CAPITULO 12

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CAPITULO 12. ESTRUCTURA DEL RNA
12.1
Estructura primaria
12.2
Estructura secundaria
12.3
Duplexes híbridos ADN-ARN
12.4
Estructura terciaria del RNA.
12.4
ARN de transferencia (estructura secundaria y terciaria)
12.5
Interacciones aparareamiento codón-anticodón
12.6
La estructura del ribosoma
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12.1 ESTRUCTURA PRIMARIA DEL ARN
El RNA es una cadena nucleotídica formada por enlaces fosfodiester 5’->3’.
Esto es, algo identico a lo que se tenía en el ARN. La diferencia fundamental, a parte de
la existencia de uridina en lugar de timidina, es la existencia de ribosa, en lugar de 2’deoxyribosa. La existencia de un grupo OH en 2’ abre una posibilidad nueva. Esto es,
porque no es el enlace fosfodiester 5’->2’, en lugar de 5’->3’?. La primera respuesta
que se nos puede ocurrir es que el enlace fosfodiester es más estable en 3’ que no en 2’.
Esto es falso, se ha visto experimental, y teóricamente que la unión 5’->2’ es incluso
más estable que la 5’->3’ y que puede formar hélices como las uniones 5’->3’. Por que
entonces es el enlace 5’->3’ el que existe in vivo?. La verdad no se sabe muy bien, pero
se especula que pueda ser un efecto evolutivo ligado al hecho de que las uniones 5’->2’
tienen una tendencia superior a formar hélices de orden superior (p.ej triples hélices)
que las que tienen los enlaces 5’->3’ standard.
Señalar que recientemente se han encontrado polímeros de RNA con unión 5’>2’. Un ejemplo es el 5’->2’ polyA RNA (3 a 8 A) que se da catalizado por la proteína
interferón. El interferón sabéis que es una molécula proteica que se da como respuesta a
la infección vírica, y que es responsable de la defensa antiviral del organismo. La
síntesis del fragmento poliA (5’->2’) induce una “interferón-induced ribonuclease” que
es la que rompe y degrada el RNAm vírico. Es decir, que el enlace 5’->2’ no es el más
abundante, pero es teóricamente posible, y biológicamente relevante.
La similitud estructural a nivel de estructura primaria del RNA y el RNA es muy
elevada, y los cambios de propiedades debido al cambio ribosa->deoxyribosa y T->U
son pequeños. De hecho las diferencias de secuencia más relevantes entre RNA y DNA
es que la presencia de bases anómalas (no codificantes) en el ARN es mucho más
abundante que no en el DNA, especialmente en lo que hace referencia al RNA(t).
12.2
ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL ARN
La presencia del grupo 2’-OH introduce pequeñas modificaciones en la
preferencia conformacional del azúcar, pero suficiente para que prevalezca la
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conformación C3’-endo (zona Norte), como ya se discutió en el capítulo anterior. De
hecho, el puckering de la ribosa en el RNA es más rígido que el correspondiente de la
2’deoxy-ribosa en el RNA y prácticamente el 100% de la población es Norte. Los
enlaces glycosidicos están todos en conformación anti.
La conformación global del RNA se adapta muy bien a lo que conocemos como
conformación A. De hecho, la estructura del A-RNA es muy parecida a la del A-DNA,
con forma de doble hélice y apareamientos del tipo Watson-Crick. Disposición general
de la hélice, surcos,..., son idénticos a los que se tenían en el A-DNA. En condiciones de
alta fuerza iónica la forma A cambia a una formar denominada A’, esta es un hélice aún
más compacta que la hélice A, ya que tiene 12 pares de bases por vuelta de hélice.
El RNA aparece en general (in vivo) como una cadena sencilla, por lo que para
adoptar estructuras de doble cadena debe replegarse sobre el mismo y seleccionar el
trozo complementario que le de máxima estabilidad. Es por ello que en la estructura del
RNA encontramos hairpins, regiones hairpins alternados, bulges, internal loops y todo
tipo de estructuras anómalas (véase más adelante). El RNA tiene tendencia a formar
estructuras 3-D complejas, lo que le permite tener una serie de funcionalidades propias
de proteínas (p.ej el RNA ribosomal, RNA de transferencia o los ribozimas).
Figura 1. Estructura tipo A característica de un RNA.
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También señalar que se ha detectado la presencia de RNA en triples hélices, se
han descrito sobre todo en motivos pirimidina y parecen tener una estructura similar a
las de DNA, aunque aún no hay ninguna descripción a alta resolución de las mismas.
Una característica interesante que diferencia a nivel de estructura secundaria a
DNA y RNA es su flexibilidad. El DNA en la forma B es más flexible que el RNA o el
DNA en la forma B. Por ejemplo, lo que tenéis en la Figura 2 es un histograma de las
poblaciones de diversas conformaciones de propeller twist en estructuras de A-DNA
(izq), B-DNA (centro) y RNA y es evidente que los perfiles son más anchos para la
forma B que para A.
Figura 2. Representación en histograma de la población de propeller twist en estructuras
de A-DNA, B-DNA y RNA resueltas por rayos X y depositadas en PDB.
Lo mismo se ve cuando se realizan dinámicas moleculares de DNA y en RNA.
Esto lo podéis ver por ejemplo en las Figura 3 donde se han representado las
poblaciones de “inclination” y “twist” que eran visitadas por B-DNA y RNA en una
dinámica de 10 ns de d(GCGCAATTGCGC)2 y r(GCGCAAUUGCGC)2.
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Figura 3. Perfil de inclination (arriba) y twist (abajo) visitado durante MD para
RNA (gráfica de la izquierda) y DNA (derecha).
12.3
DUPLEX DNA-RNA
El DNA y el RNA pueden formar duplexes (una hélice DNA, otra de RNA).
Estas estructuras tienen una enorme importancia en la vida de la célula.
i) Se forman cuando la transcriptasa reversa forma DNA a partir de RNA.
ii) Cuando la RNA polimerasa forma RNAm a partir de DNA.
iii) Se forman durante la replicación de los primers en los fragmentos de Okazaki.
La estructura del híbrido DNA-RNA es la de una doble hélice con las
características generales de un A-RNA, o del A’-RNA. Típicamente se detectan 11-12
pares de bases por vuelta de hélice. Parece que no todos los azucares se encuentran en
conformación N, sino que al menos una parte de las deoxyribosas de la cadena de DNA
se encuentran en conformación S o E. Los complejos DNA-RNA son muy estables, de
hecho más estables incluso que los DNA-RNA Esta gran estabilidad también se intenta
aprovechar con fines terapeúticos en estrategías de RNA-antisense. La idea aquí es
similar a la comentada más arriba para los antigene, pero ahora atacando directamente
el RNAm. De hecho, la estrategia antisense saca ventaja de la existencia de un enzima
la H-RNAase que degrada los híbridos DNA·RNA, rompiendo la cadena de RNA, pero
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no la de DNA. Este enzima protege a la célula de la formación de complejos no
productivos de RNA y resulta muy útil en terapia antisense porque degradaría el RNAm
diana manteniendo el DNA foráneo que hemos añadido, lo que produciría que este
DNA actuara como catalizador de la degradación.
La pega de todas estas estrategias “antisense” son varias, y muchas de ellas
comunes con las estrategias anti-sense. Primero, no es fácil que el fragmento de DNA
pase la membrana; segundo: el DNA se degrada con facilidad dentro de la célula;
tercero no es siempre fácil seleccionar el trozo de RNA(m) diana del híbrido; por último
no es simple hacer estable en sangre el RNA. Existe en la actualidad un enorme
esfuerzo tendente a generar RNA resistentes, y con mejor biodisponibilidad para ello se
modifican los extremos 5’ y 3’ (punto de ataque de muchas nucleasas), y también se
intenta crear RNA donde los fosfatos se sustituyen por otros grupos. Paralelamente se
está trabajando mucho en el desarrollo de métodos teóricos de predicción de estructura
secundaria del RNA que nos permitan determinar la mejor región para formación del
híbrido.
Las estrategias antisentido se han visto reforzadas claramente por el
descubrimiento de la maquinaria de procesamiento de los RNAi, que se aprovecha para
silenciar RNAs patógenos por incorporación a la célula de fragmentos de RNA doble
cadena complementario en una de sus dos cadenas a la secuencia diana del RNA a
inhibir. Este RNA(d) es reconocido por sistemas proteicos (RISC fundamentalmente)
que separa las 2 cadenas usando una de moled para reconocer y degradar la cadena de
RNA diana. Los problemas de RNAi son similares a los de los métodos anti-sense más
tradicionales.
12.4
CARACTERÍSTICAS DE LA ESTRUCTURA TERCIARIA DEL RNA
El RNA intenta siempre que puede recuperar una estructura dúplex donde se formen el
máximo de puentes de hidrógeno pero al ser cadena sencilla esto conduce a: i)
formación de puentes de hidrógeno e interacciones no canónicas, algunas de ellas muy
estables y ii) abundancia de motivos como loops, buldges,.., también algunos de ellos
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muy estables y conservados en diferentes RNAs. Esto da una estructura secundaria
compleja (Figura 4) que se repliega después en el espacio con gran especificidad. La
estructura terciaria del RNA es mucho más rica y compleja que la del DNA y en cierto
sentido recuerda a la de las proteínas.
Figura 4. Estructura secundaria del 165rRNA de E-Coli.
Leotis/Westhof fueron los primeros en racionalizar los tipos de contactos de puente de
hidrógeno de las bases que se clasifican según el lado del contacto: WatsonCrick/Hoogsteen/Sugar Edge (Figura 5), algunos de estos motivos implican que se
adopten conformaciones syn respecto al enlace glicosídico.
Los loops son muy prevalentes en las estructura terciarias del RNA y suelen estar
conservados. Son regiones flexibles, pero en función de su conformación mayoritaria se
clasifican según la longitud del loop y según si las bases no apareadas se mantienen
stackeadas (stacked-in) respecto a la doble cadena o salen hacia el exterior (looped-out).
En algunas ocasiones (por ejemplo comúnmente en tRNAs) se produce la interacción de
loops que disponen bases proyectadas hacia el exterior y que permiten la formación de
motivos conservados como los “kissing loops” (Figura 6).
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Figura 5. Clasificación de Leontis/Westhof de
los apareamientos entre pares de bases que se
ven en el DNA (extraído de “A.Liljas et al.,
Textbook
of
structural
Biology;
Wold
Scientific 2010”
Figura 6. Loops comunes en RNA. De
izquierda a derecha tri, tetra y penta-loops.
De arriba abajo conformaciones stacked-in o
looped-out. La última figura representa una
estructura esquemática de un kissing-loops
motif.
Al ir analizando (de una manera similar a como se hizo hace tiempo con las proteínas)
las estructruras de RNAs se ha encontrado la aparición de algunos motivos que son
recurrentes, estables y conservados.
Por ejemplos los tetraloops son muy prevalentes, especialmente los GNRA (N: purina
cualquiera R: pirimidina y A cualquier base) y en menor medida los ANYA y los
UNCG. También son comunes los internal loops y bulges, que suelen ser puntos que
sirven para pivotar movimientos de cuerpo rígido de stems (el bulge sería como el codo
en un brazo). Las junctions son también abundantes, especialmente las de 3-way, asi
como los pseudoknots y una estructura llamada K-turn que implica un cambio muy
brusco en la estructura y que está muy conservada en, por ejemplo, RNA ribosomales.
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RNA DE TRANSFERENCIA
Es uno de los RNA in vivo de los que se conoce su estructura secundaria y
terciaria. Existen numerosos tRNA lógico si pensamos en los aminoácidos diferentes
que estos tienen que transportar. No obstante, todos ellos tienen una estructura general
común que es lo que explica que puedan integrarse en un proceso común: la síntesis de
proteínas.
Estructura Secundaria
En la actualidad se habla de familias de tRNA todas ellas son en general similares, con
pequeñas diferencias en algunas zonas. La forma general se ha asimilado a una hoja de
trébol. En él distinguimos:

El aceptor stem (tallo). Tiene 7 pares de bases y termina en el sitio de unión
del aminoácido que es SIEMPRE el triplete 5’-CCA-3’ donde el extremo 3’
(A) esta con el 3OH’ sin fosforilar (donde se unirá el aminoácido).

El T-stem de 5 pares de bases que termina en el T-loop.

El “extra loop” o “variable loop” que es un fragmento muy variable de un
RNA(t) a otro, varia en longitud (de 3 a 21 nucleótidos) y composición.

El “D-stem” tiene entre 3 y 5 pares de bases y termina en el “D-loop” que
tiene una longitud variable de 7 a 11 nucleótidos.

Finalmente el “anticodon stem” tiene 5 pares de bases y acaba siempre en el
anticodon loop donde están las 3 bases del codón que reconocen al triplete
(codón) de bases del RNA(m).
Figura 7. Estructura del RNA(t)
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Algunas características son comunes a los diferentes tRNA como es la estructura
secundaria común o la presencia de bases no codificantes como pseudouridina o
dihydrouridina, lysidina, inosina,... También el tamaño es relativamente constante (entre
74 y 95), lo que contrasta con el resto de los ácidos nucleicos. Son comunes en los
diferentes tRNA la lóngitud del tallo aceptor y anticodón, y gran parte de la secuencia
del loop T (también llamando pseudoruidine loop). Otros detalles tales como el tamaño
del D stem (dihydrouridine stem), el tamaño del loop estra, y la composición concreta
del dehydrouridine loop varían de una familia a otra. La diferencia de tamaño entre
diferentes RNAs se debe a los nucleótidos extras en el D-loop y stem, así como en el
extra loop.
Todos los tRNA tienen una serie de nucleótidos comunes. Así, todos tienen en
el extremo 3’ la secuencia ----CCA sin fosfato en el extremo (3’). El hidroxilo no
esterificado del extremo 3’ será el que se une a un aminoácido. Destacar, que aparte de
estos existen otros nucleótidos constantes, sobre todo los vitales para mantener la
estructura terciaria del RNA muy definida.
Por último comentar que el RNA(t), al igual que los RNA(m) se procesa
eliminándose fragmentos de cadena (splicing) y produciéndose otras modificaciones.
Por ejemplo, el extremo CCA solo se inserta después del procesado del RMA(t), antes
era UU. Es decir que los RNA(t) tal como hemos descritos son RNA(t) maduros, justo
los que hacen su función biológica.
Estructura terciaria del tRNA
El tRNA se repliega en el espacio dando una estructura terciaria en forma de L, que es
estabilizada por interacciones de stacking entre las bases, interacciones de van der
Waals, y puentes de hidrógeno, básicamente del tipo Hoogsteen. Nota: estos puentes de
hidrógeno son entre zonas alejadas de la cadena, no confundirlos con los A:U, o G:C
que son de tipo Watson-Crick, y que son los que forman la estructura secundaria. De
hecho, el RNA(t) tiene una enorme cantidad de pares no canónicos (véase Figura 8).
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Señalar finalmente que interacciones de grupos fosfatos y de grupos 2-OH’ parecen
colaborar también a la estabilización, p.ej. con interacciones del tipo 2-OH’---N(Ade).
Figura 8. Esquemas de algunas de las interacciones existentes en RNA(t).
Como consecuencia de todo el conjunto de interacciones comentado el tRNA
adopta una estructura terciaria muy compacta y estable, pero con un grado de
flexibilidad y de variabilidad conformacional dependiente de la secuencia, que es la que
le posibilidad de ejercer las diversas funciones biológicas (recordar que cada Aa se
reconoce por un tRNA diferente).
12.5
INTERACCIONES CODON-ANTICODON
EL tRNA debe “cargar” un
aminoácido
que
es
el
que
se
corresponde con su codón. Existen 20
aminoácidos, y entre 60 y 70 tRNA,
luego existirán varios tRNA que llevan
el
mismo
degeneración
aminoácido
del
código
dada
genético
(véase Figura 9: El código genético
usual a la derecha del texto)
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La reacción de adición de un aminoácido a un tRNA se realiza por medio de la
acilación en el extremo 3’ (el CCA-OH). Esta reacción esta catalizada por la aminoacil
acil transferasas. Existen unas 20 diferentes amonoacil acil transferasas, tantas como
diferentes aminoácidos. Estos enzimas cuentan con al menos 2 dominios, uno “lee” el
anticodon y el otro el aminoácido. Tienen que ser muy específicos en cargar el Aa
porque sino el error puede ser muy grave y pensad que no es trivial distinguir un
aminoácido de otro (pensar por ejemplo en Leu, Ile, Val.,...). Por eso estos enzimas
tienen un mecanismo de doble lectura. Por ejemplo en la primera lectura miran que el
residuo no sea más grande de la cuenta, y en la segunda que no sea más pequeño. El
caso es que consiguen un nivel de fiabilidad muy elevada.
El mecanismo de acilación sugerido para el enzima se muestra en la Figura 8 y consta
de: i) reacción con ATP, ii) El aminoácido activado por el ATP interacciona con el OH
libre en el extremo 3’ de la adenosina final del tRNA.
Figura 10. Esquema de la unión de un aminoácido al RNA(t).
Una vez tenemos cargado el tRNA con el aminoácido que corresponde, el tRNA
debe ser capaz de reconocer el triplete de bases del RNam (codon). Como ya sabéis eso
se realiza dentro del complejo sistema del ribosoma y será un tema. Básicamente la
idea es de ir poniendo el nuevo RNA(t) cargado en contacto con el péptido que se esta
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sintetizando. Eso facilitará la formación del enlace peptídico y la liberación del RNA
descargado. El proceso seguirá hasta que llegue un codon de finalización UAA, UAG y
UGA que no tiene RNA(t) cargado y eso producirá la liberación del péptido y la
disociación del polisoma.
Figura 11. Esquema de la síntesis de proteínas en un ribosoma.
El reconocimiento codón-anticodón (3 bases mRNA con 3 bases del tRNA) se
da por medio de puentes de hidrógeno diferentes. Los 2 primeros nucleótidos forman
interacciones muy específicas tipo Watson-Crick. El apareamiento del tercer nucleótido
es más flexible y no siempre es Watson-Crick. Además es posible que el tercer
nucleótido del codon llegue a aparearse con un nucleótido que no es complementario.
Esto es totalmente coherente con el caracter del código genético, donde existen diversos
codones que codifican para el mismo aminoácido.
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12.6
EL RIBOSOMA
Es un ejemplo paradigmático de estructura cuaternaria formado por un gran
número de structuras complejas de RNAs (los RNA ribosómicos) de estructura muy
definida y muy conservados y unas proteínas que hacen como de nexo de unión entre
ellos. El ribosoma es la máquina de producción de proteínas y se encarga de a partir de
la información del RNAm sintetizar la cadena de polipétidos. El ribosoma es
posiblemente una estructura muy antigua propia de un mundo basado en el RNA.
Encontramos ribosomas en todos los organismos tanto procariotas como eucariotas, y
también en orgánulos específicos caso de las mitocondrias y los cloroplastos. Cada uno
de estos ribosomas es diferente.
Ribosomas procariotas. Tiene una masa de unos 2500 kD: Tienen dos subunidades,
conocidas por sus coeficientes de sedimentacion:
i) Subunidad grande (50S). Esta formada por 2 RNA ribosomales y 34 proteínas
básicas que estabilizan la estructura.
ii) Subunidad pequeña (30S). Formada por un solo tipo de RNA ribosomal y 21
proteínas.
Ribosomas eucariotas. Son mas grandes (unos 4200 kD), tienen también dos
subunidades:
i) Subunidad grande (60S). Esta formada por 3 RNA ribosomales y 49 proteínas
básicas que estabilizan la estructura.
ii) Subunidad pequeña (40S). Est formada por 1 RNA ribosomal y 33 proteínas.
Los ribosomas mas conocidos son los procariotas. Se describieron en baja resolución pr
microscopia electrónica y recientemente por cristalofgrafia de rayos X, el primero en
resolverse por técnicas de cristalografía fue el de
Archea (2000) y unos años después (2005) el de
E.Coli.
Los
primeros
trabajos
fueron
merecedores del premio Nobel de Química 2009.
La Figura 12 a la izquierda representa la
estructura tridimensional del RNA procariota.
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El ribosoma procariota es una partícula de unos 200 Angstroms de diametro con una
composicion de 65% RNA y 35% proteinas. El ribosoma eucariota es claramente mayor
y tiene una proporcion mayor de proteínas. Toda la parte relacionada con el
reconocimiento de RNAm es debido a los rRNA y se piensa que las proteínas de hecho
solo tienen un papel estructural y de interacción no específica con los RNAt. Los
largísimos
Rna
ribosomales
formas
diferentes
dominios
que
se
mueven
independientemente durante pasos del proceso de síntesis de péptidos. Se situan
definiendo el core de la estructura mientras que las proteínas on mas pequeñas y
periféricas.
Figura 13. Estructura de la subunidad pequema (izquierda) y grande (derecha) del
ribosoma procariota.
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