente de variación para el ensayo de 7.2%. En la prueba realizada para el recuento de mohos y levaduras se obtienen resultados al igual que los anteriores conforme con la literatura, ya que se obtuvieron para el microorganismos Candida albicans ATCC 10231 un promedio de 242 UFC/mL y un promedio de recuento en el estándar de 285 UFC/mL, con una diferencia de 43 UFC/mL entre dichos promedios, evidenciando una desviación estándar significativa de 21 UFC/mL y un coeficiente de variación para el ensayo de 8.9%. Es así que se puede determinar en la prueba para ambos recuentos la relación existente entre la dispersión de la medida alrededor de un valor medio o central evidenciando así la concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica repetidas veces de muestras separadas e idénticas, obtenidas de una misma muestra o lote. También se logro establecer que la metodología propuesta posee la capacidad de ser una metodología repetible ya que los valores de coeficiente de variación tan pequeños indican la precisión del método cuando este se realiza por el mismo analista, el mismo día, mismos reactivos, mismos instrumentos (precisión dentro del ensayo) (Rojas,1997) Simultáneamente se denomina como una metodología precisa teniendo en cuenta el criterio establecido por la USP 30.2007. al obtener coeficiente de variación con valores menores al 15%. Es posible que los valores de desviaciones estándar altos de los recuentos de bacterias mesofilas aerobias y recuento de mohos y levaduras se deban a posibles errores de laboratorio como lo son la incorrecta manipulación del analista en la homogenización de la muestra inoculada y/o la variación del inoculo sembrado. 62 7.3.3.3. Precisión Intermedia (Entre Analistas y entre días) 7.3.3.3.1. Precisión Entre Analistas. Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias En la Tabla No.12 se presentan los resultados de las réplicas del ensayo y control positivo (Estándar) tomando como referencia los promedios de las réplicas del ensayo: Recuento de bacterias mesofilas simultáneamente se muestran también los valores de desviación estándar y coeficiente de variación correspondiente a la prueba. En el recuento de bacterias mesofilas aerobia se obtuvo una mejor concordancia y homogeneidad en los recuentos obtenidos por parte del Analista No. 1 en los dos días que realizó el ensayo (día 1 y día 2) ya que presenta un Coeficiente de Variación de 1.5% y 7.2% respectivamente; siendo estos valores menores que el coeficiente de variación obtenido por parte del analista No. 2, el cual presento un valor de 12.2%. Aun cuando el coeficiente de variación obtenido por el analista No.2 es mayor a comparación de los valores obtenidos por parte del analista No.1, el coeficiente de variación corresponde a un valor menor al 35% exigido por la USP 30.2007, lo cual indica que los recuentos obtenidos cumplen con lo establecido por dicho criterio. Se logra determinar por tanto, que en el ensayo realizado por el analista No.1 se controlaron mejor las variables que pudieron afectar el ensayo tales como los volúmenes de diluyentes, inóculos utilizados y la homogenización de la muestra. 63 Tabla No.12. Promedios de los Recuentos del microorganismo estándar: Staphylococcus aureus ATCC 6538 en la prueba Cuantitativa de Precisión del Intermedia. Analista No.1 Analista No.1 Analista No.2 Día No.1 Día No.2 Promedio Promedio Promedio % % % de de de Recuentos Recuperación Recuentos Recuperación Recuentos Recuperación UFC/mL UFC/mL UFC/mL Promedio Estándar 462 Replica No. 1 467 101 503 113,98 440 91 Replica No. 2 462 100 464 105,22 446 99 Replica No. 3 469 101 452 102,57 454 101 Replica No. 4 455 98 466 105,67 466 100 Replica No. 5 460 99 463 104,91 446 96 Replica No. 6 450 97 523 118,52 465 104 Replica No. 7 457 98,92 416 94,26 451 96 Replica No. 8 461 99,86 486 110,28 454 101 Replica No. 9 465 100,72 469 106,27 567 126 Replica No. 10 454 98,27 530 120,18 479 104 Promedio Replicas DE Replicas CV Replicas 441 481 460 476 467 7 34,2 56,8 1,5% 7,2% 12,2% 64 7.3.3.3.2. Precisión Entre Días. Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias En la Tabla No.12 se e presentan los resultados de las réplicas del ensayo y control positivo (Estándar) tomando como referencia los promedios de las réplicas del ensayo: Recuento de bacterias mesofilas simultáneamente se muestran también los valores de desviación estándar y coeficiente de variación correspondiente a la prueba. Los recuentos obtenidos por el analista No.1 en el día 1 y en el día 2, muestran gran similitud entre sus promedios de replicas de los ensayos y el estándar obteniendo promedios de recuentos para el ensayo de 460 UFC/mL y 476 UFC/mL respectivamente, y recuentos para el estándar de 462 UFC/mL y 4416 UFC/mL respectivamente; indicando que la metodología tiene la facultad de arrojar resultados homogéneos y preciso en variaciones tales como son los días de análisis. También se pueden observar como los valores obtenidos para el coeficiente de variación son diferentes para los días No.1. 1.5% y día No.2 7.2%, aun cuando estos difieren entre si significativamente se encuentran dentro de lo establecido por la USP.30.2007, por tanto se comprueba que la prueba es precisa también entre días de análisis para la prueba de recuento de bacterias mesofilas. 7.3.3.3.3. Precisión Entre Analistas. Recuento de Mohos y Levaduras En la Tabla No.13 se e presentan los resultados de las réplicas del ensayo y control positivo (Estándar) tomando como referencia los promedios de las réplicas del ensayo: Recuento de mohos y levaduras simultáneamente se muestran también los valores de desviación estándar y coeficiente de variación correspondiente a la prueba. En el recuento de mohos y levaduras se obtuvo una mejor concordancia y homogeneidad en los recuentos obtenidos por parte del Analista No. 1 en el día No.1 ya que presenta un Coeficiente de Variación de 1.8%, siendo este valor menor que el coeficiente de variación obtenido por parte del mismo analista No.1 en el día No.2 y también comparado con el analista No.2 los cuales presentaron coeficientes de variación de 8.9% y 7.8% respectivamente. . Aun cuando el coeficiente de variación obtenido por el analista No.1 en día No.2 y el analista No.2 es mayor comparado con el valor obtenido por parte del analista No.1 en el día No.1, los coeficientes de variación corresponde a valores menores al 35% exigido por la USP 30.2007, lo cual indica que los recuentos obtenidos por ambos analistas cumplen con lo establecido por dicho criterio. 65 Tabla No.13. Promedios de los Recuentos del microorganismo estándar: Candida albicans ATCC 10231 en la prueba Cuantitativa de Precisión de Intermedia. Analista No.1 Analista No.1 Analista No.2 Dia No.1 Dia No.7 Promedio Promedio Promedio % % % de de de Recuentos Recuperación Recuentos Recuperación Recuentos Recuperación UFC/mL UFC/mL UFC/mL Promedio Estándar 215 Replica No. 1 210 94,59 272 95 242 92,37 Replica No. 2 215 97 245 86 265 101,15 Replica No. 3 223 100,3 252 88 257 98,09 Replica No. 4 220 99,1 236 83 238 90,84 Replica No. 5 217 97,6 248 87 242 92,37 Replica No. 6 215 97 215 76 277 105,73 Replica No. 7 217 97,6 208 73 252 96,18 Replica No. 8 219 98,5 236 83 271 103,44 Replica No. 9 220 99,25 236 83 295 112,6 Replica No. 10 220 99,1 255 90 275 104,96 Promedio Replicas DE Replicas CV Replicas 285 262 217 241 261 3,9 21,5 20,5 1,8% 8,9% 7,8% 66 7.3.3.3.4. Precisión Entre Días. Recuento de Mohos y Levaduras Los recuentos obtenidos por el analista No.1 en el día 1 y en el día 2, muestran gran similitud entre sus promedios de replicas de los ensayos y el estándar obteniendo promedios de recuentos para el ensayo de 217 UFC/mL y 241 UFC/mL respectivamente, y recuentos para el estándar de 215 UFC/mL y 285 UFC/mL respectivamente; indicando que la metodología tiene la facultad de arrojar resultados homogéneos y preciso en variaciones tales como son los días de análisis. También se pueden observar como los valores obtenidos para el coeficiente de variación son diferentes para los días No.1. 1.8% y día No.2 8.9%, aun cuando estos difieren entre si significativamente se encuentran dentro de lo establecido por la USP.30.2007, por tanto se comprueba que la prueba es precisa también entre días de análisis para la prueba de recuento de bacterias mesofilas. Al obtener los resultados anteriormente vistos para el parámetro de PRECISION, se puede asegurar que la metodología propuesta es precisa y comprende dos aspectos importantes como son la Repetibilidad la cual pudo ser comprobada cuando se obtuvieron resultados conformes realizados por un mismo analista, el mismo día, mismos reactivos, mismos instrumentos (precisión dentro del ensayo). La Reproducibilidad fue comprobada cuando los recuentos fueron homogéneos y similares aun cuando se realizo por diferentes analistas, y diferentes días. (Maroto, 2000) 7.3.4. Robustez Se realizó este parámetro con la misma metodología utilizada para el recuento de bacterias mesofilas aerobias y recuento de mohos y levaduras con la variante para el ensayo de recuento de bacterias mesofilas aerobias la incubadora (Incubadora Lab Line: Usada en todos los parámetros /Memmert TV-30: Incubadora variación) En cuanto al recuento de mohos y levaduras la variación se realizó en el agar nutritivo de siembra (Agar Sabouraud 4% glucosa: Usado en todos los parámetros/ Agar PDA: Medio variación) 67 Tabla No.14 Robustez para el ensayo de Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias con la variación de Incubadora Memmert TV-30. Estándar: Staphylococcus aureus ATCC 6538 Sin Variación : Incubadora Lab-Line Con Variación: Incubadora Memmert TV-30 Promedio Recuentos Recuentos Promedio de % % de Obtenidos Recuentos Obtenidos Recuperación Recuentos Recuperación UFC/mL UFC/mL UFC UFC Estándar Replica No. 1 Replica No. 2 465 423 475 441 467 465 99 411 452 419 432 431 446 446 95 456 461 Replica No. 3 100 443 105 443 100 442 423 419 424 466 425 91 441 433 423 Promedio Promedio DE 447 19,7 DE 435 17,2 CV 4,4% CV 3,9% En el ensayo de recuento de bacterias mesofilas aerobias, se puede evidenciar como los promedios de los estándares están muy cerca y su diferencia radica en tan solo 12 UFC/mL obteniendo el mayor recuento el estándar incubado en la incubadora Lab-line. Teniendo presente que el ensayo se realizó con el mismo inoculo para ambos estándares se puede evidenciar como los recuentos entre ensayos no difieren mas del 10% entre los porcentajes de recuperación replicas y los dos ensayos. Esto se verifica con el valor tan bajo y cercano de los coeficientes de variación para el ensayo en la incubadora Lab-Line y Memmert TV-30; 4.4% y 3.8% respectivamente. Por tanto se puede inferir que la técnica es robusta al cumplir con un coeficiente de variación menor al 35% establecido por la USP 30.2007 68 También es importante mencionar que la metodología propuesta para el recuento de bacterias mesofilas aerobias es robusta teniendo presente el estudio realizado en el laboratorio de Microbiología “Implementación de una metodología para el análisis microbiológico de un producto líquido no estéril fabricado en una empresa farmacéutica” donde se evaluó Bacillus subtilis ATTC 6633 como estándar, con el mismo caldo nutritivo, Caldo Lecitina Polisorbato 20, y con las mismas condiciones anteriormente mencionadas exceptuando la presencia de cualquier producto; mostrando resultados óptimos y robustos en la validación del parámetro de Robustez para métodos cuantitativos: Recuento de bacterias mesofilas aerobias; al obtener porcentajes de recuperación homogéneos, y realizar las lecturas de recuentos correspondientes a los diferentes tiempos de incubación; 40, 48 y 76 horas. (Sanchez, J. 2007) Tabla No.15 Robustez para el ensayo de Recuento de Mohos y Levaduras con la variación del medio de cultivo: Agar PDA Candida albicans ATCC 10231 Sin variación Agar Sabouraud Agar PDA Promedio Promedio Recuentos Recuentos de de %Recuperación Obtenidos %Recuperación Obtenidos Recuentos Recuentos UFC/mL UFC/mL UFC UFC Estándar Replica No. 1 Replica No. 2 Replica No. 3 129 115 151 145 123 151 117 134 158 151 124 120 121 125 96 115 130 104 135 85 129 130 101 94 127 136 118 113 98 90 78 91 Promedio DE 126,00 12,3 CV 9,7% 69 Promedio DE 113,00 20,4 CV 18% En el caso del ensayo de recuento de mohos y levaduras se puede evidenciar como la recuperación en los estándares difiere en 14 UFC/mL un recuento muy bajo. Se puede observar en el medio nutritivo Agar Sabouraud como el porcentaje de recuperación es conforme teniendo en cuenta que se recuperó un poco más del 100% en dos replicas y en una su valor fue muy cercano al 100%. De igual forma se presentó en los porcentajes de recuperación obtenidos en los ensayos donde se utilizó Agar PDA como medio nutritivo, donde se evidencio un alto nivel de recuperación al igual que el obtenido en el ensayo paralelo. Los recuentos obtenidos en el ensayo con Agar Sabouraud mostraron un coeficiente de variación menor que en el ensayo utilizando Agar PDA 7.9% y 18%, respectivamente indicado que ambos ensayos presentaron homogeneidad en los recuentos aún cuando el ensayo con Agar PDA revelo un coeficiente de variación de mayor valor. También es importante mencionar que la metodología propuesta para el recuento de mohos y levaduras es caracterizada como robusta teniendo presente el estudio realizado en el laboratorio de Microbiología “Implementación de una metodología para el análisis microbiológico de un producto líquido no estéril fabricado en una empresa farmacéutica” donde fue evaluado un hongo filamentoso como microorganismo estándar de hongos y levaduras sugerido por la USP.30.2007, Aspergillus niger ATCC 16404 evaluado con el mismo caldo nutritivo Caldo Lecitina Polisorbato 20 y con las mismas condiciones anteriormente mencionadas exceptuando la presencia de cualquier producto; mostrando resultados óptimos y robustos en la validación del parámetro de Robustez para métodos cuantitativos: Recuento de hongos filamentosos y levaduras; al obtener porcentajes de recuperación homogéneos en las lecturas correspondientes a los diferentes tiempos de incubación; 114, 120 y 126 horas. (Sanchez, J. 2007) Al igual que en el ensayo realizado para el recuento de bacterias mesofilas aerobias se comprueba la fiabilidad en el método usado, siendo determinado gracias a los valores bajos obtenidos para los Coeficiente de Variación en cada uno de los ensayos probados y mostrando a su vez la homogeneidad de los datos entre ensayos 70 7.4. RESULTADOS PARÁMETROS CUALITATIVOS 7.4.1. Linealidad A continuación se presentan las graficas y tablas con los recuentos obtenidos después de 48 horas de incubación a una temperatura entre 30ºC – 35ºC de los tres microorganismos patógenos utilizados en dicho ensayo. Grafica No.1. Curva de Regresión para el microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. Parámetro Cualitativo: Linealidad. Curva de Regresión para Escherichia coli ATCC 8739 R2 = 0,9912 25 20 15 10 5 0 0,0E+00 -5 2,0E-07 4,0E-07 UFC/1mL 6,0E-07 8,0E-07 1,0E-06 Dilución Tabla No.16. Concentración Vs UFC/mL para el microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. Parámetro Cualitativo: Linealidad. Concentración 1,00E-01 1,00E-02 1,00E-03 1,00E-04 1,00E-05 1,00E-06 1,00E-07 1,00E-08 1,00E-09 1,00E-10 Promedio Replica No.1 UFC/mL Incontable Incontable Incontable 1572 163 22 4 1 0 0 Promedio Replica No.2 UFC/mL Incontable Incontable Incontable 1552 146 19 3 0 0 0 71 Promedio Replica No.3 UFC/Ml Incontable Incontable Incontable 1536 158 16 4 0 0 0 Promedio Incontable Incontable Incontable 1553 156 19 4 0 0 0 Grafica No.2. Curva de Regresión para el microorganismo Staphylococcus aureus ATCC 6538. Parámetro Cualitativo: Linealidad Curva de Regresión para Staphylococcus aureus ATCC 6538 UFC/1mL R2 = 0,9773 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 0,0E+00 2,0E-07 4,0E-07 6,0E-07 8,0E-07 1,0E-06 Dilución Tabla No.17. Concentración Vs UFC/mL para el microorganismo Staphylococcus aures ATCC. Parámetro Cualitativo: Linealidad. Concentración Promedio Replica No.1 UFC/ mL Promedio Replica No.2 UFC/ mL Promedio Replica No.3 UFC/ mL Promedio 1,00E-01 Incontable Incontable Incontable Incontable 1,00E-02 Incontable Incontable Incontable Incontable 1,00E-03 Incontable Incontable Incontable Incontable 1,00E-04 1239 1257 1299 1265 1,00E-05 136 142 155 144 1,00E-06 10 15 15 13 1,00E-07 3 3 4 3 1,00E-08 0 0 0 0 1,00E-09 0 0 0 0 1,00E-10 0 0 0 0 72 Grafica No.3. Curva de Regresión para el microorganismo Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Parámetro Cualitativo: Linealidad Curva de Regresión para Pseudomonas earuginosa ATCC 9027 UFC/1mL R2 = 0,9842 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 0,0E+00 2,0E-07 4,0E-07 6,0E-07 8,0E-07 1,0E-06 Dilución Tabla No. 18 Concentración Vs UFC/mL para el microorganismo Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Parámetro Cualitativo: Linealidad. Concentración Promedio Replica No.1 UFC/ mL Promedio Replica No.2 UFC/ mL Promedio Replica No.3 UFC/ mL Promedio 1,00E-01 Incontable Incontable Incontable Incontable 1,00E-02 Incontable Incontable Incontable Incontable 1,00E-03 Incontable Incontable Incontable Incontable 1,00E-04 1032 1074 1052 1053 1,00E-05 111 119 131 120 1,00E-06 10 15 16 14 1,00E-07 2 2 5 3 1,00E-08 0 0 0 0 1,00E-09 0 0 0 0 1,00E-10 0 0 0 0 73 En este parámetro se trabajó con tres microorganismos caracterizados por ser indicadores de microorganismos patógenos. Teniendo en cuenta cada una de las graficas correspondientes a los microorganismos ensayados, se puede evidenciar como los microorganismos de prueba son capaces de crecer en forma consistente a la concentración inoculada en presencia del producto. La forma en la cual se evaluó la relación entre la concentración de microorganismo inoculado y el recuento obtenido de dichos microorganismos en presencia del producto preservado, se efectuó teniendo en cuenta el coeficiente de correlación al cuadrado de cada uno de los microorganismos, realizando promedios de las 3 replicas de cada uno de los microorganismos ensayados y ejecutando la ecuación de la línea recta para cada uno. Al realizar la regresión lineal para los recuentos obtenidos de Escherichia coli, presentó un R2 de 0.99, Staphylococcus aureus R2 0.97 y Pseudomonas aeruginosa R2 0.98, indicando así la aproximación de los datos a la línea recta. Se puede concluir entonces que el ensayo realizado para los tres microorganismos patógenos presentó conformidad para el parámetro evaluado ya que se logro obtener R 2 cercanos al valor teórico 1; aun cuando la USP 30.2007 no indica un valor exacto par dicho R2 También se puede considerar que la prueba ensayada presento linealidad ya que los resultados microbiológicos cuantitativos (recuentos) mostraron capacidad de generar resultados proporcionales a la concentración de microorganismos inicialmente inoculados en la muestra. (USP 30.2007) 7.4.2. Limite de detección y especificidad Teniendo en cuenta los recuentos presentados por los tres microorganismos patógenos en el ensayo de linealidad, se determinaron los últimos niveles de concentración donde se presento un recuento homogéneo y a su vez de tuvo en cuenta el siguiente nivel de concentración donde no se presento crecimiento y se procedió a realizar siembras en profundidad siguiendo la metodología de siembra descrita en el numeral 6.3.8. Siembra 74 Posteriormente se llevó a incubación por un periodo de 24 horas a una temperatura entre 30°C – 35°C y se realizaron las correspondientes le cturas. Para confirmar la presencia del microorganismo patógeno ensayado Escherichia coli ATCC 8739 en el recuento obtenido, se realizaron una serie de bioquímicas correspondientes al microorganismo en una colonia característica por ensayo realizado, obteniendo como resultado final PRESENCIA de Escherichia coli ATCC 8739. Tabla No. 19. Parámetro Cualitativo: Límite de Detección. Microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. Concentración Replica No1 UFC/ mL Replica No2 UFC/ mL Replica No3 UFC/ mL Promedios Recuento UFC /mL 24 h después 1,00E-07 4 4 4 >1600 1,00E-08 0 0 0 No Recuento Tabla No. 20. Parámetro Cualitativo: Límite de Detección. Microorganismo Staphylococcus aureus ATCC 6538. Concentración Replica No1 UFC/ mL Replica No2 UFC/ mL Replica No3 UFC/ mL Promedios Recuento UFC/ mL 24 h después 1,00E-07 3 3 3 >1600 1,00E-08 0 0 0 No Recuento Tabla No. 21. Parámetro Cualitativo: Límite de Detección. Microorganismo Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Concentración Replica No1 UFC/ mL Replica No2 UFC/ mL Replica No3 UFC/ mL Promedios Recuento UFC /mL 24 h después 1,00E-07 2 2 2 >1600 1,00E-08 0 0 0 No Recuento 75 Tabla No. 22. Parámetro Cualitativo: Especificidad Microbiana para los microorganismos Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8937 Dilución 10 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Control Positivo Staphylococcus aures ATCC 6538 Control Negativo Control Positivo Agar. Baird Parker Caldo Mac Conkey Agar Mac Conkey Agar. Cetrimide Agar Mac Conkey Caldo Mac Conkey Agar. Cetrimide Agar. Baird Parker Agar. Baird Parker Agar. Cetrimide Caldo Mac Conkey Agar Mac Conkey Replica No. 1 Control Positivo AUSENTE Turbidez Negativa AUSENTE PRESENTE AUSENTE Turbidez Negativa AUSENTE PRESENTE AUSENTE AUSENTE Turbidez Positivo PRESENTE Replica No. 2 Control Negativo Escherichia coli ATCC 8937 AUSENTE Turbidez Negativa AUSENTE PRESENTE AUSENTE Turbidez Negativa AUSENTE PRESENTE AUSENTE AUSENTE Turbidez Positivo PRESENTE Replica No. 3 Control Negativo -7 AUSENTE Turbidez Negativa AUSENTE PRESENTE AUSENTE Turbidez Negativa AUSENTE PRESENTE AUSENTE AUSENTE Turbidez Positivo PRESENTE 59 Tabla No. 23. Parámetro Cualitativo: microorganismos Pseudomonas aeruginosa Especificidad Microbiana para los ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8937 Dilución 10-8 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Escherichia coli ATCC 8937 Repique Repique Repique Agar. Cetrimide Agar. Baird Parker Caldo Mac Conkey Agar Mac Conkey Replica No. 1 AUSENTE AUSENTE Turbidez Positivo PRESENTE Replica No. 2 AUSENTE AUSENTE Turbidez Positivo PRESENTE Replica No. 3 AUSENTE AUSENTE Turbidez Positivo PRESENTE Para este ensayo se realizó siembra de las diluciones correspondientes a cada microorganismo con el nivel mas bajo de concentración evidenciado en el ensayo de -7 linealidad (Dilución 10 ) y el siguiente nivel de concentración donde no se evidencio crecimiento (Dilución 10-8) y se procedió a incubar a temperatura entre 30°C – 35°C . Los datos obtenidos muestran como la recuperación de los microorganismos en la dilución -7 10 presenta un crecimiento satisfactorio teniendo en cuenta la concentración inicial - inoculada. Staphylococcus aureus mostró una recuperación de >1600 UFC/mL (Dilucion10 7 -8 ) y 0 UFC/mL (Dilución 10 ) pasadas 24 horas de incubación, teniendo en cuenta la baja concentración inoculada inicialmente y observando el recuento después de 24 horas de incubación, se destaca entonces la capacidad del caldo de enriquecimiento para recuperar el microorganismos de ensayo. De igual manera se presento la recuperación de Escherichia coli, inoculando inicialmente 7 -7 un promedio de células de 4 x10- UFC/mL (Dilucion10 ) obteniendo un recuento final de >1600 UFC/mL y 0 UFC/mL (Dilución 10-8). En el caso de de Pseudomonas aeruginosa se inoculó un promedio de 7 -7 2 x10- UFC/mL (Dilucion10 ) obteniendo un recuento final de -8 >1600 UFC/mL y 0 UFC/mL (Dilución 10 ). 60 Teniendo presente los recuentos finales de cada uno de los microorganismos se puede constatar la capacidad de cada uno de los microorganismos de recuperarse y crecer en presencia de producto a lo largo de un tiempo de enriquecimiento e incubación, comprobando una vez más las características inactivantes del polisorbato presente en el caldo nutritivo. Para realizar el ensayo de especificidad y determinar el límite de detección se realizó el enriquecimiento de los microorganismos de prueba correspondientes a cada nivel donde presentaron en el ensayo de linealidad el recuento mas bajo y homogéneo y los subsiguientes diluciones que no presentaron crecimiento; con el fin de verificar la pureza de cada microorganismo presente en el caldo nutritivo. Se logró confirmar la presencia de los microorganismos evidenciados en el recuento a partir de la dilución 10 -7 ;de forma cualitativa para Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa y la ausencia de lo microorganismos anteriormente mencionados -8 en la dilución 10 de forma también cualitativa, esto hace pensar que en las diluciones siguientes 10 -9 y 10 -10 también arrojaran resultados de ausencia para cada uno de los microorganismos ensayados. De esta manera se puede dar cumplimiento al parámetro según el criterio establecido por la USP 30.2007 donde define el límite de detección como el número más bajo de microorganismos en una muestra que puede detectarse bajo las condiciones experimentales establecidas. 7.4.3. ROBUSTEZ En este parámetro se evaluó la capacidad del caldo de cultivo utilizado en la validación (Caldo Lecitina Polisorbato 20) como fuente nutritiva en los diferentes tiempos de incubación del microorganismo Escherichia coli ATCC 8739 para su prenriquecimiento, siendo inoculada cada una de las muestras con una suspensión celular aproximadamente de 100 UFC/mL. La USP 30.2007 establece como tiempos de prenriquecimiento de 18-24 horas, por lo tanto se procedió a realizar la modificación horas antes y horas después de las estipuladas por la USP (17 horas, 24horas, 36 horas). 61 Tabla No.23. Parámetro Cualitativo: Robustez. Para el Microorganismo Escherichia coli ATCC 8739. Escherichia coli ATCC 8739 Replica s Control Negativo 17 Horas 24 Horas Incubaci Incubaci ón ón 36 Horas Incubaci ón Resiembra Agar. Baird Parker Agar. Cetrimide Caldo Mac Conkey Caldo Mac Conkey Caldo Mac Conkey 17 Horas Incubación 24 Horas Incubación 36 Horas Incubación 1. Replica No. 1 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE 1. Replica No. 2 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE 1. Replica No. 3 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE 2. Replica No. 1 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE 2. Replica No. 2 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE 2. Replica No. 3 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE Estándar No.1 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE Estándar No.2 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE Estándar No.3 AUSENTE AUSENTE TURBIDEZ TURBIDEZ TURBIDEZ PRESENTE PRESENTE PRESENTE Teniendo presente la variación de tiempos de incubación, se puede observar como el caldo ensayado posee las capacidad de recuperar desde la hora 17 de incubación el microorganismo inoculado, siendo confirmado por la turbidez observada en cada uno de los frascos de ensayo y por la confirmación de la prueba AUSENCIA/PRESENCIA para Escherichia coli. De esta manera se demuestra la robustez del método en cuanto a la estimación cualitativa de microorganismo Eschericha coli. Teniendo en cuenta que se comprobó la presencia de Escherichia coli en los tres diferentes tiempos ensayados, se puede dar conformidad al ensayo de robustez para cualitativos, indicando así que en los tiempos evaluados de incubación en presencia del producto 62 preservado con parabenos el microorganismo no presenta inhibición siendo comprobada frente a un estándar (Control Positivo) y en la prueba realizada de AUSENCIA/PRESENCIA. Cabe recordar que en la actualidad se ha generado una gran aceptación e interés por los temas relacionados con seguridad y calidad de los productos farmacéuticos, teniendo presente que estos son productos vitales dentro de la asistencia de la salud. Es por esto que la industria farmacéutica debe velar por el total cumplimiento de la normatividad nacional e internacional tanto para sus formulaciones como para el control de calidad que se establece para cada producto fabricado. Por tanto la validación de un proceso toma gran relevancia en el mismo, ya que es la demostración escrita y experimental con un alto grado de confianza que un transcurso específico arrojará de forma consistente y permanente productos que poseerán las características de calidad predefinidas. Dentro de las validaciones de técnicas analíticas de productos es importante tener en cuenta la neutralización de agentes preservantes que contenga el producto farmacéutico ya sea por el uso de sustancias neutralizantes específicos, por dilución, por combinación de lavado y dilución o por cualquier combinación de esos métodos. Para asegurar que los resultados de los ensayos de control microbiológico de producto y límites microbianos sean verídicos, la neutralización de las propiedades antimicrobianas del ensayo solución es necesariamente requerida antes de estimar el número de microorganismos viables y esto a su vez requiere la validación del método de recuperación (USP .30. 2007) De esta manera se lograra obtener resultados confiables en cuanto a los diferentes parámetros a tener en cuenta en una validación como los son la exactitud, precisión, robustez, limite de detección, y especificidad. En el presente trabajo se evidencia el cumplimiento de todos los parámetros evaluados y exigidos por la USP.30.2007 para una validación de tipo concurrente, demostrando ser un método preciso y exacto al obtener siempre recuentos homogéneos y similares en los diferentes ensayos. También se logra establecer de acuerdo a los porcentajes de recuperación obtenidos en los diferentes ensayos, que se encuentran en un rango entre 90 al 127%, que el caldo nutritivo utilizado es el adecuado ya que presenta la faculta de inactivar los agentes preservantes presentes en la muestra. 63 De esta forma se determina que la metodología propuesta en este trabajo y una vez validada, posee la capacidad de arrojar datos confiables en el análisis de control de calidad microbiana de un producto preservado con parabenos y con las mismas características del producto con que se desarrollo la validación. 64 8. CONCLUSIONES • Se demostró de forma documentada que la técnica recomendada por la USP.30.2007 es reproducible y repetible demostrando plena confiabilidad en el momento de su realización. • Todos los parámetros de validación cumplieron la especificación dada por la USP.30.2007 presentando conformidad en la totalidad de los parámetros evaluados. • Se elaboró el protocolo de validación y una técnica analítica del análisis microbiológico para productos con agentes parabenos dentro de su formulación. • Se realizo una técnica analítica microbiológica com las herramientas necesarias para el análisis microbiológico de un producto liquido preservado con agentes parabenos, producido por uma industria farmaceutica. • De acuerdo a los porcentajes de recuperación obtenidos en los diferentes ensayos, se observo que la mayoría de ellos se encontraban em um rango entre 90 al 127% demostrando así la exactitud del método. Por lo tanto se puede asegurar que los futuros resultados obtendrán una confiabilidad del 90 al 127% • Confrontando los controles negativos de los médios de cultivo utilizados y el producto utilizado como muestra, no se observa ningún tipo de contaminación ni diferencia significativa en cuanto a recuentos teniendo en cuenta el factor del tiempo. • Se encuentra relevante la utilización de blancos (Médios de cultivo, caldo nutritivo) en los estúdios para asegurar que no se esta aportando ningún tipo de contaminación por parte de los analistas ni del médio ambiente donde se desarrollo la metodologia. 65 9. RECOMENDACIONES • Se recomienda al iniciar una validación de una técnica para un producto que contenga agentes antimicrobianos o antifungicos realizar como primera instancia una verificación acerca de la inactivación del agente. • Al aplicar esta técnica analítica para productos que contengan este mismo agente preservante se recomienda realizar ensayos previos y revisar demás componentes de la formulación farmacéutica del producto. • Evaluar la posibilidad de reducir procedimientos y/o ensayos en la realización de la validación que puedan disminuir tiempo, costos, recursos. • Se aconseja validar esta misma técnica para el análisis microbiológico de otros productos y matérias primas, revisando las posibles variaciones según muestra. • Se recomienda revisar protocolos periodicamente para verificar los posibles câmbios com el tiempo. 66 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS • Barragán Blanco Diana Constanza. 2001. Validación De las Pruebas Esterilidad e Inocuidad de la Vacuna Antiamarìlica. Microbióloga Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Ciencias. Microbiología. Bogota. Pagina 40 • Comisión Europea. CALIFICACION Y VALIDACION. Septiembre 2001. En: http://pharmacos.edudra.org/F2//edudralex/vol-4/pdfs-m/v4an15es.pdf • Kibbe H Arthur. 2000. Handbook of Pharmaceutical Exipients. American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. Third Edition. Pág:340-342, 450-452, 510 • Montalvo Aguirre Edmundo. 1989. Introducción a la tecnología farmacéutica. Primera edición. Editorial universitaria Universidad Central del ecuador. Quito, Ecuador. Pág.; 22-23 • Sánchez Sánchez Joel. 2007. Implementación de una Metodología para el Análisis Microbiológico de un Producto no Estéril fabricado en una Industria Farmacéutica. Microbiólogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Ciencias. Microbiología. Bogota. • USP XXX. 2007. Pharmacopea. The United States Phamacopeia. The official compendia of standards. USA: United States Phamacopeia Convention Inc. Rockville, Md. • WHO. 1999. Quality assurance of pharmaceuticals. Volume 2. Good manufacturing practices and inspection. Ginebra, Suiza. p: 27-39 67 ANEXO Prueba estadística ANOVA para Recuento de Mohos y Levaduras • Prueba F para varianzas de dos muestras Variable 1 Media Varianza Observaciones Grados de libertad F P(F<=f) una cola Valor crítico para F (una cola) 217,5666667 15,70229885 30 29 0,449868087 0,301301827 0,795724604 Variable 2 215,2 19,73333333 10 9 Prueba estadística t ANOVA para Recuento de Mohos y Levaduras • Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales Variable 1 Media Varianza Observaciones Varianza agrupada Diferencia hipotética de las medias Grados de libertad Estadístico t P(T<=t) una cola Valor crítico de t (una cola) P(T<=t) dos colas Valor crítico de t (dos colas) 217,5666667 15,70229885 30 16,65701754 0 38 1,588068034 0,060278988 1,685954461 0,120557975 2,024394147 68 Variable 2 215,2 19,73333333 10 69
