3 - Roderic

UNIVERSITAT DE VALENCIA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA ANALITICA
ESTUDIÓ Y APLICACIONES ANALITICAS DE LAS
REACCIONES DE
LA
CISTINA,
CISTEINA
Y
N-ACETIL-L-CISTEINA CON EL O-FTALDEHIDO
MEMORIA que para optar al
de Doctor en
Ciencias
grado
Químicas,
presenta la Licenciada
MARIA JOSE MEDINA HERNANDEZ
V a l e n c i a , Diciembre de 1988
UMI Number: U603124
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UMI U603124
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789 East Eisenhower Parkway
P.O. Box 1346
Ann Arbor, MI 48106-1346
ts
{l
A Salva
A mis padres
y hermana
VALENCIA
Una Tesis
c o n junto y
han
un esfuerzo
colaborado
común,
no sólo
fin , sino
que también
una tarea
agradable.
Doctoral es el fruto de un trabajo
son
muchas
las personas que
en que esta Tesis haya llegado a su
han contribuido a que ésta haya sido
A
todos
vosotros
quiero
daros
las
gra cias .
A la profesora D ñ a . María Celia García AlvarezCoque por la dirección,
supervisión del trabajo experimental
y colaboración en la redacción de esta Memoria y en especial
por crear un ambiente cordial de ayuda y confianza.
Al profesor D. Carlos Mongay Fernández por sus
orientaciones y
acertados consejos
este trabajo y por la
para la
consecución de
supervisión de esta Memoria;
así como
por su afabilidad.
A la profesora Dña.
por su
amistad,
su
Rosa María Villanueva Camenas
incondicional colaboración y la ilusión
pues ta en que esta Tesis sea una realidad.
Al profesor
confianza y apoyo,
por su
Ramis Ramos por su
así como al equipo del Laboratorio 3.
A los
Analítica y
D. Guillermo
% %
'miembros del
en especial
a mis
Departamento de
Química
compañeros del Tercer Ciclo
ánimo y alegre compañía que han hecho más grata la a
veces dura tarea de investigar.
Especialmente a mi marido Salvador
por su animo y
comprensión
sino
también
Sagrado
por
sus
no
solo
consejos
prácticos así como por su contribución a esta Tesis.
A mis padres por el estímulo y aliento que siempre me
han
prestado y a mi hermana,
por la eficaz
aportación
en
la
parte Bioquímica.
A D. Luis Medina Castro y D. Salvador
por
Sagrado
Soler
su colaboración en la confección, montaje y retoque
de las
figuras y el cariño que han puesto en este Trabajo.
A mi amigo Antonio Sánchez por su colaboración en
la
utilización del programa de cálculo del método de optimización
s i m pl e x .
A mis amigos y en especial a José
y
Gemma
por
su
apoyo a lo largo de estos años de trabajo.
Quiero
agradecer
por
ultimo,
a
la
' Generalitat
Valenciana la concesión de una beca de investigación
realización de esta Tesis.
para
la
UNIVERSITAT D E VALENCIA
,
|
|
FACULTAD DE QUIMICAS
Departamento de Química Analítica
Doctor Moliner, 50
Teléfono (96) 363 0011
BURJASOT (VALENCIA)
D.FRANCISCO
Departamento
BOSCH
de
REIG,
Catedrático
Química
Analítica
y
de
Director
la
del
Universidad
de
Va le n c i a ,
CERTIFICA:
Que la Licenciada en Ciencias Químicas Dña. MARIA
JOSE MEDINA HERNANDEZ ha realizado el trabajo
investigación titulado
analíticas
de
cisteína
y
o-ftald ehi do" ,
las
"Estudio
reacciones
y
aplicaciones
de
la
cistina,
N-acetil-L-cisteína
conducente
a
la
de
con
el
obtención
Grado de Doctor en Ciencias Químicas,
y
sido dirigido por los profesores D.Carlos
que
del
ha
Mongay
Fernandez y Dña María Celia Garcia A l va re z-C oq ue.
Y para que conste a los efectos oportunos,'
firmo
la
presente
en
Valencia
a
quince
Diciembre de mil novecientos ochenta y ocho.
de
ÜNIVERSITAT DE VALENCIA
FACULTAD DE QUIMICAS
Departamento de Química Analítica
Doctor Moliner, 50
Teléfono (96) 363 00 11
BURJASOT (VALENCIA)
CARLOS MONGAY FERNANDEZ,
Catedrático
ALVA RE Z-C OQU E, Profesora Titular,
,
MARIA
CELIA
GARCIA
adscritos al Departamento de
Química Analítica de la Universidad de Valencia,
CERTIFICAN:
Que la presente Memoria "Estudio
analíticas
de
las
reacciones
y
aplicaciones
de
la
cistina,
cisteína y N-aceti 1-L-cisteína con el o-ftaldehido"
constituye la Tesis Doctoral
de
Dña.
MARIA
JOSE
MEDINA HERNANDEZ.
Asimismo certifican haber dirigido
y
supervisado
tanto los diferentes aspectos del trabajo como
la
redacción de la presente Memoria.
Y para que
así
conste,
firman
la
Valencia a quince de Diciembre de mil
presente
en
*
novecientos
ochenta y ocho.
f
I N
D
I C
E
Pag.
I.- INTRODUCCION.......................................................
1
1.1.- DERIVATIZACION DE AMINOACIDOS CON O-F TA LD EH ID O ...........
3
1.1.1.- Aspectos generales
1.1.2.- Mecanismo de
................................
3
formación de los isoin dol es .......
6
1.1.3.- Estabilidad de los isoind ole s ...................
11
1.1.4.- Mecanismo de de gr ad ac ió n .........................
15
1.1.5.- Cinética de formación y desc omp osi ci ón .........
25
1.2.- FACTORES ESTRUCTURALES QUE AFECTAN A LA ESTABILIDAD
DE LOS ISOINDOLES ............................................
31
1.2.1.- Efecto de la estructura de la
amina
sobre
la est abi li dad .....................................
31
1.2.2.~ Efecto de la estructura del tiol
sobre
la
es tab il i da d ........................................
37
1.2.3.- Utilización de sustitutos de o - f ta ld eh id o ......
42
I .3 .- DETERMINACION DE LISINA, AMINAS SECUNDARIAS, CISTINA
Y CISTEINA CON O- FT AL DE H ID O ................................
46
1.3.1.- Determinación de lisina y aminas secundarias....
46
1.3.2.- Determinación de cistina y c i s t e í n a ..............
48
I.4.- D ETECCION ESPECTROFOTOMETRICA DE LOS IS OI NDOLES.........
58
II.- OBJETIVOS
61
Pag^ 111-. - PARTE EX PE RI M E N T AL .............................................
111 .1. - REACTIVOS Y A P A R A T O S ......................................
-
v III-2.- ESTUDIOS
SOBRE
LA
FORMACION DE UN
PRODUCTO
FLUORESCENTES POR REACCION DE
LA
CISTEINA
CON
O-FTALDEHIDO.............
67
69 '
72
III. 2.1.- INTRODUCCION ..................... ...............
74
111.2.2.- ESPECTROS DE EXCITACION Y E M I S I O N . . ...........
74
111.2.3.- OPTIMIZACION
DE
LAS
CONDICIONES
EX PE RI MEN TAL ES ..................................
1.- Efecto de
la
temperatura
sobre
la
formación del d e r i v a d o .....................
2.- Influencia de la acidez del m e d i o ........
3.- Influencia
de
la
concentración
de
o- f t a l d eh id o ................................
77
77
80
82
111.2.4.- DETERMINACION DE
LA
ESTEQUIOMETRIA
DEL
PRODUCTO DE REACCION DE
LA
CISTEINA CON
O - FT AL DE HI DO ........
84
111.2.5.- PARAMETROS ANALITICOS SI GN IF ICA TIV OS ..........
1.- Curva de ca l i b r a d o .........................
2.- R e p et it i vi da d ...............................
89
89
91
111.2.6.- REACCION DE LA CISTINA CON O - FT AL DE HI DO ........
92
II 1.2.7.- REACTIVIDAD DE OTROS AMINOACIDOS CON
O - F T A L DE H I DO .....................................
1.- Ausencia de t i o l ...........................
2.- Presencia de ci st e í n a ......................
95
95
97
III. 3.- DETERMINACION DE CISTINA CON O - FT AL DE HI DO ............
102
III. 3.1.- INTRODUCCION ...................................
104
II1.3.2.- REACCION DE LA CÍSTINA CON O-FTALDEHIDO Y
M ER CA PTO ET ANO L .................................
105
Pag.
II1.3.3.- REACCION DE LA CISTINA
CON
O-FTALDEHIDO
EN AUSENCIA DE ME RC AP TOE TAN OL ................
1.- Espectros de a bs or c i ón ...................
2.- Optimización
de
las
condiciones
exp er imentales .............................
a) Estabilidad del compuesto
formado
en medio bór ico -b or ato ................
b) Influencia de la concentración
de
o- fta l de hi d o ...........................
c) Influencia del p H .....................
d) Efecto de la adición de á c i d o ........
110
110
114
114
116
118
120
3.- Parámetros analíticos significativos.... 124
a) Curvas de ca li b r a d o . ................
125
b) Límitesde detección y determinación.. 130
c) R ep et i tiv id ad .............. ... ........ 132
4.- Estudio de int erferencias ................ 133
5.- Análisis de cistina , en
un preparado
far ma céutico.................. ............
140
6.- Estructura del producto der e a c c i ó n
142
a) Reacción
de
la
cisteína
con
o- ft ald ehi do ...........................
142
b) Determinación de laestequi ome trí a... 146
c) Carácter ácido-base
del
producto
de r e a c c i ó n ............................. 148
d) D is c u s i ó n ...................
♦••• 159
III.4.- UTILIZACION DE N-ACETIL-L-CISTEINA
EN
LA
DETERMINACION DE AMINOACIDOS CON O- FT AL DEH IDO ... 161
III. 4.1.- INTRODUCCION....................................
111.4.2.- OPTIMIZACION
DE
LAS
CONDICIONES
EXPER IM E N T A L E S .................................
1.- Espectro de absorción
y
estabilidad
de
los
isoindoles
derivados
de
N-acet il -L-cisteína.......................
2.- Influencia del p H ..................
3.- Influencia de
la
concentración
de
o- ft al deh id o ...............................
4.- Influencia de
la
concentración
de
N- ace ti 1-L-cisteína.......................
11 1 .4.3.- ABSORTIVIDADES MOLARES DE LOS
DERIVADOS
DE LOS
AMINOACIDOS
CON
O-FTALDEHIDO
Y
N-A CE TI L-L-CISTEINA ...........................
163
164
164
166
168
171
173
Pag.
111.4.4.- ESTUDIO CINETICO
DE
LA
FORMACION
Y
DEGRADACION DE LOS ISOIN DO LE S ................
1.- Int roducción
,......
2.- Método de G u g g e n h e i m ......................
3.- Formación de los is oin dol es ..............
4.- Degradación de los is oin dol es ...........
5.- Factores estructurales que afectan a
la estabilidad de los isoind ole s ........
111.4.5.- INFLUENCIA
DE
LA
CONCENTRACION
DE
O-FTALDEHIDO Y TIOL SOBRE LA FORMACION Y
ESTABILIDAD DE LOS IS OI NDOLES ................
III.5.- DETERMINACION DE CISTINA CON O-FTALDEHIDO
N-ACETIL-L-CISTEINA.. . ............
177
177
178
181
190
192
198
Y
III.5.1.- OPTIMIZACION
DE
LAS
CONDICIONES
E XP ER IME NT ALE S .................................
1.- Espectros de a b s o r ci ón ...................
2.- Influencia del p H ..........
3.- Influencia de la
concentración
del
reactivo
o-ftaldehido-N-acetil-Lc is t e í n a ...................................
207
209
209
213
215
II 1.5. 2.- ESTRUCTURA DEL PRODUCTO DE R E A C C I O N .........
1.- Determinación de la es te quiometría ......
2.- Acidificación
del
producto
de
re ac c i ó n ....................................
3.- Fluorescencia del producto de
r ea cc ió n ....................................
219
219
II 1.5. 3-
PARAMETROS ANALITICOS SI GN IF ICA TIV OS ........
1.- Curva de c a l i b r ad o .........
2.- Límites
de detección y
determinación..
3.- R ep et it i vi da d ..............................
4.- D i s c u s i ó n ..................................
228
228
230
231
232
III.6.- DETERMINACION DE PROTEINAS
CON O-FTALDEHIDO Y
N-A CE TI L-L-CISTEINA .....................................
233
III. 6.1.-
INT RODUCCION ..................................
1.- Análisis
de
péptidos
y
proteínas
in ta ct a s ...................................
2.- Análisis
de
péptidos
y
proteínas
hi d r o l iz a da s ...............................
221
225
235
235
237
Pag.
II1.6.2.- UTILIZACION DEL
REACTIVO
O-FTALDEHIDON-ACETI L- L-C IST EI NA ...........................
1 .- Procedimiento de hid ró li si s ..............
2.- Recuperación de
algunos
aminoácidos
sometidos al tratamiento de hidrólisis..
3.- Cálculo del peso molecular promedio y
factores de c or re cc ió n ...................
238
239
240
242
II 1.6. 3.- APLICACION DEL M E T O D O ......................... 245
1.- Análisis de mezclas dea m i n o á c i d o s
245
2.- Determinación de N-amínico en suero y
o r i n a ..................................... . 247
3.- Análisis
de
p r o t e í n a s .................. 255
a) Sensibilidad y recupe rac ión .......... 255
b) Límites de detección y
determina­
c i ó n ..................................... 259
c) R ep ro du cib il id ad ....................... 260
4.- Generalización del m é t o d o ................ 261
5.- Análisis
de
aminoácidos
libres
en
proteínas parcialmente hi d r o l i z a d a s
264
a) Estimación
de
la
absortividad
molar del derivado de una proteína
i nt act a ................................. 265
b) Determinación
del
contenido
en
aminoácidos
libres
en
caseína
268
parcialmente hid rol iz ad a. ............
III.7.- DETERMINACION DE N-ACETIL-L-CISTEINA EN FARMACOS
CON O-FTALDEHIDO E I SOL EUC IN A .........................
273
III. 7.1.- IMPORTANCIA F AR MA CO LO GI CA ......*..............
275
II 1.7. 2.- METODOS DE A N A L I S I S ...........................
1.- Oxidación del grupo t i o l .................
2.- Formación de mercapturos m e t á l i c o s ......
3.— Reacciones con compuestos cr om óf or os ....
276
277
280
284
II 1.7. 3.- ENSAYOS P R E V I O S ................................
1.- Elección de la a m i n a ......................
2.- Absorbancia del b l a n c o ...................
3.- Estabilidad de las di so luc ion es .........
286
286
291
293
II1.7.4.- OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES EXPERIMEN­
TALES.
1.- Influencia de la concentración de
o -f ta ld ehi do ...............................
2.- Influencia de la concentración de
is oleucina .................................
295
295
297
Pag.
111.7.5.- PARAMETROS ANALITICOS SIG NIF IC AT IV OS ........ 299
1.- Curva de ca l i b r a d o ........................ 300
2.- Límites de detección y determinación.... 300
3.- R e p et it i v id ad .............................. 303
111.7.6.- ANALISIS
DE
N-ACETIL-L-CISTEINA
EN
DIVERSOS F A R M A C O S ..............................
1.- Descripción y preparación de las
disoluciones de los f á r m a c o s ............
2.- Utilización de métodos com pa ra ti vo s
a) Método del tet rationato ...............
b) Determinación
colorimetrica
de
N-aceti1-L-cisteína con Fe(III)
y
1,10-f en an tro lin a ......................
3.- Determinación de N-acetil-L-cisteína
con o-ftaldehido e is ole uci na ...........
304
304
307
307
310
313
IV. - CO N CL US IO NE S ....................................................
317
V.- BIBLIOGRAFIA
337
INDICE DE ABREVIATURAS
ABA
o-acetilbenzaldehido
ACV
<T- (L-Ctf-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina
DSS
dodecil sulfato sádico
ET
etanotiol
ME
mercaptoetanol
MP
3-mercapto-l-propanol
MPA
ácido 3-mercaptopropionico
NAC
N-acetil-L-cisteína
NDA
2,3-naftalendicarboxialdehido
OBB
o-benzoilbenzaldehido
OPA
o-ftaldehido
Aminoácidos proteicos primarios
ALA
Alanina
ARG
Arginina
ASP
Acido Aspartico
,NH
CII -CH
3 'c o 2h
HN
/NH2
'C-NH-(CH ) -CH
h2n
c o 2h
/
23 Y
(R= OH)
ILE
Isoleucina
LEU
Leucina
LYS
Lisina
MET
Metionina
PRO
Prolina
SER
Serina
TYR
Tirosina
/NH2
R-CO-CH -CH
x c o 2h
ASN
Asparagina
(R= NH2 )«
GLU
Acido Glutamico
(R= OH)
GLN
/NH2
y- R-CO-(CH )„-CH
¿
2 2 vco2h
Glutamina
(R= NH2 )
CYS
PHE
Cisteina
Fenilalanina
/NH
HS-CH -CH
VC0 H
/'
/
\'\-CH
/NH2
-CH
THR
Treonina
TRP
Triptofano
nco2h
/NH2
GLY
Glicina
c o 2h
HIS
Histidina
/NH
/ / N ^ - CH„-CH
/ 1
2 x c o 2h
VAL
Aminoácidos no proteicos
BABA
Acido B-aminon-butirico
, nh
CH -CH -CH -CO-H
Citrulina
NH2
OABA
BALA
H„N-CONH-(CH„) -CH
2
COgH
Acido jr-omino-
NH
n-butirico
ll_N-CH_-CH_-CH_-CO_H
NLE
Norleucina
CH -(CH ) - á
p-Alanina
H2N-CH2-CH2-C02H
NVA
Norvalina
CH3-(CH2 )¿-CH
2
2 2 2 2
2
NCO^H
,-NH
co2h
CYS
Cistlna
H2^
'NH?
CH-CH -S-S-CH -CH ¿
h o 2c/
2
2 n c o 2h
ORN
Ornitina
/NHo
H_N-(CH ) -CH 2
2
2 3 ^ c o 2h
jsto i o o a a o H
jljst
i
- 3 -
1.1.-
PERIVATIZACION DE AMINOACIDOS CON O-FTALDEHIDO
1 . 1. 1. -
Aspectos
Los
utilizados
reactivos
en
cromatografía
(7),
el
(OPA)
debido
de
la
fluorescamina
presenta
(8)
origina
una
rápidamente
compuestos fluorescentes
con
y
fluorescencia intrínseca y
no
se
(1),
el
formados,
(1),
el
cloruro
de
7 - f luoro-4-nitro-
serie
de
el
características
temperatura
aminoácidos,
descompone
origina productos secundarios fluorescentes.
alguna limitación,
mediante
el más popular es
a
los
ampliamente
ninhidrina
(9). De todos ellos,
que
más
aminoácidos
son
cloruro de dabsilo
a
favorables:
(HPLC)
(2-6),
1,2,3-benzoxadiazol
OPA
derivatizantes
análisis
líquida
o-ftaldehido
dansilo
generales
ambiente
no
presenta
fácilmente,
ni
Sin embargo posee
como es la inestabilidad de
los
productos
que se ve acelerada en presencia de un exceso de OPA
(2 ) (10-18).
En 1971, Roth (19)
formación casi
reacción
de
mercaptoetanol
0 = 0.33-0.47
instantánea
los
describió
de
aminoácidos
(ME) a pH 9.5
(10)).
por
productos
con
OPA
primera vez,
fluorescentes
en
( A e x = 340 nm ,
aminoácidos dieran lugar al
ocurre en
la reacción con la ninhidrina.
por
presencia
de
A e m = 455 nm
Roth consideró la posibilidad de que
distintos
la
mismo compuesto,
Sin embargo, el
de que los rendimientos cuánticos obtenidos difieran
de
,
los
como
hecho
unas
aminas a otras sugirió que no se producía el mismo fluoróforo.
- 4 -
Por otro lado,
en un principio se pensó que el
actuaba simplemente como
un
agente
reductor.
Sin
tiol
embargo,
Simons y Johnson (11) (20) demostraron que el tiol forma
del producto final.
Estos autores
cristalizaron
parte
un derivado,
haciendo reaccionar OPA y t-buti1-mercaptano con n-propilamina
en etanol del 95 %. Mediante
estudios de RMN,
IR y espectrometría
fluorescente precipitado,
isoindol
Al
cromatografía
mostraron
el
disolución acuosa,
pudo ser aislado.
similares,
masas
del
que
se
trataba
t-buti1-mercaptano
fina
y
producto
de
un
obtuvieron
en
(I).
por
ME
un derivado fuertemente fluorescente que no
Los mismos autores en
demostraron que
otros
compuestos con la misma estructura
espectros UV de los derivados
anillo isoindol.
capa
de
1-alquiltio-2-alqui1-sustituído
sustituir
de
estudios
tioles
(12-13).
y
posteriores
aminas
originan
El estudio de
(13) confirmó la
presencia
los
del
- 5 -
Para
fluorescentes,
reacción
poder
precipitar
y
aislar
los
isoindoles
Simons y Johnson utilizaron largos
tiempos
de
(15 m i n ) , tioles voluminosos y bajas temperaturas
de
cristalización
(0°C).
Sin
embargo,
estas
formación de los derivados son atípicas
condiciones
(en
las
de
condiciones
utilizadas en HPLC los isoindoles se forman en cortos períodos
de tiempo,
generalmente menos de 1 min,
a temperatura ambiente
o superior) y no puede suponerse a priori
que
los
productos
fluorescentes obtenidos en condiciones muy distintas sean
mismos.
Por ello
Simpson
y
col.
(21)
cromatografía de gases-espectrometría
analizaron
de
masas
los
mediante
(GC-MS)
los
extractos en cloruro de metileno de los derivados de
diversas
aminas primarias,
y
ME
o
Debido
a
la presencia del grupo hidroxilo en los derivados de OPA-ME
,
etanotiol
obtenidos*
por
reacción
con
OPA
(ET) a la salida de una columna de HPLC
fue necesario sililar el
para obtener
un
producto
concentrado
del
extracto
suficientemente
separación por GC. El estudio realizado
.
volátil
demostró
que
necesario el aislamiento del producto sólido para su
estructural y que la
estructura
fundamental
está presente en todos los derivados.
anhidro,
del
para
la
no
es
análisis
fluoróforo
- 6 -
I .1.2.-
Mecanismo de formación de los isoindoles
Simons y Johnson (13) propusieron
formación del isoindol
(I), en el
que
el
un
mecanismo
de
OPA
reacciona
en
primer lugar con el ME y a continuación con la amina
1). El esquema propuesto supone la
intermedia
(III),
seguida
de
protonacion
una
reacción
(Esquema
de
la
intramolecular
parcial del tipo Si»l para dar el isoindol protonádo
embargo,
la observación experimental de
que
obtiene preferentemente en medio alcalino,
favorable la formación del hemitioacetal
hace a este mecanismo poco probable.
normalmente
adición
transcurren
mediante
(22) y no a través
intramolecular
Finalmente,
como
la imina
la
de
una
sugerida
(IV)
el
(V).
Sin
isoindol
donde
se
sería
poco
(IV) o isoindol
(V),
Además,
sustitución sobre un carbono unido a dos
imina
las reacciones de
o
más
procesos
heteroátomos
de
eliminación-
sustitución
nucleofílica
por Simons
no es probable que
y
Johnson.
sea un nucleofilo
más fuerte que la amina primaria de la que proviene
A la vista de estas observaciones,
(24) propusieron otro mecanismo de reacción
(23).
Sternson
y
col.
(Esquema 2), en el
que se considera que las disoluciones acuosas de OPA se hallan
en equilibrio con una forma cíclica hidratada
(VI)
(25), y
presencia de un tiol originan una reacción reversible
lugar a un producto de
adición
experimentalmente la reacción de
cíclico
(VII)
derivatizacion
(13).
se
que
en
da
Aunque
lleva
cabo mezclando en primer lugar el OPA con el tiol y añadiendo
a
- 7 -
S-R’
OH
R’-SH
0
OPA
H
c h = n- r
W i/ ^ C H = N - R
III
IV
S-R'
1
H.S-R’
V
«ferpiftma 1
- 8 -
a continuación la amina, no cabe esperar que los productos
adición VI o VII sean reactivos frente a una
Sin embargo,
araiña
se
deshidrata
altamente reactiva
atacada
por
para
producir
el
anión
intramolecular de la
carbonilo
una
(IX). Esta ultima,
(X).
amina
El
cierra
fluorescente
se
nucleofílico
sobre
el
formando
deshidrata
un
para
S -R ’
R’-S H
U C ,
un
(I).
H20
° —
formando
anillo,
(XI), que fácilmente
conducir al isoindol
protonada,
resultante
el
la
es rápidamente
ataque
secundaria
restante
producto intermedio
tiol,
la
(VIII),
imina
a su vez,
del
o^-alquilaminobencilsulfuro
grupo
primaria.
la amina primaria reaccionará rápidamente con
forma libre del OPA para formar una carbinolamina
cual
de
‘CHO —
r- n h 2
h
^
h
-o
h
í^
1v
A
CH0
—
VIII
V
U
L
^
n h
-r
un
‘CHO
—
V
U
U
^
n h
-
h
ii
O
IX
H S-R
:N-R
^
- H20
:N-R
XI
Esquema 2
OH
-r
- 9 -
Alternativamente,
bencil s ul fur o,
hemitioacetal
protonada
Johnson
anión
X,
(13);
tiol
formación
puede tener
(II)
(XII)
la
lugar
sin embargo
para
del
para formar la imina
propusieron
hemitioacetal
descompondría
y
reacción
Simons
este compuesto sería atacado por
formar el
(26-27) originando X,
como
c(-alquilamino-
por
con la amina primaria,
(Esquema 3)', tal
continuación se
del
la
(XIII),
rápidamente
reacción
en
continuaría
el
que
medio
y
a
básico
según
el
Esquema 2.
S -R ’
S -R ’
,
R~NH2^
^
T
II
^
h
_
S -R ’
R~S -
0
^
~ R ~.SH ^ x
c h « n h -r
XII
+
XIII
S -R ’
Esquema 3
La formación
XIII) y la
del
ctf-alquilaminobencilsulfuro
consiguiente
formación del
representan unos cambios
importantes con
dado por Simons y Johnson
anillo
(X-->XI— >1)
al
esquema
(13). El mecanismo está
de
acuerdo
condensación
similares,
como es la condensación de cisteína con formaldehido
la cual inicialmente se
forma
atacada
originando una
el
tiol,
evidencia más de la posibilidad
sobre la imina catiónica
degradación
del
etil
o
respecto
con los descritos para reacciones de
por
(X
(IX)
una imina
del
(28),
en
que
es
protonada
tiazolidina.
ataque
del
la proporciona el
anión
mecanismo
cx'-dimet ilaminobencilsulf uro
(XIV)
Otra
tiol
de
en
- 10 -
medio acuoso,
que origina una imina cationica
(XV)
[1]
(29).
La reacción inversa supone la adición del tiol a la imina.
Ph-CH^
S~C H
2 5
n
(c
h
PhCH = N (CH-)
J ¿
XV
Sternson y col.
mecanismo
benzoato
(24) comprobaron además
sustituyendo . el
(XVI),
OPA
por
de
tiocarbinolamina
que
el
intermedio
de
aldehídico,
(X) y que la ciclacion se inicia
el
ataque
que es de
final de deshidratación
la síntesis de 1-aril
benzofenonas
(XVII)
reacción
del grupo amino de la tiocarbinolamina sobre
OPA,
validez
en la condensación con la amina y tiol
la posibilidad
el
la
m e t i l - (o- for mil )-
obtención de un 1-alquiltio-2-alquilftalimidina
Con
[!]
3)2
XIV
del
* C-,H-S~
¿3
(29).
se
esperar
produciría
ocurra
el
sobre
[2]. La
indico
es
por
una
ataque
o-carbonilo.
un
fácilmente.
carbono
La
etapa
(XI — >1) ha sido también observada en
isoindoles
a
partir
de
o-aminometil
- 11 -
I .1.3.-
Estabilidad de los isoindoles
La detección de aminoácidos mediante HPLC
reacción con OPA
Las primeras aplicaciones
análisis de aminoácidos y de otras aminas
derivatización
post-columna
de
separación por cromatografía de
Sin embargo,
la
su
, constituye uno de los métodos más sensibles
para su determinación.
la
, tras
utilización
requiere la eliminación
los
este
completa
reactivos y de la fase móvil,
primarias
de
que
las
pueden
los
contribuir
de
una
(33). Además,
reactivo
(34-35).
actualmente el interés
dirigido
hacia
límites de detección,
análisis
de
mezcla de la fase móvil con el
pre-columna de los isoindoles
(30-32).
de
originan perdidas en la resolución y sensibilidad,
ha
su
impurezas
forma importante a la fluorescencia de fondo
se
al
tras
iónico
esquema
OPA
suponían
mismos
intercambio
de
del
(4-5)(33-36),
debido a la
Por
la
que
simplifica el sistema
se
ello,
formación
mejora
los
cromatográfico
y
reduce el tiempo de análisis.
Desafortunadamente,
como
hemos
isoindoles formados con el reactivo OPA-ME
especialmente los derivados
ornitina
de
glicina,
indicado,
no
son
tiempo de reacción,
estables,
alanina,
(5), por lo que se precisa un cuidadoso
siendo generalmente necesario
lisina
control
derivatizadas
pues
se
produce
muestras
una
rápida
de
y
del
automatizar
el instrumento para obterier una precisión aceptable.
lado, no es aconsejable guardar las
los
Por
otro
aminoácidos
pérdida
de
- 12 -
fluorescencia,
por lo que es preferible hacer
aminoácidos con OPA inmediatamente
separación
antes de
proceder
los
isoindoles
se
obtienen
concentraciones equimolares de todos
OPA y tiol)
o
cuando
existe
degradación
un
los
de
disminuye
contrario,
la adición de exceso de OPA
produce su rápida descomposición
Cooper y col.
a
partir
reactantes
exceso
velocidad
de
la
la
al
de
(amina,
amina,
la
Por
el
enormemente.
isoindol
formado,
(38-39).
(40) realizaron un estudio
utilizando
, en el que examinaron la estabilidad de los derivados en
dos condiciones distintas:
en primer
lugar,
manteniendo
derivados en la cámara de reacción (en presencia de un
de
a
(37).
Cuando
HPLC
reaccionar los
OPA,
relación
O P A :aminoácido
90:1)
durante
los
exceso
distintos
intervalos de tiempo antes de la inyección en la columna y
en
segundo lugar,
la
inyectando los derivados inmediatamente
columna y deteniendo el flujo de
disolvente
durante distintos intervalos de tiempo.
derivados dieron no solo respuestas
2
min
en
después,
En el primer caso,
fluorescentes
variables,
sino también mostraron distintos grados de estabilidad,
especialmente inestables los derivados de OPA-ME
ornitina
anteriores
y
lisina.
(5)(41).
Esta
observación
concuerda
los
de
siendo
glicina,
con
otras
- 13 -
Sin embargo,
utilizar
HPLC
con
algunos autores han
derivatización
especialmente cuando los
pre-columna
derivados
de
retenidos en la columna por menos de
respuestas
fluorescentes
los
30
comparables
inestables y los más estables.
observado
aminoácidos
min
,
para
se
los
Efectivamente,
glicina,
ácido
ornitina y lisina.
aspártico
fluorescencia
observado
y
Solo
glutámico,
significativa.
dentro
estables,
de
la
los
derivados
Cooper
El
aumento
columna
en la columna,
mayoría
ser
al estar inmovilizados
los
perdida
de
puede
col.
de
diácidos,
de
estabilidad
debido
eliminación del exceso del reactivo OPA-ME durante el
cromatográfico o a que,
y
la
aminoácidos
una
son
obtienen
incluyendo
mostraron
al
(6)(42-43),
(40) observaron que una vez dentro de la columna,
de los derivados de OPA-ME son
que
los
a
la
proceso
derivados
se retarde su descomposición.
Por otro lado,
en presencia de un exceso de
OPA, se
ha observado una disminución de la velocidad de degradación al
aumentar la concentración de diversos
tioles
(39)(44).
Esta
observación contradice otras anteriores que indicaban que
los
excesos de ME no tenían efecto sobre
los
derivados.
Sin embargo,
en uno
de
la
estos
estabilidad
estudios
variar la concentración de tiol no existía exceso de
de
(45),
al
OPA,
de
modo que se eliminaba la principal causa desestabi1izad ora . En
el segundo
(38),
de 1.5x10"*
M
aproximadamente
la máxima concentración de tiol examinada fue
y
la
un
utilizadas en (39).
de
orden
OPA,
de
1.5xl0~4
magnitud
M,
por
concentraciones
debajo
de
las
- 14 -
Se puede actuar de diversas formas para obtener
máxima
estabilidad
de
concentración de tiol,
del tiol. De ellas,
los
isoindoles:
controlar
la
la concentración de OPA o la estructura
la
influencia
relevante a altas concentraciones.
de
la
primera
Por otro lado,
una mínima cantidad de OPA parece la vía más
se ha visto anteriormente,
este reactivo,
una
la
necesidad
rápida y cuantitativa de los derivados
de
impone
estructura del tiol parece
lograr la estabilización.
Así,, finalmente,
ser
la
forma
uso
de
adecuada.
especialmente en muestras que contienen aminas
rango de concentraciones.
es
el
deben evitarse grandes
sin embargo,
solo
Según
excesos
una
formación
unos
en
de
límites,
un
amplio
la alteración de la
más
viable
para
- 15 -
I .1 .4 .- M e c a n i s mo d e d e e r r a d a c i o n
Simons y Johnson
degradación
de
los
N-alqui1ftalimidina
su formación:
degradación
(11) caracterizaron el producto
isoindoles
formados
ME
como
una
(XX), y propusieron dos posibles vías para
la hidrólisis acida del
se
con
de
ve
acelerada
a
pH
isoindol
ácidos)
(12)(15)
y . el
nucleofílico intramolecular del grupo hidroxilo
(Esquema 4).
:N-R
i
OH
0¿N
R*A
XVIII
0
¿
N'R
+
'ICH2CV
XX
Esquema 4
XIX -J
S>n
del
(la
ataque
ME
(13)
- 16 -
La intervención del grupo hidroxilo en
la
reacción
hecho
de
que ,
apoyada
de descomposición viene
por
el
velocidad de degradación de los derivados del ME es
debido probabl emente a
medio borato que en medio fosfato,
el borató
compleja
grupo
al
menor
hidroxilo
(15) .
Además,
derivados de ET son más estables que los de ME.
El producto de degradación propuesto
col.
fue también identificado por Stobaugh y
embargo,
según estos últimos autores,
el
por
Simons
col.
(38).
mecanismo
al aumentar la concentración
de
OPA,
ninguna razón obvia por la cual
el
es
OPA
que
Sin
propuesto
no explica la aceleración de la degradación de los
derivados de ME a productos no fluorescentes,
y
isoindoles
se
produce
decir,
no
existe
catalice
el
ataque
nucleofílico intramolecular mostrado en el Esquema 4.
Nakamura y
col.
desestabilizante del
OPA
(45)
propusieron
que
el
efecto
explicarse
por
un
ataque
podría
directo del OPA al anillo del
isoindol,
actuara como dienófilo
como
conduciría
a
[3]
productos
o
de
en
nucleófilo
degradación
identificado por Simons y Johnson (11).
(dieno)
y
el
derivado no fluorescente
Diels-Alder sobre
el
(XXI).
anillo
producen con dienófilos,
la N-fenilmaleimida
OPA
que
el
OPA
[4],
lo
que
distintos
En el primer caso
se produciría una reacción de Diels-Alder
fluoróforo
el
entre
(dienófilo)
Este
tipo
pirrol
de
el
para
[3]
isoindol
formar
un
de
reacciones
de
los
isoindoles
se
como el anhidrido maleico
(47-49).
del
(29)(46)
y
- 17 -
S-R
[3]
CÓ"
\
hc-
0
XXI
El segundo mecanismo propuesto por Nakamura
y
col.
[4] consiste en un ataque nucleofxlico de un grupo aldehido de
la molécula de
OPA
sobre
el
isoindol,
lo
que
también productos de condensación no fluorescentes
originaria
(XXII).
CHO
CHO
[4]
\
S-R
H
V
S-R
CHO
CHO
N-R
XXII
Stobaugh y col.
(38)
criticaron
ambos
mecanismos,
indicando que el OPA no puede actuar ni como dienófilo ni como
nucleófilo.
isoindol
Si
[3],
actuara
se
como
formaría
dienófilo
un
producto
respecto
en
el
al
anillo
cual
la
- 18 -
aromaticidad
del
OPA
se
perdería,
energéticamente poco favorable.
Por
aldehido del OPA poseen mas bien
lo
que
otro
un
es
lado,
carácter
indicó
deshidrata
en
gran
anteriormente
extensión
1,3-ftalandioles cíclicos cis y
grupos
nucleofílico
, la constante
de
aldehidos
(Esquema
para
trans
log K de protonación medio de 11.6
40°C en DaO
los
[4].
A diferencia de muchos otros
tal como se
proceso
electrofílico,
por lo que no es probable que efectúen un ataque
sobre el anillo isoindol
un
formar
2),
una
(VI), que
(I = 0.1,
hidratación
25°C)
aromáticos,
el
OPA
se
mezcla
de
exhiben
un
(25)
[5]. A
es de 3.99 ± 0.16
(25), así, aproximadamente el 80% del OPA existe en
su
forma
hidratada en disolución acuosa.
OH
CHO
CHO
‘
+
H -0
2
O
v
[5]
OH
VI
OH
conocida
habilidad
de
asistencia aquimérica
(50),
]os
en
t ioéteres
las
para
reacciones
de
junto con observaciones derivadas de
cinéticos,
llevaron a Stobaugh
mecanismo
de
catalizador
degradación
en
que
el
OPA
OH
OPA
:N-R
vía 2
XXIV
" H 2O
:N-R
V7
OH
N-R
OH
XXIII
H 20
Y7
H-0
N-R
XXV
N-R
XX
X IX
Esquema 5
estudios
proponer
(Esquema 5).
via
desplazamiento
diversos
38
el
proporcionar
actúa
un
como
- 20 -
En ausencia de exceso de OPA
(vía
(I) forma el ion 1-ciclopropilsulfonio
ataque por el agua y/o
ocurrir en las
hidróxido
posiciones
el
isoindol
sobre
metileno
1),
esta
del
ion
isoindol
(XXIII).
especie
El
puede
sulfonio
para
regenerar I o en el C-l del anillo isoindol para formar XX. En
presencia de exceso de OPA
(vía
2),
originar rápidamente el hemiacetal
el
isoindol
(XXIV)„
grupo ftalandiol para abandonar el anillo
La
(XXIV)
(I)
puede
capacidad
del
es mayor
que
la del hidroxilo en I, por lo que se facilita la formación del
ion sulfonio
(XXIII),
siendo así
mayor
ésta especie en el estado estacionario,
tanto,
la
y
concentración
aumentando
la velocidad de degradación del isoindol
La utilización
lugar de ME
de
de
por
lo
(MP),
en
(I).
3-mercapto-l-propanol
, aumenta la estabilidad de los derivados,
lo
que
se supone es debido a que la formación de un derivado sulfonio
de 4 miembros
Estas
(XXVI)
observaciones
Nakamura y col.
anillo isoindol,
(45),
es menos
descartan
favorable
el
cinéticamente
mecanismo
(38).
propuesto
en el cual el OPA ataca directamente
ya que si fuera así,
sería
la gran estabilización conseguida cuando se
por el MP.
O .
XXVI
difícil
sustituye
por
el
explicar
el
ME
- 21 -
Sin embargo,
col.
el
esquema de degradación de Stobaugh y
(38), del mismo modo
que el de Simons
solo es aplicable a los derivados de
ME).
para
Jacobs y col.
acelerar
y
Johnson
hidroxitioles
(como
(39) comprobaron que la capacidad
la
degradación
isoindoles
formados
con
hidroxilo,
por lo que
también
tioles
que
supusieron
se
no
que
(13),
del
presenta
contienen
todos
los
de
sugirieron,
dominada
un
exceso
de
OPA.
Estos
grupos
isoindoles
autores
que puesto que la química de los
por
las
sustituciones
OPA
con
deben descomponerse por medio del mismo proceso limitante,
presencia
el
además
isoindoles
electrofilicas
en
(51),
está
la
inestabilidad de los mismos se debe a una adición nucleofílica
del isoindol al OPA libre.
Sin
embargo,
no
propusieron
un
mecanismo definitivo.
Sternson y col.
(24)
indicaron que la
inestabilidad
de los isoindoles proviene principalmente de sus reacciones de
condensación y
reacciones
de
sólo
autooxidación
puede
tener
sustituidos en el nitrógeno.
su parte,
es
observada en
acelerada
diversos
en
(51).
lugar
El
con
primer
tipo
isoindoles
de
no
La degradación au to o x i d a t i v a , por
presencia
isoindoles
de
(51-56),
aire
y
ha
sido
siendo
un
caso
excepcional el de los isoindoles derivados de ME, en el que el
proceso de degradación no es oxidativo y tiene lugar,
se ha visto,
por un ataque hidrolítico en el C-l
(38).
como
ya
22
-
Stobaugh y col.
los
1
-(alq ui 1
degradación
1
(57-58)
-
observaron que
i o )- 2 -alqui 1 i soíndoles
autooxidativa,
de
productos de degradación
siendo
XXX,
una
(XXVII, XXVIII,
ftalimidina
mostrado en el Esquema
2
6
similar
otros
el
de
[6 ] (57),
componente
degradación
.
CH.CN/HjO
Según este mecanismo,
al oxígeno o a otro
radical
la
el
peroxi-isoindoil
O2
transferencia
(XXXIII).
da
para
(54),
formar
que
electrónica
lugar
proceso
(XXXII),
continuación de diversas formas
de un endoperóxido
XXX
presente
(52), que inicia un
radical reacciona con
[6
x x v i i i
XXIX
radical
a
XXIX y XXX)
mecanismo
XXVII
catiónico XXXI
una
e identificaron cuatro
tiosustituída,
m a y o r i t a r i o . Además propusieron el
general,
experimentan
manera
isoindoles no sustituidos en el azufre,
en
en
al
radical
cadena.
Este
un intermedio,
puede
reaccionar
incluyendo la
el
a
formación
-
23
-
S-R
:N-R
+
02
•N-R
+
o 2-
XXXI
S-R
+6
R
N-R
-R -S XXXII
XXXIII
XXVII
N-R
+
XXX
XXVIII
Esquema
El producto
de
6
degradación
no
(Esquema 7) puede obtenerse a partir de
radicales
-RS•
descrito en el
(producidos
Esquema
6
)
durante
con
mediante un proceso de sustitución
intermedio XXXIV.
pirróles
el
la
el
isoindol
homolitico
Este tipo de reacción
debido
a
la
reacción
proceso
se
(59-60) y cabe esperar que también
isoindoles,
oxidativo
contribución
del
los
degradado,
través
observa
tenga
de
oxidativo
no
a
(XXIX),
del
con
los
lugar
con
intermedio
- 24 -
estabilizado
reacción.
por
resonancia
que
se
produce
El efecto desestabilizador del OPA puede ser
a un ataque electrofílico en las posiciones 1 y 3
isoindol
durante
del
(61).
S-R*
+ R’- S
-H
H S-R’
XXXIV
Esquema 7
XXIX
la
debido
anillo
- 25 -
I .1.5.-
Cinética de formación y descomposición
Svedas
y
col.
espectrofotométrico
de
aminoácidos con el OPA,
consideraron
dos
(41)
la
realizaron
cinética
en presencia de
esquemas
de
A + B
> P
A + B
> D
B
reacción absorbentes
un
aminoácido,
ki la
Estos
basados
de
de
estudio
de
los
autores
en
los
(13):
[7]
> P
y
D
[8]
productos
de
(isoindoles l-alquil-2-tiosustituído y 1-
velocidad
de segundo orden,
descomposición,
.
P el producto final de
(una N-alquilftalimidina) (XX), no
constante
intermedio,
ME
C
hidroxi-2-sustit uí do , respectivamente),
descomposición
reacción
reacción
mecanismos propuestos por Simons y col.
donde A es el OPA,
de
un
primer
ka
de
formación
la
orden,
constante
y
ka
la
absorbente,
del
compuesto
velocidad
constante
de
de
velocidad de primer orden correspondiente a la conversión de C
a D.
- 26 -
Asimismo,
ecuaciones
[7] y [8]
se propusieron los siguientes sistemas
diferenciales,
(41)
correspondientes
a
los
de
esquemas
:
dx
= ki(a.-x)(b.-x)
dx
dt
= ki(a.-x)(b«-x)
dt
x = c + p + d
[9 ]
x = c + p
de
--dt
dp
[10]
= ki(a.-x)(b.-x)
- ksc
= ka(x-p)
dt
dp
= kad
dt
donde x es la fracción de OPA o de aminoácido implicada en
reacción,
ao y b. las concentraciones iniciales de
aminoácido y
t
el
tiempo.
Las
letras
OPA
minúsculas
la
y del
indican
concentraciones instantáneas de cada compuesto.
Los
autores
encontraron
correspondiente al esquema
sistema de ecuaciones
experimentales.
[8],
Se observo
las
1
del
que
y
D
que
la
era
absortividades
compuestos es comprensible,
posición
curva
obtenida por
además
absortividades molares de C
entre
la
teórica
integración
del
[10] concordaba mejor con los resultados
obtenía cuando se consideraba
similitud
que
anillo
el
mejor
ajuste
diferencia
entre
menor
10%
del
molares
de
las
.
estos
se
La
dos
puesto que las sustituciones en la
isoindol
afectan
propiedades espectrales de los compuestos
muy
(62).
poco
a
las
- 27 -
Posteriormente,
cinéticos
sobre
presencia
de
proponiendo
la
ME
el
Wong y col.
reacción
y
del
ácido
siguiente
(63) realizaron estudios
OPA
con
la
alanina
3-mercaptopropiónico
esquema
cinético,
mecanismo propuesto por Sternson y col.
en
(MPA),
basado
en
el
(24):
ki
ka
P ----------- > I
OPA + Alanina "sssrrsíSk-i
[11]
tiol
K
OPA + tiol
El reactivo OPA
=^
reacciona
con
C
la
[12]
alanina
compuesto intermedio P, que reacciona a
tiol
para
producir
Simultáneamente,
el
isoindol
formar
continuación
fluorescente
disociación es K . Cuando
deducida
[OPA]
aplicando
, cuya
<
constante
[tiol]
la
,
la
aproximación
el
con
(I)
el
[11].
el OPA reacciona reversiblemente con el
para formar el derivado C [12]
velocidad
para
tiol
aparente
de
ecuación
de
del
estado
estacionario a la especie P es:
k^[OPA]
[tiol]
[Ala]
d[P]/dt =
[13]
k ^ / kg + [tiol]
K + [tiol]
- 28 -
Mientras que en las condiciones normalmente utilizadas,
que
en las
la concentración de alanina es mucho menor que la de
OPA
y tiol se tiene:
d[P]/dt - k o£g [Ala]
[I4 ]
donde
_
k-[OPA]
k*
[tiol]
K
^-------------
[15]
k_l/ k2 + [tiol]
Al ajustar a la ecuación
k*ot»> obtenidos para
K + [tiol]
[15]
los
distintas
datos
experimentales
concentraciones
de
tiol
de
se
obtuvieron las constantes de la Tabla 2:
Tabla 2. - Constantes de formación de los isoindoles derivados
de la alanina con el reactivo OPA-tiol (63).
Tiol
ME
MPA
ki
(m M ~ 1s ~ 1 )
113 ± 4
121 ± 13
k-i/ka
0.053 ±
0.100 ±
(mM)
0.005
0.021
K
(mM)
4.64 ± 0.55
1.58 ± 0.40
- 29 -
Se observa que los valores de ki son similares
ME y MPA,
lo que está de acuerdo con el
mecanismo
propuesto,
en el que la primera etapa es independiente del tiol.
contrario,
doble
la relación k-i/ka para MPA es
que
para
ME.
Puesto
que
k-i
reactantes,
Por
el
aproximadamente
el
corresponde
descomposición del producto intermedio,
P, para
esta constante debe ser también
la concentración de tiol y por lo tanto,
para
a
la
producir
los
independiente
kz (ME) /ka (MPA)
de
2
,
lo que implica que el ME es más efectivo al reaccionar con
P.
La razón de este comportamiento se puede explicar en base a la
mayor basicidad del MPA (log K = 10.2-10.3)
la del ME
(loe K = 9.4-9.5)
condiciones utilizadas
(65-66)
(pH = 9.3),
,
(64-65)
por
lo
existe una
respecto a
que
mayor
en
las
fracción
del anión mercapto del ME que del MPA.
Diversos estudios sobre la cinética
de los isoindoles indican
que
menos dos procesos paralelos;
lineal entre la constante
k 4 ob.
de
ésta
donde ko es la constante
catalizado
de
transcurre
degradación
(39)
de
una
primer
al
relación
orden,
:
[OPA]
[16]
proceso
no
(en ausencia de exceso de OPA) y ki corresponde
al
proceso catalizado por OPA.
velocidad
degradación
mediante
además se observa
, y la concentración de OPA
k d «b.= k* + ki
de
para
el
La constante ko es despreciable en
presencia de un exceso moderado de OPA.
- 30 -
La actividad del OPA depende en gran
estructura del tiol
(38-39) . En la Tabla
3
medida
se
muestran
valores de ko y ki correspondientes a derivados de
con diversos tioles
(39). Se observa
que
la
de
solo
los
metilamina
constante ko es
menos variable que la k i , lo que parece indicar que el
de la estructura sobre la estabilidad,
la
es
efecto
debido
a
la
inhibición del proceso catalizado por el OPA
Tabl a 3. - Constantes de velocidad de degradacion
derivados de la metilamina con diversos tioles (39).
de
los
SR
N-CH
Isoindol
a
b
c
d
e
r3
ki (M ~ 1 m in ~ ')
k« (rain*1)
—CH 3
-CHzCHaOH
-CHzCHa
-CH(CH 3 ) 3
-C(CH3)a
34.0
17 . 8
13.4
5 .6
0 .1
0 . 0 0 1
.0 0 2
0 .0 0 2
0. 007
0. 003
0
El efecto estabilizador de la presencia de un exceso
de tiol es probablemente debido a la formación de
derivados OPA-tiol,
libre.
que
disminuye
la
concentración
o
mas
de
OPA
La reacción de adición de agua o tiol a un aldehido con
formación del hidrato o hemitioacetal es
(66-69) y en este caso,
el hemitioacetal cíclico
bien
el derivado formado,
(VII,
también puede ser debida a la
(70).
uno
Esquema 2).
acción
conocida
C [12],
La
(25)
puede ser
estabilización
antioxidante
del
tiol
- 31 -
I.2.-
FACTORES ESTRUCTURALES QUE AFECTAN A LA ESTABILIDAD DE
LOS ISOINDOLES
I .2.1.-
Efecto
de
la
estructura
de
la
amina
sobre
la
estabi1 i dad
Nakamura
y
col.
cualitativo sobre el efecto
(45)
de
la
realizaron
un
estructura
de
primaria sobre la estabilidad de los isoindoles,
reacción con el reactivo OPA-ME.
la
con
sean atacados por el OPA. Además se
impedimento
que
observó
los
el
estabilizador del grupo carboxilo al comparar
los
aminoácidos
L-tirosina
con
aromáticos
los
menor
que
en
esterico
la sustitución en el carbono ex
adyacente al grupo amino parece impedir
de
por
Estos autores observaron,
primarias
alrededor del grupo a m i n o . Así,
amina
formados
la velocidad de disminución de la fluorescencia era
los derivados de aminas
estudio
fluoróforos
gran
la
L-trip tó fan o,
correspondientes
estabilidad
L-dopa
y
compuestos
de sca rboxilados. En el Esquema 8 se ordenan en función
estabilidad diversos aminoácidos y aminas primarias
efecto
(45)
de
:
su
- 32 -
H a N - C H ( CH 3 ) -COOH > H a N - C H a - C H a - O H
> H a N - C H a - C H 2 -CHa-COOH >
H aN -C H a- C Ha -C OO H > HaN-CHa-COOH
H a N-CH(CH a ) a > H a N-C(CH 3)3
> HaN-CHa-CHa-CHa-CH3
>
XXXV
> H a N-CH a - C H a -C H a > H a N- C H a - C H a
a
NHa
>
O
NHa
>
O
> HaN-CHa
NHa
NH;
>
XXXVI
Esquema 8
Más
tarde,
cuantitativamente
isoindoles.
revelo
Stobaugh
la
y
estabilidad
col.
(38)
cinética
evaluaron
de
diversos
El examen de las constantes de velocidad,
que
se
producían
estabilidad al
aumentar
(Tabla 4, b>a)
y
al
ligeros
el
tamaño
contener
sustitución adicional en el
adicional de la estabilidad lo
grupo carboxilo en la
amina,
aproximarse este grupo al C - 1 0
incrementos
de
los
estos
C -10
(f>d
produce
aumentando
de
sustituyentes
y
é>c).
la
Un
presencia
la
(a— > d ) . Así,
,
la
N-sustituyentes
una
aumento
de
un
estabilidad
al
los o^-aminoácidos
tienden a formar isoindoles más estables que las otras
es tu di ad as .
k dot>«
aminas
- 33 -
Anteriormente,
Lindroth y Mopper
(5) sugirieron,
que
el efecto estabilizador del grupo carboxilo de los aminoácidos
se debe a un efecto electrodonante en la
embargo,
posición
los resultados de Stobaugh y col.
de otros
autores
(36)(71),
indican
que
(38),
el
cr , para
un
aumento
grupo
Sin
junto con los
estabilidad es debido predominantemente a factores
Además el valor de Hammett,
C-10.
en
la
estericos.
carboxilo
es
casi nulo.
Tabla 4. - Constantes de velocidad de primer orden
y
tiempos
de vida media para la degradación de los isoindoles
derivados
de OPA-ME y aminas primarias (R» = -C H 2 C H 2 OH) (38).
SR
H
N -
Isoindol
Ri
R2
k dob>
(m i n ” 1)
a
b
c
d
e
f
-H
-H
-H
-H
—CH 3
-CH3
- C H 2 CH*
-CH2CH2C02H
-CH2C02H
-CO2 H
-CH2CO2H
-CO2H
38 .0
32 .9
27 .8
22 .5
12 .0
•7.0
ti/2
(m i n )
18.2
21 .1
24 .9
30 .8
57 .8
98. 9
- 34 -
Jacobs y col.
(39),
una serie de derivados
al examinar
variando
la
estabilidad
sistemáticamente
de
la
amina,
observaron que la introducción de ramificaciones en la
cadena
lateral de la amina produce un gran
estabilizante,
y
que la magnitud de la estabilización aumenta al aproximarse
la
ramificación al anillo isoindol.
de
la extensión de la cadena,
una disminución en
degradación
por
Finalmente,
el
aminoácidos
un
sin
factor
grupo
Además,
un aumento lineal
ramificación
de
metileno
comportamiento
(Tabla 5,
efecto
dos
en
(Tabla
de
alguna,
la
5,
los
velocidad
a,
derivados
disminución
en
la
degradación con la ramificación en la posición ex
adicional
en
un
factor
estericos
de
h).
los
de
dos
por
velocidad
de
(j ->k ->1),
cada
carbono
las constantes de velocidad obtenidas
'etilaminas-2-sustituíclas
inhibición
e,
(j<->m).
Por otro lado,
con
b,
de
j-m) es paralelo al de las a l q u i l a m i n a s ,
produciéndose una drástica
y una disminución
origina
de
la
degradación
( Tabla 6 ).
muestran
es
también
producida
por
que
la
efectos
- 35 -
Tabla 5. - Constantes de velocidad de primer orden y
tiempos
de vida media para la degradación de los isoindoles
derivados
de OPA-ET y aminas primarias (R* = -CH2CH3) (39).
SR
N-C-R
Isoindol
Rx
r
2
Ra
k d • b •xl 0 2
(min ' 1 )
31 .6 ± 0 .6
12 .0 ± 0 .4
0 .33 ± 0 .03
t
2 .2
5 .8
210
-
-H
-H
-H
5 .69 ± 0 .04
2 .3 ± 0 .2
0 .33 ± 0.06
12 .2
30
210
-CHaCHaCHa
-H
-C Ha CH (C H a )2 -H
3 .15 ± 0.08
± 0 .1
1.7
22.0
41
5 .4 ± 0.02
0.14 ± 0.02
12 .8
480
20. 3
a
b
c
d
-H
-H
-CHa
-CHa
-H
-CHa
-CHa
-CHa
-H
-H
-H
-CHa
e
f
g
-H
-H
-H
— CH 2 CHa
-CH (CH a ) 2
—C (CH s ) a
h
i
-H
j
k
1
m
-H
-H
-CHa
-CHa
-H
1 1 /2
(m i n )
' -C 0 2 H
-C 0 2 H
-C 0 2 H
—CH 2CO 2H
-H
-H
-CHa
-H
* No se observan cambios a las tres horas.
*
3 .41 ± 0.02
- 36 -
Tabla 6. - Constantes de velocidad de primer orden y
tiempos
de vida media para la degradación de los isoindoles
derivados
de OPA-ET y e t ilaminas-2-sustituídas (39).
Isoindol
R
a
b
c
d
e
f
k d *b. x 1 0 a
(m i n " 1 )
12.0
5.88
5.69
4.40
3.41
3.30
1.07
0.33
-H
-OH
-CHs
= CHa
—CO 2 H
-OCHs
-C.Hí
- C (CH 3 ) 3
S
h
Sin
embargo,
en
±
±
±
±
±
±
±
±
t 1/ 2
(m i n )
5 .8
11 .8
12.2
16
20. 3
0.4
0.08
0.04
0.02
0.02
0.2
0.05
0.06
ocasiones
21
64. 7
210
la
obtención
de
un
isoindol más estable viene ac-ompañada de una disminución de la
velocidad
-tirosina)
de
y
formación
de
una
(t-but il am in a,
intensidad
de
(t-buti lamina y ciclooc ti la mi na , XXXVI)
de la fluorescencia también ha sido
Haré
(14)
con
el
ácido
XXXV
y
cx'-metil-L-
fluorescencia
(45).
La
observada
c^-aminoisobutírico,
menor
disminución
por
Cronin
isovalina
t-b ut ilamina, que carecen de hidrógeno en la posición oí.
y
y
- 37 -
I .2.2.-
Efecto de la estructura del tiol sobre la estabilidad
El
tiol
más
utilizado
en
la
derivatización
aminoácidos es el ME. Sin em b a r g o , en múltiples
de
ocasiones
se
ha sugerido su sustitución por otros tioles,
con
el
aumentar la estabilidad de
Son
muchos
los
fluorescentes,
aunque
en
tioles
que
producen
los
isoindoles.
isoindoles
algunos casos la fluorescencia obtenida es menor
(ditiotreitol y ET)
fluorescentes
y
en
otros,
se
forman
fin
que
de
con
ME
compuestos
no
(metilmercaptoacetato y ácido me rc aptosuccínico)
(10)(15).
Aunque el 2-meti1-2-propanotiol
mucho más
estables
que
ME
o
ET,
los
produce
isoindoles
derivados
presentan un rendimiento cuántico de fluorescencia
por lo que se
recomienda
su
detección
isoindoles sufren oxidación anódica a un
formados
muy
bajo,
electroquímica
potencial
(los
moderado)
(72) .
Jacobs y col.
ácido ^-aminobutfrico
(39) observaron que los derivados
(GABA)
son más estables al
ramificación en la posición ex
del
tiol
aumentar
(Tabla
7),
parece confirmar que el factor determinante de la
es el volumen del tiol
(c<-->d).
Por otro lado,
lo
del
la
que
estabilidad
en la Tabla
7
se observa que el aumento de estabilidad conseguido con ET (b)
respecto a ME (e) no es importante.
- 38 -
Tabla 7. - Constantes de velocidad de primer orden
y tiempos
de vida media para la degradación de los isoindoles
derivados
del acido T-aminobutirico (Ri = H ; Ra ~ -C H 2 C H 2 C O 2 H) (39).
SR
N-C-R
Isoindol
R3
k dob. x 1 0 2
(m i n " 1 )
-en 3
-CH2 C H 3
-C H(C H3 )2
—C (CH a )3
-CHaCH20H
a
b
c
d
e
Sin embargo,
7.7
5.96
2.7
0.17
8.7
1 1 /2
(m i n )
± 0.2
± 0.08
±0.6
± 0.02
±0.2
9.0
11 .6
25
410
8 .0
Simons y Johnson (12) sugirieron el uso
de ET como sustituto de
ME,
debido
a
que
i soindo1es der ivados de ET son mas estables
en
general
(12)(15)(73).
aumento de estabilidad de dichos derivados ha sido
recientemente
aminoácidos.
por
Stobaugh
aminoácidos que forman
(GABA,
col.
(58)
desagradable olor,
mayor volatilidad.
en
derivados
^B-alanina,
a l a n i n a ) . Sin embargo,
veces
glicina,
la
para
diversos
estabilidad
particularmente
ácido
se ve aumentado con
el
ofrece
de
los
inestables
^-a minobutírico
uno de los inconvenientes
ET,
El
comprobado
Estos autores observaron que el uso de ET
un incremento de más de 5
con ME
y
los
del
debido
y
ME,
su
a
su
- 39 -
Se ha propuesto el uso de otros tioles como el ácido
3-mercaptopropionico
(74-75) y el tioglicerol
(76),
pero no se
ha extendido su uso. También se ha estudiado la posibilidad de
usar ariltioles
(77)
(bencilmercaptano,
tiofenol
metanotiol),
menos volátiles que ME, en la
isoindoles.
Sin
fluorescencia
alguna
fluorescencia,
indicar que
isoindoles
embargo,
productos
obtenidos
formación de derivados
tiofenol,
excitación
formados
trifenil-
formación
bencilmercaptano
y el
sus máximos de
los
incrementándose
el
y
de
no
origina
aunque
y
son
produce
emisión
parecen
distintos
con alquiltioles.
Por
con trifenilmetanotiol
de
ultimo,
es
los
los
la
muy lenta,
la intensidad de fluorescencia en un factor de
cinco a lo largo de un período de tres horas.
La
N-acetil-L-cisteína
(NAC)
empleada en la derivatización pre- y
(XXXVII)
post-columna
ha
de
primarias y aminoácidos y, por ser un tiol ópticamente
permite la separación de
isoindoles
derivados
compuestos
diastereoisómeros
de
la
cisteína
(Esquema
se
9)
encuentran
mercaptanos quirales de que se puede
ópticamente pura.
enantiómeros
sido
aminas
activo,
al
(78-83).
entre
disponer
en
formar
Los
los
pocos
una
forma
40
-
1
^
L
-
+
ru r
CIIO
HS-CH2 CHCOOH
xxxvii
AlICOCH:
R -fH -C O O H
NH2
\/
Co o h
CH*COHN^C-*H
■CÜ2
co
CH3COHNI
COOH
y
Í-+ H
COOH
ft
R
Esquema 9
Los espectros de excitación y emisión,
intensidad de fluorescencia de los
casi
derivados
idéntica a la de los derivados de
la reacción antes de dos
minutos.
1a
OPA-NAC
es
de
OPA-ME,
La
así" como
completándose
fluorescencia
isoindoles formados es estable al menos durante
10-30
incluyendo
es
el
derivado
de
susceptible de autooxidación
Por
intensidad
otra
de
parte,
la
glicina,
que
que
puede
e1
fluorescencia
ser
debido
reactivo
mayor
NAC
que
la
d eterminación
»
el
más
origina
una
ME
el
a
la
alta
s imultánea
de
iminoácidos con sensibilidades del mismo orden
en
con
estab ilidad
isoindoles cis teínicos frente a la oxidación.
posible
min
los
(41).
determinacion de iminoácidos p reviamente oxidad os
lo
de
la
NaClO,
de
los
D e este m o d o , e s
aminoácidos
(82)(84).
e
- 41 -
El NAC
es
un
relativamente económico,
reactivo
sólido,
comercializado
y
presentando un olor apenas apreciable
en contraposición a los tioles normalmente usados. Ademas,
el
reactivo OPA-NAC y los derivados formados son mas estables que
los correspondientes al ME y E T . Otros derivados
que han sido utilizados son la Boc-L-cisteína
-carbonil-L-cisteína) (XXXVIII)
(XXXIX)
de
cisteína
(N-terbutiloxi-
(83) y N-acetil-D-penicilamina
(85). La resolución obtenida con NAC es peor
Boc-L-cisteína,
sin
embargo,
este
desventaja de no estar comercializado
ultimo
con
presenta
la
(83).
HS NH-CO-CH
(CH ) -Ó-CH-COOH J
d ¿
CH -CO-f-NH-fH-COOH
0
c h 2- s h
XXXVIII
que
,
XXXIX
Recientemente se han publicado un par de trabajos en
los que los derivados de aminoácidos
separan mediante cromatografía
en
como fase móvil L-prolina y Cu(II).
separan
como
C u (I I )-L-prolina
complejos
(86-87).
mixtos
DL
fase
Los
con
OPA
inversa,
isómeros
y
NAC
se
utilizando
ópticos
diastereoisómeros
se
de
- 42 -
I .2 .3.- Utilización de sustitutos de o-ftaldehido
El mínimo requisito estructural para que un reactivo
condense con una amina primaria y un tiol es la
la agrupación o-diacil ben ce no, en la cual al
carbonilo sea aldehídico.
pueden
resultar
Así,
los
adecuados.
producirían isoindoles
presencia
menos
un
grupo
o-cetobenzaldehidos
Ademas,
estos
1,2,3-t ris ustituídos,
(XL)
compuestos
(XLI)
(Esquema
1 0 ), que presumiblemente ofrecerían una mayor protección
la
oxidación
que
o-acetilbenzaldehido
(XLb)
la
que
(ABA)
proporciona
OPA
(XLa) y o-benzoilbenzaldehido
fueron seleccionados para comprobar
los derivados formados
el
la
(24).
S-R1
R' - 5 H , R"-NH2
0
R
XLI
XL
a.-
ABA
R = CH3
b .-
OBB
R = Ph ’
c.-
OPA
R = H
t
Esquema 10
'ante
.
El
(OBB)
estabilidad
\
GÓ
de
de
- 43 -
Se realizaron estudios cinéticos utilizando G A B A . La
formación del isoindol a partir de OBB mostró una cinética
de
pseudo-primer orden en presencia de un exceso de OBB y E T . Sin
embargo,
primer
la degradación del isoindol no siguió una cinética de
orden
degradación
en
es
radical libre,
estas
condiciones.
característica
en la
que
de
existe
Esta
la
un
cinética
autooxidación
período
de
de
de
un
inducción,
seguido de la aceleración de la descomposición.
El isoindol derivado de OBB es
apreciablemente
mas
estable que el derivado de ABA (y éste a su vez es mas estable
que el de O P A ) , aparentemente
efectos estéricos,
debido
a
una
combinación
electrónicos y de resonancia,
el sustituyente fenilo en la posición 3.
Por
ejercidos por
otro
lado,
velocidad de formación del isoindol a partir de OBB
menor
que
con
impedimento
OPA
o
estérico
ABA,
del
lo
que
grupo
puede
fenilo,
de
es
ser
que
la
mucho
debido
reduce
al
la
posibilidad de ataque nucleofílico intramolecular por la amina
secundaria del cx'-alquilbencilsulfuro (Esquema 2,
estabilización por resonancia del
reactivo.
X)
Así,
o
a
la
aunque
el
isoindol derivado de OBB es considerablemente mas estable
el de ABA,
que
la lenta velocidad de formación del primero lo hace
menos recomendable como reactivo analítico.
Basándose en el hecho de que la estabilidad
isoindoles
frente
a
la
autooxidación
electrofí1 ico én las posiciones
cuando
el
isoindol
posee
1
y
3
(88)
y
(58)
se
sustituyentes
al
de
los
ataque
incrementa
fuertemente
- 44
-
electroatrayentes, se ha propuesto la sustitución del
otros nucleofilos tales como
embargo,
HSO a”
Na",
SCN-,
HSO 3
y
CN~.
Sin
al utilizar alanina como amina primaria solo el CN" y
formaron
derivados
flúor es c ent es .
Se
observo
aumento de estabilidad en el deri vado de CN" con
derivado
de
ME,
sin
embargo,
intensidad fluorescente menor
La sustitución
aldehido
tiol por
(N D A ) (XLII)
CN" origina derivados
de
el
primero
un
respecto
presento
una
(89).
OPA
por
2
,3-naftalendicarboxi-
en la deriva tización de aminoácidos
1-cianobenz (f )isoindolol
OPA
la útil ización de NDA y ME
derivados inestables y muy poco fl uo rescentes. El
con
(XLIII),
presentan mayor fluorescencia que los derivados de
(89-93). Por el contrario,
al
que
y
ME
produce
Esquema
11
muestra el posible me.canismo de fo rmación de los derivados
de
NDA y CN".
RNMj
XLII
NHR
Esquema
11
- 45 -
También se ha estudiado el 5-(N ,N-dimeti lam in o)-2,3naftaléndicarboxaldehido
y a la posibilidad de
derivados con C N " . Sin
isoindoles isoméricos
(XLIV),
debido a su mayor solubilidad
incrementar
embargo,
(91)
la
la
fluorescencia
reacción
(Esquema 12).
CN
,CHO
CHO
N M «2
X L IV
Esquema 12
origina
de
los
dos
- 46 -
I .3.- DETERMINACION DE LISINA.
AMINAS SECUNDARIAS..
CISTINA Y
CISTEINA CON O-FTALDEHIDO
1.3.1 - Determinación de U s i n a y aminas secundarias
En presencia de un exceso del
reactivo
OPA-ME,
la
lisina forma un derivado que posee dos grupos isoindol,
debido
a la existencia en la molécula del aminoácido
de
grupos
amino terminales.
lisina
Chen y col.
(10)
valoraron
dos
reactivo OPA-ME.
Cuando el grado de sustitución era
encontró que la
intensidad
fluorescente
fluorescencia disminuyó,
el
^ < 1.
se
a
la
1.
la
llegando a ser la decima parte de
la
obtenida con otros aminoácidos,
era
con
similar
& >
sin embargo cuando
de otros aminoácidos en la lisina di su st i tu id a.
Sin
embargo,
la
fluorescencia
disustituida aumenta en presencia de
un
anionico
sádico
como
el
dodecil
sulfato
observándose el mismo efecto con
(95). Asi,
un
de
la
agente
tensioactivo
(DSS)
tensioactivo
es probable que la extinción
de
la
lisina
(10)(94),
no
ionico
fluorescencia
sea debida a la interacción de los dos grupos isoindol
de
la
las aminas secundarias tales como
la
lisina y que el tensioactivo facilite su separación.
Por otro lado,
prolina e hidroxiprolina no pueden
con el reactivo OPA-ME,
aminas primarias.
determinarse
directamente
sino que previamente deben oxidarse
Para ello se han empleado reactivos como
cloramina T y especialmente el hipoclorito sádico
a
la
(2)(11)(30).
- 47 -
Sin embargo,
sensibilidad,
con
las
la mayor desventaja del procedimiento es su
baja
aproximadamente diez veces menor que la obtenida
aminas
primarias.
conversión incompleta
a
Esto
amina
puede
ser
primaria
o
debido
a
una
incompleta entre la amina primaria formada y el
por la interferencia del exceso de oxidante
la
reacción
OPA,
causada
(96).
El exceso de hipoclorito es capaz de
aminas primarias formando cloraminas
a
[17-18] y
clorar
de
a
las
oxidar
al
OPA y al ME.
NaOCl + RNHa
> NaOH + RNHC1
[17]
NaOCl + R N H C 1 --------- > NaOH + RNCla
[18]
Sin embargo,
la sensibilidad de la reacción
por adición de 2,2 *-tiodie tan ol,
con
el
exceso
de
hipoclorito
monocloraminas en aminas primarias
que
aumenta
probablemente reacciona
[19]
[20]
NaOCl + (HOCH 2 C H 2 )aS ------ > NaCl +
y
convierte
las
.
(H 0 C H 2 C H 2 ) 2 SO [19]
RNHC1 + (H0CH2CH2)2S + H 2 O ------ > R N H 2 + (HOCH 2 CH a ) 2 SO + HC1
[20]
- 48 -
1.3.2.- Determinación de cistina y cisteína
El derivado que forman la cistina y cisteína con
reactivo OPA-ME es mucho menos fluorescente que el que
la mayoría de los aminoácidos
forman
(en proporciones equimolares
alrededor de 40 veces menos fluorescente
reactivo no es en principio adecuado
cistina y cisteína en proteínas,
), por
lo
el
que
es
este
para la determinación de
considerando además
su
bajo
contenido en las mismas.
El hecho de que la
aminas
primarias,
fluorescente,
de
aunque
cisteína,
lugar
no
a
ha
en
un
sido
oposición
producto
a
otras
débilmente
completamente
explicado,
parece ser debido a la presencia del grupo tiol en la molécula
de cisteína,
el cual compite intramolecularmente con el ME por
la posición 1 en el isoindol
(I)
(97-98).
reacciona con el reactivo OPA-ME,
reductores del medio,
Sin
debido
Cuando
la
a
condiciones
las
cistina
se forma el derivado de la cisteína.
embargo,
algunos
derivados
cisteicos,
al
reaccionar con OPA-ME originan una fluorescencia superior a la
producida por la cistina y cisteína
S-carboximetilcisteína
}
el
(Tabla
ácido
S-3-sulfopropilcisteína dan lugar a
veces superior a la
que
cistina y
pueden
cisteína
origina
8)
una
la
(2).
cisteico
transforman en estos derivados cisteicos.
si
por
la
y la
fluorescencia
cisteína,
determinarse
Así,
40-80
lo
previamente
que
se
- 49 -
Tabla
8. Formación
d e r i v a d o s c i s t e i c o s (2).
Reactivo
de
derivatizante
isoindoles
Derivados
fluorescentes
con
cisteicos
If -
-
Cisteína
0 .5
-
Cistina*
1 .0
4-Vinilpiridina
S ~ p ~ ( 4 - p i r i d i l e t i l )c i s t e í n a
2 .5
Ditiotreitol
tetrationato
S-sulfocisteína
2 .9
y
sódico
Et i l a m i n a
S - 2 - a m i n o e t i l c i s te ína
19 .9
Acido
iodoacético
S-carboximet ilcisteína
22. 9
Acido
performico
Acido
34 .8
Tri-n-butilfosfina
1,3-propanosulfona
■
b
cisteico
S-3-sulfopropilcisteína
y
43 .G
Se c o m p a r a n c o n c e n t r a c i o n e s e q u i m o l a r e s
L a c o n c e n t r a c i ó n de c i s t i n a es la
mitad
que
la
o t r o s c o m p u e s t o s , d e b i d o a su e s t r u c t u r a d i m é r i c a .
En los análisis de
en los
que
cisteico,
cistina
aminoácidos totales en proteínas,
cisteína
dos horas y media,
con
ácido
Desafortunadamente,
performico,
cistina,
se
determinan
como
previamente
a
ácido
metanosulfonico
durante
el
que
también
tirosina, valina
se
(42)(97)(99-100).
tratamiento
origina
e histidina
esto ultimo se minimiza por adición de
la
liofilizacion
mezcla
(102).
de
reacción
con
a
la hidrólisis
con
no solo se destruyen los puentes disulfuro
sino
triptófano,
diluyendo
los
la oxi-dacion con ácido performico se lleva a cabo
0*C durante
acida
y
de
la
de
la
destrucción
de
(99)(101);
agentes
agua,
acido
aunque
reductores
seguida
o
de
- 50 -
Bermudez y col.
(103) propusieron un método para
determinación fluorimetrica de mezclas de glicina
con OPA-ME,
propuesto,
utilizando un montaje
FIA.
En
el
y
cisteína
procedimiento
la cisteína es oxidada a ácido cisteico
con lo que su fluorescencia aumenta en gran
con
medida,
que la glicina no es afectada por el oxidante.
la
KIO*,
mientras
Se consigue
resolución de la mezcla de aminoácidos a partir de la
la
señales
obtenidas en presencia y en ausencia de oxidante.
Sin embargo,
con el reactivo OPA-ME
la derivatizacion de cistina y cisteína
tras
.su
oxidación,
no
general una buena reproducibilidad, dado el
carácter
de las reacciones de formación de ácido cisteico
obtención de los isoindoles
(reducción).
presenta
de
opuesto
(oxidación) y
Además,
total de aminoácidos requiere la obtención
el
al
análisis
menos
hi dro liz ado s, uno en presencia de ácido performico y
su ausencia
(100). Obviamente,
es deseable
la
en
dos
otro
en
existencia
de
unas condiciones experimentales para el análisis de todos
los
aminoácidos a partir de un solo hidrolizado.
Lee y Drescher
que,
tiol
(97) propusieron un método
previamente a la adición del reactivo
de
la
cisteína
es
bloqueado
1,3-propanosulfona para formar
determinar
cistina,
tri-n-butilfosfina.
OPA-ME,
el
el
grupo
reacción
con
S-3-sulfop ro p i lc is te ín a.
Para
reduce
por
en
esta
se
a
La
1,3-propanosulfona
cisteína
con
reacciona
- 51 -
específicamente con la cisteína bajo
condiciones
modo que otros aminoácidos no resultan afectados
suaves,
de
(la mezcla de
reacción se mantiene bajo atmosfera de Na a 25°C durante 2 h ) .
La sulfop rop ila cio n, seguida de hidrólisis con H C 1 , condujo
buenos
resultados
para
todos
los
aminoácidos,
triptofano que se destruyo completamente,
a la acción del H C 1 . Por el contrario,
metanosulfonico origino unos
triptofano
excepto
probablemente debido
la hidrólisis con ácido
resultados
aceptables
para
(recuperación del 80%) y excelentes para los
aminoácidos.
Además,
el
método
alquilacion e hidrólisis se
hidrólisis.
Sin
cancerígeno
de
embargo,
es
a
directo:
realizan
en
debido
al
el
la
el
demás
reducción,
mismo
tubo
posible
de
carácter
\
la
1,3-propanosulfona,
se
deben
tomar
precauciones especiales de aislamiento durante el tratamiento.
El bloqueo del grupo tiol con el
ácido
para formar S-carboximetilcisteína, produce un
una intensidad fluorescente similar a la de los
otros aminoácidos con OPA-ME
iodoacetico
compuesto
derivados
(98). El procedimiento es
la separación de su derivado con OPA-ME mediante H P L C . El
el grupo tiol también permite la formación de otros
con OPA-ME,
y cisteína
de
rápido
y permite la determinación de cisteína en suero y orina,
de reactivos como iodoacetamida y acrilonitrilo para
con
tras
uso
bloquear
derivados
que son adecuados para la determinación de cistina
(98).
- 52 -
El bloqueo del grupo amino de
que esta actué puramente como tiol.
la
cisteína
El NAC
(XXXVII)
permite
ha
sido
utilizado como estándar interno en la determinación de
tioles
con
en
OPA
y
taurina
(104).
La
utilización
derivatización de aminoácidos ha
de
NAC
la
sido comentada en el apartado
1 . 2.2 .
Un estudio interesante
en el que
-D-valina
hacen
reaccionar
es el de Usher y col.
cT- (L-ot'-aminoadipi 1) -L-cisteini 1-
(ACV) con OPA en ausencia de un
tiol;
por HPLC mostró un solo pico a los 26 min
.
el
Por
se obtuvo un pico principal a los
segundo pico a los 28 min
. Así,
a un compuesto fluorescente,
grupos amino y tiol,
mismas
min
y
que
el
pico
a
un
corresponde
en el que el ACV proporciona
mientras
corresponde a un isoindol,
lado,
las
26
el pico a 26 min
análisis
otro
cuando se cromatografio el derivado de OPA-NAC en
condiciones,
(81),
los
los
28
min
donde el ACV reacciona tan solo por
el grupo amino. Utilizando NAC más diluido,
el grupo tiol
del
ACV compitió más favorablemente con el tiol externo y el
pico
a los 28 min disminuyó.
La cisteína puede también comportarse como
su reacción con OPA y una
(104)
amina
primaria.
eligieron arbitrariamente taurina
para la reacción flu orogenica, y
determinación de cisteína y
otros
Nakamura
como
aplicaron
tioles
líquida con derivatización po st -c ol um na . La
tiol
amina
el
por
y
en
col.
primaria
método
a
la
cromatografía
presencia
de
un
- 53 -
gran exceso de
taurina
impide
que
el
grupo
amino
cisteína reaccione con el OPA. La mezcla de OPA y
de
la
taurina
da
lugar a un color rojo que aumenta con el tiempo y disminuye la
capacidad de inducir fluorescencia en los tioles,
por
lo
que
el eluato se debe mezclar en primer lugar con la disolución de
OPA y luego con la taurina.
La
reacción
se
completa
pocos segundos de añadir la taurina. Más tarde,
desarrollaron otro
procedimiento
para
estos
determinar
donde la taurina fue sustituida por L-triptofano
Una modificación de este
determinación simultánea
de
y
7
tioles con taurina y OPA a pH 9-10
y
permite
la
cisteína se eluye conjuntamente-con la cistina,
la
tras
su
reducción
de
derivatización
(105). En
autores
cisteína,
disulfuros,
separación en una columna de intercambio iónico,
los disulfuros con sulfito a pH
los
(45).
procedimiento
tioles
a
de
columna,
los
la
sin embargo es
posible la determinación diferencial omitiendo el
sulfito
en
la post- co lu mn a. Un inconveniente del procedimiento es que una
concentración de sulfito excesiva produce una. disminución
la fluorescencia,
debido probablemente al consumo de
OPA
de
por
el bisulfito.
Sin embargo,
originan
otros aminoácidos
productos
fluorescentes,
débilmente
cuando el
(10)(45). Mopper y Delmas
ME
se
y
aminas
fluorescentes
reemplaza
por
la
primarias
o
no
cisteína
(106) propusieron un método para
la
determinación de trazas de tioles biológicos por cromatografía
- 54 -
líquida y derivatización pre-columna con OPA,
taurina es sustituida por 2-aminoetanol. A
alta de 2-aminoetanol
(>
12
mM)
se
una
que
con
otros
tioles),
cisteína con OPA se mejoro
drásticamente,
una
(unas
mientras
concentración de amina inferior a 1 mM la
el
que
la
concentración
observo
fluorescente más bien baja para la cisteína
menor
en
respuesta
100
que
veces
con
reactividad
pero
el
una
de
la
derivado
eluyo junto con el volumen muerto.
La
razón
de
este
comportamiento
puede
ser
la
participación del grupo amino de la cisteína en la reacción,
una concentración baja de la amina.
cisteína
pueda
funcionales
reaccionar
( amino y tiol
tipo de los isoindoles
a
La posibilidad de
través
de
sus
) para producir un
(XLV),
que
dos
la
grupos
fluoroforo
del
tal como ocurre con el glutation
(XLVI), ha sido también sugerida por otros autores.
(COOH)
XLV
a
COOH
XLVI
- 55 -
Por otro lado, Nakamura y Tamura
fluorescencia al
hacer
temperatura ambiente,
reaccionar
en
ausencia
la
(104) no observaron
cisteína
de
otra
amina
Estos autores pensaron que ello era debido a la
reacciones
laterales,
fluorescentes,
formado,
con
formación
en
comparación
miembros que origina el glutatión
(XLVII)
cisteína)
forman con
segundos
a
50°C
(incluyendo
OPA
(en
derivados
ausencia
OPA
por
post-columna.
cromatografía
Además,
de
isoindol
en
el
el
de
10
anillo
(107) encontraron que
cisteína
y
un
tiol
las
en
pocos
externo),
estos
y
los
,^-dimetil-
fluorescentes
líquida
determinaron
derivados fluorescentes formados,
del
no
resultante
propusieron un método para la separación de
con
de
.
Recientemente Metz y col.
^3-aminot ioles
con
a
primaria.
productos
o a la ausencia de fluorescencia
anillo de 5 miembros
OPA
aparición
de
debido probablemente a la tensión
con
y
compuestos
derivatización
estructuras
de
los
analizando sus extractos
en
cloruro de metileno mediante cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas
(GC-MS).
el OPA reacciona selectivamente
producir
Los análisis demostraron
con
los
^0-aminotioles
2,3-dihidrotiazo(2,3 a )isoindoles
(XLVIII)
similares a los obtenidos con las aminas primarias
presencia de un tiol externo
(I)
que
(11-12)(21).
y
para
[21],
OPA
en
- 56 -
XLVI I
XLVIII
La cisteína formo un derivado fluorescente
356 nm
, A e m = 438 nm
), sin embargo,
aislarlo fueron infructuosos,
descomposición,
como
se
( Aex
=
reiterados intentos para
debido aparentemente a su rápida
comprobo
por
la
perdida
fluorescencia y cambios de color en los tres primeros
después de la salida de la columna.
No obstante,
de
minutos
por similitud
con los otros ^5-aminotioles se propuso la estructura XLV.
También se ha observado que las proteínas en general
producen
productos
fluorescentes
con
OPA
en
presencia
y
ausencia de ME. El rendimiento de la fluorescencia en ausencia
de ME puede incrementarse por reducción previa de los
disulfuro a grupos tiol libres,
y
anularse
por
previo de las proteínas con N-e til ma le im id a, que
grupos tiol
la
cisteína
5-hidroxiindoles
en
la
separación
acción
y
con
OPA
en
medio
determinación se hace
uso
de
diversos
halla
la
cisteína,
entre
los
tratamiento
bloquea
los
(108-109).
Resulta interesante señalar la
de
puentes
que
se
HC1
interferente
determinación
8
M
agentes
para
.
En
de
esta
reductores,
prevenir
la
- 57 -
autooxidación de los 5-hidroxiindoles
(110-113). Sin
la cisteína puede reaccionar con OPA para formar
fluorescente,
(111)(113).
por
En un
lo
que
estudio
se
recomienda
realizado
un
evitar
por
producto
su
Tachiki
muestra cómo la cisteína presenta su máxima
embargo,
uso
(111)
se
fluorescencia
al
calentarse con OPA en HC1 8 M durante 50 min a 82 °C.
Por ultimo,
NDA
(XLII)
como
recientemente se ha propuesto el uso del
reactivo
alternativo
al
determinación fluorimetrica específica de
débilmente alcalino a 20°C ( A e x =
tiempo de reacción 25 min)
la adición de tiol,
462
OPA
arginina
nm,
Aem
(114). La reacción no
e incluso su presencia
aminoácidos no presentan interferencia
en
=
excepto
la
medio
520
nm,
requiere
interfiere.
debido a la presencia del grupo tiol, que debe
por tratamiento con N-etilmaleimida.
para
de
Otros
la
cisteína,
ser
bloqueado
- 58 -
I.4.-
DETECCION ESPECTRQFOTOMETRICA DE LOS ISOINDOLES
La gran mayoría de los métodos existentes basados en
la reacción del o-ftaldehido
fluorimétricos,
aminas
su
análisis
de
aminoácidos con OPA se debe a que esta técnica es al menos
un
sobre
340
fuerte
nm
,
absorción
son
también
OPA
la
primarias
los
de
embargo,
las
de
derivados
sin
con
permite
determinación espectrofotométrica
El mayor uso de la fluorimetria en
el
orden de magnitud más sensible que la espectrofotometría y sin
embargo,
en
la
reacción
con
OPA,
esta
ultima
puede
ser
deseable en algunas ocasiones por diversas causas:
1.- Las
absortividades
distintos aminoácidos
molares
muestran
de
menor
los
isoindoles
variabilidad
que
de
los
respectivos rendimientos cuánticos fluorescentes.
2.- En algunos casos pueden existir efectos de
de
la
fluorescencia,
péptidos,
que
presentan una intensidad de fluorescencia menor que la de
los
aminoácidos
como
(10)(115-116),
molares son similares
3.- El método
ocurre
mientras
con
que
los
extinción
sus
absortividades
(117)'.
espectrofotométrico
puede
ser
alternativa cuando no se dispone de un fluorímetro.
la
única
- 59 -
El método espectrofotométrico presenta un limite
detección para los aminoácidos de 7x10“ • M, ligeramente
que el obtenido con
ninhidrina
comparación con la ninhidrina,
absorbencia muy bajas
cromoforo
son
(2x10“ •
el
OPA
a
frente
tampoco
unas
necesarias
calentamiento y enfriamiento,
La sustitución en la
modifica la forma del espectro
la
cadena
lateral
del
el
al
en
lecturas
de
como
el
ambiente,
oxigeno
etapas
mayor
embargo,
reactivo
temperatura
requiriendose su protección
son
presenta
(<0.03), y tanto
estables
M ) ; sin
de
no
atmosférico;
prolongadas
de
como ocurre con la ninhidrina.
posiciSn
1
(29). Además,
aminoácido
del
isoindol
no
la naturaleza
de
no
parece
alterar
significativamente la absortividad del derivado de OPA,
siendo
los
^6000
valores
de
las
absort ividades
molares
(10)(73)(117-118).
La reacción del OPA con
presencia
de
un
tiol,
es
las
muy
aminas
primarias,
adecuada
par.a
en
seguir
espectrofotométricamente la hidrólisis enzimática de péptidos.
El procedimiento fluorimetrico con OPA no es tan práctico como
el método espectrofotometrico, debido a la mayor
de los rendimientos cuánticos de los isoindoles
variabilidad
formados.
Se
han descrito procedimientos para medir la hidrólisis de N-acil
peptidos
y
un
(73),
la proteolisis de las proteínas lácticas
procedimiento
liberados durante
embargo,
la
general
para
proteolisis
medir
de
los
proteínas
grupos
(118).
(117)
amino
Sin
la inestabilidad de los derivados obliga a controlar
estrictamente
el
tiempo
de
reacción.
Las
espectrofotométricas se deben realizar a los 2 min,
medidas
tiempo
en
el que se alcanza la máxima absorbancia.
También
se
espectrofotométrica en
gentamicina
utilizando
se
el
ha
utilizado
HPLC.
analizaron
reactivo
Así,
con
la
muestras
detección
comerciales
derivatización
OPA-ácido
pre-columna,
mercaptoacetico
(119)
aminoácidos con derivatización post-columna con OPA-ME
En el segundo caso,
es adecuado para el
fermentación,
los autores indican que
análisis
de
el
aminoácidos
pero la sensibilidad
del
incrementarse en 2 ó 3 órdenes de
y
(120).
procedimiento
en
caldos
procedimiento
magnitud
de
con
un
de
podría
detector
fluorimetrico.
Por
ultimo,
se
han
descrito
métodos
espectrofotometricos para la determinación de aminas primarias
(bencilamina,
feniletilamina,
norefredina,
ci cl oh e x i l a m i n a ,
4-aminociclohexanol, furfurilamina, N-butilamina y etañolamina)
(121),
esteres de aminoácidos
(122)
y
etilendiamina
(123).
Para esta ultima el máximo de absorción se sitúa sobre 430
nm
( <£. =
es
5000)
y
la
estequiometría
et ilendiamina:O P A :ME 1:2:2
(XLIX ).
S-CH2-CH2OH
- c h 2- c
XLIX
de
h
s -c h
2-
2- c h 2o h
la
reacción
OBJETXVOS
- 63 -
La
cisteína
forma
con
el
mercaptoetanol un derivado mucho menos
isoindoles
de
otros
determinación
reactivos,
aminoácidos,
directa.
Además,
o-ftaldehido
fluorescente
lo
que
en
y
que
los
imposibilita
presencia
de
su
estos
la cistina se reduce dando lugar al correspondiente
derivado de cisteína.
La
aminoácidos,
débilmente
embargo,
razón
por
la
que,
a
diferencia
la cistina y cisteína dan
fluorescente
no
se
lugar
conoce
a
con
de
un
otros
derivado
exactitud.
se halla relacionada con la presencia del grupo
en la molécula de cisteína,
con el mercaptoetanol.
Por
que
otra
compite
parte,
isoindol formado no sea estable y se
Sin
tiol
intramolecularmente
es
posible
descomponga
que
el
rápidamente
apenas formado.
Si se bloquea el
grupo
obtienen isoindoles estables,
embargo,
se ha
tiol
mucho
de
más
la
cisteína,
fluorescentes;
el procedimiento se complica excesivamente.
especulado
reacción simultánea
c i st eí na .
sobre
de
la
los
formación
dos
grupos
de
un
se
sin
Asimismo,
isoindol
funcionales
de
por
la
- 64 -
Por otra parte,
cisteína,
tioles,
si se bloquea el grupo amino
se obtienen compuestos que
pueden
de
utilizarse
la
como
para derivatizar aminas primarias con o-f ta ld eh id o. Un
ejemplo de ello es
evidencias
de
la
que
la
exclusivamente como
aminas primarias.
N-a cet il-L-cisteina.
tiol
Sin
propia
en
la
embargo,
También
existen
puede
actuar
cisteína
derivatización
esto
se
de
consigue
cuando la concentración de la amina primaria
es
algunas
tan
solo
elevada,
lo
que permite competir con el grupo amino de la cisteína.
Debido
a
la
polémica
existente,
se
interesante clarificar algunos aspectos de la
reactividad
de
obtención
de
la cisteína frente al o-ftal deh id o, como son la
un isoindol
actuación
fluorescente
exclusivamente
en
ausencia
como
tiol
de
en
considero
otro
tiol
mezclas
y
con
su
otros
aminoá cid os.
El
tiol
aminoácidos
con
embargo,
olor
su
más
utilizado
o-ftaldehido
en
es
el
y
la
desagradable
la
derivatización
mercaptoetanol,
inestabilidad
derivados formados han llevado a la búsqueda de
alternativos.
La
N-acetil-L-cisteína
se
ha
recientemente para la separación de aminoácidos
sin
de
otros
no
presenta
olor
y
lo
isoindoles formados son muy estables.
se ha extendido.
más
los
tioles
propuesto
enantiomeros.
Este reactivo presenta unas características muy adecuadas:
económico,
de
importante,
Sin embargo,
su
uso
es
los
no
- 65 -
No existen estudios cinéticos sobre
formados con N-acetil-L-cisteína similares
con mercaptoetanol.
un
estudio
de
la
isoindoles
Estos estudios permiten
N-acetil-L-cisteína,
isoindoles
los
realizados
Por ello se considero interesante realizar
comparativo
degradación de los
a
los
velocidad
obtenidos
demostrar
y
por
lo
de
formación
con
ambos
y
tioles.
la clara superioridad de la
tanto,
pueden
conducir
al
reemplazo definitivo del mercaptoetanol.
Además,
la cistina es uno
difíciles de determinar
en
los
de
los
fluidos
aminoácidos
biológicos,
importante disponer de métodos sencillos para
ya
que
algunas
enfermedades
alteraciones en su concentración.
procedimientos para
la
Por
Se han
determinación
frecuencia son complicados,
buenos resultados.
están
se
siendo
estimación,
relacionadas
propuesto
de
no
con
numerosos
cistina,
poco selectivos y
ello,
su
más
que
conducen
desarrollaron
con
a
dos
nuevos
procedimientos basados en la reactividad de la cistina
frente
al o-ftaldehido que origina derivados distintos,que pueden ser
interesantes para la determinación del aminoácido.
Por otra
totales
tiene
un
parte,
doble
la
determinación
interés:
Por
un
de
aminoácidos
lado,
alteraciones metabolicas suelen ir acompañadas de
algunas
un
aumento
generalizado de los aminoácidos libres en plasma y/o orina,
por otro,
el análisis de proteínas solo conduce
aceptables si se
determinan
hidrólisis de las mismas.
los
aminoácidos
a
y
resultados
liberados
por
- 66 -
Los isoindoles formados por los distintos aminoácidos
con
el
reactivo
o-ftaldehido-N-acetil-L-cisteína
son
muy
estables y presentan espectros de absorción con sensibilidades
semejantes.
utilizar
el
Estos
hechos
reactivo
totales y proteínas.
sugirieron
en
la
la
conveniencia
determinación
Se investigo
también
de
de
que
las
tengan
en
cuenta,
por
absortividades molares de
una
los
aminoácidos
sobre
mejora de los resultados al utilizar factores
parte,
isoindoles,
y
de
la
posible
corrección,
distintas
por
otra,
la
recuperación incompleta de algunos aminoácidos.
Por
ultimo,
la
N-acetil-L-cisteína
utilizada como agente mucolítico,
de las secreciones pulmonares.
análisis descritos para
su
Sin
para reducir
embargo,
determinación
es
la
los
en
también
viscosidad
métodos
fármacos
de
solo
parecen haberse aplicado a disoluciones acuosas del compuesto,
en ausencia de posibles interferencias.
Se investigo por
ello
sobre el empleo del o-ftaldehido y de una amina primaria en la
determinación del tiol en distintos fármacos.
PARTE
EXPERX MENTAL
- 69 -
III.1.- REACTIVOS Y APARATOS
1.- Reactivos
o-Ftaldehido
(OPA) Serva para uso
bioquímico.
Se
prepararon
semanalmente disoluciones 5x10"* M en e t a n o l , conservándose en
la oscuridad.
Tampon bórico-borato de pH 9.5 preparado a partir
de
HtBO»
0.1 M (6.18 g / 1) y NaOH 0.07 M (2.8 g/1).
L-cistina
y
prepararon
L-cisteína
Merck
disoluciones
para
1x10"*
uso
M
y
bioquímico.
2.5x10"*
Se
M
en HC1 0.05 M, guardándose en nevera a 4°C.
respectivamente,
2-Mercaptoetanol
Merck
para
síntesis,
Se
prepararon
disoluciones 7.2x10"* M en etanol.
N-Acetil-cisteína
Fluka
guardaron en nevera a 4°C
DL-ctf-Alanina,
L-histidina,
L-prolina,
L- iso leu ci na,
disoluciones
L-aspa ra gin a,
se
L-leucina,
L-glutamina,
D L -f en il al an in a,
DL -t rip to fan o, L-citrulina,
, ^3-alanina,
if'-amino-butírico
Las
.
L-a rg in in a,
L-serina,
DL-norvalina
purísima.
ácido
L- no rl e u c i n a,
DL-^G-amino-butírico,
Scharlau purísimo.
ácido
- 70 -
DL-valina Scharlau para uso bioquímico.
L-Acido aspártico y L-*ácido glutámico
L-Metionina,
Merck para análisis.
L-tirosina y L-ornitina hidrocloruro
Merck
para
uso bioquímico.
Taurina y ácido DL-2-amino-butírico
Merck para síntesis.
Glicina Cario Erba puro.
L-Lisina monohidrocloruro y L-treonina
Fluka purísimo.
Los aminoácidos no solubles en medio neutro
se prepararon
en
HC1 0.05 M.
Caseína
hidrolizada,
Biochemika,
albúmina
de
suero
para microbiología.
Caseína libre de vitamina
Serva para análisis.
bovino
Fluka
- 71 -
2.-
Aparatos
Potenciómetro Crison m o d . Digilab 501 con electrodo
combinado
de vidrio.
Baño termostático Selecta Precis-Term mod.
138
Espectrofluorímetro Shimadzu de doble haz mod.
.
RF-520 equipado
con lámpara de xenón de 150 W y cubetas de cuarzo de 1
cm
de
unidad
de
paso optico.
Espectrofotómetro Shimadzu mod. UV-240 provisto de
programas mod. OPI-2
.
\
III.2.- ESTUDIOS SOBRE
LA
FORMACION
DE
UN
PRODUCTO FLUORESCENTE POR REACCION DE
LA CISTEINA CON O-FTALDEHIDO
- 74 -
III.2.1.- INTRODUCCION
Nakamura y Tamura
(104)
indicaron que a temperatura
ambiente y en ausencia de otra amina primaria,
reacciona
con
OPA
Posteriormente,
para
formar
Metz y col.
un
producto
(107) observaron
produce la reacción de la cisteína con
A. *
fluoróforo con
= 356 nm y
A*»
la cisteína
el
no
fluorescente.
que
OPA
a
para
50°C
se
dar
un
= 438 nm, que sin embargo se
descompone rápidamente.
Inicialmente,
quisimos comprobar si eran ciertas las
observaciones de ambos autores.
ambiente no
se
calentar durante
observó
algún
Efectivamente,
reacción
tiempo,
alguna,
se
formó
presentaba una fluorescencia violeta,
a
temperatura
mientras
un
que
producto
al
que
por lo que se procedió a
optimizar las condiciones de formación de este compuesto.
III.2.2.- ESPECTROS DE EXCITACION Y EMISION
Se
preparó
una
disolución
concentración 2x 10" 4 M , tampón
que
contenía
bórico-borato
de
pH
cisteína en concentración 1x10"* M . La disolución se
a 60°C durante 75 min y, después de
enfriar,
se
los espectros de excitación y emisión frente a un
OPA
9.5
en
y
calentó
registraron
blanco
contenía OPA y tampón en las mismas concentraciones.
que
- 75 -
En
la
Fisura
1
se
muestran
los
espectros
excitación y emisión del producto formado por reacción
cisteína
con
el
OPA,
observándose
un
único
excitación a 364 nm y un máximo de emisión
Es
interesante
hacer
notar
experimentales utilizadas son similares a
Metz y col.
(e.g.
(107) en la formación
concentración
de
OPA
y
del
las
las
la
de
.
condiciones
empleadas
derivado
temperatura).
autores no indicaron con claridad el pH al
de
máximo
a 424 nm
que
de
OPA-cisteína
Aunque
que
por
estos
verifican
la
reacción de derivatización po st -c ol um na , es posible que sea pH
9-9.5, ya que preparan el reactivo OPA en tampón bórico-borato
de pH 10.5 y lo mezclan con el efluente en medio ácido débil.
Es
por
obtuvieran un
segundos,
lo
producto
tanto
de
reacción
que
estos autores
fluorescente
en
pocos
que a continuación se descompuso muy rápidamente.
diferencia entre
A«* y
fue
compuesto obtenido por Metz
trabajo
sorprendente
A A
;
60
nm
.
y
Los
col.,
A
a
s
82
mientras
estudios
que
nm
que
se
continuación tuvieron como objetivo encontrar las
óptimas para la obtención del derivado de cist eina,
su posible estructura.
para
en
La
el
este
muestran
a
condiciones
asi
como
- 76 -
O
300
400
500
X (nm)
Figura 1. - Espectros de excitación y emisión del producto de
reacción de la cisteína con el OPA en medio borico-borato
(pH
9.5), tras calentar 75 min a 60°C.
Ce i
•1
1
= 1x10"* M
;
Copa
= 2xl0“4 M
- 77 -
III.2.3.- OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES EXPERIMENTALES
1. -
Efecto.de la temperatura sobre la formación del derivado
Dado que la reacción
de
presenta una cinética muy lenta,
la
cisteína
con
conteniendo
cisteína
Para ello se
5x 10” a
bórico-borato de pH 9.5
OPA
se llevó a cabo un estudio de
la variación de la fluorescencia con el . tiempo,
distintas temperaturas.
el
M
,
calentando
prepararon
OPA
. El blanco se
a
disoluciones
2x10“ ®
M
preparó
y
de
tampón
la
misma
un
baño
forma pero en ausencia de cisteína.
Las
disoluciones
se
calentaron
termo st at ad o, sacando alícuotas a
dejarlas enfriar a 20°C
fluorescencia
( A«*
,
se
= 364 nm y
diversos
leyeron
A.«
en
tiempos,
las
y
tras
intensidades
= 424 nm) .
Los resultados se indican en la Figura 2 , donde
observa la notable
influencia
que
sobre la velocidad de la reacción.
se calienta a 50°C
, la
de
presenta
Asi,
fluorescencia
cuando
la
temperatura
la
aumenta
se
disolución
gradualmente,
alcanzándose una respuesta constante a partir de las 3-3*/a h
A menor temperatura,
mientras que a 60°C
formación,
la velocidad de la reacción es muy
, a pesar del aumento en la
el producto se descompone rápidamente.
baja,
velocidad
de
o
0
1
2
3
A
5
6
t
Figura 2. - Efecto de la temperatura sobre la
derivado de cistefna-OPA .
Cclstefna
— 5x10 ® M ¡ C o P A - 2x10 9 M
Temperatura: (1) 60° C ; (2) 50° C ; (3) 40°
C
7
(h )
formación
del
- 79 -
Por ello,
a 5 0 #C
tras
en las experiencias posteriores se trabajo
, calentando durante 3 x/a h . En estas
enfriar
intensidad
la
de
disolución
fluorescencia
a
durante
la
etapa
de
temperatura
permaneció
durante 3 h , como se muestra en
condiciones
la
estable
Tabla
calentamiento,
ambiente,
las
9.
al
Sin
la
menos
embargo,
variaciones
temperatura afectan notablemente a la reproducibilidad
y
,
de
por
lo que debe controlarse estrictamente la temperatura del baño,
que debe ser lo mas homogénea posible.
Tabla 9. C . i . t . f » .
Estabilidad
= 5x10"• M
t (min)
10
20
30
50
65
105
120
150
180
;
del
Cofa
compuesto
= 2x10"* M
I
r
53.2
52.7
52.6
52.3
52.7
53.1
53.8
53.1
53.2
formado
a
50°C.
- 80 -
2.-
Influencia de la acidez del medio
La
acidez
es
una
de
las
variables
controlarse en las reacciones en que interviene el
realizar este estudio se preparo
una
serie
de
conteniendo cantidades variables de HC1 y NaOH
un amplio intervalo de pH. La concentración
que
deben
OPA.
Para
disoluciones
, para
de
abarcar
cisteína
fue
1x10 “* M y la de OPA 1.5x10“ * M.
Los resultados se muestran en la Figura 3. Debido
la gran variación de la fluorescencia con el pH
un máximo
en
el
intervalo
de
pH
9.3-10
, que
,
es
a
muestra
necesario
amortiguar la acidez del medio.
Se
ensayaron
dos
sistemas
bórico-borato y bicarbonato-carbonato,
lecturas de fluorescencia en
eligió el primero,
ambos
amortiguadores:
obteniéndose las mismas
casos.
Sin
embargo,
por ser el habitualmente utilizado
en
se
las
derivatizaciones con OPA.
Se ha estudiado además la influencia de
iónica,
resultando que esta*
fluorescencia.
no
afecta
a
la
la
fuerza
intensidad
de
- 81 -
100
If
8 0
6 0
4 0
20
«----- 1 W
2
I
4
Figura 3. Influencia
cisteína con el OPA.
C
c
i
.
t
.
f
n
. = 1 . 0x1 0 "® M ;
t
6
I
,
i . l
8
del
C o p a
pH
sobre
10
la
= 1.5x10“ » M
,,
pH
l
12
reacción
de
la
- 82 -
3.-
Influencia de la concentración de o-ftaldehido
Otro
factor
importante
a
considerar
concentración de OPA. Para este estudio se preparo
de
disoluciones
conteniendo
9.9 x1 0" 7 M , tampon borato
y
cisteína
en
cantidades
es
una
la
serie,
concentración
variables
de
OPA,
procediendose de la forma habitual.
Dado que la disolución del reactivo
medio etanólico,
se
mantuvo
constante
alcohol para evitar variaciones en
la
la
se
prepara
en
concentración
de
constante
dieléctrica
del medio.
\
Los valores obtenidos se representan en la Figura 4,
resultando que a partir de una relación molar OPA/cisteína
de
2000 la fluorescencia
la
permanece
constante.
A
necesidad de utilizar un gran exceso de reactivo,
mismo es muy reducido,
det er m i n a n .
dado los niveles
de
pesar
de
el gasto del
cisteína
que
se
100
I
f
80 60 40 oo
co
20
-
0
0
2000
4000
OPA
CISTEINA
Figura 4. - Influencia de la concentración
de
sobre la reacción.
En
abscisas
se
representa
molar.
C« i ■ < t ( m
- 9 .9x10 ^ M
6000
o-ftaldehido
la
relación
- 84 -
III.2.4.- DETERMINACION DE LA ESTEQUIOMETRIA DEL
PRODUCTO DE
€*
REACCION DE LA CISTEINA CON O-FTALDEHIDO
Para
la
determinación
de
la
estequiometría
compuesto formado por reacción de la cisteína con el
utilizó el método de Asmus
de la recta" se
estabilidad,
aplica
(124).
Este método,
usualmente
a
OPA,
único
complejos
producto
se
llamado "método
de
mediana
pero presenta la limitación de ser útil
el caso de que se forme un
del
de
sólo
en
reacción.
El
método fue desarrollado para medidas espectrofotométricas.
Para aplicar el método de Asmus a una
reacción
del
t ipo :
C + n R ------- > P
se toman volúmenes constantes
del
[22]
compuesto
C
,
concentración a« y volúmenes variables del reactivo,
en concentración b»
, aforando a un volumen
partir de las expresiones de la
derivado y de los balances
de
constante
masa
para
v®
R
,
,
constante,
de
cada
formación
uno
de
en
v
,
V.
A
del
los
reactivos se llega a la expresión:
A/<S
[23]
[a* - A/£][R]n
- 85 -
siendo A la absorbancia en el máximo, <£. la absortividad
del
compuesto
P
, [R]
la
concentración
del
molar
reactivo,
correspondiendo n a la estequiometría de la reacción.
de R es grande frente a la de C,
Si la concentración
se puede considerar que
[R]
= b« y reordenando
los
términos,
se llega a la expresión:
1
J3n
a.b.v.d
=
-------------------
vn
1
x
V n+1
Por tanto,
[24]
—
A
la representación de l/vn para distintos valores de
n frente a 1/A permite conocer la estequiometría del
P, asi como
su
constante
de
formación,
ya
coincida con el coeficiente estequi om et ri co,
derivado
que
la
cuando
n
ecuación
se
fluorescencia,
se
ajustará a una recta.
Cuando se
puede
sustituir
absorbancia
por
realizan
medidas
en
la
expresión
la
intensidad
de
[24]
de
el
valor
fluorescencia
absortividad molar por la pendiente de la recta de
(Ir vs C< &•t * ín* )
de
la
y
la
calibrado.
Para determinar la estequiometría
cisteína y
OPA,
se
prepararon
del
disoluciones
derivado
que
de
contenían
cisteína en concentración 9.92x10“7 M , volúmenes variables de
una disolución de
OPA
7.6x10“*
M
y
tampón
bórico -b ora to ,
procediendo del modo habitual.
Los resultados aparecen representados en
5. Como se observa,
el derivado se forma por
mol de cisteína con un mol de OPA. La
la
reacción
ecuación
de
Figura
de
la
un
recta
obtenida fue
1
v
1
= -0.5362 + 60566 --If
r = 0.9996
A partir de la ordenada en el origen se encont ró un valor para
la constante de formación,
gran exceso de OPA
cisteína,
qüe
,
al
log
menos
=■ 3.0
2000
veces
serequiere para alcanzar
El hecho de
, lo que explica
superior
el
a
la
una señal constante.
que otros aminoácidos
que
no
contienen
el grupo tiol no conduzcan a productos fluorescentes con OPA
en ausencia de un tiol
externo,
indica
grupo tiol de la cisteína en la reacción.
descrito por nosotros
isoindol
por
Metz
(XLV),
y
es
muy
probable
la
Así,
que
con una estructura similar a
col.
(107)'
(D-penicilamina) (XLVIII).
para
la
implicación
el
del
compuesto
corresponda
la
,
al
identificada
^ ,^3-dimet i lcisteína
- 87
Las distintas
excitación y emisión
-
longitudes de onda de los
que
muestra
el
isoindol
máximos
de
respecto a los de los derivados de otros aminoácidos,
se observa para otros yG-aminot ioles
de
cisteína
también
(Tabla 10).
Tabla 10. - Longitudes de onda de excitación y emisión de los
isoindoles de diversos yO-aminotioles (107).
Estructura del
fmax)
fnm)
(max)
fnm)
338
438
356
438
331
446
348
448
o-ABT
372
440
CAET
346
446
Abreviatura
Estructura del
y3-aminotiol
r
SH
isoindol
i
BMEA
NH,
C
e
P
O
II
--- !
I
SH
-C -O H
ch3
H-j C
o
1—
j— C - O H
SH
NH,
,-------- 1—
SH
:-o
h
NH
CH-
\
D-PEN
c - o - chj - chj l -CEE
N-l
C-OH
C -O -C H .
NHj
«
:
SH
BMEA:
j8-mercaptoetilamina;
L-CYS:
cisteína:
D-PEN
D- pe nicilamina; L-CEE: hidrocloruro de L-cisteína etil
áster
O - A B T :o-aminobencenotiol; CAET: 2-ciclohexilaminoetanotiol.
- 88 -
A
irn
3
2
1
n=0.5
n=2
O
1
T- x 1 0 J
lF
Figura 5. - Determinación de la estequiometría
del
producto
de reacción entre la cisteína y el OPA. Método de Asmus.
C c i . t e f n .
=
9
.92x10"7 M
;
Copa
= 7.6x10"* M
- 89 -
III.2.5.- PARAMETROS ANALITICOS SIGNIFICATIVOS
1.- Curva de calibrado
Se obtuvo una
curva
de
calibrado
serie de disoluciones en tampon borato a pH 9.5
OPA en
concentración
4x10'®
M
preparando
,
y cantidades
disolución de cisteína 5.0xl0‘a M , y
una
conteniendo
variables
de
según
el
procediendo
método indicado.
En la Figura 6 se representa la curva de
obtenida,
observándose
hasta
una
concentración de cisteína de 2.5xl0~a M (300 ^ag/ml),
con
una
sensibilidad
recta
de
una
2.82 xl0 7
perfecta
linealidad
calibrado
La ecuación
de
la
de
calibrado es:
Ir = -0.076 + 2. 82x107 C . i . w f n .
Incrementando la concentración
intervalo de linealidad.
de
OPA
r = 0.999
puede
aumentarse
el
- 90 -
80
60
40
20
0
0
1
'
2
CISTEINA
Figura 6. - Gráfica de calibrado.
Cofa
=
4 x1 0-*
M
, pH
9.5
x 10*
3
(M)
- 91 -
2 .- Repetitividad
Se prepararon 10 disoluciones idénticas que contenían
cisteína 9.92xl0"T M y OPA 2.1x10'* M .
Las
calentaron a 50°C durante 3 x/a h y se leyó
fluorescencia para
A« *
A*»
= 364 nm y
disoluciones
se
intensidad
de
la
= 424 nm
.
En la Tabla 11 se muestran los resultados obtenidos.
El
método
presenta
una
buena
repeti ti vid ad ,
coeficiente de variación del 1.9% .
Tabla 11. - R e p eti ti vid ad .
C e t . t . f . .
= 9.92x10"7 M
Experiencia n*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
X
s
;
Cop a
= 2.1x10-* M
Ir
27.6
26.6
26. 7
27.5
27.7
26.9
27.7
27.3
26. 3
26.7
27. 12
0.52
siendo
el
- 92 -
III.2.6.- REACCION DE LA CISTINA CON O-FTALDEHIDO
Estudios previos pusieron de manifiesto
la cistina reacciona con el OPA en las
para la cisteína,
que
condiciones
se produce un compuesto
cuando
indicadas
fluorescente
cuyas
características espectrales son idénticas a las de la cisteína
( Aex
= 364 nm y
X.»
Cuando
= 424 nm
la
).
cistina
reacciona
OPA-ME se origina el derivado de la
condiciones reductores del medio.
con
el
reactivo
cisteína,
debido
En ausencia de
ME,
a
las
es
muy
probable que la cistina también reaccione con OPA para
formar
el derivado de cisteína.
La sensibilidad obtenida al
con OPA debería ser el doble
reducción fuera completa.
lineales aceptables
que
reaccionar
para
la
Se obtuvieron
curvas
la
siendo entre
veces la sensibilidad conseguida con la cisteína
mantuvo bastante reproducible). Por lo tanto,
la cistina es probablemente sólo parcial
medida
de
pequeñas
diferencias
experimentales de un día a otro.
en
y
cistina
cisteína,
(Figura 7) y sin embargo,
de un día a otro varió ampliamente,
la
de
si
la
calibrado
sensibilidad
0.25
y
1.6
( la cual
se
la reducción
de
depende
las
en
gran
condiciones
- 93 -
O
1
2
CISTINA
x10* (M)
Figura 7. - Gráfica de calibrado para cistina.
Cop a
= 4x10'* M , pH 9.5
Para averiguar si a mayores concentraciones
se llega a obtener
una
señal
reproducible,
influencia que la concentración
sobre la reacción con la cistina.
8,
el
comportamiento
cisteína,
produciéndose
es
de
dicho
se
de
estudio
reactivo
OPA
la
presenta
Como se observa en la Figura
radicalmente
inicialmente
distinto
un
aumento
al
de
de
la
la
- 94 -
intensidad de fluorescencia,
al incrementarse la concentración
de OPA y a continuación un rápido descenso,
relación OPA/cistina de ~ 500. Para una
de ~ 20000
la
fluorescencia
respecto del valor máximo.
a
partir
relación
disminuyó
a
la
una
OPA/cistina
sexta
Este comportamiento parece
que en presencia de grandes excesos de OPA,
de
parte,
indicar
tiene lugar alguna
reacción lateral que reduce la fluorescencia.
■■
'
I
0
5
.
- I
,
---------
10
, I.
15
(o p a /CISTINA) X
103
Figura 8. - Influencia de la concentración de
OPA
sobre
la
reacción de la cistina con el OPA. En abscisas se
representan
relaciones molares.
Ce 1
i t in • -
1 .0 x 1 0 ■ •
M
- 95 -
III.2.7.- REACTIVIDAD DE OTROS AMINOACIDOS CON O-FTALDEHIDO
1.- Ausencia de tiol
Para estudiar el comport amiento de otros aminoácidos
proteicos primarios frente al OPA en ausencia de un
prepararon
disoluciones
de
los
distintos
tiol,
aminoácidos
se
en
concentración 5x10"* M .
Disoluciones lxl0"a M de los
distintos
aminoácidos
se calentaron con OPA 2x10"* M en medio borico-borato
durante
3 1/a
h
fluorescencia para
a
50°C
A* *
En la Tabla
leyéndose
= 364 nm y
12
fluorescencia relativas
aminoácidos
,
se
a
estudiados.
la
En
comportamiento de la cistina,
A..
la
= 424 nm
muestran
las
cisteína
ella
para
cabe
que es el único
(pH 9.5)
intensidad
de
.
intensidades
los
de
distintos
destacar
el
aminoácido
presenta una intensidad de
fluorescencia
inferior al de la cisteína.
El resto de aminoácidos no parecen
reaccionar con el OPA en ausencia
temperatura ambiente,
de
apreciable,
que
tiol;
en presencia de ME,
sin
aunque
embargo,
la mayoría de
a
estos
aminoácidos reaccionan instantáneamente para formar isoindoles
fluorescentes.
- 96 -
Tabla 12. - Reactividad
ausencia de tiol.
C « B i n » i e i d o
- 1x10 ® M ¡
Aminoácido
Cisteína
Cistina
de
Cofa
Ir
100.0
53.8
otros
-
aminoácidos
con
OPA
2x10 * M
Aminoácido
Ir
Isoleucina
0.1
Serina
0.1
Histidina
1.3
Alanina
0.0
A c . Aspártico
1.1
Tirosina
0.0
Glutamina
0.8
Treonina
0.0
Triptof ano
0.4
Asparagina
0.0
A c . Glutámico
0.3
Valina
0.0
Glicina
0.2
Leucina
0.0
Fenilalanina
0.2
Lisina
0.0
Prolina
0.2
Metionina
0.0
Arginina
0.2
en
- 97 -
2.- Presencia de cisteína
Se
estudio
la
influencia
que
otros
aminoácidos
presentan sobre la reacción entre la cisteína y el
ello se
preparo
cisteína
lxlO~* M
una serie
2 xl 0~ e
M
y
otros
de
disoluciones
aminoácidos
OPA.
que
en
Para
contenían
concentración
, añadiendo sobre la mezcla de cisteína y aminoácidos
el reactivo OPA (2xl0“ * M) preparado en tampon bor ico -bo rat o.
A continuación,
que se cambio
disolución
de
el
orden
se realizo una segunda serie
de *adición.
cisteína
se
En
anadio
en
la
a
la
OPA
y
intensidades
de
este
el
caso,
reactivo
posteriormente la disolución de aminoácido.
En la Tabla 13
fluorescencia
se
presentan
correspondientes
a
las
la
primera
serie,
observándose como al añadir el reactivo OPA sobre la mezcla de
cisteína y otros aminoácidos,
de fluorescencia que
ausencia,
la
se obtiene una menor
producida
por
la
cisteína
existiendo así un efecto inhibidor de
del isoindol derivado de la cisteína.
La
desplazamiento de los máximos
no
la
en
la
de
naturaleza
observándose
espectrales.
su
formación
disminución
fluorescencia parece no depender tanto de
aminoácido como de su concentración,
intensidad
Nakamura
la
del
ningún
y
col.
(45) también observaron una disminución de la fluorescencia al
aumentar la concentración de
contenía cisteína y OPA
.
L-tirosina
en
una
mezcla
que
- 98 -
Tabla
13. Intensidades
de
fluorescencia
relativas
de
disoluciones preparadas por adición de OPA sobre una mezcla de
cisteína y otro aminoácido (el valor Ir = 100 se ha asignado a
una disolución de cisteína).
C
e1 i
tc
fn
« —2x10 *® M
= 2x10** M
5
C
i
i
l
n
e
t
e
l
d
o —1x10*® M
¡
C o p a
Aminoácido
Ir
Triptóf ano
71.3
Alanina
61.0
Tirosina
68.1
Treonina
60. 9
Serina
66.9
Histidina
60. 9
A c . Aspártico
66.7
Glutamina
60.7
Fenilalanina
64 .7
Isoleucina
55.2
Leucina
64.7
Lisina
55.0
Prolina
64.1
Asparagina
55.0
Met ionina
63.6
A c . Glutámico
54.7
Arginina
63.2
G1icina
49.7
Por
otra
parte,
Aminoácido
en
influencia del orden de adición,
la
Tabla
14
ír
se
observa
encontrándose que cuando
aminoácidos se añaden después de mezclar la
cisteína
con
OPA (orden 2) la fluorescencia disminuye en menor medida.
y col.
(10) observaron que la cisteína bloquea la reacción
la
los
el
Chen
de
- 99 -
otros aminoácidos con OPA. Asi,
al
cisteína con OPA
continuación
y
añadir
a
mezclar
produjo la reacción de esta ultima con el
en
primer
alanina,
reactivo
debido probablemente a que la cisteína desplaza al
reacción con alanina y OPA
fluorescente.
lugar
no
OPA-ME
ME
en
se
,
su
, originando un producto débilmente
La escasa fluorescencia del producto de reacción
de la cisteína con OPA-ME puede deberse más que a una falta de
reactividad,
a su rápida descomposición (10)(115).
Tabla
14. Intensidades
de
fluorescencia
relativas
de
mezclas de OPA , cisteína y otros aminoácidos (el valor
Ir
=
100 se ha asignado a una disolución de cisteína).
—
2 x1 0”®
= 2 x 1 0 ”» M
t • fn •
M
¡
C t a i n « « c l 4 *
-
1x10"®
M
•
Ir
Aminoácido
orden 1*
orden 2 b
Tirosina
68
100
Alanina
61
81
* El reactivo OPA se añadió sobre la mezcla de cisteína y otro
aminoácido.
k El aminoácido se añadió sobre la mezcla de cisteína y OPA.
- 100 -
En la
fluorescencia de
Figura
una
9
se
representa
disolución
de
la
intensidad
cisteína
de
2x l0“e M , en
presencia de OPA 2x10“* M y cantidades variables
de
Se observa cómo al incrementarse la concentración
alanina.
de
alanina
se produce una disminución lineal de la fluorescencia.
La pendiente de la recta de calibrado e s ^ - 3 x l 0 7 M
mientras que las rectas de
calibrado
determinación de cisteína muestran
correspondientes
pendientes
a
positivas
valores próximos a 3xl07 . Esto parece indicar la presencia
una reacción lateral,
donde por cada mol de
alanina
deja de formarse un mol de derivado fluorescente de
Debido al gran exceso de OPA existente en
probable que OPA y cisteína reaccionen
alanina.
tiol,
Así,
es posible que
la
el
de modo similar a como lo hace frente a
presencia de OPA a temperatura ambiente
producto formado no es
fluorescente.
fluorescencia indica así la
cisteína-OPA
y
la
La
descomposición
formación
alanina-OPA-cisteína.
(104),
simultanea
de
con
muy
la
como
taurina
en
sin embargo
el
disminución
del
del
es
comporte
la
con
cisteína.
medio,
se
la
añadida,
conjuntamente
cisteína
,
de
la
isoindol
de
isoindol
de
- 101 -
o
1¿L_________ i__________ I__________ I__________ L
0
1
2
AMINOACIDOx 10*
Figura 9. - Gráficas de calibrado: (1) Cisteína; (2) Cisteína
2x10"* M en presencia de cantidades variables de alanina.
C ofa
= 2x10-* M
III.3.- DETERMINACION DE CISTINA CON O-FTALDEHIDO
- 104 -
III.3.1.- INTRODUCCION
La cistina es uno de los aminoácidos
de determinar
en
los
fluidos
más
En
biológicos.
difíciles
determinadas
enfermedades se produce una
alteración de la concentración
cistina,
interesante desarrollar un
por lo que resulta
de análisis simple y selectivo,
de
método
con una sensibilidad adecuada,
que permita la determinación de este aminoácido.
La mayoría de
determinación
cisteína con
(126-127),
NaBH*
(130),
de
los
cistina
agentes
métodos
implican
reductores,
desarrollados
su reducción
como
tributilfosfina
(128),
ditiotreitol
(131-133)
sulfito
para
previa
(125),
mercaptoetanol
y
la
ditionito
a
KCN
(129),
(134).
continuación el grupo tiol se hace reaccionar con un
A
reactivo
colorimetrico adecuado.
En
otros
métodos,
previamente
al
espectrofotométrico, la cistina es oxidada a
generalmente con
ácido
tiempo de reacción
perfórmico,
(135-136).
La
sensible,
ácido
cisteico,
requiriendo
un
elevado
determinación
de
cistina
puede también realizarse sin transformación
su absorbancia en el UV (137),
procedimiento
alguna,
midiendo
sin embargo el método no es muy
ni selectivo.
En
este
capítulo
se
propone
un '
método
espectrofotométrico para la determinación de cistina con OPA.
- 105 -
III.3.2.- REACCION
DE
LA
CISTINA
CON
O-FTALDEHIDO
Y
MERCAPTOETANOL
En la bibliografía se encuentra que el derivado
forma la cistina con OPA en presencia de ME
obtenido
con
la
cisteína.
El
compuesto
coincide
es
que
con
el
escasamente
fluorescente.
En unas experiencias preliminares,
se
encontró
la cistina reacciona con el OPA en presencia de ME
(tampon bórico-borato) para formar un compuesto
un máximo de absorción en el UV. A
a
que
pH
9.5
que
presenta
se
muestran
continuación
los estudios realizados sobre el producto formado.
\
Con el fin de investigar el tiempo de formación
derivado obtenido por reacción de la
OPA-ME
, a temperatura ambiente,
cistina
asi como su
y
el
reactivo
estabilidad,
preparó una disolución conteniendo cistina 1.80x10"* M
1.22x10"* M
En otra
del
, ME 1.15x10'* M y tampón bórico-borato
,
(pH
se
OPA
9.5).
experiencia se observó el cambio producido al
añadir
H C 1 . Se leyó la absorbancia frente a blancos preparados en las
mismas condiciones pero sin cistina.
Las
disoluciones
de
cistina
en
presencia
reactivo OPA-ME son ligeramente
amarillas
espectro de la Figura 10.1
el que se observa
, en
con máximo a 330 nm y un hombro
sobre 390 nm
y
del
muestran
una
banda
el
- 106
-
2.0
300
400
500
Figura 10. - Espectro de absorción del producto
de
la cistina
con
el
reactivo
OPA-ME
en:
bórico-borato a pH 9.5 ; (2) Medio HC1 a pH<l.
Ce
1 1 1
im
= 1 .80x10 ~4 M ; C o p a
= 1 .22x10"3 M ; C u z
X
(nm)
de
reacción
(1)
Medio
= 1.15xl0-8 M
- 107 -
En
la
Figura 11
se
muestra
la
variación
absorbancia con el tiempo para el derivado de la
O P A - M E . Como se observa,
temperatura ambiente,
la
reacción
procede
de
cistina
la
con
rápidamente
a
alcanzándose la máxima absorbancia a los
4.5 min de efectuada la
mezcla.
Sin
embargo,
formado no es muy estable y un minuto después,
el
la
compuesto
absorbancia
empieza a disminuir.
02
10
0
t(min)
Figura 11. - Variación de la absorbancia
a
330
tiempo del derivado cistina-OPA-ME a pH 9.5 .
Ce i
■t
int
= 1.80x10“ 4
M
;
C o m
= 1.22x10'*
M
;
C h e
nm
con
el
= 1.15x10-*
M
- 108 -
Al añadir HC1 al derivado formado a pH 9.5 hasta
pH
< 1 , el espectro de la disolución se modifico
(Figura
10.2),
produciéndose
330
,
la desaparición
del
máximo
a
nm
presentaba el compuesto en medio borico-borato y la
de unas nuevas bandas a 440 nm y 510 nm
color de la disolución a rosa.
Las
, con
un
formación
cambio
disoluciones
muestra
correspondiente a una serie de
una
gráfica
disoluciones
contienen OPA y ME en medio borico-borato,
procedimiento descrito anteriormente.
de
de
calibrado
cistina
lineal de la absorbancia
La ecuación
concentración
de
cistina
de
la
es:
observo
a
que
preparadas según el
A = -0.015 + 4.37x10* C
c
i
.
t
i
»
.
Al acidificar se
.
La absorbancia se leyó a
330 nm a los 5 min de' efectuada la mezcla.
recta de calibrado obtenida
del
acidificadas
mantienen su absorbancia constante al menos durante 20 min
La Figura 12.1
que
510
también
nm
,
al
(Figura 12.2),
intensidad de la banda a 440 nm
r = 0.998
una
incrementarse
la
mientras
la
permanecía
ecuación de la recta de calibrado obtenida
dependencia
a*
que
constante.
510
nm
es
La
la
sigui ent e;
A = -0.023 + 1.36x10* C c i - t m
r = 0.999
- 109
Sin embargo,
puesto que
control del tiempo de reacción,
-
es
necesario
un
estricto
la reacción de la cistina
el reactivo OPA-ME no es adecuada para
el
desarrollo
de
con
un
procedimiento analítico para determinar cistina.
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1
2
CISTINA
x 10‘
(M)
Figura 12. - Curvas de calibrado en: (1) Medio
borico-borato
a pH 9.5 ( A = 330 n m ) ; (2) Medio HC1 a PH< 1 (
- 510 nm ).
X
C
opa
=
1.22xlQ-3 M ; C h e
= 1.15xl0"3 M
- 110 -
III.3.3.- REACCION DE LA CISTINA CON O-FTALDEHIDO EN AUSENCIA
DE MERCAPTOETANOL
En
el
apartado
anterior
encontramos
concentraciones inferiores a 1-2x10"® M
embargo,
para
cisteína.
dando lugar
, previsiblemente un isoindol.
concentraciones
reacción es un derivado
para
, la cistina reacciona
con OPA sin necesidad de la adición de un tiol,
un derivado de cisteína-OPA
que
superiores
distinto
al
A continuación se muestran
el
obtenido
una
a
Sin
producto
de
a
de
serie
partir
de
estudios
sobre el compuesto obtenido.
1.- Espectros de absorción
Se
preparé
borico-borato a pH 9.5
una
disolución
en
medio
tamponado
, con concentraciones de cistina y
OPA
2 x l0 "4 M y 4x10"® M, respectivamente.
La disolución se calentó
a 60°C durante
enfriada
ambiente,
30
min
y
una
vez
a
temperatura
se registro el espectro de absorción y
absorbancia frente
a
un
blanco
preparado
Igualmente,
se
obtuvo
el
se
en
leyó
la
ausencia
de
cistina.
espectro
del
formado tras acidificar la disolución anterior con
producto
HC1
hasta
pH < 1 , así como los espectros correspondientes a los blancos
en medio borico-borato
y
en
medio
ácido,
conteniendo
OPA
- 111 -
4x 10“ 3 M (2 mi de disolución etanólica de OPA 5 x l 0 “a
M
a
25
mi). En este ultimo caso se midió la absorbancia frente a una
disolución que contenía 2 mi de etanol y tampón
borico-borato
en 25 mi de agua.
En la Figura 13 aparecen los espectros del OPA tanto
en medio borico-borato
(espectro
1),
como
en
medio
ácido
(espectro 2). En ambos casos los espectros muestran bandas
el UV sobre 260 y 300 nm
En
la
.
Figura
14
Jse
muestran
los
espectros
absorción del producto de reacción de la cistina con OPA.
se observa en dicha figura,
borico-borato
sobre 335 nm
que presenta
el
compuesto
(espectro 1) presenta
. La pequeña,
el
OPA
en
a
pero no
esta
una
formado
banda
de
despreciable,
longitud
de
en
de
Como
medio
absorción
absorbancia
onda
indica
la
necesidad de utilizar blancos que contengan este reactivo.
Por
disoluciones
otra
parte,
obtenidas
al
a
acidificar
pH
9.5
intensificación de su color amarillo,
una nueva banda a
440
nm
(Figura
,
con
se
HC1
las
observó
la
debido a la aparición de
14.2).
La
acidificación
originó al mismo tiempo la disminución de la absorbancia a 335
nm
. En
este
caso
las
medidas
realizar frente a blanco agua,
del OPA a 440 nm
.
de
debido a
absorbancia
la
nula
se
pueden
absorbancia
- 112
-
0.8
I
200
300
1__JL
400
X (n m )
Figura 13. - Espectros de absorción del OPA en
borico-borato a pH 9.5 ; (2) Medio HC1 a pH< 1 .
C
opa
= 4x10"8 M
(1)
Medio
- 113 -
6
0.8
3 0 0
4 0 0
5 0 0
X(nm)
Figura 14. - Espectros de absorción del producto de
reacción
de la cistina con el OPA en
ausencia
de ME
en:
(1)
Medio
bórico-borato a pH 9.5 ; (2) Medio HC1 a pH< 1 .
C
= 2x10"4 M ; C o p a
= 4x10-® M
- 114 -
2. - Optimización de las condiciones experimentales
a ) Estabilidad del compuesto formado en medio borico-borato
Con el fin de investigar el tiempo y
óptima de formación del compuesto obtenido,
la
al
reaccionar
cistina y el OPA en medio borico-borato a pH 9.5
la variacidn de la
temperaturas.
absorbancia
Para ello se
con
el
prepararon
, se
tiempo
a
diversas
conteniendo una concentración de cistina
4x10"* M
temperatura
la
estudio
distintas
disoluciones
2.92x10"4
, y se calentó a distintas temperaturas.
M
y
OPA
Tras enfriar
se leyd la absorbancia a 335 nm a tiempos variables.
Los resultados aparecen representados en
15
, donde se observa
como
al
aumentar
produce un aumento de la
velocidad
temperatura de 60 °C
absorbancia
la
de
la
la
la
Figura
temperatura
reacción.
permanece
A
constante
se
una
a
partir de los 30 min
; con temperaturas inferiores se requiere
un
de
mayor
tiempo
estabilización
superiores
de
la
calentamiento
señal,
mientras
para
que
alcanzar
la
temperaturas
(70 °C) no afectan prácticamente ni a la
velocidad
de la reacción, ni a la estabilidad de las disoluciones.
- 115
-
Las disoluciones obtenidas por calentamiento
durante 30 min
, y enfriadas a temperatura ambiente,
prácticamente inalterado el valor de
largo tiempo,
la
a
60°G
mantienen
absorbancia
durante
observándose a las 24 h un descenso de tan
sólo
un 5 % .
A
la
vista
de
los
resultados,
se
elige
condiciones óptimas de trabajo el calentamiento a
menos durante 30 min
60-70°C
como
al
.
0.9
-o
0.6
0.3
3
t (h)
Figura 15. - Efecto de la temperatura sobre la reacción de la
cistina con el OPA en medio b órico-borato.
Gelatina
= 2.92x10"* M ; C o p a = 4 x l 0" 3 M
Temperatura: (1) 60°C ; (2) 50°C ; (3) 40°C
; (4) 20° C-
- 116 -
b ) Influencia de la concentración de o-ftaldehido
Se estudió la influencia de la concentración de
para dos niveles de concentración de
2.85xl0-4
M
.
Para
ello
se
cistina:
prepararon
OPA
5.7xl0~s
dos
M
series
de
disoluciones que contenían cantidades constantes de cistina
de tampón bórico-borato y cantidades
disoluciones se mantuvieron en
un
variables
baño
de
OPA.
termostatado
y
y
Las
a
una
temperatura de 60 °C durante 30 min y se leyó la absorbancia a
temperatura ambiente a 335 nm
.
Los resultados se representan en la Figura 16
ella se observa que es necesaria una concentración de
menos 25 veces superior a la de cistina para que
la lectura de absorbancia constante.
.
En
OPA
al
obtener
una
- 117
-
2.0
0.8
0A
■Cr
0
20
40
60
OPA
80
cistina
Figura 16. - Influencia de la concentración de OPA a pH 9.5
En abscisas se representan relaciones m o l a r e s .
Cci.tin.:
(1) 5.7x10"5 M ; (2) 2.85x10-* M
.
- 118 -
c ) Influencia del pH
Se preparó una
serie
de
disoluciones
concentraciones de cistina 2.92xl0~4 M
diferentes valores de
citrato,
fosfato
y
pH
,
borato
ajustados
de
fuerza
y
OPA
con
conteniendo
7.9xl0-4 M , a
HC1
iónica
y
tampones
0.1
M
Se
calentaron a 60 °C durante 30 min
, leyéndose la absorbancia a
335 nm
disoluciones
una
vez
enfriadas
las
a
temperatura
ambiente.
Los resultados se representan en la
Figura
17.
La
reacc ion de la cistina con OPA depende acusadamente del PH del
medio . Se observa la máxima absorbancia en el intervalo de
PH
9.2-9 .7 . Una disminución del pH da lugar a un descenso de
la
señal analítica,
que llega a anularse a pH
m o d o , pH superiores conducen a
<
absorbancias
3
.
De
menores.-
igual
En
lo
suces ivo se lleva a cabo la reacción entre la cistina y el OPA
a pH 9.5- 9.6 amortiguado con tampón bórico- b o r a t o .
La disminución de la efectividad de la reacción entre
el
OPA
y
los
probablemente
aminoácido,
aminoácidos
con
la
a
pH
protonación
cuyo log K es v 9.5
<
9.2
del
grupo
. Sin embargo,
explicar por que disminuye la absorbancia a
correspondería a la protonación de otro grupo
log K > 11.0
(41).
está
pH
asociada
amino
del
resulta difícil
>
10
,
ionogénico
que
con
- 119 -
0.9
0.6
3
0
0
2
4
Figura 17. - Influencia
cistina con el OPA.
Cei.tim
= 2 .92x10" 4 M
;
6
del
C o p a
pH
8
sobre
= 7 .9x10 “4 M
la
10
,
,
12
pH
reacción
de
la
- 120 -
d ) Efecto de la adición de ácido
En la Figura 14 se puso de manifiesto
de una banda a 440 nm en el espectro obtenido
la
en
aparición
medio
HC1.
Este máximo puede tener Ínteres analítico debido a la ausencia
de esta banda en otros aminoácidos.
En
este
apartado
se
realiza
un
estudio
de
la
influencia de la acidez sobre el producto que forma la cistina
con el OPA a pH
obtenido en medio
9.5
.
Para
tamponado
60 °C durante 30 min
.
Una
ello
se
parte
borico-borato
tras
vez
la
enfriada
temperatura ambiente se acidifica con
HC1
de cistina es 9.07xl0"8 M y la de OPA
4x10“ * M
En las Figuras 18 y 19
obtenidos
a
distintos
del
valores
.
compuesto
calentar
a
disolución
a
La concentración
se
muestran
de
pH
,
los
espectros
observándose
una
disminución gradual de la banda a 335 nm y un incremento de la
banda a 440 nm a medida que disminuye
el
observan dos puntos isobesticos hacia
pH 6 ( X = 355 nm ) y 3 (X
= 400 nm),
que corresponderían a distintas
compuesto formado
a
pH
9.5
(ver
pH
. Asimismo,
protonaciones
apartado
intensidad de la banda a 440 nm obtenida a pH
III.3.6.c).
<1
menor que la banda a 335 nm en medio borico-borato.
es
un
se
del
La
20%
- 121
-
A
0.8
0.6
300
400
500
X (nm)
Figura 18. - Efecto de la adición de ácido sobre el
formado por reacción de cistina y OPA a pH 9.5 .
Ceiittm
= 9.07xl0"5 M ;
PH: (1) 7.25 ; (2)
(6) 4.04
6.49
Copa
producto
- 4x10 “ 3 M
; (3) 6.12
; (4) 5.58
; (5) 4.70
;
- 122
-
A
0.8
0.6
0.4
300
400
500
X (nm)
Figura 19. - Efecto de la adición deácido sobre
el
formado por reacción de cistina y OPA a pH 9.5 .
Ce
1 1 1
in • = 9.07x10" 6 M ; C o p a
PH : (1) 4.70
(6) 1.65
; (2). 4.04
producto
= 4x10-® M
; (3) 3.29
;
(4) 3.05 ; (5)
2.62
;
- 123 -
Al aumentar nuevamente el pH se vuelve a obtener
espectro del compuesto formado a pH 9.5
es distinto al
OPA-ME
, en
observado
los
que
con
la
los
adición
destrucción irreversible
del
. Este
comportamiento
isoindoles
de
un
isoindol.
derivados
de
origina
la
ácido
Es
compuesto formado al acidificar un isoindol
el
posible
que
el
coincida
con
el
producto OPA-amina obtenido en ausencia de ME (19).
En la
Figura
20
absorbancia a 440 nm frente
se
representan
los valores
al pH. Se observa que a valores
pH inferiores a 1 la absorbancia permanece constante,
que al aumentar el
pH
la
extinguirse en medio neutro.
señal
disminuye,
de
de
mientras
no llegando
A pH < 1 la absorbancia a 440
a
nm
permanece inalterada durante varias horas.
0.4
0.3
0.2
0.1
o
1
Figura 20.
el pH.
C c i . t i n .
2
3
5
- Aumento de la absorbancia a 440 nm al
= 9.07x10-* M ;
C o p a
= 4xl0'a M
disminuir
- 124 -
3.- Parámetros analít icos significativos
En
linealidad,
este
apartado
límites
se
de
muestra
el
detección
correspondientes a la determinación
de
intervalo
de
repet itividad
y
cistina
OPA
con
en
medio borico-borato y después de la adición de HC1 has t a pH <1.
a ) Curvas de calibrado
Medio borico-borato
Se preparó una
borico-borato de
pH
variables de cistina,
serie
9.5
de
, .OPA
disoluciones
8.75x10"*
M
con
y
cant idades
procediendo del modo habitúa 1.
la absorbancia de las disoluciones a 335 nm
tampón
Se
.
En la Figura 21 se muestra cómo evoluciona la
a 335 nm con la
concentración
ligero desplazamiento
de
cistina,
hipsocrómico
para
leyó
banda
observándose
un
concentraciones
de
cistina mayores de 1.3 xl0~4 M .
Al representar la absorbancia a 335 nm frente
concentración de cistina
curvatura,
que se
(Figura 22)
acentúa
para
superiores a 1.5xl0-4 M (36 jig/ml)
se
observa
concentraciones
. El ajuste
de
una
de
la
ligera
cistina
los
hasta esa concentración conduce a una recta de ecuación
A= -0.016 + 4.54x10* Cci.tin
a
datos
:
r = 0.999
- 125
-
1.2
0.4
400
X (nm)
500
Figura 21. - Efecto de la concentración de cistina
sobre
el
espectro
de
absorción
del derivado
de
OPA en
medio
borico-borato .
Copa
= 8.75xlC>-3 M
C o i i t i m (M) : (1) 3 .6x10 "6
; (2) 5.4x10-* ;
(4) 9.1x10-* ; (5) 1.09x10-“ ;(6) 1.27x10-“ ;
(8) 1.63x10-“ ; (9) 1.81x10-“
(3) 7.3x10-*
;
(7) 1.45x10-“ ;
- 126
-
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
2
CISTINA x
10*
(M)
gura 2 2 . - Gráfica de calibrado en medio borico-borato.
Copa
= 8.75xl0~3 M
- 127 -
Medio ácido
Las disoluciones anteriores
con HC1 hasta pH<l
(pH 9.5) se acidificaron
, obteniéndose los espectros
mostrados
en
la Figura 23.
En la Figura 24.2 se representa la absorbancia
nm frente a la concentración de cistina.
La
ecuación
a
440
de
la.
recta de calibrado es:
A = -1 .1x10“ * + 3.8“3 x l O * C « t . t m .
r = 0.999
La linealidad en este caso se amplia al menos hasta 1.9x10"4 M
(45 jag/ml), si bien la sensibilidad disminuye ligeramente
3.83x10a
frente
a
un
borico-borato)(Figura 24).
&
=
4.54x10*
obtenido
en
( £- =
medio
- 128
-
1.6
400
X (nm)
50°
Figura 23. - Efecto de la concentración de cistina
espectro de absorción del derivado con OPA a pH<l .
C opa
sobre
el
= 4x10'* M
Cci.tin. (M) : (1) 3.6x10"6 ; (2) 5.4x10-* ; (3)
7.3x10-*
;
(4) 9.1x10-* ; (5) 1.09x10-“ ; (6) 1.27x10-“ ; (7) 1.45x10-“ ;
(8) 1.63x10-“ ; (9) 1.81x10-*
O
4
8
CISTINA
Figura 24.
borato
(
A
C o p a
- Gráficas de
calibrado
en:
= 335 n m ) ; (2) pH < 1 (HC1) (
= 4x10"» M
X
12
*10*
16
(M)
(1)
Medio
borico= 4 4 0 nm).
- 130 -
b ) Limites de detección y determinación
En este apartado se halla la concentración mínima de
cistina que
puede
detectarse
procedimientos propuestos.
y
determinarse
mediante
Para ello se prepararon dos
de 10 disoluciones conteniendo OPA en concentración
(1 mi de disolución etanolica 5xl0'2 M a 25
serie se preparo en
segunda
añadiendo
continuación
HC1
tampon
borico-borato
primeramente
concentrado
absorbancia a 335 y 440 nm
mi).
,
tampon
hasta
de
los
series
2x 10 "8
La
primera
9.5
y
la
borico-borato
y
a
pH<l
pH
M
.
Se
respectivamente,
midió
frente
la
a
un
blanco que contenía tampon y 1 mi de etanol.
Los resultados se muestran en la Tabla 15 . El limite
de detección se ha calculado según el
3s ,
criterio
mientras
que el límite de determinación se halló para lOs.
Los
valores
detección fueron
encontrados
los
: 8.39 xl0 '7 M (0.20 pg/ml)
5.54xl0"7 M (0.13 p g / m l ) a 440 nm
determinación:
para
,
y
para
2.74x10"* M (0.67 p g / m l ) y
pg/mi), respectivamente.
a
límites
335
los
nm
de
y
de
límites
de
1.85x10'*
M
(0.44
- 131 -
Tabla 15. - Cálculo del limite de detección.
Absorbancia de disoluciones de OPA.
Experiencia n*
pH = 9.5
1
0.028
0 .005
2
0.025
0 .005
3
0.024
0 .006
4
0.024
0 .005
5
0.024
0.005
6
0.024
0.006
7
0.024
0.007
8
0.024
0.005
9
0.024
0.005
10
0.025
0.006
s
,
pH <1
0.0013
7. 0x10"4
- 132 -
c ).Repetítividad
Para este estudio se prepararon independientemente 10
disoluciones idénticas de cistina y OPA en medio borico-borato,
y a pH<l
. La concentración de cistina fue 1.3x10”4 M y la
de
OPA 4x 10” * M .
En la Tabla 16 se muestran los resultados
tanto en medio borico-borato
(A
r 440 n m ) . El
siendo los
método
coeficientes
(
A
= 335 nm) como en
presenta
de
una
variación
buena
del
obtenidos
medio
repet
0.5%
HC1
itiv i da d,
y
1.0%
respectivamente.
Tabla 16. - Repetítividad en medio borico-borato y
medio H C 1 .
Ceiitui
= 1. 3x 10"4 M
;
C o f a
= 4x10"* M
Experiencia n*
pH = 9.5
pH < 1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.613
0.617
0.610
0.614
0.609
0.617
0.609
0.616
0.610
0.611
0.479
0.484
0.477
0.472
0.471
0.481
0.480
0.472
0.482
0.471
x
0.613
0.477
C V (%)
0.5
1.0
en
,
- 133 -
4.- Estudio de interferencias
Se estudio el efecto de la
aminoácidos
norleucina,
cistina.
proteicos
presencia
primarios,
citrulina y norvalina,
Para ello se preparo
junto
serie
distintos
con
sobre la
una
de
ornitina,
determinación
de disoluciones que
contenían cistina 1.3x10“4 M junto con otros aminoácidos,
2x10“ 3 M y tampán borico-borato
(pH 9.5).
de
OPA
Las disoluciones
se
calentaron durante 30 min a 60 °C y se midió la absorbencia
335 nm a temperatura ambiente;
a
posteriormente se acidifico con
HC1 hasta pH <1 y se leyó la absorbencia a 440 nm
.
Otros aminoácidos reaccionan con el OPA a
dando lugar a bandas de absorción a
335
nm
pH
(Figura
9.5
,
25).
A
pesar de que las absortividades molares son en general menores
que la de la cistina
227
;
ácido
( e.g.
glutámico,
fenilalanina, £
= 839
serina, ¿ = 137
£
=
444
;
;
isoleucina, <£
tirosina,
£
=
=
597
;
), estas son lo suficientemente elevadas
para producir errores
Además,
la
absortividad
molar de algunos aminoácidos es similar a la
de
la
Así,
en la
importantes.
determinación
de
cistina
en
cistina.
presencia
de
una
concentración de alanina 1.5 veces mayor, el error fue del 250%
asimismo,
error
con una
fue
del
relación molar
108
%y
con
glicina/cistina
una
relación
triptofano/cistina de 2, el error fue del 120%
.
de
3,
el
molar
;
- 134
-
0.8
0.6
0.4
0.2
0
300
400
500
Á.(nm)
F igura
2 5 . - Espectros
de
absorción
de
disoluciones
glicina y OPA en: (1) Medio bórico-borato; (2) Medio ácido.
Copa
~
2X 10 ~ 8
M , Cgiicin*
=
2 . 4 x 10 “ 4 M
de
- 135 -
£1 procedimiento en medio ácido
puesto que el
único
aminoácido
que
absorción a 440 nm es la cistina.
es
más
presenta
selectivo,
la
banda
Los espectros de la
de
mayoría
de los aminoácidos proteicos primarios no experimentan
cambio
alguno al disminuir el pH del medio.
anchas
No obstante,
las
bandas de absorción a 335 nm llegan a solaparse con
de la cistina a 440 nm
, interfiriendo
en
la
la
banda
determinación
(Figura 25) .
En la Tabla 17 se
interferencia/cistina
para
indican
las
las
cuales
relaciones
el
error
molares
en
la
determinación de cistina a 440 nm es menor del 6 % .
Debido al aumento de
acidificar
la
disolución
aminoácido interferente
de
la
línea
cistina
base
en
(la absorbancia no
producido
presencia
llega
a
absorbancia
a
aminoácido,
frente
cistina.
440
y
al
600
nm
valor
comparando
(ver
de
la
Figura
esta
diferencia
26)
diferencia
del
anularse
incluso a longitudes de onda muy alejadas del máximo e.g.
nm) , los errores se calcularon
al
para
para
600
de
cada
la
- 136 -
Tabla 17. - Efecto de otros aminoácidos en
de cistina a pH<l*.
Aminoácido
Relación mo la r1
Aminoácido
la
determinación
Relación mo l a r b
Cisteína
0.2
Leucina
4.0
Ornitina
0.3
Valina
4.7
Norleucina
0.6
Tirosina
5.8
Histidina
1.0
Glicina
6.0
Triptóf ano
1.2
A c . Aspártico
7.0
Lisina
1.5
Treonina
7.5
Arginina
2.0
Metionina
8.0
Fenilalanina
2.0
Prolina
12.0
Alanina
2.3
Isoleucina
12.5
Citrulina
2.7
A c . Glutámico
12.5
Glutamina
3.0
Serina
25.0
Norvalina
3.5
Taurina
30.0
Asparagina
3.5
* Cciitin* “ 1.3x10 * M
b Relación molar aminoácido/cistina
relativo < 6% .
que
produce
un
error
- 137
-
2.0
A
0.8
0 .4
300
400
500
600
X(nm)
F igura
26. - Espectros
de
absorción
de
cistina y OPA en presencia de fenilalanina:
(1) Medio bórico-borato ; (2) Medio ácido.
Ccistino
= 1.3x10“4
M
;
C
o p a
—
2x10“ 3
M
disoluciones
de
- 138 -
Algunos
aminoácidos
como
la
alanina,
lisina e histidina dan lugar a coloraciones
presentando una banda de absorción con
ornitina,
(rosa a
violeta),
X a a x > 440
nm
,
interfiere gravemente en la determinación de cistina.
la coloración
violeta
bori co- bor ato ,
que
presenta
la
ornitina
se vuelve naranja a los
pocos
que
Además,
en
medio
minutos,
y
roja al acidificar.
Existen referencias sobre la formación
coloreados con OPA en medio fuertemente ácido u
de
productos
orgánico,
algunos aminoácidos como glicina,
triptofano y arginina
142),
(143).
así como taurina y tiramina
con
(138-
Algunos aminoácidos precipitan por la adición de HC1
por encima de una cierta concentración:
histidina,
citrulina,
glutamina,
cisteína,
glicina,
tirosina,
y metionina. Para la mayoría de estos aminoácidos,
de
interferencia
precipitados,
que
viene
fijado
probablemente
reacción del OPA con la cistina.
de surfactantes como el SDS
X-100
evito
exist i en do .
la
por
la
norvalina,
isoleucina
el
aparición
absorban
Sin embargo,
el
la
de
los
producto
de
aunque el empleo
(dodecilsulfato sodico)
precipitación,
límite
interferencia
o
Tritón
siguió
- 139 -
Una de las interferencias más graves
cisteina,
debido
instantáneamente
coloraciones,
a
un
que
al
es
acidificar
precipitado,
que
se
presenta
de
aunque éstos no afectaron a la determinación
de
cisteína
siguió
de
proporcionando
absorbancia inferiores a los hallados
en
su
la
produce
distintas
dependiendo de la concentración de cisteina.
precipitación se evito utilizando surfactantes,
presencia
la
sin
La
embargo,
cistina,
la
valores
de
ausencia,
para
concentraciones superiores a 2.6xl0~5 M .
El
método
suficientemente
propuesto
selectivo
para
no
es
permitir
directa de cistina en fluidos biológicos,
tras una separación cron^atográf i c a .
probablemente
la
lo
determinación
pero puede ser
útil
- 140 -
5.- Analisis de cistina en un preparado farmacéutico
Se aplico el método propuesto
de
determinación
de
cistina a un preparado del laboratorio La Química Medica S. A.
(Barcelona),
en forma de comprimidos,
comprimido de 250 mg de cistina,
Este medicamento está indicado
con un valor nominal por
en presencia
para
afecciones
exista un déficit de azufre como alopecias
acné,
eczemas
psoriasis,
seborreicos,
de
excipiente.
en
las
difusas,
enfermedades
de
que
peladas,
las
uñas,
etc.
Par^a
determinar el contenido en cistina
se
disolvió
un comprimido
( ~ 350 mg ) en HC1
1 M , se filtro para separar
el excipiente
y se aforo a 500 mi
; a continuación
25 veces.
muestra,
En aforados
de
25
mi
se
se
introdujeron
2
diluyo
mi
de
tampón borico-borato y OPA en concentración 6 x1 0“ * M.
La determinación se
adición estándar,
crecientes
de
una
añadiendo
hizo
sobre
disolución
de
siguiendo el procedimiento habitual.
aplicando
la
el
muestra
cistina
método
cantidades
8.7 9xl0"4
M
y
Las medidas se realizaron
en medio bórico-borato midiendo la absorbancia a 335 nm
En la Figura 27 se muestra la aplicación del
de adición estándar a la determinación de
cistina.
obtenido fue 250.4 mg frente a los 250 mg
declarados
f a b ri ca nt e.
de
El
.
método
valor
por
el
- 141 -
0.4
0
1
CISTINA x 10*
Figura 27. - Método d© adición
estándar.
contenido en cistina de un comprimido.
C o p a
-
6x10“ ® M
Determinación
(M
del
- 142 -
6.- Estructura del producto de reacción
a ) Reacción de la cisteína con o-ftaldehido
En la bibliografía se indica que cuando
reacciona con OPA en presencia de ME
a cisteína,
siendo el producto
ci ste ína-OPA.
En
de
ausencia
la
cistina
, se produce su reducción
reacción
de
un
derivado
mercaptoetanol ,
de
para
concentraciones de cistina menores de l-2xl0_e M , también
se
forma
su
un
derivado
concentración
es
de
un
cisteína muestran un
cisteína.
orden
de
Sin
embargo,
magnitud
comportamiento
muy
cuando
mayor,
cistina
distinto.
En
apartado se estudia la reactividad de la cisteína con
el
y
este
OPA
en las condiciones de determinación de la cistina.
En primer lugar, se obtuvo el espectro
del
de reacción de la cisteína con el OPA (en relación
presenta una coloración verde.
producto
1:1),
que
En la Figura 28 se muestran los
espectros de absorción de los derivados de cistina y
en medio borico-borato, que son claramente distintos,
cisteína
por
lo
que puede afirmarse que corresponden a distintos productos
de
rea cc ió n.
2.0
A
1.2
143
0.8
0.4
300
400
500
600
700
A (nm)
F igura 2 8. - Espectros
de
absorción
de
los
productos
de
reacción de la cistina (1) y cisteína (2)
con OPA
(relación
1:1)
a PH 9 . 5 .
- 144 -
Se observo,
por otra parte,
que
al
acidificar
la
disolución de cisteína y OPA
, se produce la precipitación del
producto de
presenta
(verde,
reacción,
violeta
y
que
marrón),
distintas
dependiendo
de
coloraciones
la
relación
Con el fin de investigar si es posible la
formación
OPA/c i s t e i n a .
de un derivado cisteína-OPA estable,
se realizo un estudio
la influencia de la concentración de OPA
. Sin
embargo,
se observa en la Figura 29, al reaccionar la cisteína
(hasta
al
menos
una
al
aumentar
relación
la
molar
como
con
el
,
el
OPA en medio bo ri c o - b ó r at o, tras calentar 30 min a 60°C
espectro se modifica
de
concentración
de
OPA
OPA/cisteína
de
50),
existiendo un cambio muy notable en la forma del espectro para
concentraciones bajas de OPA.
- 145
-
A
400
X (nm)
Figura 29 . - Influencia de la concent rae ion
producto de reacción de
la cisteína.
Cctsttfnt
— 5x10
de
500
OPA
el
* M
(M) : (l) 5x10'* ( 1 : 1 ) ; (2) 2.5x10-* (1:5) ;
(1:10) ; (4) 1.25x10"2 (1:25) ; (5) 2.5xlQ-2 (1:50)
Copa
sobre
(3)
5xl 0*3
- 146 -
b ) Determinación de la esteguiometria
Para
producto de
método
la
determinación
de
la
estequiómetría
del
reacción de la cistina con el OPA se aplico
de
Asmus,
apartado III.2.4
según
el
procedimiento
indicado
el
en
el
.
Para ello se preparo una serie de
disoluciones
que
contenían tampón borico-borato, cistina 5.7xl0“6 M y volúmenes
variables de una disolución de OPA 3.8x10“® M
un volumen final de 25 mi
, llevándolos
a
disoluciones
a
. Se calentaron las
60°C durante 30 min , leyéndose la absorbancia a 335 nm
En la Figura 30
se
representa
la
método de A s m u s , observándose como el compuesto
.
aplicación
coloreado
forma por reacción de un mol de cistina con dos moles de
La ecuación
del
se
OPA.
de la recta obtenida fue:
1/v® r -1.355 + 0.32
(1/A)
r = 0.998
Conocida la estequiómetría del derivado,
conocer un valor
aproximado
acumulada, a partir de la
obtenido fue
de
ordenada
:
log
= 7.7
su
constante
en
el
de
origen.
es posible
formación
El
valor
- 147
-
n =3
n=2
n=1
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
7
8
A
F igura
30. - Determinación
de
la
estequiometría
reacción de la cistina con OPA . Método de Asmus.
Cciatio.
=
5
.7x1 0 ~ 6 M ;
C opa
=
3
.8x10 * 3 M
de
la
- 148 -
c ) Carácter ácido-base del producto de reacción
En el apartado III.3.3.1 se puso
de
manifiesto
la
producto
de
aparición de una banda a 440 nm al acidificar el
reacción de la
Asimismo,
cistina
con
el
OPA,
formado
a
en el apartado III.3.3.2.c se encontró
se obtienen valores de absorbancia
aparición
de
dos
puntos
pH
que a pH < 1
constantes a 440
isobesticos
existencia de dos grupos ácido-base,
9.5
indicaron
nm
.
La
además
que se protonan en
la
medio
ácido debi 1.
En
este
apartado
se
hallan
las
constantes
de
protonación del producto de reacción de la cistina con el
OPA
a I = 0.1 M y 20° C
que
. Para ello, se preparo una disolución
contenía cistina 3. 6xl0~4 M , OPA 2.5xl0~2 M
, NaOH 0.09
una disolución tampón universal de Britton-Robinson
de acetato,
fosfato
y
borato
en
9.5
La
y
(compuesto
concentraciones
cuya preparación se detalla a continuación.
"M
iguales),
mezcla,
de
, se calentó 30 min a 60°C y se tomaron alícuotas,
a
pH
las
que se añadió distintos volúmenes del mismo tampón universal y
de H C 1 , leyéndose la absorbancia a 440 n m .
diagrama
Las disoluciones tamj>ón se prepararon utilizando
un
log
la
concentración
C
frente
analítica
a
(donde
C h /C
del
tampón
C
representa
universal
y
C h
concentración analítica de los iones H + ), que
Ramis
col.
universal
(144)
trazaron
Britton-Robinson
para
el
tampón
(acetato-fosfato-borato)
iguales y a diversas fuerzas iónicas
en
Ramos
la
y
de
concentraciones
(Figura 31).
F igura— 3 1 . - Di agrama log C vs C h /C para el tampón
universal
de Britton-Robinson (acetato-fosfato-borato en concentraciones
iguales) a distintas fuerzas iónicas.
El diagrama fue construido
tomando
constantes de protonacion a 25°C y I = 0.1
las
siguientes
.
Acido acet ico
log Ki = 4.56
Acido fosfórico
log h
= 11.74
log P* - 18.46
log fi. = 20.46
Acido bórico
log ¿5. = 8. 97
log pa ,» = 19.
log P* ,s = 38.
Para la preparación
valores de pH
, se
elaboro
de
la
disoluciones
Tabla
18
,
continuación el significado de cada columna
pH
:
C h /C y log C:
C:
de
distintos
detallándose
a
:
Valores de pH esperados.
Valores leídos de la Figura 31.
Concentración del tampón de Britt on- Rob in son .
El
tampón
se
prepara
iguales de los sistemas
borato,
la
que
con
concentraciones
acetato,
fosfato
partiendo de una disolución madre
los
concentración
utilizados
tres
sistemas
0.25
para
M
su
.
se
hallan
Los
preparación
y
en
en
reactivos
fueron
Tabla 18. - Ajuste del pH de
tarnpón de Br i 11 on-Robinson .
pH
CH/C
log C
H
9.5
1.28
-1.68
0.0209
0.0267
9.0
1.55
-1.65
0.0224
0.0347
8.5
1.80
-1.62
0.0240
0.0432
1.98
-1.60
0.025
2.16
-1.56
0.027
2.40
-1.50
0.031
2.70
-1.42
0.038
0.103
2.92
-1.35
0.045
0.130
3.08
-1.30
0.050
5.0
3.30
-1.24
0.058
4.5
3.60
-1.14
0.072
3.84
-1.06
0.087
3.98
-1.02
4.84
-0.30
las
HCl
disoluciones
Ac
/„
tampón
1.5x10
-0.029
3.1x10
0.15
mediante
A
c h-,
HCl
3.5x10
,-3
-3
,-3
0.050
el
0.28
.-3
-0.019
151
0.025
0.0241
4.0x10
0.0314
0.0291
0.0371
1.0
0.0533
0.079
1.98
0.334
0.109
2.72
0.095
0.38
0.131
3.28
0.501
2.426
0.130
3.25
0.415
10.37
- 152 -
Ch :
Representa
la
concentración
de
hidrógenos
totales que debe haber en la disolución
obtener los diversos
valores
de
pueden provenir de las formas
pH
y
Cici
debe
añadirse
a
acetato-fosfato-borato
deseado.
Puesto que
tres.moles
tampón,
de
la
la
para
el
protón
adicional
mezcla
obtener
sistema
por
de
el
pH
proporciona
mol
de
sistema
= Ch — 3 C
Para los pH superiores se obtienen
C bci
de
la Cici viene dada como:
C bci
de
de
.
Representa la concentración de HCl
que
que
protonadas
los sistemas acetato-fosfato-borato o
adición de HCl
para
negativos,
valores
lo que significa que
en
vez de HCl debe añadirse NaOH.
Ct «a p ó n :
Puesto que inicialmente
debe
reaccionar
la
cistina con el OPA a pH 9.5, y posteriormente
deben
acidificarse
las
preparó una disolución
disoluciones,
conteniendo
3.6x10*4 M , OPA 2.5x10“2 M
, 126
se
cistina
mi de NaOH
0.178 M y 52 mi de la disolución tampón madre
0.25 M
, aforando a 250 mi
. De
esta
ción se tomaron alícuotas de 10 mi
ciéndose en aforados
de
25
mi
disolu­
, introdu­
.
Para
la
- 153 -
obtención de los valores de pH inferiores
se
requiere una concentración ‘del sistema tampón
y de H + totales mayor que a pH 9.5
,
que
cantidades
fue
necesario
añadir
unas
por
adicionales de tampón y de HCl para
constante la fuerza iónica
columna indica
la
diferencia
adicionarse.
entre
la
mantener
medio.
concentración
adicional que debe
por
del
de
Se
Esta
tampon
calculo
concentración
tampon C que debe existir para cada pH
adicionada para conseguir un pH de 9.5
Vt taP
:
lo
de
y
la
.
Volumen de tampón 0.25 M adicional que se añade
a los aforados de 25 mi
^Cbci:
Concentración
añadirse a
conseguir
calcula
adicional
la
de
disolución
valores
como
de
la
HCl
de
pH
concentración
pH
diferencia
de
obtener un pH de 9.5
9.5
HCl
Se
la
adicionarse
necesaria
y
para
.
pH superiores a 5.5 el HCl utilizado fue
, mientras que para los
utilizó HCl 1 M
para
entre
Volúmenes de HCl necesarios . Para valores
M
debe
inferiores.
concentración de HCl que debe
la
que
pH
inferiores
de
0.1
se
- 154 -
En la Tabla 19 se muestran los valores de pH esperados
y los experimentales,
observándose una concordancia aceptable.
Tabla 19. - Efecto de la
acidez
del
medio
sobre
producto de reacción de la cistina con OPA obtenido
medio bórico-borato.
pH
esperado
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
1.5
1.0
0.5
A
encontrado
9. 504
9.006
8.288
7.680
7.355
6. 927
6. 346
5.816
5.303
4.897
4.302
3.780
3.003
1.258
0. 942
0.515
experimental
0.155
0.174
0. 180
0.190
0. 200
0.212
0.230
0. 267
0.309
0.350
0.403
0.467
0. 561
0.588
0.604
0. 617
teórica
0.201
0. 201
0.201
0.201
0. 210
0.210
0. 234
0.275
0.314
0. 340
0.398
0.465
0.564
0.607
0. 609
0. 609
el
en
- 155 -
Para
protonacion,
Para
ello
la
se
se
determinación
de
las
constantes
de
aplico el método de regresión lineal múltiple.
partió
absorbancia de la
de
la
disolución,
ecuación que
A,
con
la
relaciona
la
concentración
de
hidrog eniones, h:
+
¿ij3ih
+ SxISah.2
A = ---------------------------- x C
1 + y3ih + Ji»h*
€,» son
donde £.0 ,
<Si
y
las absort ividades
especies
no
protonada, mono
y
[25]
molares
diprotonada; J31 y
de
las
JS*
las
constantes de. protonacion acumuladas del sistema acido-base
y
C su concentración.
La expresión
[25] puede
escribirse
de
modo
que
adopte la forma de la ecuación de un plano:
Z “ a« + aiX + azY
donde los
J3a y
[26]
parámetros a<> , ai y aa están
relacionados con y3 x ,
, mientras que X,Y y Z son función de <So, ¿a ,
h
y
(siendo & = A / C ) .
En'realidad,
al reordenar
la
pueden obtener 4 expresiones distintas
expresión
(Tabla 20).
[25]
se
£.
- 156
-
ZíÜLla.^— ~~
^ Obtención
de
las
constantes
de
mediante el método de regresión lineal múltiple.
Plano
Ecuación
ni
---y- Z * -r—T +
1
Pl
"
.
.
H
P
h
de
mínimos
observaron
que
descendente,
h(£-£2)
_ i
h"1
-
2
C. Mongay y col.
sobre la bondad de las
£
“1
(145),
v2 £2 " £
**
£-£c
£
> ! r £
11 £
£
n_1(£-£0)
cuadrados
la
a
un
estudio
obtenidas
las
curva
h- £« - £
£ -6,
h-1 É
£-£2
1 £-£2
en
constantes
cuando
1
„
i
¿'¿o
z
1
1
IV
método
t
- 1
^■ "
_i
r... v
^ _
+i
I +1 ~f, /'rw .■ 11
h
1
’
II
V4
X
/ 22
protonacion
al
cuatro
A —pH
es
realizado
aplicar
el
expresiones,
ascendente
o
los mejores resultados se obtienen utilizando las
ecuaciones II y III. En este estudio
se
aplico
la
ecuación
III .
Para aplicar el
valores de
£.0
dado que a
absorbancia,
y
pH<l
¿ 2
método
. El valor de
se
obtiene
sin embargo,
£,2
una
es
necesario
los
es perfectamente conocido,
lectura
constante
el valor de ¿-o no es
que en medio básico no se obtiene
conocer
una
de
la
inmediato,
ya
estabilización
de
la
- 157 -
señal,
debido probablemente a
ácido-base con log K
>
8
la
,
que
existencia
puede
de
otra
forma
corresponder
a
la
se supuso
un
protonacion de los nitrógenos isoindólicos.
Para poder aplicar el método expuesto,
valor de
la
curva
teórica.
£ .0
y se siguió un procedimiento iterativo
£.0
experimental
concordo
hasta
satisfactoriament e
con
que
la
Los valores obtenidos fueron:
S.I
= 1249
= 2121
log Ki = 5.88
En
la
Figura
J
B
a obtenidos. Se observa
= 3828
log Ka = 3.70
32
se
experimentales y la curva teórica
ecuación [25] utilizando
£ 2
representan
obtenida
los valores de
una
£ 0
a
,
£.1
los
partir
,
buena concordancia
valores experimentales y los teóricos.
£•a
puntos
de
.
ent re
la
y
los
- 158
-
O---o— y
O
2
4
6
pH-
Figura 32. - Carácter ácido-base del producto de reacción
la cistina con el OPA a pH 9.5 , I = 0.1 M y 20°C .
C ci■tin•
=
1 . 4x10"
4 M ;
o puntos experimentales
C opa
;
=
1 xl0 “
2 M
curva teórica
8
de
- 159
-
d ) Di scus ion
La reacción de las aminas primarias con un exceso de
OPA en ausencia de tiol,
da lugar a
ftalimidas
N-sustituídas
(L) como producto mayoritario y el compuesto correspondiente a
la estructura LI
(146).
La proporción de los compuestos L y LI
depende de la relación OPA/amina primaria.
0
NR
HO'
L
LI
Debido a la estructura dimérica de
propone la formación del derivado LII.
la
ci s t i n a ,
se
Exper imentalmente se ha
comprobado que en presencia de un exceso de 25 veces de OPA se
produce a las 24 h la precipitación de un
pálido.
Esta precipitación
no
tiene
compuesto
lugar
la
relación
OPA/cistina es la estequiómetrica. Es posibl e que el
produc t o
formado por reacción de la cistina y el OPA
si
amar i lio
evolucione
una estructura análoga a la L I .
0
0
j ^ j | ^ ^ “ C H ~ C H 2 ” S - S — C H 2- C H —
COOH
COOH
L II
30
hacia
- 160 -
La estructura
LII
se
encuentra
apoyada
por
los
siguientes hechos experimentales:
1.- La estequiómetría del compuesto es 1:2
2.-
Se
confirmo
la
existencia
log Ki = 5.88 y log K* = 3.71
de
, que
protonación de dos grupos 'carboxilo
similares
a
los
.
dos
grupos
pueden
ácidos con
atribuirse
a
la
, ya que estos valores son
correspondientes
a
otros
compuestos
di carboxílicos.
3.- £1 pH optimo de formación del compuesto es 9.5
, que puede
corresponder a la desprotonación del grupo amino de la cistina
con log K
4.-
Se
9.0
ha
.
comprobado
que
la
cisteína
comportamiento distinto en las condiciones
las
que
se produce
la
reacción
presenta
experimentales
OPA-cistina.
disoluciones resultantes de la reacción
Así,
OPA-cisteína,
un
en
las
cuando
los reactivos se encuentran en relación 1:1 son de color verde
y su
espectro es muy diferente al del derivado de cistina.
concentraciones
mayores
de
OPA
cisteína superiores a 5) cambia
espectro y
no
llega
a
de
los
de
hasta
productos
de
aparición inmediata de un precipitado
suponer que
no
ha
tenido
disulfuro de la cistina,
cist eí na .
molares
drásticamente
estabilizarse
incluso con excesos de OPA
acidificación
(relaciones
lugar
la
50
la
señal
veces.
reacción
verde.
la
que daría lugar
reducción
al
OPA/
forma
del
analítica,
Ademas,
produce
Por
Con
ello
del
derivado
la
la
cabe
puente
de
la
UTILIZACION DE N-ACETIL-L-CISTEINA EN
LA DETERMINACION DE
O-FTALDEHIDO
AMINOACIDOS
CON
- 163 -
III.4.1.- INTRODUCCION
La
N-acetil-L-cisteína
(XXXVII)
se
ha
propuesto
recientemente como tiol en la reacción del OPA con las
primarias,
para
la
separación
cromatográfica
fluorimétrica de aminoácidos enantiómeros
Los productos de reacción
aminas
primarias
presentan
de
las
y
mismas
NAC
derivados
del
NAC
sódico.
presentan
las
, mostrando rendimien­
el
caso
aminas primarias y superiores con los iminoácidos
hipoclorito
con
características
tos cuánticos de fluorescencia similares en
oxidados con
detección
(ver apartado 1.2.2).
OPA
espectrales que los derivados de OPA-ME
y
aminas
Asimismo,
espectros
de
de
las
previamente
los
isoindoles
absorción
muy
semejantes a los de los derivados del ME , con
un
absorción sobre 335 nm
sensibilidades
. En ambos
como veremos a continuación,
casos,
son
las
similares
máximo
para
todos
de
los
ami noá cid os.
Los derivados de los aminoácidos con NAC
son
mucho
más estables que los análogos obtenidos con ME y ET . Estudios
flúorimétricos
indicaron
que
fluorescencia se alcanza en
durante 10-30 min
la
1-2
(78)(82-83).
máxima
min
y
intensidad
permanece
Sin embargo,
constante
con NAC no se
realizado estudios de estabilidad paralelos a
los
de
han
realizados
con el ME.
Asi,
estudio
el objeto
de
este
capitulo
cinético-espectrofotometrico
de
es
la
degradación de los isoindoles derivados del NAC.
realizar
un
. formación
y
- 164 -
III.4.2.- OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES EXPERIMENTALES
£1 estudio de las condiciones óptimas
de los derivados de aminoácido-OPA-NAC
pH
, concentraciones de OPA y NAC)
un aminoácido modelo,
de
de
formación,
se llevo a cabo
utilizando
la isoleucina,
(tiempo
formación
que
forma
uno
de
los
derivados más estables con OPA y ME.
1.- jEspectro de absorción y estabilidad de
los
isoindoles
derivados de N-acetil-L-cisteína
Se preparó una disolución que
OPA y NAC en
concentraciones
contenía
1.93xl0‘4
M
,
isoleucina,
1.2x10"*
M
y
1.2x10"* M , respectivamente,
en medio bórico-borato de pH 9.5
a
se
temperatura
absorción,
qmbiente,
utilizando
y
como
registró
blanco
preparada en ausencia de isoleucina.
espectro de absorción
una
el
disolución
También
correspondiente
a
espectro
se
la
de
similar
registró
disolución
el
del
blanco.
El espectro de absorción del producto de reacción de
la isoleucina con el reactivo OPA-NAC se muestra en la
33
. Se observa un máximo a 335 nm
el blanco
aminoácidos
presenta
una
presentaron
incluida la cistina
, longitud de onda a la que
absorción
muy
el
espectro
mismo
baja.
El
de
resto
de
absorción,
(ver apartado III. 5). La cisteína no forma
un isoindol con OPA-NAC,
OPA-ME.
Figura
a semejanza
de
lo
que
ocurre
con
- 165 -
Por otra parte,
cabe destacar la gran estabilidad de
los isoindoles derivados del NAC
. Así,
la
estabilización
la señal analítica se alcanzo en un tiempo inferior
min de mezclar los reactivos,
a
los
permaneciendo constante para
de
2
la
mayoría de los aminoácidos aquí estudiados durante al menos 60
min
, por lo que utilizando NAC no
estricto del tiempo de reacción,
es
necesario
un
control
como ocurre con ME.
2,0
A
0.8
300
A0°
Figura 33. - Espectro
de
absorción
reacción
de
la
isoleucina
con
el
(2) blanco.
Cisoicuein*
— 1.93x10“4
M
;
C o p a
—
C n a c
X(nrn)
500
de:
(1)
reactivo
— 1.2x10"*
Producto
OP A —NAC
M
de
;
- 166 -
2 .- Influencia del
t>H
Se estudio la influencia del pH sobre la reacción de
la isoleucina con los reactivos OPA-NAC y OPA-ME
se preparo una serie de
1x10 ~4 M
disoluciones que contenían
, OPA 1. 2x 10 '9 M y NAC o ME 1.2xl0-3
valores de pH ajustados
con H C 1 ,
y
borato de fuerza iónica
0.1 M
Se
335
blanco
nm
frente
a
un
.
.
con
M
la
preparado
en
ello
isoleucina
a
tampones
leyó
Para
distintos
citrato
absorbancia
ausencia
y
a
del
aminoácido.
Los resultados obtenidos con ME y NAC se representan
en la Figura 34
. Se observa en ambos casos la
una meseta de máxima
absorción,
que
existencia
abarca
al
unidades de pH ( 7.5-11 para NAC y 8-11 para ME
parte,
a 11 la absorbancia
valor máximo.
aumentaba
lentamente,
El valor representado a p H ~ 1 2
menos
tres
Por
otra
).
con el reactivo OPA-NAC se observó que a pH
de
superiores
aproximándose
al
se tomó a los
10
min de mezclados los reactivos.
Para
el
trabajo
bórico-borato de pH 9.5
posterior,
se
utilizó
, que son las condiciones
tampón
normalmente
empleadas en la obtención de derivados de OPA y tiol.
- 167
-
.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Figura
34.
C l s o l e u c l n a
- Influencia del p H : (1) OPA-NAC y
-
1X 10 _ 4 M
CoPA
=
C N A C
-
Cm E
-
(2) OP A- M E
1.2xl0“3 M
.
- 168 -
3 .- I n f l u e n c i a d e la c o n c e n t r a c i ó n de o - f t a l d e h i d o
Se realizo
un
estudio
de
la
influencia
concentración de OPA tiene sobre la reacción de
los isoindoles.
Se
preparó
una
contenían isoleucina 1x10"4
M
serie
,
NAC
de
que
la
formación
de
disoluciones
1.2x10“ 3
M
,
que
tampón
borico-borato de pH 9.5 y concentraciones variables de OPA
Los
resultados
representados
en
la
.
Figura
35
muestran que a partir de una relación molar OPA/aminoácido = 5
sé obtiene un valor de absorbancia constante.
Con
superiores a
=
las
mostradas
(OPA/aminoácido
relaciones
200)
no
se
observó variación alguna en la señal analítica.
Por
otra
parte,
se
concentración de OPA es baja,
reacción.
observó
que
cuando
se necesita un mayor
tiempo
baja
la reacción es lenta,
aumentar la
relación
concentración
OPA/aminoácido
instantáneamente,
de
=
5
aumentando
OPA.
la
manteniéndose la
menos durante una hora.
Así,
reacción
la
a
velocidad
partir
de
transcurre
absorbancia
a
5, 15 y
observándose que cuando la relación OPA/aminoácido
(<5)
de
Las curvas mostradas en la Figura 35 corresponden
medidas realizadas para distintos tiempos de reacción,
30 min,
la
constante
es
al
una
casi
al
169
o
O
10
20
30
OPA /ISOLEUCINA
Figura 35. - Influencia de la concentración de OPA
sobre
la
reacción de la isoleucina con el reactivo OPA-NAC. En abscisas
se representan relaciones molares. Tiempo de reacción:
(1) 5 min ; (2) 15 min ; (3) 30 min
Clsoleucina
= 1X 10 " 4 M J C n AC = 1.2xlO'9 M
- 170 -
Como se apunto en la
(apartado 1.1.5),
Introducción
de
esta
la reacción de los aminoácidos
Memoria
con
el
para formar isoindoles presenta una cinética de segundo
respecto
al
aminoácido
y
determinada concentración de
al
OPA,
por
lo
aminoácido,
un
que
OPA
orden
para
una
aumento
en
la
concentración de OPA supone un aumento en la velocidad
de
la
reacción.
También se encuentra en la bibliografía,
presenta
un
fluorescente,
adecuado.
El
efecto
desestabilizador
sobre
por lo que es necesario llegar a
OPA
debe
estar
presente
en
suficiente para que la reacción sea rápida,
exceso.
Sin embargo,
OPA/amina de 100
.
el
un
,
al
menos
a
la
hasta
OPA
isoindol
compromiso
concentración
pero no en un gran
como se muestra en el apartado III.4.5
la concentración de OPA no afecta
derivados de OPA-NAC
que el
estabilidad
relaciones
de
,
los
molares
- 171 -
4 .- Influencia, de la c o n c e n t r a c i ó n de N - a c e t i l - L - c i s t e í n a
Se estudió el efecto que
ejerce sobre
la reacción delOPA
ello sepreparó
una
serie
la
con
concentración
los
así
como concentraciones
aminoácidos.
de disoluciones
isoleucina lxlO-4 M , OPA 2.5x10"8 M ,
variables
de
de
que
tampón
NAC
Para
contenían
bór ic o-b or ato ,
NAC,
leyendo
la
absorbancia a 335 nm
En
obtenidos,
la
Figura
36
se representan
observándose cómo a partir de
NAC/aminoácido = 3 ,
Por
otra
una
resultados
relación
molar
la absorbancia permanece constante.
parte,
y
a diferencia
concentraciones bajas de NAC no se observó
lenta,
los
del
una
OPA,
para
reacción
más
obteniéndose un valor de absorbancia constante antes de
los 5 min de efectuada la mezcla.
Por lo tanto,
son
pH 7.5
-
11
y
las condiciones
relaciones
óptimas
molares
de
análisis
OPA/aminoácido
NAC/aminoácido mayores de 5 y 3 , respectivamente.
y
A
0.8
cr-o
0.4
172
i
o I------ 1______i______ i______i______ i______
0
10
20
30
NAC/ISOLEUCINA
Figura 36. - Influencia de la concentración de NAC
sobre
reacción de
la
isoleucina
con
el
reactivo
OPA-NAC
.
abscisas se representan relaciones molares.
C
= 1x10 ~ 4 M ;
C o p a
= 2.5x10"® M
la
En
- 173 -
III.4.3.-
ABSORTIVIDADES MOLARES
DE
LOS
DERIVADOS
DE LOS
AMINOACIDOS CON O-FTALDEHIDO Y N-ACETIL-L-CISTEINA
Svedas
y
col.
(41)
realizaron
espectrofotométrico sobre la interacción
con OPA en presencia de ME
,
de
obteniendo
un
los
las
estudio
aminoácidos
absortividades
molares de algunos aminoácidos proteicos primarios
(Tabla 21).
Las condiciones de
25°C
9.7-10
,
ME
análisis
0.6-1x10'*
utilizadas
M
y
una
fueron:
concentración
dos o tres veces superior a la del aminoácido.
molar media fue 6 m = 5130 ± 360
no se ha tenido en cuenta e*l
derivado
molécula dos grupos amino primarios,
de
la actividad de determinados enzimas.
que
obtuvieron
(£^ m = 5992 ± 144)
estos
(Tabla 21).
obtenido por Rowlett y col.
La absortividad
autores
Este
baja concentración de OPA utilizada.
cisteína,
tener
(117-118)
que
en
su
propusieron
espectrofotometrica
así como para determinar
La
absortividad
resultó
valor
(73). Las
molares obtenidas por Svedas y col.
la
que al
determinación
del grado de proteolisis de la leche,
media
OPA
presenta un £. = 8800).
Church y col.
el reactivo OPA-ME para la
de
pH
(en la obtención de este valor
presenta un 6. = 1550, y el de la lisina,
Posteriormente,
,
ser
coincide
menores
molar
superior
con
el
absortividades
se deben seguramente a
la
- 174 -
En este
apartado
molares de los isoindoles
se
de
obtienen
los
20
las
aminoácidos
primarios y cistina con el reactivo OPA-NAC
Se prepararon disoluciones
que contenían OPA y NAC
absortividades
en
proteicos
.
tampón
bórico-borato
, ambos en concentración
2x10"3
distintas alícuotas de disoluciones l xl O"2 M de los
aminoácidos,
abarcando
4.0x10"*-2.0x10”4 M
experiencias
con
el
.
el
intervalo
Asimismo, se
fin
de
de
y
distintos
concentraciones
realizó
comprobar
M
las
una
serie
de
absortividades
molares de algunos aminoácidos con el reactivo OPA-ME
en
las
mismas condiciones.
En
la
Tabla
21
se
muestran
correspondientes al reactivo OPA-NAC,
siendo
los
la
resultados
absortividad
molar media para los aminoácidos proteicos primarios de
<SM
6830 ± 350 (sin considerar la lisina y cisteína).
misma
tabla
se
muestran
las
absortividades
En la
molares
de
=
algunos
aminoácidos con el reactivo OPA-ME obtenidos por nosotros.
Los
valores
los
encontrados
resultaron más
concordantes
con
proporcionados por Church y Rowlett que con los de Svedas.
En
general,
de
las
absortividades
molares
de
los
derivados
OPA-NAC son algo superiores a las correspondientes a OPA-ME
Por
otro
lado,
la
dispersión de
los
valores
absortividades molares de los aminoácidos proteicos
de
primarios
con. el reactivo OPA-NAC
essimilar
a la obtenida con OPA-ME
Por último,
delo
ocurría
OPA-ME,
a semejanza
que
con
la prolina al ser una amina secundaria,
con OPA y NAC
.
el
no
las
reactivo
reacciona
- 175 -
Tabla
21 . - Absortividades
molares
de
los
aminoácidos
proteicos primarios y
cistina
con ' los
reactivos
OPA-ME
OPA-ET y OPA-NAC.
OPA-ME
OPA-ET
OPA-NAC
Aminoácido
Alanina
Arginina
Asparagina
A c .Aspart ico
Cisteína
A c .Glutámico
Glutamina
Glicina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Triptóf ano
Tirosina
Valina
Cist ina
Media
•
b
c
*
€d
£•
£b
£«
5400
5700
4600
4800
1550
4900
5000
4800
5000
4800
8800
5200
5700
5500
5200
4700
5200
5600
6090
6120
6230
6600
6420
\
1350
6120
5880
6020
6470
6430
6300
6400
11800
5830
6400
6310
6000
6160
6180
4800
5130 ± 360
Datos obtenidos
Datos obtenidos
Datos obtenidos
Datos obtenidos
6290
6340
por
por
por
por
Svedas y col. (41).
Church y col. (117-118)
Rowlett y col. (73).
nosotros.
6830
6480
6130
6920
2700
6910
6700
7180
6860
6740
6860
10740
6930
6590
6980
6850
7830
6580
6780
12200
6830 ± 350
- 176
-
En la Figura 37 aparecen representadas
calibrado para los aminoácidos
con el reactivo OPA-NAC.
encontró
una
correlación,
perfecta
En
lisina,
todos
los
linealidad,
las curvas de
triptófano e isoleucina
casos
con
estudiados
coeficientes
se
de
r > 0.9999.
1.4
0.8
0-4
0
1
2
AMINOACIDO
Figura 37. - Curvas de calibrado:
(3) isoleucina.
C
o p a
=
C
n a c
- 2 x l 0 -3
M
(1) Lisina
x 10*
(M )
; (2) triptófano;
- 177 -
III.4.4.- ESTUDIO CINETICO DE LA FORMACION
Y
DEGRADACION DE
LOS ISOINDOLES
1. - Introducción
Svedas y col.
velocidad
de
(41) determinaron
formación
y
degradación
las
de
constantes
los
de
isoindoles
obtenidos con el reactivo OPA-ME a 25.0 ± 0.1°C
,
correspon­
dientes al esquema indicado en el apartado 1.1.5
(ecuaciones 7
y 8 ). Las constantes de formación de pseudo-primer
orden
obtuvieron a partir de medidas espectrofotornetricas,
uso del método de Guggenheim
se
haciendo
(147) y utilizando excesos de OPA
10-20 veces superiores a la concentración
de
aminoácido.
La
constante bimolecular de formación de la reacción se calculó a
partir de la pendiente de la recta
las
constantes
de
pseudo-primer
obtenida,
orden
al
representar
frente
concentración de OPA. El tratamiento matemático de
a
los
la
datos
se realizó por el método de mínimos cuadrados ponderado.
Estos autores determinaron también las constantes de
descomposición,
de primer orden,
de los productos de reacción,
mediante el método de Guggenheim.
Nosotros hemos calculado las constantes de velocidad
de
formación
de
los
isoindoles
formados
con
OPA-NAC,
utilizando el mismo esquema cinético y aplicando el método
Gu g g e n h e i m .
de
- 178 -
2.- Método de Guesenheim
La ecuación integrada de velocidad para una cinética
de primer orden es:
[27]
donde C« y C son
tiempo inicial
las
, t©
concentraciones
del
reactante
, y en el tiempo t , y k la
en
el
constante
de
velocidad de primer orden.
Sustituyendo estos valores por
la
magnitud
de
la
propiedad física medida, &, en los tiempos t y t+x se tiene:
[28]
0t*. -
= ( 0. - 0„ >
y eliminando J0^, valor de la
infinito,
k <t+i
propiedad
física
[29]
a
un
tiempo
queda la ecuación:
0* - 0t + « = ( 0* - 0 ^ ) e - k,,- ‘.)
(1 - e "**)
[30]
- 179 -
Así,
intervalos de
tomando una
tiempo
serie
de
constantes,
ln ( 0 t - 0t + x ) frente a t-to
valores
x ,
la
&%+*
y
a
representación
corresponde
a
una
recta
de
de
ecuación:
ln ( 0* -
) = A - k (t-to)
[31]
donde
A
= ln ( 0o
-0 ^ ) + ln ( 1 - e * k *)
y cuya pendiente coincide con
Cuando
concentración del
modifica
la
la constante develocidad k.
propiedad
producto,
[32]
la
física
depende
ecuación
de
de
la
Guggenheim
se
:
ln ( 0t + , -
0* ) = B + k (t-to)
[33]
El método de Guggenheim es de aplicación general a
las cinéticas de primer orden,
la única limitación consiste en
la elección de x . Si x es elevado,
el número de
la propiedad física a medir será bajo
calculará principalmente con los
tomados,
por
determinación.
lo
que
se
si se
pequeño,
se podrá trabajar con un
valores.
Sin embargo,
el
primeros
cometerá
Por otra parte,
y
un
gran
valor
y
de
últimos
error
escoge
lecturas
un
número
alto
se
puntos
eñ
valor
de
k
de
la
de
pares
x
de
el error obtenido en la determinación de
k es inversamente proporcional a la raíz cuadrada
del
número
- 180 -
de observaciones
utilizadas,
por
lo
que a
partir
de
un
determinado valor de x es despreciable el aumento de exactitud
alcanzado.
Por ello,
es
necesario
llegar
a
siendo conveniente seguir la reacción durante
un
compromiso,
tres
o. cuatro
vidas medias.
Asi,
para
un
numero
total
de
propiedad 0 obtenidos a intervalos de
selección de x se debe realizar como
valores de 0
tiempo
sigue:
datos,
N,
constantes,
Se
dividen
la
la
los
, en dos grupos de N/2 observaciones consecutivas
y se escoge x como el intervalo de tiempo de separación
la primera observación del primer grupo y la del
esta forma,
de
cada observación del primer
una vez con una del segundo.
entre
segundo.
grupo solo
De
secompara
- 181 -
3.- Formación de los isoindoles
Las constantes de
isoindoles,
velocidad
de
formación
de
obtenidos por reacción de los aminoácidos
reactivo O P A - N A C , se calcularon considerando que
es de pseudo-primer orden en presencia de
un
la
los
con
el
reacción
exceso
de
OPA
(relación molar OPA/aminoácido = 10-20).
Para ello se prepararon disoluciones 1 x1 0" 2 M de los
20 aminoácidos proteicos
OPA-NAC y OPA-ME
concentración:
primarios,
así
( relación molar 1:1
2.5x10"* M
ambos reactivos,
como
los
) para tres
, 1.75x10"* M y
reactivos
niveles
1.25x10"*
en tampón bórico-borato de pH 9.5
M
,
de
en
.
Para poder medir la absorbancia a los pocos segundos
de mezclados
los
reactivos,
micropipeta graduable,
se
operó
50 jil de la
inyectando
disolución
de
con
una
aminoácido
directamente en la cubeta del espectrofotómetro, conteniendo 3
mi del reactivo OPA-tiol en medio tampón b ó r i c o - b o r a t o .
Una vez homogeneizada
la
absorbancia a 335 nm a los 6 s de
disolución,
iniciada
registró durante 1 min la curva de formación,
de absorbancia con intervalos de 5 s
programa de la unidad OPI
registra
constantes
los
de
valores
tiempo.
(Shimadzu
,
UV-240
Las experiencias
leyó
la
reacción.
Se
tomando
haciendo
deabsorbancia
termostatando a 25.0 ± 0.1 °C
la
se
,
uso
medidas
de
OPI-2),
un
que
para
incrementos
se
realizaron
- 182 -
Se calcularon las constantes de formación de
primer orden,
k i ', por aplicación
del
método
para los tres niveles de concentración de OPA,
determinación
por
duplicado.
La
constante
de
pseudo
Guggenheim
realizando cada
de
formación
bimolecular k i , viene dada por la ecuación:
ki
En la Figura
38
=
ki
X
C o p a
[34]
se muestra la representación de los valores de
k i ’ para la isoleucina,
frente a la concentración de OPA.
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.02
0
0
2
3
OPA
x 103
(M)
Figura 38. - Determinación de la constante
de
velocidad
formación del derivado de la isoleucina con OPA y N A C .
C l i o l t u e i n t
— 1.2x10 “4 M
de
- 183 -
En
constantes
OPA-NAC,
la
de
Tabla
22
formación
aparecen
de
los
los
valores
isoindoles
junto a sus desviaciones estándar,
las constantes obtenidas por Svedas y col.
condiciones,
para el reactivo OPA-ME
En las Figuras 39 y. 40 se
formación de los
glicina,
arginina,
isoindoles
alanina,
observa un incremento en
reactivo
OPA-NAC
supone
aminoácidos,
de
con
y se comparan
con
,
en
muestran
las
las
con
velocidad
un
de
los
formación
aumento
es
ácido aspártico,
claramente una menor velocidad
la
mismas
en
muy
glicina
la
( Tabla 22
En ellas se
el
al
uso
del
constante
de
Sólo
lisina
).
de
aminoácidos
, aunque para
elevada.
y
curvas
reacción,
. Generalmente,
velocidad de formación respecto al OPA-ME
la velocidad
obtenidos
isoleucina y treonina.
aumentar la concentración de OPA
las
.
obtenidos
la
de
se
ambos
con
los
observó
- 184 -
Tabla
22. - Constantes
de
velocidad
de
formación
y
porcentajes de d e g r a d a c i ó n de
los
isoindoles
obtenidos
por
reacción de los aminoácidos proteicos primarios con OPA-NAC
y
OPA-ME a 25*C.
OPA-■ME­
OPA--NAC
Aminoácido
kik
SA*
kib
%Ae
Alanina
40*2
13.4
86*6
0
Arginina
58*6
6.3
102*11
0
Asparagina
39*1
-
36*2
0
A c .Aspártico
44*2
- .'
30*3
0
A c .Glutámico
64*3
8.6
52*6
0
-
54*3
0
Glutamina
G1 icina
930*40
Histidina
22*4
Isoleucina
Leucina
78.7
268*20
8.3*
5 11)
40*3
9.5
57*1
4.9
49*5
0
60*20
6.6
81*1
0
10 0 * 2 0
8.9
79*6
6.4*
Metionina
80*4
7.6
81*3
0
Fenilalanina
38*2
5.9
61*6
0
Serina
44*6
-
Treonina
20*2
Triptófano
38*4
Tirosina
33*1
Valina
38*6
Lisina
2
103*7
6.7
11.5
28*4
3 .3
10.9
65*4
0
6.6
54*3
0
3.9
40*1
0
* Datos obtenidos a partir de Svedas y col. (41).
b Constantes de velocidad de formación (M“ 1 s “1 ).
* Porcentaje de disminución de la absorbancia a los 60
* Porcentaje de aumento de la absorbancia a los 60 min
min
.
- 185 -
t
b
10s
Figura 39. - Curvas de formación de los isoindoles
para
aminoácidos: (a) Glicina ; (b) arginina
y (c) alanina.
los
C« aino«ei 4 o = 1.2x 10 ~ 4
M
; concentración
del
reactivo
OPA-NAC (relación 1:1) : (1) 1.25x10-* M ; (2) 1.75x10-*
M ;
(3) 2.5x10"* M
- 186 -
Figura 40. - Curvas de formación de los isoindoles
aminoácidos: (a) Isoleucina ; (b) treonina.
para
los
C«» in • • e i « =
1.2X10 ” 4
M
; concentración
del
reactivo
OPA-NAC (relación 1:1) : (1) 1.25x10” * M
; (2) 1.75x10”* M
(3) 2.5x10” * M
;
- 187 -
Las distintas velocidades con las
que
se
obtienen
los isoindoles indica que la estructura del aminoácido
a la cinética de la reacción,
tal como se observa en la
afecta
Tabla
23 .
Tabla 23. - Influencia
de
los
sustituyentes
Rx
sobre
constante de velocidad de formación de los isoindoles de
OPA-NAC (Ra = - C O O H ) .
SR
N -C -R
Aminoácido
Ri
kx
(M- 1 s “1 )
103 ± 7
Serina
-CHa-OH
Alanina
-CHi
86
±
6
Leucina
—C H a - C H (C H a )a
81 ±
1
Feni 1alanina
-CHa-CeHa
61
6
Tirosina
-CHa-CeH4-0H
54 ± 3
Glutamina
-CHa-CHaCONHa
54 ± 3
A c . Glutámico
-CHa-CHaCOOH
52 ±
6
Asparagina
-CHa-CONHa
36 ±
2
A c . Aspártico
-CHa-COOH
30 i 3
la
- 188 -
So observa que el radical Rx , presente
afecta
a
la
velocidad
de
reacción,
= -COOH
que el carácter de la amina juega un papel
formación
del
ésta
( -OH .> -R
isoindol
se
(24)
,
importante,
produce
por
en
ya
un
proceso
intacto
intermedio,
sobre
(ver Esquema 2, X)
Por lo tanto,
el
grupo
el
que
carbonilo
en
todavía
.
aquellos
carácter nucleofílico de la amina,
la reacción.
>
ataque
nucleofílico intramolecular de la amina secundaria formada
un
al
). Estas observaciones están de acuerdo
con el mecanismo propuesto por Sternson y col.
la
el C-10,
aumentando
incrementarse el carácter dador del sustituyente
> -Ph > -CONHa
en
factores
aumenten
el
aumentarán la velocidad
de
El poder nucleofílico de
la
ppder inductivo de los sustituyentes de la
que
amina
depende
misma,
del
aumentando
su basicidad aquellos sustituyentes que ceden carga.
estérico
Por otra parte,
se debe tener en
de
efecto
la
amina,
que
cuenta
parece
resultados de la Tabla 24, donde se observa que
efecto
explicar
la
de formación disminuye con una sustitución adicional
el carbono adyacente al C-10.
el
los
velocidad
(-CHs)
en
- 189 -
Tabla 24. - Influencia de los sustituyentes R< y Re sobre
la
velocidad
de
formación
de
los
isoindoles
derivados
del
reactivo OPA-NAC ( R i = - C H - R a y R 2 = -COOH ) .
I
Re
SR
N -C -R
R4
Re
ki
Serina
-OH
-H
103 ± 7
Treonina
-OH
-CHa
28 ± 4
Alanina
-H
-H
86
Valina
-CHa
- CHa
40 ± 1
Leucina
-CH(CH#) a
-H
81 ±
Isoleucina
-CHaCH»
- CHa
49 ± 5
Aminoácido
(M~ 1 s * 1 )
±
6
1
- 190 -
4.- Degradación de los isoindoles
La determinación de la
descomposición de primer orden,
constante
ka
de
, es mas
velocidad
de
problemática dada
la gran estabilidad de los derivados de los aminoácidos con el
reactivo OPA-NAC
. Por ello,
se calculo la disminución
absorbancia de los distintos derivados a
formación,
y
se
compararon
los
los
60
min
resultados
de
la
de
su
con
los
correspondientes a los derivados del reactivo OPA-ME
Para ello se preparo una serie
contenían aminoácido,
2.5 x10 “* M y 2.5x10"*
de
disoluciones
que
OPA y NAC en concentraciones 1.2x10“4 M,
M
,
respectivamente,
y
absorbancia a 335 nm a lo largo del tiempo.
Las
se realizaron termostatando a 25.0 ± 0 . 1
.
°C
se
leyó
la
experiencias
Los resultados aparecen reflejados en la
Tabla
22.
Los datos que aparecen en la tabla para el reactivo OPA-ME
se
calcularon a partir de las constantes de degradación dadas por
Svedas y col.
(41). Los valores
mostrados
para
el
reactivo
OPA-NAC se obtuvieron en las mismas condiciones.
Se observa que los derivados de OPA y NAC son
más estables que los
análogos
al
derivados de glicina e histidina,
reactivo OPA-ME.
OPA-ME
,
destacando
altamente inestables con
Con OPA-NAC no se observo disminución
de la absorbancia para la mayoría de los aminoácidos
de 60 min
mucho
los
el
alguna
al
cabo
- 191
La glicina
estas condiciones
peculiar
en
(relación molar OPA/glicina de 20), pues
la
absorbancia continuo
tiempo.
mostró
aumentado
Por otra parte,
contenía
glicina
un
-
se
comportamiento
lentamente
observo
8.84x10'*
M
,
que
a
una
OPA
lo
largo
del
disolución
que
1.16xl0'3
1.22x10'® M ( relación molar OPA/glicina de 13
)
las 7 h un descenso de la absorbancia a 335 nm de
M
y
NAC
mostró
un
a
2.5%
,
contrastando con la gran inestabilidad de este derivado cuando
se utiliza ME como tiol
( a los 10 min su
descomposición
del 32 % y a los 30 min de un 57 % ) ( Figura 41
fue
).
0.8
0%
0
0
1
3
5
7
t (h)
Figura 41. - Estabilidad del derivado de la
reactivo: (1) OPA-NAC ; (2) OPA-ME .
C
(iteína
r 8.84x10“* M ;
C o p a
=
C n a c
-
C
me
glicina
= 1.2x10'® M
con
el
- 192 -
5.- Factores estructurales que afectan a la
estabilidad
de
los isoindoles
Estudios
anteriores
pusieron
de
manifiesto
influencia de la estructura de la amina sobre
de los isoindoles obtenidos
apartado 1.2.1
con
el
la
reactivo
estabilidad
OPA-ME
(
de
diversos
isoindoles
derivados
del
NAC,
comparando los resultados con los obtenidos empleando ME
Los aminoácidos
estudio fueron:
,
glicina
ácido
^-amino-butírico
estructurales,
seleccionados
(GLY),
para
alanina
(GABA)
, ya
que
sus
este
^-al an in a
y
ácido
características
permiten obtener algunas conclusiones sobre
que
contenían
, NAC 2.5x10"® M , tampón bórico borato
9.5 y aminoácido en
concentración
disoluciones
concentración 2.5x10"* M
similares
la
( Tabla 25).
Se preparo una serie de disoluciones
prepararon
,
(BABA)
dadas
.
realizar
(ALA)
yG-amino-butírico
estabilidad de los isoindoles formados
OPA 2.5x10” ® M
ver
). En este apartado se realiza un estudio sobre
la estabilidad
(BALA)
la
1x10"4
que
M
de
. Asimismo,
contenían
. La temperatura fue de
para facilitar el estudio cinético de la reacción.
ME
40.0±0.1
pH
se
en
°C
- 193 -
En las Figuras
42
y
43
degradación de los derivados de
aparecen las
,
figuras
ordenadas
normalizadas,
representa
en
de
los distintos aminoácidos con
los reactivos OPA-ME y OPA-NAC
se
curvas
respectivamente.
las
En
estas
absorbancias
A», que se calculan asignando el valor unidad
la máxima absorbancia alcanzada para cada
Tabla 25 se muestran los valores de tío
disolución.
a
En
la
(tiempo necesario para
que la descomposición sea del 10 % ). De la observación de las
figuras destacan varios hechos:
En
primer
lugar,
si
comparamos
las
degradación de los derivados deglicina y alanina
( 3 y 5
de la ^-alanina y ácido JB-amino-butírico
(2 y 4),
un importante efecto estabilizador
grupo
C-10,
del
efecto que es mucho más acusado cuando
curvas
se
)
y
observa
metilo
se
de
en
el
utiliza
NAC
como tiol, puesto que en este caso los isoindoles derivados de
alanina y ácido ^-amino-butírico no se descomponen en absoluto
al cabo de 5 h
,
presentando
los
^-alanina una descomposición próxima
Cuando se utiliza ME,
el tiempo
derivados
al
50
necesario
de
%
para
misma degradación con estos aminoácidos es de 10
glicina
(Figura
42).
alcanzar
min
y
la
(Figura
43) .
En segundo lugar,
sustituyente Ri
BALA
y
GLY)
estabilidad.
la posición del grupo ácido en
( derivados 1, 2 y 3 de la
no
presenta
una
clara
Sin
embargo,
destaca
estabilidad de los derivados del NAC.
Tabla
influencia
nuevamente
25)
(GABA,
sobre
la
el
la
mayor
- 194 -
Tabla 25
Efecto de los factores estructurales sobre la
estabilidad de los isoindoles.
SR
H
N -
tío
Ri
Ra
NAC
ME
1.
GABA
-H
-CHaCHaCOaH
2.75
2.
BALA
-H
— CHaCOaH
3 .5
3.
GLY
-H
—COa H
4.
BABA
i
O
W
i*
Aminoácido
-CHaCOaH
5.
ALA
-CHa
-COaH
(m i n ) m
103
3 7 .5
1
62
17
1
4 .5
108
24
j
6.0
>270
>45
i
>270
>25
I
11
* Tiempo necesario para que se alcance una disminución
absorbancia del 10 %.
Ra
= -CHtCHaOH
(ME)
; - CHaCH( NHCOCH»)C00H
NAC/ME
de
(NAC)
1. Acido (T-amino-butirico;
2.
^-alanina;
4. Acido £ - a m i n o -b ut ír ic o; 5. Alanina.
3.
Glicina;
%
la
4-5
O
1
2
3
A
t(h)
F igura
42. - Factores
estructurales
que
afectan
a
la
estabilidad de los derivados de OPA-NAC y: (1) GABA ; (2) BALA;
(3) GLY ; (4) BABA ; (5) ALA
Caninoacldo
—
1x10 * M ¡ C O P A — CnAC
—
2 . 5 X 10 ~ 3 M
o-
O
30
60
t (min)
Figura
43. - Factores
estructurales
que
afectan
a
la
estabilidad de los derivados de OPA-ME y: (1) GABA ; (2) BALA ;
(3) GLY ; (4) BABA ; (5) ALA
C.-ino*cido
= lxlO*4 M ;
Copa
= C mi
= 2.5xl0~3 M
- 197 -
Así,
parece
ser
que
el
factor
más
importante
determinante de la estabilidad de los isoindoles es el
esterico
( existencia de un sustituyente
al anillo del isoindol)
N-alquilo
factor
adyacente
más que el efecto electrónico ejercido
por el grupo carboxilo.
Por otra parte,
los isoindoles,
el gran aumento en la estabilidad de
que supone el empleo de NAC,
al mayor volumen del tiol
peor de los casos
(BALA,
(apartado 1.2.2),
2) un aumento de la
respecto al derivado de ME de 17 veces.
puede ser
obteniendo
debido
en
estabilidad
el
con
- 198 -
III.4.5.- INFLUENCIA DE LA
TIOL SOBRE LA
CONCENTRACION
FORMACION
Y
DE
O-FTALDEHIDO Y
ESTABILIDAD
DE
LOS
ISOINDOLES
Para establecer el efecto de la concentración de OPA
y tiol sobre la estabilidad de los isoindoles,
como isoindoles
modelo
los
derivados
de
histidina con los reactivos OPA-NAC y OPA-ME
origina uno
de
los
isoindoles
aminoácidos proteicos primarios
más
se
la
.
escogieron
isoleucina
La
inestables,
e
histidina
entre
los
(Tabla 22), mientras que,
como
hemos comentado anteriormente, -la isoleucina forma un derivado
altamente estable.
Para
realizar
este
estudio
disoluciones de
los reactivos OPA, NAC y ME
5x10"* M todos
ellos,
y
de los
se
en
aminoácidos
histidina 2 x 1 0 " 3 M en ambos, y se realizaron
prepararon
concentración
isoleucina
experiencias
las que se variaron las concentraciónes de los reactivos
amina
y
tiol,
examinándose las
e
en
OPA,
relaciones t i o l :O P A :amina
siguie nt es :
1.- 100:1:15
2.- 100:25:1
3.-
25:25:1
4.-
25:100:1
El valor unidad
corresponde a una concentración 1x10"4 M . Las
experiencias se
realizaron en baño termostatado a 25.0 ± 0.1°C
En las Figuras 44 y 45 se muestran las
A * , obtenidas a diversos
normalizadas,
OPA-NAC
,
a
correspondientes
anteriormente,
para isoleucina
Para la isoleucina
absorbancias
tiempos con el reactivo
lasrelaciones
e
(curva 1 de la
histidina,
Figura
indicadas
respectivamente.
44)
se
tomo
como
valor de referencia para calcular A r , la absorbancia alcanzada
a las 3 h , a pesar de
que
esta
seguía
Figuras 46 y 47 se presentan los valores
reactivo OPA-ME.
aumentando
En las
correspondi entes
De la observación de estas figuras s e
al
pueden
obtener varias conclusiones:
1.- Cuando se trabaja con un exceso de NAC,
en
presencia
concentraciones de OPA inferiores a la de la amina
las Figuras 44 y 45),
el caso de la isoleucina,
siendo este efecto más acusado
de formación correspondientes al ME
46 y 47 no se han representado,
debido a que la
(curvas 3)
Anteriormente
utilizando
, respectivamente,
las
condiciones
III.4.2.3)
velocidad de formación de los derivados de
Figuras
formación
una
de
se
habituales
mostró
OPA-NAC
para relaciones OPA/aminoácido inferiores a 5.
formación
mientras
, la formación es próxima al 100 %
(apartado
curvas
con la isoleucina
el tiempo necesario para alcanzar
de un 5 % fue de 30 y 17 min
Las
(curvas 1) en las
los isoindoles era excesivamente lenta. Así,
trabajo
en
donde se observa un continuo aumento
de la absorbancia a lo largo de un tiempo de 3 h.
en estos tiempos,
(curva 1 de
la velocidad de la reacción de formación
de los isoindoles es menor,
e histidina,
dé
que
de
.
que
la
disminuía
- 200 -
2.- Asimismo,
aumentar
la
la disminución de la velocidad de
concentración
de
concentraciones moderadas de OPA
utiliza ME como tiol
tiol , en
no observándose este efecto con NAC
tiene efecto sobre la cinética de la
de ME
, un efecto parecido al
y
de
se
47),
.
en general,
(44) encontraron,
presencia •
de las Figuras 46
las concentraciones de tiol normalmente
Trepman y col.
al
, resulta evidente cuando
( curvas 2 y 3
En la bibliografía,
formación
se encuentra que con
utilizadas,
reacción.
al utilizar
mostrado
este
Sin
no
embargo,
grandes
excesos
Estos
autores
aquí.
apuntaron que aunque la razón de este comportamiento no estaba
clara,
se podría explicar por la
formación
de
un
compuesto
0PA(ME)i que impediría la formación del isoindol.
3.- Por otra parte,
un aumento en la
concentración
inhibe la degradación de los isoindoles
Figuras 46 y 47).
Como
1.1.3),
fluorimetricos
estudios
se
comento
de
(curvas 2 y 3
anteriormente
sobre
la
ME
de'
las
(apartado
formación
degradación de isoindoles han puesto de manifiesto que
el tiol se encuentra en concentraciones bajas,
no
ni en la cinética de formación ni de degradación.
,
y
cuando
interviene
Sin embargo,
en la bibliografía se muestra que una concentración elevada de
tiol
( ME ) actúa como inhibidor del efecto catalítico del OPA
sobre la degradación de
los
efecto no se observo con NAC
isoindoles
fluorescentes.
Este
(curvas 2 y 3 de lá Figura 44)
se observo el efecto contrario
o
(curvas 2 y 3 de la Figura 45).
- 201 -
4.- Por último,
el aumento
produce un efecto
derivados,
100
en
importante
la . concentración
sobre
la
de
estabilidad
3
y
4
de
las
Figuras
44-47).
de
los
Estudios
fluorimetricos realizados anteriormente indicaron que
un
fluorescente
al
no
al menos hasta una relación molar OPA/aminoácido de
(curvas
presenta
OPA
aumentar
efecto
desestabilizador
( 1.1.5),
la
sobre
aumentando su velocidad de
concentración
de
OPA
desde
el
el
isoindol
degradación
relaciones
OPA/aminoácido de 150 (relación recomendada para realizar
análisis)
hasta 750
.
OPA
los
- -
-o.
0—
0
2-3
202
0
0
1
2
3
t (h)
Figura 44. - Efecto de la concentración de OPA y NAC sobre la
formación
y
estabilidad
del
isoindol
de
la
isoleucina.
Relaciones NAC:,OPA: isoleucina :
(1) 100:1:25 ; (2) 100:25:1 ; (3) 25:25:1 y (4) 25:100:1 .
El valor unidad corresponde a una concentración de lxlO-4 M.
203
o
t( h )
Figura 45. - Efecto de la concentración de OPA y NAC sobre la
formación
y estabilidad
del
isoindol
de
la
histidina.
Relaciones N A C :O P A :histidina :
(1) 100:1:25 ; (2) 100:25:1 ; (3) 25:25:1 y (4) 25:100:1 .
El valor unidad corresponde a una concentración de lxlO-4 M.
2
204
0.4
0
1
2
3
t (h)
4
F igura 4 6. - Efecto de la concentración de OPA y ME sobre
la
formación
y estabilidad
del
isoindol
de
la
isoleucina.
Relaciones M E :O P A :i soleucina :
(1) 100:1:25 ; (2) 100:25:1 ; (3) 25:25:1 y (4) 25:100:1 .
El valor unidad corresponde a una concentración de lxlO-4 M.
205
— --------------------------------- 1----------------------------------- 1___________________________________ l _
o ,
30
60
90
t(m in )
Figura 47. - Efecto de la concentración de OPA y ME sobre
la
formación y
estabilidad
del
isoindol
de
la
histidina.
Relaciones M E :O P A :histidina :
(1) 100:1:25 ; (2) 100:25:1 ; (3) 25:25:1 y (4) 25:100:1 .
El valor unidad corresponde a una concentración de 1x10"4 M.
III.5.- DETERMINACION DE CISTINA CON O-FTALDEHIDO
Y N-ACETIL-L-CISTEINA
- 209 -
Como se comentó en el apartado III.4.2.1
aminoácidos
originan
el
mismo
reacc ionar con OPA y NAC
espectro
de
los
absorción
al
, incluyendo la cistina,
da lugar a
un
compuesto
con tr a r i o ,
no
muestra
distinto.
el
espectro
isoin do le s. En este apartado
se
La
que
cisteína
,
característico
muestran
diversos
sobre el derivado de la cistina con OPA-NAC
III.5.1.-
, todos
con
ME
por
el
de
los
estudios
.
OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES EXPERIMENTALES
1.- Espectros de absorción
Se
preparo
una
7.2x10"6 M y OPA y NAC,
disolución
que
contenía
ambos en concentración 2x10"*
otra conteniendo cisteína en concentración 1.3x10"4 M
y NAC 2x 10"8 M
. Las disoluciones se prepararon a
ambiente en medio bórico-borato a pH 9.5
.
.
Se
registraron
absorción utilizando como blanco
M
, y
Paralelamente
y
OPA
se
tiol
en
espectros
de
preparadas
en
espectros
de
los
disoluciones
,
temperatura
realizaron experiencias similares utilizando ME como
concentración 2x 1 0 " 8 M
cistina
ausencia del aminoácido.
En
la
Figura
48
se
muestran
los
absorción de la cistina y cisteína con los reactivos OPA-NAC y
O P A - M E . Se observa,
por una parte,
que la cistina
origina
el
espectro característico de los isoindoles cuando reacciona con
OPA-NAC
, mientras que el producto de reacción de la
cisteína
- 210 -
presenta un espectro de absorc i<5n distinto,
280 nm y que es muy semejante
reactivo OPA-ME
espectro
m ismo
que
un
máximo
obtenido
(Figura 48 b ) . El espectro
la cistina con OPA-ME es el
cisteína,
al
con
con
correspondiente
el
obtenido
debido a que con est e tiol la cistina
se
con
reduce
a
el
a
la
a
cisteína.
Asi,
es probable que al reaccionar
la
cistina
con
OPA-NAC se forme un isoindol, en el que el enlace disulfuro
de
la molécula de cistina permanezca intacto,
En
la
formación
de
sin reducir.
bibliografía no se ha descrito anteriormente la
un isoindol con cistina.
Se comprobé que una disolución que contenía
7.23x10"*
M,
en
presencia
concentración 2x10"* M
de
OPA-NAC
(relación
, alcanzo el máximo de
1:1)
en
absorbencia
en
un tiempo inferior a los 2 min y permaneció estable
durante 5 min
min
, mostrando una degradación del 24 %
(Figura 49). Por lo tanto,
el isoindol
formado
estable que los obtenidos con otros aminoácidos
cistina
al
a
menos
los
es
60
menos
(Tabla 22).
A
1.0
0.8
0.6
211
0A
0.2
500
300
300
X (nm)
400
X (nm)
Figura 48. - Espectros
de
absorción
de
los
productos
de
reacción de : (a) cistina y (b)
cisteína
con
los
reactivos
(1) OPA-ME y (2) OPA-NAC .
C c l s t e l n a
Copa
-
—
Cnac
1.31x10 * M \ C e i •
C m e = 2xl0-3 M
=
t
1n i
—
7.23x10 6 M
500
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
60
30
t (min)
Figura 49. - Estabilidad
del
producto
de
reacción
cistina con el o-ftaldehido y N-acetil-L-cisteína.
Gelatina
= 7.23xl0'6 M
;
Cofa
=
C hac
= 2xl0~a M
de
la
- 213 -
2.-
Influencia del pH
Se estudio la influencia del pH sobre la
la cistina con el reactivo OPA-NAC
disoluciones que contenían
cistina
. Para ello
se
6.87xl0-6
M
reacción de
prepararon
y
reactivo
OPA-NAC en concentración 2x10"® M a distintos valores de pH
,
ajustados con HC1 y tampón borato.
a
335
nm
frente
a
un
blanco
Se leyó
la
absorbancia
preparado en
ausencia
del
ami no á c i d o .
Los resultados
se
representan en
la
Figura
50,
mostrando la máxima absorbancia en el intervalo de pH 8-9.5. A
pH > 10 se observo una reacción muy lenta, que con
llegaba a alcanzar el valor máximo de absorbancia,
el
lo que
acompañado de la aparición de una coloración amarilla.
trabajo posterior se eligió un pH entre 9-9.5
tampón bórico -b or at o.
,
tiempo
iba
Para el
ajustado
con
- 214 -
A
O
2
4
6
8
10
PH
Figura 50. - Influencia del pH
C < 1 1 11 n«
=
6
.87x10"6 M
;
Co p a
=
.
C m a c
= 2x10*» M
- 215 -
3.- Influencia de la concentración del reactivo o-ftaldehido-
N-aceti1-L-cisteína
No
es
posible
estudiar
influencia de la concentración
de
independientemente
OPA
y
de
formación del derivado de la cistina debido,
NAC
la
sobre
por una parte,
que la cistina reacciona con el OPA en ausencia de tiol,
se mostró en el apartado III.3.3
,
y
por
la
otra,
a
a
como
que
la
reacción de la cistina con el reactivo OPA-NAC en presencia de
relaciones
NAC:OPA
elevadas
es
realizaron experiencias añadiendo
reactivo OPA-NAC
lenta.
6. 87x10"6 M en medio
cantidades
valoración
tampón
valorante el reactivo OPA-NAC
leyéndose la absorbancia
. Se
sobre
a
bó rico-borato,
en
335
nm
realizó una segunda serie de
disoluciones
de
OPA-NAC
frente
en
la
cistina
a
como
6x10"*
M
agua.
blanco
para
compensar
concentración
experiencias
,
de
añadiendo
concentración
4x 10"6-
, cistina 6. 87xl0"6 M . Los resultados se
muestran
1.- Cuando
se
adicionó
(se espero 5 min
alcanzar una señal
estable)
:
lentamente
una disolución de cistina,
lentamente
de
concentración
en la Figura 51, donde se observa que
sobre
se
del
utilizando
se realizó una valoración en blanco
4.8 xl 0" 4 M
ello,
crecientes
fotométrica
la variación de absorbancia al aumentar
OPA
Por
, preparado en concentraciones equimolares.
Se realizó una
Asimismo,
muy
el
reactivo’ OPA-NAC
la reacción transcurrió
después
(curva
de
1),
cada
adición,
encontrando
muy
para
que
a
- 216 -
partir de una concentración de OPA-NAC próxima
a
3.5x10"4
(correspondiente a una relación molar OPA-NAC/cistina = 5 )
obtiene una lectura de absorbancia constante,
a una absortividad molar del
orden
de
M
se
correspondiendo
6400,
valor
que
es
característico de la formación de un único isoindol.
2.-
Al
añadir
cistina
sobre
disoluciones
de
OPA-NAC
(relaciones molares OPA-NAC/cistina comprendidas entre
7) se obtuvo también
un
valor
de
absorbancia
partir de relaciones molares OPA-NAC/cistina
(curva 2)
, presentando en esta ocasión el
una absortividad molar próxima
observó modificación alguna
obtenidos
en
los
dos
a
12000
0.6
y
constante
a
superiores
compuesto
.
a
5
formado
Asimismo,
no
se
en
los
espectros
de
absorción
casos,
que
mostraron
el
espectro
\
característico del isoindol,
variando tan sólo
la
intensidad
de la banda.
Estos resultados
adiciona
el
reactivo
parecen
OPA-NAC
indicar
lentamente,
que,
se
cuando
produce
reacción de uno de los grupos amino de la cistina,
un isoindol simple,
que parece inhibir la
la
para formar
reacción
grupo amino del aminoácido con este reactivo.
se
del
Por otra
otro
parte,
cuando la cistina se mezcla rápidamente con una disolución que
contiene reactivo OPA-NAC
isoindol doble,
cistina,
la
por reacción de los dos
a semejanza de
etilenamina
, se favorece
(123),
lo
que
grupos
ocurre
con
siendo en este caso la
del compuesto formado prácticamente el
isoindoles de otros aminoácidos.
formación
amino
lisina
de
un
de
la
(10)
absortividad
doble
de
la
y
molar
de
los
0.8
0.6
o
0.4
0.2
o-
1
0
2
3
4
5
O P A - N A C X10*
Figura 51. - Influencia
de
la concentración
del
reactivo
OPA-NAC : (1) Adición lenta del reactivo sobre una
disolución
de cistina; (2) Adición de cistina sobre el reactivo ; (3)
en
ausencia de cistina.
Ce
i■ i
1 n<
—
6.87x10 ~ B M
(M)
- 218 -
Por otra parte,
se
observo
alcohol presente en la disolución
que
(la
la
proporción
disolución
de
OPA
de
es
et anol ica), influye tanto sobre la velocidad de la reacción de
cistina
con
disoluciones,
OPA-NAC
como
sobre
la
absorbancia
de
las
para proporciones superiores al 10 % respecto al
volumen total.
Así,
unas disoluciones que contenían cistina en
concentración
6.87x10"6
M
,
OPA
y
NAC
1x10"* M y etanol en proporciones del 0-10
en
%
concentración
, alcanzaron el
máximo de absorbancia a los 3 min de mezclados los
reactivos,
mientras que la misma disolución en presencia de un
35
etanol,
analítica
tardó
8
min
para
alcanzar
una
señal
constante, que resultó ser un 9 % inferior a la anterior.
%
de
- 219
4.-
-
ESTRUCTURA DEL PRODUCTO DE REACCION
1•~ D e t e r m i n a c i ó n
de
la
estec/uiom etría
Se utilizó el método
de
Asmus
(apartado
III.2.4)
para determinar la estequiómetría de la reacción de la cistina
con el reactivo OPA-NAC
El método se
.
aplicó
a
los
puntos
experimentales
indicados en la Figura 51 (curvas 1 y 2). En la Figura
muestra el diagrama obtenido en el primer caso,
estequiometría
1:1:1
, lo
que
esta
de
52
se
que indica una
acuerdo
con
la
absortividad molar de este producto de reacción
(<S~6400).
la
ecuación
constante
de
de
la
recta
obtenida
formación aproximada de log
mostró
i = 6.2
una
.
La aplicación del método de Asmus en el segundo caso
(curva 2) no conduce a resultados concluyentes,
por lo que
posible que coexistan dos compuestos
estequiómetría
1:1:1
(LUI)
y el 1:2:2
;
el
de
(LIV) .
S -C H ,- C H -N H -C O C H ,
I
COOH
COOH
COOH
LUI
N H -C O C H j
S -C H .-C H -N H C O C H j
7 I
S -C H ,-C H V
i
COOH
[ T / N - ch -ch ^ s-s -ch^ ch -nJ ^ J
COOH
COOH
L IV
es
n=2
6
4
220
2
O
12
14
A
Figura 52. - Determinación de la estequiometría del
producto
de reacción de la cistina con el reactivo OPA-NAC , obtenido
por adición lenta del reactivo. Método de Asmus.
Cci&tina
— 6.87x10"6 M ;
Copa
=
C nac
= 6x10 3 M
- 221 -
2.- Acidificación del producto de reacción
Se realizo una
del producto
OPA-NAC,
de
reacción
valoración
de
la
fotométrica
cistina
con
ácido-base
el
reactivo
en la que se utilizó como valorante HC1 0.01 M
la celda de valoración termostatada
cistina en concentración 3.5x10*6
concentración 2x 1 0 ” * M a pH 9.5
a
M
25°C
y
,
se
reactivo
En
introdujo
OPA-NAC
en
, y se observó la variación de
la absorbancia a 335 nm al acidificar la disolución.
Los
resultados
aparecen
en
la
Figura
observándose un acusado descenso de la absorbancia
Asimismo,
como se muestra en la Figura 54
producto de reacción de la cistina
con
, al
el
53
a
pH<3.5.
acidificar
reactivo
hasta pH = 1 , se produce un desplazamiento
,
el
OPA-NAC
hipsocrómico
del
máximo de absorción desde 335 nm a 325 nm , a
la
vez
acelera su descomposición.
la
absorbancia
descendió un 50%
en medio ácido,
Al cabo de
2 min
. Al añadir NaOH 0.1 M al
volvió
a
obtenerse
producto
la banda
a
del isoindol.
Sin
embargo,
la
gran
nm
Asi,
,
el
protonación
inestabilidad
de
derivado impidió obtener los valores de la(s) constante(s)
proton ac ió n.
se
obtenido
335
característica del isoindol formado en medio básico.
cambio espectral es muy probable que se deba a la
que
este
de
- 222 -
0
2
4
6
8
10
PH
Figura
53. - Variación
de
la
absorbancia
a 335
nm
acidificar el producto
de
reacción
de
la
cistina
con
reactivo OPA-NAC.
C
= 6.87x10-* M
;
C o p a
=
C r a c
= 2x10"* M
al
el
- 223
-
400
X (nm)
Figura 54. - Espectros de absorción del producto de
reacción
de
la cistina
con
el
reactivo
OPA-NAC
en:
(1)
medio
bórico-borato (2) medio ácido; (3) medio ácido (a los 2 min );
(4) tras alcalinizar el producto obtenido en (3).
CciBtino
= 6.87
xl0 ~ 6 M ; C
opa
=
C
nac
= 2x10 ~ 3 M
- 224 -
Estos resultados ponen de manifiesto que el producto
de reacción de la cistina con el reactivo OPA-NAC es
al obtenido cuando la cistina reacciona con
en ausencia de tiol
(apartado III.3 ,
LII).
el
o- ft aldehido,
En
este
caso se forma lentamente un producto a pH 9.5 } que
335 nm (£• =4.5 xl0 3 ) y que tras su acidificación,
banda de absorción a 440
nm
( <£ =
distinto
ultimo
absorbe
presenta
3.83x10a), que
a
una
permanece
estable durante varias horas.
El hecho de que la cistina forme un isoindol con
reactivo OPA-NAC
, a diferencia
de
lo
que
ocurría
el
con
el
reactivo OPA-ME puede deberse a dos causas:
1.- Al mayor carácter reductor del ME
cual no resulta probable,
respecto
del
NAC
, lo
ya que el potencial de reducción
no
se halla demasiado influenciado por el resto de la molécula.
2.- A la mayor estabilidad que muestran los derivados del NAC
muy superior a la obtenida con ME.
,
- 225 -
3. - Fluorescencia del producto de reacción
Para comprobar si el
cistina con el
fluorescente
reactivo
del
resto
producto
de
reacción
OPA-NAC
muestra
de
isoindoles,
los
el
de
la
comportamiento
se
prepararon
disoluciones que contenían OPA y NAC en concentración 1x10"8 M
en
ambos,
y
los
aminoácidos
isoleucina
concentración 5 x 1 0 “® M. Asimismo,
se
y
prepararon
cistina
en
disoluciones
análogas con el reactivo OPA-ME en las mismas concentraciones.
En
la
Figura
55
aparecen
representados
espectros de excitación y emisión de los derivados de
leucina y cistina para ambos reactivos.
ios
la iso­
Las longitudes de onda
para los derivados del reactivo OPA-NAC fueron A®* = 344 nm
A®.
= 445 n m , mientras que para
fueron
los
derivados
336 y 456 nm
, respectivamente.
A pesar
que
de
la
cistina
presenta
de
ME
los
y
éstas
mismos
máximos de emisión y excitación que el isoindol formado por la
isoleucina,
su intensidad de fluorescencia
fue
igual que ocurre cuando se utiliza ME como tiol.
el uso del reactivo OPA-NAC supone un aumento del
intensidad de fluorescencia,
inferior,
Sin
50%
al
embargo,
de
la
respecto a la obtenida con OPA-ME
- 226
-
120
100
80
60
250
350
550
X (nm)
Figura 55. - Espectros de excitación y emisión
del
producto
de reacción de la
isoleucina
y
cist ina
con
los
react ivos
OPA-NAC (1 y 3) y OPA-ME (2 y 4), respectivamente.
ClLE
=
C c i a t l n a
—
5X 10 “8
M *,
CoPA
-
C
NA C
—
C
ME
-
1X10
“3 M
- 227 -
La
menor
intensidad
de
del
fluorescencia
justificarse por la
presencia
átomo
molécula de cistina.
Además se debe tener
de
en
podría
azufre
cuenta
en
la
que
no
todos los isoindoles son fluorescentes.
Por otra parte,
el carácter dimérico de la
de cistina la hace semejante a
la
lisina,
que
comportamiento peculiar con el reactivo OPA-ME
molécula
presenta
.
un
Cuando se
adiciona SDS a una disolución de lisina' se produce un
aumento
importante en la fluorescencia del isoindol derivado,
por
que se anadio SDS (concentración final 0.4%) a
de cistina.
disolución
Sin embargo no se observó efecto alguno.
Este comportamiento no implica,
sin embargo,
se haya formado un isoindol doble. Chen y col.
también
la
un
aumento
en
la
leucil-triptófano al añadir SDS
fluorescencia
.
Debe
que
del
' péptido
considerarse
disustituída
(115).
Así,
si las interacciones
dol e isoindol-indol causan la extinción de
en los derivados de
lisina
y
de
que
««.-amino
leuci1-triptófano y el grupo indol del. triptófano es la
que la existente entre los dos grupos isoindol
no
(10) observaron
distancia entre el isoindol formado por el grupo
tivamente,
lo
de
la
la
del
misma
lisina
isoindol-isoinla
fluorescencia
leucil-triptófano, respec­
es razonable esperar en ambos el
mismo
efecto
de
aumento de fluorescencia al añadir SDS. La distancia entre los
dos grupos amino de la cistina es mayor,
por
lo
que
podría
explicarse que no se haya producido el efecto exaltador de
flu ore scencia.
la
- 228 -
III.5.3.- PARAMETROS ANALITICOS SIGNIFICATIVOS
La formación
adecuada
para
aminoácido.
En
linealidad,
su
de
un
isoindol
utilización
este
límites
apartado
de
en
se
de
la
cistina
determinación
muestra
detección
resulta
y
el
del
intervalo
de
determinación,
y
repetitividad, correspondientes a esta determinación.
1 .- Curva de calibrado
Se preparó una serie
-de
disoluciones que contenían
cantidades
OPA-NAC en concentración 2x10** M y
una disolución de cistina 8.63xl0~4 M
de concentraciones 1-8x10"* M
Los resultados
mostrando una
buena
se
variables
de
, abarcando el intervalo
.
representan
linealidad.
La
en
ecuación
la
Figura
de
la
56,
recta
obtenida fue:
A = -0.0047 + 1.207x104 Cciitint
r = 0.9999
- 229 -
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
2
4
CISTINA
x 105
Figura 56. - Curva de calibrado.
C o p a
=
C r a c
= 2x10“* M
(M)
- 230 -
2. - Limites de detección y determinación.
En este apartado se halla la concentración mínima de
cistina
que
procedimiento.
puede
detectarse
y
determinarse
por
Para ello se preparo una serie de
que contenían OPA y NAC
en
concentraciones
este
disoluciones
2x10"3
M
,
en
tampon bór ico -bo ra to, leyendo la absorbancia a 335 nm frente a
blanco agua.
Los resultados se muestran en
límites de detección y determinación,
lOs
la
Tabla
26
Los
según los criterios 3s y
, resultaron ser de 8.92 xl0 "7 M (0.21 jig/mi) y 2.06x10"* M
(0.50 ^ig/ml),
respectivamente.
Tabla
26. determinación
Límites
Experiencia n&
de
detección
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.033
0.030
0.028
0.030
0.033
0.033
0.028
0.028
0.029
0.029
X
0.030
s
0.0020
y
- 231 -
3 .- Pepe ti ti vi dad
Se prepararon
contenían
cistina
10
disoluciones
6.87x10"6
M
y
independientes
reactivo
OPA-NAC
concentración 2x 1 0 " 3 M , leyéndose la absorbancia frente a
que
en
un
blanco preparado en ausencia de cistina.
Los resultados se muestran en la Tabla 27
que el método
presenta
una
buena
, mostrando
re pe titividad, siendo
coeficiente de variación del 0.5 % .
Tabla 27. - R e p et i tiv id ad.
Ce 1 1 1 1 ni
=
6.87x10“6 M
Experiencia n&
;
C o p a - n a c
—
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.862
0.864
0.860
0.856
0.854
0.854
0.853
0.854
0.850
0.851
5
0.856
s
0.0045
2x10"* M
el
- 232 -
4.- Discusión
El método propuesto para la determinación de cistina
con el reactivo OPA-NAC en medio borico- bo ra to ,
ventajas de su sensibilidad,
rapidez
y
presenta
las
re producibilidad,
si
bien tiene los inconvenientes de la falta de selectividad y la
mayor inestabilidad del producto formado,
el método para la determinación de
apartado III.2. Por ello,
necesario utilizar
si lo comparamos con
cistina
propuesto
para aplicar este
t i o l , en medio borico-borato
producto de reacción a pH
¿
=
procedimiento
es
el procedimiento
la determinación de cistina con o-ftaldehido
(
el
método de separación.
algún
En contraposición,
sensible
en
4830)
1,
y
posterior
si
bien
presenta
en
para
ausencia
de
acidificación
es
la
propuesto
un
ventaja
del
método
menos
de
mayor
su
selectividad y mayor estabilidad de los productos formados.
La determinación de la concentración de
muy importante en la diagnosis de
la
cistinuria,
cistina
enfermedad
que se caracteriza por un aumento en la concentración de
aminoácido en la orina.
determina
cistina
cereales,
cerveza,
levaduras,
y caseína.
Otros tipos de muestra en los
son:
harina,
productos
cosméticos
chocolate y cacao,
huevos y productos derivados,
que
este
se
capilares,
tabaco,
gelatinas,
es
mostos,
e insulina
III.6.- DETERMINACION DE PROTEINAS CON O-FTALDEHIDO
Y N-ACETIL-L-CISTEINA
- 235 -
III.6.1.- INTRODUCCION
La determinación de la concentración de proteínas en
una muestra puede llevarse a cabo sobre -las proteínas intactas
o previa hidrólisis de las mismas,
proteína en el
primer
caso
aminoácidos en el segundo.
y
tomando como referencia una
un
aminoácido
Sin embargo,
o
mezcla
de
los métodos basados en
la hidrólisis son más exactos y sensibles.
1.- Analisis de néntidos y proteínas intactas
\
Joys y Kim
flagelar,
detección
(148),
en un estudio sobre la
utilizaron los reactivos OPA y
de
póptidos,
encontrando
ninhidrina
que
mientras
Salmonella
para
la
que
la
ninhidrina era capaz de detectar los 5 peptidos existentes,
el
reactivo OPA-ME tan sólo reaccionaba con aquellos peptidos que
contenían uñ residuo de
lisina
terminal.
confirmó que la respuesta fluorescente
de
Posteriormente
se
los
de
peptidos o proteínas con OPA depende tan sólo
derivados
del
terminal de la cadena de aminoácidos y de los grupos
de los residuos de lisina
grupo ot-NH*
<5-amino
(149):
w P
I, =
(
M
1Z<
+ n£ I¿ )
[35]
- 236 -
donde w P y M
molecular,
son el peso de la proteína o peptido y
n^ y
£-amino por mol
n € el numero de
moles
de proteína, y I^,
y
respuesta
fluorescente
grupos
peso
de
los
la
fluorescencia
mol de proteína de los grupos cX- y £-amino,
La
su
ex'-
y
por
respectivamente.
de los derivados
de
páptidos y proteínas con el reactivo OPA-ME varía ampliamente,
ya que depende casi exclusivamente de un solo
aminoácido,
lisina.
calibrado
Por esta razón,
determinar
un
peptido
elección del patrón.
albúmina
en
cuando se realiza un
proteína,
por
ejemplo,
es
mas
fluorescente
estas
albúmina como patrón,
se
determinan
para
es muy importante
Así,
general
globulinas y si
o
la
el
en
se obtienen valores
derivado
que
de
el
suero,
la
de
la
las
utilizando
anormalmente
bajos
(150).
En realidad,
todos
los
intactas
métodos
con excepción del método Kjeldhal,
existentes
proporcionan
valores
resultado debe expresarse como
determinada,
para
determinar
variables,
equivalentes
casi
proteínas
por
lo
que
el
de
la
proteína
respecto a una proteína tomada como referencia.
Puede lograrse una respuesta mas uniforme y sensible
con los diversos
hidrolizan,
peptidos
y
incrementándose así
proteínas,
el
numero
disponibles para la reacción (151-154).
si
previamente
de
grupos
se
amino
- 237 -
2 .- Análisis de peptidos .v proteínas hidrol izadas
En los procedimientos empleados en la hidrólisis
peptidos y proteínas se utilizan ácidos
enzimas
(157).
La
hidrólisis
exactitud y sencillez,
(2), bases
acida,
debido
de
(155-156)
a
su
o
mayor
es generalmente la más utilizada.
Butcher y Lowry (153) determinaron albúmina de suero
bovino con el
utilizando
reactivo
alanina
OPA-ME
como
, tras
aminoácido
su
de
recuperaciones fueron tan sólo de un 70 %
que no todos los aminoácidos
originan
hidrólisis
acida,
referencia.
Las
, lo que es debido a
compuestos
igualmente
fluorescentes e incluso algunos no reaccionan con OPA y ME
En realidad,
una
proteína
consiste
el único método seguro para
en
analizar
mediante
determinar
HPLC,
los
aminoácidos obtenidos tras hidrolizar la proteína, y sumar los
pesos de sus residuos.
Sin embargo,
el procedimiento es
largo
y requiere un equipo especializado.
Hortsman (158) describió un
determinación de
proteínas,
que
procedimiento
proporciona
una
prácticamente independiente de la composición de la
que se basa en su hidrólisis y la reacción de los
liberados
con
ninhidrina.
Esta
reacción
para
respuesta
misma,
respuesta similar para todos los aminoácidos proteicos
los
una
(159).
moles
de aminoácidos libres hallados por el peso molecular medio
los residuos de los aminoácidos.
y
aminoácidos
proporciona
La cantidad de proteína fue obtenida multiplicando
la
de
- 238 -
Posteriormente,
Peterson
reactivo OPA-ME en vez de la
como patrón,
(160) propuso
ninhidrina,
el
uso
utilizando
del
alanina
e incluyo un factor de corrección en los cálculos
para compensar las diferencias de la respuesta fluorescente de
los distintos aminoácidos.
aconsejable,
Sin embargo,
el método
debido a la inestabilidad de
reactivo OPA-ME
los
no
es
muy
derivados
del
.
III.6.2.- UTILIZACION
DEL
REACTIVO
O-FTALDEHIDO-N-ACETIL-
L-CISTEINA
Como se puso de manifiesto en el apartado III.4, los
aminoácidos reaccionan con el OPA en presencia de NAC a pH 9.5
\
para formar isoindoles,
que presentan una banda
con máximo a 335 nm y sensibilidades similares
de
absorción
(¿ m = 6830±360).
Los derivados formados presentan una alta estabilidad,
por
lo
que no se requiere un estricto control del tiempo de reacción.
En
este
espectrofotométrico
apartado
para
totales y proteínas con
utilizo
isoleucina,
que
la
este
determinación
reactivo.
tiene
absortividad molar intermedios
proponemos
(
un
£
de
Como
peso
=
un
método
aminoácidos
referencia
molecular
6740).
propuesto se incorporan factores de corrección,
En
el
y
se
una
método
que tienen
en
cuenta las diferencias entre las absortividades molares de los
distintos isoindoles y la recuperación de los aminoácidos tras
el proceso de hidrólisis.
- 239 -
1. - Procedimiento de hidrólisis
En tubos de vidrio de 15 cm de longitud y
diámetro,
previamente
introduce
la
limpios
proteína
sólida
con
mezcla
o
en
cm
de
su lf onítrica,
se
disolución
necesario para que su concentración final sea 6
final 1-2 mi
M
1
y
el
HC1
(
volumen
). Los tubos se sellan al vacio y se calientan
a
110° C
durante 24 h . Para facilitar el proceso
de sellado
vacio,
se realiza un pequeño estiramiento en la
zona media del
tubo y
se congela la muestra,
introduciendo los
tubos
frasco Dewar que contiene una mezcla frigorífica
y acetona
una vez
realizado
este,
llama del soplete sobre el estrechamiento,
tubo.
Una
vez
finalizado
el
proceso
muestras se guardan en frigorífico
Para abrir el tubo de
extremo superior,
metálicas húmedas,
por ultimo,
se
aplica
sellándose
de
así
hidrólisis,
hidrólisis,
se
calienta
se toca sin ejercer presión con unas
para favorecer la formación de
se golpea
ligeramente
esta
zona.
A 10 mi de esta disolución neutralizada
la
el
las
Se
su
pinzas
grietas
y,
lleva
el
mi, aforando
previamente
con NaOH 1 M , se añaden 10 mi del reactivo OPA-NAC en
borato de pH 9.5 y se afora a 25 mi
a
.
contenido del mismo hasta un volumen final de 25
con agua.
proceso
A continuación se conecta el tubo de hidrólisis
una bomba de vacío y
un
( CO* solido
) para evitar las perdidas de muestra en el
de sellado.
en
al
tampón
, leyendo la absorbencia a
335 nm frente a un blanco preparado en las mismas condiciones,
en ausencia de proteína.
- 240 -
2 ►” Recuperación
de
alecunos
aminoácidos
sometidos
al
tratamiento de hidrólisis
Se realizo una serie de experiencias para
averiguar
el efecto de las condiciones experimentales utilizadas
hidrólisis de las proteínas,
aminoácidos.
sobre la recuperación de
Los aminoácidos
según la bibliografía,
en
elegidos
fueron
la
algunos
aquellos,
que
se destruyen total o parcialmente,
asi
como otros que se consideran estables.
Para ello se prepararon disoluciones en HC1 6
M
de
los distintos aminoácidos en concentración 0.1 g/100 mi
y
se
procedió a su hidrólisis tomando
1
mi
de
la
muestra
Los
ensayos se realizaron por duplicado o triplicado.
En
la
Tabla
obtenidas considerando
28
las
se
muestran
las
absortividades
recuperaciones
molares
aminoácido incluidas en la Tabla 21. Se observó en
casos
una
hidrólisis.
tirosina,
buena
reproducibi1idad
tras
el
Las recuperaciones correspondientes a
glicina,
leucina,
valina
y
serina
de
cada
todos
los
proceso
de
isoleucina,
resultaron
próximas al 100 % , lo que indica que estos aminoácidos no son
afectados por el proceso
afectó de
manera
de
hidrólisis.
importante
a
la
acusada la destrucción de treonina y
hidrólisis,
formando
la
asparagina
amoniaco
respectivamente
(159)
y
.
y
ácido
la
Este
proceso
cisteina,
siendo
triptófano.
glutamina
aspártico
se
o
sólo
menos
Durante
la
descomponen
glutámico,
- 241 -
Tabla 28. - Análisis de aminoácidos.
Aminoácido
mg introducidos
Recuperación
Isoleucina
1.017
99.1
Tirosina
1.015
102.8
G1icina
1.008
103 .8
Leucina
1.005
99.5
Valina
1.015
101.0
Serina
1.011
97.3
Triptóf ano
1.009 .
84.0
Treonina
1.004
90.0
Cisteína
1 .008
21.0
(%)
- 242 -
3. - Cálculo
del
peso
molecular
promedio
.v
factores
de
correccion
Si se conoce la composición de la proteína,
se puede
calcular la cantidad de la misma (mg) a partir de la siguiente
expre si ón :
m = n x W x F
[36]
en donde n representa los mmoles de isoleucina equivalentes
a
los aminoácidos totales obtenidos en el proceso de hidrólisis;
W es el
peso
molecular
promedio
de
aminoácidos que constituyen la proteína
residuos varia desde 57 para la
triptófano).
Así,
(
glicina
residuos
el
peso
hasta
186
si se conoce la composición de la
y teniendo en cuenta
reactivo OPA-NAC,
los
que
la
por no ser
prolina
una
no
amina
de
de
estos
para
el
proteína,
reacciona
primaria,
los
con
se
el
puede
calcular W (158) a partir de la expresión:
19
ai b
[37]
i= l
W =
1 - ai
donde ai es la fracción molar del aminoácido i y
molecular de los residuos de
cada
aminoácido,
bi
que
el
peso
aparecen
reflejados en la Tabla 29. El subíndice i representa a los
aminoácidos proteicos primarios exceptuando a la prolina.
20
- 243 -
Por otro lado, F es
un
factor
de
corrección
que
viene dado por:
1
[3 8 ]
19
a if iRi
i= l
donde
fi
tiene
en
cuenta
las
diferencias
entre
las
absortividades molares de los distintos aminoácidos respecto a
la isoleucina:
<S*
fi = -------
[39]
6llZ
y Ri es el factor de recuperación del
proceso de hidrólisis. A la
asigna
los
valores
aspártico y glutámico,
de
fi
asparagina
aminoácido
y
glutamina
correspondientes
respectivamente.
i
a
los
tras
se
el
les
ácidos
- 244 -
Tabla 29. - Peso molecular de los
residuos
de
aminoácidos,
absortividades molares de los derivados de OPA-NAC y
cociente
de absortividades respecto a la isoleucina.
Aminoácido
bi
&
ft
Alanina
ALA
71
6830
1.013
Arginina
ARG
154
6480
0.961
Asparagina
ASN
114
6130
1.027
A c .Aspártico
ASP
115
6920
1.027
Cisteína
CYS
103
2700
0.400
A c .Glutámico
GLU
129
6910
1.025
Glutamina
GLN
128
6700
1.025
Glicina
GLY
57
7180
1.065
Histidina
HIS
138
6860
1.018
Isoleucina
ILE
113
6750
1.000
Leucina
LEU
113
6860
1.018
Lisina
LYS
128
10740
1.593
Metionina
MET
131
6930
1.028
Fenilalanina
PHE
147
6590
0.978
Serina
SER
87
6980
1.036
Treonina
THR
101
6850
1.016
Triptof ano
TRP
186
7830
1.162
Tirosina
TYR
163
6580
0. 976
Valina
VAL
99
6780
1.006
- 245 -
III.6.3.- APLICACION DEL METODO
1.- Análisis de mezclas de aminoácidos
Se
tirosina,
prepararon
glicina,
disoluciones
leucina, valina,
de
los
aminoácidos
isoleucina,
triptofano
treonina en concentración 0.1*g/100 mi
. Se tomaron
cantidades de estas disoluciones
preparar
deseadas.
1
mi
de
Por último,
estas
para
mezclas,
siguiendo
distintas
las
se sometió al tratamiento de
el
y
mezclas
hidrólisis
procedimiento
anteriormente descrito.
Las recuperaciones obtenidas aparecen
30.
Los
valores
procedimientos,
En el primero,
mostrados
se
en
calcularon
mezcla de aminoácidos,
isoleucina hallados.
, que tiene
se
en
dos
isoleucina.
de
la
los
mmoles
de
introdujo
además
el
W, y se multiplico por
En el segundo,
factor de corrección F
molecular
Tabla
según
que utilizan como referencia a la
se calculo el peso
la
cuenta
promedio
las
distintas
absortividades de los aminoácidos que componen la mezcla,
como sus recuperaciones.
de corrección,
al 5 % .
Como se observa,
asi
el empleo del factor
F, supone una mejora en los resultados,
próxima
Tabla 30. - Análisis de mezclas de aminoácidos.
Recuperación
Muestra
mg
introducidos
LEU + GLY
1.0065
95.5
0.954
108.8
103.8
GLY + TYR
1.0115
106. 3
0.962
109.0
104.8
GLY+TYR+LEU
0.9084
113.5
0. 968
108.4
104. 9
TYR+LEU+GLY+
+VAL+ILE+TRP+
+THR
0.9984
114.0
0.974
105. 5
102.8
F
R*
Rb
246
• m = n x W
b m = n x W x F
W
(%)
- 247 -
2. - Determinación de N-aminico en suero y orina
Muchas
alteraciones
del
metabolismo
aminoácidos se caracterizan por un aumento
de
los
indiscriminado
de
la concentración de estos en orina y/o suero.
Todos los métodos existentes para
de este parámetro hacen uso de un
la
aminoácido
determinación
de
referencia.
Ello supone que los diversos cX-aminoácidos reaccionan
reactivo
analítico
con
sensibilidades
con
ig ua les ,
el
lo
que
generalmente no ocurre.
El
reactivo
OPA-ME
se
ha
utilizado
para
determinación fluorimetrica de aminoácidos libres en
plasma desproteinizado con buenos resultados
(161),
haciendo
referencia.
procedimiento
embargo,
uso
Este
de
norleucina
aminoácido
estándar
que
es
emplea
suero
y
(LOD = 0.05 mg/1)
como
el
la
aminoácido
utilizado
ninhidrina
los resultados difieren en función del
de
en
el
(162).
Sin
aminoácido
mezcla de aminoácidos utilizados como referencia.
Tsai y
(163) también describieron un método flúorimetrico con
o
col.
OPA-ME
para analizar aminoácidos totales en suero desproteinizado con
tricloroacetico, consiguiendo un límite de
nmol de aminoácido y
requiriendo
tan
sólo
detección
5
sanguíneo. Compuestos como la urea, ácido úrico
no interfieren el análisis.
^il
y
de
de
0.1
suero
creatinina
- 248 -
En realidad,
hasta el momento,
el único
método
que
proporciona resultados exactos es el método gasométrico de
ninhidrina de Van Slyke
(164).
Sin embargo,
el
la
procedimiento
es lento y actualmente está en desuso.
Un procedimiento espectrofotometrico
del reactivo OPA-NAC puede resultar muy
determinaciones,
debido
a
que
adecuado
proporciona
similares para los diversos aminoácidos.
propuesto
se
utiliza
la
referencia y se calcula el
isoleucina
contenido
En
como
en
calibrado de
expresiones
con
la
el
reactivo
isoleucina,
para
uso
estas
procedimiento
aminoácido
nitrógeno
OPA-NAC,
aplicando'
haga
' sensibilidades
el
introduciendo el valor de la absorbancia de
derivatizarla
que
la
en
a
amínico,
muestra
la
de
tras
recta
de
continuación
las
[40] y [41] para la orina y suero, re spe cti vam ent e:
mg de N-amínico = n x 10* x 14 x V(24 h)/ V(m ues tra )
[40]
mg de N-amínico = n x 10* x 14 x 100 m l / V (m u e st ra )
[41]
donde n corresponde a los moles de isoleucina
equivalentes
a
los aminoácidos totales y 14 es el peso atómico del nitrógeno.
- 249 -
Sin embargo,
es aconsejable introducir un factor
de
corrección F, que tenga en cuenta las pequeñas variaciones
de
sensibilidad de los distintos aminoácidos
al
reaccionar
con
OPA-NAC:
i= l
------------n
>
a if t
i= l
F
[42]
donde ai son los moles del aminoácido i y fi
molar relativa
a
la
isoleucina,
que
se
la
absortividad
calcula
según
la
expresión [39] y cuyos valores aparecen reflejadas en la Tabla
29.
*
Para que el método sea viable,
factor
no
muestra.
varíe
demasiado
con
la
es necesario que este
composición
de
Asi, a continuación se calcularon los valores
la
máximo
y mínimo que puede alcanzar el factor de corrección F.
Para ello se utilizó,
Simplex modificado MSM
(165).
en
primer
Este
método
lugar,
de
multivariable permite hallar los valores máximo
el
optimización
y
mínimo
una función dependiente de una s erie de parámetros,
variar en un intervalo conocido,
este caso es el factor de
[42],
corre cción
siendo las variables,
en suero y en orina.
La
función
a
dado
por
los contenidos de cada
tipo
de
muestra,
de
que pueden
optimizar
Los límites de los contenidos
mínimos normales en cada
método
la
en
ecuación
aminoácido
máximos
expresados
y
como
- ¡250 -
yumol/24 h para la orina y yumol/100 mi para el
suero
indicados en la Tabla 31. Los valores normales de
totales expresados como nitrógeno amí'nico son
los
aminoácidos
para
4-6 mg de aminoácidos/ 100 mi y de 175-530 mg de
24 h para la orina
son
el
suero
aminoácidos/
(166).
El Simplex inicial se obtuvo para un tamaño inicial
de 1. El primer vértice se situó en los valores mínimos de las
variables,
y la región de variables se
estandarizo
modificación propuesta por Morgan y Deming
(167).
según
El
la
programa
utilizado se basa en el diagrama de flujo propuesto por Nelder
y Mead (168)^ que posteriomente fue descrito por
Cela
(169). Se realizaron los ciclos necesarios para que
y
col.
el
error
en la obtención del valor máximo o mínimo de la función
fuera
inferior al 0.01 % . Los resultados obtenidos fueron:
F««« = 0.978
, F.i» = 0.824
, F = 0.90 ± 0.08
para orina y
Fati = 0.940
, Fain = 0.810
, F = 0.88 ± 0.07
para suero.
Sin embargo,
los valores del factor de corrección
sólo deben interpretarse como la máxima dispersión
aparecer por aplicación del método.
que
F
puede
- 251 -
Tabla 31.
- Contenido en aminoácidos en orina y suero
(166).
Valores normales
Aminoácido
pmol/24 h*
Alanina
Arginina
Aspsragina
60-800
-
¿imol/100 m l b
17-50
4.6-15
270-700
2.6-8.6
Acido Aspártico
-
1.1-5.4
Cisteína
-
-
50-270
0-12
Glutamina
140-860
42-76
Glicina
160-4200
13-49
Histidina
130-2100
5.6-12
Isoleucina
18-210
3.5-10
Leucina
21-200
6.9-16
Lisina
48-640
9.0-26
Metionina
20-95
1.8-3.9
Fenilalanina
24-190
3.4-12
Acido Glutámico
Prolina
Serina
Treonina
-
-
160-700
6.1-19
85-400
7.5-25
-
-
Tirosina
40-270
3.2-8.7
Valina
14-51
Taurina
63-2300
3.5-14
Cistina
20-130
3.1-44
Triptóf ano
• Orina.
b Suero.
12-33
- 252 -
Por otra parte,
que
se
supuso
aminoácidos
una
mostrados
se realizo un segundo estudio en
muestra
en
ideal
la
Tabla
correspondientes a sus valores
lado,
el factor F para
esta
calcularon los factores F
conteniendo
31
medios.
muestra
,
Se
y
asignando
aminoácidos su valor máximo y mínimo
y
resto de aminoácidos,
El
el valor medio.
en
a
a
todos
el
los
concentraciones
calculó,
por
un
continuación,
se
cada
uno
manteniendo
proceso
de
los
para
se
el
repitió
para cada aminoácido.
Los
resultados
encontrando para la orina
0.931-0.968
se
''muestran
unos factores
en
la Tabla
F que
32
varían
, siendo el valor medio de 0.948
± 0.005
entre
,
coincide con el valor de F obtenido con la muestra ideal.
el suero se encontró
(0.864-0.941),
una
mayor
variación
en los
debido a que el número total de
moles
,
que
Para
factores
de
los
aminoácidos es inferior y a que el contenido de cistina es muy
variable.
aminoácido,
Así,
cualquier
pequeña
variación
que tiene un fi distinto del resto,
medida al resultado final,
en
este
afecta en gran
tal como se muestra en la Tabla 32.
El valor medio de F es 0.90 ± 0.01
este valor al de la muestra i d e a l .
, correspondiendo
asimismo
- 253 -
T a b l a 32. - V a l o r e s de l f a c t o r de
corrección
s ue r o , o b t e n i d o s a s i g n a n d o a c a d a u n o de
los
v a l o r m á x i m o y m í n i m o , m a n t e n i e n d o el r e s t o d e
su v a l o r m e d i o .
para
orina
y
aminoácidos
su
los a m i n o á c i d o s
ORINA
F
SUERO
= 0.949
F r 0.898
Aminoácido
Alanina
Fhin*
F m AX k
Fmih*
Fm a x k
0.947
0. 950
0.893
0. 902
-
-
0.896
0. 900
0.945
0. 952
0.896
0.900
Arginina
Asparagina
Acido
Aspártico
-
-
0.898
0.899
Acido
Glutámico
0. 948
0.949
0.897
0.900
Glutamina
0. 947
0. 950
0.894
0. 902
Glicina
0. 95 2
0.946
0.896
0. 900
Histidina
0. 944
0. 952
0.897
0.899
Isoleucina
0.948
0. 949
0.897
0.899
Leucina
0.948
0. 94 9
0.897
0.899
Lisina
0. 968
0.931
0. 91 0
0.887
Metionina
0. 94 8
0. 949
0.898
0.898
Fenilalanina
0. 94 8
0. 9 49
0.896
0.900
-
-
-
-
Serina
0. 94 8
0. 9 4 9
0.897
0.899
Treonina
0. 948
0. 949
0.896
0. 900
Tirosina
0. 947
0. 94 9
0.897
0.899
Valina
0.948
0.949
0.895
0.901
Taurina
0. 94 0
0. 955
0.896
0. 900
Cistina
0.953
0. 944
0.941
0.864
Prolina
F
* Valores
fc V a l o r e s
0.948
F*obtenidos
F obtenidos
con
con
± 0.005
0.90
lo s v a l o r e s m í n i m o s .
los v a l o r e s m á x i m o s .
± 0.01
- 254 -
Como se observa,
los valores medios obtenidos por el
método Simplex son ligeramente menores.
resulta
más
general,
independiente de la matriz,
0.90
conveniente
utilizar
Como
un
en
factor
la
practica
de
carácter
se eligió el valor
F =
, que es intermedio entre los obtenidos para ambos
tipos
de muestra.
los casos,
La aceptación de este factor supone,
un error que
no
excede
del
7.5%
en el peor de
,
lo
que
plenamente aceptable en la determinación de nitrógeno
es
amínico
total en aplicaciones clínicas.
I
El
procedimiento
propuesto
para
^-aminoácidos totales en suero, consistente
volumen de muestra del orden de 100
lectura de la absorbancia a 335 nm
siendo fácil de automatizar,
,
es
lo que puede
para los laboratorios clínicos.
(referido a la isoleucina).
^il,
el
en
análisis
añadir
reactivo
rápido
ser
a
OPA-NAC
de
un
y
y
sencillo,
muy
apropiado
El LOD previsto es de 1-5 mg/1
- 255 -
3.- Analisis de proteínas
a ) Sensibilidad y recuperación
£1 método propuesto se aplico
proteínas de composición conocida,
al
albúmina
(BSA), normalmente utilizada como patrón
proteínas,
y que presenta una riqueza
parcialmente
hidrolizada,
composición de BSA
con
una
del
de
suero
el
96%
riqueza
de los aminoácidos que las constituyen)
la
de
en
(170) y caseína (171)
33. Los valores indicados para
análisis
bovino
análisis
,
del
y
86%
caseína
en
se
de
caseína
(fracciones
aparece
dos
.
La
molares
la
Tabla
obtuvieron
a
partir de las fracciones en peso dadas por el fabricante.
^
ñ
Se prepararon disoluciones
conteniendo la primera 0.2567g
/100
0.2464 g/100 mi de BSA pura) y
la
(correspondientes
respectivamente
a
y
0.1950
se
g/100
tomaron
de
BSA
mi
(correspondientes
segunda
mi
de
distintas
y
de
0.2268
caseína
alícuotas
sometieron al proceso de hidrólisis acida descrito.
caseína,
g/100
a
mi
pura),
que
se
- 256 -
Tabla 33. - Composición de la albúmina de suero bovino
la caseína.
y
ai x 100*
Aminoácido
BSA (170)
Alanina
Arginina
caseína
8.13
2.90
3.89
3.72
(171)
>
Asparagina
►
9.36*
|
7.20*
Acido Aspártico
Cisteína
-
6.18
Acido Glutámico
} 13.25*
|
21.60*
Glutamina
G1icina
2.83
1.63
Histidina
3.00
2.90
Isoleucina
2.30
5.11
10.78
8.86
Lisina
9.89
7.90
Metionina
0.71
2. 90
Fenilalanina
4.59
4.76
Prolina
4. 95
9.41
Serina
4.59
5.81
Treonina
5.65
4.41
Triptóf ano
0.35
1.16
Tirosina
3.36
3.37
Valina
6.18
6.39
Leucina
• Fracciones molares.
* El valor indicado corresponde a la suma de las
molares de los dos aminoácidos.
fracciones
de
- 257 -
A
partir
de
los
resultados
obtenidos
con
distintas concentraciones de proteína se ajustaron las
las
rectas
de calibrado:
Para B S A :
A = 0.0067 + 3.514x10®
Para caseína:
La
r = 0.9990
C b s a
A = 0.0062 + 1.283x10® C e t i t u »
hidrólisis
de
las
proteínas
r = 0.9995
y
consiguiente
determinación de los aminoácidos libres con OPA-NAC supone
aumentó de la sensibilidad,
respecto a la determinación de las
proteínas intactas con el mismo reactivo
(ver apartado III.6.3.5.
en
un
factor
parte,
otra,
como
^xlO
a y b).
En la Tabla 34 se muestran los resultados
tomando isoleucina
un
referencia
el peso molecular promedio,
por
una
W (procedimiento a), y
por
el factor WF (procedimiento b ) .
y
utilizando,
En
los
dos
obtuvieron recuperaciones aceptables, mejorándose en
cuando se aplica el factor W F .
obtenidos
casos
un
se
5
%
- 258 -
Tabla 34. - Análisis de proteínas.
Recuperación
{%)
mg
Muestra
introducidos
Albúmina de
0.386
suero bovino
0.676
W
F
100 .7
100.8
105.1
0.740
94. 2
98. 1
0.966
94.8
102.4
0.979
93 .7
97.7
1.232
89.0
92.8
1.725
90.0
93 .8
1.043
-
94.2±4. 0 98.7 ± 4 .5
96.8
100 .9
0.390
99.8
104. 1
0.585
96. 1
100.2
0.780
94. 5
98.6
0. 975
96.7
100.8
0.194
120.4
1.042
Valor medio :
• m = n x W
b m = n x W x F
Rb
96. 6
119.5
Valor m e d i o ;
Caseína
R-
9 6. 8± 1.9 100.9 ± 2 .0
- 259 -
b ) Limites de detección
y determinación
Se realizó una serie de experiencias con el
determinar
la
cantidad
mínima
de
proteína,
determinarse y detectarse mediante el método
ello
y
1
mi
de
HC1
,
siguiéndose
a
que
de
de
puede
propuesto.
se hicieron diez hidrólisis independientes
agua
fin
Para
1 mi
de
continuación
el
procedimiento habitual.
Los resultados se muestran en la Tabla 35. £1 limite
de detección y determinación según los criterios 3s y 1.0s
de 9.22x10"9 M (0.62 fig/ml) y 3.07x10-» M
BSA
para
,
y 2.53x10-» M (0.61 ¿ig/ml) y
la caseína
y 0.1292 mg de
(2.06
8.4xl0~»
M
yug/ml)
fue
para
(2.02 /ig/ml)
(correspondientes a la hidrólisis de 0.0388 mg
BSA
,
y
0.0381
y
0.1271
respectivamente).
Tabla 35. - Límite de detección.
Experiencia n*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
X
s
0.001
0.002
0.005
0.023
0.002
0.008
0. 0 03
0.007
0.033
0.018
0.0102
0.011
mg
de
caseína,
- 260 -
c ) Reproducibi1 idad
Para obtener
la
reproducibilidad
del
introdujo en diez tubos de hidrólisis 1 mi de
que contenía 55 mg/100 mi de BSA y HC1 6
M
método,
una
y
se
disolución
se
sometió
a
hi dr ól is is .
Los resultados aparecen en la Tabla 36
,
que el método presenta una buena reproducibilidad,
coeficiente de variación del 2.4 %
cientes de variación
de
indicando
siendo
. Por otra parte,los coefi­
correspondientes
distintas cantidades de proteína
a
las
(Tabla 34)
recuperaciones
fueron de
4.5% para BSA y un 2% para la caseína.
Tabla 36. - Reproducibilidad.
C b s a
= 55 mg/100 mi (en el* tubo de hidrólisis) .
Experiencia na
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.453
0.458
0.440
0.451
0. 445
0.457
0.436
0.424
0.439
0.453
X
0. 446
0.011
s
el
un
- 261 -
4.- Generalización del método
Para que
el
método
propuesto
sea
g e n e r a l , es conveniente que exista un factor
universal,
que permita conocer el contenido
de
WF
aplicación
de
en
carácter
proteínas
de
una mezcla o de una proteína de composición desconocida.
Para ello,
una
mínima
es importante por una parte,
variación
del
factor
F
al
composición de la muestra de proteínas,
coeficientes fi
constante y fi =
[39]
1).
espectrofotométricos
ventajosos
que
(en
el
En
este
que
los
caso
hacen
rendimientos
cuánticos
la
lo que depende de
los
sentido,
de
fluorimétricos,
absortividades molares presentan menor
de
exista
modificarse
ideal,
uso
que
el
factor F será
los
procedimientos
OPA
resultan
puesto
que
variabilidad
fluorescencia,
al
mas
las
que
estar
los
menos
afectada la absorción por el entorno molecular.
Por otro lado,
la distribución de los aminoácidos en
las proteínas de distintos organismos es
Doolittle y col.
(172) realizaron un
estudio
mostraba la distribución de aminoácidos
peptidos
Sequences
y
proteínas,
and
Structure
listados
y
en
en
184
recogidas en la Enciclopedia Newat.
ambas distribuciones.
bastante
en
homogénea.
el
encontrados
el
Atlas
peptidos
of
y
que
en
se
1081
Protein
proteínas
En la Tabla 37 se muestran
- 262 -
Tabla
37.
- D i s t r i b u c i ó n do los a m i n oá ci d os
ai
(172).
x 100*
Aminoácido
Atlas
Newat
G1icina
9.09
8.12
Alanina
8.48
7 .75
Leucina
7.56
8.75
Serina
7.47
6.16
Lisina
7.12
6.36
Valina
6.57
6.10
Treonina
6.19
5.59
Prolina
5.49
4.96
Acido Glutámico
5.39
6.89
Acido
5.16
6.66
Arginina
4. 37
5.29
Isoleucina
4.02
5 .18
Fenilalanina
4.02
3.98
Asparagina
3.84
4.11
Glutamina
3. 50
3.78
Tirosina
3.28
3.48
. Cisteína
3.28
2.00
Histidina
2.42
2 .30
Metionina
1. 60
2.12
Tr iptáf ano
1.11
1 .45
Aspártico
W
109. 3
113.1
F
1.035
1.011
WF
113 .1
114 .3
• Fracciones
molares.
- 263 -
En la misma tabla se muestra el valor WF
distribución,
posible
siendo el valor medio, WF
calcular
el
contenido
(mg)
=
para
113.7
de
una
.
cada
Así,
es
proteína
composición desconocida o de una mezcla de proteínas,
de
a partir
de la expresión:
m = n x l l 3 . 7
Horstman
(158) aplico su procedimiento
ninhidrina como reactivo,
en membrana de eritrocito,
al 100 %
el
aplicar
(173) y el del
método
inconvenientes
con
a
la
biuret
misma
(174),
,
ninhidrina
calentamiento
absorbancia
inconvenientes,
como hemos
del
a
posee
una
durante
no
el
recupera­
Sin
serie
de
en
la reacción es
es
demostrado,
muestra
debe prepararse
100°C
blanco
próximas
las
atmosfera inerte y almacenarse en la oscuridad;
además,la
proteínas
respectivamente.
: El reactivo es inestable,
lenta y requiere
utiliza
obteniendo recuperaciones
ciones fueron tan solo del 80% y 50%
embargo,
que
al análisis de mezclas de
, mientras que al
método de Lowry
[43]
20
min
alta.
los
y
Estos
presenta
el
también
al
método aquí propuesto.
Este
análisis
de
procedimiento
micromue str as,
puede
aplicarse
haciendo
uso
de
capilares
(volúmenes de muestra del orden de 15 yul) , lo
que
permitiría
la determinación de 1-100 yjg de proteína.
- 264 -
5.- Análisis de aminoácidos libres en proteínas parcialmente
hidrolizadas
Los aminoácidos
parcialmente hidrolizada
entre
los
resultados
libres
presentes
deben
en
determinarse
una
por
obtenidos,
al
analizar
parcialmente hidrolizada y después
de
su
proteína
diferencia
la
proteína
hidrólisis
total,
debido a que las proteínas intactas también reaccionan con
el
reactivo O P A - N A C .
Efectivamente,
III.6.1.1
se
, el OPA reacciona con
lisina y con
intactas.
como
el
grupo
Church y col.
of-amino
(117)
comento
los
en
grupos
terminal
examinaron
la
, y obtuvieron una
de laabsorbancia con la
concentración
A
partir
de
del
las
proteína,
, Su
de
la
proteínas
absorbancia
relación
de
lineal
^3-lactoglobulina,
cociente
absortividades molares de la proteína intacta, £i
grupo amino
apartado
£-amino
de
derivados proteína-OPA-ME
con una pendiente de lxlOB .
el
, calcularon el numero de grupos
y
de
las
la de un
amino de la
(ni.ys + 1), que contribuyen a la absorbancia:
ST
(n l t s + 1) =
El valor
obtenido
fue
de
16.7
[44]
grupos
amino
por
^-l ac to globulina, siendo el valor teórico de 16 grupos
un grupo amino terminal y 15 residuos de lisina.
mol
de
amino:
Por su parte,
- 265 -
la
protombina
humana
presento
una
1.77x10*,
que corresponde a
proteína,
frente al valor teórico para
grupos amino:
29.5
absortividad
grupos
amino
esta
molar
de
mol
de
de
30
por
proteína
uno terminal y 29 residuos de lisina.
a ) Estimación de la absortividad molar del
derivado
de
una
proteína intacta
Para determinar el contenido en aminoácidos libres en
una proteína parcialmente hidrolizada,
absortividad molar de
la
proteína
OPA-NAC
en
muchos
. Sin embargo,
intacta
casos,
parcialmente hidrolizada sea soluble
poco soluble,
es necesario conocer
con
el
reactivo
aunque
la
proteína
, la proteína
incluso en medio ligeramente básico,
no resulta sencillo
realizar
un
la
calibrado
intacta
por
para
es
lo
que
obtener
su
absortividad molar.
No obstante,
la
absortividad
proteína-OPA-NAC puede calcularse
teniendo en cuenta la ecuación [44]
<£i =
de
una
molar
forma
aminoácidos libres,
de
= 6830
derivado
aproximada,
:
( n l t s + 1 ) <£.m
Se puede suponer que la absortividad molar de
formados con los grupos
del
y
[45]
los
isoindoles
£-amino es semejante a la de
que presentan con OPA-NAC un
. Por otra parte,
el número de grupos
valor
de
los
medio
lisina
- 266 -
puede
obtenerse
multiplicando
existentes en un mol de proteína,
de lisina en esa proteína,
el
n*
numero
de
, por la
aminoácidos
fracción
ax.rs:
niT8 = n* x ax.Ts
Si no se conociera el valor de n«
una forma aproximada,
molar
[46]
, este puede
calcularse
dividiendo la absortividad molar
proteína totalmente hidrolizada,
molar media para cada grupo amino
&■
,
por
la
de
de
la
absortividad
( £.** = 6830):
[47]
n« =
-----
Para comprobar la validez del método,
a la determinación de la absortividad molar
soluble en agua,
la BSA
de
este se aplicó
una
proteína
, comparando el valor estimado con
el
obtenido experimentalmente.
Se calculó el numero de
aminoácidos
presentes
mol de proteína a partir de la recta de calibrado,
por
obtenida en
el apartado III.6.3.3 para la albdmina hidrolizada:
A = 0.0067 + 3.514x10® C b s a
r = 0.999
- 267 -
A pa rt ir del v a l or de <Sh , y a p l i c a n d o la e x p r e s i ó n
[47],
se
obt i e n e :
3.514x10*
n0 =
5 14
6830
es
decir,
cada
aminoácidos,
mol
de
albúmina
de los cuales
molar de lisina,
50.8
arrs = 0.0989)
contiene
serán
(Tabla
estimado de la absortividad molar de la
3 .470x1015
de
514
lisina
33).
de
(fracción
Así,
proteína
el
valor
intacta
es
[45].
Para conocer la absortividad molar
intacta se preparó una serie
cantidades
moles
variables
de
de
BSA
de
disoluciones
y
la
que
reactivo
concentración 2x10"* M en medio bórico-borato. La
albúmina
contenían
OPA-NAC
en
ecuación de
la recta obtenida fue:
A = 0.04 + 3.363x10*
Como se observa,
r = 0.9999
C . sa
el valor estimado
de
prácticamente con el obtenido experimentalmente.
<Si
coincide
- 268 -
b)
Determinación
del
contenido
en
aminoácidos
libres en
caseína parcialmente hidrolizada
En este apartado se desarrolla un procedimiento para
determinar los aminoácidos libres en una proteína parcialmente
hidrolizada,
aplicándolo a la determinación de una muestra
de
c as eí na .
El numero de moles totales de proteína
, nT
suma del numero de moles de la proteína intacta,
proteína hidrolizada,
na
ni
la
, y de la
:
nT s ni + na
A su vez,
, es
el numero de moles de
[48]
aminoácidos
libres
se puede calcular multiplicando el numero de moles de proteína
hidrolizada,
na
mol de proteína,
, por el numero de aminoácidos existentes
n®
:
n a > = nH x n©
[49]
A la absorbancia contribuyen tanto
libres,
n*m
por
, como los grupos «'-amino terminal
los
y
aminoácidos
6- am in o
los residuos de lisina de la proteína intacta:
A x V = nA- x £.m + m
donde
V es el volumen de la disolución.
x «Si
[50]
de
- 269 -
Por
hidrolizada,
ultimo,
m
, se
el
numero
obtiene
a
de
moles
partir
de
de
[48]
proteína
y
[50]
,
llegando a la expresión:
m
A x V - nA> x £.*
= nT - -------6i
[51]
y a partir de [49] y [51]:
nr - (AxV/£i)
[52]
(1/n.) - (£*/£,)
>
Se
comprobo
aplicándolo
a
la
caseína
riqueza del 86 %
y
un
validez
del
parcialmente
contenido
en
método
hidrolizada,
aminoácidos
44.18 % , siendo su peso molecular 24000. El valor
obtuvo considerando la riqueza
fabricante.
calcularse
Si
a
este
partir
valor
de
en
no
los
hidrolizar totalmente la proteína
OlpA-NAC,
caseína
se
con
conociera,
una
libres
de
indicada
resultados
y
propuesto
nT
se
por
el
nT
podría
obtenidos,
hacerla
del
reaccionar
tras
con
tal como se ha descrito en el apartado III. 6.3.3. Por
su parte, £i y no se obtuvieron a
[45] y [47],
III.6.3.3) .
partir
siendo bits = 0.0790 y £h =
de
las
1.283x10®
ecuaciones
(apartado
- 270 -
Los valores hallados
no = 187.8
, mis
= 15
,
£.1
fueron
:
= 16x6830 = 1.093xl08 . El
final de las disoluciones fue de 25 mi
volumen
.
Los resultados aparecen reflejados en la
mostrando una buena concordancia con los
valores
Tabla
38,
declarados,
siendo el contenido medio del 42.7 % (CV = 3.0 %).
Tabla 38. - Determinación del contenido en aminoácidos libres
en caseína parcialmente hidrolizada.
mg
introducidos
nTxn»
xlO *
nA m
xlO •
0.1952
1.53
0.85
44.5
0.3904
3.06
1.76
42.4
0.5856
4.59
2.65
42.2
0.9761
7.65
4.47
41. 6
Valor medio;
Riqueza
42.7±1 .3
- 271 -
El procedimiento puede aplicarse a la
de la actividad proteolítica de
col.
(117-118)
desarrollaron
diversas
un
hicieron uso del reactivo OPA-ME,
inestabilidad de los isoindoles
enzimas.
procedimiento
sin
embargo,
obtenidos,
estricto control del tiempo de reacción.
determinación
La
es
gran
Church
en
debido
que
a
la
necesario
un
estabilidad
de los derivados de OPA-NAC puede facilitar enormemente
determinaciones.
el
y
estas
DETERMINACION DE
N-ACETIL-L-CISTEINA
EN
PREPARADOS FARMACEUTICOS CON O-FTALDEHIDO
E ISOLEUCINA.
- 275 -
III.7.1.- IMPORTANCIA FARMACOLOGICA
La N-acetil-L-cisteína, generalmente su
sal
sódica,
es un agente mucolítico que se usa junto a otras terapias para
reducir la viscosidad de
las
secreciones
pulmonares
fibrosis cística del páncreas y en otras afecciones,
requiere
una
terapia
mucolítica,
presentando
actividad en concentraciones del 10-20% a pH 7-9
en
la
donde
se
su
mayor
.
El NAC es un compuesto soluble en 5 partes de agua y
en 4 de alcohol,
eter.
y prácticamente
insoluble
El pH de una disolución de NAC al 1%
en
es
cloroformo
2-2.75
y
y
una
disolución al 4.58% es isoosmotica con el suero.
Es incompatible
caucho,
oxígeno
y
con
sustancias
la
de
oxidantes,
lactobionato
de
erimicina,
hidrocloruro
de
oxitetraciclina
te traciclina.
mayoría
fosfato
e
los
así
de
metales,
como
con
cleandomicina,
hidrocloruro
de
- 276 -
III.7.2.- METODOS DE ANALISIS
La N-acetil-L-cisteína puede determinarse
de
cualquiera
(carboxilo,
de
los
grupos
funcionales
a
que
través
contiene
acetamida o tiol) o evaluando el nitrógeno por
el
método Kjeldahl.
En general,
los métodos analíticos de
de NAC se basan en la
1975,
reaccionabilidad
del
determinación
grupo
tiol.
Friedman hizo una revisión de estos métodos
(175).
En
Los
procedimientos analíticos existentes para la determinación del
grupo tiol
incluyen
valoraciones
amperom ét ri ca s,
métricas y espectrofotométricas, cromatografía de
iónico, gas-líquido,
potencio-
intercambio
papel y capa fina.
Los métodos propuestos para el análisis
productos farmacéuticos se pueden clasificar,
de
NAC
en
atendiendo a
la
reacción que tiene lugar en :
1.- Oxidación del grupo tiol
2.- Formación de mercapturos metálicos
3.- Reacciones con compuestos cromóforos
Sin
embargo,
en
general
dichos
métodos
aplicado tan solo a disoluciones acuosas de NAC.
se
han
- 277 -
1 .- O x i d a c i ó n del g r u y o tiol
La oxidación del grupo tiol puede
dar
lugar
a
la
formación de un disulfuro:
2 RSH ---- > RSSR + 2 H + + 2 e"
[53]
Con oxidantes fuertes puede incluso pasar a S(IV) o S(VI),
embargo,
los
procedimientos
oxidaciones son escasas,
basados
en
estas
ya que son difíciles de
sin
ultimas
controlar
y
pueden reaccionar también otros grupos reductores.
\
El
iodo
se
ha
valoración potenciométrica
propuesto
de
NAC
como oxidante
(176).
Sin
en
embargo,
consumo de iodo puede ser superior al que correspondería a
reacción [53], dependiendo principalmente de la
del tiol. Las disoluciones
diluidas
del
oxidarse a grados de oxidación superiores
col.
la
el
la
concentración
tiol tienden
a
(177).
y
Motonaka
(178) propusieron la siguiente reacción:
RSH + 3 1 2
+ 3 H 2 0 ------ > RSO.H + 6 HI
[54]
aplicándola a la determinación de NAC en el intervalo
( 0.008-
8.6
liberado
mg
) y valorando potenciometricamente el
con Ag(I),
ioduro
haciendo uso de un electrodo selectivo de ioduro.
- 278 -
Análogamente,
o bromo da lugar a
la
la oxidación del grupo tiol
formación
del
sulfónico [54]. Aunque la reacción
veces mas rápida que con bromo,
con
cloro
correspondiente
ácido
con
en
cloro
análisis
utiliza con preferencia
el bromo debido a la
de manejo y estabilidad
de sus disoluciones
Los problemas derivados de la
disoluciones de cloro
pueden
es
unas
volumétrico
se
mayor facilidad
(179).
inestabilidad
evitarse
50
valorando
de
con
las
cloro
el ectrogenerado. Se ha propuesto un método cloroculombimetrico
(180),
que
utiliza
rojo
d e J metilo
como
determinar NAC en estado puro y en fármacos.
interferido por otras
sustancias
que
indicador,
El método
reaccionan
para
se
con
ve
cloro
(reductores y compuestos insaturados). La valoración con bromo
electrogenerado no conduce a resultados satisfactorios
debido
a la lentitud de la reacción.
Verma
analítico
(181)
del
evaluó
comparativamente
tetrationato,
ferricianuro como oxidantes en
hierro(III),
la
ya que es de
acción
de
rápida
y
tiourea y ácido ascórbico.
y
tioles,
el tetrationato
incluso en presencia de sustancias que interfieren
utilizan los otros oxidantes,
potencial
cistina
determinación
entre ellos NAC. De los cuatro reactivos,
el mejor oxidante,
el
fue
selectiva,
cuando
a excepción de sulfuro,
se
sulfito,
- 279 -
El tetrationato no reacciona a pH ácidos con el tiol
y sin embargo en tampon fosfato,
a pH 7, tiene lugar rapida
y
cuantitativamente la siguiente reacción:
R-SH + S «Oe2 “ --------- >
RS-SaOs*"
+ S * 0 8*- + H +
La valoración con iodo del tiosulfato
utilizarse para la determinación cuantitativa
embargo,
debido a que las disoluciones muy
(^5xl0“* M) son bastante inestables,
[55]
formado
del
tiol.
diluidas
es
puede
Sin
de
preferible
iodo
utilizar
como valorante del tiosulfato formado el monocloruro de
iodo,
siendo la reacción de valoración:
IC1 + 2 S s O * 8- + H + --------- > 1“ + HC1 + S «Oe 8“
[56]
El punto final se pone de manifiesto por la formación de iodo,
que se detecta con almidón.
Otro método basado en el poder
tiol es el propuesto por Raggi y col.
tiol con Fe(III)
reductor
del
grupo
(182). La oxidación
del
en presencia de 1,10-fenantrolina, da lugar a
la formación cuantitativa del complejo t r i s (1,10-fenantrolina)
hierro(II),
el cual se mide espectrofotometricamente a 515
( £ = 10800 para NAC
) después de 20 min
.
2 F e + * + 2 R - S H --------- > 2 F e +8 + R-S-S-R + 2 H +
F e 2 + + 3 (C 1 2 H . N 2 )
>[Fe(CiaHaN 2 )s]2+
[57]
[58]
nm
- 280 -
La aplicación del método a disoluciones
inyectables
de NAC conduce a recuperaciones del 100.1% respecto
declarado,
al
valor
con una desviación estándar relativa del 0.6%
,
no
son
la
interfiriendo el
NaaEDTA presente en algunos preparados.
2.— Formación de
mercaoturos metálicos
Las valoraciones con sales de Hg(II) o Ag(I)
base de la mayoría
de
los
métodos
tioles de importancia biológica
de
análisis
R-SHgX,
la
formación
(RS)aHg o (RS)aHga.
de
los
(183-184).
La reacción de los tioles con las
da lugar a
de
mercapturos
La
sales
mercúricas
metálicos, .e.g.
estequiometría
del
compuesto
formado depende principalmente de la sal mercúrica elegida,
ya
que si el Hg(II)
la
sal,
forma complejos estables con el anión
este puede competir con el tiol. También
razones de tipo esterico asociadas a
grupos tiol con un ion mercurio;
la
pueden
interacción
en consecuencia,
a
de
influir
de
dos
veces
difícil conocer la estequiometría de la reacción.
Los tioles reaccionan con HgCla
RSH + HgCla
según:
> RS-HgCl + HC1
[59]
es
- 281 -
La valoración del acido formado,
indicador,
permite
la
utilizando fenolftaleína como
determinación
del
tiol
evitar la formación del hidróxido mercúrico,
exceso de Hg(II)
con ioduro.
Sin embargo,
ser aplicado
directamente
a
grupos ácidos
(como el N A C ) ,
muestras
ni
(185).
se
compleja
neutralizarse
ácidos
que
ácidos
previamente
a
la
la
contengan
libres,
ya
si
se
otros
que
Puesto
fenolftaleína,
muestra
el
este método no puede
necesaria la neutralización previa de los mismos.
todos los tioles son
Para
no
es
que
puede
utiliza
este
in di ca do r.
Verma y Gulati
utilizando
rojo
de
(186) modificaron el método
fenol
valoración final como para
muestra,
como
la
indicador,
tanto
neutralización
se formaría HgS
,
para
la
de
la
en
el
previa
y lo aplicaron a la determinación de NAC.
fármaco existiera sulfuro,
anterior
Si
siendo
entonces
preferible la detección potenciométrica del punto final.
El método oficial para determinar
NAC
(187-188)
basa en la valoración potenciométrica directa del
con
nitrato
mercúrico,
oro-calomelanos.
ambigüedades,
Sin
usando
embargo,
un
este
sistema
de
método
posee
debido a la incertidumbre de
del producto formado
(189).
grupo
la
se
tiol
electrodos
algunas
estequiometría
- 282 -
Por otro lado,
Hg(AcO)a
cuando se
, en medio acuoso,
2 RSH + Hg(AcO)»
utiliza acetato mercúrico,
tiene lugar la siguiente reacción:
----- > RS-Hg-SR + 2 AcOH
mientras que en medio acético la
reacción
[60]
puede
transcurrir
sin liberación de protones por parte del grupo tiol:
2 RSH + H g ( A c O ) a ----- > R - S - > H g 8 + <-S-R
Dado
coexistir,
que
ambas
I
I
H
H
reacciones,
+ 2 AcO"
[60]
y
[61],
propusieron
la
valoración
Hg(AcO)a en medio acético,
mercurio como
electrodo
Billabert y Hammon
potenciométrica
de
a
la
indicador.
formación
formaría
con
utilizando un electrodo de gotas de
del
estequiometria 2:1 y el segundo,
se
(190)
tioles
Para
el
NAC
potencial vs pHg muestra dos saltos diferenciados.
Este ultimo
pueden
resulta inviable la determinación del tiol a partir
de la valoración del acido liberado.
corresponde
[61]
a
compuesto
la
El
curva
primero
NAC:Hg(II)
al
de
estequiometría
través
de
los
carboxilo de la molécula de NAC
. El método
grupos
se
aplico
de
1:1.
tiol
a
y
la
determinación de NAC en disoluciones utilizadas en aerosoles.
- 283 -
Existen otros métodos mas elaborados para determinar
tioles,
basados también en
Hg(II).
El
acido
la
formación
de
o-hidroximercuribenzoico
mercapturos
(HMB)
ha
de
sido
propuesto para la valoración directa de tioles en presencia de
ditiofluoresceína como indicador.
HMB forman un complejo incoloro,
HMB-tiol.
Por otra parte,
muestra,
seguido
determinación
de
La
,
y
el
menos estable que el complejo
la adición de un exceso de HMB a
la
adición
espectrofometrica
ditiofluoresceína
ditiofluoresceína
permite
de
(588
evaluar
la
ditiofluoresceína
nm)
el
del
y
exceso
contenido
de
de
tiol
(191).
Walendziak y Jadczak (192) propusieron la
selectiva
de
tioles
ionogenicos
2-mercaptopropionico,
NAC
y
(ácidos
detección
tioglicólico
glutation)
después
de
separación por electroforesis. La ditiofluoresceína, de
azul,
liberada
en
la
fluoresceína con tioles,
La Ag(I)
reacción
del
conteniendo
color
HMB-ditio-
reacciona también con NAC según:
(193)
determinó
hidrocloruro
de
+ HNO*
NAC
de electrodos calomelanos/Ag
. Los
[62]
en
policarpina
valoración potenciométrica con AgNOs
del 10% .
su
se determinó fotometricamente.
RSH + A g N O s ------ > RS-Ag
Vogel
complejo
y
y
gotas
oculares
NAC,
mediante
, utilizando
errores
un
cometidos
sistema
fueron
- 284 -
Santi y Peillon
Ag(I)
en medio ácido a la
contienen grupos
citrato,
de Pt
tiol,
en
(194)
aplicaron
determinación
presencia
la
de
de
reacción
con
aminoácidos
que
ácido
ascorbico
midiendo el cambio de potencial entre dos
y
electrodos
a los que se aplico una corriente constante de 0.7 mA
Jovanovic y col.
(195) determinaron NAC puro y en un
fármaco con un error del 1% , mediante valoración
trica con PdCla
, formándose un complejo
amarillo
estequiometria Pd:NAC 1:2, estable entre pH 2 y 11
cambio de potencial se obtuvo a pH 3.4
determinación de NAC en el intervalo
potenciomápálido
.El
de
máximo
. El método permite
16.3-261
yug/ml
la
con
un
(196) usaron la espectrofotometría
UV
CV < 1% .
\
3.- Reacciones con compuestos cromo foros
Talley y col.
directa para determinar NAC en disolución.
Sin
método ha sido
interferencias
presenta,
criticado
la
a
las
este
que
especialmente la debida a su producto de degradación
N ,S-diacetilcisteína
para
debido
embargo,
(197).
determinación
de
El método oficial propuesto
NAC
como
compuesto
(198)
puro,
en
disoluciones estériles del mismo y en disoluciones
inhaladoras
que contienen también isoproterenol, se basa en la
separación
del compuesto mediante cromatografía líquida y detección UV
214 nm
.
a
- 285 -
El
reactivo
de
Ellman,
acido
5 , 5 ’-ditiobis-
(2-nitrobenzoico) se ha utilizado en la determinación
de
NAC
como compuesto puro y en disoluciones comerciales al 10 y
20%
(189). El método se basa en la medida de la absorbancia a
412
nm del anión del acido 2-nitro-5-tiobenzoico
liberado
en
la
reacción del NAC con el reactivo de Ellman a pH 8. El color se
desarrolla en 3 min y la curva de calibrado es lineal entre
y 6 jig/m\ de NAC
error obtenido,
(187),
Según comentan los autores del trabajo,
del + 5 % respecto al método oficial
es debido probablemente a que los efectos de
de
1
el
1975
oxidación
aerea son mas acusados con este ultimo.
El acido
acetilhidroxamico,
reacción de NAC con hid roxilamina, da
con Fe(III),
que
un
se
forma
producto
en
la
coloreado
cuya medida a 510 nm permite la determinación
de
NAC entre 50 y 500 jig/ml (199) .
Por
ultimo,
cabe
señalar
determinar NAC (0.1 - 10 jxg/ml)
que
también
fluorimétricamente
se
a
del derivado fluorescente que forma con monobromobimane
puede
través
(200).
El método se ha utilizado en estudios farmacocinéticos de NAC,
mediante HPLC y detección fluorimétrica del derivado formado.
- 286 -
III.7.3.-
ENSAYOS PREVIOS
1. - Elección de la amina
La reacción de las aminas primarias con
para formar un isoindol con absorción sobre
también aprovecharse en la
determinación
OPA
335
y
nm
,
NAC
puede
espectrofotometrica
del tiol.
Existen algunas referencias sobre la
la reacción OPA-amina-tiol
en-
Nakamura
establecieron
y
col.
(45)
la
aplicación
determinación
un
de
tioles.
procedimiento
fluorimetrico para la determinación de tioles, que no
a la N- ac eti l-L -ci ste ína , y que hace uso de OPA
como reactivos.
y
triptofano
OPA
en
concentración
3.2x10"*
mezcla de reacción conteniendo triptofano 6.3x10"4 M
borico-borato
incluye
El método propuesto consiste en adicionar,
agitación continua,
(pH
9.5)
y
el
tiol
en
concentraciones 0.6 3-6.3x10“ 8 M (relación
de
el
M
,
a
la
tampon
intervalo
molar
con
mínima
de
OPA/
tiol de 5).
Se realizaron unos ensayos
condiciones anteriores,
100:5:1),
(
relación
previos
molar
aunque midiendo la absorbancia.
utilizando
las
triptofano:O P A :NAC
Se observo que tanto
la disolución de NAC como el blanco presentaban una coloración
muy intensa
( de amarillo a rojo
), con valores de absorbancia
superiores a 3 . Esto es debido probablemente
a
la
reacción
- 287 -
lateral OPA-aminoácido que ya se ha puesto de manifiesto en el
apartado III.3. 3.4
, donde se
demostró
que
los
reaccionan con el OPA en medio bórico-borato
tiol,
de
en
aminoácidos
ausencia
originando un producto de reacción con una amplia
absorción
sobre
335
nm
.
Esta
reacción
temperatura ambiente y se acelera al calentar.
es
de
banda
lenta
a
La velocidad de
la reacción depende del aminoácido implicado.
En
la
Figura
57
se
muestran
los
espectros
producto de reacción OPA -triptófano, así como el
absorción
del
isoindol
cantidades de NAC.
obtenido
al
espectro
adicionar
del
de
diversas
Se observa que la absorbancia del blanco es
bastante elevada y que al aumentar la concentración de NAC
produce un corrimiento hipsocrómico del máximo de
se
absorbancia
desde 335 a 330 n m .
Con una concentración de triptofano menor se observó,
que
aunque
inferior,
inicialmente
la
absorbancia
esta aumentaba con el tiempo.
del
Por
otra
absorbancia de las disoluciones que
contenían
gradualmente,
mayor
lo
que
indica
una
blanco
parte,
NAC
era
la
disminuía
inestabilidad
del
isoindol formado en estas condiciones.
La absortividad molar encontrada
orden
1x10 “*
de
de
M
3000
y
para
concentraciones
2.1 xl0“4
absorbancia
se
OPA
,
respectivamente.
tomaron
inmediatamente
mezclados los reactivos.
M
de
para
NAC
y
fue
del
triptofano
Las
lecturas
después
de
- 288
-
2.0
A
1.6
0.8
0.4
400
X (nm)
^
Figura 57. - Espectro de absorción del producto de reacción
de OPA-triptófano-NAC.
Ctriptóf.no = 2.1x10'4 M ; C o p a = 1x10"3 M ; C
(1) 4.2x10 ~ 6 ; (2) 8.4x10“6 ; (3) 1.26x10-“ ;
(5) 2.1x10-“
n a c
(4)
(M): (0) 0
1.68x10-“
- 289 -
Por otro lado,
en el
apartado
III.3.3.4
observamos
que la isoleucina muestra una reactividad baja con el
ausencia de tiol,
si se compara con el resto
por lo que esta amina puede
ser
la
más
de
OPA
en
aminoácidos,
apropiada
para
su
utilización como reactivo deriva ti za nt e.
En la Figura 58 se
reactividad de la
isoleucina
8 x l 0 “4 M en ambos reactivos
figura se
pone
muestra
el
de
con
OPA
para
de
obtenido utilizando isoleucina como
absorción
amina,
triptofano
( & n a c c i ■ « i • u « i n • > '=' 6000 y
para OPA 1x10“ * M
debido,
y
aminoácido
escasa
En la
del
que
. Por otra parte,
la sensibilidad de la reacción es mayor que
la
concentraciones
(en ausencia de NAC).
espectro
máximo de absorción a 335 nm
manifiesto
isoindol
presenta
que
obtenida
con
la
M)
un
se observo
£,* a c ( t * i P * © « • n « >
1x10“*
misma
,
3000
probablemente
por un lado, a que la reacción lateral
OÍA-isoleucina
en las condiciones utilizadas es despreciable,
mientras que la
de OPA-triptófano es importante.
del
isoindol
condiciones.
del
triptófano
Por otro lado,
es
poco
la
favorable
formación
en
estas
Las absortividades molares correspondientes a los
derivados de isoleucina y triptofano con el reactivo OPA-NAC
,
utilizando disoluciones 2x10 “ * M de OPA y de NAC
y
7800,
respectivamente
(apartado III.4.3).
, son 6700
290
las
Debi do
isoleucina,
características
apropiadas
se escogió ésta como amina para
de NAC. A continuación se muestra un estudio
la
de
con
la
obtención
de
los
1a
determinación
optimización
de las concentraciones de los reactivos OPA y amina
junto
de
parámetros
primaria,
analíticos
significativos y su aplicación a muestras farmacológicas.
0.8
0.4
300
500
400
X(nm)
Figura 58. - Espectro
de
absorción
de:
reacción de OPA-isoleucina-NAC ; (2) blanco.
C»AC
PA
(1)
Producto
de
- 291 -
2.-
Absorbancia del blanco
La reacción lateral
mayor
medida
reactivos.
el OPA
conforme
aumenta
la
tiene
deben
encontrarse
reactivos,
ya que
en
exceso.
blancos
la
Sin
concentraciones
originarían
lugar
concentración
En el procedimiento desarrollado,
conveniente trabajar con
Así,
OPA-isoleucina
de
en
ambos
isoleucina
embargo,
elevadas
y
no
de
excesivamente
es
estos
altos.
es necesario estudiar la evolución de la absorbancia
del
blanco al variar la concentración de isoleucina y OPA.
Se preparo una serie de disoluciones
cantidades variables de
para dos
niveles
1x10“8 M ) .
de
isoleucina
en
concentración
medio
de
OPA
que
contenían
bo ri co-bor ato,
(6.1x10“8
La absorbancia se leyó a los 10 min de mezclar
M
y
los
reactivos.
En la Tabla 39 se muestran los resultados obtenidos,
donde se observa
(6.1x10“ 8
M)
se
que
para
obtienen
una
concentración
blancos
presencia de concentraciones bajas
parte,
una concentración de OPA
elevados,
de
OPA
incluso
isoleucina.
1x10"8
puesto que la absorbancia del blanco
de
es
M
es
Por
más
inferior
alta
en
otra
adecuada,
a
0.1
en
presencia de concentraciones de isoleucina 1x10"4-lxl0 ~8 M .
- 292 -
Tabla 39.
- Variación de la absorbancia del blanco.
C xlexIO4
(M)
C o f a x IO*
1.21
2.42
6.06
12.1
30.3
60.6
1.25
5.00
10.0
20.0
50.0
62.5
100.0
6.1
,
1.0
‘
(M)
A*»s
0.139
0.193
0.358
0.617
1.472
3.420
0.020
0.025
0.050
0.135
0.495
0.571
0.807
3 .- E s t a b i l i d a d de l a s d i s o l u c i o n e s
Se
1.36x10“4
1x10“ ® M
preparo
M
y
OPA
una
e
disolución
isoleucina,
, en medio borico-borato,
que
contenía
ambos
en
concentración
y se leyó la absorbancia
335 nm frente a un blanco preparado en ausencia de NAC
Se estudio también la estabilidad de
del
blanco
preparada
a
partir
concentraciones 1x10"® M en
de
ambos,
OPA
en
la
e
es
conveniente
simultáneamente
tiempo.
la
Figura
absorbancia
(curva 2), esta aumenta lentamente,
preparar
en
borico-borato,
Los resultados aparecen representados en
59, observándose que si bien inicialmente la
.
isoleucina,
medio
a
disolución
leyendo la absorbancia frente a agua a lo largo del
blanco es baja
NAC
el
por lo
blanco
y
del
que
la
muestra.
Por otra parte,
NAC, OPA e isoleucina
son
las
disoluciones
altamente
del
estables
curva 1), observándose a las 2 h un descenso de la
de tan solo un 2% .
derivado
(Figura
de
59,
absorbancia
294
0.2
0
0
0.5
1
1.5
2
t (h)
Figura 59. - Estabilidad de las disoluciones de:
(1) OPA-isoleucina-NAC ; (2) OP A- isoleucina.
Cnac
— 1.36x10"4 M ; C o p a
— C
= 1x10"3 M
- 295 -
III.7.4.- OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES EXPERIMENTALES
1 .- I n f l u e n c i a de la c o n c e n t r a c i ó n de o - f t a l d e h i d o
Se estudió la influencia que tiene la
de OPA
sobre
isoleucina.
la
reacción
del
NAC
con
concentración
el
reactivo
OPA-
Para ello se preparó una serie de disoluciones que
contenían NAC 1.36x10"4 M
borico-borato de pH 9.5
,
isoleucina
8x 10"4
M
y
tampón
t así como cantidades variables de OPA
leyendo la absorbancia a 335 nm frente a blancos preparados en
ausencia de NAC y conteniendo cantidades variables de OPA
Los resultados se
muestran
en
la
Figura
observa que a partir de una relación OPA/NAC = 5
se
60.
.
Se
obtienen
lecturas constantes de la absorbancia hasta relaciones OPA/NAC
de al menos 25
Se
.
escogió
para
el
trabajo
concentración de OPA tal, que la relación
encuentre en el intervalo 5-25
.
posterior
molar
OPA/NAC
una
se
,
296
o
10
30
20
o p a
/n a c
Figura 60. - Influencia de la concentración de OPA
sobre
la
reacción del NAC con el reactivo OP A-isoleucina. En
abscisas
se representan relaciones molares.
Cnac
—
1.36x10*4 M ¡ C i i o i i i c i m
— 8x10 4 M
- 297 -
2.- Influencia de la concentración de isoleucina
Se
estudio
la
influencia
concentración de isoleucina sobre la
que
reacción
presenta
la
estudiada.
Se
prepararon disoluciones que contenían NAC 1.23x10“4
M
,
OPA
9.8xl0“4 M y cantidades variables de isoleucina.
Los resultados aparecen representados en
61, observándose como a partir de una relación
la
Figura
isoleucina/NAC
de 3 la absorbancia se mantiene constante hasta relaciones
25.
El
uso
de
relaciones
disminución de la absorbancia,
superiores
debido a
(^50)
la
origina
reacción
de
una
lateral
existente entre la isoleucina y el OPA.
Para el trabajo posterior se escogió una concentración
de isoleucina tal, que la relación isoleucina/NAC se
en el intervalo 3-25 veces.
mantenga
0.8
0A
298
0
20
30
ISOLEUCINA/NAC
F.
i gura— 6 1
Influencia de la concentración de amina sobre la
reacción del NAC con el reactivo OPA-isoleucina. En abscisas
se representan relaciones molares.
Cnac
= 1.23x10"4 M
; Cofa
= 9.8xl0"4 M
- 2 99
-
III.7.5.- PARAMETROS ANALITICOS SIGNIFICATIVOS
Se obtuvieron los intervalos de linealidad,
de
detección
y
determinación,
y
correspondientes a la determinación de
NAC
límites
repetitividad,
con
el
reactivo
OPA- is ol eu ci na .
La curva de calibrado se preparé con disoluciones que
contenían tampon borico-borato de pH 9.5
,
isoleucina 1x10"* M y cantidades variables de
de NAC 1.57x10-* M
Asimismo,
OPA
una
1x10"*
M
,
disolución
.
para determinar la concentración mínima
de
NAC que puede detectarse y determinarse según el procedimiento
propuesto,
se
prepararon
contenían OPA e isoleucina,
Por ultimo,
10
disoluciones
del
blanco
ambos en concentración 1x10"* M .
para obtener la repetitividad del método,
se prepararon 10 disoluciones que contenían NAC 1.26x10"4 M
OPA e isoleucina,
que
ambos 1x10"* M
.
y
- 300 -
1.- Curva de calibrado
En la Figura 62 se muestra
para el NAC
, observándose que el
la
rango
curva
de
calibrado
dinámico
lineal
se
extiende hasta una concentración de NAC 3.0x10"4 M (49 yug/ml).
La ecuación de la recta obtenida fue:
A»»s = 0.0032 t 6.26x10*
r = 0.99998
C r a c
2.- Límites de detección v determinación
Los resultados se
muestran
en
la
Tabla
40.
Los
límites de detección y determinación según los criterios 3s
y
lOs resultaron ser
y
de
9.1x10’7
3.03x10'* M (0.49 jig/mi de NAC),
M
(0.15
yug/ml
respectivamente.
de
NAC)
- 301 -
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
0
1
2
3
N
A
Cx 10 a
Figura 62. - Gráfica de calibrado.
Co pa
—
C l a o l e u c i n o
“
1X 1 0 ~
8
M
(M)
- 302 -
Tabla 40. - Cálculo del límite de detección.
Absorbancia de disoluciones de OPA e isoleucina.
Experiencia n ¡
1
2
0.049
,
0.050
3
0.047
4
0.044
5
0.045
6
0.047
7
0.046
8
0.045
9
0.045
10
0.046
x
0.046
s
1.90x10-* M
- 303 -
3.-
Repetí ti vi dad
En la Tabla 41 se muestran los resultados obtenidos.
El método presenta una buena repet itividad. El coeficiente
variación correspondiente a NAC 1.26xl0~4 M fue del 0.3 %.
Tabla 41.
C n a c
- Re pe ti t i v i d a d .
= 1 .26x10”4
M
;
Experiencia n*
C o p a
=
C i i o i i t e i m
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.795
0.798
0.794
0.791
0.793
0.791
0.789
0.790
0.794
0.791
X
0.793
CV
0.3%
= 1x10" *
M
de
- 304 -
III.7.6.- ANALISIS DE N-ACETIL-L-CISTEINA EN DIVERSOS FARMACOS
1.- Descripción y preparación de
las
disoluciones
de
los
fármacos
Se aplico el método propuesto a la determinación
contenido en N-aceti1-L-cisteína
en
diversos
del
fármacos.
Los
medicamentos que se encuentran disponibles en el comercio son:
Fluimucil oral. Laboratorio Zambón S.A. Granulado
en todos los procesos
donde
existen
secreciones
mucopur ule nta s. Cada sobre contiene 200 mg de
indicado
mucosas
NAC,
8
mg
y
de
sacarina y 4.8 g de excipiente.
Fluimucil
antibiótico.
liofilizado que
contiene
acetilcisteinato
(
405
mg
equivalente
levógiro y a 113 mg de NAC
tiamfenicol
Laboratorio
glicinato
de
a
Zambón
tiamfenicol
250
) y 2 mi de
mg
de
agua
acetilcisteinato
tópica y oral.
tiamfenicol
posee
por
las
cuales
la
presencia
de
fenómenos
complica o hace más lenta la evolución clínica.
de
vía
afecciones
bacterianas respiratorias producidas por germenes gram +
en
El
destacadas
activo
Está indicado en las
Vial
glicinato
bidestilada.
características antibiótico-mucolíticas y es
intramuscular,
S.A.
y -,
mucoestasis
- 305 -
Superpeni mucolítico. Laboratorios Rousell. Suspensión cuya
composición por cada
(trihid rat o),
50
100
mg
mi
de
es:
5000
terbutalina
mg
de
amoxicilina
sulfato,
150
mg
de
250
mg
sódica
y
gu aya colgliceriléter, 330 mg de citrato de oxolamina,
de
N-acetil-L-cisteína,
excipiente.
300
mg
de
sacarina
Esta indicado para el tratamiento de
enfermedades
de las vías respiratorias causadas por gérmenes sensibles a la
amoxicilina,
en
justifica la
las
que
presencia
la
abundante
simultanea
de
secreción
un
bronquial
mucolítico
y
un
ex pe cto ran te.
Riñofluimucil. Laboratorios Zambón S.A. Gotas
un
contenido
estabilizada,
por
mi
de:
5 mg de
10
mg
de
tuaminoheptano
indicado en la rinitis aguda
exudados
mucopurulentos
y
Este
subaguda,
de
lenta
mg
resolución,
exudativas
intervenciones
de
esta
especialmente
sinusitis y reacciones
de
0.125
medicamento
vasomotoras o alérgicas,
después
con
N-acetil-L-cisteína
sulfato,
benzalconio cloruro y vehículo acuoso.
nasales
con
rinitis
inflamatorias
quirúrgicas
de
las
Granulado
cuya
cavidades nasales o paranasales.
Flubiotic 250 mg. Laboratorio Zambón
composición por sobre es: 250 mg
100 mg de N-acetil-L-cisteína,
excipiente.
mucolíticas
de
4 mg
S.A.
amoxicilina
de
sacarina
trihidrato,
y
5
g
de
Este medicamento presenta propiedades antibióticodebidas
a
la
asociación
antibiótico de amplio espectro,
mucolítico fluidificante.
y
a
la
de
la
amoxicilina,
N-acetil-L-cisteína,
- 306 -
S© prepararon las siguientes disoluciones:
Fluimucil:
Se disolvió en
agua
un
sobre
del
preparado,
aforando a 200 mi y se diluyó 10 veces.
Fluimucil antibiótico:
vial liofilizado,
Se disolvió en agua el contenido del
y se aforó a 250 mi
.
Rinofluimuci1: Se tomó 1 mi de las gotas nasales y se aforó’
a 50 mi con agua.
Superpeni mucolítico:
Se disolvió la suspensión en
se filtró con placa del n® 2 , aforando a continuación
agua
a
y
500
mi
Flubiotic:
Se disolvió un sobre del preparado en agua y
se
filtró con placa del n® 1, aforando la disolución resultante a
250 mi
.
- 307 -
2.- Utilización de métodos comparativos
Para la determinación del
contenido
cisteína en los distintos preparados,
método aquí propuesto,
dos métodos
se
en
N-acetil-L-
aplico
ademas
del
alternativos basados
el poder reductor del grupo tiol presente en
la
molécula
en
de
NAC:
Valoración del tiosulfato formado por
reacción
del
NAC
con
tetrationato
colorimétrica
del
la
del
Fe(II)
tiol
(181)
y
determinación
formado con 1,10-fenantrolina
con Fe(III)
ellos
oxidación
(182). El fundamento de estos métodos
detallado en el apartado III. 7.2.1
pr imero de
tras
en
varias
, habiéndose
publicaciones
se
ha
utilizado
el
como
método
de
ref e r e n c i a .
a)
Método del tetrationato
Se
prepararon
las
Tetrationato 0.025 M , obtenido
tiosulfato 0.05 M
siguientes
valorando
con
disoluciones:
iodo
0.05
M
. La disolución debe mantenerse en atmósfera
de nitrógeno y guardarse en frasco de topacio.
Monocloruro de iodo 0.005 M
de iodato
2x 10"8
M
y
, preparado añadiendo a una mezcla
ioduro
potásico
1x 10"2
M
,
acido
clorhídrico concentrado de una vez. Tras agitar la disolución,
se añadió iodato
potásico
hasta
la
desaparición
del
iodo
- 308 -
formado.
Por ultimo,
se adiciono ioduro potásico hasta obtener
una ligera coloración violeta al agitar una alícuota
disolución
C I 4 C.
con
iodimétr ic.amente
tiosulfato,
Esta
disolución
utilizando
una
se
de
esta
estandarizo
disolución
patrón
que a su vez se normalizo iodimétricamente
de
frente
a iodato potásico patrón.
El procedimiento seguido para el análisis de NAC fue:
A la disolución que contenía 16-49 mg de NAC se añadió
fosfato
(pH 7) y 10
mi
de
la
disolución
de
tampon
tetrationato,
agitando durante 1 min \ A continuación se añadieron 0.5 g
K I , 1 mi de almidón al 0.5%
, agua y 3
mi
de
HC1
0.1
de
M
,
valorando el tiosulfato formado con monocloruro de iodo, hasta
la aparición del color azul.
Se realizaron
también determina­
ciones en blanco.
En la Tabla 42 se muestran los
para los distintos
medicamentos,
resultados
expresados
aritmética de tres determinaciones,
presenta una buena precisión,
relativa
0.7 %
.
de
siendo
la
media
encontrándose en todos los
casos factores de recuperación superiores al
cuando se analizo una disolución
como
obtenidos
NAC
la
100%
patrón.
desviación
,
El
incluso
método
estándar
- 309
-
Tabla 42. - Determinación de N-acetil-L-cisteína en fármacos.
Método del tetrationato.
mg
obte­
nidos
mg
decla­
rados
Fármaco
Fluimuci1
Fluimucil antibiótico
Rinofluimucil
Superpeni mucolítico
Flubiotic
NAC
•
224 .0
445
11.66
156.7
101 .1
509
200
113
10
150
100
490
112
117
104 .5
101
104
0. 53
0 .46
0.51
0.71
0. 57
0 .40
Factor de recuperación en X.
Cabe destacar sin embargo,
el resultado
alto para el medicamento Fluimucil antibiótico,
contiene
CV ?
R*
además
de
NAC,
tiamfenicol
anormalmente
preparado
levógiro
(L V ).
compuesto presenta en su molécula un ácido sulfínico,
oxidarse a ácido sulfónico,
que puede ser la
causa
se
puntos
que
Este
capaz de
del
alto
error positivo obtenido.
Por
indefinidos
otra
(el
parte,
viraje
del
obtuvieron
almidón
retrocedía)
medicamentos Superpeni mucolítico y Flubiotic,
en
su
composición
amoxicilina
(LVI),
que
finales
con
presentan
antibiótico
posiblemente reacciona con el iodo formado en el punto
En
estos
casos
se
tomó
como
punto
final
el
OnCII
C IIC O N I I
HOCTt
COOII
C H-OK
LV
LVI
que
final.
volumen
correspondiente a la aparición del primer color azul.
HC K H C O C H O
los
- 310 -
b ) Determinación
Fe(III)
colorimétrica
de
N-acetil-L-cisteina
con
y 1.10-fenantrolina
Se prepararon disoluciones de 1,10-fenantrolina
0.25 %
0.3 M
fue:
, Fe(III)
4.8 xl0"3 M
,
tampón
, asi como NAC 1.6x10"* M
.
acético
El
0.1
M-acetato
procedimiento
seguido
Se anadio sobre la disolución de NAC 5 mi de Fe(III),
mi de 1,10- fenantrolina y 5 mi de tampon acético-acetato
final 4),
del
2.5
(pH
aforando con agua hasta un volumen final de 25 mi
Al cabo de 20 min se leyd la absorbancia a 515 nm (<£ =
10800)
frente a un blanco preparado en ausencia de tiol.
Se .construyo una curva de calibrado en
de
concentraciones
3x 1 0 "8- l .2x10"4
procedimiento descrito.
M
de
se
realizaron
según
NAC
determinaciones
triplicado de cada uno de los medicamentos,
A =
,
intervalo
Para calcular el contenido en
los distintos preparados,
sus disoluciones.
NAC
el
tomando
1
mi
el
en
por
de
La ecuación de la recta de calibrado fue:
0 . 0 1 8 5
+
10755
C r a c
r = 0.99995
- 311 -
En la Tabla 43 se muestran los
para los distintos preparados.
Se observa
recuperación oscila entre 94-111 %
buena precisión,
resultados
que
el
Sin embargo,
factor
de
, presentando el método una
con coeficientes de variación
todos los casos al 1.2%
obtenidos
inferiores
en
descrito
en
.
aunque en el procedimiento
la bibliografía se indica que después de 20 min la absorbancia
se
mantiene
inalterada,
medicamentos
Superpeni
constante de la misma,
se
observó
mucolítico
el
caso
Flubiotic
amoxicilina
de
un
como se muestra en la Figura
puede deberse a la presencia de
preparados,
y
en
los
aumento
63.
(LVI)
en
Esto
estos
que probablemente también reduzca al hierro(III)
aunque mas lentamente que el tiol. Los datos que
la Tabla 43 para estos preparados
se
calcularon
,
aparecen
en
leyendo
la
absorbancia a los 20 min de iniciada la reacción.
Tabla 43. - Determinación de N-aceti1-L-cisteína
Método del F e (I I I )-1,10-fenantrolina.
Fármaco
Fluimuci1
Fluimucil antibiótico
Rinofluimucil
Superpeni muco lí ti co 1’
Flubiotic b
mg
decla­
rados
200
113
10
150
100
• Factor de recuperación en %
b Se leyó la absorbancia a
los
r.eact ivos .
20
en
fármacos.
mg
obte­
nidos
R-
CV %
187
111.5
11 .08
164
100.1
94
99
111
109
100
1. 1
0.19
0.25
1.2
0. 62
min
de
mezclados
los
- 312 -
-O"
O
20
40
60
t (min)
F i g u r a 6 3 . - V a r i a c i ó n de la a b s o r b a n c i a
a
515
ni
con
el
t i e m p o p a r a los p r e p a r a d o s :
(1)
Flubiotic
y
(2)
Superpeni
m u c o l í t i c o . M é t o d o d e l F e ( I I I ) ~ 1 »10~f e n a n t r o l i n a .
- 313 -
3.- Determinación de N-aceti1-L-cisteina con o-ftaldehido
e
i soleucina
Para la determinación del contenido
preparados,
se
NAC
en
se aplico el método de adición estándar.
preparo
lxlO"8 M
en
una
serie
, isoleucina
medicamentos,
de
disoluciones
lxlO-8
tampon
M
,
1
bórico-borato
que
mi
(pH
Para ello
contenían
los
distintos
9.5)
y
cantidades
,
leyendo
absorbancia a 335 nm frente a un blanco en ausencia de
observo
en
todos
los
casos
que
los
acompañan al NAC en los preparados presentan
muy baja
una
disolución
que
la
NAC
componentes
(<0.01) a la longitud de onda de medida,
comprobó preparando una
OPA
de
crecientes de una disolución de NAC 1.58x10"8 M
Se
los
que
absorbancia
lo
contenía
que
1
mi
se
del
fármaco y tampon.
Los resultados aparecen en la Tabla
44
,
donde
observa una buena concordancia entre los valores declarados
los obtenidos,
precisión,
estándar relativas inferiores al 1.2%
componentes que
acompañan
interfieren
la
exactitud
y
con recuperaciones que oscilan entre 98-114 % ,
presentando el método una buena
en
se
al
NAC
determinación,
con
. Por
en
como
de los resultados obtenidos
desviaciones
otra
los
lo
parte,
medicamentos
demuestra
los
no
la
- 314 -
Tabla 44.
- Determinación de N-acetil-L-cisteína
en
fármacos.
Método OPA- iso leu ci na.
mg
dec la ­
obte­
rados
nidos
R-
**
>
O
Fármaco
mg
Fluimucil
200
207
103 .5
0.78
Fluimucil antibiótico
113
119
106
1.2
10
11.4
114
1.1
Superpeni mucolítico
150
151. 9
101
0.38
Flubiotic
100
98.0
98
0.59
Rinofluimuci1
• Factor de recuperación en %.
- 315 -
En
resultados
la
Tabla
obtenidos
45
aparece
para
los
una
comparación
fármacos
de
investigados
los
por
aplicación de los tres métodos ensayados.
Tabla 45. - Determinación de N-acetil-L-cisteína
Compar ación de los métodos ensayados.
mg
decla­
rados
Fármaco
mg*
obte­
nidos
200
113
10
150
100
Fluimucil
Fluimucil antibiótico
Rinofluimuci1
Superpeni mucolítico
Flubiotic
en
fármacos
mgc
obte­
nidos
mgb
ob t e ­
nidos
187
111 .5
11.08
164
100.1
224.0
445
11.66
156.7
101.1
207
119
11.4
151 .9
98.0
• Método del tetrationato. b Método del F e (I I I )-1,10-fenantrolina.
c Utilización del reactivo OPA-isoleucina.
Cabe destacar que el contenido en
los distintos métodos para el
medicamento
resultado siempre superior al
declarado
NAC
obtenido
Rinofluimuci1,
por
el
antibiótico
Flubiotic
comentados
ha
fabricante,
encontrando para el resto una concordancia aceptable,
el caso de los fármacos
por
anteriormente:
salvo en
Fluimucil
(método del tetrationato) y Superpeni mucolítico y
(métodos
fenantrolina) .
del
tetrationato
y
del
F e (I I I )-1,10-
- 316
Tanto
colorimetrico,
tiol,
el
método
-
del
tetrationato,
por lo que los reductores presentes en los
Así,
el tiamfenicol parece
método
y
en
la
determinación
medicamentos
ser
interferencia en el método del tetrationato y
este
el
están basados en el carácter reductor del grupo
pueden interferir.
en
como
una
la
grave
amoxicilina
con
Fe(III)
y
1,10-fenantrolina.
Por
su
parte,
el
utiliza OPA e isoleucina,
método
se
espectrofotometrico
basa
en
la
formación
isoindol a partir del tiol, poí* lo que la única
que cabria esperar son otros tioles,
estos preparados.
Asimismo,
se
sencillo y fácil de
automatizar,
método
del
volumétrico
en
propia
desventaja de la inestabilidad
de
que
además
los
es un método más lento que el
que requiere un corto tiempo de análisis.
en
rápido,
con
de
presenta
reactivos.
el método
del Fe(III)-l,10 -fen ant ro lin a, aparte de
ya comentados,
método
técnica,
los
como se comento anteriormente,
un
ausentes
contraposición
tetrationato,
inconvenientes derivados de la
parte,
de
un
interferencia
normalmente
trata
de
que
Por
el
los
la
otra
colorimetrico
inconvenientes
aquí
propuesto,
I V . —
C O N C L U S I O N E S
- 319 -
ESTUDIOS SOBRE LA FORMACION DE UN PRODUCTO FLUORESCENTE POR
REACCION DE LA CISTEINA CON O-FTALDEHIDO
A temperatura ambiente,
el o-ftaldehido en ausencia
de
la cisteína no reacciona con
otro
tiol,
sin
embargo
calentar se observa la formación de un compuesto
(A««
de gran estabilidad,
=
A.-
364 nm ,
=
fluorescente
424
nm)
.
observación contrasta con la realizada por Mezt y col.
que en
condiciones
experimentales
similares
pocos segundos un compuesto fluorescente
A.»
= 438 nm
(
derivado
de
lenta su formación:
la
cisteína.
Los
al menos durante 3
rápidamente.
=
a
356
la
mejores
en
nm
se obtiene una fluorescencia
h
.
formación,
Una
el
embargo
se
muy
constante
a
que permanece estable
temperatura
pero
formación
resultados
, siendo sin
partir de las 3 - 3 1/* h de calentamiento,
de
(107),
), que se descompuso rápidamente.
obtuvieron por calentamiento a 50°C
velocidad
Esta
obtuvieron
A««
La temperatura afecta notablemente
del
al
mayor
producto
se
aumenta
la
descompone
La fluorescencia es máxima en el intervalo de
pH
9.3-10 y con relaciones molares OPA/cisteína mayores de 2000.
El margen dinámico
lineal
se
extiende
hasta
una
concentración de cisteína de 2.5xl0"# M , con una sensibilidad
de 2.82xl07
El coeficiente de variación,
correspondiente
una disolución de cisteína 9.92x10"7 M fue del 1.9% .
a
- 320 -
La aplicación del método
de
Asmus
indico
que
derivado obtenido se forma por reacción de un mol de
con un mol de o-ftaldehido,
log K
siendo su constante
cisteína
de
formación
3. Otros aminoácidos que no poseen el grupo
originan productos fluorescentes con o-ftaldehido,
de un tiol externo,
por lo que el grupo tiol
debe estar implicado en la reacción.
Es muy
de
el
tiol,
no
en ausencia
la
cisteína
probable
que
se
menor
de
produce
el
forme un isoindol.
Al reaccionar la cistina en concentración
l-2xl0"# M con un gran exceso de o-ftaldehido,
derivado de cisteína,
se
sin embargo la reducción de
es sólo parcial y depende en gran medida
de
experimentales.
grandes
Además,
en presencia
o-ftaldehido parece tener
lugar
una
de
la
las
reacción
cistina
condiciones
excesos
de
lateral, ..que
reduce la fluorescencia del derivado.
Al añadir o-ftaldehido sobre una mezcla de
y
otros
aminoácidos
proteicos
intensidad de fluorescencia menor
primarios,
que
cisteína en su ausencia,lo que indica
la
una
se
obtiene
producida
la
de
la
Por
cuando los aminoácidos se añaden después de mezclar
cisteína con el o-ftaldehido,
menor medida.
la
fluorescencia
una
por
inhibición
formación del isoindol derivado de este aminoácido.
parte,
cisteína
disminuye
otra
la
en
- 321 -
La
disminución
de
la
depender tanto de la naturaleza
concentración.
Al
variar
la
fluorescencia
del
aminoácido
concentración
fluorescencia disminuyó linealmente,
parece
siendo
cómo
de
el
de
su
alanina,
la
valor
de
pendiente de la recta de calibrado aproximadamente de
mientras que
la
recta
de
calibrado
no
-3 xl07 ,
correspondiente
a
cisteína presentó una pendiente positiva de ^ 3 x l 0 7 . Así,
cada mol de alanina añadida,
fluorescente de cisteína.
Es
deja formarse un mol de
muy
probable
reaccione con alanina y o-ftaldehido,
que
la
la
la
por
derivado
cisteína
actuando como tiol,
sin
embargo el isoindol formado no es fluorescente.
Los estudios realizados muestran cómo
la
al reaccionar con o-ftaldehido puede actuar como
cisteína,
amina,
como
tiol y a través de ambos grupos simultáneamente.
DETERMINACION DE CISTINA CON O-FTALDEHIDO
La
cistina
reacciona
con
el
mercaptoetanol en medio bórico-borato a pH 9.5
o-ftaldehido
y
, originando un
compuesto amarillo con un máximo de absorción a 330
nm
reacción
ambiente,
procede
rápidamente
a
temperatura
alcanzándose la máxima absorbancia a los 4.5 min de
los reactivos.
Sin embargo,
el compuesto
estable e inmediatamente se descompone.
formado
La
mezclados
no
es
muy
- 322 -
Al acidificar hasta pH
compuesto formado a pH 9.5
<
1
las
disoluciones
, se modifica la forma
tro, apareciendo bandas a 440 nm y 510 nm
absorbancia constante durante 20 min
del
del
espec­
, y permaneciendo la
. Sin embargo,
debido
a
que es necesario un estricto control del tiempo
de
la reacción
o-ftaldehido-
de
la
mercaptoetanol no
cistina
es
con
apropiada
el
reactivo
para
el
reacción,
desarrollo
de
un
procedimiento analítico de determinación de cistina.
Por
otra
parte,
se
observo
que
cuando
la
concentración de cistina es mayor de 2-3xl0“# , esta reacciona
con el o-ftaldehido en ausencia de tiol formando
distinto al de la cisteína.
en
medio
bórico-borato presenta una banda de absorción a 335
nm
Al
la
temperatura
se
compuesto
derivado
obtenido
aumentar
El
un
incrementa
la
velocidad
formación del derivado obtenido en medio básico.
compuesto se forma en 30 min y una vez
ciones,
la absorbancia se
durante al menos 24 h .
mantiene
Es
enfriadas las
una
el
disolu­
inalterada
concentración
o-ftaldehido al menos 25 veces superior a la de
obtener una absorbancia constante,
A 60-70°C
prácticamente
necesaria
de
cistina
con un valor máximo
de
para
en
el
intervalo de pH 9.2-9.7
Al acidificar las
básico,
disoluciones
obtenidas
en
se observa una disminución gradual de la banda
nm y la aparición de una banda a 440 nm. Asimismo,
dos puntos isobesticos hacia pH 6
(A
= 355 nm ) y 3
n m ) . Al aumentar nuevamente el pH se obtiene el
medio
a
335
se observan
(A
=
400
espectro
del
- 323 -
compuesto formado a pH 9.5
, a diferencia de lo que ocurre con
los isoindoles derivados de o-ftaldehido y me rc apt oet ano l,
los
que
la
adición
irreversible del
de
un
ácido
compuesto.
disminuir el pH corresponde
La
a
origina
variación
la
la
destrucción
del
espectro
protonación
en
del
al
derivado
formado en medio básico.
Se obtuvieron los
parámetros
analíticos
significa­
tivos correspondientes a los compuestos formados a
tras su acidificación a pH < 1. En el primer caso
pH
9.5
y
( A = 335 nm)
se obtuvo un £ = 4.54 x 10* ., LOD = 8.39 x 10" 7 M y CV = 0.5 %
(para cistina 1.3 x 10-4 M ) . En medio ácido
£> = 3.83 x 10*
, LOD = 5.54 x 10'7
M
y
(Á
CV
=
=
440
nm)
%
1.0
(para
cistina 1.3 x 1 0 ~ 4 M ) .
A
pH
9.5
absorción a 335 nm
otros
bandas
de
, lo que supone una grave interferencia
en
la determinación, de cistina.
aminoácidos
originan
En medio ácido la selectividad es
mayor pues sólo la cistina muestra la banda a 440
nm,
las anchas bandas a 335 nm de los otros aminoácidos
interferir.
La
mayor
aminoácidos que absorben
interferencia
a
A
precipitan por encima de una
>
cierta
proviene
440
nm
y
de
de
concentración.
aunque
llegan
a
algunos
otros
Así,
que
el
procedimiento no es lo suficientemente selectivo para permitir
la determinación de cistina en
fluidos
útil tras una separación cromatográfica.
biológicos,
pero
es
- 324 -
Aunque en
origina con
ausencia,
presencia
o-ftaldehido
un
de
mercaptoetanol
derivado
de
la
cistina
cisteína,
en
los productos de reacción de cistina y cisteína
muy distintos,
apareciendo un precipitado verde a
su
son
violeta
al
acidificar las disoluciones que contienen cisteína.
El método de Asmus indico que el derivado de
se forma por reacción de un mol de cistina con
o-ftaldehido
(constante de formación,
l o g J3Z -
dos
7.7).
se confirmo la existencia de dos grupos ácidos con
cistina
moles
de
Asimismo,
log
Ki
=
5.88 y log Ka-= 3.71 a I = O.l.y 20°C,que pueden
corresponder
a la protonacion de
dos
grupos
reacción es probable que sea
una
carboxilo.
El
producto
de
ftalimida
en
la
el
puente disulfuro de la cistina permanece intacto.
cual
- 325 -
UTILIZACION DE N-ACETIL-L-CISTEINA EN LA
DETERMINACION
DE
AMINOACIDOS CON O-FTALDEHIDO
El bloqueo del grupo amino
de
la
tioles que pueden ser utilizados en las
o-ftaldehido.
cisteína
origina
derivatizaciones
Con N-acetil-L-cisteína se forman isoindoles
gran estabilidad,
con
de
con un máximo de absorción a 335 nm.
El derivado de isoleucina-N-aceti1-L-cisteína presenta
la máxima absorción en el intervalo de pH 7.5-11
la
absorbancia
es
constante
para
Asimismo,
relaciones
o-ftaldehido
/isoleucina y N-acetil-L-cisteína/isoleucina mayores de 5 y 3,
respectivamente.
En estas condiciones,
la reacción
rápidamente a temperatura ambiente y el
derivado
transcurre
formado
es
estable durante al menos una hora.
La absortividad molar media de los isoindoles de
aminoácidos proteicos primarios formados
N-acetil-L-cisteína es <5* = 6830 ± 350,
con
o-ftaldehido
los
y
siendo este valor algo
superior que el correspondiente a los derivados de o-ftaldehi­
do y merc apt oet an ol.
Se
formación
obtuvieron
de
los
las
isoindoles
constantes
derivados
de
velocidad
de
o-ftaldehido
de
y
N-aceti1-L-cisteína con los aminoácidos proteicos primarios, y
se
compararon
con
los
correspondientes
a
o-ftaldehido-
- 326 -
me rc ap to et an ol . En
general,
el
supone una mayor velocidad de
tioles es muy elevada,
uso
de
N-acetil-L-cisteína
formación,
aunque
para
del orden de unos pocos segundos.
La comparación de
las
constantes
de
velocidad
formación indica que la naturaleza del radical Ri
en el C-10,
ambos
,
de
presente
es determinante en la formación de los isoindoles,
aumentando su
velocidad
de
formación
al
carácter dador del sustituyente, lo que se
con el mecanismo de
formación
de
C-10
halla
isoindoles
Sternson y 6 o l . (24). Por otro-lado,
en el carbono adyacente al
incrementarse
de
disminuye
acuerdo
propuesto
la sustitución
la
el
por
adicional
velocidad
de
No es posible obtener las constantes de velocidad
de
formación de los isoindoles.
degradación de los isoindoles derivados de N- ac eti l-L-cisteína,
debido a su gran
estabilidad.
Sin
embargo,
disminución de la absorbancia a los 60 min
del mercaptoetanol y de la
un
aumento
importante
de
de
estabilidad
glicina
e
en
comparó
los
N-acetil-L-cisteína,
de
destacando los derivados
se
la
derivados
observándose
estos
últimos,
histidina,
que
son
altamente inestables con mercaptoetanol.
Por otro lado,
isoindoles del ácido
ácido
^-amino-butírico
un estudio sobre la degradación de los
— am in o- butirico,
y
alanina
^-alanina,
indicó
que
el
determinante de la estabilidad es el factor esterico,
el efecto electrónico ejercido por el grupo carboxilo.
glicina,
factor
más
que
- 327 -
Por último,
isoindoles,
el gran aumento en la estabilidad de
que supone el empleo de N-acetil-L-cisteína,
los
puede
ser debido al mayor volumen del tiol.
Se realizaron también estudios sobre la influencia de
la concentración de o-ftaldehido y tiol sobre las
velocidades
de formación y descomposición de los
Se
isoindoles.
observo
que con relaciones o-ftaldehido/aminoacido inferiores a 5,
velocidad de formación
concentración
formación
moderada
disminuye
mercaptoetanol,
compuesto
isoindol.
es
menor.
de
al
Por
otro
o-ftaldehido,
aumentar
lado,
con
una
velocidad
de
concentración
de
la
la
lo que puede ser debido a la formación
o-ftaldehido-tiol,
que
inhibe
la
la
de
formación
un
del
Este efecto no se observó con N-acetil-L-cisteína.
En
cuanto
a
la
velocidad
de
degradación,
disminuye al aumentar la concentración de
esta
mercaptoetanol,
lo
que puede ser debido a la inhibición del efecto catalítico del
o-ftaldehido sobre la
degradación
efecto tampoco se observó con
lado, no se produjo
de
los
isoindoles.
N-acetil-L-cisteína.
disminución
en
la
isoindoles al aumentar la concentración
estabilidad
de
Por
de
o-ftaldehido,
Este
otro
los
al
menos hasta una relación molar o-ftaldehido/aminoacido de 100.
- 328 -
DETERMINACION DE
CISTINA
CON
O-FTALDEHIDO
Y
N-ACETIL-L-
CISTEINA
La cistina
origina
con
o-ftaldehido
-L-cisteína un isoindol suficientemente estable,
isoindol
de
N-acetil-
mientras
con otros tioles la cistina se reduce a cisteína.
el
y
Sin embargo,
cistina-o-ftaldehido-N-acetil-L-cisteína
menos estable que
los
formados
con
otros
Se observo que,
cistina,
reactivo
dependiendo
de
es
aminoácidos.
máxima absorbancia se alcanza en el intervalo de pH 8-9.5
mezcle el
que
la
forma
o-ftaldehido-N-acetil-L-cisteína
La
.
como
se
con
la
se forma un isoindol simple o uno doble.
Al adicionar
o-ftaldehido-N-aceti1-L-cisteína lentamente sobre
una disolu­
ción de cistina,
esperando 5 min después de cada adición
alcanzar una señal estable,
se obtiene un valor
la absorbancia para una relación molar
para
constante
de
o-ftaldehido-N-aceti 1-
L-cisteína/cistina de 5, con una absortividad molar aproximada
del orden de
=
6400,
valor
formación de un único isoindol.
estequiometría 1:1:1
que
es
característico
de
la
El método de Asmus confirmo la
.
Por otro lado,
al añadir cistina sobre
disoluciones
de o-ftaldehido-N-aceti1-L-cisteína, también se logra un valor
constante de la absorbancia para una relación
/cistina de 5, pero
en
esta
ocasión
el
muestra una absortividad del orden de 12000
molar
compuesto
,
reactivo/
formado
característico
- 329 -
de un isoindol doble.
proporcionó
su
coexistencia
de
Sin
embargo,
estequiometría,
los
compuestos mostraron
mismo
y
simple
a
doble.
no
la
Ambos
absorción,
de
espectro
Asmus
debido
probablemente
isoindoles
el
de
método
el
con
máximo a 335 n m .
La cantidad de alcohol presente en la disolución
disolución de o-ftaldehido es etanólica)
la velocidad de la reacción como sobre
influye
la
tanto
(la
sobre
absorbancia,
para
proporciones superiores al 10% respecto al volumen total.
Al acidificar el producto de reacción de la
con o— ftaldehido-N-acetil-L-cisteína se
produce
miento hipsocromico del máximo de absorción,
cistina
un desplaza­
hasta 325 nm a pH
próximos a 1, acelerándose su descomposición.
Alcalinizando de
nuevo se vuelve a obtener el compuesto formado a pH 9.5
lo que el
cambio
espectral
protonación del isoindol.
es
probablemente
Sin embargo,
la
gran
,
debido
a
por
la
inestabilidad
de este derivado impidió obtener las constantes de protonación
del compuesto.
A pesar de que la cistina presenta los mismo máximos
de emisión
y
isoleucina,
su intensidad de fluorescencia es
embargo,
excitación
que
el uso del reactivo
el
isoindol
formado
por
inferior.
la
Sin
o-ftaldehido-N-acetil-L-cisteína
supone un aumento del 50% de la intensidad
de
fluorescencia,
respecto a la obtenida con o-ftaldehido-mercaptoetanol.
- 330 -
La formación del
adecuada
para
aminoácido.
su
isoindol
utilización
en
de
la
la
cistina
determinación
La absortividad molar es de 12070,
de detección de 8.92xl0“7 M y un
CV
resulta
de
0.5%
con
un
del
límite
(para
cistina
6.87x10“* M ) .
DETERMINACION DE
PROTEINAS
CON
O-FTALDEHIDO
Y
N-ACETIL-
L-CISTEINA
Se propone un
determinación
reactivo
de
método
aminoácidos
espectrofotometrico
totales
y
la
con
el
proteínas
o-ftaldehido-N-acetil-L-cisteína,
referencia isoleucina,
para
utilizando
aminoácido que tiene un peso
como
molecular
intermedio y que forma un isoindol con una absortividad
molar
también intermedia.
Las proteínas
se
determinan
tras
su
hidrólisis,
haciendo reaccionar los aminoácidos liberados con el
o-ftaldehido- N-acetil-L-cisteína.
de proteína existente se
halla
A continuación,
multiplicando
los
reactivo
la cantidad
moles
de
isoleucina equivalentes a los aminoácidos totales obtenidos en
el proceso de hidrólisis
, n, por el peso molecular
los residuos de los aminoácidos,
medio
de
W,e incorporando un factor de
- 331 -
corrección,
F, que tiene en cuenta las diferencias
entre
absortividades molares de los distintos isoindoles
las
obtenidos,
así como la recuperación de los aminoácidos tras el proceso de
hidrólisis:
m= n x W x F
La
hidrólisis
de
las
proteínas
determinación de los aminoácidos
libres
con
N-acetil-L-cisteína supone un aumento de la
un factor de 10
y
consiguiente
o-ftaldehido
sensibilidad,
y
en
, respecto a la determinación de las proteínas
intactas con el mismo reactivo.
\
Las recuperaciones medias obtenidas con albúmina
suero
bovino
y
respectivamente.
caseína
fueron
La cantidad
mínima
del
de
detectarse por este
procedimiento
fue
albúmina
bovino
0.62
de
suero
y
de
98.7%
y
proteína
de
0.62
^pg/ml
0.0381 mg de caseína)
100.9%,
que
para
caseína
albúmina
proteínas de distintos organismos es
factor
WF
de
bastante
carácter
en
una proteína de composición
desconocida.
Para
las
homogénea,
universal,
permita conocer el contenido de una mezcla de proteínas
resultados óptimos,
y
(CV = 2 - 4%).
Debido a que la distribución de aminoácidos
posible proponer un
puede
yjg/ml
para
(correspondientes a la hidrólisis de 0.0388 mg de
de
es conveniente que se produzca una
variación del factor F, al modificarse la composición
que
o
obtener
es
de
unos
mínima
de
una
- 332 -
muestra,
lo que depende de la relación entre las respuestas de
cada aminoácido respecto al aminoácido tomado como referencia.
En este sentido,
los procedimientos espectrofotométricos,
hacen uso de o-ftaldehido,
fl uorimetricos,
puesto
resultan
que
más
las
ventajosos
que
absortividades
que
los
molares
presentan menor variabilidad que los rendimientos cuánticos de
fluorescencia,
al estar menos afectada
la
absorción
por
el
entorno molecular.
Los aminoácidos libres
parcialmente hidrolizada
entre
el
resultado
deben
en
determinarse
obtenido
parcialmente hidrolizada,
presentes
al
una
por
analizar
y después de
su
proteína
diferencia
la
proteína
hidrólisis
total,
debido a que las proteínas intactas también reaccionan con
el
reactivo o-ftaldehido-N-aceti1-L- cisteína.
Así,
para determinar
el
contenido
en
libres en una proteína parcialmente hidrolizada,
conocer la absortividad molar de la proteína
reactivo
o-ftaldehido-N-aceti1-L-cisteína.
proteína intacta es a menudo
resulta
sencillo
absortividad
realizar
molar.
No
poco
un
soluble,
calibrado
obstante,
ésta
aminoácidos
es
necesario
intacta
Sin
con
el
embargo,
la
por
para
lo
que
obtener
puede
no
su
calcularse
aproximadamente puesto que la absortividad de la proteína solo
se debe a los grupos 6-amino
o'-amino terminal,
de
los
residuos
de
lisina
y su absortividad molar es similar a
los grupos o¿-amino libres
(
= 6830).
la
y
de
- 333 -
El
método
parcialmente
se
aplico
hidrolizada,
al
análisis
obteniéndose
aminoácidos libres del 42.7%
(CV = 3.0%),
de
un
caseína
contenido
siendo el
en
declarado
por el fabricante del 44.18%.
DETERMINACION
DE
N-ACETIL-L-CISTEINA
EN
FARMACOS
CON
O-FTALDEHIDO E ISOLEUCINA
Se propone un procedimiento espectrofotométrico
determinar N-acetil-L-cisteína, haciendo uso
de
su
con las aminas primarias y o-ftaldehido a pH 9.5
isoindoles.
La reacción lateral
para
para
reacción
formar
aminoácido-o-ftaldehido,
que
origina un producto de reacción con máximo a 335 n m , restringe
la elección de la
amina.
Sin
embargo,
la
isoleucina,
muestra una reactividad baja con o-ftaldehido en
tiol,
que
ausencia
de
utilizarse
en
resulté apropiada.
La isoleucina y el o-ftaldehido deben
exceso respecto a
la
N-aceti1-L-cisteína,
concentraciones no pueden ser
blancos
muy
elevados.
Se
excesivas
observo
que
ya
sin
que
embargo
sus
originarían
concentraciones
de
o-ftaldehido IxlO-3 M y de isoleucina 1x10"4-lx l0 ~* M originan
blancos con absorbencias inferiores a 0.1
absorbencia del
blanco
aumenta
lentamente,
Sin
por
embargo,
lo
que
conveniente preparar simultáneamente el blanco y la muestra.
la
es
- 334
Las condicionas
N-acet il-L'-cisteína
se
-
óptimas
para
obtienen
con
o-ftaldehido/N-acetil-L-cisteína e
la
determinación
relaciones
de
molares
isoleucina/N-acetil-L-cis-
teína en los intervalos 5 - 25 y 3 - 25
, respectivamente.
El
derivado formado es totalmente estable al menos durante 2 h.
El intervalo dinámico lineal se
extiende
hasta
concentración de N-acetil-L-cisteína de 3.0xl0-4 M, siendo
6.26x10».
una
&=
El LOD es 9.1xl0-7 M y el CV del 0.3 % para N-acetil
-L-cisteína 1.26xl0“4 M .
El procedimiento se aplico con muy buenos
a
la
determinación
fármacos.
de
N-acetil-L-cisteína
Los resultados se compararon
con
resultados
en
los
diversos
obtenidos
a
partir de la valoración del tiosulfato formado por reacción de
la
N-acetil-L-cisteína
determinación
con
colorimetrica
1,10-fenantrolina tras
la
tetrationato
del
(181)
Fe(II)
oxidación
del
y
formado
tiol
con
la
con
Fe(III)
(182).
En general,
los
tres
recuperaciones aceptables,
Rinofluimucil
fabricante.
El
siempre
método
procedimientos
siendo los
superiores
del
valores
al
condujeron
obtenidos
declarado
tetrationato
originó
por
a
con
el
resultados
anormalmente altos con Fluimucil antibiótico,
presumiblemente
debido a la presencia de tiamfenicol,
puntos
fueron indefinidos
para
Superpeni
y
los
mucolítico
y
finales
Flubiotic,
- 335 -
debido probablemente a la amoxicilina presente.
últimos fármacos,
estabilizarse
al
los valores de
aplicar
absorbencia
el método
Con estos
no
del
llegaron
dos
a
F e (II I )-1,10-
f enant rolina.
Por su
esperar
con
o-ftaldehido
el
e
parte,
la
método
única
interferencia
espectrofotométrico
isoleucina
ausentes en estos preparados.
son
otros
Ad e m á s , el
sencillo y fácil de automatizar.
tioles,
método
que
que
cabría
utiliza
normalmente
es
rápido,
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