Departament de Ciències Fisiològiques II CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA PROTEÍNA HERC1 Francesc Garcia Gonzalo Tesis Doctoral 2005 CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA PROTEÍNA HERC1 Memoria presentada por FRANCESC GARCIA GONZALO para optar al grado de Doctor en Bioquímica Trabajo realizado bajo la dirección del Dr. José Luis Rosa López en la Unidad de Bioquímica del Departamento de Ciencias Fisiológicas II de la Universidad de Barcelona. Francesc Garcia Dr. José Luis Rosa A les meves dues àvies A la meva mare AGRAÏMENTS José Luís Rosa Són moltes les persones a les quals he d'agrair el fet d'haver pogut arribar a la conclusió d'aquest projecte, gairebé set anys després del seu inici. Això no obstant, una d'elles sobresurt amb especial intensitat: es tracta del meu director de tesi, el José Luís. Ell m'ha fet costat en tot moment, quan les coses han anat bé i quan no han anat tan bé. D'ell he après moltíssim, tant pel que fa a la manera de treballar al laboratori com en la forma d'organitzar tot allò referent al funcionament del grup de recerca. Totes dues coses, confio, em seran de gran utilitat a partir d'ara i és a ell a qui les dec principalment. A més de tot això, el José Luís ha estat un dels meus millors amics durant aquests anys i per aquest motiu li desitjo molt d'èxit en les seves futures investigacions sobre HERC1, de les quals, després d'uns anys inicials força durs, crec poder vaticinar que aviat arribarà l'anhelada fase de recollida de fruits. Jo ja no hi seré per recollir-los, però em complau saber que el laboratori es queda en bones mans per dur a terme aquesta tasca. Els Amics Hi ha molta més gent amb la qual em sento endeutat. En primer lloc vull destacar els qui han estat els meus principals amics durant aquests anys. Ells han estat els artífexs del fet que jo m'hagi trobat a gust dins i fora del departament. Per a mi, aquests anys de tesi han estat com una segona escola: el Francesc que va arribar a Bellvitge el juliol de 1998 i el que ara se'n va són persones remarcablement diferents. Vull pensar que aquests canvis han estat molt positius i no haurien tingut lloc de la mateixa manera si no hagués gaudit de la inestimable companyia de gent com ara l'Arnau, l'Edu, el Llorenç, la Raquel, el Dani, el Jordi, el Jaume, el Xavi, l'Andrés, el Ricky i d'altres que no poso per no fer una llista massa llarga i avorrida. Els records d'activitats tals com les festes de la masia, les tardes soporíferes en els cursos de doctorat, la caminada de la Matagalls-Montserrat, l'aventura de l'aurora boreal, els futbolins, les esquiades i moltes altres els atresoraré d'ara endavant I de forma especial. I quan pensi en aquestes coses, pensaré en vosaltres i us estaré enormement agraït per haver compartit amb mi aquests valuosos moments de la meva vida. Els Companys de feina Aquesta tesi he tingut la sort de fer-la en un ambient força agradable i distès, en el qual la gent sempre m'ha ajudat quan ho he necessitat. Aquí sí que faré una llista més exhaustiva, començant per la gent del meu propi laboratori, del present i del passat, com la Cristina Cruz i la Puri Muñoz, dues grans científiques que malgrat no recollir-ne tampoc gaires fruits, han estat cabdals en la recerca d'HERC1 (a totes dues els desitjo el millor en tot allò que facin), l'Eduard, el Ouadah i la Roser, les bones mans en què es queda ara el lab i l'Elena, la Diana i en Gustavo, als quals HERC1 no els va acabar de fer “el pes” i van preferir provar sort en altres llocs o oficis. Del grup del Francesc Ventura i del Francesc Vinyals, els nostres companys de seminaris i antics companys de laboratori, a més dels susdits caps, vull mencionar a l'Elisabeth Chalaux, la qual recordo que em va ensenyar quelcom tan bàsic com revelar films, cosa que ara un diria que ha sabut fer tota la vida, la Teresa López, que també em va fer una mica de mestra en la meva fase de novici, la Raquel, l'Arnau, el Nelson, la Cristina Gamell, la Cristina Lacasa, l'Antonio i la Bea, tots ells esplèndides persones amb qui ha estat un honor poder treballar. Als neurocientífics del departament també els vull agrair el seu suport així com nombroses converses interessants: al Santi, el Jordi Llorenç, la Cristina Gómez, el Pol, la Julia, la Roser, l'Eduard Balbuena, el Pere, la Judit, l'Anna Seoane, la Blanca i la Mònica Espejo. Tampoc em podré oblidar fàcilment dels asos de la PFK2, des del Ramon Bartrons, a qui sempre he considerat l'alma mater del departament i a qui també professo una gran admiració, al Lluís, un altre dels mestres que vaig tenir al principi tot i que paradoxalment era ell qui s'entestava a anomenar-me mestre a mi, la Mercè, el Joan, l'Àurea, l'Esther Adanero, la Marta, l'Anna Manzano, la Nieves i la Mònica Vallès. Gràcies també als integrants del grup d'apoptosi: al Joan, una altra persona en la qual també m'he volgut emmirallar donats el seu talent i entusiasme per la ciència, el Biel, l'Esther Castaño, la Montse, la Maria Piqué, el Dani, el Llorenç, la Clara, l'Antonio, el José II Manuel, l'Anna Maria, la Mercè i la Mireia Dalmau. Per altra banda, ha estat també un plaer compartir departament amb els biofísics: el Jordi Bermúdez, la Teresa Roig, a la qual li agraeixo a més haver tingut la generositat de prestar-me la seva targeta de pàrquing sense tenir perquè fer-ho, l'Edu, el Jordi Boada, l'Anna Vidal, la Maria Molas, el José Carlos, el Francesc Xavier i l'Alícia. I ja per anar acabant, dono també les gràcies a la Pepita, la Fina, la Laura, la Kathryn i el Manel, de la cinquena al Ricardo, la Beatriz, la Vanessa, la Beth, la Wilmar, la Marta, el Ricky i sobretot a l'Esther, amb qui he tingut el plaer de compartir molts moments meravellosos en el darrer any, i tornant a la quarta a la gent de biologia cel·lular, especialment l'Àlex, el Benja i en Joan Blasi, qui al capdavall fou la primera persona de Bellvitge amb qui vaig parlar ara fa set anys i gràcies a la qual vaig conèixer a qui acabaria esdevenint el meu director de tesi. Per últim, dono també les gràcies als meus amfitrions durant la meva estada a Alemanya: Erich Eigenbrodt, Sybille Mazurek i Markus Ott. En definitiva, moltes gràcies a tots !!!!! Les Àvies Les meves dues àvies es mereixen un apartat especial dins d'aquesta secció. No només perquè vaig estar vivint amb totes dues durant la primera meitat dels meus anys de tesi i per tant en bona mesura em van mantenir, sinó també perquè el fet de viure amb elles va suposar una experiència enormement edificant per a mi i em va permetre aprofundir en les meves arrels. Per aquest motiu aquesta tesi la dedico a les meves dues àvies, a la memòria de la meva estimada iaia Berta, que en pau descansi, i a la de tota una institució familiar, l'encara viva i increïblement lúcida iaia Severina. Infinites gràcies a les dues. La Família La meva mare ha estat la persona de la qual més coses he rebut al llarg de la meva vida i és per això també la persona amb qui més endeutat em sento. El cert és que, tot i que a cops em resulti fàcil III oblidar-ho, no sé pas que faria sense saber que ella es troba al meu darrere per donar-me suport en tot allò que necessiti. Per aquest motiu i molts d'altres, tots els meus agraïments són pocs: gràcies Mama, perquè sense tu mai hauria arribat a ser ni una ombra del que sóc. Així mateix, vull expressar el meu més sincer agraïment als meus germans i germanes, la simple existència dels quals em fa enormement feliç: als grans, el Marc i la Lluna, i als més petits, el Marcel i el Bernat. També estic en deute amb el Ramon, el qual em va educar durant la meva adolescència i, en un gest que l'honra, sempre ha estat allà quan l'he necessitat. També agraeixo profundament al Papa la seva tasca paternal, així com el fet d'haver sufragat els costos de la práctica totalitat dels meus estudis. A l'Olga li agraeixo sobretot que sigui tan bona mare dels meus germans petits, a més de tot el que ha fet per mi durant aquests anys. Per acabar, no em vull pas oblidar dels meus abundants cosins i cosines, tiets i tietes, i altres parents amb qui he passat molt bons moments. També voldria aprofitar l'avinentesa per retre homenatge als meus dos avis, l'avi Paco i el iaio Herminio, que en pau descansin. IV TABLA DE CONTENIDOS Página 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Las proteínas HERC 1.1.1. Definición 1.1.2. El dominio RLD 1.1.3. El dominio HECT 1.1.4. Las proteínas HERC en el ser humano 1.1.4.1. La proteína HERC1 1.1.4.2. La proteína HERC2 1.1.4.3. La proteína HERC3 1.1.4.4. La proteína HERC4 1.1.4.5. La proteína HERC5 1.1.4.6. La proteína HERC6 1.1.5. Evolución de los genes HERC 1 1 1 1 11 17 18 23 29 30 32 35 36 2. OBJETIVOS 2.1. Identificación de moléculas asociadas a HERC1 2.2. Análisis de la localización subcelular de HERC1 2.3. Estudio de los efectos de la silenciación de HERC1 2.4. Estudio de los efectos de mutaciones en HERC1 41 41 41 41 42 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Reactivos 3.2. Plásmidos 3.3. Anticuerpos 3.4. Líneas celulares, transfecciones y RNAi 3.5. Sistema de los dos híbridos en levadura 3.6. Expresión y purificación de proteínas 3.7. SDS-PAGE y Western blot 3.8. Experimentos de pull-down 3.9. Ensayos de ubiquitinación 3.10. Actividades enzimáticas 3.11. Cromatografía de filtración en gel 3.12. Experimentos de inmunoprecipitación 3.13. Experimentos de disociación e intercambio de nucleótidos 3.14. Slot-blots 3.15. Ensayos de unión a fosfolípidos 3.16. Técnicas inmunocitoquímicas 3.17. Microscopía confocal 3.18. Técnicas de DNA recombinante 3.19. Centrifugación en gradiente de sacarosa 3.20. Experimentos de internalización de EGF, transferrina y dextrano 3.21. Genotipaje de ratones 43 43 43 45 46 47 48 49 50 51 51 52 52 53 54 54 55 55 56 58 59 60 V 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Identificación de moléculas asociadas a HERC1 4.1.1. Interacción entre HERC1 y M2PK 4.1.2. Interacción entre HERC1 y CLC 4.1.3. Interacción entre HERC1 y fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 4.1.4. Interacción entre HERC1 y otros fosfolípidos 4.2. Análisis de la localización subcelular de HERC1 4.2.1. Análisis de la localización subcelular de HERC1 por microscopía confocal 4.2.1.1. Colocalización entre HERC1 y marcadores de vías endocíticas 4.2.1.2. Colocalización entre HERC1 y marcadores de la vía secretora 4.2.2. Efecto del fluoruro de aluminio sobre la localización subcelular de HERC1 4.2.2.1. HERC1 se halla en protrusiones de membrana ricas en actina 4.2.2.2. La sobreexpresión de HERC1 no afecta a la formación de protrusiones 4.2.2.3. HERC1 colocaliza con PI(4,5)P2 en las protrusiones de actina 4.3. Estudio de los efectos de la silenciación de HERC1 por RNAi 4.3.1. Efecto del RNAi de HERC1 sobre endocitosis 4.3.2. Efecto del RNAi de HERC1 sobre la vía secretora 4.4. Estudio de los efectos de mutaciones en HERC1 4.4.1. Estudio de proteínas de fusión entre GFP y formas delecionadas de HERC1 4.4.2. Estudio de la mutación tambaleante 62 62 62 75 77 81 84 84 84 89 96 96 98 100 103 105 108 111 111 123 5. DISCUSIÓN FINAL 130 6. CONCLUSIONES 135 7. REFERENCIAS 138 8. ARTÍCULOS 158 VI TABLA DE FIGURAS Página Figura 1. Estructura del dominio RLD de RCC1 Figura 2. Regulación de la actividad de las GTPasas de la superfamilia de Ras Figura 3. Alineamiento múltiple de RLDs Figura 4. Árbol filogenético de RLDs Figura 5. Estructura del dominio HECT de E6AP unido a UbcH7 Figura 6. Alineamiento múltiple de HECTs Figura 7. Árbol filogenético de HECTs Figura 8. Mecanismo de ubiquitinación de proteínas Figura 9. Tipos de ubiquitinación y sus funciones Figura 10. Los genes HERC Figura 11. Las proteínas HERC Figura 12. Árbol filogenético de las proteínas HERC Figura 13. Orígenes de los genes HERC Figura 14. Interacción entre HECT de HERC1 y M2PK en levadura Figura 15. La piruvato quinasa tipo M2 Figura 16. Isoenzimas de la piruvato quinasa Figura 17. Posible lugar de unión a M2PK en el HECT de HERC1 Figura 18. Interacción in vitro entre el HECT de HERC1 y M2PK Figura 19. Interacción HERC1-M2PK en células de insecto Figura 20. Localización subcelular de M2PK y HERC1 Figura 21. M2PK no parece ser un sustrato de ubiquitinación Figura 22. Alteraciones en HERC1 no afectan a la actividad enzimática de M2PK Figura 23. El HECT de HERC1 no altera la estructura cuaternaria de M2PK Figura 24. Interacción entre HERC1 y CLC Figura 25. HERC1 es un factor disociador de GDP para ARF6 Figura 26. Requerimiento de PI(4,5)P2 para la actividad GRF de HERC1 Figura 27. El dominio RLD1 de HERC1 tiene afinidad por varios fosfolípidos Figura 28. Interacción de HERC1 con fosfoinosítidos Figura 29. HERC1 sólo colocaliza débilmente con dextrano Figura 30. HERC1 no colocaliza con transferrina Figura 31. HERC1 no colocaliza con EGF Figura 32. HERC1 no colocaliza con marcadores endosomales Figura 33. HERC1 no colocaliza con VSVG-GFP Figura 34. HERC1 se halla en vesículas asociadas al Golgi pero no en las cisternas Figura 35. Efecto de BFA sobre colocalización HERC1-GM130 Figura 36. HERC1 se transloca a protrusiones de actina tras activación de ARF6 Figura 37. HERC1 no afecta al grado de activación de ARF6 en HeLa Figura 38. HERC1 colocaliza con PI(4,5)P2 y PIP quinasa en las protrusiones de actina Figura 39. RNAi de HERC1 Figura 40. HERC1-siRNA no afecta la localización de proteínas endocíticas Figura 41. HERC1-siRNA no afecta la internalización de EGF en HeLa Figura 42. HERC1-siRNA no afecta la degradación de EGFR Figura 43. HERC1-siRNA no afecta la localización de proteínas de la vía secretora VII 2 3 4-5 7 12 13 14 15 16 17 19 37 38 63 64 65 67 68 69 70 72 73 74 76 78 79 82 83 85 86 87 88 91 92 94 97 99 101 104 105 106 107 109 Figura 44. HERC1-siRNA no afecta al transporte a la membrana de VSVG y EGFR Figura 45. Proteínas de fusión entre GFP y HERC1 Figura 46. Western blot de las proteínas de fusión entre GFP y HERC1 Figura 47. Localización subcelular de las proteínas de fusión GFP-HERC1 Figura 48. Mapeo de la secuencia de HERC1 que da lugar a acumulaciones Figura 49. Las acumulaciones de HERC1 contienen ubiquitina Figura 50. Las acumulaciones de HERC1 son probablemente agregados proteicos Figura 51. El dominio RLD1 de HERC1 inhibe la internalización de EGF Figura 52. Los dominios RLD1 y RLD2 bloquean la internalización de EGF Figura 53. La mutación tambaleante del ratón Figura 54. Posible ubicación y papel de la glicina-483 de HERC1 Figura 55. La mutación tbl no afecta la localización subcelular de RLD1 Figura 56. La mutación tbl no afecta a la inhibición de la endocitosis causada por RLD1 Figura 57. Genotipaje de los ratones tambaleante VIII 110 112 113 114 116 118 120 121 122 124 125 126 127 129 TABLA DE ABREVIATURAS Abreviatura Significado / Definición Ado ADP AMP APC ARF ARNO BCA E-COP BFA E-ME BSA bp CCVs Cdc42 Cdk1 cDNA Ceb1 cGMP CHC CI-M6PR CLC COP-I COP-II Cyt b5 dCTP DelGEF DelGIP1 DMSO DNA dNTPs DOC dsRNA DTT E1 E2 E3 E6 E6AP EDTA EEA1 EGF EGFR ENU ER ERES ERGIC ERGIC53 F-actina Adenosina Adenosina 5’-difosfato Adenosina 5’-monofosfato Complejo promotor de la anafase Factor de ADP-ribosilación Proteína abridora del lugar de unión a nucleótido de ARF Ácido bicinconínico Subunidad beta del coatómero Brefeldina A 2-mercaptoetanol Albúmina sérica bovina Par de bases Vesículas recubiertas de clatrina Cell division cycle-42 Quinasa dependiente de ciclinas-1 (p34cdc2) DNA complementario Proteína de unión a ciclina E Guanosina 3’,5’-monofosfato cíclico Cadena pesada de la clatrina Receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes Cadena ligera de la clatrina Vesículas de coatómero de tipo I Vesículas de coatómero de tipo II Dominio homólogo al citocromo b5 Desoxicitidina 5’-trifosfato GEF asociado a locus de sordera Proteína-1 que interacciona con DelGEF Dimetilsulfóxido Ácido desoxirribonucleico Desoxinucleósidos trifosfato Dominio homólogo a la subunidad Doc/Apc10 del APC RNA de doble hebra Ditiotreitol Enzima activador de la ubiquitina (Uba) Enzima conjugador de la ubiquitina (Ubc) Ubiquitina ligasa (Ubl) Oncoproteína E6 de HPV-16 Proteína asociada a E6 Ácido etilendiaminotetraacético Autoantígeno de endosomas tempranos-1 Factor de crecimiento epidérmico Receptor de EGF N-etil-N-nitrosourea Retículo endoplásmico Lugares de salida del ER (elementos de transición del ER) Compartimento intermedio entre ER y Golgi Proteína de 53 kDa del ERGIC Actina filamentosa IX FBS FITC Flag FSH FYVE GAL4 GAL4AD GAL4BD GAP GDP GEF GFP GH GM130 GMPt-1 GRASP65 GRF GST GTP GTPasa GTPJS HA HECT HEPES HERC HGNC His HPV-16 HRP HSMECs Hsp70 HUGO ID IgG IL-1E IPTG jdf2 kb kDa KDELr LB LDH LH LIMP-II LLnL LPA LPC LPS M2PK MAPK M-H mRNA MVBs Myc Suero fetal bovino Isotiocianato de fluoresceína Epítopo Flag (DYKDDDDK) Hormona estimulante de los folículos Fab1p, YOTB, Vac1p y EEA1 Factor de transcripción de S.cerevisiae involucrado en el metabolismo de la galactosa Dominio de activación de la transcripción de GAL4 Dominio de unión al DNA de GAL4 Proteína activadora de la actividad GTPasa Guanosina difosfato Factor intercambiador de nucleótidos de guanina Proteína fluorescente verde Hormona del crecimiento o somatotropina Proteína de 130 kDa de la matriz del Golgi Proteína de la matriz del trans-Golgi-1 Golgi reassembly stacking protein of 65 kDa Factor disociador de nucleótidos de guanina Glutatión S-transferasa Guanosina trifosfato GTP hidrolasa Guanosina 5’-(J-tio)-trifosfato Epítopo HA (residuos 98-106 de la hemaglutinina del virus de la gripe humana) Dominio homólogo al extremo COOH de E6AP Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico Gen o proteína con dominios HECT y RLD Comité de nomenclatura génica de HUGO Hexapéptido formado por seis residuos de histidina Papilomavirus humano tipo 16 Peroxidasa de rábano picante Células endoteliales microvasculares de piel humana Proteína de choque térmico de 70 kDa Organización del genoma humano Identidad Inmunoglobulinas G Interleucina 1-beta Isopropil-E-D-1-tiogalactopiranósido Síndrome de desarrollo juvenil y fertilidad-2 (rjs) Kilobases (miles de pares de bases) Kilodaltons Receptor de KDEL Medio de cultivo de Luria L-lactato deshidrogenasa Hormona luteinizante Proteína integral de membrana de lisosomas-II N-acetil-leucil-leucil-norleucinal Ácido lisofosfatídico Lisofosfatidilcolina Lipopolisacárido Piruvato quinasa tipo M2 Proteína quinasa activada por mitógenos Dominio Mindbomb-Herc2 RNA mensajero Endosomas multivesiculares Epítopo Myc (residuos 408-439 de la proteína p62c-myc humana) X NADH NFNB Ni-NTA NLS ORF p70-S6K PA PAM PBS PC PCR PE PEI PEP PFA PH-PLCG1 Pi PI PI(3)P PI(4)P PI(5)P PI(3,4)P2 PI(4,5)P2 PI(3,5)P2 PI(3,4,5)P3 PIP PIPKD PK PMSF PPi PS PVDF PWS Rab Rac Ran Ras Rb RCC1 Rho RING rjs RLD RNA RNAi RPGR RPGRIP SDS SDS-PAGE Sec7 SH3 siRNA Smurf1 Forma reducida del dinucleótido de nicotinamida y adenina Factor nuclear kappa B Ácido nitrilotriacético con iones Ni2+ coordinados Señal de localización nuclear Marco abierto de lectura p70-S6 quinasa Ácido fosfatídico Proteína asociada al factor de transcripción c-Myc Salino tamponado con fosfato Fosfatidilcolina Reacción en cadena de la polimerasa Fosfatidiletanolamina Polietilenimina Fosfoenolpiruvato Paraformaldehido dominio de homología a plecstrina de la fosfolipasa C-delta-1 Ion mono- o dihidrógenofosfato Fosfatidilinositol Fosfatidilinositol-3-monofosfato Fosfatidilinositol-4-monofosfato Fosfatidilinositol-5-monofosfato Fosfatidilinositol-3,4-difosfato Fosfatidilinositol-4,5-difosfato Fosfatidilinositol-3,5-difosfato Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato Fosfoinosítidos PI(4)P 5-quinasa Piruvato quinasa Fluoruro de fenilmetilsulfonil Iones pirofosfato Fosfatidilserina Fluoruro de polivinilideno Síndrome de Prader-Willi Familia de GTPasas pequeñas de la superfamilia de Ras GTPasas pequeñas pertenecientes a la familia de Rho Proteína nuclear relacionada con Ras Familia de GTPasas pequeñas descubiertas como los oncogenes existentes en los virus de los sarcomas murinos de Harvey y Kirsten Proteína del retinoblastoma Regulador de la condensación cromosómica-1 Familia de GTPasas pequeñas de la superfamilia de Ras Dedo de zinc de tipo RING (really interesting new gene) Síndrome de enanismo, movimientos bruscos y esterilidad (jdf2) Dominio homólogo a RCC1 Ácido ribonucleico Interferencia por RNA Regulador de GTPasas de la retinitis pigmentosa Proteína que interacciona con RPGR Dodecilsulfato sódico Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS Dominio homólogo a la proteína Sec7p de S.cerevisiae Dominio-3 de homología a Src RNA interferente pequeño Factor regulador de la ubiquitinación de Smads-1 XI SNF1 SNF4 Sph(1)P SPRY tbl TGN TNF-D TopBP1 TRITC TSC Ubc WD40 wt VSV-G VTCs X-gal ZZ Sucrose Non-Fermenting-1 Sucrose Non-Fermenting-4 Esfingosina-1-fosfato Dominio homólogo a splA y al receptor de rianodina Tambaleante Red trans-Golgi Factor de necrosis tumoral-alfa Proteína de unión-1 a la DNA topoisomerasa II Isotiocianato de rojo de Texas Complejo de la esclerosis tuberosa Enzima conjugador de ubiquitina (E2) dominio homólogo a la subunidad beta de las proteínas G heterotriméricas tipo salvaje Glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular Compartimentos túbulo-vesiculares 5-bromo-4-cloro-3-indolil-E-D-galactopiranósido Dedo de zinc de tipo ZZ XII