Revisiones - Revista Ecosistemas

Año XII, Nº1 / 2003
Enero - Abril
Revisiones
Capel, J. Lozano R., Martínez-Zapater, J.M. y Jarillo, J.A. 2002. Ritmos y relojes circadianos de las plantas. Ecosistemas
2003/1 (URL: http//www.aeet.org/ecosistemas/031/revisiones2.htm)
Ritmos y relojes circadianos de las plantas
Juan Capel1, Rafael Lozano1, José M. Martínez-Zapater2 y José A. Jarillo2
1
Área de Genética, Dpto. de Biología Aplicada, Universidad de Almería, Carretera de
Sacramento s/n, 04120 La Cañada, Almería.
2
Dpto. de Biotecnología, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y
Alimentaria (INIA), Carretera de la Coruña km7, 28040 Madrid.
L
as plantas necesitan coordinar toda su fisiología, y por ende su reproducción, con la información del ambiente que las
rodea. Los ritmos biológicos permiten a las plantas anticiparse a ciertas condiciones exteriores cambiantes como luz y
temperatura. Los encargados de generar los ritmos son los relojes biológicos, que a su vez utilizan la información del
ambiente que rodea a la planta para actualizar su propio funcionamiento. Entre los ritmos biológicos los de mayor
trascendencia para plantas y animales son los que ocurren con periodos cercanos a un día o ritmos circadianos. En los
últimos años hemos asistido a una gran cantidad de descubrimientos acerca de la naturaleza del reloj circadiano de las
plantas y de cómo éste controla proceso anuales tan importantes como la floración y la tuberización. Sin embargo aún
estamos lejos de comprender, y por tanto manipular, este importante mecanismo biológico clave para la ecología y la
producción de los vegetales.
De entre todos los procesos biológicos que ocurren con cierta periodicidad, quizá los de mayor
relevancia son los que tienen lugar siguiendo la pauta del tiempo empleado por la tierra en rotar
alrededor de su eje, o lo que es lo mismo, según los ciclos diarios de luz - oscuridad. Cuando se observa
que un proceso continúa produciéndose de forma periódica en ausencia del estímulo ambiental que lo
ocasiona, nos encontramos ante un ritmo biológico, que en el caso de tener una periodicidad diaria, y
precisamente por el periodo de tiempo que ocupan, han sido denominados ritmos circadianos.
En la naturaleza se distinguen también procesos rítmicos cuyos periodos son más cortos de un día, y son
denominados ritmos infradianos. Ejemplo de estos ritmos son los movimientos de circumnutación que
acompañan al crecimiento de muchos vegetales, los cuales presentan periodos que oscilan entre 30
minutos y varias horas (Engelmann y Jhonsson, 1998). Por el contrario, los periodos menstruales de
muchos animales son ritmos ultradianos, ya que los periodos con los que se producen oscilan entre
pocos días en algunos roedores hasta periodos cercanos a los 30 días en los primates (Moore-Ede et al.,
1982). Algunos de los ritmos con mayor trascendencia para el desarrollo de las plantas, tales como la
tuberización o la floración, son también ritmos ultradianos que ocurren con periodicidad anual
(Sweeney, 1987).
Si bien resulta evidente que las pautas de actividad de la mayoría de animales, incluido el hombre, son
ritmos circadianos, los ritmos biológicos diarios se describieron científicamente por primera vez en
plantas, a comienzos del siglo XVIII cuando el astrónomo francés de Mairan observó que plantas de
mimosa (Mimosa pudica L.) que previamente habían sido crecidas en ciclos naturales de luz-oscuridad,
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después de ser transferidas a oscuridad permanente continuaban abriendo y cerrando sus hojas con una
ritmicidad cercana a 24 horas. Algunos años más tarde fue Linneo quien propuso que la apertura y
cierre de los pétalos de diversas especies de plantas está controlada por los ritmos diarios de
iluminación-oscuridad y diseñó un "reloj de flores", con el que simplemente mirando el estado de los
pétalos de las flores de un jardín en el que creciesen las especies adecuadas, podría conocer la hora del
día (Somers, 1999) .
Fue necesario que transcurriese casi un siglo hasta que se pudo demostrar que los ritmos del
movimiento de las hojas de la mimosa están controlados de forma endógena, y no por algún tipo de
influencia inadvertida de la rotación de la tierra. Este trascendental descubrimiento fue debido a la
observación de que en completa oscuridad los ritmos de apertura y cierre de las hojas de la mimosa
tienen periodos que oscilan entre 22-23 horas, lo cual descarta que sea la rotación de la tierra la
responsable de esta actividad cíclica, y por el contrario demuestra que se trata de un ritmo controlado
por un mecanismo celular endógeno que ha sido denominado reloj biológico o reloj circadiano.
Desde entonces la presencia del reloj biológico ha sido demostrada en muchos organismos, desde
procariotas hasta la mayoría de eucariotas, hecho probablemente ocasionado porque el reloj circadiano
supone una ventaja evolutiva para los organismos que lo poseen, puesto que les permite predecir y
anticiparse a las condiciones cambiantes del exterior (Ouyang et al., 1998). Por tanto, se puede definir
un ritmo circadiano como aquel que en ausencia de estímulos externos es mantenido por el reloj
endógeno con periodos cercanos a 24 horas. En condiciones naturales mantener un proceso biológico
con un periodo de 24 horas necesita de estímulos externos que ajusten la actividad del reloj. En la
mayoría de sistemas estudiados estos estímulos son los ciclos naturales de luz-oscuridad y/o los cambios
en la temperatura exterior, si bien en animales también se ha demostrado que la alimentación y la
actividad son estímulos capaces de actualizar la información del reloj circadiano (Takahashi, 1995).
Además de necesitar continuamente de un estimulo para mantener actualizada la información temporal
externa, los relojes circadianos tienen una propiedad que les hace únicos entre los procesos biológicos y
es la denominada compensación de temperatura. Y es que al contrario de la mayoría de procesos
bioquímicos, que son muy sensibles a la temperatura, los ritmos circadianos pueden alterar su fase
debido a un cambio de temperatura, pero una vez estabilizada la nueva condición ambiental, no se
observa efecto alguno sobre la periodicidad de los ritmos (Somers, 1999). Si bien la necesidad de esta
cualidad de los relojes endógenos resulta evidente, ya que poca utilidad tendría un reloj que midiese
distintos periodos dependiendo de la temperatura exterior, el mecanismo por el que se consigue es
totalmente desconocido.
Ritmos circadianos en las plantas
Desde la observación original del astrónomo de Mairan, se conoce que el movimiento de las hojas de la
mimosa está controlado por el reloj biológico. De igual manera se ha descrito que el crecimiento del
hipocotilo de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, la especie modelo en biología molecular vegetal,
muestra ritmos circadianos (Figura 1), aunque se desconoce el mecanismo por el que el reloj biológico
controla la elongación de las células que componen este órgano de la planta. Sin embargo, la
monitorización del crecimiento de las plantas de Arabidopsis es una tarea relativamente sencilla que ha
permitido identificar muchos mutantes alterados en la longitud del periodo de este ritmo, y de esta
forma ha sido posible identificar posibles componentes moleculares del reloj biológico. El movimiento
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de los cotiledones es otro proceso biológico rítmico y circadiano, el cual está generado por la elongación
diferencial de las células de los peciolos (Figura 1).
Figura 1. Ritmos circadianos en el crecimiento de una plántula de Arabidopsis. En A se
muestran fotogramas de una plántula crecida previamente durante 3 días en ciclos de
luz/oscuridad (12h:12h) y después colocada en luz continua de baja intensidad. Se
muestran fotogramas de las primeras 24 horas en luz continua tomadas cada 3 horas. En B
se muestra la posición relativa en píxeles de distintos órganos de la plantula mostrada en
A, tales como el extremos de la raíz o el hipocotilo durante 60 horas en luz continua. El
movimiento de un cotiledón se obtiene restando la posición del extremo del cotiledón a la
posición del hipocotilo.
La apertura y cierre de los estomas, y por ende el intercambio gaseosos que se produce a través de
poros, en condiciones adecuadas ocurre de manera rítmica y está controlada por el reloj biológico. Este
último es el responsable de las reorganizaciones que muestra el citoesqueleto de las células oclusivas de
los estomas, las cuales, a su vez, provocan la apertura y cierre de los poros estomáticos. Por tanto, no es
de extrañar que la asimilación del CO2 atmosférico, y en algunas especies parte del ciclo de Calvin,
estén controlados también por el reloj biológico (Strayer y Kay, 1999).
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Fue también en las plantas donde por primera vez se describió que cambios en la expresión génica
estaban controlados por los ritmos circadianos. Los primeros genes descritos cuya expresión era
regulada por el reloj biológico fueron algunos de los genes claves de la fotosíntesis, tales como los
genes CAB que codifican para los complejos antena tipo I del fotosistema II o los genes RBCS que
codifican para la subunidad pequeña de la RUBISCO (Piechulla, 1999). También se ha descrito que la
transcripción de genes localizados en el genoma cloroplastidial están controlados de una forma
circadiana (Harmer et al., 2001). De forma paralela se ha demostrado que muchos de los genes
nucleares que participan en la fotosíntesis están controlados por el fotoperiodo y por el reloj endógeno,
lo que supone una ventaja para las plantas, toda vez que el reloj biológico es el encargado de inducir a
los genes que participan en la fase luminosa antes de que amanezca y, por el contrario, comienza a
reprimir estos genes antes de que anochezca, con el consiguiente ahorro energético.
Las nuevas tecnologías que han surgido para el estudio de genomas completos han permitido
recientemente determinar la secuencia completa de los genomas de Arabidopsis y arroz, lo que a su vez
ha facilitado analizar todos los genes hasta ahora identificados. De esta forma, ha sido posible
determinar que entre el 2% y el 6% de los genes de Arabidopsis analizados están controlados por el
reloj circadiano (Harmer et al., 2000; Schaffer et al., 2001). Dos conclusiones pueden ser destacadas de
estos experimentos: en primer lugar que pueden establecerse grupos de genes con similar periodo de
transcripción y que se han encontrado grupos de genes que muestran máximos de transcripción en
cualquiera de las fases del día o de la noche subjetivos; y en segundo lugar que probablemente este
número de genes que se ha identificado bajo el control del reloj endógeno probablemente supone una
subestimación del número total de genes que están controlados por el reloj circadiano (Harmer et al.,
2000; Schaffer et al., 2001). Por ello que se ha sugerido que prácticamente todos los aspectos del
metabolismo, y por ende de la fisiología de las plantas, estaría modulados por el reloj endógeno.
Llegada de información medioambiental al reloj.
El o los mecanismos por el que el reloj percibe los cambios de temperatura o incluso el mecanismo que
permite al reloj la compensación de temperatura permanecen aún desconocidos. Sin embargo, los
mecanismos por los cuales la energía luminosa es percibida por las células, y como esa información es
trasmitida al reloj, comienzan a ser muy bien conocidos (Devlin, 2002). En todos los sistemas
biológicos, desde cianobacterias hasta humanos, es la luz perteneciente a la región azul del espectro
luminoso la que es percibida por el reloj circadiano. Tanto en plantas como en animales son los
fotorreceptores de luz azul tipo criptocromos los encargados de percibir dicha luz y transmitir la
información al reloj circadiano (Cashmore et al., 1999). La gran diferencia entre estos sistemas es que
en mamíferos los criptocromos son también componentes integrales del reloj, mientras que en plantas
únicamente parecen actuar como moléculas fotorreceptoras (Harmer et al., 2001).
Además, los relojes circadianos vegetales son los únicos descritos con capacidad para percibir
información luminosa del espectro del rojo al rojo lejano. Los fitocromos son los fotorreceptores
responsables de percibir información en dicha región del espectro y son los encargados de transmitir
dichos estímulos luminosos a los componentes del mecanismo del oscilador circadiano (Quail, 2002).
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Mecanismo del oscilador
La energía luminosa y térmica es transmitida al denominado oscilador central del reloj que, en ultima
instancia, es el encargado de mantener la periodicidad temporal, lo que le convierte en el componente
más interesante de este mecanismo biológico. En sistemas tales como cianobacterias, insectos o incluso
mamíferos, los componentes moleculares del oscilador central están perfectamente definidos, si bien se
observa poca similitud entre las proteínas que forman parte de los respectivos osciladores. En todos
estos sistemas se postula que el oscilador está compuesto por componentes positivos, proteínas que
regulan e inducen la expresión de otras proteínas (componentes negativos) las cuales a su vez, reprimen
a los elementos positivos, originándose un bucle de retroalimentación (Figura 2). En plantas solo
recientemente se ha comenzado a identificar posibles componentes del oscilador central en Arabidopsis,
y aún de muchas de las proteínas identificadas no se dispone de pruebas inequívocas que demuestren su
función como componentes del mecanismo del oscilador. Las dos primeras proteínas que fueron
señaladas como posibles componentes de reloj circadiano en plantas fueron CCA-1 y LHY, proteínas
homólogas entre si que tienen como característica poseer un dominio de unión al ADN tipo c-myb
(Carre y Kim, 2002). La sobrexpresión de los genes correspondiente (CCA-1 y LHY) provoca
arritmicidad en todos los procesos circadianos estudiados hasta el momento. Además se han identificado
mutantes nulos de los genes CCA-1 y LHY1 (es decir, plantas mutantes que carecen de las proteínas
CCA-1 y LHY1), y se ha observado que los dobles mutantes cca1 lhy1 presentan periodos más cortos
en la ritmicidad de diversos genes controlados por el reloj, indicando que LHY y CCA1 son
componentes del oscilador central (Mizoguchi et al., 2002).
El primer gen de plantas que se demostró que codificaba para un componente negativo del oscilador
central fue TOC1, ya que se ha descrito que las plantas mutantes para este gen muestran periodos
significativamente más cortos en todos los ritmos circadianos estudiados, siendo la proteína codificada
por este gen un nuevo tipo de proteína reguladora, nunca antes descrita en plantas (Strayer et al., 2000).
Recientemente se ha propuesto la existencia de una regulación recíproca entre TOC1 y CCA1/LHY en
el reloj de Arabidopsis. TOC1 parece participar en la regulación positiva de la expresión de CCA1 y
LHY mientras que LHY y CCA1 regulan de forma negativa TOC1, uniéndose a la secuencia promotora
de TOC1, lo cual indicaría que son componentes del oscilador central de las plantas (Alabadi et al.,
2001).
Un tercer tipo de mutantes alterados en el periodo de ritmos circadianos ha sido recientemente
identificado, con la particularidad de que en ellos el periodo de los ritmos circadianos es más largo,
fenotipo que ha servido para nombrar a los genes que codifican para estas proteínas adagio (Jarillo et
al., 2001). El mutante adagio1 (también llamado zeitlupe) en ciertas condiciones de iluminación es
arrítmico, lo que indicaría que la proteína ADAGIO1 o bien sería un componente positivo del oscilador
central o bien sería un intermediario entre los fotorreceptores y el oscilador. El hecho de que en el
genoma de Arabidopsis existan tres genes ADAGIO muy similares podría explicar por qué los mutantes
sencillos no son arrítmicos en todas las condiciones lumínicas. Se están generando dobles y triple
mutantes de estos genes que ayuden a dilucidar, de una forma precisa la función que cada uno de ellos
tiene en el mecanismo de control de los ritmos circadianos en Arabidopsis.
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Figura 2. Representación esquemática del sistema circadiano en
plantas. La energía luminosa del exterior es percibida por
fotorreceptores como Fitocromos (PHY) y Criptocromos (CRY),
si bien se desconoce el receptor de temperatura de la plantas. La
información del exterior es transmitida al oscilador central que es
el encargado de medir la longitud del periodo de diversos
procesos como los que se destacan en amarillo (tiempo de
floración, movimiento de las plantas, etc) a través del control de
los procesos indicados en azul (control de la expresión génica,
etc).
Salida de la información desde el oscilador central
Mutaciones que afectan al gen adagio3 (también llamado fkf1), provoca alteraciones en los ritmos
circadianos, así como un retraso muy significativo en el tiempo del proceso de la floración (Figura 3).
Algunos otros mutantes de genes que codifican para componentes del reloj biológico también provocan
alteraciones en el tiempo de floración. Así por ejemplo, las mutaciones toc1 provocan un adelanto en el
tiempo de floración , característica que además se encuentra en otros mutantes alterados en el reloj
circadiano (tales como early flowering3 y 4), lo que demuestra que el reloj biológico participa en el
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control de ritmos ultradianos, probablemente informando a la células correspondientes de la longitud del
día y de la noche. Muy recientemente se ha demostrado que en Arabidopsis el reloj circadiano participa
en el control de la floración regulando el nivel de expresión de dos genes claves de este proceso como
son CONSTANS y FT (Yanovsky y Kay, 2002). Y también recientemente se ha demostrado que
CONSTANS participa en el control fotoperiódico de la tuberización, lo cual implica que este gen,
controlado a su vez por el reloj biológico, es clave para transmitir la información del reloj biológico, la
cual es utilizada por la planta para el control de diversos procesos de la máxima importancia en la
biología de las plantas (Martínez-Garcia et al., 2002).
Figura 3. Tiempo de floración de plantas de Arabidopsis mutantes de los genes adagio.
Las plantas de Arabidopsis del ecotipo Columbia (Col) y de los mutantes adagio1 y 2
(ado1 y 2) florecen normalmente mientras que las plantas del mutante adagio3 (ado3),
muestran un fenotipo de floración tardía.
De todas las vías de transmisión de señales que parten desde el oscilador central, las que interviene en el
control del tiempo de floración son las mejor conocidas de plantas. Sin embargo, cabe esperar que las
nuevas herramientas moleculares de las que actualmente se dispone, las mejores de ellas derivadas del
conocimiento de la secuencias nucleotídica completa del genoma de Arabidopsis, permitirán en un
futuro no muy lejano identificar componentes de todas las vías de transmisión de señales que parten del
oscilador central del reloj biológico y que participan en el control de multitud de procesos bioquímicos,
biológicos y celulares.
Conclusiones
A pesar de que los ritmos circadianos fueron identificados por primera vez en las plantas, y que también
fue en plantas donde se demostró que los ritmos circadianos están generados por el denominado reloj
endógeno, aún no se conoce con suficiente detalle este mecanismo que resulta clave en la biología
celular así como en la fisiología y la reproducción de las plantas. En los últimos años se han acumulado
evidencias de múltiples procesos controlados por el reloj biológico, si bien no ha sido hasta
recientemente cuando se han identificado algunos de los componentes implicados en la percepción de
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los estímulos luminosos, y cómo esta información es transmitida hasta el componente clave del reloj, el
denominado oscilador central, generado por la síntesis y degradación cíclica de determinadas proteínas.
También muy recientemente se han identificado los primeros mediadores en la señal que, originada en
el oscilador central, permite al reloj circadiano controlar procesos con periodos anuales como son la
floración y la tuberización. Sin lugar a dudas en los próximos años asistiremos a descubrimientos que
nos permitirán conocer con más detalle todos los componentes moleculares del reloj biológico así como
profundizar en las vías de transmisión de señales que permiten al reloj circadiano controlar diferentes
procesos metabólicos y fisiológicos de las plantas.
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