BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA EN NUESTRO

II Congreso Latinoamericano de Especialistas en Pequeños Rumiantes y Camélidos Sudamericanos
XI Congreso Nacional de Producción Ovina
BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA EN NUESTRO FUTURO INMEDIATO
Hernán Baldassarre, DVM
Nexia Biotechnologies Inc., Ste. Anne de Bellevue, Québec, Canada
El presente manuscrito discutirá el “estado del arte” en la aplicación de las –así llamadasBiotecnologías de Reproducción Asistida de ultima generación a la producción ovina y
caprina. Dichas técnicas han sido desarrolladas o adaptadas al uso en ovejas y cabras,
donde se obtienen hoy resultados comparables a aquellos obtenidos en las especies que son
objetivo primario del desarrollo (generalmente bovinos). Los aspectos técnicos y resultados
obtenidos serán motivo de extenso tratamiento, pero es también un importante objetivo de
esta presentación la evaluación de las aplicaciones concretas (actuales y potenciales) para
utilización de estas técnicas a la producción pecuaria, con especial interés en los pequeños
rumiantes domésticos.
1. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO:
La In Vitro Producción de embriones (IVP) tiene la capacidad potencial de producir mayor
cantidad de hijos de hembras sobresalientes que la Ovulación Múltiple y Transferencia
Embrionaria (MOET). La naturaleza laparoscopica de la técnica de recuperación de óvulos
permite repetir el procedimiento en la misma donante mayor cantidad de veces que la
recuperación de embriones por lavaje uterino, que es un procedimiento quirúrgico que deja
secuelas (adherencias) que limitan su repetibilidad en el mismo animal. Por otro lado, la IVP
permite producir progenie a partir de animales de alto valor en circunstancias en las que la
MOET no es posible, como es el caso de animales prepuberes, seniles, gestantes y postmortem. Esta técnica involucra al menos 4 etapas que son la recolección de ovocitos, la In
Vitro Maduración (IVM), la In Vitro Fertilización (IVF) y el In Vitro Cultivo (IVC) hasta estadio
de desarrollo compatible con transferencia al útero de una receptora.
1.a. Recolección de ovocitos: Si bien la IVP de embriones puede realizarse a partir de
ovocitos recuperados de ovarios de matadero, la mayoría de las aplicaciones practicas que
describiremos requieren que los óvulos provengan de animales de alto valor económico o de
historia sanitaria conocida (e impecable). En consecuencia, dichas aplicaciones requieren la
utilización de una técnica de recolección efectiva y eficiente para la obtención de óvulos
procedentes de animales vivos. En este sentido, los mejores resultados se obtienen
aplicando la técnica de recuperación de óvulos por aspiración laparoscopica (folículocentesis
laparoscopica).
Snider y Dukelow (58) reportaron la colecta laparoscopica de ovocitos ovinos por primera vez
en 1974. Sin embargo, la técnica fue desarrollada casi 20 años mas tarde al mismo tiempo
por el grupo de Robin Tervit en Nueva Zelanda (56,60,61, 62, 63) y nuestro grupo en
Argentina (1,2,3,4), ambos trabajando con ovinos.
El procedimiento se realiza bajo anestesia general, y requiere por tanto que los
animales estén en ayuno sólido y líquido no menor de 24 h. Los animales se colocan en una
típica camilla de laparoscopia que permite colocarlos en un plano inclinado de
aproximadamente 45° con respecto al piso. La técnica de recolección es relativamente
sencilla para el operador habituado a trabajar con laparoscopía. Brevemente, bajo
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observación laparoscópica, los ovarios son expuestos levantando la fimbria con un fórceps
atraumático, y los folículos son aspirados utilizando una aguja 20G de bisel corto montada en
la punta de una pipeta plástica (tipo IA) conectada a un tubo de recolección y una línea de
vacío. Cada 5-10 folículos punzados, la pipeta y tubuladura se enjuagan en medio de
recolección, compuesto por TCM 199 suplementado con 0.05 mg/ml de heparina, 100 UI/ml
de penicilina, 1 mg/ml de estreptomicina, 0.5 mg/ml de kanamicina, y 0.5% (p/v) de albúmina
bovina sérica (fracción V).
Respecto de las hembras donantes, las mismas pueden no tener ningún tratamiento
hormonal en cuyo caso trabajaremos sobre una población folicular aleatoria y eventualmente
pequeña (59), o bien podemos sincronizarlas a base de progestagenos (esponjas/CIDR) y
estimularlas con gonadotropinas a los efectos de trabajar sobre una mayor población folicular
(1,2,3,4,27,28,39,53,56,60,61,62,63,64).
Los datos que siguen a continuación, resumen los resultados de recuperación
laparoscopica publicados por diferentes grupos trabajando con ovejas y cabras.
Tabla 1: Resultados de aspiración folicular y recuperación de ovocitos publicados en ovinos y
caprinos.
Especie
Ovina
Ovina
Ovina
Ovina
Ovina
Ovina
# de
donantes
18
40
64
27
46
Ovina
142
Ovina (pp)
44
Caprina
15
Caprina
16
Caprina
27
Caprina (pp)
23
Caprina
21
Caprina
60
(pp)=animales prepuberes
TFA/donant TOR/donant %Rec.
Autor (año)
e
e
5.3 – 6.9
1.6 – 2.7
35% Tervit y col. (1992)
10.4
5.2
50% Tervit y col. (1993)
14.7
8
54% Smith y col. (1994)
12.6
5.9
49% Tervit y col. (1995)
13.9
11.1
80% Baldassarre
y
col
(1994ª)
12.5
10.2
82% Baldassarre
y
col
(1994b)
13.6
10.7
79% Baldassarre y col (1995)
19.4
9.6
49% Rodríguez y col. (2000)
14.1
9.7
69% Terzano y col. (1999)
16.1
11.5
71% Graff y col (1995)
20
14.4
72% Graff y col (1999)
39
28.4
73% Koeman y col (2000)
19
15.9
84% Koeman y col (2000)
18.5
14.8
80% Baldassarre y col (2001)
Diversos factores afectan el numero de folículos disponibles para aspiración y el número y
calidad de los óvulos recuperados. En primer lugar tenemos el tratamiento de sincronización
/ superovulación empleado: trabajando con ovejas, hemos encontrado resultados
equivalentes cuando comparamos un protocolo a base de múltiples inyecciones de FSH vs.
un régimen que combina FSH y PMSG en una sola inyección (OS = one shot) 36-48h antes
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de la aspiración folicular (Tabla 2). Similares resultados fueron obtenidos por Rodríguez y
col. (1999) trabajando con corderos y por nuestro grupo en Canadá trabajando con cabras
(Baldassarre y col., no publicados). En consecuencia, de rutina utilizamos el protocolo que
combina FSH-PMSG en una sola inyección 36h antes de la recolección de óvulos.
Tabla 2: Resultados comparativos entre diferentes tratamientos hormonales a nivel del total
de folículos aspirados (TFA), total de ovocitos recuperados (TOR) y porcentaje de
recuperación (%Rec.) en ovejas. Baldassarre y col. (1998)
Protocolo
# de ovejas
TFA
TFA/oveja
TOR
TOR/oveja
Multiple FSH
73
1075
14.7±5.4
871
11.9±4.9
24
OS
38
475
12.5±5.3
369
9.7±3.7
OS-eCG24
31
390
12.6±5.2
282
9.1±5.2
48
OS-eCG
70
961
13.7±5.9
806
11.5±6.2
Resultados en la misma columna no son diferentes (P>0.05, ANOVA)
%Rec.
81.0±5.6
77.4±10.3
72.2±5.2
83.9±15.2
Otro factor muy importante es la presión de vacío ya que debe ser suficiente para aspirar el
contenido del folículo, pero no demasiada ya que haría que los óvulos pierdan sus cubiertas
celulares (cúmulus). Durante el desarrollo de la técnica, llegamos a la conclusión de que la
presión ideal es de entre 50 y 75 mmHg. Trabajos iniciales en bovinos con ovarios de
matadero demostraron que los ovocitos con pocas cubiertas celulares tienen menores
chances de desarrollo luego de IVM/IVF. Sin embargo, trabajando con ovocitos ovinos
recuperados por laparoscopia, nuestro grupo no encontró diferencias en el desarrollo In Vitro
de los embriones derivados de ovocitos de grado 1 (cúmulus compacto / completo) y grado 2
(1-3 capas celulares).
Tabla 3: Resultados comparativos en el desarrollo hasta blastocistos luego de la IVM/F/C de
ovocitos de grado 1 y 2 recuperados por laparoscopia (Baldassarre y col, 1998)
Evaluados
G1
G2
273
238
Madurados
Fertilizados
Blastocistos
G1
G2
G1
G2
G1
G2
258 (94%) 234 (98%) 197 (72%) 180 (76%) 94 (34%) 75 (31%)
De particular interés es la repuesta obtenida en animales jóvenes. Por mecanismos que no
son del todo conocidos, corderos y cabritos prepuberes son capaces de responder a estimulo
gonadotropico en forma exagerada, ofreciendo significativamente mayor numero de folículos
para la aspiración de óvulos(19,20,21,39,40,52,53). Este fenómeno es particularmente
evidente en animales de entre 45-60 días de edad y se va perdiendo (disminuyendo) a
medida que el animal crece (20-21). Earl y col. (1995) reportaron cantidades superiores a los
100 ovocitos recuperados por laparotomía de corderos de 6-7 semanas de vida.
Contrariamente a lo reportado en terneros, estos ovocitos tuvieron luego una buena tasa de
desarrollo In Vitro y los autores sugirieron que la tecnología permitiría producir alrededor de
25 crías a partir de cada cordero donante. La alta recuperación por laparotomía (86/donante)
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y una aceptable tasa de desarrollo in vitro de ovocitos procedentes de corderos de 4-6
semanas ha sido posteriormente confirmada por Ledda y col. (1999). En el caso de las
cabras prepuberes, uno de los grupos más activos es la Universidad Autónoma de
Barcelona. Sin embargo en sus trabajos los ovocitos provienen de ovarios de matadero en
los que los cabritos no han sido estimulados hormonalmente por lo que la comparación es
difícil (32,33,34,42). Trabajando con cabras prepuberes de 2 a 5 meses de edad, nuestro
grupo publicó un trabajo de recuperación laparoscopica en el que el numero de folículos
aspirados y ovocitos recuperados fue significativamente mayor que el de cabras adultas que
actuaron como control (Tabla 4).
Tabla 4: Aspiración laparoscopica de ovocitos en caprinos: Resultados comparativos entre
cabras prepuberes y adultas. Extractado de Koeman y col. (2000)
Edad
# de animales
Foliculos/donante Ovocitos/donant % Recuperación
e
Prepuberes
23
39.1±4.5a
28.4±3.5 a
73% a
Adultas
21
19.1±1.4b
15.9±1.5 b
83% a
Valores en la misma columna con distinto superíndice son diferentes (Anova P.0.05)
En dicho estudio, el desarrollo In Vitro de los embriones procedentes ovocitos de cabras
prepuberes y adultas fue similar aunque bajo, posiblemente producto de condiciones de
cultivo suboptimas (8 y 14% respectivamente). Trabajos posteriores de nuestro equipo
confirmarían que la capacidad de desarrollo de los ovocitos de cabras prepuberes luego de
la IVM/IVF es aceptable (manuscrito en preparación).
Por ultimo, un breve comentario sobre la recuperación de ovocitos por aspiración guiada por
ultrasonografía. Si bien es el sistema de elección en vaquillonas y vacas adultas, los
resultados obtenidos por Graff y col. (27,28) son bastante pobres comparados con los
obtenidos por laparoscopia por ellos mismos (ovocitos recuperados, 11 vs 4.3/cabra).
1.b. In vitro maduración (IVM): El tubo conteniendo el liquido folicular aspirado es evaluado
bajo stereomicroscopia y los complejos ovocito-cúmulus son pipeteados y transferidos a las
placas con medio de maduración para comenzar la línea de IVP. En todos los casos, las
incubaciones se realizan en microgotas de medio de cultivo bajo aceite de parafina, a 39ºT y
en atmósfera de 7% O2, 5% CO2 y 88% N2
En el caso de los ovinos el medio de maduración es TCM199 suplementado con 10% suero
fetal bovino y hormonas (10µg/ml oLH (ICP, Auckland, New Zealand; NIH-oLH-S1), 1 µg/ml
pFSH (Schering, Omaha, NE, USA), y 1 µg/ml Estradiol 17ß (Sigma, USA). Un trabajo
publicado por de Matos y col (18) sugiere que el agregado de cisteamina 200 µM en el medio
de maduración de ovocitos ovinos tiene un efecto favorable en el desarrollo posterior de los
embriones hasta estadio de blastocisto.
En el caso de las cabras, utilizamos 10% suero caprino ya que estudios de Palacios y col
(44) demuestran sugieren que el suero de cabra promueve una mejor maduración nuclear y
adquisición de competencia meiotica y la incubación se realiza en atmósfera de 5% CO2 en
aire. La duración de la IVM es 24 a 27h.
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Utilizando estos medios, el porcentaje de maduración in vitro de ovocitos obtenidos por
aspiración laparoscopica en ovejas y cabras estimuladas con gonadotropinas se encuentra
en el orden del 80-90% (1,3,4,39,56,62).
1.c. In vitro Fertilización (IVF): En el caso de los ovinos, la misma se realiza en base a
procedimientos ampliamente descriptos en la bibliografía (1,3,4,56,51,62). El medio base es
el SOFM, que es el Synthetic Oviduct Fluid (SOF) descripto por Tervit y col. en 1972 con el
agregado de 1 mM glutamina, 2% (v/v) aminoácidos esenciales (BME-essential, Sigma) y 1%
(v/v) aminoácidos no esenciales (MEM-nonessential NEAA, Sigma). Para el caso de la
fertilización, el SOFM se suplementa con 20% suero de oveja en estro, 20 µM penicilamina y
10 µM hipotaurina. Para su capacitación, el semen ovino / caprino fresco debe dejarse a
oscuras y a temperatura ambiente por espacio de 2-3 horas. Luego se procede a enriquecer
la muestra a través de un lavaje en gradiente discontinuo de Percoll (90:45). Los
espermatozoides sedimentados son luego resuspendidos en Hepes-SOFM y vueltos a
centrifugar, para finalmente realizar la cuenta en cámara y su suspensión definitiva en medio
de fertilización a concentración de 5×106 espermas/ml , de la cual usaremos 10µl por “gota”
en la placa de Petri. En el caso de los caprinos, se utilizan mas comúnmente los medios DM
y TALP y la solución de espermatozoides requiere ser incubada en presencia de “agentes
capacitantes” tales como heparina (42,45), heparina + cafeína (65,66) ionóforo de calcio (38),
lactato de calcio (16) antes de “inseminar” las gotas conteniendo los ovocitos. En líneas
generales podemos decir que la obtención de buenos resultados de fertilización (~70%) es
un poco mas difícil en los caprinos donde requiere habitualmente un tiempo encontrar la
relación ideal entre la concentración de los agentes capacitantes y el tiempo de incubación
compatible con alta tasa de fertilización, baja tasa de poliespermia y alta tasa de desarrollo
embrionario.
1.d. In vitro Cultivo (IVC): Si bien pueden encontrarse en la literatura cientos de trabajos
empleando co-cultivo con células somáticas y/o medios conteniendo altos porcentajes de
suero, los trabajos en los que los embriones fueron transferidos muestran que para obtener
buenas tasas de viabilidad post transferencia, buenas tasas de viabilidad post-congelamiento
y mínima incidencia de síndromes de cordero / cabrito grande, la IVC debe realizarse en
ausencia de suero. Trabajando con ovinos, excelentes resultados han sido obtenidos
cultivando los embriones en medio SOFM suplementado con 8mg/ml de FAF-BSA
(3,4,25,40,51,52,62,63.) La Tabla 5 resume los mejores resultados en la literatura utilizando
medios de cultivo sin suero.
Tabla 5 : Desarrollo hasta estadio de blastocisto en embriones IVP cultivados en medios sin
suero luego de la IVM e IVF.
Especie
Medio
Blastocist (%)
%Gest.
%Crias
Autor (año)
Ovina
SOFM-BSA
31%
55%
55%
Tervit y col. (1992)
Ovina
SOFM-BSA
20%
41%
38%
Baldassarre y col (1996)*
Ovina
SOFM-BSA
30%
59%
41%
Ptak y col (1999)
Los resultados de preñez y parición fueron reportados por Martínez y col (1997)
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En el caso de los embriones caprinos, existe un menor volumen de información incluyendo
transferencias y congelamiento de embriones producidos in vitro, pero la mayoría de los
autores utilizan medios conteniendo suero y/o co-cultivo con células somáticas (10, 15, 16,
41, 45, 48,49, 65, 66), .
2. TRANSGENESIS:
La posibilidad de modificar el genoma de un animal a través de la introducción de un
fragmento de DNA que no le es propio, es uno de los logros mas interesantes de la
biotecnología reproductiva en los últimos años (43,50,67,68). Este fragmento de DNA, el
“transgen”, codificara la producción de una proteína determinando una nueva función
orgánica o modificando una existente según el caso. Si bien las aplicaciones como veremos
mas adelante son múltiples, debido a limitaciones actuales de la tecnología la misma esta
siendo utilizada solamente en aquellas aplicaciones de muy alta rentabilidad, lo que se
reduce prácticamente a la producción de proteínas de interés medico y farmacéutico
utilizando la glándula mamaria de animales transgénicos como birreactor (50). En este
sentido, la glándula mamaria tiene un potencial fabuloso ya que ha sido estimado que tiene
una capacidad para producir hasta 40g de proteína por litro de leche. Es por ello que la
producción de proteínas en animales transgénicos resulta siendo mucho mas eficiente que
los sistemas tradicionales a base de bacterias y hongos que son primitivos y no pueden
sintetizar proteínas complejas, o el caso de los cultivos celulares que son extremadamente
costosos y de baja eficiencia.
Tradicionalmente, la producción de animales transgénicos se realiza por medio de la
microinyección de DNA a ovocitos fertilizados en estadio de pronúcleos (30). El
procedimiento en si mismo es relativamente sencillo cuando se cuenta con el equipamiento y
entrenamiento necesario y confiable como sistema de producción de transgénicos. Sin
embargo, es característico de observar bajas tasas de integración (1-10%), integración al
azar (con la consiguiente variabilidad en los resultados de expresión dependiendo de la
posición y numero de copias) y alta proporción de mosaicismo (determinando variabilidad en
la heredabilidad del transgen cuando el animal es reproducido).
Para ejemplificar la ineficiencia general del sistema, veamos los resultados que obtuvimos la
producción de cabras transgénicas para htPA (activador tisular de plasminógeno humano)
por microinyección de zigotas en estado de pronúcleos (5). En este trabajo, zigotas en
estadio de pronúcleos fueron recolectadas de cabras superovuladas e inseminadas. La
recolección se realizo por laparotomía mediana seguida de un lavaje de oviducto. Un
importante factor para el éxito de este tipo de programa es la correcta sincronización de
ovulación en las donantes, para asegurar que huevos recuperados se encuentren en un
periodo de 15-20h post-fertilización, la cual se logra a través del uso de una inyección de
GnRH a las 36h de retirada la esponja de sincronización (6).
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Cabras superovuladas:
Cabras colectadas:
Ovulaciones:
Huevos recuperados:
Zigotas aptas para microinyección:
Zigotas microinyectadas y transferidas:
Receptoras transferidas:
Receptoras preñadas:
Receptoras a termino:
Cabritos nacidos:
Cabritos transgénicos:
118
83
981
774
540
487
134
69
51
86
4
(70%)
(11.8/cabra colectada)
(9.3.cabra colectada)
(6.5/cabra colectada)
(5.9/cabra colectada)
(3.6 embriones/receptora)
(51%)
(1.7/receptora; 17% de los embriones)
(2M:2H; 4.6% transgénesis; ~1% emb.)
Ambas hembras produjeron htPA en su leche pero la bioactividad y concentración en leche
fue superior en una de ellas (~ 5g/litro) ejemplificando quizás la variabilidad del resultado
motivada por integración al azar. Ambas hembras parieron mellizos (2 hembras y 2 machos
respectivamente) de los cuales ninguno fue transgénico sugiriendo los efectos del
mosaicismo en la heredabilidad del carácter. Asimismo, la presencia del transgen en la
población de espermatozoides fue estudiada en ambos machos usando FISH (Fluorescent In
Situ Hybridization). Los resultados mostraron una gran diferencia entre ambos a nivel del
porcentaje de espermas conteniendo el transgen (70% vs 20%). Cuando el mejor de los
machos fue utilizado por inseminación artificial para generar el rodeo productor de htPA,
28/54 cabritos nacidos resultaron transgénicos confirmando que el FISH es un buen test para
estimar la potencial transmisión vertical del transgen (7).
Si bien estos resultados exponen la ineficiencia general del sistema, debemos decir también
que el htPA tiene un valor (dependiendo del mercado) del orden de los U$S 20.000 por
gramo (1 dosis = 100 mg.). Por lo tanto podemos decir que es una actividad extremadamente
rentable que justifica los enorme costos.
Múltiples estrategias han intentado mejorar la ineficiencia de la microinyección de pronúcleos
como mecanismo de producir animales transgénicos. Estas estrategias incluyen la
transferencia de DNA mediada por espermatozoides –resumido por Squires en 1999-(57);
ICSI utilizando espermatozoides transgénicos (46), la utilización de retroviruses para inyectar
/ infectar ovocitos y embriones (31) y la utilización de la tecnología de Transferencia Nuclear
(clonación) a base de células transgénicas (9, 35, 54). De todas ellas, la que ofrece una
mejor perspectivas es la clonación a base de células transfectadas in vitro con el DNA de
interés.
En cuanto a las aplicaciones posibles esta tecnología, las mismas son de lo mas variadas.
La mas concreta y corriente es el uso de los animales como biorreactores para la producción
de proteínas recombinantes de interés farmacéutico. Ejemplos en los que la especie en uso
es un pequeño rumiante incluyen el citado htPA (5, 7, 22, 23); Factor de coagulación humano
VIII y IX (12,29,54); α-1 Anti-tripsina humana (55, 71.), Anti-trombina III (23,24) y
anticuerpos monoclonales (26). En líneas generales podemos decir que dependiendo del
tamaño del mercado, las cabras (y en menor medida las ovejas) ofrecen un excelente
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modelo para la producción de fármaco-proteínas en la leche de animales transgénicos, ya
que la producción de fundadores y los costos operativos son significativamente inferiores con
respecto a los bovinos (23). En un estudio hecho por Wall y col. en 1992 se estimo que el
costo de producir una vaca transgénica era U$S 546.000 mientras que una oveja / cabra
transgénica era U$S 60.000. Estas cifras confirman un importante rol para los pequeños
rumiantes en la industria de referencia. Otro interesante ejemplo de los alcances que puede
tener la tecnología, es el caso de la producción de Biosteel(BioAcero) que es la proteína de
la “tela de araña” producida en la leche de cabras transgénicas. En este caso, la proteína
producida en la leche de nuestras cabras transgénicas es hilada para producir una fibra que
será posteriormente utilizada para aplicaciones de lo mas variadas, incluyendo aplicaciones
medicas (suturas, ligamentos prostéticos) e industriales (redes de pesca, chalecos antibala,
etc.) . En cuanto a los usos de la tecnología con miras a aumentar la producción pecuaria, la
misma tendrá que aumentar la eficiencia y abaratarse antes de que podamos ver
aplicaciones practicas en este campo. Sin embargo algunas aplicaciones concretas ya han
sido insinuadas o probadas en pequeña escala. Estas aplicaciones incluyen la modificación
de la composición de la leche (mas proteína para mejorar el rinde en la producción de
quesos; menos lactosa para el mercado de las personas que no pueden digerir este azúcar,
etc.); resistencia a las enfermedades por ejemplo producción de “lysostaphin” (stafilo-lisina)
en la leche para generar resistencia a las mastitis S. Aureus (37); mejoras en la producción
de carne a través de la modificación de los perfiles de crecimiento trabajando con cassettes
de hormona de crecimiento (resumido por Wall, 1996) y en la producción de lana , por
ejemplo a través de la expresión de factores de crecimiento en el folículo lanoso (17).
3. CLONACION :
La habilidad de poder re-programar el núcleo de una célula diferenciada y luego utilizarlo
para generar individuos idénticos es un desarrollo que sin duda marcara el futuro de la
producción pecuaria. La demostración física de este concepto –Dolly- ha puesto a la
biotecnología de reproducción y a las ovejas en la tapa de todos los diarios y revistas del
mundo en forma casi cotidiana desde que su existencia fuera comunicada por Wilmut y col.
en Febrero de 1997 (11, 70). Poco tiempo después, la técnica ha sido utilizada con éxito
para producir otras mas clones de oveja (69) y otras especies domesticas incluyendo vacas
(13), cabras (9, 35,36) y, mas recientemente, cerdos (47).
A casi cinco años del nacimiento de Dolly, la tecnología básica para producir clones por
transferencia nuclear (TN) permanece la misma. El citoplasma receptor son básicamente
ovocitos en estadio de Metafase II los cuales son enucleados por aspiración con una
micropipeta. En cuanto a las células donantes, en la técnica original descripta por Wilmut y
col., las mismas deben ser inducidas a salir del ciclo celular (G0) por medio de su cultivo en
medios pobres en suero (serum starvation). Así cultivadas, las células entran en un estadio
de reposo (quiescencia) en el que la cromatina nuclear seria mas fácil de ser re-programada
por el citoplasma receptor. Dicho estadio también puede ser inducido por cultivo de las
células hasta confluencia, en este caso la quiescencia es el resultado de “inhibición por
contacto”. Cibelli y col. (13) han reportado también la producción exitosa de clones a partir de
células ciclando, sugiriendo que el estadio de quiescencia no seria esencial, lo cual ha
producido cierto debate ya que en todo grupo de células ciclando siempre hay una
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subpoblación de células en G0. La forma mas frecuente de realizarla TN es fusionando la
célula donante y el citoplasma receptor por medio de pulsos eléctricos. Detalles de estos
procedimientos han sido cubiertos ampliamente en publicaciones anteriores (9, 11, 13, 35,
36,54, 70).
Factores a tener en cuenta en le estrategia de un programa de TN:
•
•
•
Citoplasma receptor: Mientras que todos los trabajos reportados en bovino utilizan
ovocitos de matadero y la vasta mayoría de los trabajos en ovejas y cabras se basan
en ovocitos madurados in vivo recuperados por lavaje de oviducto, nuestro sistema se
basa en la utilización de ovocitos inmaduros recuperados por aspiración
laparoscopica. Esta característica nos permite garantizar salud animal en el origen de
dichos óvulos y, al mismo tiempo, prolongar la vida útil de estas donantes comparado
con el limitado uso que permite el lavaje de oviductos.
Tipo celular: Dependiendo del objetivo del trabajo, las líneas celulares pueden ser no
transgénicas (fetales-adultas), de un animal transgénico (feto o adulto) o líneas
transfectadas en cultivo (fetales-adultas)
Cultivo posterior a la TN: Casi todos los trabajos de clonación en bovinos y ovinos
describen el cultivo de los embriones “reconstruidos” hasta estadio de blastocisto
antes de ser transferidos al útero de una hembra receptora. Curiosamente, los 2
grupos que trabajamos en cabras hemos preferido transferir los embriones al oviducto
de cabras receptoras 24-48h post TN. Este hecho se vuelve muy interesante ya que
los resultados publicados parecen sugerir que la incidencia de anormalidades que
desencadenan en perdidas de preñez y de crías post-parto son muy superiores en
clones ovinos y bovinos. Algunas de estos problemas (anormalidades placentarias,
síndrome ternero grande, etc.) parecen ser compartidos con los embriones producidos
in vitro, particularmente cuando los embriones han sido cultivados en medios
conteniendo suero. Esto podría sugerir que las menores perdidas reportadas en la
producción de cabras por TN se deben (al menos parcialmente) al hecho de que se
evita el cultivo in vitro por tiempo prolongado.
Los resultados que se muestran a continuación reflejan el grado de eficiencia de la técnica
de TN en nuestras manos, aplicado a la producción de cabras (35-36)
Tipo Celular
Ovocitos procesados
Ovocito madurados (%IVM)
Resultados de fusion nuclear
Embriones transferidos
Receptoras preñadas/transferidas
Crías nacidas
Crías sobrevivieron
Fetales
Adultas
Transfectadas TOTAL
 =========================
989
 ========================= 784 (80%)
 ========================= 54 to 80%
124
97
13
234
5/14
4/8
1/2 10/24 (41%)
7
7
2
16
3
6
1
10 (62%)
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El número de crías logradas respecto del numero de embriones trasferidos termina siendo
semejante al obtenido por microinyección de pronúcleos (1-2%). La ventaja de la clonación
en la producción de transgénicos es se requieren menos receptoras para lograr la misma
cantidad de transgénicos ya que si utilizamos células transgénicas todos los individuos que
nacen son transgénicos.
En cuanto a las aplicaciones de la TN, las mismas pueden ser de lo mas variadas:
a)
Asociada a Transgénesis: definitivamente, la TN esta destinada a mejorar las
ineficiencias de la producción de animales transgénicos (14,41). Las células pueden
ser transfectadas y seleccionadas in vitro para asegurar que los individuos que nazcan
serán transgénicos. Las células pueden ser además estudiadas en cuanto a numero
de copias del transgen y posición en la que ha integrado antes de su transferencia,
mejorando así las posibilidades de expresión. Mas aun, modernas herramientas de
biología molecular podrán ser utilizadas para poder activar y desactivar genes y/o las
secuencias que los controlan, mientras las células están en cultivo y previo a la
transferencia. En este sentido, las aplicaciones son las antes descriptas para
transgénesis pero con mayor eficiencia.
b)
Duplicado de animales de alto valor genético: En primera instancia, conservar células
de un animal de alto valor servirá como póliza de seguro en caso de muerte. En este
caso, la técnica ofrece mas sofisticación y garantías que el banco se semen o
embriones. En una segunda instancia el clonado de individuos de superioridad
probada permitirá expandir los limites de su uso en programas de IA y TE.
c)
Generación de individuos idénticos para la investigación: El experimento perfecto
tendrá como controles a animales genéticamente idénticos a los que están recibiendo
el tratamiento experimental.
d)
Transplante de órganos: En particular es una aplicación en la que los cerdos son
vistos como la especie ideal, pero debe ser mencionado.
4. BALANCE Y CONCLUSIONES
La aplicación en escala comercial de estas tecnologías esta necesariamente ligada a la
ecuación costo beneficio. En este sentido, seguirá siendo difícil encontrar situaciones
pecuarias de producción caprina y ovina en las que se justifique la necesaria inversión en
laboratorios, personal, equipamiento y, en algunos casos, pago de licencias.
La IVP de embriones está suficientemente desarrollada como para ofrecer una alternativa
eficiente a la MOET convencional. En particular, en programas orientados a la introducción
de nuevas razas puras a partir de un núcleo pequeño de hembras. La posibilidad de acortar
los intervalos generacionales mediante el uso de donantes prepuberes puede también en
este caso tener un valor muy importante. La limitante mas importante es la necesidad de
tener un laboratorio fijo donde procesar los ovocitos recuperados de estas donantes, que
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también puede ofrecer el servicio de producir embriones a partir de animales de alto valor
que han perdido su fertilidad o de los ovarios de animales valiosos que han muerto.
La tecnología de transgénesis (asociada o no a la de transferencia nuclear para la
producción de los fundadores) ofrecerá un nicho de oportunidad a unos pocos productores
lecheros con capacidad para adaptarse a trabajar bajo la alta rigurosidad sanitaria que exige
la producción de proteínas de interés medico y farmacéutico. En este sentido, proteínas de
uso industrial como nuestro Biosteelquizás tengan mas posibilidades de ofrecer en el futuro
una mayor rentabilidad que la producción tradicional a los productores. Por ultimo, las
aplicaciones específicamente pecuarias (mejoras en la producción, resistencia a
enfermedades, etc.) requerirán primero una aumento de la eficiencia, una disminución de los
costos y mejoras substanciales en los márgenes agropecuarios.
Por ultimo, la tecnología de Transferencia Nuclear permitirá aumentar la eficiencia en la
producción de animales transgénicos y expandir sus aplicaciones, así como también el
duplicado de animales sobresalientes o de alto valor, mas allá de su propia vida. Para ello
primero deberá superar un gran numero de problemas que afectan su eficiencia, en particular
los problemas de mortalidad pre y peri-natal.
En el caso de las aplicaciones terapéuticas de clones y transgénicos el gran fantasma
seguirá siendo por un tiempo el poder demostrar las garantías que serán exigidas por los
organismos de control (ej. FDA) a los efectos de autorizar la venta y distribución de estos
productos. En estos casos esta invertida la carga de la prueba, y los productos son vistos
como potencialmente nocivos y deben demostrar su inocuidad. Este proceso a veces puede
ser imposible o tan costoso de demostrar que no vale la pena. Otro escollo a superar será la
opinión publica cuya sensibilidad inicial es negativa por la habitual reacción a lo que no se
entiende, pero también por el temor de que estas tecnologías puedan ser utilizadas en el
futuro en personas con fines inapropiados.
Por ultimo, el gran interés económico generado alrededor de la producción de animales
transgénicos y clones impide la comunicación abierta entre los diferentes grupos trabajando
en el área, lo que hace que los progresos puedan ser mas lentos. Al mismo tiempo, los
desarrollos resultan en patentes y luego, para aplicar la tecnología con fines comerciales, es
necesario obtener licencias y pagar regalías, lo que puede tener un gran peso negativo a la
hora de realizar la ecuación costo-beneficio.
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