CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE LOS COMPUESTOS
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I ire UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA BIOLÓGICA CAMPUS XALAPA UNIDAD DE SERVICIOS DE APOYO EN RESOLUCIÓN ANALÍTICA CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES EMITIDOS POR Pachira aquatica MEDIANTE HEADSPACE DINÁMICA – GC – MS TESIS QUE PARA ACREDITAR LA EXPERIENCIA RECEPCIONAL DE LA CARRERA DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO PRESENTA IVÁN DE JESÚS PALE EZQUIVEL DIRECTORA DRA. ZAIRA J. DOMÍNGUEZ ESQUIVEL XALAPA-ENRIQUEZ, VER. CO-DIRECTOR DR. ARMANDO AGUIRRE JAIMES DICIEMBRE 2014 II III El presente trabajo se realizó en la Unidad de Servicios de Apoyo en Resolución Analítica (SARA) de la Universidad Veracruzana, bajo la dirección de la Dra. Zaira J. Domínguez Esquivel y la co-dirección del Dr. Armando Aguirre Jaimes. Las mediciones cromatográficas se realizaron gracias al financiamiento del proyecto de Fondos Mixtos COVECyT-México FOMIX VER-2009-C03-127523. IV AGRADECIMIENTOS A la Dra. Zaira Domínguez por su dirección, apoyo, consejos y recomendaciones que permitieron la realización de este trabajo recepcional. Al Dr. Armando Aguirre (Instituto de Ecología A.C.) por su acertada co-dirección y el apoyo en la comprensión de temas relacionados con ecología reproductiva, asimismo por las facilidades prestadas para las visitas a la Reserva de la Biósfera de la Selva de los Tuxtlas. A la Dra. Remedios Mendoza y a la Dra. Magda Olivia Pérez, por el tiempo destinado para la lectura, corrección y comentarios hechos a este trabajo. A la Biol. Rosamond Coates (Instituto de Biología – UNAM) por las facilidades prestadas para la localización de la zona de muestreo y el trabajo realizado en la Estación de Biología Tropical “Los Tuxtlas” – UNAM. A J. Laborde-Dovalí y R. Langrave (Instituto de Ecología A.C.) por la elaboración del mapa del sitio de estudio. A la Biol. Dulce Rodríguez por el apoyo brindado durante el trabajo de campo realizado para la captura de los volátiles. A la M.C. Evelin Martínez y a la M.Q.B. Analilia Sánchez por sus conocimientos compartidos y su valiosa asistencia durante mi estancia en el laboratorio. A la Dirección General de Investigaciones de la Universidad Veracruzana por la beca como auxiliar de investigador perteneciente al SNI. V Índice Resumen ....................................................................................................................................VI Introducción ................................................................................................................................. 1 1. Antecedentes............................................................................................................................ 4 1.1 Volátiles florales ............................................................................................................................ 4 1.1.1 Clasificación de compuestos orgánicos volátiles .................................................................... 4 1.1.2 Compuestos orgánicos volátiles más comunes ....................................................................... 6 1.2 Headspace dinámica ....................................................................................................................... 7 1.3 Separación de los volátiles capturados ........................................................................................... 9 1.4 Identificación de los volátiles capturados .................................................................................... 10 1.4.1 Índices de Retención ............................................................................................................. 11 1.5 Pachira aquatica .......................................................................................................................... 14 1.5.1 Flores ..................................................................................................................................... 15 1.5.2 Hojas, Frutos y Semillas........................................................................................................ 16 1.5.3 Biología reproductiva ............................................................................................................ 17 1.5.4 Usos ....................................................................................................................................... 17 1.5.5 Estudios químicos previos ..................................................................................................... 18 2. Planteamiento del Problema .................................................................................................. 20 2.1 Hipótesis....................................................................................................................................... 21 3. Objetivos................................................................................................................................ 22 3.1 Objetivo General .......................................................................................................................... 22 3.2 Objetivos Particulares .................................................................................................................. 22 4. Material y Métodos................................................................................................................ 23 4.1 Reactivos comerciales .................................................................................................................. 23 4.2 Captura de volátiles ...................................................................................................................... 23 4.3 Análisis de los volátiles ................................................................................................................ 25 4.4 Identificación de los volátiles ....................................................................................................... 26 5. Resultados y Discusión.......................................................................................................... 27 6. Conclusión ............................................................................................................................. 35 7. Referencias bibliográficas ..................................................................................................... 36 ANEXOS ................................................................................................................................... 42 VI Resumen Los compuestos volátiles emitidos por flores juegan un rol importante en las interacciones planta-polinizador, pues la visita discriminatoria de los polinizadores se debe en gran medida a los volátiles florales presentes en las esencias teniendo implicaciones importantes en la reproducción de las plantas. Aunque las distintas especies de plantas comparten muchos componentes químicos en sus esencias, la combinación y concentración es diferente para cada especie, formando un código de aroma único que determina el tipo de polinizador que atrae. Pachira aquatica (Malvaceae) es un árbol nativo y dominante en humedales de agua dulce en la Planicie Costera del Golfo de México que posee visitantes florales de diversas especies, especialmente murciélagos y esfíngidos; sin embargo, aún se desconoce cuál de ellos es el polinizador efectivo. Por ello, en este trabajo se propuso identificar la naturaleza y concentración de los compuestos volátiles presentes en su esencia, para discernir sobre el tipo de polinizador que atrae, así como aspectos más finos de su biología reproductiva. Esto fue posible empleando la metodología Headspace dinámica y Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC-MS). De esta manera se identificaron 25 compuestos volátiles presentes en la esencia floral, de los cuales los más abundantes son el trans-β-ocimeno (50.987%), (z)-3-hexenil acetato (16.473%), trans-cariofileno (4.035%), metil salicilato (3.214%) y linalool (2.479%). De acuerdo a lo reportado en la literatura los murciélagos del continente americano son atraídos por compuestos azufrados, sin embargo la ausencia de éstos en Pachira aquatica nos hace suponer que no son los únicos polinizadores efectivos y que los esfíngidos son los que están siendo atraídos por la esencia floral. 1 Introducción Las esencias florales son un factor importante en la atracción de polinizadores a larga distancia pues aunque se sabe poco acerca de la respuesta de los polinizadores a componentes individuales encontrados en las esencias, es bastante claro que son capaces de distinguir entre mezclas complejas de volátiles emitidos por flores (Dudareva y Pichersky, 2000). Las esencias florales varían ampliamente en número, identidad y cantidades relativas de compuestos volátiles. Las investigaciones demuestran que los compuestos comúnmente encontrados en tales esencias son monoterpenos como limoneno, (E)-ocimeno, mirceno, linalool, α- y β-pineno, y bencenoides como benzaldehído, metil 2-hidroxibenzoato (metil salicilato), alcohol bencílico y 2-fenil etanol, los cuales aparecen entre el 54 y el 71% de las familias de flores investigadas. El sesquiterpeno cariofileno y los terpenos irregulares como 6metil-5-hepten-2-ona son también muy comunes y aparecen en más del 50% de las familias de angiospermas (Knudsen et al., 2006). Para la captura de estos compuestos volátiles o semi-volátiles que las plantas liberan generalmente se emplea el método de Headspace dinámica (dynamic heaspace), el cual permite recolectar los compuestos liberados por la planta entera o por algunas estructuras como yemas, flores o frutos, así como la captura de feromonas sexuales, de agregación u ovoposición de insectos (Tholl et al., 2006). Este método es usualmente fácil de aplicar en el campo colocando una estructura floral aun conectada al resto de la planta dentro de una cámara de cristal o en bolsas de poliacetato para después crear un flujo de aire con una bomba operada por baterías capturando los compuestos volátiles mediante la adsorción de los mismos en trampas o cartuchos con polímeros artificiales porosos o con carbón activado (Raguso y Pellmyr, 1998; Stachenko y Martínez, 2008). Después de un periodo de tiempo determinado, los volátiles adsorbidos en los polímeros son extraídos con un disolvente orgánico. Luego la solución es inyectada en un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas, el cual separa los diferentes compuestos de la mezcla que constituye la esencia floral, y cada volátil es identificado por su espectro de masas (Kaiser en Müller y Lamparsky, 1994), empleando la base de datos NIST, comparando los tiempos de retención de cada uno de los componentes de la esencia con estándares puros disponibles comercialmente y/o estimando los 2 índices de retención correspondientes para cotejarlos con los reportados en la literatura (Tholl y Röse en Dudareva y Pichersky, 2006). Los grandes avances en las técnicas para extracción de volátiles y su identificación han permitido caracterizar más de 1720 compuestos orgánicos volátiles en esencias florales de alrededor de 1000 especies de plantas (Knudsen et al., 2006). Sin embargo, existen aún muchas especies que han sido poco estudiadas o incluso continúa sin investigarse la química de sus volátiles florales, tal es el caso de Pachira aquatica, un árbol tropical muy común en los humedales de la Planicie Costera del Golfo de México perteneciente a la familia Malvaceae y subfamilia Bombacoidea (Lorenzi, 1992; Infante-Mata et al., 2011) que ha sido propuesta como una especie promisoria para la restauración de los humedales debido a su alta capacidad de germinación (Infante-Mata y Moreno-Casasola, 2005). La mayoría de los árboles de esta familia como Ceiba pentandra, C. aesculifolia, C. grandiflora, Pachira quinata y Pseudobombax ellipticum, son predominantemente autoincompatibles por lo que dependen de sus polinizadores para lograr su éxito reproductivo (Fuchs et al., 2003; Quesada et al., 2004; Lobo et al., 2013;). Existen investigaciones recientes sobre la biología de polinización de esta especie pero en ellas se ignora por completo la naturaleza química de su esencia floral. Las flores de Pachira aquatica son visitadas por 9 especies distintas de murciélagos, entre ellos Leptonycteris yerbabuenae (familia Phyllostomidae), el cual se ha propuesto como el polinizador efectivo de Pachira aquatica debido a que se ha observado que transporta grandes cantidades del polen de ésta. La flor también es visitada por los esfíngidos Manduca rustica, Cocytius duponchel y Eumorpha satellita. Sin embargo aun no se sabe con certeza cuál es el polinizador efectivo ya que la contribución de cada uno de ellos al éxito reproductivo de la especie puede variar (Hernández-Montero y Sosa, 2014). Por otra parte, se ha reportado en la literatura que los murciélagos son atraídos por compuestos azufrados presentes en las esencias de las flores que polinizan (von Helversen et al., 2000), por lo que si L. yerbabuenae es el polinizador efectivo de Pachira aquatica, su esencia debe contener este tipo de compuestos. 3 En este contexto, en el presente trabajo se caracterizó químicamente a los compuestos volátiles presentes en la esencia floral de Pachira aquatica mediante la técnica Headspace dinámica y Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC-MS), lo que contribuye a discernir sobre el polinizador efectivo de la especie, y por lo tanto favorece su conservación. 4 1. Antecedentes Las plantas interactúan con diversos organismos en su ambiente, ya que por un lado deben defenderse contra herbívoros y patógenos para sobrevivir y por el otro necesitan atraer a polinizadores para su reproducción (Schiestl, 2010). Para ello se valen de la forma, el color, la estructura y textura de las flores, del néctar y de los aromas florales (Raguso, 2004; Pacini et al., 2008; Grajales-Conesa et al., 2011). En las últimas décadas han sido precisamente las esencias florales las que han llamado la atención de los ecólogos, ya que cuando están presentes son determinantes en la atracción de polinizadores (Dudareva y Pichersky, 2000; Vainstein et al., 2001; Marín-Loaiza y Céspedes, 2007). 1.1 Volátiles florales Químicamente las esencias florales consisten en mezclas complejas de compuestos orgánicos volátiles que son altamente lipofílicos y de bajo peso molecular, los cuales se evaporan al ser expuestos al aire o a temperatura ambiente ya que sus presiones de vapor son altas (Dudareva et al., 2004; Dudareva y Negre, 2005). Las esencias florales varían ampliamente en el número, identidad y cantidad relativa de cada compuesto según la especie, lo que permite la creación de un código de aroma único, y el reconocimiento de éste por los insectos polinizadores da lugar a la visita discriminatoria de los mismos a las flores, generando interacciones específicas planta-animal (Dudareva y Pichersky, 2000; Cunningham et al., 2006; Grajales-Conesa et al., 2011). 1.1.1 Clasificación de compuestos orgánicos volátiles Generalmente, los volátiles florales pueden clasificarse en tres familias principales: los terpenoides (que incluye a monoterpenos y sesquiterpenos), los bencenoides y los compuestos alifáticos (también llamados volátiles de hojas verdes), los cuales se sintetizan por las vías del mevalonato, del shikimato y por rutas para síntesis de ácidos grasos, respectivamente. Una descripción detallada de estas rutas se muestra en la Figura 1. Además en algunos casos también pueden estar presentes compuestos nitrogenados o azufrados (Marín-Loiaza y Céspedes, 2007). 5 Acetil Coenzima A Dióxido de carbono O Ácido linolénico Vía ácidos grasos Lipooxigenasa OH Ácido 13-hidroperoxilinolénico O OOH Glucosa Glucólisis Piruvato Gliceraldehído-3-P Vía de pentosas fosfato o Glicólisis OH Vía del mevalonato Vía DEOXP Eritrosa-4-fosfato 1-Deoxi-D-xilulosa-5-fosfato O OPP Ácido shikímico IPP (isopentenil pirofosfato) Vía del ácido shikímico N H Dimetil nonatrieno Indol Ácido corísmico O O OH Ácido cinámico OH OH Ácido salicílico Salicilato de metilo O Ácido 7isojasmónico Vía de volátiles de hojas verdes O OH OH Ocimeno Linalool O H O O OH 3-(Z)-hexenal O OH 3-(Z)-hexenol OH Ácido benzoico Benzoato de metilo Farneseno Cariofileno 3-(E)-hexenol Modificada de Marín-Loaiza y Céspedes, 2007 Fig. 1 – Rutas metabólicas para la síntesis de compuestos volátiles en plantas. Los terpenoides (monoterpenos y sesquiterpenos) se sintetizan a partir de la vía del mevalonato, los bencenoides a partir de la vía del shikimato y los compuestos alifáticos a partir de los ácidos grasos. 6 1.1.2 Compuestos orgánicos volátiles más comunes Dentro de los compuestos más comunes encontrados en las esencias florales destacan monoterpenos como limoneno, β-ocimeno, mirceno, linalool, α-pineno, y β-pineno, los cuales se presentan entre el 59% y 71% de angiospermas ya estudiadas; sesquiterpenos como el cariofileno en el 52% de las familias, además del nerolidol y el farneseno. Están presentes también bencenoides como benzaldehído, metil salicilato, alcohol bencílico y 2-fenil etanol encontrados entre el 52 y 64% de las familias. Ejemplos de derivados de ácidos grasos son (Z)-3-hexenal, (Z)-3-hexenol, 3-hexenil acetato y los jasmonatos (Fig. 2) (Dudareva y Pichersky, 2000; Knudsen et al., 2006; Marín-Loaiza y Céspedes, 2007). OH A1 A2 OH O B O H OH OH O OH O O C O OH O O OR Fig. 2 - Estructuras químicas de los compuestos volátiles florales más comunes. A1) Monoterpenos, de izquierda a derecha: limoneno, β-ocimeno, mirceno, linalool, α-pineno, y β-pineno. A2) Sesquiterpenos: cariofileno, nerolidol y farneseno. B) Bencenoides: benzaldehído, metil salicilato, alcohol bencílico y 2-fenil etanol. C) Compuestos alifáticos: (Z)-3-hexenal, (Z)-3-hexenol, 3-hexenil acetato y jasmonato. 7 Se sabe que los compuestos de tipo aromático (bencenoides) tienen principalmente funciones de atracción de polinizadores, mientras que los monoterpenos por lo general se secretan como defensa ante herbívoros y ante el ataque de hormigas. Sin embargo, cada compuesto de manera individual puede tener múltiples funciones dependiendo de la especie, tal es el caso de algunos monoterpenos los cuales también tienen un papel importante en la atracción de abejas para la polinización de algunas flores (Schielt, 2010). Para la polinización por palomillas se ha reportado que resultan relevantes compuestos como el linalool, alcoholes aromáticos (alcohol bencílico, 2-feniletanol) y ésteres derivados de éstos, así como pequeñas cantidades de compuestos que contienen nitrógeno (Jürgens et al., 2002). A diferencia de las flores polinizadas por abejas y palomillas, en las que son polinizadas por murciélagos, la mezcla de volátiles por lo general tiene un olor desagradable (Marín-Loaiza y Céspedes, 2007). En el caso de especies de plantas del continente americano polinizadas por murciélagos nectarívoros (Phyllostomidae) este aroma característico es causado principalmente por la presencia de compuestos azufrados (di y trisulfuros), además de monoterpenos (limoneno, α-pineno y 1,8-cineol) y sesquiterpenos como cariofileno (von Helversen et al., 2000; Petterson et al., 2004). Lo mismo sucede en las plantas polinizadas por moscas, donde los aromas desagradables son causados por algunas aminas, el indol y p-cresol que contribuyen a un olor similar al del estiércol (Kite, 1995; Marín-Loaiza y Céspedes, 2007). Sin embargo, a pesar de las relaciones entre plantas y polinizadores que ha sido posible establecer, es importante mencionar que dentro de la misma especie, la función de cada volátil dependerá del contexto y de las cantidades que se liberan (Schielt, 2010). 1.2 Headspace dinámica El incremento del interés científico en los compuestos volátiles de las plantas y su relación con la ecología así como los avances en química analítica han permitido el desarrollo de técnicas que permiten la captura y el análisis de estos volátiles (Tholl et al., 2006). Entre las técnicas más importantes para la captura se encuentran la Microextracción en Fase Sólida (SPME, por sus siglas en inglés) y Headspace dinámica. A pesar de que SPME facilita en gran medida el análisis de volátiles, no permite la cuantificación de diferentes tipos de compuestos 8 dentro de una misma muestra (Romeo, 2009), por lo tanto, en su lugar se emplea la metodología Headspace dinámica. En Headspace dinámica, un flujo continuo de aire pasa a través de un contenedor en cuyo interior se encuentra la flor y sus volátiles liberados, este aire y la mezcla de volátiles pasa luego a través de un cartucho con polímeros adsorbentes donde los analitos son atrapados mientras el aire sigue circulando permitiendo la captura de cantidades suficientes de volátiles para su detección (Tholl et al., 2006; Stachenko y Martínez, 2008). Para poder llevarla a cabo, se coloca una flor o inflorescencia dentro de envases pequeños de vidrio o dentro de bolsas de poliacetato para hornear, el aire entra al envase a través de un filtro de carbón activado para evitar contaminación y sale a través de un cartucho con polímeros adsorbentes que se encuentra conectado a una bomba de vacío la cual hace posible el flujo continuo (Fig. 3) (Raguso y Pellmyr, 1998; Tholl y Röse en Dudareva y Pichersky 2006). Modificada de Raguso y Pellmyr, 1998 Fig. 3 – Esquema general de la metodología Headspace dinámica; muestra la cámara donde se encuentra la flor, la posición del cartucho de carbón que sirve de filtro y el cartucho con polímero adsorbente, así como la bomba de vacío. Los polímeros adsorbentes más utilizados para la captura de volátiles son Porapak-Q®, su versión refinada Super-Q®, Tenax GC®, su versión más limpia Tenax TA® (de Alltech Associates) y carbón activado. Tanto Tenax (poli(óxido de 2,6-p-difenil-fenileno)) como Porapak (etilvinilbenceno-divinilbenceno) comparten propiedades similares pues ambos tienen 9 una alta afinidad por compuestos de poca a mediana polaridad, de peso molecular intermedio y una baja afinidad por compuestos polares de bajo peso molecular como el etanol y el agua (Dettmer y Engewald, 2002). Una vez atrapados los volátiles, son eluidos de los polímeros dentro de viales de cristal empleando cantidades pequeñas de disolventes orgánicos de alta pureza y de bajo punto de ebullición como pentano, hexano, éter o acetona. Luego este extracto de volátiles se concentra bajo un flujo suave de Nitrógeno y posteriormente se le añade una cantidad definida de algún compuesto que se utiliza como estándar para realizar el análisis cuantitativo (Kaiser en Müller y Lamparsky, 1994; Tholl y Röse en Dudareva y Pichersky, 2006). Para el estudio de estos volátiles, la técnica más utilizada es la combinación de la cromatografía de gases con la espectrometría de masas (GC-MS). 1.3 Separación de los volátiles capturados La solución obtenida a partir de los polímeros porosos es analizada en un cromatógrafo de gases para separar los compuestos orgánicos volátiles presentes en la esencia floral (Dudareva y Pichersky, 2000). En la cromatografía de gases, la muestra se vaporiza y los compuestos presentes se desplazan mediante la ayuda de un gas inerte (fase móvil) a través de una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un relleno sólido inerte o en las paredes de un tubo capilar (fase estacionaria). Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven con mucha lentitud con el flujo de la fase móvil; en cambio, los componentes unidos débilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez. Como consecuencia de las distintas velocidades de migración, los compuestos presentes en la muestra se separan en bandas o zonas que al llegar al extremo de una columna son detectadas obteniendo un gráfico denominado cromatograma (Skoog et al., 2008). Para lograr lo anterior, la solución es inyectada en la columna del cromatógrafo a través del puerto de inyección, el cual debe encontrarse a una temperatura que permita la vaporización completa de los compuestos volátiles presentes en la muestra, por lo que generalmente se ajusta entre 230 y 250° C (Tholl y Röse en Dudareva y Pichersky 2006). La 10 inyección puede realizarse en modo Split o Splitless. El modo Split permite entregar rápidamente una pequeña fracción conocida de la muestra inyectada y el resto se desecha, mientras que en el modo Splitless se introduce la muestra entera inyectada lo cual es preferible para un análisis de mayor sensibilidad en muestras a bajas concentraciones de analito (Snow en Grob y Barry 2004; Skoog et al., 2008). Las columnas más utilizadas son las columnas capilares de sílice fundida en cuya superficie interna se encuentra unida la fase estacionaria. La fases estacionarias más comunes pueden ser no polares de dimetil polisiloxanos, como DB-1, DB-5, CPSil 5, SE-30, y OV-1, y las polares de polímeros de polietilenglicol como Carbowax™ 20M, DB-Wax y HP-20M. Generalmente estas columnas miden alrededor de 30m de longitud con un diámetro interno de 0.25mm y la fase estacionaria se encuentra dentro con un grueso de película de 0.2 a 0.3 µm (Tholl y Röse en Dudareva y Pichersky, 2006). 1.4 Identificación de los volátiles capturados Una vez que cada compuesto volátil ha sido separado en el cromatógrafo de gases, cada volátil es identificado por su espectro de masas (Dudareva y Pichersky, 2000). En un sistema acoplado GC-MS, los volátiles separados provenientes del cromatógrafo son introducidos a través de una línea de transferencia a una fuente de ionización (Fig. 4). Estos analitos ya vaporizados son ionizados mediante impacto electrónico produciendo iones de las moléculas y/o de sus fragmentos los cuales son detectados por un “electron multiplier”. El espectro de masas resultante es mostrado como un gráfico de las intensidades relativas de cada ion contra su relación masa/carga (m/z). Los datos generados tanto de la separación cromatográfica como de la espectrometría de masas permiten relacionar cada pico cromatográfico correspondiente a un compuesto con su respectivo patrón de fragmentación (Masucci y Caldwell en Groub y Barry, 2004). Los espectros de masas obtenidos de cada compuesto son comparados con aquellos disponibles en bases de datos para encontrar la mayor similitud entre ellos y así identificar tentativamente a los compuestos presentes en la muestra (Tholl y Röse en Dudareva y Pichersky, 2006). Una de las bases de datos más utilizadas es la del NIST (National Institute of Sciencie and Technology) pues contiene los patrones de fragmentación de 11 aproximadamente 120,000 compuestos orgánicos (Snyder en Groub y Barry, 2004). Esta base de datos posee además una interfase amigable que permite navegar en ella empleando el nombre común de un compuesto, el nombre IUPAC o la fórmula molecular, por lo que resulta una herramienta poderosa para la identificación de las muestras de volátiles. Modificada de Groub y Barry, 2004 Fig. 4 – Diagrama de un sistema acoplado GC-MS. El analito gaseoso que eluye del cromatógrafo entra en la fuente de ionización del espectrómetro donde es ionizado. Los iones producidos son separados de acuerdo a su relación m/z y son detectados. Sin embargo, a pesar de la utilidad de la base de datos NIST, ésta solo nos genera una lista de compuestos probables correspondientes a cada pico cromatográfico, por lo que para lograr una identificación precisa de los compuestos volátiles, es necesario comparar los tiempos de retención de cada compuesto con los de estándares analíticos puros analizados bajo las mismas condiciones cromatográficas, los cuales deben coincidir (Tholl y Röse en Dudareva y Pichersky, 2006). 1.4.1 Índices de Retención Otro dato útil para la identificación de los volátiles es el índice de retención, cuyo valor muestra el comportamiento de retención de un compuesto dado con respecto a una escala de nalcanos (Jennings y Shibamoto, 1980). Para calcular este índice se utiliza una serie de alcanos normales usados como referencia y a cada uno se le asigna un índice de retención arbitrario, 12 de 100 veces su número de carbonos, por ejemplo para octano, decano y dodecano sus índices de retención son 800, 1000 y 1200 respectivamente; luego los tiempos de retención de los nalcanos son relacionados matemáticamente con su índice de retención, y el índice de retención del compuesto de interés se determina usando las fórmulas correspondientes (Grob y Kaiser en Grob y Barry 2004). Cuando los índices de retención son calculados empleando isotermas, los datos obtenidos tienen una mayor precisión pues los valores resultantes dependen sólo de la fase estacionaria empleada, de manera que la temperatura de la columna, su longitud y diámetro, el flujo y presión de la fase móvil, son factores que no influyen en el resultado (Witte en Linskens y Jackson, 1986). En estos índices, llamados índices Kovats debido a quien los propuso (Kovats, 1958), existe una relación logarítmica entre los tiempos e índices de retención. Por ello, el índice Kovats (KI) de un compuesto se obtiene extrapolando en una gráfica del logaritmo de los tiempos de retención de los n-alcanos contra sus respectivos índices Kovats (Witte en Linskens y Jackson, 1986). Para facilitar el cálculo, se emplea la siguiente fórmula: Donde: KI = Índice Kovats y = número de átomos de carbono del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés tRx = tiempo de retención del compuesto de interés tRy = tiempo de retención del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés tRz = tiempo de retención del n-alcano que eluye después del compuesto de interés (Agilent Technologies, 2007) Sin embargo, a pesar de la precisión de los índices Kovats, existen mezclas de volátiles cuyo rango de puntos de ebullición varían ampliamente ocasionando que muchas isotermas sean requeridas, por lo que varios investigadores han propuesto usar programas de temperatura lineales para la determinación de estos índices (Jennings y Shibamoto, 1980). En estos casos 13 las rampas de temperatura deben mantenerse bajas (1 o 2 °C/min), pues entre mayor sea la rampa, la precisión de los índices disminuye (Witte en Linskens y Jackson, 1986). La variación de los índices de retención con programas de temperatura es de ±10 unidades, no obstante estos valores son suficientes para confirmar la estructura de un compuesto propuesto por espectrometría de masas, especialmente si las posibles estructuras difieren ampliamente en sus índices de retención (Witte en Linskens y Jackson, 1986). Afortunadamente para la mayoría de los terpenos la variación de estos índices por cada 10°C de variación en la temperatura son realmente mínimos (alrededor de 1 unidad). Además, la temperatura influye menos en los índices de retención de compuestos poco polares analizados en fases estacionarias de la misma naturaleza (Jennings y Shibamoto, 1980). Este índice, calculado utilizando rampas de temperatura, es llamado índice Aritmético (AI) (Dool y Kratz, 1963; Adams, 2007) pues en este caso los tiempos de retención de los nalcanos no son ajustados logarítimicamente, graficando directamente su valor en minutos contra los respectivos índices de retención de cada n-alcano y obteniendo el índice aritmético de los compuestos de interés por interpolación en la gráfica resultante, utilizando la siguiente fórmula: Donde: AI = Índice Aritmético y = número de átomos de carbono del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés tRx = tiempo de retención del compuesto de interés tRy = tiempo de retención del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés tRz = tiempo de retención del n-alcano que eluye después del compuesto de interés (Agilent Technologies, 2007) Muchos índices de retención de compuestos volátiles han sido publicados en la literatura durante las últimas décadas y existen publicaciones que han compilado estos datos para una consulta fácil y rápida. Destacan la de Jennings y Shibamoto donde reportan los 14 índices calculados en una columna OV-1 y Carbowax 20-M (Jennings y Shibamoto, 1980) y la de Robert P. Adams que compila los índices Kovats y los Índices Aritméticos para compuestos volátiles calculados en una columna DB-5ms (Adams, 2007). De esta manera, los patrones de fragmentación de la espectrometría de masas, junto con los datos precisos ofrecidos por la cromatografía de gases como el tiempo e índices de retención, son una herramienta poderosa para la identificación de los compuestos volátiles presentes en esencias florales. 1.5 Pachira aquatica Actualmente ha sido posible caracterizar más de 1720 compuestos orgánicos volátiles en esencias florales de alrededor de 1000 especies de plantas, sin embargo existen aún muchas especies cuyos volátiles florales se desconocen (Knudsen et al., 2006). Una de las especies cuyos volátiles son desconocidos es Pachira aquatica, una planta que pertenece a la familia Malvaceae (subfamilia Bombacoidea). Es Nativa del Sur de México y se distribuye hasta el Norte de Brasil (Lorenzi, 1992; Oliveira et al., 2000). Es un árbol perennifolio de copa densa que puede medir de 6 a 14-17m de altura (Lorenzi, 1992; Lim, 2012), cuya corteza lisa es verde cuando el árbol es joven y se vuelve gris conforme va desarrollándose (Lim, 2012). Este árbol es característico de humedales tropicales y crece al lado del cauce de ríos y estuarios así como en zonas de pantanos, formando un componente florístico importante de las selvas inundables que colindan con manglares (Infante-Mata et al., 2011) y se ha considerado como una especie acompañante de los mismos, sin embargo por sus características y la similitud en fisonomía con los mangles mexicanos (por sus raíces adventicias y contrafuertes), así como por las condiciones salinas y de inundación en las cuales pueden prosperar, se ha propuesto considerar a P. aquatica como una especie más de los manglares (Infante-Mata et al., 2014). Crece en regiones con altitudes que van de 0 a 1300 m.s.m. donde las temperaturas sean de 24°C o mayores con una precipitación anual de 1000 a 2000 mm (Lim, 2012) y se adapta fácilmente a diferentes condiciones climáticas y de suelo (Peixoto y Escudeiro, 2002). En México se le conoce como apompo, palo de agua, zapote reventador o zapotón (Avendaño, 1998; Pennington y Sarukhán, 2005; Infante-Mata 2014). 15 1.5.1 Flores Las flores llegan a medir hasta 23 cm de diámetro (Peixoto y Escudeiro, 2002) y de 20 a 35cm de longitud, el pedicelo cilíndrico mide de 1.5 a 3.3 cm y el cáliz, en forma de campana, tubular, verde y de ápice truncado mide de 1.5 a 1.8 cm. Los pétalos miden entre 25 y 31.5cm de longitud y entre 1.4 y 1.9 cm de ancho; son lineares-lanceolados de ápice agudo, externamente puberulentos e interiormente pubscentes. Posee acumulación de estambres en dos verticilos de coloración violácea en el tercio apical y miden de 20 a 25 cm (Fig. 5A) (DuBocage y Ferreira-de-Sales, 2002). Los botones, lineales y levemente curvados en la punta, pueden medir hasta 28 cm (Fig. 5B). La antesis de las flores toma lugar durante la noche y viven menos de un día (Peixoto y Escudeiro, 2002; Hernández-Montero y Sosa, 2014). A A B B Fig. 5 – A) Flor de Pachira aquatica. Se observa el ápice en forma de campana, tubular y de ápice truncado, logran apreciarse los estambres de coloración violácea. B) Botón de Pachira aquatica, lineal y levemente curvado en la punta. 16 1.5.2 Hojas, Frutos y Semillas Sus hojas son compuestas y digitadas, constan de 5 a 7 foliolos oblongo-lanceolados de base aguda y ápice acuminado; el peciolo es liso y mide entre 11 y 15 centímetros (Lorenzi, 1992; Pennington y Sarukhán, 2005). Sus frutos, de color café-oscuro y opacos, miden en promedio 12.3cm de longitud y 8.19 cm de diámetro, y pesan alrededor de 317 g. Son de tipo cápsula de dehiscencia loculicida y polispérmicos de endocarpo seríceo, y en su interior se encuentran de 2 a 18 semillas por fruto. Las semillas son grandes, con cáscara de color ferruginoso. Miden en promedio 2.5cm de largo, 3.7cm de ancho y 2.5cm de grueso y pesan aproximadamente 12 gramos. Varían de reniformes a angulosas, poseen cotiledones grandes y carnosos, y embrión de tipo invaginado, ranurado y plegado con endospermo hialino y gelatinoso (Bernardo-Silva et al., 2012). Tomada de Lim, 2012 Fig. 6 – Semillas y fruto seco de Pachira aquatica (Fig. 6) 17 1.5.3 Biología reproductiva En México, Pachira aquatica tiene un periodo de floración de diciembre a agosto mientras que el periodo de fructificación es de enero a septiembre (Pennington y Sarukhán, 2005). La germinación es de tipo epigea fanerocotiledonar, dando inicio a los 8-15 días después de sembrarla (Bernardo-Silva et al., 2012). La germinación de las semillas no es afectada por la cantidad de luz en el ambiente y éstas pueden germinar hasta 90 días después de estar flotando en el agua, aun habiendo una humedad baja, media o alta, y también en aguas salinas (a bajas concentraciones), lo cual demuestra su diferente capacidad de germinación en lugares donde el nivel del agua cambia según la temporada (Infante-Mata y Moreno-Casasola, 2005). Por las características morfológicas de sus flores, se ha catalogado como una especie quiropterofílica, sin embargo también tiene características que se ajustan a un síndrome de polinización falenofílico (Fleming et al., 2009). Pachira aquatica es visitada por diversas especies de murciélagos y debido a las cargas polínicas es probable que el polinizador más efectivo sea Leptonycteris yerbabuenae. No obstante esta flor también es visitada por 4 especies de palomillas, de las cuales 3 han sido identificadas: Manduca rustica, Cocytius duponchel y Eumorpha satellita (Hernández-Montero y Sosa, 2014). Al igual que otras especies de la misma subfamilia, Pachira aquatica presenta mecanismos de autoincompatibilidad tal como sucede con Ceiba pentandra, C. aesculifolia, C. grandiflora, Pachira quinata y Pseudobombax ellipticum (Fuchs et al., 2003; Quesada et al., 2004; Lobo et al., 2013), por tal razón dependen fuertemente de la polinización biótica para lograr su éxito reproductivo. 1.5.4 Usos Tanto flores como hojas frescas se cocinan y son consumidas (Lorenzi, 1992; Oliveira et al., 2000). Los Rama, un pueblo amerindio de Nicaragua, suele utilizar la corteza de los árboles y las semillas para tratar diarreas, erupciones y llagas de la piel así como en casos de anemia (Coe, 2008). Totonacas de la Sierra Norte de Puebla utilizan las hojas para tratar urticaria, comezón y salpullido en la piel (Martínez-Alfaro, 1984). Por su parte, las semillas a veces se consumen crudas o tostadas, y se ha reportado que tienen un sabor parecido al del 18 cacahuate o al de las castañas, respectivamente. Además, con ellas puede también prepararse una bebida con sabor a chocolate (Lorenzi, 1992). 1.5.5 Estudios químicos previos En el extracto clorofórmico de la corteza exterior de las raíces se han identificado 4 compuestos diferentes: iso-hemigosipolona (naftoquinona), acuatidial (un bis- norsesquiterpenoide asimétrico reportado por primera vez), p-cumarato de triacontilo y lupeol (Shibatani et al., 1999; Paula et al., 2006). En cuanto a las flores, mediante un sistema simultáneo de destilación-extracción fue posible obtener el aceite esencial de las flores completas el cual fue analizado por GC-MS, encontrándose 29 compuestos volátiles, de los cuales predominan (E,E)-α-farneseno (19.2%), β-cariofileno (11.5%) trans- óxido de linalool (piranoide) (7.2%), elemol (5.6%), fenilacetaldehído (5.3%), cis- y trans- óxido de linalool (furanoides) (5.2% y 4.2%) y ácido palmítico (4.35%) (Zoghbi et al., 2003). Se ha estudiado también el contenido nutricional de las semillas (Tabla 1) pues son las que se consumen generalmente (Oliveira et al., 2000). Debido a que éstas tienen un alto contenido en lípidos, se ha detallado el contenido de ácidos grasos y tocoferoles del aceite obtenido de las mismas (Tabla 2 y 3) (Jorge y Luzia, 2012). Tabla 1. Composición nutricional aproximada de las semillas de Pachira aquatica Componente g / kg de material seco Humedad 60 ± 1.2 Proteína 129 ±4.5 Lípidos 539 ± 28.6 Carbohidratos* Cenizas 297.0 35.0 ± 0.9 *Calculado por diferencia Las propiedades fisicoquímicas de este aceite (índice de refracción, índice de yodo, índice de peróxido, índice de saponificación y punto de fusión) que son similares a las de los aceites comestibles (Camargo, 2008; Jorge y Luzia, 2012), así como su alto contenido en 19 ácidos grasos y la predominancia del ácido palmítico, oleico y linoleico (Jorge y Luzia, 2012), abren la posibilidad de emplearlo con fines alimenticios y farmacéuticos. Tabla 2. Perfil de ácidos grasos presentes en el aceite de las semillas de Pachira aquatica Acidos grasos Porcentaje (%) Tabla 3. Cantidad de tocoferoles en el aceite de las semillas de Pachira aquatica Tocoferoles mg Kg-1 Palmítico 44.93 ± 0.12 Esteárico 3.08 ± 0.08 α-tocoferol 15.23 ± 0.10 Oleico 39.27 ± 0.16 β-tocoferol 1.13 ± 0.03 Linoleico 11.35 ± 0.10 γ-tocoferol 34.66 ± 0.21 Araquídico 0.87 ± 0.02 δ-tocoferol 0.26 ± 0.01 α-Linolénico 0.46 ± 0.05 Tocoferoles totales 51.27 ± 0.28 Behénico 0.05 ± 0.03 Saturados 48.93 Monoinsaturados 39.27 Poliinsaturados 11.81 No obstante existen otros datos que conllevan a restringir su uso, ya que el aceite contiene antitripsinas y antilectinas y presenta actividad hemaglutinante en eritrocitos de conejo. Igualmente se ha demostrado que estas semillas son altamente tóxicas en ratas cuando se suministran vía oral (Oliveira et al., 2000). Además, en otra especie del mismo género, Pachira insigenes, se encontró un 21% de ácidos grasos ciclopropénicos potencialmente tóxicos (Berry, 1980; Oliveira et al., 2000). De las semillas también ha sido posible aislar una lipasa con un peso de 55kDa. Ésta muestra preferencias por ésteres, ácidos grasos de cadena larga, y otros sustratos (Polizelli et al., 2008). Este tipo de enzimas tienen alto potencial para su explotación comercial por su aplicación en reacciones de síntesis orgánica, industria de alimentos, química de aceites, manufactura de papel, biosurfactantes, cosméticos, biodiesel, en la industria farmacéutica y como aditivo en detergentes (Li et al., 2012). 20 2. Planteamiento del Problema La conservación de la biodiversidad se ha convertido en una de las prioridades mundiales tanto para los gobiernos como para los científicos y la sociedad en general (MoraOlivo et al., 2013). Particularmente hay interés en los humedales tropicales, regiones de notable biodiversidad que se cuentan entre los ecosistemas más amenazados (Zamora-Cornelio et al., 2010). Su importancia ecológica radica en que son zonas de paso y de anidación de aves migratorias, son relevantes “sumideros” de carbono alrededor del planeta (Marín-Muñiz et al., 2014) y proveen conectividad entre ecosistemas costeros, lo cual es crucial para el control de inundaciones y almacenamiento de materia orgánica, retención de sedimentos, entre otras cosas (Infante-Mata et al., 2011). En algunas regiones, estos ecosistemas han desaparecido hasta en un 90% debido al crecimiento poblacional, la deforestación, la sobreexplotación de pesquerías, los cambios del uso de suelo, desvío de cauces e incendios (Mora-Olivo et al., 2013). Se calcula que 35% de los humedales de México han sufrido algún deterioro por alguno de estos factores, lo cual pone a sus poblaciones y comunidades en un estado de inminente riesgo de desaparición, por lo que realizar acciones para su restauración es una necesidad vigente (Zamora-Cornelio et al., 2010). Por ello Pachira aquatica, un árbol nativo y dominante de humedales de agua dulce de la Planicie Costera del Golfo de México (Hernández-Montero y Sosa, 2014), ha sido propuesta como una especie prometedora para la reforestación y rescate de estos humedales ya que esta especie vegetal presenta una alta capacidad de germinación (Infante-Mata y Moreno-Casasola, 2005). Sin embargo, es imprescindible conocer la biología reproductiva de esta planta para darle un correcto aprovechamiento y así lograr el éxito de la regeneración natural de la vegetación de la zona a través de la obtención de semillas (Zamora-Cornelio et al., 2009). Hasta el momento se sabe que Pachira aquatica, al igual que otras especies de su subfamilia, presenta mecanismos de autoincompatibilidad por lo que la eficacia de sus polinizadores es un factor que determina el éxito reproductivo de la especie (Fuchs et al., 2003; Quesada et al., 2004; Lobo et al., 2013). 21 Se ha comprobado que posee un sistema de polinización especializado funcionalmente para murciélagos y esfíngidos (Hernández-Montero y Sosa, 2014), no obstante se desconoce cuál es su polinizador efectivo. De esta manera, conocer la química de volátiles florales de Pachira aquatica, aportaría datos relevantes que contribuirían en el conocimiento sobre los potenciales polinizadores de esta planta. Con base en estos antecedentes, el presente estudio abordó la caracterización química de la esencia floral de Pachira aquatica mediante técnicas cromatográficas y espectrométricas, en el entendido que el conocimiento detallado de los patrones y procesos involucrados en la polinización contribuye de manera significativa en estrategias de manejo y conservación no solo para las plantas, sino también para los animales que tienen esta interacción mutualista con sus flores. 2.1 Hipótesis Debido a que Leptonycteris yerbabuenae está siendo atraído por la esencia floral de Pachira aquatica, la composición química de la misma se caracteriza por la presencia de compuestos azufrados, tal como sucede con otras especies del continente americano que son polinizadas por murciélagos. 22 3. Objetivos 3.1 Objetivo General Realizar una descripción química de los compuestos orgánicos volátiles presentes en la esencia de las flores de Pachira aquatica. 3.2 Objetivos Particulares Capturar los compuestos orgánicos volátiles presentes en la esencia floral de Pachira aquatica mediante la técnica de Headspace dinámica. Realizar la extracción de los compuestos volátiles a partir de los polímeros adsorbentes contenidos en los cartuchos de captura empleando disolventes orgánicos. Obtener el perfil cromatográfico de la esencia floral de Pachira aquatica mediante Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas. Identificar cada uno de los compuestos orgánicos volátiles presentes en la esencia comparando los patrones de fragmentación obtenidos con los ofrecidos por la base de datos NIST. Confirmar la naturaleza química de los compuestos orgánicos volátiles comparando tiempos de retención con estándares puros y mediante la estimación de los Índices Aritméticos de Retención. Realizar el análisis cuantitativo de los compuestos orgánicos volátiles presentes utilizando Undecano como estándar de referencia. 23 4. Material y Métodos 4.1 Reactivos comerciales Para la captura de los volátiles se utilizaron cartuchos ORBO™ de Tenax® 100/50mg y como filtro se emplearon cartuchos ORBO™ de carbón activado, ambos de la marca SUPELCO. Los disolventes utilizados para la extracción (Hexano y Acetona), grado cromatográfico, se obtuvieron de TEDIA. El estándar -humuleno se adquirió en SigmaAldrich mientras que, los estándares de trans-cariofileno, linalool, benzoato de metilo, acetato de bencilo, jasmona, heptano, octano, dodecano, hexadecano, nonadecano y heneicosano se obtuvieron de Fluka. Los estándares de nonano, decano, undecano, tridecano, tetradecano, pentadecano, heptadecano, octadecano y eicosano fueron adquiridos de la marca SUPELCO. 4.2 Captura de volátiles El muestreo se llevó a cabo en la Reserva de la Biósfera de la Selva de los Tuxtlas en zonas aledañas a las playas de Balzapote al sur del Estado de Veracruz (Fig. 7) del 29 de abril al 3 de Mayo de 2014. Se seleccionaron 4 árboles de Pachira aquatica en los cuales se ubicaron botones florales previos a la antesis. Una vez que las flores abrieron, se introdujeron en una pequeña jaulilla de alambre forrada con cinta teflón y luego se cubrieron con una bolsa de poliacetato de la marca Reynolds®. En un extremo de la bolsa se colocó un cartucho con relleno de carbón activado ORBO™ para filtrar el aire proveniente del exterior mientras que los volátiles se capturaron en un cartucho de Tenax®, el cual se conectó a una bomba de vacío (Mini Pump Shibata) operando a un flujo de 0.3 L/min y se mantuvo así por 10 horas (23:00hrs – 9:00 hrs) para capturar los volátiles. Para cada muestra se colectaron de manera simultánea los volátiles de un blanco, instalando un sistema como el descrito anteriormente alrededor de material vegetal sin flor del mismo árbol (Fig. 8). 24 Altitud (m s.n.m) 0 BALZAPOTE 1680 Golfo de México 1 cm = 5,000 m Modificada de Siemens, 2004 Fig. 7 - Localización del área de estudio, dentro de la Reserva de la Biósfera de la Selva de los Tuxtlas. La zona de vegetación riparia cercana a la comunidad de Balzapote es donde se llevó a cabo el muestreo de volátiles. Una vez concluido el tiempo de captura, los cartuchos se sellaron al vacío (Foodsaver Oster® V2240) en un empaque plástico y se almacenaron a 0 °C hasta su extracción posterior. La extracción de las muestras y de sus blancos se llevó a cabo empleando 1mL de mezcla Hexano:Acetona 9:1 (ambos disolventes de grado cromatográfico) en un tubo durante 20 minutos en baño de hielo, se centrifugó durante 5 minutos y se separó el sobrenadante con una pipeta Pasteur limpia. La operación se llevó a cabo una segunda vez en cada caso, empleando 0.5mL de mezcla Hexano:Acetona 9:1. El extracto se almacenó a 0 °C hasta su traslado al laboratorio. 25 Fig. 8 – Sistema de Headspace dinámica montado para la captura de volátiles en una flor de Pachira aquatica. a) Bolsa y jaulilla sobre la flor muestreada. b)Bolsa y jaulilla sobre material vegetal sin flor (blanco). c)Cartuchos de Tenax para la captura de los volátiles. d)Bomba de vacío (Mini Pump Shibata). e) Flujómetro. 4.3 Análisis de los volátiles Las muestras se concentraron hasta 850µL con un flujo suave de Nitrógeno, posteriormente se agregaron 50µL de 0.15% v/v de Undecano como estándar de referencia para el análisis cuantitativo y se inyectó 1µL de muestra en un Cromatógrafo de Gases Varian 450 acoplado a un Espectrómetro de Masas Varian 220 equipado con una columna cromatográfica DB-5ms de 30m de longitud y 0.25mm de diámetro interno con un grueso de película de 0.25µm usando Helio como gas acarreador empleando las siguientes condiciones: Temperatura del inyector: 220°C. 26 Temperatura del horno del cromatógrafo: 40°C que se mantienen por 3 minutos para luego aumentar hasta 220°C a 3°C/min y se mantiene a 220°C por 3 minutos. Inyección tipo Splitless Flujo de gas acarreador: 1 mL/min. Rango m/z: 40-350. Delay inicial de la trampa de iones: 3 minutos. 4.4 Identificación de los volátiles Una vez obtenidos los cromatogramas, se compararon aquellos pertenecientes a la muestra con su respectivo blanco (control) ambiental. Aquellos picos presentes en el blanco y que se encontraron también en la muestra fueron descartados, pues no pertenecen a los volátiles emitidos por la flor. Los espectros de masas de los compuestos correspondientes a los volátiles emitidos por Pachira aquatica, se compararon con aquellos disponibles en la base de datos NIST para una identificación preliminar, y mediante la base de datos SCENTbase se corroboró si estos compuestos han sido encontrados anteriormente en alguna otra especie de planta (de preferencia de la misma familia). Para confirmar la identidad de los compuestos propuestos por la base de datos NIST, se compararon los tiempos de retención de los picos de las muestras con los tiempos de retención de estándares puros disponibles comercialmente (linalool, trans-cariofileno, α-humuleno, metil benzoato, bencil acetato y jasmona) bajo las mismas condiciones en que fueron analizadas las muestras de esencia floral de Pachira aquatica. Para el cálculo de Índices Aritméticos, se preparó una mezcla de todos los hidrocarburos (desde heptano hasta heneicosano) cada uno al 0.01% p/p en Hexano:Acetona 9:1. La mezcla se inyectó empleando las mismas condiciones en que se analizaron las muestras y se estimaron los Índices Aritméticos de los posibles componentes de la esencia floral de P. aquatica para luego comparar tales índices con los reportados por Adams (2007) para una columna DB5. 27 5. Resultados y Discusión Al analizar los cromatogramas de las muestras y compararlos con los de sus respectivos controles, fue posible observar cuáles picos de las muestras correspondían a compuestos de la esencia floral de Pachira aquatica (Fig. 9). Esta comparación se llevó a cabo con cada uno de los cuatro muestreos de manera que fue posible observar 28 picos cromatográficos pertenecientes a compuestos de la esencia de la flor (Fig. 10), de éstos, 25 pudieron ser identificados mediante la comparación de sus patrones de fragmentación con los de la base de datos NIST (Anexos) y por la comparación de los índices de retención estimados con los reportados en la recopilación de Adams en 2007. Además en 6 de ellos (linalool, transcariofileno, α-humuleno, metil benzoato, bencil acetato y jasmona) fue posible comparar su tiempo de retención con los de estándares analíticos puros. En la Tabla 4 se enlistan los compuestos identificados clasificados de acuerdo a la familia a la que pertenecen. Dos de los compuestos que no pudieron ser identificados plenamente son de naturaleza sesquiterpenoide de acuerdo al patrón de fragmentación que presentan, ya que éste es muy similar entre todos los sesquiterpenos (presentan los mismos iones y aproximadamente con la misma abundancia) (ver Anexos). Además, el porcentaje de correlación que presentan los patrones de estos dos compuestos con los de la base de datos NIST es muy bajo (menor al 70%) y no coincide el Índice Aritmético de retención estimado experimentalmente con el de los posibles compuestos que propone. La flor emite en promedio un total de 36.071 µg/h de esencia. De este total, el compuesto más abundante es el trans-β-ocimeno, un monoterpeno que representa el 50.987% de la esencia, seguido de (z)-3-hexenil acetato (16.473%), el compuesto desconocido 2 (7.108%), trans-cariofileno (4.035%), metil salicilato (3.214%) y linalool (2.479%) (Fig. 11). El 62.760% de la esencia corresponde a compuestos de la familia de los terpenoides, 17.865% son derivados de ácidos grasos, 10.405% son bencenoides, 0.608% es del único compuesto nitrogenado y el 8.359% restante corresponde a los compuestos que no pudieron ser identificados completamente, pero cuyos principales espectrometría de masas se incluyen en la Tabla 4. iones observados mediante 28 a) 23.9 24.9 25.9 26.9 27.9 28.9 29.9 30.9 31.9 33.9 34.9 35.9 36.9 37.9 38.9 39.9 40.9 b) 32.9 13 18 23 28 33 38 43 min Fig. 9 - Comparación del cromatograma del primer muestreo con el de su respectivo control ambiental. En rojo se muestra el cromatograma del muestreo y en azul el del control. a) Ampliación de los cromatogramas de 23.9 a 31.9 min. b) Ampliación de los cromatogramas de 32.9 a 40.9 min. 29 M1 M2 M3 M4 Fig. 10 – Cromatogramas de cada uno de los cuatro muestreos de la esencia. La identidad de cada compuesto se muestra en la Tabla 4. M1) Primer muestreo. M2) Segundo muestreo. M3) Tercer muestreo. M4)Cuarto muestreo. En cada cromatograma se indica con los incisos a,b,c y d las respectivas ampliaciones que se presentan en la Figura 10b. 30 a) b) c) d) Fig. 10b – Ampliaciones respectivas de los cromatogramas de cada muestreo del minuto 23 al minuto 42. a)Ampliación del cromatograma del primer muestreo. b)Ampliación del cromatograma del segundo muestreo. c)Ampliación del cromatograma del tercer muestreo. d)Ampliación del cromatograma del cuarto muestreo. 31 16 28 Tabla 4. Compuestos orgánicos volátiles presentes en la esencia floral de Pachira aquatica Compuesto Tiempo de Porcentaje Min-Máx (%) Cantidad Min-Máx Índice retención dentro de la emitida por (µg/h) Aritmético (min) esencia (%) hora (µg/h) experimental TERPENOIDES Monoterpenos cis-β-Ocimeno 16.496 1.703 1.184 – 2.023 0.613 0.288 – 0.885 1035 trans-β-Ocimeno 17.144 50.987 44.82 – 61.90 18.353 12.35 – 21.68 1048 Linalool 19.615 2.479 0 – 8.400 0.892 0 – 3.430 1098 Sesquiterpenos 30.629 0.278 0 – 0.643 0.133 0 – 0.225 1332 δ-Elemeno 31.148 0.166 0.123 – 0.202 0.060 0.046 – 0.072 1344 α-Cubebeno Copaeno 32.361 0.095 0 – 0.182 0.034 0 – 0.054 1372 β-Cubebeno 32.902 0.328 0 – 0.570 0.118 0 – 0.233 1384 trans-Cariofileno 34.205 4.035 1.418 – 6.194 1.452 0.579 – 2.170 1415 35.687 0.749 0.276 – 1.258 0.269 0.112 – 0.440 1450 α-Humuleno 38.301 0.890 0.155 – 1.455 0.320 0.063 – 0.636 1514 δ-Cadineno Terpenos oxigenados Geranil acetato 32.523 0.054 0 – 0.098 0.019 0 – 0.034 1375 Dendrolasina 40.557 0.989 0.373 – 1.726 0.356 0.090 – 0.604 1571 4 7 9 12 21 26 27 BENCENOIDES Metil benzoato Bencil acetato Metil salicilato Isobutil benzoato Isopentil benzoato Isopentil salicilato (z)-3-Hexenil benzoato 19.163 22.523 23.892 30.219 34.970 38.889 40.325 1.891 1.293 3.214 0.112 1.887 0.340 1.664 0 – 3.060 0.092 – 3.359 0.320 – 7.964 0 – 0.236 0.141 – 5.029 0 – 1.038 0.071 – 4.680 0.681 0.465 1.157 0.040 0.679 0.122 0.599 0 – 1.008 0.037 – 1.177 0.112 – 3.486 0 – 0.103 0.057 – 2.201 0 – 0.454 0.029 – 2.048 1089 1158 1186 1323 1433 1529 1565 1088 1157 1190 1327 1433 1535 1565 1 8 DERIVADOS DE ÁCIDOS GRASOS (z)-3-hexenil acetato 3-hexenil butanoato 14.953 23.785 16.473 0.467 7.765 – 27.92 0.221 – 0.844 5.929 0.168 3.399 – 11.40 0.053 – 0.369 1004 1184 1004 1184 N° de Pico 2 3 5 13 14 15 17 19 22 25 Índice Aritmético reportado 1032 1044 1095 1335 1345 1374 1387 1417 1452 1513 1379 1570 32 N° de Pico 10 Compuesto 18 2-metil 3-hexenil butanoato 3-hexenil 3-metil butanoato Jasmona 6 COMPUESTOS NITROGENADOS Metil nicotinato 11 20 23 24 COMPUESTOS DESCONOCIDOS Desconocido 1 (204, 161, 119, 105, 91, 77, 65, 51, 41)* Desconocido 2 (204, 161, 133, 119, 105, 91, 67, 53, 41)* Desconocido 3 (206, 191, 119, 107, 93, 79, 69, 57, 41)* TOTAL Tiempo de retención (min) 25.909 Continuación Tabla 4 Porcentaje Min-Máx (%) Cantidad dentro de la emitida por esencia (%) hora (µg/h) 0.197 0 – 0.423 0.071 Min-Máx (µg/h) 0 – 0.121 Índice Aritmético experimental 1229 Índice Aritmético reportado 1229 26.156 0.383 0 – 1.261 0.138 0 – 0.552 1234 1232 32.982 0.343 0 – 0.794 0.164 0 – 0.347 1386 1390 21.189 0.608 0 – 1.808 0.219 0 – 0.791 1130 NR 34.637 0.234 0.187 – 0.287 0.084 0.055 – 0.105 1425 - 36.772 7.108 5.528 – 8.427 2.558 1.549 – 3.476 1476 - 37.842 1.016 0 – 2.406 0.366 0 – 1.053 1502 - 36.071 24.35 – 43.77 NR – no reportado * Iones más relevantes en Espectrometría de Masas 100 33 Es importante mencionar que el índice de retención del compuesto nitrogenado, metil nicotinato, no está reportado en la literatura, sin embargo el porcentaje de correlación obtenido por comparación con la base de datos NIST fue de 78%. Este compuesto ha sido reportado en las esencias de plantas de familias como Cactaceae, Fabaceae, Magnoliaceae, Nyctiginaceae, Orchidaceae y Rosaceae (Knudsen et al., 2006). Aunque las cuatro capturas corresponden a la esencia de Pachira aquatica, hubo compuestos que no estuvieron presentes en todos los muestreos, razón por la cual la mínima cantidad de compuesto en algunos casos es cero. En el caso particular del 3-metil3-hexenil butanoato, éste sólo fue encontrado en la muestra de la primera captura con un porcentaje del 1.261%. En el caso de jasmona, metil nicotinato, isopentil salicilato y uno de los compuestos desconocidos (desconocido 3) estuvieron presentes en dos de los muestreos realizados, mientras que el resto de los compuestos volátiles aparecieron en al menos 3 de las capturas. O O OH O O OH a) b) c) d) e) Fig. 11 – Estructuras químicas de los compuestos volátiles más abundantes presentes en la esencia de Pachira aquatica: a)trans-β-ocimeno b)(z)-3-hexenil acetato c)trans-cariofileno d)metil salicilato e)linalool. Al comparar la composición química de la esencia que hemos analizado con la del aceite esencial obtenido por extracción de las flores completas de P. aquatica (Zoghbi et al., 2003), observamos que trans-β-ocimeno, linalool, trans-cariofileno, α-humuleno, δcadineno y dendrolasina son compuestos volátiles presentes en ambos estudios. La diferencia entre ambos es la presencia de otros compuestos en el aceite esencial obtenido de las flores, principalmente los precursores de linalool (óxidos cis- y trans- de linalool) y el 34 ácido palmítico, ya que al hacer una extracción con disolvente de las mismas, se obtienen también aquellos compuestos que se encuentran en el tejido vegetal de la planta (pétalos y demás estructuras), a diferencia de la captura de volátiles mediante Headspace dinámica, que corresponde sólo a aquellos compuestos que son liberados en la esencia de la flor. Los compuestos como trans-β-ocimeno, linalool, α-copaeno, δ-cadineno, metil benzoato y metil salicilato se han reportado también como volátiles presentes en las esencias de otras plantas de la misma subfamilia (Bombacoidea), tales como Ceiba pentandra, Eriotheca longitubulosa y Adansonia digitata (MacFarlane et al., 2003; Petterson et al., 2004). Si se toma en cuenta que los visitantes florales de P. aquatica son esfíngidos y murciélagos (Peixoto y Escudeiro, 2002; Hernández-Montero y Sosa, 2014), merecen atención los compuestos que caracterizan a las esencias de plantas polinizadas por estos animales. Jürgens menciona que los compuestos que son relevantes en las esencias de flores polinizadas por palomillas son el linalool, alcoholes aromáticos y ésteres derivados de éstos así como pequeñas cantidades de compuestos nitrogenados (Jürgens et al., 2002). De esta manera, dentro de la esencia floral de P. aquatica, el linalool, los ésteres de compuestos aromáticos (bencenoides) y el metil nicotinato son compuestos que pueden estar desempeñando un papel importante en la atracción de las 4 especies de esfíngidos que visitan a la flor. Por otro lado, las especies de plantas americanas que son polinizadas por murciélagos nectarívoros (familia Phyllostomidae) se caracterizan por contener dentro de su esencia compuestos azufrados, particularmente dimetil disulfuro y dimetil trisulfuro (von Helversen et al., 2000, Marín-Loaiza y Céspedes, 2007), los cuales no están presentes en la esencia de P. aquatica. La ausencia de compuestos azufrados también ocurre en especies polinizadas por murciélagos nativas del continente africano, excepto en Adansonia digitata, cuya esencia floral sí contiene compuestos con azufre y es polinizada por murciélagos; esta especie también pertenece a la subfamilia Bombacoidea al igual que P. aquatica. Por tanto, debido a la ausencia de compuestos azufrados en la esencia de P. aquatica, consideramos que los volátiles emitidos están atrayendo principalmente a los esfíngidos y no al 35 murcielago Leptonycteris yerbabuenae (Phyllostomidae), considerado como uno de los polinizadores potenciales de esta especie de planta (Hernández-Montero y Sosa, 2014). De esta manera, tomando en cuenta la composición química de la esencia floral que ya hemos descrito, proponemos que las 4 especies de palomillas (esfíngidos) que visitan P. aquatica son atraídas por los aromas de sus flores debido a la presencia de linalool, ésteres de compuestos aromáticos y metil nicotinato. Por tanto, las palomillas podrían ser consideradas como uno de los polinizadores efectivos de la especie. 6. Conclusión Pachira aquatica emite en promedio un total de 36.071 µg/h de esencia, de ésta el 62.760% corresponde a compuestos de la familia de los terpenoides, 17.865% son derivados de ácidos grasos, 10.405% son bencenoides, 0.608% del único compuesto nitrogenado y el 8.359% restante corresponde a los compuestos que no pudieron ser identificados. Fue posible identificar 25 compuestos diferentes dentro de la esencia, de los cuáles los más abundantes son el trans-β-ocimeno (50.987%), (z)-3-hexenil acetato (16.473%), trans-cariofileno (4.035%), metil salicilato (3.214%) y linalool (2.479%). Los compuestos que coinciden en la esencia floral y en el aceite esencial obtenido de las flores completas son trans-β-ocimeno, linalool, trans-cariofileno, α-humuleno, δ-cadineno y dendrolasina, mientras que trans-β-ocimeno, linalool, α-copaeno, δ-cadineno, metil benzoato y metil salicilato son compuestos reportados en la esencia de otras plantas de la misma subfamilia. Finalmente debido a la presencia de linalool, ésteres de compuestos aromáticos (bencenoides) y de metil nicotinato, aunado a la ausencia de compuestos azufrados, se propone que los esfíngidos son los polinizadores que están siendo atraídos por la esencia floral de P. aquatica. Así, los murciélagos, al no ser atraídos por los volátiles florales, visitarían a las flores en busca de recompensas como el consumo del néctar. Sin embargo, se requieren estudios experimentales que confirmen que los compuestos identificados son los responsables de la atracción de las palomillas. 36 7. Referencias bibliográficas Adams, R. (2007). Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass Spectrometry. Illinois: Allured Publishing Corporation. Agilent Technologies. (2007). Guía de selección de columnas Agilent J&W para GC. Alemania: Agilent Technologies. Avendaño, R. (1998). Bombacaceae. Flora de Veracruz , 107, 1-40. Bernardo-Silva, K., Ursulino-Alves, E., Pontes-Matos, V., & Alcântara-Bruno, R. (2012). Morphological characterization of fruits, seeds and phases of germination Pachira aquatica Aubl. (Bombacaceae). Semina: Ciências Agrárias, Londrina , 33, 891-898. Berry, S. K. (1980). Cyclopropenoid fatty acids in some Malaysian edible seeds and nuts. Journal of Food Science and Technology India , 17, 224-227. Camargo, M. (2008). Caracterização Quimica do óleo extraído da Pachira aquatica Aubl. Tchê Química , 5(9), 19-22. Coe, F. (2008). Ethnomedicine of the Rama of Southeastern Nicaragua. Journal of Ethnobiology , 28, 1-38. Cunningham, J., Moore, C., Zalucki, M., & Cribb, B. (2006). Insect odour perception: recognition of odour components by flower foraging moths. Proc. R. Soc. B , 273, 2035-2040. Dettmer, K., & Engewald, W. (2002). Adsorbent materials commonly used in air analysis for adsorptive enrichment and thermal desorption of volatile organic compounds. Anal Bioanal Chem , 373, 490-500. Dool, V., & Kratz, P. (1963). A generalization of the Retention Index System including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. Journal of Chromatography , 11, 463-471. Du-Bocage, A., & Ferreira-de-Sales, M. (2002). A Família Bombacaceae Kunth no Estado de Pernambuco, Brasil. Acta bot. bras. , 16(2), 123-139 . Dudareva, N., & Negre, F. (2005). Practical applications of research into the regulation of plant volatile emission. Current Opinion in Plant Biology , 8, 113-118. 37 Dudareva, N., & Pichersky, E. (2000). Biochemical and Molecular Genetic Aspects of Floral Scents. Plant Phisiology , 122, 627-633. Dudareva, N., Pichersky, E., & Gershenzon, J. (2004). Biochemistry of Plant Volatiles. Plant Phisiology , 135, 1893-1902. Fleming, T., Geiselman, C., & Kress, W. (2009). The evolution of bat pollination: a phylogenetic perspective. Annals of Botany , 104, 1017-1043. Fuchs, E., Lobo, J., & Quesada, M. (2003). Effects of Forest Fragmentation and Flowering Phenology on the Reproductive Success and Mating Patterns of the Tropical Dry Forest Tree Pachira quinata. Conservation Biology , 17, 149-157. Grajales-Conesa, J., Meléndez-Ramírez, V., & Cruz-López, L. (2011). Aromas florales y su interacción con los insectos polinizadores. Revista Mexicana de Biodiversidad , 82, 1358-1367. Grob, R., & Kaiser, M. (2004). Qualitative and Quantitative Analysis by Gas Chromatography. En R. Grob, & E. Barry, Modern Practice of Gas Chromatography (págs. 403-460). New Jersey: John Wiley & Sons Inc. von Helversen, O., Winkler, L., & Bestmann, H. (2000). Sulphur-containing "perfumes" attract flower-visiting bats. J Comp Physiol A , 186, 143-153. Hernandez-Montero, J., & Sosa, V. (2014). Reproductive biology of Pachira aquatica Aubl. (Malvaceae: Bombacoidea): a tropical tree with a pollination system specialized in bats and sphingid moths. Xalapa: Instituto de Ecologia A.C. Infante-Mata, D., & Moreno-Casasola, P. (2005). Effect of in situ storage, light, and moisture on the germination of two wetland tropical trees. Aquatic Botany , 83, 206218. Infante-Mata, D., Moreno-Casasola, P., & Madero-Vega, C. (2014). ¿Pachira aquatica, un indicador del límite del manglar? Revista Mexicana de Biodiversidad , 85, 143-160. Infante-Mata, D., Moreno-Casasola, P., Madero-Vega, C., Castillo-Campos, G., & Warner, B. (2011). Floristic composition and soil characteristics of tropical freshwater forested wetlands of Veracruz on the coastal plain of the Gulf of Mexico. Forest Ecology and Management , 262, 1514-1531. Jennings, W., & Shibamoto, T. (1980). Qualitative Analysis of Flavor and Fragance Volatiles by Glass Capillary Gas Chromatography. California: Academic Press. 38 Jorge, N., & Luzia, D. (2012). Characterization of seed oil Pachira aquatica Aublet for food utilization. Acta Amazonica , 42, 149-156. Jürgens, A., Witt, T., & Gottsberger, G. (2002). Flower scent composition in nightflowering Silene species (Caryophyllaceae). Biochemical Systematics and Ecology , 30, 383-397. Kaiser, R. (1994). Trapping, Investigation and Reconstitution of Floral Scents. En P. Müller, & D. Lamparsky, Perfumes: Art, Science and Technology (págs. 213246). United Kingdom: Springer Science+Bussines Media. Kite, G. (1995). The Floral Odour of Arum maculatum. Biochemical Systematics and Ecology , 23, 343-354. Knudsen, J., Eriksson, R., Gershenzon, J., & Stahl, B. (2006). Diversity and Distribution of Floral Scent. The Botanical Review , 72, 1-120. Kovats, E. (1958). Retentionsindices aliphatischer Halogenide, Alkohole,. Helvetica Chimica Acta , 1915-1932. Li, J., Li, L., Tong, J., Wang, Y., & Che, S. (2012). Research Development on Lipase-catalyzed Biodiesel. Energy Procedia , 1014-1021. Lim, T. (2012). Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants. Volume 1, Fruits. Nueva York: Springer. Lobo, J., Fuchs, E., & Quesada, M. (2013). Individual and Temporal Variation in Outcrossing Rates and Pollen Flow Patterns in Ceiba pentandra (Malvaceae: Bombacoidea). BIOTROPICA , 45(2), 185-194. Lorenzi, H. (1992). Árvores Brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil, Editora Plantarum Ltd. Sao Paulo, Brasil: Nova Odessa. Marín-Loaiza, J., & Céspedes, C. (2007). Compuestos volátiles de plantas. Origen, emisión, efectos, análisis y aplicaciones al agro. Revista Fitotecnia Mexicana , 30, 327-351. Marín-Muñiz, J., Hernández, M., & Moreno-Casasola, P. (2014). Comparing soil carbon sequestration in coastal freshwater wetlands with various geomorphic features and plant communities in Veracruz, Mexico. Plant Soil , 378, 189-203. 39 Martínez-Alfaro, M. (1984). Medicinal Plants used in a Totonac community of the Sierra Norte de Puebla: Tuzamapan de Galeana, Puebla, Mexico. Journal of Ethnopharmacology , 11, 203-221. Masucci, J., & Caldwell, G. (2004). Techniques for Gas Chromatography/Mass Spectrometry. En R. Grob, & E. Barry, Modern Practice of Gas Chromatography (págs. 339-402). New Jersey: John Wiley & Sons Inc. Mora-Olivo, A., Villaseñor, J., & Martínez, M. (2013). Las Plantas Vasculares Acuáticas Estrictas y su conservación en México. Acta Botanica Mexicana , 103, 27-63. Oliveira, J., Vasconcelos, I., Bezerra, L., Silveira, S., Monteiro, A., & Moreira, R. (2000). Composition and nutritional properties of seeds from Pachira aquatica Aubl, Sterculia striata St Hil et Naud and Terminalia catappa Linn. Food Chemistry , 70, 185-191. Pacini, E., Viegi, L., & Franchi, G. (2008). Types, evolution and significance of plant-animal interactions. Rendiconti Lincei , 19, 75-101. Paula, V., Rocha, M., Barbosa, L., & Howarth, O. (2006). Aquatidial, a New bisNorsesquiterpenoid from Pachira aquatica Aubl. J. Braz. Chem. Soc. , 17(7), 14431446. Peixoto, A., & Escudeiro, A. (2002). Pachira aquatica (Bombacaceae) na obra “História dos Animais e Árvores do Maranhão” de Frei Cristóvão de Lisboa. Rodriguésia , 53 (82) 123-130. Pennington, T., & Sarukhán, J. (2005). Árboles Tropicales de México. Manual para la identificación de las principales especies. México: UNAM, FCE. Petterson, S., Ervik, F., & Knudsen, J. (2004). Floral scent of bat-pollinated species: West Africa vs. the New World. Biological Journal of the Linnean Society , 82, 161-168. Polizelli, P., Facchini, F., Cabral, H., & Bonilla-Rogriguez, G. (2008). A New Lipase Isolated from Oleaginous Seeds from Pachira aquatica (Bombacaceae). Appl Biochem Biotechnol , 150, 233-242. Quesada, M., Stoner, K., Lobo, J., Herrerías-Diego, Y., Palacios-Guevara, C., Munguía-Rosas, M., y otros. (2004). Effects of Forest Fragmentation on Pollinator Activity and Consequences for Plant Reproductive Success and Mating Patterns in Bat-pollinated Bombacaceous Trees. BIOTROPICA , 36(2), 131-138. 40 Raguso, R. (2004). Flowers as sensory billboards: progress towards an integrated understanding of floral advertisement. Current Opinion in Plant Biology , 7, 434440. Raguso, R., & Pellmyr, O. (1998). Dynamic Headspace Analysis of Floral Volatiles: A Comparison of Methods. Oikos , 81, 238-254. Romeo, J. (2009). New SPME Guidelines. J Chem Ecol , 35, 1383. Schiestl, F. (2010). The evolution of floral scent and insect chemical communication. Ecology Letters , 13, 643-656. Shibatani, M., Hashidoro, Y., & Tahara, S. (1999). A major Fungitoxin from Pachira aquatica and its accumulation in outer bark. Journal of Chemical Ecology , 347-353. Skoog, D., Holler, F., & Crouch, S. (2008). Principios de análisis instrumental. México: Cengage Learning Editores. Snow, N. (2004). Inlet Systems for Gas Chromatography. En R. Grob, & E. Barry, Modern Practice of Gas Chromatography (págs. 461-490). New Jersey: John Wiley & Sons Inc. Snyder, J. (2004). Environmental Applications of Gas Chromatography. En R. Grob, & E. Barry, Modern Practice of Gas Chromatography (págs. 769-882). New Jersey: John Wiley & Sons Inc. Stashenko, E., & Martínez, J. (2008). Sampling flower scent for chromatographic analysis. J. Sep. Sci. , 31, 2022-2031. Tholl, D., & Röse, U. (2006). Detection and Identification of Floral Scent Compounds. En N. Dudareva, & E. Pichersky, Biology of floral scent (págs. 3-26). New York: Taylor and Francis Group. Tholl, D., Boland, W., Hansel, A., Loreto, F., Röse, U., & Schnitzler, J. (2006). Practical approaches to plant volatile analysis. The Plant Journal , 45, 540-560. Vainstein, A., Lewinsohn, E., Pichersky, E., & Weiss, D. (2001). Floral Fragance. New inroads into an old commodity. Plant Physiol. , 127, 1383-1389. Witte, L. (1986). GC-MS for Terpenoids. En H. Linskens, & J. Jackson, Modern Methods of Plant Analysis Vol. 3 (págs. 134-145). Berlin: Springer-Verlag. Zamora-Cornelio, L., Ochoa-Gaona, S., Vargas-Simón, G., Castellanos-Albores, J., & Jong, B. (2010). Germinación de semillas y clave para la identificación de 41 plántulas de seis especies arbóreas nativas de humedales del sureste de México. Rev. Biol. Trop. , 58(2), 717-732 . Zoghbi, M., Andrade, E., & Maia, J. (2003). Volatiles from flowers of Pachira aquatica Aubl. Journal of Essential Oil-Bearing Plants , 6(2), 116-119. 42 ANEXOS PATRONES DE FRAGMENTACIÓN (ESPECTROMETRÍA DE MASAS) OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE CORRESPONDIENTES A LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES PRESENTES EN LA ESENCIA FLORAL DE Pachira aquatica 43 (z)-3-Hexenil acetato O trans-β-Ocimeno O cis-β-Ocimeno Metil benzoato O O 44 v Linalool Bencil acetato OH O O Metil nicotinato O O O N 3-hexenil butanoato O 45 Metil salicilato 3-metil-3-hexenil butanoato O O O O OH 2-metil-3-hexenil butanoato Isobutil benzoato O O O O 46 δ-Elemeno Copaeno α-Cubebeno Geranil acetato O O 47 O β-Cubebeno trans-Cariofileno Jasmona Desconocido 1 48 Isopentil benzoato Desconocido 2 O O α-Humuleno Desconocido 3 49 δ-Cadineno (z)-3-Hexenil benzoato O O Isopentil salicilato Dendrolasina O O OH O
