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CURSO DE
BIOTECNOLOGÍA
APLICADA
7ª Edición
DIRECCIÓN DEL CURSO
Este curso es posible gracias a una aportación educacional de
7º Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA
DR. JUAN BUEREN Y DR. JOSÉ LUIS MOTELLÓN
Fundación
Centro Nacional de
Investigaciones
Cardiovasculares
Carlos III
Madrid, 13-16 de febrero de 2007
Grupo
saned
© SANED 2007
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publicación podrá ser reproducida, almacenada o transmitida en
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Índice
ÍNDICE
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
5
.........................
Miguel A. Piris. Programa de Patología Molecular. CNIO. Madrid
Proteómica y Medicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
Fernando Vivanco. Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz
Inmunoterapia humoral
..........................................................
31
Dr. Manuel Hidalgo. The Johns Hopkins University
Introducción a la inmunoterapia celular
..........................................
41
José R. Regueiro. Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad
Complutense. Madrid
Eduardo Martínez Navas. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid
Células embrionarias pluripotentes
.............................................
57
Miguel Torres. Científico titular del Departamento de Inmunología y Oncología.
Centro Nacional de Biotecnología. CSIC-Pfizer
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
..................
65
Felipe Prósper. Servicio de Hematología y Área de Terapia Celular. Clínica
Universitaria. Universidad de Navarra
Avances en terapia regenerativa
.................................................
89
María Dolores Herreros Marcos, Isabel Pascual Migueláñez, Jacobo Trébol López,
Damián García Olmo
Cátedra UAM-CELLERIX de Terapia Celular y Medicina Regenerativa
Unidad de Terapia Celular del Hospital Universitario La Paz. Madrid
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
................
103
Laura M. Lechuga. Grupo de Biosensores. Centro Nacional de Microelectrónica
(IMM-CNM). CSIC
Vectores de transferencia en terapia génica
....................................
Jesús M. Fominaya. Centro Nacional de Investigaciones oncológicas
119
1
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Índice
......................
137
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología . . . . . . . . .
157
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Juan A. Bueren1 y Antonio Bernad2
1División
de Hematopoyesis y Terapia Génica. CIEMAT
de Inmunología y Oncología
Centro Nacional de Biotecnología. CSIC
2Departamento
Alfonso Domínguez-Gil Hurlé. Servicio de Farmacia. Hospital Universitario de
Salamanca
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica
humana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
173
Fernando Ponz. Departamento de Biotecnología. INIA, Madrid
Innovación tecnológica y nuevas terapias: obtención de anticuerpos
monoclonales totalmente humanos: panitumumab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
185
José Luis Motellón. Amgen S.A.
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la Agencia Europea
de Medicamentos (EMEA). BWP (Grupo de Biológicos) y CHMP
(Comité de Medicamentos de uso Humano) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
197
Sol Ruiz y Gonzalo Calvo. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios
Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised
pharmacotherapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl MPharm. Department of Hospital
Pharmacy, Erasmus University Medical Centre Rotterdam. The Netherlands
2
209
INTRODUCCIÓN
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción
U
n año más nos complace presentar una nueva edición
del curso de Biotecnología Aplicada. La buena acogida y el entusiasmo de ponentes y asistentes en cursos
previos nos ha servido de incentivo para trabajar en esta sexta
edición.
El rápido avance que durante los últimos años han experimentado nuestros conocimientos en los múltiples campos de la
Biología y la Medicina ha puesto a nuestro alcance una información abundante y crítica que crece de manera exponencial. Nunca anteriormente habíamos podido observar, desde una perspectiva tan múltiple y diversa,
el complejo escenario existente en la investigación y el desarrollo de nuevos
tratamientos. Nuevos problemas necesitan nuevas soluciones y, ahora más que
nunca, la innovación terapéutica se presenta como la clave para la consecución
de nuevos tratamientos eficaces y seguros.
La búsqueda de nuevas aproximaciones en investigación y desarrollo se ha
beneficiado de las aportaciones de nuevas y revolucionarias herramientas, entre
las que la Biotecnología brilla con luz propia. Ella nos ha permitido, por primera vez en la historia, ser capaces de producir mediante manipulación genética los compuestos deseados y crear o modificar nuevos fármacos, siguiendo un
diseño determinado para mejorar sus propiedades terapéuticas.
Los productos biotecnológicos han pasado de ser una parte minoritaria en
el arsenal terapéutico, a ser cada vez más indispensables en el tratamiento de
millones de pacientes. Gracias a esta incorporación de la Biotecnología a la
práctica clínica habitual, enfermedades graves pueden ser hoy día tratadas con
éxito, y pacientes con una deteriorada calidad de vida pueden realizar ahora sus
tareas cotidianas.
La Biotecnología alcanza hoy múltiples campos de la investigación médica, en los que hemos asistido gracias a ella a notables avances. Así ha ocurrido
por ejemplo en el campo del diagnóstico, en el descubrimiento de nuevas dianas celulares, en la potenciación de proteínas naturales y en la mejora de tratamientos previos biotecnológicos que permiten aumentar su eficacia y tolerabili-
3
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción
dad. Un buen ejemplo de ello son las nuevas tecnologías que han permitido desarrollar anticuerpos totalmente humanizados, o pequeñas moléculas de síntesis
química que actúan sobre múltiples dianas terapéuticas.
La Biotecnología ha recorrido un largo camino, pero las posibilidades que
puede brindar en el futuro son enormes. La interdependencia absoluta entre todas las partes implicadas hace de la buena combinación de esfuerzos y sinergias entre todas estas partes el factor, probablemente, más importante para seguir avanzando. El reto está en potenciar la innovación y la defensa de la
calidad de los productos biotecnológicos. Sólo a través de la continua y estrecha interacción entre los diferentes sectores de la investigación, tanto públicos
como privados, con profesionales del ámbito clínico, será posible encontrar
nuevos horizontes en este campo. Para que nuestro país logre ser puntero en
este sector, todo ello deberá estar potenciado por un ambiente de apoyo a la innovación dentro del marco macroeconómico.
En el marco de esta colaboración, el Curso de Biotecnología Aplicada en
su 7ª edición que ahora se presenta ofrece de nuevo la oportunidad de que profesionales de diversos sectores: centros de investigación, farmacia hospitalaria,
clínicos y la industria biofarmacéutica se reúnan en una plataforma de formación sobre los aspectos más relevantes ligados con la investigación biotecnológica, especialmente desde el punto de vista más básico y técnico en busca de
nuevas perspectivas y aplicaciones prácticas de la investigación biotecnológica,
y explorar las nuevas líneas de trabajo que han de arrojar, en breve plazo, nuevas opciones terapéuticas de relevancia científica y clínica.
Agradecemos su interés por esta nueva edición del curso y esperamos que
encuentren esta iniciativa útil y provechosa.
José Luis Motellón
Juan Bueren Roncero
4
TÉCNICAS DE ANÁLISIS MASIVO
DE LA EXPRESIÓN DE GENES
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
Miguel A. Piris. Programa de Patología Molecular. CNIO. Madrid
Los conocimientos sobre el genoma humano hacen posible
la utilización de tecnologías en Genómica y Proteómica,
capaces de analizar la diversidad y complejidad de cada
tipo de cáncer, enfocadas hacia el diagnóstico molecular
de tumores, adecuando la terapia a cada paciente y
contribuyendo a la identificación de genes relevantes en
cáncer esporádico y familiar1.
De interés particular es la aplicación de los sistemas de
análisis molecular masivo a la predicción de respuesta a
tratamientos individuales. Numerosos estudios han
demostrado la capacidad de generar estos modelos
predictivos aplicados a supervivencia, metástasis, respuesta
a tratamientos concretos2-5. Todos ellos, en mayor o menor
grado, adolecen del mismo defecto, la insuficiente
reproducibilidad de los resultados generados, cuando son
aplicados en un contexto distinto; es decir, en otros centros,
por otros especialistas, o usando una tecnología diferente4,6.
SISTEMAS DE ANÁLISIS MOLECULAR MASIVO
Matrices tisulares (tissue arrays)
Permiten utilizar en bloques parafinados sistemas de análisis masivo. Para
ello crean un nuevo bloque de parafina en el que se insertan en posiciones predefinidas hasta 800 cilindros de 600 a 1000µ, procedentes de biopsias de aguja
efectuadas sobre bloques de parafina preexistentes.
Es un sistema adaptado para investigar un marcador o un panel de marcadores relacionados en una serie amplia de muestras, útil en IHQ, FISH, HIS,
5
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
complementario a microarrays de cDNA. Indicaciones típicas de esta técnica
son control de calidad, análisis de nuevos anticuerpos, estudio molecular de
cánceres de pequeño tamaño, establecimiento de modelos predictivos basados
en expresión de proteínas.
La posibilidad de digitalizar el resultado de las inmunotinciones, así como
de cuantificar la expresión de una marcador preciso, abre el camino de un uso
más ambicioso de las matrices tisulares (MTA)7,8.
SNPs
Variaciones naturales de la secuencia entre dos copias del genoma debidas a sustituciones de una base. Hay actualmente descritos por encima de tres
millones en todo el genoma -SNP Consortium (TSC) & Human Genome Project (HGP)-, con una densidad mínima de 1 SNP/1.9 kb. De ellos, hay 60.000
SNPs en exones, lo que refleja una mayor densidad de los mismos en regiones exónicas, más investigadas, hasta una densidad de 1 SNIP/1.08 kb. El
numero de polimorfismos existente está en el rango de 10 a 15 millones por
individuo9,10.
El análisis de SNPs permite realizar estudios de genética de poblaciones,
estudio de genes candidatos para asociación con enfermedades precisas, análisis de resistencia a fármacos, sensibilidad/toxicidad a drogas, así como informar de la predisposición individual a contraer enfermedades complejas, multigénicas 9,10 . Así, la mejora en las posibilidades de detección masiva de
polimorfismos abre el camino a estudios que relacionen variabilidad genética
con riesgo a formas precisas de cáncer y sensibilidad individual a drogas.
CGH-Arrays
Hay diferentes opciones para arrays de CGH, esencialmente BACs u
oligonucleótidos. BACs son cromosomas artificiales humanos conteniendo
secuencias de DNA de longitud variable entre 100 a 200 kb. Hay actualmente clones disponibles para todo el genoma, que cubren el genoma con una
alta densidad. Su uso permite el diagnóstico preciso de deleciones, duplica-
6
ciones, inserciones y reordenamientos. La disponibilidad de miles de BACs
ha permitido el desarrollo de chips de BACs (CGH-arrays), que permiten
detectar duplicaciones y deleciones con una sensibilidad de 100 Kb 11. Para
ello se realiza hibridación comparativa entre DNA de un paciente/DNA sujeto sano, o DNA tumoral/DNA constitucional. Un ejemplo de ello es la reciente publicación de un array de BACs especifico para la LLC-B, desarrollado por P Lichter12.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
Existen también microarrays comerciales de CGH basados en oligonucleótidos, con resolución más fina que los basados en BACs y un alto potencial en
investigación y diagnóstico13.
Matrices de cDNA (Oncochip) u oligonucleótidos
Un microarray de DNA es un sistema miniaturizado en el que fragmentos
de DNA se inmovilizan en soportes sólidos. Desde un punto de vista de longitud de la sonda usada, hay 2 tipos de microarrays de DNA: microarrays de cDNA que presenta sondas de cientos de bases y arrays de oligonucleótidos con
sondas de 20-25 bases o 50-80.
Estos chip o microarrays consisten en un soporte sólido, por ejemplo un
portaobjetos, sobre el que un robot ha impreso de manera ordenada miles de
cDNAs específicos (u oligonucleótidos) representantes de otros tantos genes.
Por analogía con el término chip micro-electrónico (dispositivo con una alta
densidad de circuitos electrónicos), en biología molecular también se ha utilizado el término de biochip de expresión para denominar a los arrays de DNA,
ya que son dispositivos de pequeño tamaño (chip) en los que se alcanza una
gran densidad de material biológico (bio) inmovilizado sobre una superficie
sólida. Un chip puede ser hibridado simultáneamente con dos sondas de
cDNA marcadas diferencialmente (por ejemplo con los fluorocromos Cy3 y
Cy5) generadas a partir del RNA mensajero de las muestras a comparar (por
ejemplo, tejido normal versus tejido tumoral), o bien ser marcado con un único fluorocromo.
Después de la hibridación, y utilizando un scanner, puede medirse para cada spot de cDNA la intensidad de cada uno de los fluoróforos, siendo el nivel
de señal detectado proporcional al número de copias de mRNA en la muestra;
de modo que el cociente de la intensidad de fluorescencia (Cy3/Cy5) constituye una medida de la expresión génica diferencial relativa al cDNA representado en el chip ("ratios" de expresión).
El alto grado de integración del array permite, en un solo ensayo, obtener multitud de valores de expresión génica relativa para distintas condicio-
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Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
nes biológicas, lo que convierte a esta técnica en una herramienta de alto
rendimiento para trabajos en el área de la genómica funcional. El gran volumen de datos generados debe ser tratado con herramientas y métodos bioinformáticos14,15.
ANÁLISIS DE RESULTADOS DE MICROARRAYS
Los datos generados en estos experimentos precisan de análisis bioinformático, que esencialmente pretenden:
• Agrupar muestras o genes expresados de forma sincronizada.
• Identificar genes cuya expresión se asocia a eventos específicos.
• Asignar función biológica a los genes resultado del experimento.
• Identificar cambios tiempo-dependientes, ordenados a lo largo del tiempo.
• Simplificar series de genes al mínimo numero de datos posible.
• Asignar riesgos específicos derivados de la expresión de genes concretos.
Diversas herramientas informáticas están disponibles para este objetivo,
entre otras las desarrolladas en el CNIO (GEPAS) y alojadas en la pagina web:
http://gepas.bioinfo.cnio.es/index.html
LIMITACIONES DE LOS MICROARRAYS DE DNA
Como otras técnicas usadas en investigación, los microarrays tienen limitaciones, como:
1. Secuencias no verificadas. Hay un proceso constante de reasignación y
edición de las secuencias inicialmente descritas. No obstante, las últimas versiones de los sistemas más comercializados contienen muy escasos errores de
asignación.
2. Dificultad de trasladar datos cuantitativos a estados funcionales. Niveles altos de expresión de ARN o proteína no necesariamente implican activacion funcional del gen preciso, y de hecho ocasionalmente implican secuestro o
anulación funcional. En este sentido, conclusiones elaboradas a partir de datos
generados por estudios de microarrays deben de ser entendidos como hipótesis
8
necesitadas de verificación experimental.
3. Ruido biológico. Sistemas celulares críticos están caracterizados por
una alta redundancia. En parte, la variabilidad Inter.-experimental es depen-
diente de fenómenos azarosos, u oscilaciones cíclicas, no relacionadas con el
objeto del experimento.
4. Falta de estandarización de técnicas de análisis. La mayoría de las
plataformas usadas para análisis genómico han alcanzado un alto gado de ro-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
bustez, pero aún adolecen de una reproducibilidad subóptima, cuando los resultados obtenidos con diversas plataformas son comparados entre sí. El imprescindible gold standard en validación de datos sigue exigiendo comprobar el
valor de los datos obtenidos en una nueva población de casos.
PCR CUANTITATIVA
Aunque sobre un número menor de genes, existen actualmente plataformas
comerciales que permiten investigar un numero limitado de genes en sistemas
de PCR a tiempo real, dotados de una alta sensibilidad y reproducibilidad. Adicionalmente, datos cada vez mas numerosos muestran que esta técnica es aplicable, en determinadas condiciones, a RNA extraído de material parafinado.
El carácter multigénico de alguno de estos análisis (realizados sobre plataformas o tarjetas de hasta 384 pocillos) ha llevado a su denominación como
chips de baja densidad.
La alta reproducibilidad de estos experimentos facilita la expansión de esta
tecnología y su uso en la aplicación clínica de datos surgidos de análisis realizados con microarrays de alta densidad. Así, existen en la actualidad diversos
ensayos clínicos enfocados a la predicción de respuesta a terapia basada en datos de expresión obtenidos con PCR en tiempo real, por ejemplo en carcinoma
de mama.
DETECCIÓN DE PROTEÍNAS COMO MARCADORES SÉRICOS
Múltiples grupos de investigación coinciden en el objetivo de identificar
marcadores séricos informativos de riesgo de contraer enfermedades específicas, o adecuados para el seguimiento de enfermedad residual mínima16. La idea
no necesita apenas justificación, el análisis de suero es una técnica mínimamente invasiva, que permite monitorizar con frecuencia cambios previos al
diagnóstico clínico o a lo largo de la enfermedad. Resultados iniciales obtenidos en cáncer de ovario, páncreas o próstata alentaron esta línea de trabajo,
9
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
usando SELDI-TOF-MS. Sin embargo, estos estudios han demostrado una baja
reproducibilidad y una elevada tasa de falsos positivos, lo que prejuzga su uso
como técnica de análisis rutinario en análisis de poblaciones a riesgo de contraer enfermedades específicas17,18.
DETECCIÓN DE FOSFOPROTEÍNAS EN CÉLULAS INDIVIDUALES
Recientes datos experimentales coinciden en que tanto el mecanismo de
acción de drogas, como la sensibilidad a las mismas, es desvelado con mayor
precisión recurriendo a análisis de proteínas inducidas por la acción de estas
drogas, bien en modelos o pacientes. Así, agentes que dañan el DNA inducen
fosforilación de sensores de daño a DNA, mientras que agentes cuya diana está
constituida por rutas de traducción de señal inducen cambios en el estado de
fosforilación de proteínas críticas en estas rutas. La disponibilidad de anticuerpos contra diferentes estados funcionales de estas proteínas permite usar la citometría de flujo como técnica de análisis de estos cambios, con la ventaja de
que esto nos permite reconocer la existencia de cambios sutiles en subpoblaciones celulares minoritarias19-21.
APLICACIONES EN FARMACOGENÓMICA
Las matrices de cDNA permiten también establecer el llamado perfil genómico de un fármaco, o firma molecular del mismo, además de establecer firmas moleculares predictivas de sensibilidad/resistencia. Aunque desde un punto
de vista clínico tiene mayor interés identificar marcadores iniciales, al diagnóstico, de sensibilidad a drogas precisas, alcanzar este objetivo tropieza con los
mecanismos de acción múltiples de la mayoría de las drogas en uso, así como
con la existencia de múltiples sistemas redundantes de promoción de la supervivencia de las células neoplásicas. En la práctica, se ha demostrado que los
cambios inducidos por drogas son más informativos que alteraciones moleculares al diagnóstico3. Estos cambios pueden ser analizados in vitro -células tumorales expuestas a la acción de drogas precisas- o in vivo - cambios en el tiempo
10
en células leucémicas tras tratamiento-.
De hecho, el tratamiento con un fármaco concreto de una línea celular específica permite identificar el conjunto de genes inducidos en respuesta a ese
fármaco. Estos genes muestran variabilidad en función de la droga, estirpe celular, alteraciones génicas precisas e intervalo de tiempo transcurrido hasta el
análisis. Su conocimiento permite proponer mecanismos de acción de una droga precisa.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
Uno de los objetivos en análisis farmacogenómico es la identificación de
pacientes sensibles o resistentes a drogas concretas. La resistencia a una droga
depende de múltiples factores, incluyendo sobreexpresión de genes de resistencia a drogas, incremento en la reparación de DNA, o alteraciones en la sensibilidad celular a quimioterapia, afectando a múltiples rutas. Marcadores de resistencia o sensibilidad identificados en modelos experimentales en el laboratorio
o en pacientes aislados pueden perder interés cuando se estudian sobre series
largas de pacientes. Consecuentemente, es preciso analizar la relevancia clínica
de los genes así identificados en series de pacientes tratados de forma randomizada.
Una aplicación extremadamente relevante de estos estudios es la identificación de dianas terapéuticas y el análisis de rutas. Esencialmente, la información derivada de estos estudios brinda la oportunidad de proponer nuevas dianas que, después de validación experimental, permitan el desarrollo de drogas
racionalmente dirigidas.
FUTURO EN LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE GENÓMICA
Y PROTEÓMICA
El alto potencial aplicado a investigación y diagnóstico de estas técnicas aún precisa de numerosos estudios adicionales, previamente a su aplicación clínica masiva. Este carácter novedoso y el alto nivel de complejidad
de estos experimentos queda subrayado por el hecho de que aún se publican
muchas más revisiones o comentarios editoriales sobre técnicas de genómica
y proteómica que resultados originales. No obstante, cabe esperar que la
aplicación clínica de estas técnicas siga en incremento, cubriendo primero
una etapa de identificación de marcadores diagnósticos y, posteriormente,
propuesta y validación de dianas terapéuticas. El desarrollo de estas técnicas
de análisis molecular masivo, al mismo tiempo, está ofreciendo un reto para
el desarrollo de sistemas de análisis estadístico de múltiples variables y validación de datos.
11
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
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12
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
13
PROTEÓMICA Y MEDICINA
Fernando Vivanco. Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Proteómica y Medicina
La medicina molecular se está desplazando muy rápidamente
de la genómica a la proteómica ya que, al permitir el estudio
de tejidos, células y líquidos biológicos, las alteraciones en las
proteínas constituyen auténticas firmas moleculares de los
procesos patológicos. Aunque todavía está en desarrollo en
muchas áreas, la proteómica ya está madura para empezar a
ser trasladada a la clínica. La proteómica clínica favorece la
detección precoz de la enfermedad, su monitorización, el uso
de terapias más efectivas y un entendimiento más profundo y
global de la patogénesis. La utilización de perfiles proteicos
diagnósticos y pronósticos, de suero y de tejidos, constituye
una auténtica revolución que puede cambiar el panorama de la
analítica clínica, acercándose a la medicina personalizada.
Además, es un atajo para la detección de biomarcadores (hay
mas de 500 nuevas proteínas con interés clínico identificadas
por proteómica, frente a las 150 proteínas actualmente
utilizadas como marcadores clínicos) y dianas diagnósticas y
terapéuticas, en un mercado claramente en expansión. Los
perfiles proteicos de muestras tratadas con fármacos
permiten, además, identificar posibles efectos secundarios
desconocidos, ya que permite detectar todas las proteínas
que el fármaco altera. La proteómica clínica es ya una realidad
de la Medicina del siglo XXI. En España es un área sin
desarrollar, que debería ir implantándose en todos los grandes
hospitales y centros de investigación biomédica.
INTRODUCCIÓN
Una de las consecuencias más beneficiosas derivadas del conocimiento del
Genoma Humano ha sido el gran impulso que se ha producido en el desarrollo
15
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Proteómica y Medicina
16
de la Proteómica. La descripción del genoma de los organismos (Genómica)
aporta un conocimiento esencial para el estudio de cualquier proceso biológico.
Sin embargo, tal conocimiento es tan necesario como insuficiente, porque las
funciones celulares dependen en última instancia de los productos finales de los
genes: las proteínas y sus interacciones, asociaciones macromoleculares, vías de
señalización, etc. De esta forma, la era post-genómica de la medicina molecular
se está desplazando rápidamente de los listados de genes, la transcriptómica y la
genómica funcional, a la proteómica. Ésta ha dejado de ser (como en sus inicios) la producción de listas de proteínas que incrementan o decrecen su expresión como causa o consecuencia de diversas condiciones o alguna patología.
Actualmente, la proteómica implica el conocimiento global de las proteínas, su
estructura y funciones, interacciones y modificaciones postraduccionales, rutas
de señalización, localización intra e intercelular, etc., para generar el mapa celular que permita entender los procesos biológicos en condiciones normales y patológicas (lo que ha venido a denominarse la biología de sistemas). En suma, la
proteómica es una actividad científica lo suficientemente madura, como para ser aplicada a la clínica humana con notables beneficios.
Figura 1. Esquema de las
El proteoma comprende el conjunto de todas las proteínas que
relaciones entre genoma y
resultan de la expresión del genoma de las células, tejidos u organisproteoma. Mientras que el
genoma es comun a todas
mos. No es algo estático como el genoma (relativamente) sino una
las células y
colección dinámica de proteínas que refleja tanto el programa genérelativamente estático, el
tico propio de la célula como el efecto de su entorno (Figura 1).
proteoma está cambiando
Comparado con el genoma, el proteoma proporciona una visión más
constantemente en
realista del status biológico y se espera, por tanto, que tenga una
respuesta a las
mayor utilidad que el análisis genómico, para evaluar y conocer la
condiciones de cada
enfermedad, su progresión y la respuesta al tratamiento farmacológimomento.
co. Así, la proteómica es el puente entre la
mera descripción de la secuencia de los genes y el comportamiento celular.
Cada gen puede producir varias formas
moleculares de una(s) proteína(s) que posteriormente son modificadas post-traduccionalmente. Se han descrito más de 200 tipos
de tales modificaciones químicas (glicosilación, prenilación, fosforilación, acetilación,
etc.), pudiéndose dar varias en una misma
proteína de manera permanente o transitoria. Tales modificaciones afectan a su
estructura y propiedades funcionales, vida media, localización intra y extracelular, interacciones proteína-proteína, etc. El proteoma viene definido, por tanto, en términos de secuencia, estructura, abundancia, localización, modifica-
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Proteómica y Medicina
ción, interacción y función de las proteínas y constituye el fenotipo
característico de cada célula o tejido. Esta información no puede obtenerse del
genoma ni del transcriptoma (conjunto de ARN mensajeros transcritos), por lo
que el estudio de los proteomas es imprescindible y complementario de los datos genómicos. Entre las muestras biológicas más importantes cuyo conocimiento del proteoma es esencial se encuentran los líquidos fisiológicos (suero),
ya que no tienen ácidos nucleicos. Por otra parte, las proteínas son la diana de
más del 90% de los fármacos, por lo que su estudio cobra mayor relevancia.
La proteómica se define habitualmente como el análisis del conjunto de
las proteínas que componen las células y se lleva a cabo mediante tres tipos
fundamentales de estudios:
A) Identificación y catalogación de las proteínas (y sus modificaciones
post-traduccionales) que constituyen los distintos proteomas, cuya información, almacenada en bases de datos, es un elemento esencial para
el resto de estudios proteómicos.
B) Proteómica de expresión diferencial, cuya finalidad es el estudio comparativo de una célula (o muestra biológica) en dos condiciones distintas (un control sano frente al patológico, o tratado y sin tratar con un
fármaco, etc.) para detectar las proteínas que sufren modificaciones
químicas o alteraciones en sus niveles de expresión. Permite identificar
proteínas que puedan representar biomarcadores pronósticos, diagnósticos y de seguimiento de una enfermedad y que, con frecuencia, pueden
ser nuevas dianas terapéuticas.
C) Proteómica del mapa celular, cuyo objetivo es el estudio de las interacciones proteína-proteína, asociaciones macromoleculares, rutas de señalización, etc. Pretende construir un mapa físico de las interacciones
existentes entre las proteínas celulares, haciendo uso de técnicas estructurales (rayos X, resonancia magnética nuclear) y cinéticas y de
herramientas bioinformáticas.
Una de las áreas con mayor actividad actualmente en proteómica es la
identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico y la prevención de
las enfermedades prevalentes, cáncer, cardiovasculares, neurológicas, etc. Los
17
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Proteómica y Medicina
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avances en las estrategias diagnosticas convencionales (técnicas de imagen,
RMN, PET), están suponiendo una notable mejora, pero no poseen ni la sensibilidad ni la especificidad requerida para detectar estados preclínicos, y además
su coste es muy elevado. Es bien conocido que mas del 50% de los infartos
agudos de miocardio ocurren sin síntomas previos y que más del 60% de los
pacientes con cáncer de mama, pulmón, colon y ovario, presentan ya metástasis cuando son diagnosticados, y en ese estadio, las terapéuticas convencionales
tienen un éxito muy limitado. Hay, por tanto, una necesidad urgente de identificar nuevos biomarcadores que eviten estas situaciones. Un marcador biológico
(biomarcador) es una molécula o característica, que puede ser medido objetivamente y evaluado como un indicador de un proceso biológico normal o patológico, o de la respuesta farmacológica a una
Figura 2. Esquema del
intervención terapéutica. La búsqueda de biomarcadores puede llefuncionamiento de la
microdisección mediada
varse a cabo en tejidos, en células (circulantes) o en líquidos fisiolópor láser. Parte izquierda:
gicos (fundamentalmente plasma o suero). En el caso de los tejidos
observación al microscopio
(biopsias por ejemplo) uno de los mayores obstáculos es la heterogedel corte de tejido y
neidad celular, que puede complicar mucho el diseño y sobre todo
selección de la zona de
los resultados de los análisis proteómicos, al no tratarse de poblaciointerés. Centro: disparo del
nes celulares homogéneas. Sin embargo, recientemente se ha desaláser sobre la zona
seleccionada que catapulta
rrollado una técnica muy útil para la obtención y purificación de esa las células al tubo de
tirpes celulares puras a partir de cortes de tejidos, denominada
recogida. Parte derecha:
microdisección, mediante captura con láser que se ilustra en la Figuampliación de la figura del
ra 2. Las preparaciones celulares homogéneas así obtenidas son muy
centro donde se observa el
apropiadas para el análisis proteómico. Sin embargo, el tipo de
grupo de células que son
muestra idóneo para los estudios clínicos es el plasma o el suero, del
selectivamente extraídas
que puede obtenerse un perfil o patrón del conjunto de las proteínas
del tejido.
(y/o péptidos) presentes en cada momento y
que puede contener biomarcadores que reflejen el estado patológico y que posean valor
diagnóstico y/o pronóstico. Sin embargo, el
estudio de los proteomas o de los perfiles
proteicos de los líquidos biológicos (ver más
adelante), presenta un grado de complejidad
considerable que no existe en los estudios
genómicos, debido fundamentalmente a las
siguientes causas:
a) El amplísimo rango dinámico de la concentración de proteínas en tejidos y especialmente en el plasma humano. Entre la concentración de
albúmina (milimolar; 50 mg/ml) y algunas interleuquinas (picomolar;
1-5 pg/ml) hay una diferencia de más de 10 logs. Ninguna técnica analítica ni proteómica abarca mas de 4-5 órdenes de magnitud. Además,
20 proteínas representan el 99% del contenido total de las proteínas
plasmáticas, lo que dificulta enormemente el análisis de las proteínas
presentes a baja concentración, donde con frecuencia se encuentran los potenciales biomarcadores. Para el análisis de
Figura 3. Depleción de las
plasma es necesario deplecionar de estas proteínas mayoritaseis proteínas mayoritarias
rias (Figura 3).
del plasma utilizando un
b) La presencia de diferentes formas moleculares de cada procromatógrafo líquido
teína e isoformas. Muchos genes producen múltiples mR(FPLC) y una columna de
afinidad que posee
NAs, mediante diversos mecanismos (splicing alternativo,
anticuerpos específicos
mRNA editing, modificaciones co- y post traduccionales).
frente a las 6 proteínas. Al
En promedio, en humanos, se estima que un gen genera al
aplicar el plasma sobre la
menos 3-4 proteínas, por lo que considerando 30.000 genes,
columna la mayoría de las
pueden esperarse un mínimo de 100-200.000 proteínas. Obproteínas fluyen sin ser
viamente no todas las proteínas estarán presentes en todas
retenidas ("low abundant
proteins") y
las células, tejidos, etc., pero el plasma contiene una gran reposteriormente
las
presentación de muchas de ellas.
proteínas mayoritarias son
c) Diversidad estructural. Dada su presencia en distintos entoreluidas ("high abundant
nos (solubles, membranas, matriz, etc.) las proteínas son de
proteins"). En la parte
naturaleza muy diversa. Solo en tamaño pueden variar desde
inferior se muestra el
50 aminoácidos (hay 2.500 anotados en el Swiss-Prot) hasta
análisis mediante 2-DE de
casi 10.000 aminoácidos, como la Nesprina 1 (8746 aa).
ambas fracciones.
Además, hay que considerar la presencia de múltiples modificaciones
postraduccionales que afectan a la
función, localización, etc., de las
proteínas.
d) Una gran mayoría de las proteínas
no actúan solas sino en asociación
con otras, creando por un lado, asociaciones macromoleculares, y por
otro, participando en multitud de ru-
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Proteómica y Medicina
tas de señalización, metabólicas, etc. El conocimiento de las interacciones proteicas y la descripción del mapa celular es esencial para entender la fisiopatología de cualquier sistema biológico.
Sin embargo, el conocimiento de los proteomas ofrece la visión óptima de
lo que ocurre en la célula, tejido, líquido fisiológico, etc., por lo que es necesario su determinación.
PROTEÓMICA CLÍNICA
A pesar de la complejidad antes citada, el rápido y notable desarrollo de
la Proteómica en los últimos años, ha conducido a su aplicación a los procesos patológicos o Proteómica Clínica. La proteómica está especialmente "capacitada" para el estudio de la enfermedad porque se puede aplicar a las células, tejidos y líquidos biológicos. La aplicación clínica de la proteómica
implica el uso de las tecnologías proteómicas para todos aquellos aspectos que
puedan beneficiar a los pacientes: desde la búsqueda de nuevos marcadores de
enfermedad o de perfiles proteicos diagnósticos, hasta la descripción de factores predictivos y preventivos que permitan un tratamiento y seguimiento terapéutico personalizado.
La Proteómica Clínica se ocupa de la identificación sistemática y exhaustiva, a gran escala, de patrones proteicos de enfermedad y la aplicación de esos
datos a los pacientes (estudio de la enfermedad, susceptibilidad, prevención,
selección de terapias, seguimiento de los tratamientos, etc.). Dada la complejidad de los procesos patológicos, la integración de las nuevas tecnologías proteómicas con las bases de datos clínicas y las técnicas analíticas clásicas, sería
altamente beneficioso para la comprensión y el tratamiento de la enfermedad.
Entender, por ejemplo, las alteraciones tempranas en diversas enfermedades (típicamente en cáncer o en los síndromes coronarios agudos), produce una notable mejora en la prevención e identificación de pacientes con riesgo y/o en estado preclínico. La Proteómica Clínica pretende definir patrones de proteínas
que puedan generar información de valor clínico acerca de la susceptibilidad,
diagnóstico, pronóstico y terapia de la enfermedad. Testar hipótesis clínicas re-
20
levantes, frente a conjuntos de datos (masivos) derivados de medidas procedentes de técnicas de alto rendimiento como las proteómicas, y poblaciones humanas fenotipadas correctamente, es una función esencial de la proteómica
clínica. Para que la proteómica clínica impacte de manera real en la mejora de
la salud debe descubrir y seleccionar patrones proteicos, validarlos en estudios
poblacionales muy amplios y trasladarlos a la práctica clínica.
Aunque no se describe aquí, no debe olvidarse que el aprovechamiento
óptimo de la relación entre patrones proteicos y enfermedad, depende a su vez
de la integración con la información sobre la variación genética y la expresión
génica (arrays de DNA, genotipado, SNPs, etc.).
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OBJETIVOS DE LA PROTEÓMICA CLÍNICA
La finalidad de la Proteómica Clínica está, actualmente, centrada en al
menos los siguientes tipos de actividades:
Identificación de biomarcadores
La búsqueda e identificación de biomarcadores individuales se lleva a
cabo siguiendo la metodología proteómica clásica de separación de proteínas
(2-DE, DIGE, cromatografía multidimensional y electroforesis caFigura 4. Esquema del
pilar) y su identificación por espectrometría de masas (MS; MALanálisis proteómico
DI-TOF, ESI-Q-TOF o ESI-Trap, MALDI-TOF/TOF). Su estratediferencial. La
gia fundamental es el análisis de la expresión diferencial de
comparación de los geles
proteínas entre controles y muestras patológicas (Figura 4), de
2-D permite identificar las
proteomas completos (lisados celulares) o subproteomas específiproteínas
cos (mitocondrias, membranas, etc.). Recientemente se está utilidiferencialmente
expresadas.
zando la cromatografía líquida (en una o varias dimensiones) aplicando diversos métodos de proteómica
cuantitativa que permiten la comparación
de los perfiles proteicos de varias muestras
simultáneamente (iTRAQ, SILAC, etc.).
Un aspecto fundamental es la determinación de las modificaciones postraduccionales y su potencial implicación en patología.
En muchos casos los biomarcadores se
convierten simultáneamente en nuevas dianas terapéuticas.
21
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Obtención de perfiles proteicos
Consiste en el estudio sistemático, a gran escala, de las proteínas de una
muestra para la identificación de patrones o perfiles proteicos (huellas dactilares
proteicas), con carácter diagnóstico (discriminatorio) y/o pronóstico. Los escasos
biomarcadores identificados, y aprobados (por la FDA) en los últimos años, son
un reflejo de la estrategia habitual de testar una proteína individual, o llevar a cabo análisis en pequeña escala, etc. Aunque existen excepciones (paraproteínas de
los mielomas, déficit de α1-antitripsina) es muy posible que no existan marcadores únicos de las enfermedades complejas, por lo que la estrategia proteómica de
estudiar paneles proteicos supone un paso cualitativo de gran trascendencia. Este
estudio se puede llevar a cabo mediante al menos tres estrategias:
Figura 5. Diferentes formas
A) Perfiles proteicos de plasma o suero
de representar el
resultado del análisis
mediante SELDI-TOF de una
muestra de suero. En el
panel superior se muestra
el resultado experimental
y en los dos inferiores tras
su procesamiento
informático. Sólo se
muestra la sección
correspondiente a las
masas (m/z) comprendidas
entre 3000 y 7000 m/z.
22
Se lleva a cabo analizando el suero/plasma de los pacientes con
la patología objeto de estudio (cardiovascular, neurodegenerativa, infecciosas, cáncer, etc.) y alternativamente en otros líquidos fisiológicos (lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquído, orina). Se utiliza
la técnica denominada SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time of Flight) para la generación de los perfiles
proteicos, que combina la retención de las proteínas del suero en
biochips con la determinación de sus masas moleculares mediante
MS, permitiendo generar gráficos donde se representa la abundancia
frente a la masa molecular de las proteínas, a modo de código de barras proteicos constituidos por miles de líneas que caracterizan el suero de cada individuo (Figura 5). La comparación de los
perfiles normales (individuos sanos) con los
obtenidos del suero de pacientes con distintas patologías (se está utilizando en cáncer y
en patologías cardiovasculares, neurodegenerativas, osteoarticulares, respiratorias, infecciosas...) permite obtener perfiles pronósticos, diagnósticos, de seguimiento, de
tratamiento farmacológico, etc. Su poder
discriminatorio es muy superior al de marcadores únicos con los que se han
comparado (por ejemplo, PSA en cáncer de próstata, proteína C reactiva en infección e inflamación). Como el análisis mediante SELDI-TOF utiliza muy poca muestra (1 µl) y, además, es muy rápido (se pueden analizar cientos de
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muestras al día) y automatizado, su potencial en clínica analítica es enorme y
puede ir sustituyendo muchas de las técnicas habituales de los laboratorios de
bioquímica clínica (enzimo-inmunoanálisis), que son más lentos, más caros
(utilizan anticuerpos fluorescentes), usan mayor cantidad de muestra y sólo informan de un único marcador, frente a los miles que proporciona el SELDITOF. A pesar de sus indudables ventajas, el sistema SELDI-TOF decrece su
sensibilidad y exactitud en la determinación de la masa para proteínas mayores
de 70 kDa, lo que es el caso de muchas de las proteínas plasmáticas humanas
(se conocen más de 3.000 actualmente). Por otra parte, su reproducibilidad no
es bien conocida, dado el todavía reducido número de investigadores que utilizan esta plataforma; además, en muestras tan complejas como el plasma humano, el sistema de fraccionamiento inicial en los chips de retención necesita estandarizarse mejor, por lo que se están definiendo actualmente unos estándares
cuantitativos de referencia. Sin embargo, el número de potenciales biomarcadores de enfermedad, identificados mediante SELDI-TOF, no deja de aumentar de
manera constante. Algunas de las críticas al sistema SELDI-TOF tienen un origen más económico que científico, dado el enorme mercado por el que compite, el de la bioquímica clínica.
B) Perfiles proteicos de tejidos: MS-Imaging
En tejidos, pueden obtenerse perfiles o imágenes (mapas) bidimensionales
de proteínas (MS-Imaging), aplicando directamente la MS sobre cortes histológicos del tejido (cortes habituales sobre portaobjetos para microscopia óptica,
de 5-20 m de grosor), utilizando el MALDI-TOF o el MALDI-TOF/TOF. El
mapa bidimensional se obtiene haciendo incidir el láser (que "barre" la superficie de la muestra) del espectrómetro sobre los cortes histológicos recubiertos
de matriz (compuestos orgánicos que cristalizan atrapando las proteínas en el
cristal y absorben la energía del láser, siendo el conjunto sublimado) y analizando las proteínas que son vaporizadas. Típicamente se obtienen 500-1.000
señales de proteínas individuales en cada punto del tejido, con masas entre 270 kDa. De esta forma se obtiene la masa (m/z) de las moléculas (péptidos,
23
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Proteómica y Medicina
24
proteínas) presentes en cada zona del tejido.
Seleccionando una masa dada (m/z) en los
distintos espectros de las diferentes zonas, se
genera un mapa bidimensional de la distribución de esa proteína (esa m/z) a lo largo
del corte de tejido (a modo de cartografía
proteica). Se pueden obtener dos tipos de
datos: Perfiles proteicos (mediante una aplicación puntual de matriz y adquisición de
datos de cada punto) e Imágenes (recubriendo todo el tejido y haciendo un barrido del
Figura 6. Representación
mismo con el láser) (Figura 6).
esquemática de los
Las imágenes son generadas mediante un software específico
fundamentos del MSque clasifica y agrupa las proteínas y compara diversas muestras,
Imaging. Sobre el corte de
tejido recubierto de
permitiendo obtener imágenes tridimensionales de la distribución de
matriz, se hace incidir un
las proteínas del tejido. Este software también puede integrarse con
láser que va recorriendo la
software de análisis histológico, permitiendo la cuantificación de susuperficie del tejido y logra
perficies e intensidades, así como la superposición con imágenes de
vaporizar las proteínas
microscopia (histoquímica e inmunohistoquímica). Esta tecnología
presentes en cada punto de
implica un tipo de información totalmente nuevo para la descripción,
la superficie, obteniéndose
clasificación y caracterización de muestras histológicas, que está
un espectro de masas de
cada punto. Seleccionando
permitiendo la identificación de biomarcadores, la localización de
una masa (m/z) dada (que
proteínas específicas y en el campo de la oncología, por ejemplo, la
corresponderá a una
reclasificación de tumores. La técnica es compatible con los métoproteína particular) a lo
dos de tinción clásicos, lo que permite la integración de ambos tipos
largo del tejido (en sus
de datos. El MS-Imaging puede aplicarse a preparaciones homogécorrespondientes
neas de células, obtenidas del propio corte histológico mediante miespectros), puede
reconstruirse una imagen o
crodisección por captura con láser, incrementando así su resolución.
mapa bidimensional de la
Esta tecnología puede complementar, o sustituir, muchas de las técpresencia de dicha
nicas manuales actuales (microscopia óptica, fluorescencia) en los
proteína.
departamentos de anatomía patológica de los hospitales.
Una técnica muy similar (SIMS-TOF; secondary ion mass spectrometry)
permite el análisis (identificación y caracterización) de moléculas de bajo peso
molecular presentes en la superficie de una muestra (determinación del metaboloma). Hasta hace pocos años no se utilizaba con muestras biológicas debido a la alta fragmentación que producía sobre los componentes biológicos. Sin
embargo, el desarrollo de nuevas fuentes de
iones como los clústeres de metal líquido
(oro o bismuto) han ampliado el rango de
masa que puede ser analizado hasta los
1.000 Da. Esta limitación en el reducido
rango de masas analizado es compensada en
parte por la alta resolución obtenida (subcelular; hasta 200 nm/pixel) y por no necesitar
la utilización de ningún tipo de matriz (evitando interferencia y deslocalización de las
muestras, se usa el tejido directamente) lo
Figura 7. Esquema del
que la convierte en una herramienta muy vafundamento del SIMS-TOF.
liosa en patología. Además, como esta técnica se aplica para locali- Es similar a lo descrito
zar y mapear en el tejido moléculas pequeñas, particularmente fár- para el MS-Imaging
macos (y su colocalización con proteínas), es de gran interés para la (Figura 6), salvo que la
fuente de láser se
industria farmacéutica.
Los fundamentos del SIMS-TOF Imaging son muy semejantes a sustituye por una fuente
de iones (bismuto) y que
los descritos anteriormente para MALDI Imaging, siendo la princilas moléculas liberadas del
pal diferencia las fuentes de ionización. Los iones primarios se gene- tejido corresponde a
ran utilizando un dispositivo denominado "liquid metal ion gun", compuestos de bajo peso
siendo seleccionados los clústeres de iones incidentes en base a su molecular (<2000 Da). No
masa y carga, focalizándolos en la muestra. El impacto de los iones es necesario aplicar la
primarios en cada punto de la muestra (corte de tejido) genera iones matriz sobre el tejido.
de la misma (secundarios), que son extraidos mediante un campo
eléctrico entre la muestra y las lentes de extracción. Cuando los iones secundarios alcanzan el detector son convertidos en señales digitales y representados
en forma de un espectro de masas para cada posición de la superficie de la
muestra (x,y). Para cada ion detectado se puede representar su intensidad a lo
largo del tejido en forma de imagen tridiemensional, mostrando su abundancia
relativa, utilizando el mismo software que en el MALDI Imaging (Figura 7).
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C) Micromatrices (chips o arrays) de proteínas
La obtención de perfiles proteicos, tanto de suero (u otros líquidos fisiológicos) como de células o tejidos, puede también obtenerse a partir de la utilización de chips (o micromatrices) de proteínas. Este es el sector de mayor creci-
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Figura 8. Esquema del
análisis comparativo de
dos muestras (marcadas
con dos fluoróforos
diferentes, Cy3 y Cy5)
mediante chips o
microarrays
(micromatrices) de
anticuerpos.
26
miento en el mercado proteómico, especialmente en el área de la proteómica funcional
(análisis de las propiedades bioquímicas y
celulares de las proteínas). No deben confundirse los chips de proteínas (micromatrices de proteínas capturadas o depositadas en
una superficie) con la miniaturización (y automatización) de las distintas técnicas bioanalíticas proteómicas (2-DE, electroforesis
capilar, cromatografías) que se están desarrollando en formato tipo chip ("the lab-ona-chip") basados en la tecnología de microfluídica. Los chips de proteínas pueden clasificarse según muchos
parámetros (modo de fabricación, química de la superficie, especificidad, densidad, etc.). Sin embargo, es mejor sistematizarlos en dos
grandes grupos, en base a lo que capturan o analizan:
Chips analíticos: se utilizan para determinar las proteínas presentes en una muestra (perfil de expresión) y su cuantificación. La disolución de la mezcla de proteínas a analizar se aplica sobre el chip, que
contiene agentes de captura que actúan como sondas. Los agentes de captura más
conocidos son los anticuerpos (Ab) en sus distintas modalidades: monoclonales
completos, Fab, scFv, afibodies (Ab sintéticos), dominios de Ab, etc. (Figura 8).
El uso de Ab no está exento de problemas: inespecificidad, reacciones cruzadas,
orientación, afinidad, etc. Otra alternativa son los chips de antígeno para analizar
el perfil sérico de Ab (y autoAbs en enfermedades autoinmunes), como los chips
de alergénos para la detección de IgEs en respuestas alérgicas.
Recientemente se están generando una plétora de agentes de captura distintos
a los Abs, como péptidos, moléculas orgánicas, polímeros sintéticos, oligonucleótidos, aptámeros, ribozimas, trinectinas (derivados de la fibronectina), MIPs (molecular imprinted polymers: compuestos que se polimerizan sobre las proteínas creando moldes para su uso posterior), etc. A pesar de esta diversidad, la captura de
las proteínas (y los métodos de detección) constituye el gran problema de los chips
proteicos: no existen todavía agentes de captura de alta calidad que puedan inmovilizarse en la superficie de un chip y que permitan unir, detectar y cuantificar una
mezcla compleja de proteínas. Este problema está retrasando no sólo el desarrollo
de los chips proteicos, sino de la industria proteómica en general. La investigación
proteómica está generando multitud de biomarcadores potenciales y nuevas dianas
terapéuticas, pero tiene el cuello de botella del cribado y la validación de fármacos
y los chips de proteínas parece el método adecuado para solucionarlo.
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Los chips de fase reversa son de especial relevancia en Medicina porque
permiten determinar las proteínas implicadas en las rutas de señalización celular en las biopsias de los pacientes. En ellos, las biopsias (típicamente de tumores o cardíacas) se lisan y se depositan en diluciones sucesivas como microgotas (utilizando los mismos robots que para la fabricación de los chips de ADN);
posteriormente, son revelados con Abs validados (que reconocen proteínas fosforiladas y kinasas, a fin de determinar el grado de activación de las diferentes
rutas de señalización), obteniéndose información cualitativa y cuantitativa para
cada paciente, lo que permite un tratamiento personalizado. Existen actualmente cerca de 1.000 Abs validados. Mediante estos arrays puede determinarse simultáneamente el estado de fosforilación de las proteínas implicadas en las
principales rutas de señalización intracelular. En este tipo de chip se depositan
pequeños volúmenes (nl) de lisados de tejidos (biopsias de tumores, segmentos
de carótidas procedentes de las endarterectomías) o de células obtenidas mediante LCM de los mismos tejidos, sobre una superficie plana (portaobjetos)
usando un microarrayer. Cada microgota contiene el conjunto de todas las proteínas, fosforiladas y no fosforiladas, contenidas en una muestra. Las proteínas
de interés (fosforiladas) se detectan con anticuerpos específicos y se comparan
con las no-fosforiladas. Con arrays de alta densidad pueden detectarse miles de
muestras en un porta. La utilización de los arrays de fase reversa permite así
obtener un tipo de información molecular único e individualizado de cada
muestra, y por tanto de cada paciente. Este nuevo tipo de array proporciona
perfiles de señalización intracelular, incluyendo las modificaciones postraduccionales, datos que no son accesibles mediante técnicas genómicas.
Chips funcionales: estos chips se utilizan para determinar actividades bioquímicas e interacciones moleculares. Las proteínas de interés se inmovilizan
en el chip y se analizan sus funciones biológicas e interacciones incubándolas
con distintas moléculas (otras proteínas, metabolitos, sustratos de enzimas,
DNA, etc.). Los dos problemas principales de estos chips son la producción de
colecciones extensas de proteínas y su mantenimiento en forma activa en el
chip. Sin embargo, para grupos de proteínas con características funcionales si-
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milares (factores de transcripción, receptores, kinasas) hay un gran campo por
desarrollar en clínica humana.
Análisis y procesamiento de datos: Bioinformática
La enorme cantidad de datos que se están generando mediante la enumeración de los componentes celulares (genes y proteínas), sus funciones e interacciones, a partir de la genómica y la proteómica, está transformando la Biología
y la Medicina. Esta información está siendo recopilada en diversas bases de datos como las relativas a los geles 2-D de proteínas, proteomas de las distintas
estirpes celulares y sus subproteomas, etc. Se están desarrollando multitud de
herramientas informáticas dedicadas al análisis de imagen de los geles 2-D, a
la interpretación de los espectros de masas, a la secuenciación de las proteínas
de forma automática fiable, a los métodos de cuantificación, etc. Uno de los
objetivos fundamentales de la proteómica clínica es la utilización de herramientas bioinformáticas (y bioestadísticas) para el almacenamiento y procesamiento analítico de los datos masivos generados por proteómica. Su finalidad
esencial es el desarrollo y aplicación de métodos de jerarquización y clustering,
visualización de datos, algoritmos estadísticos multivariable, para definir los
perfiles específicos de las distintas patologías. Una necesidad inmediata es la
creación de bases de datos de proteínas implicadas en las distintas patologías,
sus interacciones, participación en rutas de señalización, etc., así como su relación con los datos genómicos. La aplicación de estos métodos a gran escala no
está desarrollada y deben implementarse para poder definir claramente cuál es
el patrón "normal"(no existe actualmente) y poder discriminar, posteriormente,
los patológicos y su gradación. Esto es esencial para poder definir y establecer
test multiparámetricos. Además, hay que desarrollar métodos que integren de
forma efectiva la información procedente de diversos niveles biológicos (perfiles proteicos, niveles o concentraciones, imágenes histológicas, datos clínicos,
etc.). Es evidente que el análisis masivo de datos, y la integración de los distintos niveles de información, sólo puede llevarse a cabo mediante una plataforma
bioinformática proteómica, que constituye uno de los elementos claves de cualquier unidad de Proteómica Clínica.
28
Sin embargo, lo más destacado es la aparición de nuevas herramientas informáticas y bases de datos, con una orientación totalmente diferente, fisiológica y funcional, que intentan integrar el catalogo de proteínas y genes, para re-
flejar el comportamiento celular, analizando las rutas de señalización, las interacciones proteína-proteína, los biomarcadores, los perfiles proteicos, etc. Además, esos datos deben ser integrados con los de la Medicina clásica (historia
clínica, analítica, imágenes de rayos X y resonancia magnética nuclear, histolo-
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gía, tratamiento) para obtener un verdadero valor fisiopatológico. De esta forma, se están generando auténticas plataformas bioinformáticas dedicadas a integrar todos los datos relativos a patologías concretas. En España, ésta es un
área incipiente.
Creación de bancos de muestras clínicas (suero, tejidos)
Tanto los ensayos clínicos como los estudios de validación de biomarcadores o de perfiles proteicos necesitan colecciones amplias de muestras biológicas
y sus protocolos de obtención y recogida de muestras, conservación, uso, etc.
Tales estudios son particularmente necesarios para demostrar la especificidad
diagnóstica del perfil proteico, esto es, su ausencia en los controles (incluyendo
otras enfermedades) y su presencia en la enfermedad estudiada. Se contemplan
dos tipos de grupos de muestras:
a) Grupos reducidos de muestras clínicas muy bien caracterizadas, para la
fase de descubrimiento de biomarcadores o perfiles y estudios piloto.
b) Grandes colecciones de muestras clínicas bien caracterizadas necesarias
para la validación de los biomarcadores o perfiles y el progreso hacia
su uso clínico de rutina.
CARÁCTER MULTIDISCIPLINAR DE LA PROTEÓMICA CLÍNICA
Con lo expresado hasta aquí, parece obvio que la proteómica clínica debe
llevarse a cabo por equipos multidisciplinares, con médicos clínicos y anatomopatólogos, químicos de proteínas, expertos en MS, bioinformáticos, farmacólogos, etc. Con frecuencia, los análisis proteómicos proporcionan una avalancha de datos de difícil evaluación. Una de las funciones esenciales de los
equipos multidisciplinares es la priorización de patrones candidatos que han de
ser validados. La fiabilidad de los datos, avalados en las bases de datos, su potencial valor clínico y un riguroso análisis bioinformático, son algunos de los
criterios que deben seguirse en la priorización.
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30
INMUNOTERAPIA HUMORAL
Dr. Manuel Hidalgo. The Johns Hopkins University
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Inmunoterapía humoral
El uso de anticuerpos monoclonales es actualmente una
modalidad terapéutica de enorme importancia en el
tratamiento de pacientes con enfermedades neoplásicas.
Los anticuerpos se han utilizado como agentes únicos o
conjugados con agentes radioactivos o como vehículos de
fármacos y toxinas. Actualmente existen anticuerpos frente
a receptores de factores de crecimiento, factores de
crecimiento per se y otras dianas celulares como antigenos
de membrana. Estos fármacos han demostrado actividad
clínica en pacientes con tumores de de mama, colon,
pulmón, linfomas y leucemias. Áreas de investigación y
desarrollo incluyen la generación de agentes con mejores
propiedades farmacológicas y menos tóxicos.
INTRODUCCIÓN
El desarrollo de anticuerpos con fines terapéuticos ha crecido de forma
importante en la última década. Inicialmente se utilizaron anticuerpos de origen
murino. Estas moléculas tienen el inconveniente de que generan una respuesta
immunológica frente a ellos. Los anticuerpos murinos se pueden transformar
en moléculas humanizadas de forma que no son reconocidos por el sistema immune. Los anticuerpos humanos o "humanizados" se caracterizan también por
una mayor vida media. Más recientemente, se han desarrollado estructuras con
capacidad para reconocer multiples antígenos, y con distintos tamaños y propiedades. Junto a la creciente identificación de dianas terapéuticas, el uso de
anticuerpos tanto "desnudos" como conjugados con toxinas, fármacos y compuestos radiactivos ha aumentado notablemente. Los anticuerpos más frecuentemente utilizados en el tratamiento contra el cáncer son las IgG. Los avances
en genética humana y molecular han permitido la síntesis de fragmentos de
IgG. Estos anticuerpos modificados se caracterizan por tener distinta afinidad
31
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Inmunoterapía humoral
antigénica, número variable de sitios de unión al antígeno y distintas propiedades farmacológicas. Las más utilizadas son los fragmentos variables de cadena
única (scFV) que están compuestos por las cadenas variables pesadas y ligeras
unidas por un péptido. Estas moléculas tienen un peso molecular de ≈ 25 kDa
y son eficaces como vehículos de radionucleótidos. También se han desarrollado estructuras de mayor envergadura como los llamados diabodis y minibodis.
El menor peso molecular de estas estructuras facilita su eliminación renal y especificidad en la localización tumoral con menor toxicidad que la asociada con
IgG completas.
MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS ANTICUERPOS
MONOCLONALES COMO AGENTES TERAPÉUTICOS
Los anticuerpos monoclonales ejercen sus actividades de forma muy diversa y varía en función de las dianas afectas. Los anticuerpos dirigidos contra
receptores de factores de crecimiento, como el receptor del factor de crecimiento epidérmico, inhiben la unión de ligandos con sus receptores y, en consecuencia, inhiben las funciones del receptor resultando en inhibición de la
proliferación celular y apoptosis. Los anticuerpos también generan actividad
antitumoral a través de mecanismos inmunológicos, induciendo anticuerpos antiidiotipo, citotoxicidad dependiente de celulas (ADCC) y citotoxicidad mediada por complemento. Como se ha mencionado anteriormente, los anticuerpos
también se utilizan como vehículos de otros agentes terapéuticos como fármacos, toxinas y sustancias radioactivas. En estos casos, los mecanismos de acción están en función de las moléculas asociadas.
LIMITACIONES DEL EMPLEO DE ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS
Inicialmente, los anticuerpos terapéuticos usados en Oncología eran anticuerpos murinos. Una de las limitaciones más importantes de estos fármacos es
la generación de HAMA (human antimouse antibodies). Este problema limita
32
el número de tratamientos que los pacientes pueden recibir. Técnicas más modernas han permitido la generación de anticuerpos quiméricos que comparten
estructuras humanas y murinas y que tienen menor immunogenicidad. Actual-
mente, es posible la generación de anticuerpos totalmente humanizados que no
generan HAMA. Un segundo problema es la unión del anticuerpo a antígenos
circulantes con la consiguiente reducción en la disponibilidad del anticuepo para llegar al tumor. Otras limitaciones a la distribución de los anticuerpos en el
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Inmunoterapía humoral
tejido tumoral incluyen las alteraciones en la vasculatura de los mismos, elevada presión hidrostática y la distribución heterogénea de los antígenos dentro de
los tumores. Además, la inmunoterapia humoral se ve limitada por las dificultades de acceso de las células efectoras a los tejidos tumorales. Finalmente, es
bien conocido que los tumores secretan sustancias que disminuyen la respuesta
inmunológica.
ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS
Neoplasias hematológicas
CAMPATH-1: El CAMPATH-1 es un anticuerpo moclonal específico frente al antigeno CD52, un glicopéptido que se expresa en linfocitos B y T. Se ha
empleado en pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia promielocítica y linfomas no Hodgkin (LNH) así como para depleccionar de células T la médula en transplantes alogénicos. El fármaco tiene aproximadamente
un 50% de respuesta en pacientes con LMC resistente a fludarabina. En pacientes con enfermedad no tratada el fármaco ha demostrado también actividad
en pacientes con enfermedad no tratada, si bien la actividad es menor en pacientes con afectación esplénica y de ganglios linfáticos. En pacientes con
LNH se ha estudiado una versión humanizada del anticuerpo. Un 20% de pacientes respondieron, aunque de forma transitoria. Las principales toxicidades
observadas fueron anemia, trombocitopenia e infecciones oportunistas.
Rituximab: El rituximab es un anticuerpo monoclonal humanizado frente
al antigeno CD20. En estudios fase II, el fármaco resultó en un 40-50% de respuestas objetivas en pacientes con recidivas de LNH de bajo grado con muy
buena tolerancia. En algunas ocasiones, el tratamiento con rituximab resultó en
reacciones infusionales caracterizadas por fiebre, escalofríos, lisis tumoral, plaquetopenia, broncoespasmo e hipoxemia. Estos síntomas se suelen resolver con
tratamiento de soporte y los pacientes pueden continuar el tratamiento sin secuelas. En raras ocasiones se han descrito reacciones cutáneas de gran intensi-
33
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Inmunoterapía humoral
dad, siendo algunas incluso fatales. En pacientes con linfomas de grado alto e
intermedio, las respuestas fueron de un 30% con independencia de la dosis empleada. En combinación con quimoterapia CHOP, el índice de respuestas es
mayor del 90% con hasta un 55% de respuestas completas de larga duración.
Es importante resaltar que pacientes con translocacion del gen blc2 negativizaron dicho marcador en sangre medido por PCR. En pacientes ancianos, el tratamiento combinado de quimioterapia con rituximab ha demostrado superioridad
al tratamiento con quimioterapia sola. En linfomas de bajo grado, el tratamiento combinado de rituximab y fludarabina resultó en un 93% de respuestas globales, con una duración de más de 14 meses. Una observación importante en el
desarrollo clínico del rituximab es que la presencia de células CD-20 positivas
circulantes puede afectar a la actividad del fármaco, actuando como un santuario en el que se deposita el anticuerpo, pudiendo necesitar dosis más altas del
mismo. De hecho, en otros estudios se ha observado una relación entre niveles
séricos del anticuerpo y actividad clínica, de forma que pacientes con enfermedad avanzada puedan necesitar una dosis de anticuerpo más alta. En casos ocasionales, los pacientes desarrollan resistencia a rituximab debido a la proliferación de poblaciones linfocitarias sin expresión del antígeno. En estas
situaciones se puede considerar la combinación de este agente con otros fármacos dirigidos contra las poblaciones linfocitarias emergentes.
Tumores sólidos
Trastuzumab: El Her2/Neu, también llamado ErbB2, es uno de los miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).
Este receptor de membrana se encuentra sobreexpresado, debido a una amplificación genética en el 30% aproximadamente de pacientes con cáncer de mama.
El trastuzumab (Herceptin®), también conocido como herceptin, es una versión
humanizada del anticuerpo murino 4D5. El anticuerpo va dirigido frente a epitopos en el dominio extracelular del Her2. En estudios de fase II, en pacientes
con carcinoma de mama avanzado, el tratamiento con este fármaco resultó en
un 10-15% de respuestas objetivas, y aproximadamente, 9 y 13 meses de tiempo a la progresión y supervivencia respectivamente. El fármaco es activo en
34
aquellos tumores que sobreexpresan el Her2, determinado bien mediante immuhistoquimica o mediante amplificación genética por FISH. En combinación
con quimioterapia, el tratamiento con trastuzumab ha mostrado superioridad
frente al tratamiento con quimioterapia sola en pacientes con cáncer de mama
avanzado. En un estudio fase III, el tratamiento combinado de herceptin con
paclitaxel o ciclofosfamida-adriamicina demostró superioridad en repuestas objetivas así como supervivencia. El tratamiento combinado con antraciclinas re-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Inmunoterapía humoral
sultó en casos de disfunción miocárdica y no se recomienda su utilización. Recientemente se han publicado los estudios de herceptin en pacientes con
carcinoma de mama operado en combinación con quimioterapia. Estos estudios
han demostrado una mejor supervivencia libre de enfermedad en pacientes tratadas con este fármaco, lo cual ha resultado en la aprobación de los mismos
para uso clínico. La mejor supervivencia de las pacientes tratadas indica que
posiblemente se logre un mayor número de curaciones de la enfermedad.
Cetuximab: El EGFR, o sus ligandos, está sobreexpresado en la gran mayoría de los tumores sólidos epiteliales y es una diana muy interesante para el desarrollo de fármacos antitumorales. Farmacológicamente se han desarrollado dos
estrategias contra esta diana, que se basan en el uso de anticuerpos monoclonales
contra el dominio extracelular del receptor o moléculas pequeñas dirigidas frente
al domino intracelular del mismo. Ambas estrategias han demostrado ser efectivas y actualmente se están aprobando fármacos inhibidores de este receptor en
estas dos categorías. Los anticuerpos monoclonales bloquean la interacción del
ligando receptor e inhiben la función del mismo. Además, los anticuerpos monoclonales inducen la degradación del receptor, siendo este otro mecanismo de atenuación de la señal. A nivel celular, estos eventos producen una inhibición de la
proliferación celular. Estudios preclínicos han demostrado, además, que estos fármacos reducen la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular, con
lo que se produce una disminución del potencial angiogénico. En estudios preclínicos se ha visto también que los anticuerpos monoclonales frente al EGFR ejercen efectos sinérgicos con quimioterapia y radioterapia.
Actualmente existen varios anticuerpos de esta clase en desarrollo. Los
más avanzados son el cetuximab (Erbitux®), aprobado para el tratamiento de
pacientes con carcinoma de colon refractario a irinotecán en combinación con
este agente, en combinación con radioterapia en pacientes con carcinoma epidermoide de cabeza y cuello con enfermedad localmente avanzada así como en
pacientes con enfermedad avanzada como agente único. En diferentes estudios
clínicos se ha observado que este anticuerpo tiene actividad como agente único
y en combinación con irinotecán en pacientes con cáncer de colon avanzado.
En un reciente estudio fase III, la combinación de cetuximab con irinotecán re-
35
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Inmunoterapía humoral
sultó ser superior a cetuximab sólo en pacientes con cáncer de colon avanzado
que habían progresado al tratamiento con irinotecan. El fármaco tiene también
actividad en otros tumores tanto como agente único como en combinación con
quiotereapia y radioterapia. En particular, varios estudios recientes han demostrado que este fármaco tiene actividad como agente único en pacientes con tumores de cabeza y cuello. Asimismo, la adición de cetuximab al tratamiento
con quimioterapia basada en platino en pacientes con carcinoma de cabeza y
cuello resistentes a esta quimioterapia resultó en un aumento de las respuestas
objetivas. Finalmente, en un estudio fase III, la combinación de cetuximab con
radioterapia resultó superior a la radioterapia sola en pacientes con carcinoma
de cabeza y cuello localmente avanzado. La toxicidad principal observada con
este fármaco cutanea y se manifiesta como acne. En estudios clínicos se ha observado, de forma muy interesante que los pacientes que desarrollan toxicidad
cutanea tienden a evolucionar mejor.
El otro anticuerpo monoclonal aprobado para uso clínico es panitumumab.
Este anticuerpo, a diferencia de cetuximab, es totalmente humano, lo cual disminuye la indicencia de reacciones de hipersensiblidad. En un reciente estudio
fase III en pacientes con carcinoma de colon resistente a tratamiento con quimioterapia, el panitumumab resultó en un aumento significativo en el tiempo a
la progresión frente a placebo. Estos resultados han llevado a la aprobación clínica de panitumumab para pacientes con carcinoma de colon refractario a quimioterapia.
Edrecolomab: El anticuerpo 17-1A (Panorex®) reconoce el antígeno EpCAM. El anticuerpo desarrollado clínicamente es un anticuerpo humanizado
que tiene una larga vida media, induce ADCC y no produce HAMA. Debido a
observaciones preclínicas que indican una mayor actividad del anticuerpo
cuando se combina con citokinas como interferón, interleukinas y factores de
crecimiento hematopoyéticos, este anticuerpo se ha desarrollado en combinación con estos otros agentes. Los estudios clínicos realizados con esta molécula
han dado resultados conflictivos. La combinación con citoquinas ha resultado
en mejores respuestas inmunólogicas, pero no en mejores respuestas clínicas.
Los estudios iniciales en pacientes con estadio III de cáncer de colon demostraron un aumento en la supervivencia del grupo tratado con anticuerpo frente al
36
control. Estudios posteriores en pacientes con estadio II de cáncer de colon y
en combinación con quimioterapia en pacientes con estadio III no han confirmado dicha actividad.
Bevacizumab: El VEGF es uno de los mediadores más importantes de la
angiogénesis. Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal dirigido contra este
factor de crecimiento que ha sido recientemente aprobado para el tratamiento
de pacientes afectos de carcinoma de colon en combinación con quimiotera-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Inmunoterapía humoral
pia. El fármaco ha demostrado en estudios fase III en pacientes con carcinoma de colon avanzado, mama y pulmón un mayor índice de respuestas objetivas y mejor supervivencia. La droga tiene también actividad en pacientes con
carcinoma de pulmón y está siendo extensivamente estudiada en estas otras
enfermedades. Los principales efectos secundarios más notorios han sido hipertensión, hemorragias (tumorales, epistaxis, hemoptisis) y cuadros de perforación intestinal.
RADIOINMUNOTERAPIA
Radioinmunoconjugados
En esta modalidad terapéutica, los anticuerpos se utilizan como vehículos
de sustancias radioactivas. Los anticuerpos utilizados pueden ser anticuerpos
sin actividad terapéutica per se o con actividad terapéutica, como por ejemplo
rituximab. La gran disponibilidad actual de anticuerpos y radioisótopos con
propiedades físicas y biológicas muy diversas permite mucha flexibilidad en
la combinación de los mismos, de manera que es posible generar reactivos de
muy diversa índole. Hasta recientemente, el único radioisótopo disponible era
el
131I.
Más recientemente está disponible también el
90Y,
cuyo uso está au-
mentando de forma progresiva. Estos agentes se clasifican en dos grandes categorías dependiendo del tipo de energía que emiten, alfa o beta. Estas sustancias se han utilizado mayormente en el tratamiento de neoplasias
hematológicas. Tositumomab (Bexxar®) está compuesto por
131I
-anti CD 20.
Dosis mieloablativas de este agente han sido eficaces en el tratamiento de pacientes con linfoma refractario a tratamiento convencional y también ha demostrado actividad a dosis más bajas en pacientes con linfomas refractarios.
Ibritumomab (Zevalin®) combina un anticuerpo frente al CD20 con
90Y.
El es-
tudio más relevante con este fármaco es un estudio randomizado fase III en
pacientes con linfoma de bajo grado. Ciento cuarenta y tres enfermos se randomizaron a recibir tratamiento con ibritumomab o rituximab resultando en un
37
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Inmunoterapía humoral
mayor índice de respuestas objetivas tanto completas como parciales en el
grupo tratado con ibritumomab. Otros fármacos RAIT incluyen Lym-1 y
M195. Esta modalidad terapéutica se ha ensayado también en tumores sólidos
con menor éxito hasta el momento.
CONCLUSIONES
Los anticuerpos monoclonales se han establecido como una importante
modalidad terapéutica y actualmente existen varios aprobados para el tratamiento de pacientes con diversos tipos de tumores. Los anticuerpos ofrecen
una gran versatilidad en cuanto a su posible utilización como agentes únicos o
combinados con radioinmunoconjugados, fármacos y toxinas.
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Inmunoterapía humoral
39
INTRODUCCIÓN A LA INMUNOTERAPIA CELULAR
José R. Regueiro. Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid
Eduardo Martínez Navas. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
¿QUÉ ES LA INMUNOTERAPIA?
La inmunoterapia es la utilización de herramientas inmunológicas para tratar enfermedades como las que se indican en la Figura 1.
• Cáncer (Blattman 2004).
• Infecciones (Casadevall 2004).
• Enfermedades inmunitarias.
– Por exceso de respuesta a antígenos.
Propios: autoinmunidad (Steinman 2004, Feldmann 2004).
Ajenos: alergia, rechazo (Hu
ggins 2004, Waldmann 2004).
– Por defecto de respuesta a patógenos: inmunodeficiencias.
■
■
Figura 1.
LA INMUNOTERAPIA FUNCIONA (Blattman 2004)
41
La extraordinaria capacidad de reconocimiento del sistema inmunitario ya se puso de manifiesto en siglos anteriores con la inmunoprofilaxis,
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción a la inmunoterapia celular
Figura 2.
42
Figura 4.
que ha permitido erradicar, por ejemplo, la viruela o el sarampión. De
igual manera, la inmunoterapia ha demostrado en los últimos años que
funciona, como acreditan los ejemplos que se citan en la Figura
2. Por ejemplo, el linfoma no-Hodgkin se trata con éxito con
Figura 3: Manipulación de la
anticuerpos monoclonales anti-CD20, ya que la célula tumoral
inmunidad adaptativa
humoral. (A) Los antígenos
expresa CD20 y, por tanto, queda marcada para su eliminación
tumorales pueden inducir,
sistemática y concienzuda merced a todos los mecanismos desmediante vacunación, la
tructivos que la
producción por los linfocitos
inmunidad dedica
B de anticuerpos capaces
normalmente a los
de eliminar tumores o
patógenos (Figura
mejorar la presentación de
sus antígenos por las
3). La Figura 4 recélulas dendríticas (DC). Los
sume algunos de
monoclonales, como el antiellos y otras estraCD20 o anticuerpos
tegias que aprovebiespecíficos, reconocen
chan la exquisita
tumores y activan diversas
especificidad de
células efectoras. BCR/lg, B
los anticuerpos.
cell receptor; Ag:Ab,
antígeno:anticuerpo. (B) Los
Otro ejemplo es el
monoclonales pueden
uso de anti-CD25
eliminar tumores por
para tratar el remecanismos independientes
chazo renal agudo,
de células efectoras. MAC,
que es debido al
membrane attack complex.
reconocimiento de
Tomado de Blattman 2004.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
Figura 8.
las células renales por los linfocitos T alogénicos (Figura 5). Como dichos
linfocitos expresan CD25 para su expansión (Figura 6), el tratamiento los
elimina eficazmente sin dañar a otros linfocitos T. Los linfocitos T, en este caso autorreactivos, son los responsables de la síntesis de un importante
mediador de la inflamación (TNFα) en patologías autoinmunitarias como
la esclerosis múltiple (Figura 7) o la artritis reumatoide. Es dicho mediador el que bloquean los anticuerpos anti-TNFα, que tanto éxito han tenido
en esta enfermedad. En realidad, los mecanismos implicados en la inmunoterapia de la aloreactividad podrían aplicarse a todas las inmunopatías
(Figura 8), ya que en todas existen linfocitos "malos" (alo, auto o alerreactivos).
43
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción a la inmunoterapia celular
LA INMUNIDAD ADAPTATIVA ES MUCHO MÁS
QUE LOS ANTICUERPOS
Los ejemplos precitados tienen en común que se aprovechan de la enorme
diversidad de los anticuerpos, normalmente dirigidos contra los patógenos, para
eliminar o bloquear la causa de la patología tratada (sea ésta el tumor, el linfocito
malo o la citocina, Figura 9). Pero los linfocitos T también tienen esa capacidad,
aún no explotada suficientemente, aunque su concepto de antígeno (péptido externo o interno presentado por moléculas MHC) difiere del que tienen los linfocitos B (epítopo externo del antígeno nativo, Figura 10). Además los linfocitos T,
especialmente los Th, tienen una enorme capacidad reguladora de la inmunidad
Figura 9.
Figura 10.
Figura 11.
Figura 12.
44
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
innata y adaptativa, y entre
otras cosas son los responsables
de la propia función de los B
(Figura 11, 12). Por tanto, intentar redirigir la actividad defensiva anti-patógeno de los linfocitos T y sus células auxiliares
sobre el tumor, el linfocito malo
o la citocina, es una estrategia
con enormes posibilidades terapéuticas (Figura 13).
Figura 13.
¿QUÉ ES LA INMUNOTERAPIA CELULAR?
La inmunoterapia celular es la utilización de células como herramientas inmunológicas para tratar las enfermedades que se listan más arriba,
especialmente el cáncer (Paul 1998 y Figura 14). La Figura 15 propone algunos ejemplos, más deseos que realidades salvo quizá el tratamiento de la
leucemia por trasplante de médula ósea compatible. La técnica se resume
en la Figura 16: se obtienen precursores hematopoyéticos del paciente, que
se limpian ex vivo de posibles células tumorales, y se congelan. Entretanto, el paciente se trata agresivamente para erradicar el tumor, y después se
reconstituye con los precursores congelados. Los recientes avances en la
45
Figura 14.
Figura 15.
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción a la inmunoterapia celular
Figura 16.
reconstitución del linaje T, que es el
más importante clínicamente, mejorarán
previsiblemente esta opción terapéutica
(van den Brink 2004). También se puede
aplicar el procedimiento a enfermedades
autoinmunitarias graves (esclerosis múltiple, artritis reumatoide resistente a
otros tratamientos), ya que los linfocitos
autorreactivos, como la leucemia, pueden ser eliminados dentro y fuera del
paciente (Sykes 2005).
DAME UN BUEN ANTÍGENO Y ELIMINARÉ EL CANCER
Aunque el sistema inmunitario ha evolucionado para defendernos de los patógenos, y parece poco preocupado por los tumores (o por constituir una molesta barrera frente a los trasplantes), lo cierto es que elimina con rapidez tumores siempre
que tengan un buen antígeno asociado. Dos ejemplos: el virus de Epstein-Barr y
los idiotipos (regiones variables de las Igs) en linfomas B de bajo grado (Figura
17), aunque hay otros (Figura 18). El caso del virus de Epstein-Barr es muy ilustrativo (Figura 19), ya que infecta a casi toda la población e in vitro transforma a los
linfocitos B (su diana) para que crezcan indefinidamente. Pero in vivo se mantiene
a raya por los linfocitos Tc principalmente. La inmunosupresión lo puede liberar de
46
Figura 17.
Figura 18.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
Figura 19.
Figura 20.
este control permitiendo la proliferación de los linfocitos B infectados, que con el tiempo pueFigura 21.
den acumular mutaciones que
los hacen tumorales (Figura 20). La Figura 21 explica el mecanismo de las vacunas
antitumorales con idiotipos del BCR del linfoma, que se convierten por sobreexpresión en antígenos tumorales (de distribución mucho más restringida que CD20,
por cierto, y por tanto mucho más específicos). Sin embargo, pocas veces hay un
buen antígeno tumoral (ver último párrafo del siguiente apartado).
INMUNOTERAPIA CELULAR DEL CÁNCER
Por tanto, la inmunoterapia celular pretende convencer a los linfocitos Tc (y
Th) de que destruyan a las células tumorales (propias, aunque descarriadas) como
si estuvieran infectadas por EBV (Figuras 22, 23). Para ello, utiliza células diversas: linfocitos alogénicos de médula ósea, células dendríticas, las propias células
47
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción a la inmunoterapia celular
Figura 23.
Figura 22.
tumorales modificadas, o linfocitos propios (T, NK NKT…,
Figuras 24, 25) (Plunkett 1999).
Linfocitos alogénicos
48
Las preparaciones de médula
ósea alogénica contienen siempre
cierto porcentaje de linfocitos T
maduros (Figura 26). Mientras
que los precursores se diferencian
en el timo del receptor para dar
lugar a linfocitos T autotolerantes
restringidos por el MHC del receptor, los linfocitos contaminantes pueden contener una proporción variable de linfocitos T
Figura 24.
Figura 25.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
Figura 26.
Figura 27.
alogénicos, que son los responsables de la reacción injerto contra huésped en los trasplantes de médula no purgada de linfocitos. Esta reacción es más peligrosa que la reacción alogénica de los linfocitos T del receptor contra el injerto de médula y su progenie (que puede provocar el rechazo del injerto), ya que puede comprometer la vida
del receptor. Por esa razón se suele purgar la médula alogénica con monoclonales anti- CD2, CD3, CD5, CD7 o CD52 en el caso de pacientes sin cáncer. Pues bien, esa
misma actividad anti-huésped aparentemente indeseable es la responsable del efecto
injerto contra leucemia, que elimina con efectividad a todas las células tumorales por
razones alogénicas, las mismas que operan en el rechazo renal (Figura 27), pero ahora dirigidas contra el tumor. Este efecto antitumoral de las células T alogénicas ha sido claramente demostrado en dos enfermedades: leucemia mieloide crónica (CML) y
la enfermedad linfoproliferativa de linfocitos B inducida por el virus de Epstein-Barr
(EBV). Pero, en este caso, la razón por la que el
tumor es eliminado es porque, en realidad, no
es propio. También se ha demostrado el efecto
beneficioso del rechazo del huésped en algunas
enfermedades autoinmunitarias (Sykes 2005).
Células dendríticas y tumorales
(Irvine 2000, Berzofsky 2004a)
Las células dendríticas y tumorales autólogas (Figura 28) son también objeto de
las estrategias de inmunoterapia celular que
49
Figura 28.
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción a la inmunoterapia celular
Figura 29.
Figura 30.
a menudo se denominan vacunas celulares. El diseño es sencillo (Figuras 29,
30): consiste en hacer crecer las células dendríticas ex vivo a partir de monocitos (si es que al resultado se le puede llamar células dendríticas), madurarlas y
cargarlas con lisados del tumor, o vectores virales que expresen antígenos tumorales, o péptidos antigénicos de origen tumoral (Curti 2004, Figura 31). Se
espera que así las células dendríticas carguen en su MHC péptidos tumorales y,
al reinyectarse al paciente, consigan disparar una respuesta vigorosa de linfocitos Tc (y Th) antitumorales. Más recientemente se ha demostrado en ratón que
los antígenos tumorales podrían expresarse con vectores en precursores hematopoyéticos que, al diferenciarse en dendríticas, activarían a los linfocitos T antitumorales (Cui 2003). Otra estrategia complementaria es modificar las propias
50
Figura 31.
Figura 32.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
células tumorales con vectores que produzcan localmente moléculas inmunoestimuladoras (por ejemplo, citocinas, o bien moléculas coestimuladoras, como B7/CD80) con
la esperanza de que, al volver al enfermo,
estimulen una fuerte respuesta presentadora
en las células dendríticas y, por tanto, una
respuesta Th y Tc muy potente (Figura 30),
o bien una respuesta directa por parte de estas últimas (Figura 32). Otra estrategia es
utilizar el propio tumor autólogo o bien uno
alogénico del mismo tipo (Cancervax).
Figura 33.
Linfocitos T, NK, NKT (Khanna 1999, Kessels 2001, Alvarez-Vallina 2001)
Por último, la extraordinaria capacidad de los linfocitos propios para
eliminar células infectadas ha propiciado su aplicación a la eliminación de
tumores, con diversas estrategias (básicamente despabilar linfocitos, Figura
34). Una es la transferencia adoptiva de grandes números de linfocitos T
anti-tumor generados in vitro por estimulación con citocinas como la IL-2,
a partir de linfocitos infiltrantes o TIL (B). Los resultados de las fases I y
II de estos ensayos fueron bastante desesperanzadores, aunque recientemente las estrategias linfoablativas han hecho renacer las esperanzas (Rosenberg 2004). Otra es la modificación genética de los linfocitos T, antes de su
transferencia adoptiva, para que expresen
nuevos receptores de reconocimiento tumoral (TCR, anticuerpos biespecíficos o
quiméricos), o de proliferación autocrina,
o proteínas que bloquean las señales inhibidoras que limitan las respuestas T (D y
Figura 35).
El tratamiento con IL-2 también se ha empleado para la transferencia adoptiva de linfocitos NK expandidos in vitro (las LAK, Figura
36). La α-galactosilceramida es un análogo del
ligando natural de los linfocitos NKT que per-
51
Figura 34.
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción a la inmunoterapia celular
Figura 36.
Figura 35.
52
mite expandirlos y que ha acreditado su potencial antitumoral.
En el caso de los linfocitos
T y las células dendríticas, existen dos problemas importantes
Figura 37.
(Figura 37): el riesgo de autoinmunidad, y la necesidad de que exista un verdadero antígeno tumoral. Este último
obstáculo no puede destacarse lo suficiente, porque confunde enormemente el panorama científico. CD20, CEA (antígeno carcinoembrionario), AFP (alfa feto proteína) no son verdaderos antígenos tumorales, ya que se expresan normalmente en
el enfermo en cantidades que garantizan la autotolerancia. Por tanto, es muy difícil convencer al sistema inmunitario que los considere ajenos, a no ser que se le
proporcione un sistema de reconocimiento generado en otra especie, para la que sí
son verdaderos antígenos (por ejemplo un anti-CD20 de ratón). En cambio, los
antígenos (inmunógenos para ser más precisos) de los oncovirus (EBV, HTLV-I) o
la p53 mutada o el antígeno oncofetal sí son verdaderos antígenos tumorales, ya
que para ellos no existe autotolerancia y puede, por tanto, estimularse la inmunidad contra las células tumorales que los portan (Coggin 2005).
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
INMUNOTERAPIA CELULAR DE OTRAS ENFERMEDADES
Pero la inmunoterapia celular, al menos en teoría, tendría una enorme aplicación potencial en diversas patologías, como se sugiere en la Figura 38. Por
ejemplo, células dendríticas cultivadas con un antígeno de melanoma deberían
generar in vivo linfocitos Tc anti-melanoma. O expandiendo linfocitos Tc autólogos anti-EBV in vitro debería poderse tratar la mononucleosis (Khanna 1999,
Berzofsky 2004b). Una vacuna celular a base de los linfocitos T responsables
de la artritis reumatoide, el asma o el rechazo podría eliminarlos completamente. Pero también injertar TCR anti-EBV, o -tumor, o -linfocito malo puede redirigir a linfocitos normales contra las dianas implicadas en cada una de esas patologías (Figura 39).
Por último, las inmunodeficiencias (ID)
congénitas son desafortunados experimentos
de la Naturaleza que afectan a la inmunidad.
Resulta especialmente apropiado que puedan
curarse mediante afortunados experimentos
diseñados por el ser humano. Ya fue así en
1968, cuando una ID ligada al cromosoma X
se convirtió en la primera enfermedad humana curada con éxito por trasplante de médula
ósea, un procedimiento terapéutico que ahora es estándar para muchas otras patologías,
incluido el cáncer. Naturalmente, se observaron efectos adversos graves, como la enfermedad del injerto contra el huésped. Más de
30 años después, la misma ID ha sido la primera en ser curada por terapia génica. Hay
obstáculos que superar, como ha demostrado
la leucemia de células T desarrollada por oncogénesis insercional en tres pacientes. La
propia inmunidad puede ser un obstáculo para la terapia génica cuando se dirige contra
el vector o incluso la proteína terapéutica.
Pero la terapia génica seguirá adelante. El
cáncer, las enfermedades infecciosas, inclui-
Figura 38.
53
Figura 39.
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción a la inmunoterapia celular
do el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida, y otras enfermedades congénitas, son las siguientes de la lista. Los beneficios globales serán probablemente más que los riesgos, como se demostró para el trasplante (Regueiro 2004).
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
55
CÉLULAS EMBRIONARIAS PLURIPOTENTES
Miguel Torres. Científico titular del Departamento de Inmunología y Oncología
Centro Nacional de Biotecnología. CSIC-Pfizer
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Células embrionarias pluripotentes
INTRODUCCIÓN
El cuerpo humano se compone de una gran variedad de células especializadas en diferentes funciones. Esta especialización determina una divergencia
extrema en la apariencia externa y capacidad funcional de cada una de las clases de células que componen un organismo. Por ejemplo, una célula ósea difiere extraordinariamente en su apariencia externa de una neurona y no podría realizar sus funciones especializadas. La composición y diversidad celular de
nuestro cuerpo, salvo excepciones, está presente en el momento de nacer y nos
acompaña hasta la muerte. Sin embargo, a pesar de su gran heterogeneidad, todas nuestras células descienden de una única célula embrionaria: el zigoto. Durante el desarrollo embrionario ocurren dos importantes procesos que conducen
a la composición final del recién nacido; por un lado el zigoto se multiplica
por división, generando el número de células necesarias para la construcción
del organismo, y en paralelo, distintos linajes celulares se diferencian en poblaciones celulares que adoptan las características propias de su identidad.
Una vez diferenciadas, las células disponen de un periodo de vida limitado
y deben ser reemplazadas por otras nuevas para mantener la función de los tejidos y órganos del individuo. En el embrión temprano existe una población de
57
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Células embrionarias pluripotentes
células, las células troncales embrionarias, capaz de diferenciarse en cualquier
tipo celular del organismo, y por lo tanto, capaz de aportar todos los tipos celulares necesarios para la construcción de los distintos tejidos y órganos. En el
individuo ya desarrollado, son las células troncales adultas las que heredan esta
capacidad y aportan a cada tejido u órgano un flujo constante de nuevas células
que sustituyen a las envejecidas o dañadas por enfermedad o accidente, regenerando órganos y tejidos. Sin embargo, la capacidad de regeneración es muy variable según el tejido; desde casi nula en el caso del Sistema Nervioso Central,
o muy reducida en el caso del páncreas, hasta muy activa en el caso de la piel,
el sistema hematopoyético o el hígado. Esta circunstancia determina que la pérdida o deterioro de una población celular concreta durante la vida adulta sea,
en muchos casos, insustituible de manera espontánea.
La carencia de las funciones realizadas por las células dañadas provoca el
sufrimiento de enfermedades crónicas como la diabetes, el Parkinson, la esclerosis múltiple, etc. o la pérdida de determinadas funciones, como las parálisis
sufridas tras una lesión de médula. Una de las soluciones para resolver este tipo de enfermedades sería la disponibilidad de células embrionarias totipotentes,
capaces de especializarse en las funciones perdidas durante la vida adulta. Sin
embargo, las células troncales embrionarias se encuentran de manera natural en
el embrión en estadio de blastocisto, en número muy limitado y en una ventana
de tiempo muy restringida. Por esta razón, la posibilidad de usarlas depende de
la capacidad de aislar y multiplicar las células troncales embrionarias de manera controlada en el laboratorio.
LAS CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS: OBTENCIÓN,
CARACTERÍSTICAS Y APROXIMACIONES TERAPÉUTICAS
EXPERIMENTALES
El aislamiento y cultivo de células troncales embrionarias se consiguió por
primera vez a partir de blastocistos de ratón en el año 1981 (Figura 1), conociéndose universalmente como células ES (según la denominación inglesa
"Embryonic Stem")1,2. Las células aisladas mostraron características excepcio-
58
nales; por un lado se multiplican indefinidamente en cultivos in vitro, y a la
vez, si se les proporciona las condiciones adecuadas, se diferencian dando lugar a las distintas células especializadas del organismo. Las conclusiones deri-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Células embrionarias pluripotentes
vadas del cultivo y
uso de las células ES
en el ratón son contundentes. Células
ES mantenidas en
cultivo por periodos
prolongados son capaces de mezclarse
con células de un
embrión en desarrollo, contribuyendo
células sanas y funcionales a todos los
tejidos de un animal
adulto (Figura 2). A
pesar de haber acumulado un número
indefinido de divisiones in vitro, las células ES no parecen "envejecer", ya que los animales generados a partir de éstas células no presentas síntomas de
envejecimiento prematuro. Estas características se relacionan con una
alta actividad telomerasa y con la expresión de otros marcadores relacionados con el mantenimiento del estado indiferenciado y proliferante.
En 1998 se consiguió por primera vez obtener y propagar in
vitro líneas de células pluripotentes aisladas de blastocistos y de
gónadas fetales humanas3,4. Al igual que sus homólogas de ratón,
Figura 1. Establecimiento
de líneas de células
troncales embrionarias.
Figura 2. Contribución
de las células ES a la
formación de quimeras
de ratón con colonización
de la línea germinal.
59
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Células embrionarias pluripotentes
las células pluripotentes embrionarias humanas se multiplican indefinidamente en cultivos artificiales, pero si se les proporciona las condiciones adecuadas, se diferencian dando lugar a las distintas células especializadas del organismo. Los cultivos de células ES humanas representan por lo tanto una
fuente ilimitada de células jóvenes capaces de contribuir a cualquier tejido
del organismo adulto5,6.
En modelos experimentales animales se han producido ya varios ejemplos del potencial terapéutico de las células ES. Se ha descrito, por ejemplo,
la diferenciación de células ES de ratón hacia músculo cardíaco y su implantación con éxito en el corazón de un animal adulto7. En estudios similares, se han observado mejorías de lesiones medulares y enfermedades neurodegenerativas trasplantando, respectivamente, poblaciones de neuroblastos o
gliales diferenciadas in vitro a partir de células ES de ratón 8,9. También se
han conseguido derivar células beta-pancreáticas funcionales a partir de células ES, mediante un proceso de diferenciación y purificación. La posterior
implantación de estas células en modelos experimentales de diabetes ha eliminado los síntomas de la enfermedad, demostrando la eficacia de la aproximación10.
LIMITACIONES PRESENTES A LA APLICACIÓN DE LAS
CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS EN TERAPIA HUMANA
Existen al menos tres problemas conocidos que impiden prever qué enfermedades se beneficiarán de la nueva técnica y cuándo será posible su aplicación.
En primer lugar, las células ES de ratón forman teratocarcinomas al ser
implantadas en estado indiferenciado en animales de laboratorio. Este problema
desaparece si se implantan después de su diferenciación total o parcial in vitro,
por lo que cualquier protocolo de transferencia de células ES deberá incluir un
paso previo de diferenciación in vitro.
Un segundo problema para la aplicación terapéutica de las células ES reside en la dificultad de obtener células diferenciadas a un linaje celular puro.
60
Cuando se estimula su diferenciación, las células ES son capaces de originar
cualquier tipo celular, pero raramente lo hacen de manera homogénea, sino
que dan lugar a poblaciones de células en que se mezclan distintos tipos es-
pecializados. Idealmente deberíamos ser capaces de controlar las vías elegidas por las células ES cuando se diferencian 6,11. Gracias a experimentos en
células en cultivo y a modelos animales como el ratón, hoy conocemos genes
de diferenciación que controlan estas vías. Por ejemplo, existen genes miogé-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Células embrionarias pluripotentes
nicos que determinan la diferenciación hacia músculo, neurogénicos que inducen la diferenciación hacia neuronas, genes que determinan los distintos tipos celulares pancreáticos, otros implicados en determinar los diferentes tipos
celulares de la hipófisis y un largo etcétera. La activación controlada de genes de diferenciación en las células ES podría producir el tipo celular deseado para cada aplicación. Un ejemplo práctico de esta aplicación es la estimulación de la producción in vitro de células troncales hematopoyéticas a partir
de células ES de ratón por la sobreexpresión del factor de transcripción
HoxB412. Alternativamente, se pueden exponer los cultivos a factores difusibles capaces de instruir a las células sobre la vía de diferenciación a seguir.
Muchos de estos factores de crecimiento tienen ya aplicaciones terapéuticas y
su utilización sería fácil y directa. Algunas de estas aproximaciones se han
aplicado ya con éxito para dirigir la diferenciación de células ES a determinados linajes in vitro11.
El tercer problema sería que las células implantadas podrían sufrir el mismo tipo de rechazo inmune que se produce en el trasplante de órganos. Antes
de su utilización habría que establecer bancos de distintas líneas celulares compatibles con el sistema inmune de cada uno de los posibles receptores, una tarea abordable con la tecnología disponible en este momento, pero sin duda laboriosa. Una posibilidad en este contexto sería utilizar técnicas de clonación
por transferencia nuclear, mediante lo cual se pueden generar líneas de células
troncales personalizadas a partir de células somáticas de cada individuo13. Esta
aproximación se ha demostrado viable en animales de experimentación y sería
la solución definitiva al problema del rechazo.
COMBINACIÓN DE TERAPIA CELULAR Y TERAPIA GÉNICA POR
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA: ¿UNA VENTAJA TERAPÉUTICA DE
LAS CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS?
En aquellos casos en que una población celular determinada esté dañada debido a un defecto genético congénito o adquirido, el autotransplante,
61
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Células embrionarias pluripotentes
simple o por clonación, no sería eficaz. Por otro lado, el trasplante de células sanas ajenas plantearía los problemas de rechazo antes mencionados. De
nuevo, el modelo experimental de ratón ofrece una posible solución idónea
a este problema. La tecnología de células ES en el ratón se ha explotado
fundamentalmente como una vía para la producción de animales modificados genéticamente14,15. La repercusiones de esta aplicación han sido, y serán en el futuro, de gran importancia. Baste mencionar la disponibilidad de
modelos de ratón que reproducen patologías humanas como el cáncer, la esclerosis múltiple o la diabetes, o el avance en el conocimiento sobre cómo
los genes determinan los distintos linajes celulares que componen el organismo. Gracias a esto, las técnicas de modificación dirigida del genoma del
ratón se han desarrollado enormemente, y en la actualidad permiten realizar
de manera "limpia" mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, sustituciones, translocaciones, inversiones, mutaciones inducibles etc…El potencial terapéutico de estas aproximaciones sería extraordinario en el caso de
que se pudieran aplicar a la reparación del genoma en células ES humanas.
La reparación genética mediante estas técnicas representaría la terapia génica idónea, al reestablecer un genoma intacto, en lugar de añadir material
genético de manera incontrolada. Este tipo de modificaciones genéticas se
han realizado extensivamente en células ES de ratón, pero se pueden realizar en cualquier línea celular establecida. Sin embargo, por el momento, no
se ha tenido éxito al intentar aplicarlas en células troncales humanas, ya sea
adultas o embrionarias. En caso de no conseguir aplicar estas técnicas en
células troncales, existiría un argumento añadido en favor de la utilización
de la clonación terapéutica, ya que se podría realizar la corrección genética
en una línea establecida de células somáticas y utilizar sus núcleos como
donadores para obtener, primero blastocistos y luego células troncales corregidas. En un experimento paradigmático, que supera todas las limitaciones previsibles a la aplicación terapéutica de las células ES16, se han combinado las diferentes aproximaciones mencionadas en este artículo para
sanar ratones inmunodeficientes a causa una mutación en el gen Rag-2.
Mediante biopsia, se obtuvieron núcleos celulares de los ratones adultos inmunodeficientes y, por trasplante nuclear, se clonaron blastocistos genética-
62
mente idénticos al ratón original. Posteriormente, de estos blastocistos se
derivaron células ES y se corrigieron por modificación dirigida, reparando
el defecto en el gen Rag-2. A continuación, se utilizó una combinación de
diferenciación espontánea, y dirigida por el gen selector HoxB4, para obtener in vitro células troncales hematopoyéticas reparadas. Finalmente, se
trasplantaron las células obtenidas en los ratones deficientes en Rag-2, reconstituyendo establemente un sistema inmune completamente sano.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Células embrionarias pluripotentes
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
En resumen, la disponibilidad de células ES humanas representa un gran
avance que proporciona accesibilidad ilimitada a tejidos especializados y a
su proceso de diferenciación. De manera inmediata, representan un modelo
excelente para el estudio de los procesos de generación de diversidad celular
en nuestro organismo y para la caracterización de fármacos que puedan dirigirlos. Los resultados de los ensayos terapéuticos realizados en animales modelo permiten pensar en la aplicación a corto/medio plazo de la tecnología
de células troncales embrionarias en terapia humana. Una de las
perspectivas más prometedoras en este campo es la combinación
Figura 3. Esquema
del uso de células troncales embrionarias con la reparación genópropuesto para la
mica dirigida, lo que representaría la terapia génica ideal. En cualaplicación de nuevas
quier caso, existen limitaciones técnicas a la aplicación terapéutica
estrategias en terapia
de las células troncales embrionarias que impiden determinar con
celular.
certeza qué enfermedades se van a beneficiar
de las nuevas terapias y
en qué plazos. La combinación de la tecnología de células troncales
embrionarias con la clonación terapéutica permitirá, al menos, eliminar los problemas de
rechazo, y además, puede ser esencial para
conseguir la reparación
genómica dirigida (Figura 3).
63
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Células embrionarias pluripotentes
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TRASPLANTE CELULAR Y TERAPIA REGENERATIVA
CON CÉLULAS MADRE
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
Felipe Prósper. Servicio de Hematología y Área de Terapia Celular. Clínica Universitaria
Universidad de Navarra
Uno de los campos de la Medicina que más expectativas ha
levantado en los últimos años es la terapia celular con
células madre. El aislamiento de células embrionarias
humanas, la aparente e inesperada potencialidad de las
células madre adultas y el desarrollo de la terapia génica
nos lleva a imaginar un futuro esperanzador para un
importante número de enfermedades actualmente
incurables. A lo largo de las siguientes páginas vamos a
tratar de dibujar el panorama de la investigación con
células madre, describiendo los principales logros en este
campo así como algunas de las preguntas pendientes de
responder. A pesar de las grandes expectativas, es
fundamental que mantengamos un espíritu crítico y realista
a la hora de analizar los avances científicos en este área.
INTRODUCCIÓN
Las primeras evidencias científicas de que en el organismo adulto existen
células madres proviene de experimentos realizados por Till y McCulloch a finales de los años 50 centrados en las células madre hematopoyéticas. Sin embargo, la capacidad de regenerar tejidos en organismos adultos, e incluso de regenerar organismos completos, como en el caso de planarias, se conoce desde
mucho antes. Clínicamente, hemos explotado la potencialidad de las células
madre adultas, concretamente de las células madre hematopoyéticas, desde hace más de 50 años, y podemos afirmar que gracias al trasplante de médula ósea
(trasplante de células madre hematopoyéticas) miles de pacientes han podido
ser curados de enfermedades incurables de otra forma. Aunque la forma más
ampliamente utilizada de TC es el trasplante de progenitores hematopoyéticos,
65
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
el término Terapia Celular (TC), en un sentido amplio, incluye cualquier tipo
de tratamiento que utiliza células como agente terapéutico.
El interés por la utilización de las células madre, sin embargo, ha crecido
de forma exponencial en los últimos años a raíz de la identificación, caracterización y aislamiento de las células madre embrionarias humanas1 y de las expectativas, de alguna forma prematuras, de que las células madre podrían ser
capaces de curar innumerables enfermedades (enfermedades neurodegenerativas, cardíacas, endocrinológicas, etc.) gracias a su enorme potencial de diferenciación. Desgraciadamente, el debate científico sobre las aplicaciones terapéuticas de las células madre, adultas o embrionarias, se ha transformado en un
debate político y mediático en detrimento del ambiente necesario que facilite el
progreso científico.
Quizá el mensaje más importante que me gustaría trasmitir es que, a pesar
de las enormes perspectivas que existen en relación con las células madre, es
esencial que seamos capaces de trasmitir un sentimiento de prudencia y paciencia a nuestros enfermos y colegas: las células madre pueden llegar a contribuir
al tratamiento de distintas enfermedades, pero estos avances no son esperables
a corto plazo. Solamente, la investigación seria y continuada podrá contribuir a
medio o largo plazo a determinar la utilidad terapéutica real de las células madre adultas o embrionarias.
CÉLULAS MADRE
Una célula madre, o más adecuadamente denominada troncal, es aquélla
que es capaz de dividirse indefinidamente y diferenciarse a distintos tipos de células especializadas, no sólo morfológicamente sino también de forma funcional. Las células madre se pueden clasificar según su capacidad de diferenciarse
a distintos tipos de tejidos o lo que es lo mismo según su potencialidad: las células madre totipotenciales son aquellas capaces de producir tanto tejido embrionario, es decir, un embrión completo, como extraembrionario (placenta y anejos
placentarios). En sentido estricto, solamente los estadios iniciales del zigoto
constituirían células madre totipotenciales; las células madre pluripotenciales
66
son aquéllas que tienen la capacidad de diferenciarse a cualquiera de los tejidos
existentes en un organismo adulto y, por tanto, tejidos procedentes de cualquiera
de las tres capas embrionarias incluyendo las células germinales; por último, las
células madre multipotenciales serían capaces de diferenciarse a distintos tipos
celulares, pero siempre restringiendo su potencial a tejidos derivados de una
única capa embrionaria, es decir, tejidos derivados mesodérmicos, ectodérmicos
o endodérmicos2. Desde el punto de vista de su origen dividimos a las células
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
troncales en embrionarias (derivan del embrion, bien del blastocisto o de la
cresta gonadal) y adultas (derivan de alguno de los tejidos adultos).
Células madre embrionarias
Las células madre embrionarias se han obtenido bien a partir de la masa
celular interna del blastocisto en el estadio de embrión preimplantatorio1, o
bien de las cresta gonadal3. Aunque las líneas de células embrionarias de ratón
se utilizan desde hace más de 20 años4, hasta 1998 no fue posible obtener células embrionarias humanas1,3. La posibilidad de obtener y utilizar terapéuticamente las células embrionarias humanas ha disparado las expectativas de la terapia celular con células madre.
Las células madre embrionarias son pluripotenciales, es decir, son capaces de
proliferar de forma continua sin diferenciarse, siendo prácticamente inmortales, y
además son capaces de diferenciarse a cualquier tejido del organismo, incluyendo
tejidos somáticos (corazón, hígado, hueso, pulmón, cerebro, etc.. y células germinales (oocitos y espermatozoides), como se ha podido demostrar recientemente5-8.
Obviamente, la posibilidad de obtener cualquier tipo de tejido, y sin limitaciones
en cuanto a número de células, ha abierto expectativas de tratamiento de enfermedades tradicionalmente incurables (infarto de miocardio, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad de Parkinson, diabetes y otras muchas).
Sin embargo, las células madre embrionarias tienen, a día de hoy, importantes limitaciones que, de momento, han hecho que no exista ningún estudio
clínico abierto en pacientes. Por una parte, la misma capacidad proliferativa de
estas células lleva a que en los distintos modelos animales en los que se han
utilizado, se detecte de forma invariable la producción de tumores (teratomas y
teratocarcinomas). Con el objetivo de limitar este problema, diferentes grupos
han realizado estudios utilizando células embrionarias prediferenciadas con resultados positivos. Junto a este problema, se encuentra el hecho de que el trasplante de células embrionarias se produciría entre dos sujetos inmunológicamente incompatibles, lo cual exigiría la utilización de medicación
inmunosupresora y los consiguientes efectos adversos. Aunque en este sentido,
67
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
la trasferencia nuclear, al menos teóricamente, permitiría eludir el problema de
histoincompatibilidad, desde el punto de vista económico e incluso científico
no es una solución viable hoy en día.
Células madre adultas
Se conoce desde hace muchos años que distintos tejidos del organismo tienen
la capacidad de auto-regenerarse, gracias a la existencia de células madre residentes en dichos tejidos. Estas células madre obtenidas de tejidos adultos poseen las
dos características de auto-renovación y diferenciación que hemos mencionado
anteriormente. Sin embargo, a diferencia de las células madre embrionarias, se
considera que su capacidad proliferativa y su potencial de diferenciación es significativamente menor9. Se han identificado células madre adultas en la médula
ósea, músculo esquelético, epidermis, intestino, testículo, hígado, y de forma más
reciente en tejidos como el sistema nervioso central o el corazón.
Las células madre adultas se consideran multipotenciales, es decir, capaces
de diferenciarse a un número limitado de tejidos, principalmente en función de
su origen embrionario (células de origen mesodérmico pueden diferenciarse a tejidos derivados mesodérmicos etc.). Sin embargo, cada vez parece más evidente
que las células madre adultas son capaces de generar células maduras de tejidos
derivados de capas embrionarias distintas, siendo el caso más típico el de las células madre hematopoyéticas capaces de diferenciarse a hepatocitos, músculo
cardíaco, endotelio o incluso a tejidos derivados de las tres capas embrionarias912.
Este fenómeno, denominado versatilidad o capacidad de transdiferenciación
de las células madre adultas no está exento de controversia, ya que mientras algunos estudios lo apoyan, otros trabajos recientes cuestionan la existencia de esta
capacidad de transdiferenciación de las células, justificando algunos de los hallazgos de versatilidad en función de fenómenos de fusión celular13,14 o incluso
cuestionando abiertamente los resultados experimentales15.
TERAPIA CELULAR CON CÉLULAS MADRE
68
A día de hoy, las aplicaciones clínicas de la terapia celular se limitan a las
células madre adultas. Es posible que en el futuro las células madre embrionarias se apliquen de forma terapéutica, pero hoy en día las limitaciones que he-
mos mencionado anteriormente hacen inviable su utilización. Existen, sin embargo, ensayos clínicos con células madre embrionarias previstos en un futuro
próximo.
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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
Terapia celular en Endocrinología
La prevalencia de la diabetes mellitus se está incrementado hasta adquirir
proporciones epidémicas en el mundo. Se estima que actualmente 100 millones
de personas padecen la enfermedad, debido a la incapacidad de las células β
del páncreas de secretar insulina, hormona fundamental para el control de la
glucemia. En la actualidad, no existe un tratamiento curativo de la diabetes sino que el pronóstico de los pacientes está supeditado al control de su glucemia
mediante el tratamiento sustitutivo.
Recientemente, los resultados positivos obtenidos mediante el trasplante
de islotes de páncreas en pacientes diabéticos ha incrementado el interés por
utilizar células capaces de producir insulina. Mientras que el escaso número de
islotes, y la imposibilidad de expandir dichas células in vitro, impide que el
trasplante de islotes de cadáver sea utilizable en un número importante de pacientes, la posibilidad de utilizar células madre con capacidad de diferenciarse
en células productoras de insulina se plantearía como una estrategia mucho
más atractiva16.
En modelos experimentales, se ha podido demostrar que las células madre
embrionarias se pueden diferenciar a células secretoras de insulina y que cuando estas células se implantan en el bazo de ratones, en los que previamente se
ha inducido una diabetes mediante la inyección de estreptozotozina, son capaces de inducir una normalización de las cifras de glucosa. Uno de los principales problemas para la utilización de células embrionarias es que en el proceso
de diferenciación, además de células productoras de insulina, se producen otros
tipos celulares diferentes, que habría que eliminar de forma previa a su utilización17.
Aunque hasta el momento no ha sido posible caracterizar la célula madre
pancreática, distintos estudios sugieren el potencial de células obtenidas a partir de hígado, conductos pancreáticos o islotes pancreáticos, o incluso células
de médula ósea para producir células secretoras de insulina18-19. En cualquier
caso, una de las principales limitaciones con cualquiera de los tipos celulares
descritos es que el porcentaje de células secretoras de insulina que se puede
69
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
obtener es muy pequeño, lo cual limita su aplicación terapéutica. A pesar del
enorme interés en esta área de investigación, no existe ningún estudio clínico
publicado utilizando células madre en pacientes con diabetes tipo I, aunque las
expectativas sean enormes.
Terapia celular en enfermedades neurológicas
Las células madre tienen un enorme potencial como células capaces de reconstruir las neuronas y estructuras dañadas en enfermedades como la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, esclerosis en placas, infartos cerebrales o las lesiones medulares, por mencionar
algunas. El sistema nervioso central añade una dificultad adicional a la terapia
celular. Al ser un órgano con una sofisticada organización estructural, las células implantadas han de ser capaces no sólo de injertarse, sino también de establecer nuevas conexiones sinápticas e integrarse con el resto del tejido circundante.
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa
que afecta a más del 2% de la población mayor de 65 años. Se caracteriza por
una degeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra20 que origina la aparición de los signos y síntomas característicos de la enfermedad. A pesar del tratamiento farmacológico, la evolución de la enfermedad
conlleva complicaciones motoras y psiquiátricas que disminuyen la calidad de
vida de los pacientes y dificultan su manejo clínico. La utilización de células
con capacidad de sintetizar y liberar dopamina y restablecer los circuitos neuronales dañados se perfila como nuevas expectativas en el tratamiento de la EP21.
En la EP se han utilizado células de origen fetal en ensayos clínicos en humanos
con resultados cuando menos controvertidos22,23. Estudios in vitro e in vivo han
demostrado que tanto las células madre embrionarias como las adultas (células
madre de médula ósea, células madre neurales) son capaces de diferenciarse a
neuronas dopaminérgicas. Sin embargo, no está claro hasta que punto dichas células son capaces de restablecer los circuitos neuronales destruidos en la EP y,
por tanto, eliminar los síntomas de la enfermedad.
Las lesiones medulares, principalmente secundarias a traumatismos, son
70
una de las causas más frecuentes de patología neurológica en edades jóvenes.
No existe un tratamiento curativo para esta enfermedad incapacitante, por lo
que la posibilidad de utilizar células madre para restablecer las conexiones axo-
nales aparece como una estrategia especialmente atractiva. Estudios recientes
sugieren que las células madre embrionarias poseen la capacidad de diferenciarse a neuronas motoras y facilitar la recuperación motora en animales con
lesiones espinales24,25. Sin embargo, parece que el mecanismo por el cual di-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
chas células contribuyen a restablecer las neuronas motoras estaría relacionado
con la liberación de factores de crecimiento, que contribuirían al recrecimiento
de los axones destruidos. Otros tipos celulares, como las células de la glía envolvente o las células mesenquimales (o estromales) de la médula ósea también
han demostrado su capacidad para favorecer el recrecimiento de los axones tal
como se ha demostrado en modelos animales26-28.
La esclerosis múltiple es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada
por la degeneración de las células productoras de mielina (oligodendrocitos) y
que se manifiesta por una afectación tanto motora como sensitiva como consecuencia de la desmielinización de los axones. La posibilidad de favorecer la
formación de mielina mediante la utilización de células madre capaces de diferenciarse a oligodendrocitos ha sido explorada en modelos animales. Un estudio reciente ha podido demostrar en un modelo de esclerosis múltiple en ratón
(más concretamente de encefalitis autoinmune experimental), que la inyección
de neuroesferas (células madre neurales) tanto de forma intravenosa como intratecal promueve la remielinización multifocal. Indudablemente, estos resultados están muy lejos de justificar experimentos en pacientes, en una enfermedad, que aunque incapacitante, tiene una supervivencia prolongada29.
Por la gran incidencia y el elevado coste económico y humano que generan, los accidentes cerebrovasculares son uno de los objetivos más atractivos
para la terapia celular. Las evidencias recientes que indican la presencia de un
proceso de neurogénesis tras producirse una isquemia cerebral han estimulado
el interés por utilizar células madre para suplementar la regeneración autóloga
que se produce espontáneamente30,31. El beneficio de la terapia celular con células madres podría deberse al aporte exógeno de células con capacidad de
neurogénesis o de angiogénesis, o debido a la modulación del microambiente,
estimulando la supervivencia y diferenciación de las células residentes en el tejido dañado. El trasplante de células madre neurales en modelos de rata ha demostrado ciertos beneficios y de hecho se han realizado pequeños estudios en
humanos utilizando neuronas obtenidas a partir de una línea celular de teratocarcinoma32-34. Estudios realizados en animales sugieren que las células de médula ósea son reclutadas a las zonas de infarto cerebral y que contribuyen a la
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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
mejoría funcional cuando son inyectadas focalmente e incluso intravenosamente. La inyección de células se asocia con la formación de nuevos vasos, liberación de factores tróficos así como con la expresión de marcadores neurales por
parte de las células implantadas.
No son estas las únicas enfermedades neurológicas susceptibles de beneficiarse de la terapia celular con células madre, pero si las más frecuentes o las
que representan un paradigma, como es el caso de la enfermedad de Parkinson.
Terapia celular en enfermedades cardiovasculares
La cardiopatía isquémica es una de las causas más importantes de mortalidad
y morbilidad en el mundo occidental y un problema de salud pública. Dentro de
ésta, el infarto de miocardio tiene una especial trascendencia ya que el músculo
cardíaco posee una limitada capacidad de regenerarse, por lo que la necrosis de
una región lleva a la formación de una cicatriz fibrosa. Dependiendo del área a la
que afecte esta cicatriz, y debido a los mecanismos que condicionan el remodelado ventricular, el infarto puede llevar a una disminución progresiva e irreversible
de la función cardiaca, que conduce al síndrome de la insuficiencia cardíaca (IC).
La prevalencia de la IC en la población general en EEUU o el Reino Unido es del
orden del 1% y si nos fijamos en los mayores de 75 años oscila entre el 5 y
10%35. En los últimos años se han desarrollado nuevos tratamientos para la fase
aguda del infarto de miocardio (fibrinolisis, angioplastia primaria) que han tenido
un gran impacto en el pronóstico de estos pacientes pero que, desgraciadamente,
no han conseguido detener la evolución de la enfermedad que prosigue hasta el
desarrollo de la IC terminal. Para su tratamiento el único recurso real del que disponemos en la práctica clínica es el trasplante cardiaco, cuyas limitaciones más
importantes son la desproporción entre el número de donantes y receptores potenciales, así como la necesidad de tratamiento inmunosupresor de por vida.
La posibilidad de utilizar células madre para regenerar el músculo cardíaco destruido ha abierto enormes esperanzas para un número muy importante de
pacientes. Es probablemente en este campo donde la experiencia clínica es mayor, habiéndose publicado en la actualidad más de 20 ensayos clínicos de terapia celular en pacientes con infarto de miocardio. Por limitaciones de espacio
72
nos limitaremos a detallar los tipos de células empleadas y algunos aspectos
concretos de los resultados obtenidos (se han publicado excelentes revisiones
recientes en este sentido)36-40.
Diversos estudios, inicialmente en modelos experimentales y posteriormente en humanos, han utilizado las células madre del músculo para regenerar
el músculo cardíaco en pacientes con infarto de miocardio (mioblastos esqueléticos)41. La plasticidad de las células de músculo esquelético junto con su capacidad de responder a estímulos eléctricos sugieren la posibilidad de que células
musculares individuales (mioblastos) puedan ser convertidos en fibras musculares capaces de producir trabajo cardíaco (cardiomioplastia celular)42. Los estudios iniciales con mioblastos obtenidos de músculo esquelético han permitido
determinar que dichas células son capaces de injertar en el corazón de animales
de experimentación y contribuir a mejorar la función contractil del corazón 43
constituyendo la base de la aplicación de esta técnica en pacientes con infarto
de miocardio.
El grupo de Menasche ha sido pionero en la utilización de mioblastos esqueléticos, realizando el primer implante de mioblastos autólogos en un pacientes con un IM en junio del 200044. La estrategia diseñada por este grupo, y
posteriormente utilizada por otros grupos, consiste en la obtención de una biopsia muscular del propio paciente entre las 2-3 semanas previas a la cirugía de
revascularización en pacientes con IM antiguo. Durante la cirugía se procede al
implante por inyección intramiocárdica de las células cultivadas in vitro en la
región peri-infarto. Los estudios realizados por el grupo de Menasche y por
nuestro grupo han permitido demostrar la seguridad del procedimiento y su eficacia45,46. Otros grupos, de forma muy reciente, han utilizado una vía de administración percutanea, evitando por tanto la necesidad de la cirugía47. Tanto los
estudios en modelos experimentales como los estudios clínicos indican la capacidad de los mioblastos para implantarse y diferenciarse a células músculares
esqueléticas, Sin embargo, no se ha podido demostrar que las células originadas a partir de los mioblastos sean capaces de trasmitir las señales electromecánicas derivadas de las células musculares cardiacas o de transdiferenciarse a
células musculares cardíacas.
Estudios recientes apoyan la existencia de diferentes poblaciones celulares
en la médula ósea (MO) con capacidad de diferenciarse a fibras musculares
cardíacas, así como a células endoteliales, contribuyendo a la angiogénesis o
vasculogénesis48-53. En la mayoría de estos estudios los investigadores han utilizado poblaciones celulares heterogéneas, lo que limita de forma importante
las conclusiones, ya que no es posible determinar cuáles son exactamente las
células responsables del beneficio terapéutico. Frente a estudios en los que se
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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
73
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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
han utilizado células mononucleadas de MO48, el grupo de Anversa y Orlic ha
utilizado poblaciones seleccionadas de células madre hematopoyéticas de MO
(Lin- Kit+) demostrando la capacidad de dicha células de injertarse, diferenciarse a células musculares cardíacas y endoteliales y contribuir a la mejoría de
la función cardíaca.
Además de las células madre hematopoyéticas, en la médula ósea existen
progenitores y células madre angioblásticas, identificables por la presencia de
una serie de marcadores y antígenos celulares como CD34, AC133 o el receptor de VEGR tipo 2, expresados a su vez en células madre hematopoyéticas5357.
Estudios realizados en modelos animales de isquemia periférica e IM indi-
can que en la MO existen células madre endoteliales con capacidad de
contribuir a la neo-angiogénesis, favoreciendo la regeneración miocárdica49, 53,
58, 59.
Estas células madre endoteliales pueden ser movilizadas a sangre perifé-
rica y contribuir también a la angiogénesis en extremidades isquémicas59.
Las células madre mesenquimales (MSC) son capaces de diferenciarse a
tejidos mesodérmicos como osteoblastos, condrocitos, adipocitos o músculo esquelético60 pero, a su vez, estudios recientes indican que las MSC son capaces
de diferenciarse tanto in vitro como in vivo a cardiomiocitos48, 61. In vitro, el
cultivo de MSC en presencia del agente desmetilante 5-azacitidina induce diferenciación hacia células con características fenotípicas y electrofisiológicas de
músculo cardíaco62. Utilizando modelos animales de IM, varios grupos han demostrado que las células madre mesenquimales inyectadas en la cicatriz miocárdica no sólo son capaces de injertarse, sino que adquieren características de
cardiomiocitos y, lo que es más importante, contribuyen a mejorar la función
cardíaca48, 63.
A pesar del número de incógnitas existentes, la acumulación de resultados
derivados de los estudios preclínicos en los últimos 5 años ha impulsado el desarrollo de los primeros ensayos clínicos de factibilidad y seguridad de regeneración cardíaca con células madre. Tales ensayos hasta el momento no han estado desprovistos de cierto grado de controversia, derivada de la opinión de
distintos investigadores cuyo argumento es la falta de suficientes evidencias
que apoyen el inicio de la investigación clínica. No vamos a detenernos en argumentar las distintas posturas, sino en poner en perspectiva los esfuerzos clí-
74
nicos realizados. Hasta el momento se han publicado al menos 20 estudios clínicos en los que se han utilizado las vías percutánea, intracavitaria o
intramiocárdica, se han implantado células mononucleadas de médula ósea, cé-
lulas enriquecidas en progenitores hematopoyéticos o endoteliales o mioblastos
y los resultados se han monitorizado mediante técnicas de imagen y función
como resonancia, ecocardiografia o tomografía con positrones. Algunos estudios han utilizado pacientes controles con los que comparar los resultados entre
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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
los pacientes que han recibido células y los que no, pero en cualquier caso todos los pacientes han recibido además de las células tratamientos adicionales.
La acumulación de estos resultados apoya la continuidad de los estudios en
marcha y el desarrollo de nuevos ensayos clínicos.
Terapia celular en Oftalmología
La visión, junto con los otros sentidos, provee la relación con el mundo
exterior, y es de gran valor para la supervivencia de muchas especies animales
y tiene un gran valor para los hombres. A pesar de su importancia, sólo en algunas especies de anfibios se conserva una capacidad de regeneración importante de los tejidos del ojo. Es, por tanto, de gran valor conocer en profundidad
los distintos tipos de células madre del ojo y sus mecanismos de renovación y
regeneración, para intentar terapias capaces de recuperar los distintos tejidos
oculares que se pueden dañar. Las estructuras que tienen más interés desde el
punto de vista de la Medicina Regenerativa son el epitelio corneal, el epitelio
conjuntival y la retina.
La fuente de células del epitelio corneal son las células madre que se encuentran en la región del limbo corneal. Estas células, que se encuentran en la
zona de transición entre la córnea y la esclera, tienen todas las características
de las células madre, ya que poseen una gran capacidad de renovación, que se
mantiene a lo largo de la vida y son capaces de originar células hijas que pueden sufrir un proceso de diferenciación terminal a células especializadas (64).
Sin embargo, no se ha podido demostrar que estas células sean pluripotentes y
parece que sólo dan lugar a células del epitelio corneal y conjuntival. Actualmente no existe un marcador biológico definitivo de las células madre del limbo corneal, aunque se han propuesto varios, como la alfa-enolasa, y más recientemente el factor de transcripción p63, aunque ciertamente estos antígenos
pueden aparecer en otras células65.
En condiciones fisiológicas, las células madre del limbo corneal son capaces de suplir la necesidad de renovación de la córnea. Sin embargo, en algunas
situaciones patológicas, como traumatismos, quemaduras, sustancias químicas,
75
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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
síndrome de Stevens Johnson o penfigoide ocular, la capacidad de regeneración
de las células limbocorneales se ve desbordada (o se produce una disminución
o ausencia de éstas) y se origina un daño corneal permanente66. Aunque el trasplante de córnea es una opción, no es eficaz en los casos donde es necesario
restaurar el epitelio corneal. Kenyon y Tseng en 1989 fueron los primeros en
llevar a cabo un autotrasplante de limbo conjuntival67. Posteriormente, tras el
conocimiento de las células madre corneales, Kinoshita modificó la técnica para transplantar células madre del limbo corneal en conejos.
Actualmente el trasplante de limbo corneal es una práctica reconocida,
usándose células del ojo contralateral cuando el daño es en un solo ojo, y células de un donante cuando el daño es bilateral. Se pueden usar células histocompatibles de un donante vivo, o células no compatibles de donantes cadáver. La
posibilidad de expandir ex vivo estas células puede reducir el riesgo de deficiencia de células del limbo del ojo sano o del donante68. La combinación de
células del limbo con membrana amniótica se usa con éxito para promover una
rápida reepitelización de la córnea. En españa al menos 2 grupos de investigación (Vall d'Hebron y Clínica Universitaria) han implantado células madre limbocorneales con éxito en pacientes con insuficiencia limbocorneal completa,
resultando en la re-epitelización de la cornea con mejoría de la agudeza visual
de los pacientes.
La retina neural y el epitelio pigmentario de la retina se desarrollan durante el periodo postnatal temprano, y no hay evidencia de regeneración en la
edad adulta. Ha sido ampliamente documentada la presencia de células madre
en la retina de peces y anfibios. Sin embargo, hasta el año 2000 no se habían
identificado células progenitoras de la retina en mamíferos. Estas células se encuentran en muy baja frecuencia en la zona ciliar marginal y tienen muchas
propiedades asociadas con las células madre: son capaces de proliferar y expresan el marcador neuroectodérmico nestina, son multipotentes y pueden autorrenovarse. La identificación de células progenitoras de la retina abre la posibilidad de su uso para tratamiento en degeneraciones retinianas como la retinitis
pigmentosa, el glaucoma y la degeneración macular. El éxito del uso de células
madre retinianas para la regeneración de la retina depende de la posibilidad de
restaurar los complejos circuitos establecidos en la retina, ya que aunque el en-
76
tendimiento actual de las conexiones dentro de la retina es muy importante, se
conoce menos como se controla el proceso que lleva a estas conexiones entre
las células.
Además, se están llevando a cabo estudios experimentales con otros tipos
de células madre, como células madre neurales, células madre embrionarias,
células madre derivadas de la médula ósea, etc., que tratan de confirmar el potencial del trasplante de células madre en este contexto y contribuyen al cono-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
cimiento de los mecanismos de diferenciación y de integración de las células
transplantadas en la retina, que conduzca a un adecuado procesamiento visual.
Terapia celular en enfermedades musculares
El músculo ha sido reconocido recientemente como otra importante fuente
de células madre adultas. Las células progenitoras musculares más importantes
son las células satélite, que no sólo contribuyen a la regeneración de miofibras,
sino que se han demostrado capaces de diferenciarse en otras líneas celulares
como osteoblastos, condrocitos y adipocitos. Si embargo, además de las células
satélite, existen otras poblaciones de células madre en el músculo con un mayor potencial de diferenciación. El origen de estas células, bien existentes en el
músculo69 o procedentes de otros órganos como la médula ósea70, se desconoce
con precisión, pero en cualquier caso estas células serían las progenitoras de
las propias células satélite.
La mayoría de las lesiones musculares son reparadas espontáneamente,
sin que quede deterioro funcional, pero en algunas circunstancias, debido a la
importancia de la herida, ésta no cura completamente y se forma tejido cicatricial que impide la recuperación funcional completa. En estos casos, la curación de la lesión podría ser mejorada aumentando la regeneración de fibras
musculares e inhibiendo la fibrosis. El trasplante de células progenitoras musculares podría curar esas importantes lesiones. Muchos de los esfuerzos de los
investigadores que trabajan en patología muscular se centran en determinar la
forma de corregir miopatías congénitas tales como la distrofia muscular de
Duchenne, enfermedad caracterizada por la ausencia de expresión de distrofina, una proteína de membrana imprescindible para mantener la integridad estructural de las miofibras. A lo largo de la vida del enfermo se produce una
destrucción crónica del tejido muscular y aunque, inicialmente, las células satélites son capaces de regenerar el músculo, progresivamente van agotando su
capacidad de proliferar. El objetivo del tratamiento sería conseguir células
musculares con genoma normal capaces de formar miofibras que se injerten y
regeneren el músculo atrofiado.
77
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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
Se han utilizado modelos experimentales de enfermedad de Duchenne,
más concretamente en ratones mdx1 (ratones transgénicos deficientes en distrofina) para determinar la capacidad de distintos tipos de células madre de
contribuir a regenerar el músculo esquelético. De forma análoga a la regeneración cardíaca, los primeros estudios en modelos de distrofia muscular se
realizaron con mioblastos esqueléticos, es decir, células progenitoras musculares. Aunque los resultados iniciales en los año 90 no fueron positivos, permitieron determinar una serie de aspectos como la importancia de la inmunosupresión y la forma de administración de células que posteriormente han
sido de gran utilidad a la hora de diseñar estudios nuevos71. De forma más
reciente, distintos grupos han utilizado otras fuentes de células madre con la
esperanza de poder utilizar una vía sistémica de administración 72, 73. En estos
estudios se ha podido demostrar que utilizando células obtenidas de médula
ósea de ratones, un pequeño número de células contribuyen a formar fibras
musculares con expresión de distrofina. A pesar de intentos posteriores, el
grado de contribución de las células de médula ósea que se ha observado en
los distintos estudios hasta el día de hoy es muy escaso (menor del 1%). Una
de las principales limitaciones para el éxito de la terapia celular en pacientes
con distrofias musculares es la escasa supervivencia de las células una vez
implantadas, a pesar de que el implante se realice directamente en el músculo74, asi como el hecho de que el tratamiento se tendría que realizar entre un
donante y un receptor no idénticos y, por tanto, supeditado a problemas de
rechazo inmunológico.
Terapia celular en Traumatología
El organismo tiene una importante capacidad de reconstruir los huesos,
cartílagos y tendones dañados, gracias a la capacidad regenerativa de las células progenitoras presentes en las estructuras lesionadas. Por ahora estamos lejos
de conocer el origen y características fenotípicas de estas células progenitoras y
los factores que gobiernan la formación y remodelación de los huesos. A pesar
de este desconocimiento, ha sido posible la utilización de células maduras como forma de contribuir a la regeneración de tejidos óseos y cartilaginosos y,
78
concretamente, la utilización de células de cartílago cultivadas es un ejemplo
de cómo el autotrasplante de células maduras puede ser un tratamiento eficaz
para la reparación de la superficie articular75.
Más atractiva resulta la posibilidad de utilizar células madre con capacidad
de diferenciarse hacia tejidos de estirpe mesenquimal, como el hueso o el cartílago. Las células madre mesenquimales (MSC) se pueden obtener a partir de
médula ósea, pero también de grasa e incluso otros tejidos. Son capaces, in vi-
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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
tro, de autorenovarse y proliferar extensamente, sin perder su capacidad de diferenciarse hacia osteoblasto, condrocitos, adipocitos o incluso músculo esquelético según las condiciones en las que se cultivan. Estas cualidades han
permitido su utilización para la reparación de lesiones óseas extensas, normalmente utilizando algún tipo de soporte en la colocación de las células. Igualmente, también se han utilizado para tratar defectos cartilaginosos y lesiones
traumáticas, pudiendo sustituir a los injertos de condrocitos, con la ventaja de
su mayor capacidad proliferativa y de supervivencia, al no tratarse de células
maduras sino de progenitoras.
También se han utilizado células mesenquimales en el tratamiento de niños con osteogénesis imperfecta76. En este estudio, los niños recibieron tratamiento mediante trasplante alogénico, pudiendo demostrarse a los meses del
trasplante un mejoría muy significativa en la calidad y cantidad de tejido óseo
formado y demostrando la capacidad de las células mesenquimales injertadas
de generar osteoblastos y sintetizar nueva matriz ósea.
Terapia celular en enfermedades hepáticas
Un número importante de enfermos hepáticos puede curarse gracias al
trasplante hepático, que restituye un órgano enfermo por un órgano sano. De
igual forma que en otros tipos de trasplantes de órganos, las dificultades técnicas junto con la escasez de órganos hacen que el número de pacientes que se
benefician de esta terapéutica sea mucho menor que el número de potenciales
candidatos. La posibilidad de utilizar células madre de distintos orígenes, o incluso hepatocitos maduros modificados genéticamente, aparece como una alternativa de gran interés. Vaya por delante que no existen en la actualidad estudios clínicos de regeneración hepática con células madre y tan sólo se han
realizado algunos estudios clínicos utilizando el trasplante de hepatocitos con
escaso éxito. Sin embargo, existen estudios experimentales que sugieren la posibilidad de regenerar tejido hepático a partir de células madre.
Las células madre embrionarias tienen una indudable capacidad de diferenciarse en hepatocitos maduros in vitro; sin embargo, existen muy escasos
79
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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
estudios in vivo que hayan podido demostrar la eficacia de las células embrionarias en la regeneración hepática, existiendo además el problema de la generación de tumores a partir de dichas células embrionarias77.
La posibilidad de regenerar tejido hepático con células madre hematopoyéticas se describió por primera vez por el grupo de Petersen78 en el que observaron
la contribución de células de médula ósea a la regeneración del hígado a través
de la diferenciación hacia células ovales. Utilizando un modelo de ratón transgénico análogo a la tirosinemia humana tipo I, Lagasse demostró la capacidad de
las células madre hematopoyéticas de rescatar animales con dicha enfermedad,
con la consiguiente implicación clínica79. Aunque como ya hemos comentado no
existen estudios clínicos, sí que existen observaciones en pacientes sometidos a
trasplante de médula ósea en los que se ha podido demostrar que células derivadas del donante son capaces de adquirir características de células hepáticas, apoyando en humanos las observaciones de Lagasse y Petersen. La principal limitación de estos estudios es que datos posteriores, obtenidos por diversos grupos de
investigación, sugieren que la mayor parte de los fenómenos de regeneración hepática, observados a partir de células madre hematopoyéticas, se deben realmente
a la capacidad de fusión de las células trasplantadas con los hepatocitos existentes en el animal, y por tanto no a una auténtica transdiferenciación80. Aunque el
mecanismo que contribuye a la regeneración de los hepatocitos es de indudable
interés desde el punto de vista biológico, el hecho de que se trate de fusión celular o de auténtica transdiferenciación no disminuye su interés desde el punto de
vista clínico. Es decir, incluso en el caso de que las observaciones experimentales
de regeneración hepática se debieran mayoritariamente a fusión celular, sería posible que resultaran clínicamente beneficiosas en pacientes.
La existencia de un compartimento hepático de células madre ya se sugirió hace mas de 40 años81. Las células ovales fueron las primeras candidatas a
células madre hepáticas. Localizadas en los canales de Hering, son células madre multipotenciales capaces de diferenciarse a hepatocitos así como a epitelio
ductal, y poseen algunos antígenos comunes con células de médula ósea. Sin
duda esta población celular tiene cierta capacidad de regeneración hepática, pero a día de hoy permanece sin definir si realmente su origen está en el hígado
o, por el contrario, derivan de células de la médula ósea.
80
Estudios recientemente publicados sugieren que una población de células madre bien caracterizada, como las células madre mesenquimales, pueden contribuir a
la regeneración hepática. Como hemos mencionado anteriormente, la principal fuen-
te de células madre mesenquimales es la médula ósea, si bien es posible derivar dichas células a partir de otros tejidos, como la grasa. Son células no hematopoyéticas
de origen mesodérmico en las que, al menos in vitro, se ha podido demostrar su capacidad de diferenciarse a hepatocitos maduros y funcionales(82). El potencial in vivo
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
de esta población de células madre no esta definido en la actualidad.
CONCLUSIONES
A lo largo de las paginas anteriores hemos tratado de presentar una perspectiva general, quizá un poco superficial, de lo que la terapia celular y las células madre podrían representar en el futuro. No tenemos ninguna duda de que
las posibilidades son enormes, pero sin embargo es muy importante que seamos conscientes de que estamos todavía muy lejos de alcanzar el objetivo de
utilizar clínicamente esta nueva herramienta. Este es el mensaje más importante que queremos trasmitir: a pesar de las enormes expectativas que existen para
pacientes con enfermedades incurables, es imprescindible eludir el optimismo
exagerado y continuar desarrollando una investigación de calidad científica que
nos permita alcanzar nuestros objetivos.
No sabemos si la terapia celular llegará a curar la diabetes o la enfermedad de Parkinson, pero si lo hace seguro que no será en los próximos 5 años,
ni con células madre adultas ni con células madre embrionarias. Los obstáculos
existentes son enormes, y es responsabilidad de los médicos e investigadores
no manipular ni trasmitir esperanzas erróneas e infundadas a los pacientes, que
a la larga se volverán contra nosotros.
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
87
AVANCES EN TERAPIA REGENERATIVA
María Dolores Herreros Marcos, Isabel Pascual Migueláñez, Jacobo Trébol López,
Damián García Olmo
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Avances en terapia regenerativa
Cátedra UAM-CELLERIX de Terapia Celular y Medicina Regenerativa
Unidad de Terapia Celular del Hospital Universitario La Paz de Madrid
El término de célula madre se ha hecho tan popular dentro y
fuera del foro científico que, en ocasiones, puede parecer
que pierde credibilidad. Por esto es tan importante respetar
las normas del rigor científico, por un lado, y filtrar la
información que nos llega, por otro, de manera que nuestra
investigación parta de una base completamente revisada.
En este artículo se ha realizado una actualización de la
literatura con dos objetivos: conocer cada uno de los tipos
de células madre existentes y las ventajas e inconvenientes
que presentan; saber cuál es la aplicación clínica en
humanos que tienen este tipo de células, basándonos en la
revisión de los ensayos clínicos en fase I y II publicados en
la literatura.
INTRODUCCIÓN
El término célula madre o célula troncal (stem cell) se utiliza para definir una
célula indiferenciada con capacidad de autorregeneración que, a su vez, puede dar
lugar a diferentes líneas de células especializadas. Es decir, son células con capacidad de división asimétrica (Fig. 1). Se describieron inicialmente en el embrión y
son el origen de todas las líneas celulares somáticas y germinales que conformarán el nuevo organismo (células madre embrionarias totipotenciales); desde el año
2001 se están describiendo células con características semejantes en diferentes tejidos del organismo adulto (células madre adultas) (Silvester et al 2004).
Se conoce como terapia celular al método que intenta curar enfermedades
con el uso de células vivas. El concepto de Medicina Regenerativa sugiere la
89
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Avances en terapia regenerativa
posibilidad de obtener
en el laboratorio, a
Autorrenovación
partir de las células
madre, órganos con
todas sus funciones.
Sin embargo, existen
todavía barreras importantes en este camCélula madre
po; algunas de ellas
son puramente técnicas o de laboratorio
(desarrollo de mejores
Célula diferenciada
procedimientos de selección y cultivo de
Figura 1. Representación
células) y otras son las barreras que podríamos llamar fisiopatolóesquemática del concepto
gicas o médicas (como la posibilidad de inmunotolerancia de las
de reproducción
células. Salvar este problema de inmunotolerancia supondría poder
asimétrica que caracteriza
realizar trasplantes celulares alogénicos sin necesidad de inmunoa las células madre.
supresión).
En este artículo se intentará contestar a dos preguntas que resultan fundamentales para evaluar en qué momento se encuentra actualmente la terapia regenerativa:
–¿Qué tipo de células madre son mejores para el uso terapéutico en humanos?
–¿Cuáles son los últimos avances en terapia regenerativa en humanos?
¿QUÉ TIPO DE CÉLULAS MADRE SON MEJORES PARA EL USO
TERAPÉUTICO EN HUMANOS?
90
Las células madre embrionarias se obtienen a partir de un blastocisto. Una
vez aisladas de la masa celular interna del embrión en este estadio pueden
mantenerse en cultivo de forma indiferenciada porque se dividen indefinidamente. Teóricamente podrían constituir una fuente de progenitores de células
de las tres capas embrionarias: endodermo, ectodermo y mesodermo (células
pluripotenciales). Sin embargo, no pueden ser usadas en clínica al menos por
cuatro graves problemas: son cancerígenas, generan problemas de histocompa-
tibilidad, requieren un gasto imposible de asumir para las patologías que se
pretenden tratar y plantean problemas éticos de gran complejidad.
Las células madre adultas se encuentran en tejidos órgano-específicos después del nacimiento. Al principio se pensó que las células progenitoras existen-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Avances en terapia regenerativa
tes en los tejidos adultos estaban predeterminadas para generar exclusivamente
un tipo de célula especializada de ese tejido. Por ello se las llamó células multipotenciales. Así, por ejemplo, las células progenitoras de las criptas intestinales solo podrían formar células del epitelio intestinal. Sin embargo, en sucesivos experimentos se ha comprobado que hay células madre en tejidos adultos
con capacidad de transdiferenciación, es decir, que son capaces de dar lugar a
múltiples líneas celulares de las tres capas embrionarias. De esta manera, estas
células podrían ser consideradas verdaderas células pluripotenciales. Un buen
ejemplo de ello es que a partir de células madre de la médula ósea se han obtenido líneas celulares como condrocitos, miocitos o neuronas (Conrad et al.
2005).
El uso de células autólogas (del mismo sujeto) o alogénicas (de la misma
especie) obtenidas de sujetos adultos parece suponer un camino más sencillo y
seguro para la terapia celular. Por ello hay que señalar que, hoy por hoy, el uso
de las células madre de origen embrionario está alejado de la clínica humana,
por lo que la única fuente celular en la Medicina Regenerativa actual son los
tejidos del propio ser humano adulto. Actualmente hay cinco fuentes de células
madre de uso clínico: la médula ósea, la sangre periférica, el cordón umbilical,
la biopsia muscular y la grasa (lipoaspirados). La siguiente cuestión es averiguar cuál es el mejor tejido donante.
La capacidad de algunas células del estroma de la médula ósea para diferenciarse también en otras líneas celulares no hematopoyéticas está hoy bien
documentada. Ha sido demostrado por varios autores (Pittenger et al 1999) que
estas células pueden diferenciarse in vitro evolucionando a osteoblastos, condrocitos o adipocitos en función de los factores de crecimiento que se utilicen
para estimularlas. También es interesante la posibilidad de que estas células,
tras entrar en la circulación, puedan migrar a otros lugares del cuerpo donde
pueden diferenciarse y reparar tejido dañado. Puede que, en el futuro, el tratamiento consista únicamente en usar citocinas para incrementar la salida a la
circulación de las células madre de la médula ósea, tal y como han mostrado
resultados prometedores en modelos murinos (Orlic et al. 2003). Por otro lado,
no debe olvidarse que el uso de citocinas como factores estimulantes de colo-
91
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Avances en terapia regenerativa
nias se ha visto asociado a efectos secundarios que aún hoy son difíciles de
predecir. El problema es que para obtener poblaciones celulares de la médula
ósea es necesario realizar varias punciones bajo anestesia, que comportan molestias y riesgos.
Desde 1980 ha sido posible movilizar estas células a la sangre periférica
donde pueden ser recogidas por aféresis, un procedimiento que es más práctico, menos doloroso y asociado a menor riesgo que las punciones (Lewis et al.
2005). Por otro lado, se ha comunicado que las células madre procedentes de
sangre periférica desarrollan el injerto de neutrófilos y plaquetas más rápidamente reduciendo el riesgo de infección o hemorragia en el tratamiento de la
enfermedad hemato-oncológica.
El transplante de células de cordón umbilical en adultos presentan las siguientes ventajas respecto a las derivadas de médula ósea (Chao et al. 2004): 1.
Fácil disponibilidad (se pueden tener en depósito perfectamente testadas y con
la tipificación de HLA para su uso inmediato); 2. No existe riesgo para madres
y donantes; 3. Posibilidad escasa de transmitir infecciones, particularmente citomegalovirus; 4. Pocas posibilidades de desarrollar enfermedad de injerto contra huésped; 5. Criterios menos estrictos para el cruce de HLA; 6. El donante
no sufre una agresión. Este tratamiento se ha utilizado sobre todo en enfermedades hematológicas como leucemia mieloide crónica, leucemia aguda o síndromes mielodisplásicos. El transplante de células madre del cordón umbilical
expandidas ex vivo está todavía en experimentación.
El crecimiento y la regeneración del músculo tras una agresión del mismo
denotan la existencia de células musculares progenitoras en este órgano (Jankowski et al 2004). Se ha defendido la idea de que la miogénesis es atribuible
a precursores musculares circulantes, habiéndose demostrado en algunos trabajos que esta labor la realizan células madre dependientes del músculo y también de la médula ósea. Esta vía sistémica todavía se encuentra en investigación, ya que no se ha logrado evitar las pérdidas celulares para conseguir que
las células cumplan su objetivo. En cualquier caso, la biopsia muscular se ha
mostrado como una buena fuente de células madre (Herreros et al 2003).
El tejido adiposo, como la MO, deriva de la hoja embrionaria mesodérmica y contiene estroma que puede ser aislado fácilmente. Aquí se han identifica-
92
do células madre denominadas células madre derivadas de lipoaspirado
(CMDL) (Zuk et al. 2001 y 2002). El proceso de aislamiento de esta población
de células madre fue descrito por primera vez por Rodbell en 1964. Más tarde
el procedimiento fue
mejorado por varios
grupos de investigación y, finalmente, las
células fueron caracterizadas como células
madre por el equipo
de Hedrick del "Laboratorio de Bioingeniería y Reparación Regenerativa" del Servicio
de Cirugía de la Universidad de California
de Los Ángeles (Zuk
et al. 2001).
Figura 2. Células
Estas células, al igual que las células madre mesenquimales de
mesenquimales
la MO, pueden evolucionar hacia líneas osteogénicas, adipogéniprocedentes de
cas, miogénicas y condrogénicas. Lo más sorprendente es que tamlipoaspirados en cultivo.
bién pueden diferenciarse en células de características neuronales
(Ashjian et al. 2003). Muestran una caracterización muy similar a
las derivadas de MO (CD29, CD44, CD71, CD90, CD13, CD105, SH-3 y
STRO-1) pero también algunos marcadores específicos (CD49d, CD106,
CD54, CD 34) (De Ugarte et al. 2003). No se han observado diferencias significativas entre los dos tipos de células respecto a la adherencia estromal, el
crecimiento, la senescencia celular, la capacidad de diferenciarse en diferentes líneas celulares y la eficiencia en la transducción genética (De Ugarte et
al. 2003). El proceso de obtención se inicia con una liposucción al paciente
que se realiza bajo anestesia local o sedación. El lipoaspirado se somete a un
proceso de laboratorio mediante el cual se aíslan las células adecuadas; éstas
se cultivan a 37º C hasta que el crecimiento alcanza la subconfluencia (Fig.
2). En ese momento pueden emplearse terapéuticamente o ser criopresevadas
para su uso posterior. Este método presenta las siguientes ventajas respecto al
necesario para obtener células de médula ósea: 1. Es seguro; 2. La grasa es
un tejido de fácil acceso; 3. Es menos molesto y agresivo que las punciones
medulares; 4. Puede realizarse bajo anestesia local; 5. Las células pueden
criopreservarse (Mizuno et al. 2003).
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Avances en terapia regenerativa
93
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Avances en terapia regenerativa
Por todo esto, desde nuestro punto de vista de clínicos, las células madre
derivadas de lipoaspirado superan incluso a las de médula ósea a la hora de
utilizarlas en terapia humana. Como cirujanos, el método de obtención nos
resulta sencillo y cotidiano, pero puede ser igualmente alcanzable para cualquier especialista que cuente con un cirujano plástico o general en su centro
de trabajo.
Al revisar la literatura actual sobre las células madre derivadas de lipoaspirado, se observa que la mayoría de los trabajos publicados se centran en su
caracterización en el laboratorio o en ensayos realizados en animales. De hecho, sólo se ha comunicado un ensayo clínico realizado en humanos (García
Olmo et al. 2005). Esto significa que, a pesar de su manejabilidad y fácil obtención, el clínico todavía no se ha acostumbrado a este tipo de células, posiblemente por desconocimiento o rutina.
Ahora bien, este modelo celular se está analizando ampliamente en modelos experimentales. Se han comunicado estudios en animales que utilizan
CMDL como vehículo de determinados genes. Dragoo y cols. (Dragoo et al.
2003, 2005) aislaron células madre derivadas de lipoaspirado de la grasa subcutánea y de la almohadilla infrapatelar y las cultivaron en un medio osteogénico. La mitad de estas células fueron transfectadas con un adenovirus con el
cDNA para la proteína morfogenética básica (BMP-2). Las células, inmersas en
una matriz de colágeno I, fueron inyectadas en una pata trasera de ratones inmunodeficientes; la otra pata fue inyectada con CMDL no modificadas genéticamente. Tras 6 semanas se comprobó que en la pata donde se inyectaron las
células transfectadas, el hueso tenía una mineralización adecuada y comenzaba
a establecer la cavidad medular.
Por otro lado, Martinez-Estrada y cols. (Martinez-Estrada et al. 2005) consiguieron diferenciar CMDL en EPC (células progenitoras endoteliales postnatales) cultivándolas en un medio hematopoyético. El primer marcador que expresaron fue Flk-1, y progresivamente Ve-caderina y factor de Von Willebrand.
Dado que el bajo número de EPC en la circulación limita su uso en Medicina,
las CMDL pueden ser un gran apoyo.
Además, es muy prometedor el efecto anti-inflamatorio que presentan las
CMDL. Se ha comparado (Puissant y cols. 2005) el efecto de las células madre
94
derivadas de médula ósea con las CMDL. Las CMDL no provocaron in vitro
"alorreactividad" frente a linfocitos incompatibles, es más, lograron suprimir la
reacción linfocitaria mixta (MLR) y la proliferación linfocitaria como respuesta
a mitógenos. Cuando las CMDL y los linfocitos fueron separados por una
membrana permeable estos hallazgos no se repitieron, lo que hace pensar que
es necesario el contacto celular para desencadenar esta reacción. Aquí surge
una nueva idea respecto a la posibilidad de utilizar estas células de manera alo-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Avances en terapia regenerativa
génica a partir de un banco de donantes.
En esta línea, otro estudio (Aust et al 2004) investigó el rendimiento celular por milímetro cúbico de lipoaspirado y los marcadores de superficie que determinan su fenotipo. Se recogió el producto de lipoaspirado de 18 donantes
mujeres, registrando su edad e índice de masa corporal (BMI). El rendimiento
celular medio fue de 404.000±206.000 células por milímetro de lipoaspirado,
de manera inversamente proporcional al BMI pero no a la edad. Las CMDL
eran positivas homogéneamente para CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e,
CD59, CD90 y HLA-ABC; y homogéneamente negativas para CD11b, CD45 y
HLA-DR. La ausencia del marcador panhematopoyético CD45 indica que las
células no derivaban de células madre circulantes. El hecho de obtener una población tan homogénea procedente de múltiples donantes refuerza también la
idea del empleo alogénico en un futuro.
Por último, Morizono y cols. (Morizono et al. 2003) examinaron la infección de las CMDL con vectores como adenovirus, oncoretrovirus y lentivirus,
demostrando la posibilidad de transfectarlas con lentivirus. Las células mantienen la expresión transgénica tras diferenciarse en líneas adipogénicas y osteogénicas. Así, las CMDL y un vector como el lentivirus pueden ser una buena
combinación como vehículo de la terapia génica.
Para utilizar las células en humanos se han desarrollando ensayos de bioseguridad. Para llegar a realizar estudios en humanos las células se han sometido a estudios de caracterización por inmunofluorescencia y de crecimiento. Existe un trabajo en la literatura en el cual se ha comunicado que, tras mantenerlas en cultivos
durante mucho tiempo, las CMDL pueden experimentar una transformación neoplásica capaz de desarrollar tumores en el ratón (Rubio et al. 2005). La posibilidad de transformación neoplásica de CMDL humanas in vitro se vio en cultivos
en los que se permitió el crecimiento más allá de la subconfluencia, manteniéndolos incluso más de dos meses después del aislamiento celular. En estas células se
demostró la transformación neoplásica mediante el estudio del cariotipo, que confirmó la existencia de cambios en el DNA. Se observó, además, que eran células
de crecimiento anómalo o no controlado, capaces de desarrollar tumores al inocularse en ratones inmunodeprimidos. Por otro lado, de manera paralela, se cultiva-
95
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Avances en terapia regenerativa
ron CMDL evitando el crecimiento más allá del 85% de confluencia celular. En
estas células también se estudió el cariotipo y se inocularon después en ratones
deficientes, observándose ausencia de alteraciones en el DNA y de desarrollo de
tumores en los animales. Ésta es la razón por la cual nuestro grupo siempre ha utilizado células del pase 3 o menor, antes de que las células lleguen a la subconfluencia. No hemos observado ningún caso de reacciones de rechazo ni transformación tumoral. Por otro lado, la terapia con células madre derivadas de
lipoaspirado, que nuestro grupo utiliza en el tratamiento de fístulas en humanos,
se ha demostrado tan segura que ha sido aprobada por la Agencia Europea del
Medicamento (EMEA) para que este "producto" sea considerado un medicamento
huérfano ("orphan drug"). Además, este ensayo clínico está registrado en Clinicaltrials.gov, ID: NCT00115466) para el tratamiento de la fístula perianal compleja.
¿CUÁLES SON LOS ÚLTIMOS AVANCES EN TERAPIA
REGENERATIVA EN HUMANOS?
El uso de células madre como terapia en humanos se está extendiendo rápidamente en distintos campos de la Medicina. Los grupos que investigaban las
enfermedades hematológicas fueron pioneros al iniciar este camino. Actualmente, los oncólogos trabajan en íntima colaboración con los hematólogos para
tratar enfermedades proliferativas con stem cells. Se ha comunicado un estudio
en fase I/II sobre el tratamiento del cáncer de ovario (Frickhofen et al. 2006).
Este tipo de tumor es quimiosensible, pero la mayoría de los pacientes mueren
por la progresión del mismo. La quimioterapia cura el 25% de los pacientes,
por ello está justificado el tratamiento con altas dosis. Se incluyeron 48 pacientes con cáncer de ovario intratable realizándose una movilización de células de
sangre periférica con ciclofosfamida y paclitaxel. Posteriormente las pacientes
se sometieron a dos ciclos de altas dosis de quimioterapia con carboplatino/paclitaxel y carboplatino/melfalan/etoposido. A los 8 años la supervivencia libre
de enfermedad fue de 13,3 meses y la supervivencia global de 37 meses.
La imposibilidad de regeneración de los miocardiocitos en la enfermedad
isquémica supone el fallo cardíaco congestivo postinfarto y el deterioro de la
96
función del ventrículo izquierdo. Tras demostrar que las células madre procedentes de la médula ósea y de la sangre periférica son capaces de evolucionar a
miocardiocitos bajo las condiciones adecuadas, se están utilizando como tera-
pia de la cardiopatía isquémica dentro de varios ensayos clínicos (Schachinger
et aml 2006) (Bardoff et al. 2006) (Emanueli et al. 2005) (Thorin-Trescases et
al. 2005). Este tratamiento parece reemplazar a los miocardiocitos, desarrollar
neoangiogénesis y conseguir la remodelación de la cicatriz. También se ha
comparado el efecto de stem cells derivadas de médula ósea frente a las derivadas de sangre periférica, asociándose a las primeras una mejoría significativa
de la eyección del ventrículo izquierdo a los tres meses (Assmus et al. 2006).
Las grandes heridas de los quemados se presentan como otro ejemplo de
terapia celular. Gracias a células madre procedentes de la médula ósea se ha
conseguido una recuperación precoz tanto de las áreas quemadas, como de las
zonas donde se extrajeron los autoinjertos libres de piel (Rasulov et al. 2005).
Se ha comunicado el tratamiento satisfactorio de úlceras del limbo ocular
en pacientes diabéticos. Tras realizar una inyección en el limbo ocular de células madre derivadas de sangre periférica en los pacientes del grupo de tratamiento se encontró una tasa de cicatrización completa del 77,8% frente a un
38,9% de los pacientes tratados con placebo (Huang et al. 2005).
En casos severos de enfermedades autoinmunes se están utilizando ciclos
de altas dosis de quimioterapia seguidos de transplante de células hematopoyéticas. Los estudios en fase I y II realizados en 473 pacientes mostraron una
mortalidad del 11% debido a una complicación del transplante o a la progresión de la enfermedad. El 71% de los pacientes respondieron a la terapia con
una franca mejoría de la enfermedad (Gratwohl et al. 2005).
Una de las líneas de investigación de nuestro equipo es el tratamiento de
fístulas en humanos con células madre derivadas de lipoaspirado. Hemos desarrollado un estudio en fase I, con el objetivo de demostrar que la terapia es segura y factible, y un estudio en fase II para conocer la eficacia.
Los resultados del estudio en fase I ya han sido comunicados (García-Olmo et al. 2005). Se reclutaron cinco pacientes desde abril del 2002 a noviembre del 2003, tres hombres y dos mujeres. Se realizaron nueve implantes celulares, 4 en fístulas rectovaginales, 4 en fístulas enterocutáneas (tres fístulas en
el mismo paciente) y uno en una fístula perianal supraesfinteriana. El seguimiento mínimo exigido en el protocolo fue de 8 semanas. Finalmente se inocularon con CMDL pase 3 o menor nueve fístulas de cuatro pacientes. Ocho de
las fístulas fueron consideradas como evaluables y fueron seguidas durante un
mínimo de ocho semanas (Tabla 1). Se logró ausencia de supuración y el cierre
del orificio externo con reepitelización a la octava semana en seis fístulas
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Avances en terapia regenerativa
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Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Avances en terapia regenerativa
Figura 3. Procedimiento
para el tratamiento de las
98
fístulas en el ensayo
clínico en fase I.
(75,0%); estos pacientes se consideraron
curados. Las otras dos
fístulas sólo mostraron un cierre parcial
del orificio externo
con disminución del
flujo, según refirieron
los pacientes, pero
con ausencia de reepitelización. Estos dos
pacientes fueron considerados no curados
(25,0%).
Actualmente se
han cumplido más de
dos años de seguimiento en todos estos
pacientes y ninguno
de los considerados
curados ha presentado
una recidiva de la fístula. No existió relación entre el número
de células inyectadas
y la reepitelización.
No existió relación
entre el sexo y la
edad de los pacientes
y la curación.
Los procedimientos quirúrgicos y de
implantación se realizaron de manera habitual y sin dificultades técnicas añadidas debidas a la inyección celular de las nueve fístulas
tratadas (Fig. 3). No se observaron efectos adversos en ninguno de
los 9 implantes.
Tabla 1. Resumen de los resultados clínicos el fase I. NE, no evaluable; NI, no implantado
Nº
implante
Nº
paciente
Tipo de
fístula
Nº
pase
Días
cultivo
Nº células
(x106)
Resultado
1
001
Rectovaginal
1
6
6.1
Curado
2
002
Enterocutanea
1
9
9.0
Curado
3
002
Enterocutanea
1
7
8.0
NA
NI
003
Perineal
1
NE
NI
NA
4
002
Rectovaginal
2
14
10.0
No curado
5
002
Enterocutanea
2
8
3.5
Curado
6
001
Rectovaginal
1
12
20.0
Curado
7
004
Enterocutanea
2
16
30.0
No Curado
8
005
Perineal
2
31
20.0
Curado
9
002
Enterocutanea
3
12
15.0
Curado
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Avances en terapia regenerativa
No se han observado efectos adversos a largo plazo ni aparición de tumores u otras enfermedades en los dos años siguientes a la aplicación de las células (Tabla 1).
Por otro lado, hemos concluido el ensayo clínico en fase II que analiza la
eficacia de la terapia con células madre derivadas de lipoaspirado para el tratamiento de fístulas perianales complejas, que está pendiente de publicación.
Para concluir, ha quedado claro que el tratamiento con células madre adultas es una de las líneas de investigación más prometedoras actualmente. Lo
más importante es la gran aplicación clínica que posee, que esperamos que siga
desarrollándose a este ritmo casi vertiginoso, aunque siempre dentro de las normas de buena praxis clínica y siguiendo el máximo rigor científico.
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Avances en terapia regenerativa
101
NANOBIOTECNOLOGÍA: HERRAMIENTAS
DIAGNÓSTICAS Y TERAPÉUTICAS
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
Laura M. Lechuga. Grupo de Biosensores. Centro Nacional de Microelectrónica (IMM-CNM). CSIC
La Nanobiotecnología, convergencia entre la Nanotecnología
y la Biotecnología, es la rama de la Nanotecnología que se
perfila como la de mayor impacto en un futuro próximo
debido a sus importantes aplicaciones, especialmente,
diagnósticas y terapéuticas. La detección temprana de
enfermedades, su tratamiento precoz a nivel personalizado
y el posterior seguimiento de su evolución serán posibles en
los próximos años gracias a la aplicación de las herramientas
nanobiotecnológicas que se están actualmente
desarrollando. Los importantes avances en este campo
podrían dar lugar a sistemas de diagnóstico y terapéuticos
de mayor eficacia que los existentes, lo que redundaría en
una mayor calidad de vida para los ciudadanos.
INTRODUCCIÓN: ¿QUE ES LA NANOBIOTECNOLOGÍA?
Desde hace unos años, la Nanotecnología se esta perfilando como un área
emergente en ciencia y tecnología y todo indica que esta disciplina nos conducirá
a una nueva revolución industrial. La Nanotecnología hace referencia a las técnicas que permiten manipular la materia a escala atómica y molecular. Nano- significa la milmillonésima parte de un metro. Lo mas interesante de la Nanotecnología no es la posibilidad de trabajar con materiales de reducidas dimensiones, sino
el cambio a menudo radical que sufren las propiedades físicas y químicas de la
materia cuando se trabaja a escala nanométrica: la conductividad eléctrica, el color, la resistencia, o la elasticidad, entre otras propiedades, se comportan de manera diferente a como lo hace el material volumétrico (ver Figura 1).
La Nanotecnología tiene gran aplicación en diferentes campos, entre los
que destacan los materiales, la electrónica, la Medicina y la energía. Así, ya se
103
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
104
está avanzando en
conseguir materiales de mayor dureza y resistencia,
ordenadores más
veloces y con mayor capacidad gracias a los microprocesadores con
componentes nanotecnológicos, diagnósticos médicos
más eficaces o
energía abundante
a bajo coste y respetuosa con el meFigura 1. Comparativa de
tamaños entre el mundo
dio ambiente. Actualmente ya existen productos “nanotecnológicos”
natural y el mundo artificial
en el mercado como cosméticos más eficaces y protectores, raquetas
desarrollado mediante
de tenis más flexibles y resistentes o gafas que no se rayan, por citar
Micro y Nanotecnología.
algunos ejemplos.
La irrupción de la Nanotecnología en la Biotecnología y en la Medicina ha
dado lugar a una nueva disciplina que se denomina Nanobiotecnología y que sin
duda constituirá uno de los pilares básicos de esta nueva revolución industrial.
La Nanobiotecnología se define como la aplicación de herramientas, componentes y procesos de la Nanotecnología al campo de la salud, lo que frecuentemente se denomina también como Nanomedicina, permitiendo el desarrollo de herramientas para diagnosticar, prevenir y tratar enfermedades cuando
están todavía en estados poco avanzados o en el inicio de su desarrollo. La Nanomedicina estudia interacciones a la nanoescala (1 a 100 nm) y para ello utiliza dispositivos, sistemas y tecnologías que incluyen nanoestructuras capaces de
interactuar a escala molecular y que se interconectan a nivel micro para interaccionar a nivel celular. Uno de los grandes retos en este proceso reside en el
desarrollo de “nanoterapias”, dirigidas específicamente a los tejidos y órganos
enfermos, evitándose dañar a las células sanas circundantes.
En nuestro mundo industrializado se está observando un progresivo aumento
de graves enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la
diabetes o las enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer y Parkinson), para
las que no existen tratamientos definitivos. Por otra parte, debido a la mayor calidad de vida y al aumento de la esperanza de vida, hay un progresivo envejecimiento de la sociedad y una mayor incidencia de enfermedades crónicas, lo que
está significando un considerable aumento del gasto de la sanidad pública.
Es evidente que necesitamos nuevos métodos diagnósticos y terapéuticos
que sean más rápidos, eficaces y específicos que los actuales y que, además,
reduzcan al máximo los costes de los análisis y los servicios. La Nanomedicina
promete resolver algunos de estos grandes retos mediante la capacidad de detectar de forma precoz la presencia de enfermedades (como el cáncer) o la capacidad de regenerar los órganos y tejidos que estén dañados dentro del organismo, proporcionado un diagnóstico precoz, una terapia adecuada y un
seguimiento posterior efectivo de la evolución del paciente. En un futuro próximo se podrá incluso disponer de tratamientos individualizados a distancia en el
propio hogar o lugar de trabajo del paciente.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
NANOMEDICINA
La Nanomedicina agrupa tres áreas principales: el nanodiagnóstico, la liberación controlada de fármacos y la medicina regenerativa, tal como se detalla en la
Figura 2. El nanodiagnóstico desarrolla sistemas de análisis y de imagen para detectar una enfermedad o un mal funcionamiento celular en los estadios más tempranos posibles tanto in vivo como in vitro. Los nanosistemas de liberación de fármacos transportan los medicamentos sólo a las células o zonas afectadas para
conseguir un tratamiento más efectivo y con menos efectos secundarios
Figura 2. Áreas de
y, además, protegiendo al fármaco de la degradación antes de llegar a
investigación en
su destino. La medicina regenerativa pretende reparar o reemplazar teNanomedicina.
jidos y órganos dañados aplicando
herramientas nanobiotecnológicas.
A continuación se detalla el
nivel de desarrollo que se ha conseguido hasta la fecha principalmente en el área de nanodiagnóstico, así como las principales lineas
de investigación futuras.
105
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Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
Nanodiagnóstico
El objetivo del nanodiagnóstico es identificar la aparición de una enfermedad en sus primeros estadios a nivel celular o molecular e idealmente al nivel
de una sola célula, mediante la utilización de nanodispositivos (nanobiosensores, biochips de ADN, laboratorios-en-un-chip, nanopinzas, nanosondas...). De
esta forma se conseguiría una capacidad de respuesta más rápida para comenzar
el tratamiento adecuado de cada enfermedad o bien de reparar o recrecer los tejidos y órganos dañados, lo que ofrecería mayores posibilidades de curación.
Los nanosistemas de diagnóstico se pueden aplicar in vitro o in vivo. En
aplicaciones de diagnóstico in vitro, los nanodispositivos son capaces de detectar con gran rapidez, precisión y sensibilidad la presencia de patógenos o defectos en el ADN a partir de volúmenes muy reducidos de muestras de fluidos
corporales o de tejidos. En aplicaciones de diagnóstico in vivo, se pueden desarrollar dispositivos biocompatibles que, por ejemplo, puedan penetrar en el
cuerpo humano para identificar estadios iniciales de una enfermedad, identificar y cuantificar la presencia de un determinado patógeno o de células cancerígenas, etc.
La principal área del nanodiagnóstico son los nanobiosensores, dispositivos capaces de detectar en tiempo real y con una alta sensibilidad y selectividad agentes químicos y biológicos.
Biosensores
Desde que en el año 1962 surgió el primer concepto de biosensor (biosensor de glucosa, Clark, 1962), el campo de investigación sobre biosensores ha
ido creciendo de forma exponencial hasta convertirse en un área fundamental
de trabajo. La masiva introducción en el mercado de los biosensores de glucosa, que son utilizados diariamente por miles de personas en todo el mundo, supuso la prueba más concluyente de la utilidad de la tecnología biosensora, al
ayudar a miles de enfermos diabéticos a mantener una mejor calidad de vida.
Un biosensor se puede definir como un dispositivo compuesto por dos
106
elementos fundamentales: un receptor biológico (por ejemplo proteínas, ADN,
células,...) preparado para detectar específicamente una sustancia basado en la
gran especificidad de las interacciones biomoleculares y un transductor o sen-
sor, capaz de interpretar la reacción de reconocimiento biológico
que produce el receptor
y “traducirla” en una
señal cuantificable. En
la Fig. 3 se muestra el
esquema básico de funcionamiento de un biosensor.
Figura 3. Esquema del
Los dos constituyentes del biosensor están integrados conjuntafuncionamiento de un
mente y es precisamente esta íntima unión de dos mundos opuestos
biosensor.
(el “vivo” y el “inerte”) la que le confiere a los dispositivos biosensores sus especiales características de sensibilidad y selectividad. Es frecuente
confundir el termino “biosensor” con un dispositivo que mide moléculas biológicas, cuando en realidad el nombre “biosensor” hace referencia a la parte receptora biológica que lleva incorporada en su interior.
Además de la sensibilidad y selectividad, una de las características fundamentales que hace atractivos a los biosensores es la posibilidad de realizar el
análisis de la sustancia a determinar en tiempo real y de forma directa (sin necesidad de marcador) a diferencia de cualquier análisis biológico o clínico que requiere siempre un marcador (ya sea fluorescente o radioactivo). Estas dos características le confieren a los biosensores la posibilidad de realizar no sólo un
análisis cualitativo (si/no) y cuantitativo, sino también la posibilidad de evaluar
la cinética de la interacción (constante de afinidad, asociación, disociación,...) y,
por tanto, elucidar los mecanismos fundamentales de dicha interacción. Las técnicas de análisis de laboratorio más habituales, ya sea de sustancias químicas o
biológicas, suelen ser laboriosas, consumen mucho tiempo y en la mayoría de la
ocasiones requieren personal especializado para su manejo. Frente a ellas los
biosensores ofrecen la posibilidad de hacer medidas directas, continuas, de forma rápida y con alta sensibilidad. Además, muchos biosensores ofrecen también
las ventajas del pequeño tamaño y la portabilidad, lo que posibilita su utilización en cualquier lugar, como el hogar o la consulta del médico. Ello implica
también la necesidad de una cantidad de muestra para hacer el análisis relativamente baja (de micro a nanolitros), lo que es muy importante si se trata de análisis de sangre o de ADN o si la muestra es cara o difícil de conseguir.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
107
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
Son muchos los dispositivos biosensores que se
han desarrollado y muy variados los mecanismos físico-químicos de transducción que se han empleado
para traducir la interacción
biológica de la parte “bio”
en una señal cuantificable y
útil para el usuario. La clasificación de los biosensoFigura 4. Algunos ejemplos
res
viene
impuesta
tanto
por
la
naturaleza
de
la biocapa receptora elede nanobiosensores que se
gida como por el tipo del transductor empleado. Para construir un
pueden emplear para el
diagnóstico precoz de
biosensor se pueden usar diferentes componentes. Como elementos
enfermedades de una
biológicos receptores se pueden emplear enzimas, anticuerpos, receptoforma selectiva y con un
res proteicos, secuencias de oligonucleótidos, fragmentos subcelulares
alto nivel de sensibilidad.
como mitocondrias, secciones de tejidos animales y vegetales, células
completas, etc. y como transductor dispositivos ópticos, electroquímicos y mecano-acústicos, principalmente. La combinación de las diversas capas receptoras con
los diferentes transductores ha dado lugar a una gran variedad de biosensores.
El término “nanobiosensor” designa a aquellos biosensores cuyas propiedades vienen moduladas por la escala nanotecnológica con la que están fabricados. Es de esperar que los nanobiosensores tengan una sensibilidad mucho más
alta que la de los dispositivos biosensores convencionales y además emplean
un menor cantidad de muestra. Por otra parte, podrían ser fácilmente introducidos en el interior del cuerpo humano, por lo que proporcionarían datos mucho
más fiables del estado de salud de un paciente. Dentro de los incipientes desarrollos de nanobiosensores son de destacar los nanobiosensores fotónicos, los
basados en nanopartículas de oro o magnéticas, los nanobiosensores basados en
nanotubos de carbono o los biosensores nanomecánicos, que han surgido como
reemplazo de los biochips de ADN, entre los más importantes (ver Fig. 4).
Biosensores basados en nanopartículas
108
Existen ya numerosos trabajos científicos que han demostrado la posibilidad de detectar la aparición de las primeras células cancerosas utilizando dife-
rentes tipos de nanopartículas.
Una de las más utilizadas son
las llamadas puntos cuánticos
(“Quantum Dots”), así denominadas porque su tamaño nanométrico provoca un efecto de
confinamiento cuántico en su
estructura (ver Figura 5). Los
puntos cuánticos están fabricados de material semiconductor
y contienen sólo unos cientos
de átomos. Cuando son excitados emiten luz en diferentes
Figura 5. Nanopartículas
longitudes de onda dependiendo de su tamaño, por lo que son extrecon diferentes propiedades
madamente útiles como marcadores biológicos. Los puntos cuánticos
de emisión según su
más empleados son los de CdSe, ya que son fáciles de fabricar con el
tamaño utilizadas en
tamaño deseado mediante procesos químicos, se pueden producir en
nanodiagnóstico. Puede
gran variedad de colores, tienen una emisión excelente (mejor que los
observarse el detalle de
marcadores fluorescentes habitualmente usados en biología), y no se
una nanopartícula obtenido
mediante microscopia
desestabilizan ya que son fotoestables. La emisión de fluorescencia
electrónica
(Foto cortesia
de estos puntos cuánticos es tan brillante que incluso es posible obdel Prof. L.Liz-Marzán,
servar una célula que contenga una única de estas nanopartículas.
Univ. Vigo).
Hoy en día los puntos cuánticos son comerciales y se ha demostrado ampliamente su utilidad para la localización de tumores en los primeros estadios, lo cual significa que se podría proceder a su extirpación inmediata.
Pero los puntos cuánticos no funcionan por sí mismos, es preciso indicarles cómo localizar el tumor y para ello hay que recubrir la superficie del punto
cuántico con moléculas biológicas (biorreceptores) con afinidad hacia un compuesto específico de la célula cancerosa. Por ejemplo, hay ciertas proteínas o
moléculas que se encuentran en mayor proporción en la superficie de las células cancerosas (como los receptores de ácido fólico o la hormona luteinizante)
y ésto va asociado con cada tipo de cáncer en particular. Cuando los puntos
cuánticos recubiertos con el biorreceptor se acercan a una muestra que contiene
dicha proteína, ambos se unen. Ahora se puede detectar la interacción iluminando los nanocristales con luz ultravioleta y observando su emisión característica. Hay ya numerosos ejemplos de como los puntos cuánticos localizan célu-
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Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
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Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
las tumorales, como en el caso
del cáncer de mama y de ganglios linfáticos cancerosos. Hasta ahora, los experimentos se
han realizado con animales, pero se preve que una vez autorizado por las agencias de salud
correspondientes, estos ensayos
puedan realizarse en seres humanos. La Figura 6 muestra un
ejemplo de tal localización.
Al igual que los puntos
cuánticos, muchos otros tipos de
nanopartículas pueden usarse para la localización de tumores, por
ejemplo nanopartículas metálicas
o magnéticas. El paso primordial
es disponer del biorreceptor adecuado a la enfermedad que se
pretende detectar y, sobre todo,
Figura 6. Funcionalización
ser capaces de recubrir adecuadamente estas nanopartículas con dicho
de puntos cuánticos de
receptor que permita la localización de las células tumorales.
CdSe con biomarcadores
Además de para realizar un diagnóstico, las nanopartículas tamespecíficos a tumor de
bién
pueden usarse como método terapéutico. Así, una vez que las
próstata e inyección
nanopartículas se unen a las células cancerosas, se puede inducir un
de los mismos para
la localización precoz
calentamiento de las mismas mediante un campo magnético de baja
de las primeras células
intensidad. El calentamiento provoca la destrucción de las células tucancerosas (comparación
morales pero sin causar ningún daño a las células o tejidos sanos
entre un ratón enfermo
circundantes. Esta tecnología para el tratamiento del cáncer evitaría
y sano).
los graves problemas de efectos secundarios de los actuales tratamientos de quimio o radioterapia.
Biosensores plasmónicos
110
El biosensor óptico más conocido es el Biosensor de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR), basado en la variación de reflectividad de una capa me-
tálica en contacto con un
medio biológico. El biosensor SPR ha sido ampliamente desarrollado,
cientos de publicaciones
aparecen cada año en la
literatura especializada y
numerosas compañias lo
comercializan en diferenFigura 7. (Izda.) Esquema
tes versiones. Este sensor permite detectar de forma directa concende funcionamiento de un
traciones en el rango nanomolar (o cambios de 10-5 en el índice de
biosensor de Resonancia
2
refracción, o lo que es lo mismo 1pg/mm depositado en la superfide Plasmón Superficial.
cie del sensor).
(Dcha.) Biosensor de SPR
En el sensor de resonancia de plasmón se deposita una capa
comercial (SENSIA, S.L.).
metálica delgada (generalmente una capa de oro de 50 nm de espesor) sobre una cristal. Excitando esta superficie en condiciones de reflexión interna total se obtiene una resonancia para un cierto ángulo de incidencia de la
luz, resonancia que se manifiesta en una absorción de la luz y, por tanto, un
mínimo agudo en la intensidad de la luz reflejada. La característica más interesante de este efecto es que el ángulo de resonancia es muy sensible a cualquier
variación que tenga lugar en la superficie metálica, como puede ser una inmunorreación o cualquier otro tipo de interacción biomolecular. La interacción
biomolecular se detecta entonces como una variación del ángulo de resonancia.
En la Fig. 7 se muestra el esquema de un sensor de SPR y su mecanismo de
funcionamiento.
Especial mención merece el biosensor de SPR comercializado por Biacore
bajo diferentes modelos, que domina desde hace años el mercado de los biosensores ópticos. Su única desventaja es su elevado precio y su sofisticada instrumentación.
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Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
Biosensores nanofotónicos
Los biosensores nanofotónicos han demostrado un nivel de sensibilidad
extremo para la detección directa de proteínas y ADN. En estos sensores (también llamados de onda evanescente) se hace uso de la forma particular en que
se transmite la luz en el interior de los circuitos ópticos: esta transmisión tiene
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Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
lugar a lo largo de la guia óptica mediante multiples reflexiones internas. A cada reflexión, una componente de la luz, denominada onda evanescente, se propaga en el medio que envuelve a la guía. La longitud de penetración de la onda
evanescente es de unos cientos de nanometros y ofrece una oportunidad única
e ideal para medir cualquier interacción biomolecular que tenga lugar en su interior. Con estos sensores es posible evaluar concentraciones de proteínas a nivel picomolar o variaciones de una única base en el ADN en tan sólo unos minutos, necesitando volúmenes de muestra del orden de los microlitros y, en
algunas ocasiones, las muestras a analizar (orina, suero) no necesitan ni tan siquiera ser pretratadas.
Los nanosensores fotónicos también permiten la medida en el interior de
una única célula de su estado metabolico. Para este fin existen nanosensores
que consisten en una fibra óptica muy afilada (su extremo final tiene solo 3050 nm) lo que le permite penetrar a través de la membrana celular sin causar
ningún daño y sin alterar el funcionamiento normal de la célula. La fibra óptica
se biofuncionaliza con receptores específicos antes de su introducción. Una vez
dentro, la nanosonda puede detectar especies químicas y señalizar procesos
moleculares en localizaciones especificas del interior de la célula. La detección
se realiza a través de la interacción del campo evanescente de la luz que circula por la fibra óptica con la interacción biomolecular, debida al biorreceptor específico anclado en la superficie del extremo final de la fibra. Con esta técnica
se abre la posibilidad de identificar cambios patológicos dentro de una célula
individual e incrementar nuestro conocimiento sobre las funciones celulares in
vivo como la división celular, la apoptosis, funcionamiento de las nanomáquinas biológicas, etc....
Biosensores nanomecánicos
Otro tipo de nanobiosensor con grandes perspectivas en nanodiagnóstico
son los biosensores nanomecánicos, que emplean como sistema de transducción la deflexión nanométrica de una micropalanca o el desplazamiento de su
frecuencia de resonancia al interaccionar con el sistema biológico. El cambio
en la posición y movimiento de la micropalanca inducido por el reconoci-
112
miento molecular ocurre a escala de unos pocos nanometros y de aquí deriva
el nombre de biosensores “nanomecánicos”. La Figura 8 muestra las imágenes de algunos de estos sensores. Las micropalancas tienen un área sensora
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Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
muy pequeña (del orden de 1000 µm 2 ) lo
cual permite el análisis de cantidades de
sustancia inferiores al
femtomol. Además, se
fabrican con tecnología microelectrónica
estándar, lo que proporciona producción
en masa a bajo coste y
permite la fabricación
de miles de micropalancas en un mismo proceso, que podrían ser
empleadas para la detección simultanea de miles de analitos de la
misma muestra.
Figura 8. Biosensores
nanomecánicos empleados
en nanodiagnóstico. Las
micropalancas se doblan
unos pocos nanómetros
Sistemas “laboratorio-en-un-chip”
cuando tiene lugar una
reacción de
reconocimiento molecular
Desarrollos como los nanosensores fotónicos o los nanomecánien su superficie. El
cos, fabricados a miles gracias a la tecnología microelectrónica, nanobiosensor de matrices
de micropalancas puede
abren un camino para la fabricación de nanobiochips genómicos y
emplearse
como biochip
proteómicos, que a diferencia de los actuales biochips, llevan incorde ADN o proteómico
porado un sistema de transducción de la interacción (no se necesitasegún la
rían marcadores fluorescentes) con los que sería posible conseguir
biofuncionalizacion (Foto
en muy poco tiempo una inmensa cantidad de información genética
cortesia de los Drs. K.
y proteómica, lo que permitirá elaborar vacunas, identificar mutacioZinoviev, J.A. Plaza, C.
nes indicativas de enfermedades, identificar nuevos fármacos, identiDomínguez y L.M. Lechuga
del Centro Nacional de
ficar patógenos, etc...de forma mucho más rápida que utilizando las
Microelectrónica,
CSIC).
tecnologías convencionales.
Pero, a pesar de estos incipientes desarrollos, todavía queda
mucho camino por recorrer y, cara al futuro, sería deseable contar con nanobiosensores que cumplieran la mayoría de los siguientes requisitos: robusto,
barato, posibilidad de multianalito, detección a niveles de pico/femtomolar o
incluso a nivel de una sola molécula, rápidos y directos, portátiles, de fácil
manejo por parte de personal no especializado, de multiuso o suficientemente
barato para ser de un único uso. El trabajo futuro se encamina tanto al desa-
113
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
114
rrollo de nuevas estrategias de inmovilización y de protección, para permitir
biosensores completamente reversibles y regenerables y que puedan funcionar in situ en muestras complejas (como es la sangre) y que sean biocompatibles para ser implantados in vivo. La inclusión de los nanodispositivos en el
interior del cuerpo humano preservando su funcionalidad será un logro paradigmático en nanodiagnóstico. Los nanobiosensores implantados podrían funcionar como “centinelas” dentro del cuerpo humano y emitir una señal de
alarma ante la aparición de las primeras células enfermas. Ya se han obtenido
pequenos avances como pildoras con cámaras de imagen que pueden tragarse, sensores que pueden realizar medidas in vivo durante operaciones, etc.
Ésta será sin duda una de las grandes áreas de trabajo de la Nanomedicina en
los anos venideros (ver Figura 9).
La integración en sistemas “lab-on-a-chip” será otras de las áreas fundamentales de trabajo, que permitirá la descentralización de las medidas. El término “lab-on-a-chip” (o “laboratorio en un chip”) describe el desarrollo de
plataformas integradas y miniaturizadas donde tienen lugar comFigura 9. Futuro de la
plejas reacciones químicas y bioquímicas. Estas plataformas se esutilización de
tán constituyendo como una tecnología revolucionaria en el sector
nanobiosensores como
clínico. Las micro y nanotecnologías han proporcionado las herrasistemas de
mientas necesarias para llevar a cabo esta innovación en el diagnanodiagnóstico
nóstico molecular, al permitir la fabricación e integración de mi(Adaptado de General
Electric).
cro/nanobiosensores, microcanales, microactuadores, etc. en un
mismo chip microelectrónico. El uso
de estos dispositivos aporta las ventajas de rapidez en
el análisis, reducidos volúmenes de
muestra, alto grado
de automatización
y su carácter portátil y desechable.
Un simple microsistema con nanosensores incor-
porados podría ofrecer un diagnóstico completo a partir de una gota de sangre mediante la identificación (de otra manera imperceptible) de cambios
moleculares. Esto implica que los análisis podrían hacerse a domicilio. Cuando se empiecen a reemplazar los caros y lentos análisis de laboratorio por estos análisis de microchips más baratos, rápidos y cómodos, el impacto en organizaciones sanitarias y sus pacientes será tremendo. De momento, todavía
no se cuenta con ningún desarrollo de microsistema biosensor que haya llegado al mercado, pero numerosos laboratorios a nivel internacional trabajan
en esta dirección.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
Liberación controlada de fármacos
La segunda gran área de actuación de la Nanomedicina es el desarrollo de
sistemas de liberación controlada de fármacos. Estos sistemas tienen como misión transportar el fármaco hasta el lugar donde debe ser liberado. Además, los
fármacos necesitan ser protegidos durante su tránsito por el cuerpo hasta llegar
al lugar afectado, tanto para mantener intactas sus propiedades físico-químicas
como para proteger a las otras partes del cuerpo por las que viaja de
sus efectos adversos. Una vez que el fármaco llega a su destino, ne- Figura 10. Diferentes tipos
cesita liberarse a una velocidad apropiada para que sea efectivo. Este de nanosistemas que
proceso no siempre es óptimo con las medicinas actuales, por lo que pueden emplearse en la
la Nanomedicina está ofreciendo métodos para mejorar tanto las ca- dosificación de fármacos.
racterísticas de difusión del fármaco como las de degradación del
material encapsulante, permitiendo
que el fármaco se transporte de forma mucho más eficaz y que su liberación sea igualmente más controlada. Para la administración de
fármacos pueden emplearse diversos tipos de nanoestructuras. Entre
ellas cabe destacar la utilización de
nanopartículas, nanocápsulas, dendrímeros, liposomas, micelas, nanotubos, conjugados poliméricos, etc.
(ver Figura 10).
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Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
Nanomedicina regenerativa
La Nanomedicina regenerativa es la tercera gran área de la Nanomedicina
y es una de las áreas más emergentes. La Medicina regenerativa intenta la reparación o reemplazamiento de tejidos y órganos enfermos o dañados mediante
la aplicación de métodos procedentes de terapia génica, terapia celular, dosificación de sustancias biorregenerativas e ingeniería tisular, estimulando los propios mecanismos reparadores del cuerpo humano.
La ingeniera tisular intenta generar tejidos in vivo o in vitro, para lo cual necesita materiales biocompatibles que mimetizen respuestas celulares específicas a
nivel molecular. Gracias al desarrollo de las nanotecnologías, los materiales tienen el potencial de interaccionar con componentes celulares, dirigir la proliferación y diferenciación celular y la producción y organización de la matriz extracelular. Entre los materiales que se están utilizando cabe destacar los nanotubos de
carbono, nanopartículas como nanohidroxiapatita o nanozirconía, nanofibras de
polímeros biodegradables, nanocomposites, etc. También se pueden utilizar superficies con nanoestructuración nanométrica que actúen como incubadoras de líneas celulares y que favorecen el proceso de diferenciación celular.
Gracias a la Nanomedicina, las células madre pluripotenciales y los factores de señalización serán componentes esenciales de implantes inteligentes y
multifuncionales que podrán reaccionar en función del microambiente que le
rodee y facilitar entonces la regeneración del tejido dañado de forma especifica
y en el mismo lugar.
Es de prever también que se puedan desarrollar nanoestructuras artificiales
que puedan detectar y reparar daños en el organismo, de la misma forma que
las nanoestructuras naturales lo hacen (por ejemplo los linfocitos de la sangre).
Así, se ha propuesto de forma teórica la fabricación de unas nanoestructuras
para sustituir la hemoglobina, denominadas “respirocitos”. Los respirocitos son
células rojas nanofabricadas con una enorme capacidad para transportar oxígeno y que pueden permitir pasar varias horas bajo el agua sin respirar. Según los
cálculos de su creador, con una inyección de respirocitos podríamos vivir con
el corazón parado durante 4 horas o bucear durante 2,5 horas. Otros interesan-
116
tes desarrollos incluyen motores biomoleculares, interruptores moleculares o
nanoagujas que penetren en el nucleo de células vivas con un alto grado de
precisión para realizar cirugia celular.
CONCLUSIONES
La Nanobiotecnología es un área multidisciplinar que puede conllevar
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
grandes avances diagnósticos y terapéuticos proporcionando nuevos métodos
de diagnóstico más efectivos, mejores sistemas para la administración de fármacos y nanoherramientas para la monitorización in situ de parámetros biológicos y reparación celular. Las nanoterapias, bien mediante la destrucción selectiva de células dañadas o infectadas o bien mediante la liberación controlada
de fármacos en el lugar indicado, se perfilan como uno de los grandes avances
a lograr para mejorar la calidad de vida de nuestra sociedad.
El futuro nos deparara microchips implantables que administrarán los fármacos en dosis preprogramadas, fármacos que habrán sido elegidos “a la carta”
según el perfil genético de cada individuo gracias al uso de micro/nanochips de
ADN y que trasmitirán sus datos al hospital para tener controlado al paciente
mientras éste hace su vida normal. Ya existen chips subcutáneos para medir de
forma continua parámetros cruciales como el pulso, la temperatura y la glucosa, microsensores ópticos que se implantan en los tejidos subdérmicos para medir la circulación en los tejidos después de una operación o sensores MEMS
que miden la presión, aceleración, velocidad y parámetros relacionados en pulmones paralizados y que ayudan en el diseño de pulmones artificiales. Ya se
están fabricando dispositivos “laboratorio-en-un-chip” y se están realizando ensayos clínicos para liberación de fármacos con productos nanotecnológicos. Sin
embargo, los largos procesos de aprobación en los sectores médicos y farmacéuticos pueden significar que los beneficios para la salud solo podrán apreciarse dentro de muchos años. Aunque quedan muchos problemas por superar,
no hay duda de que la Nanobiotecnología nos deparará grandes avances que redundarán en una mejora de la calidad de vida de nuestra envejecida sociedad y
que ayudará a vencer a las principales enfermedades (cáncer, desórdenes neurodegenerativos y enfermedades cardiovasculares) de nuestro entorno.
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Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
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118
VECTORES DE TRANSFERENCIA
EN TERAPIA GÉNICA
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Vectores de transferencia en terapia génica
Jesús M. Fominaya. Centro Nacional de Investigaciones Oncólogicas
INTRODUCCIÓN
El concepto de terapia génica, definida como la introducción de material
genético en una célula con el propósito de aliviar o eliminar un proceso patológico, surgió a nivel ideológico a mediados de los años 60, incluso antes del desarrollo de la tecnología del DNA recombinante. Su apoyo experimental comenzó en los 80 con la aparición de los vectores retrovirales. Las primeras
demostraciones in vitro de la potencialidad de esta nueva tecnología generaron
un optimismo desmesurado en la comunidad científica que ha provocado, a lo
largo de poco más de una década, el establecimiento de más de un millar de
ensayos clínicos. Sin embargo, la euforia inicial se ha traducido en prudencia e,
incluso en cierto escepticismo en algunos sectores, al no cumplirse las expectativas temporales de evolución y consecución de resultados. El fallecimiento de
un joven paciente implicado en uno de estos programas, junto con la aparición
inesperada de varios casos de leucemia inducida tras la integración del transgen, ha provocado una dura crítica al desarrollo que se está produciendo en este campo. En contraposición, comienzan a obtenerse las primeras evidencias de
éxito terapeútico, además de acumularse datos experimentales prometedores.
Por otra parte, la baja toxicidad de los tratamientos y las grandes posibilidades
119
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Vectores de transferencia en terapia génica
aún por desarrollar, siguen justificando, e incitando, un continuo avance en este
apasionante campo de la investigación biotecnológica.
El cuello de botella del desarrollo de la terapia génica se encuentra en la
obtención de sistemas eficaces de transferencia génica. Hasta el momento,
existe una gran variedad de vectores que presentan diversas ventajas e inconvenientes, pero ninguno de ellos alcanza el nivel de calidad requerido para que la
terapia génica obtenga la madurez que le permita ser una alternativa real y
competitiva frente a las terapias tradicionales. La potencialidad sigue siendo
desmesurada. El conocimiento de la totalidad de nuestro material genético, como resultado de la finalización del proyecto Genoma Humano, abre unas expectativas ilimitadas. Por ello, necesitamos que los vehículos de transporte del
material genético se desarrollen suficientemente, de modo que permitan la utilización de los genes como nuevos agentes farmacológicos y se posibilite su
explotación terapeútica.
El objetivo de este trabajo es dar una idea general del estado en el que se
encuentra actualmente el campo del diseño y desarrollo de vectores de transferencia génica con aplicación terapeútica. Antes de comenzar conviene recordar
que estamos tratando con un concepto terapeútico global, ya que cualquier célula puede ser el objetivo del tratamiento. Además, la aplicación terapeútica de
material genético es potencialmente ilimitada, puesto que va más allá de la reparación, sustitución o compensación de una alteración genética, permitiendo
su utilización como agente farmacológico per se, incorporando nuevas actividades en el organismo que permitirían tanto tratamientos de patologías sin daño genético (enfermedades infecciosas, por ejemplo) como tratamientos preventivos (vacunas de DNA). Por lo tanto, la diversidad de situaciones en las
que se podría aplicar, justifica el desarrollo de una amplia diversidad de vectores (el tratamiento de cada patología puede requerir el diseño de un vector específico). La obtención de un vector universal con aplicación generalizada es
una quimera, ya que diferentes enfermedades pueden tener requerimientos
opuestos. Sin embargo, sí se pueden definir las características de un "vector
ideal" y adaptarlas posteriormente a situaciones concretas:
1. Que sea reproducible.
2. Que sea estable.
120
3. Que permita la inserción de material genético sin restricción de tamaño.
4. Que alcance concentraciones elevadas (>108 partículas/ml).
5. Que permita la transducción de células tanto en división como quiescentes.
6. Que posibilite la integración específica del gen terapeútico.
7. Que reconozca y actúe sobre células específicas.
8. Que la expresión del gen terapeútico pueda ser regulada.
9. Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Vectores de transferencia en terapia génica
10. Que pueda ser caracterizado completamente.
11. Que sea inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios.
12. Que sea fácil de producir y almacenar y a un coste razonable.
Los vectores son sólo una parte, aunque fundamental, del sistema terapéutico. El sistema en sí consta de dos componentes, el "vector" (vehículo de
transporte) y el "cargo" (material transportado). Éste, a su vez, se puede subdividir en otros dos componentes: el "efector" (gen a introducir) y el "soporte"
(los elementos que condicionan su expresión).
El cargo suele ser una estructura de tipo plasmídico (ADN bicatenario y
circular) aunque puede ser de diversa naturaleza y complejidad, desde un simple oligonucleótido hasta un cromosoma artificial, que permite incorporar una
cantidad elevada de material genético con capacidad de perpetuación en el
tiempo.
El efector que se utilice dependerá del efecto que se persiga. Si se pretende compensar, sustituir o reparar un gen dañado, el efector ha de ser una copia
del gen intacto o un elemento que posibilite su reparación. Si se pretende inducir un efecto biológico concreto (eliminar específicamente un tipo de células,
bloquear la expresión de un virus, inducir una respuesta inmune...), se pueden
introducir genes naturales que potencien dicho efecto o genes que originen
nuevas actividades que den lugar al efecto perseguido. Es el caso, por ejemplo,
de los genes suicida, que expresan enzimas procesadoras de pro-drogas, capaces de convertir un sustrato inocuo (pro-droga) en una potente droga citotóxica.
El sistema más utilizado es el del gen de la timidina quinasa del virus Herpes
Simplex (HSV), que transforma el glanciclovir en su derivado tóxico, glanciclovir trifosfato. El producto tóxico es capaz de afectar, además, a las células
adyacentes no transducidas, aumentando su eficacia por el denominado efecto
"bystander".
El soporte es la base para el control de la expresión del transgén e incluye
distintos tipos de elementos reguladores. El primero y fundamental es el promotor, la zona de ADN anterior al gen donde se recluta la maquinaria de transcripción. La naturaleza del promotor condiciona el tipo de regulación de la expresión génica. Así, se pueden utilizar promotores constitutivamente activos o
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Vectores de transferencia en terapia génica
Figura 1. Puntos clave
par regular la eficacia
de un vector
promotores específicos, que sólo son activos en un tipo celular concreto. De la misma manera, se pueden emplear promotores inducibles, que
requieren la presencia de un elemento concreto para ejercer su función.
Éste puede ser un agente de adicción exógena (control externo) o un agente determinado por características fisiológicas especiales (por ejemplo, los promotores sensibles a situaciones de hipoxia). Existen otros elementos del soporte de
diversa importancia, dependiendo de la funcionalidad perseguida. Entre ellos se
encuentran potenciadores y represores de los promotores, secuencias de aislamiento ("insulators") que impiden las influencias de secuencias reguladoras
próximas, secuencias de integración (para permitir la inclusión del material
exógeno dentro del genoma de la célula hospedadora), secuencias de recombinación homóloga (para permitir el intercambio de material genético con el genoma hospedador en una región específica), secuencias de empaquetamiento
(para introducir el material genético en el interior de un vector viral), o secuencias inmunoestimulantes (secuencias bacterianas del tipo islas CpG no metiladas, que sirven como coadjuvantes en las vacunas de ADN).
Los vectores son los encargados de asegurar la estabilidad del material genético transportado y de vencer todas las barreras biológicas hasta alcanzar su
destino final, el núcleo de la célula diana, donde tiene lugar la regulación génica. También de ellos va a depender la vía de administración a utilizar. En la Fi-
de transferencia génica.
122
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Vectores de transferencia en terapia génica
Figura 2. Tipo de vectores
y proceso esquematizado
gura 1 se esquematizan las barreras más importantes que el vector ha
de solventar en su camino hacia su destino funcional. Entre ellas se incluyen la estabilidad en el medio extracelular (para evitar su eliminación y degradación), el reconocimiento de la célula diana (generalmente mediante un receptor específico), su unión a la membrana, su internalización en la célula
(normalmente utilizando un sistema de transporte vesicular como la endocitosis), el escape de los sistemas de degradación intracelular (lisosomas) y su entrada final al núcleo, donde debe desmantelarse para permitir que el material
genético que transporta gane acceso a su ubicación final y a la maquinaria de
transcripción.
Existen dos grandes grupos de vectores: virales y no-virales (Figura 2).
Los primeros incluyen todos aquellos que se han obtenido a partir de un virus,
tratando de eliminar sus características patológicas y de adaptarlos a su nueva
función como transportadores de material genético heterólogo. Pretenden aprovechar la ventaja que aportan los virus como vectores naturales, que han sufrido procesos de evolución complejos a lo largo de millones de años para optimizar su función de introductores de material genético en las células que
invaden. Los vectores no-virales siguen una estrategia opuesta, de síntesis en
de obtención.
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Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Vectores de transferencia en terapia génica
lugar de modificación. Parten de estructuras sencillas, conocidas, e intentan reconstruir desde la base un sistema completamente artificial que posibilite el
transporte efectivo de genes en el interior de una célula. Como resulta obvio,
las opciones son muy diversas, aunque todas ellas tienen en consideración puntos equivalentes, que han de resolver, en el intento de incorporar todos los elementos necesarios para la construcción de un sistema de transferencia efectivo.
Ambas estrategias tienen ventajas y desventajas que analizaremos a continuación. Existen también algunos casos de vectores biológicos no virales (bacterianos) como portadores de genes terapéuticos, alguno de ellos incluso en ensayos clínicos (para más información, visitar la base de datos de ensayos clínicos
en terapia génica que facilita el portal de la revista Journal of Gene Medicine:
http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/), pero no van a ser analizados en este
documento.
VECTORES VIRALES
Los vectores de tipo viral son actualmente los más efectivos, fueron los
primeros en utilizarse en ensayos clínicos a comienzos de 1990 y continúan
siendo los más utilizados en dichos ensayos. Los virus son, de hecho, sistemas
naturales de transferencia genética. Para modificar un virus y transformarlo en
un vector con potencialidad terapéutica, el primer paso es bloquear su capacidad de propagación eliminando los genes responsables de su replicación. Normalmente, se suelen establecer líneas celulares que incorporan parte del genoma vírico y que permiten completar el ciclo reproductivo del virus, cuando son
transfectadas con plásmidos que introducen el material genómico complementario. Estas líneas celulares se denominan "empaquetadoras" y son las herramientas de producción de los vectores virales. El segundo paso en el proceso
de obtención de un vector viral es la eliminación de parte del genoma viral para crear espacio donde introducir el material terapeútico (gen o genes, más los
elementos de control). Se han de eliminar genes que no sean esenciales y, especialmente, aquellos que puedan resultar tóxicos o perjudiciales para la célula a
tratar.
124
En general, los vectores virales presentan como ventaja su gran eficacia de
transferencia y la posibilidad, en algunos casos, de integrar el transgén en el
genoma de la célula huésped. Sin embargo, arrastran importantes limitaciones
que incluyen su falta de especificidad celular en la mayoría de los casos, la limitación del tamaño en el material genético a incorporar, debido a que han de
empaquetarlo en la cápsida, su elevada inmunogenicidad y, sobre todo, el riesgo biológico que conllevan (reconstitución de partículas replicativas por re-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Vectores de transferencia en terapia génica
combinación genética y oncogenicidad inducida por integración inespecífica).
De hecho, esto es lo que ha ocurrido en un reciente ensayo clínico, por otra
parte exitoso, de terapia compensatoria en una inmunodeficiencia congénita
tratada con vectores retrovirales portadores de una copia "sana" del gen dañado. En este ensayo, la inserción del transgén en el genoma del paciente generó,
en un par de casos, el desarrollo de una leucemia producida por su integración
cerca del oncogén LMO2, provocando su activación.
La lista de vectores virales es cada día más amplia. Aquí solo se muestran
algunos de los más representativos, y que están siendo utilizados en ensayos
clínicos.
Vectores retrovirales
Los retrovirus son virus RNA con envuelta y fueron elegidos inicialmente
como prometedores vehículos de transferencia génica debido a su elevada eficacia de transducción en un gran número de tipos celulares, a que son capaces
de integrarse de forma estable en el genoma de la célula que infectan, sin expresar ninguna proteína viral inmunogénica, y a que son relativamente poco
patogénicos, con populares excepciones como el virus del SIDA (HIV, Human
Immunodeficiency Virus). La mayoría de ellos derivan del virus de la leucemia
murina (MuLV). El virus parental posee tres genes, gag, pol y env, que codifican proteínas responsables de la replicación, encapsidación, transcripción reversa e infección. Estos tres genes pueden ser utilizados en trans (facilitados
por las células empaquetadoras), permitiendo la generación de vectores que limitan el genoma retroviral a la señal de empaquetamiento y las secuencias terminales necesarias para la integración (LTRs, Long Terminal Repeats). De esta
forma se minimiza el componente genómico viral y se maximiza la capacidad
de incorporación de material genético heterólogo, aunque el límite sigue siendo
discreto, unas 7-8 kilobases (kb).
Su mayor limitación reside en el hecho de que sólo son capaces de transducir eficazmente células en división, ya que el acceso al núcleo del complejo
de preintegración requiere la ruptura de la membrana nuclear. Ésto inicialmente
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Vectores de transferencia en terapia génica
ha sido utilizado como una ventaja para el tratamiento de patologías oncológicas, generando un cierto grado de especificidad debido al elevado nivel de proliferación de las células transformadas. Sin embargo, limita grandemente su
utilización en sistemas tan atractivos como las células progenitoras, normalmente en estado quiescente. La utilización de vectores derivados de otro tipo
de retrovirus, los lentivirus (HIV, SIV...), que sí son capaces de infectar e integrarse en células quiescentes, abre nuevas posibilidades a estos vectores, aunque los riesgos inherentes al uso de los mismos han retrasado su utilización en
ensayos clínicos, habiéndose iniciado recientemente.
Un segundo tipo de inconvenientes reside en la poca estabilidad de las
partículas y su baja tasa relativa de producción. Esto ha sido parcialmente resuelto mediante la sustitución de la proteína de la envuelta por la glicoproteína
G del virus de la estomatitis vesicular que posibilita la obtención de títulos de
hasta 109 p.i./ml y estabiliza las partículas. Además, la utilización de células
empaquetadoras de origen humano produce vectores resistentes a la inactivación por complemento.
Finalmente, la carencia de especificidad celular inherente a estos virus
(poseen un rango de infectividad muy amplio) está tratando de resolverse mediante la utilización de vectores que poseen proteínas quiméricas en la envuelta. Estas incorporan ligandos heterólogos o anticuerpos monocatenarios que generan nuevas especificidades y permiten transducir selectivamente una
población celular.
Vectores adenovirales
Los adenovirus son virus DNA sin envuelta con un genoma bicatenario de
hasta 36 kb. Se han seleccionado los serotipos 2 y 5 para la obtención de vectores por no estar asociados con ninguna enfermedad severa ni originar tumores en animales. Pueden transducir un número bastante amplio de tipos celulares distintos, tanto células en división como post-mitóticas, con una eficacia
muy elevada. Sin embargo el genoma viral se mantiene episómico, lo que permite solo una expresión genética transitoria.
La primera generación de vectores adenovirales se obtuvo mediante delec-
126
ción de la región E1, que bloqueaba su capacidad replicativa y la E3, aparentemente no esencial. Sin embargo, posteriormente se demostró que la presencia
de E3 incrementaba significativamente la expresión del transgen y disminuía la
respuesta inmune, por lo que volvió a introducirse en la segunda generación de
vectores a expensas de otras regiones como la E4 o la E2A. En ambos casos, la
capacidad del vector para acomodar genes terapéuticos no sobrepasaba los 7-8
kb, muy por debajo de la capacidad teórica de las partículas originales. Recientemente, se ha conseguido eliminar la mayoría del genoma viral manteniendo
sólo las señales de empaquetamiento y las secuencias terminales (ITRs, Inverted Terminal Repeats), rindiendo vectores con gran capacidad incorporadora
(hasta 35 kb) que se han denominado "vectores sin tripas" (gutless).
La eliminación de material genómico viral no sólo aumenta la capacidad
del vector, sino que disminuye también el riesgo de inducción de respuesta inmune. De hecho, éste es uno de los problemas más graves de estos vectores, y
ha sido la causa del fallecimiento accidental mencionado anteriormente. La
mayoría de la población humana ha sido infectada en algún momento con adenovirus y presenta una respuesta inmunitaria inicial. Existen estrategias inmunosupresoras transitorias y se están tratando de desarrollar vectores adenovirales de origen animal (canino, bovino u ovino). Sin embargo, el problema se
mantiene sin resolver de una forma satisfactoria y el uso de vectores adenovirales se reduce a aplicaciones unitarias.
Una de las mayores ventajas de estos vectores radica en su alta productividad, con títulos de hasta 1010 p.i./ml, y su gran estabilidad, que les permiten
ser concentrados adicionalmente para alcanzar valores de 1012 p.i./ml. Esto,
junto con la posibilidad de transducir células quiescentes, les ha hecho muy
atractivos para la comunidad científica y son el segundo tipo de vectores en
frecuencia de utilización en ensayos clínicos.
Su falta de especificidad celular también ha sido compensada por el desarrollo de estrategias de redireccionalidad: quimeras que introducen ligandos específicos en proteínas de la cápsida y moléculas biespecíficas que reconocen
tanto la cápsida viral como el receptor seleccionado, para conferir un nuevo
tropismo celular.
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Vectores de transferencia en terapia génica
Vectores basados en virus adenoasociados
Los virus adenoasociados son parvovirus humanos no patológicos. Son pequeños virus sin envuelta con un genoma de DNA monocatenario, capaces de
infectar un gran número de células de origen diverso, tanto en división como
en su estado quiescente. A diferencia de los adenovirus, pueden integrarse en la
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Vectores de transferencia en terapia génica
célula huésped en una ubicación específica (el brazo q del cromosoma 19) eliminando la posibilidad de mutagénesis insercional. Otra ventaja adicional es la
carencia de respuesta inmune observada in vivo.
Sus mayores limitaciones se centran en su reducida capacidad de transporte (unos 4.5 kb) y en su tediosa producción, que requiere la presencia de virus
de apoyo (adenovirus o herpesvirus), dificiles de eliminar completamente. Una
complicación adicional surgió al comprobar que la eliminación de parte del genoma viral para permitir la introducción del transgén se tradujo en la pérdida
de la capacidad de integración específica. Reciéntemente se ha descubierto que
la proteina Rep78, en presencia de los ITRs, es capaz de potenciar la integración específica en el genoma celular y podría ser la clave que solucionara este
problema.
Finalmente, como hemos visto en los vectores anteriores, la falta de especificidad celular ha sido también tratada empleando la estrategia de moléculas
biespecíficas.
Tabla 1.
V. Retrovirales
V. Adenovirales
V. Adenoasociados
Soporte génico
RNA lineal
bicatenario
DNA lineal
bicatenario
DNA lineal
monocatenario
Capacidad transportadora
7-8 kb
Hasta 35 kb
(gutless)
4.5 kb
Inmunogenicidad
Baja
Elevada
Baja
Eficacia de transfección
Elevada
Elevada
Elevada
Dependencia del estado
de división celular
Sí
(excepto lentivirus)
No
No
Integración del transgén
Sí, aleatoria
No
Sí, específica
Estabilidad
Baja
Elevada
Elevada
Especificidad
Baja
Baja
Baja
Otras
Riesgo biológico
(infect., mutag.
insercional)
Limitado
a aplicaciones
reducidas
Elaboración
tediosa
Características
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Vectores virales quiméricos
Una opción interesante, que cada día se está explotando con mas fre-
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Vectores de transferencia en terapia génica
cuencia, es la combinación de varios vectores para compensar las limitaciones que presentan cada uno por separado, a la vez que se aprovechan las ventajas más destacables que aportan individualmente. Existen diversas
estrategias experimentales de estas quimeras, pero sólo voy a mencionar, a título de ejemplo, la quimera adenovirus-retrovirus. Consiste en la utilización
simultánea de dos tipos de vectores adenovirales: uno que incorpora la maquinaria de empaquetamiento retroviral (gag, pol y env) y otro que introduce
el material genético equivalente a un vector retroviral (LTRs, señal de empaquetamiento y material terapéutico). Se aprovecha la elevada eficacia de
transducción de los vectores adenovirales para cotransfectar con ambos vectores, transformando las células dianas en células productoras de vectores retrovirales. Los vectores así generados son capaces de infectar las células vecinas e integrarse en su genoma.
VECTORES NO-VIRALES
El concepto general aplicado al desarrollo de este tipo de vectores se asemeja más al de los productos farmacéuticos tradicionales. Se pretende mimetizar el proceso natural de introducción de material genético en una célula huésped, utilizando material sintético y, por lo tanto, conocido y controlable. La
eficacia de estas nuevas "medicinas génicas" depende de dos niveles de actuación, el sistema de introducción de los genes (el vector propiamente dicho) y el
sistema de regulación de su expresión (el soporte). Ambos son fundamentales y
complementarios, pero aquí sólo vamos a tratar el primero de ellos.
Los vectores no-virales presentan, en general, una eficacia inferior a la de
sus oponentes (no es fácil competir con sistemas desarrollados por la naturaleza). Algunas características virales, como la capacidad de integración en el genoma huésped, están en proceso de desarrollo. Actualmente se está trabajando
en el empleo de transposones como "Sleepy Beauty", capaz de insertar transgenes en cromosomas de mamíferos. La explotación de estrategias alternativas,
que no requieren la integración del transgén, para asegurar un efecto terapeútico estable, también favorece el desarrollo de estos vectores. Es el caso de los
129
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Vectores de transferencia en terapia génica
métodos de inducción de reparación de DNA in situ, como la "quimeraplastia",
aunque su eficacia no está claramente establecida.
En cuanto a sus ventajas, destacan su facilidad de manipulación, mayor
estabilidad, bioseguridad, gran capacidad transportadora, menor inmunogenicidad y especificidad celular, en algunos casos. Los tipos de vectores son muy
variados, pero pueden agruparse en categorías, que veremos a continuación.
Métodos físicos
Se basan en la introducción de DNA en la célula mediante la aplicación de
un sistema mecánico o eléctrico. Alguno de ellos está siendo utilizado en ensayos
clínicos, aunque presentan claras limitaciones, principalmente por su aplicación
local y el número reducido de células que afectan. En esta categoría se encuentran la microinyección (introducción de DNA en el núcleo celular mediante el
uso de una microaguja), bombardeo de partículas, popularmente conocido como
la "pistola génica" (proyección de micropartículas metálicas recubiertas de DNA
mediante un sistema balístico impulsado por gas), electroporación de bajo voltaje
(permeabilización transitoria de la membrana celular por aplicación de pulsos
eléctricos de alta frecuencia y bajo voltaje) e inyección intersticial de DNA desnudo. Este último método ha resultado especialmente efectivo en músculo.
Liposomas catiónicos (Lipoplexes)
Buscando la similitud con otras formulaciones farmacéuticas, y tratando de
aprovechar la experiencia acumulada en sistemas particulados de encapsulación de
pequeños fármacos en vesículas lipídicas, se trató de aplicar la tecnología de los liposomas al transporte de ácidos nucleicos. Aunque inicialmente se intentó encapsular el
DNA en el interior de liposomas, el rendimiento fue pobre y la eficacia se incrementó considerablemente al cambiar los liposomas tradicionales por otros basados en lípidos catiónicos. A diferencia de aquéllos, el DNA interacciona con los grupos catiónicos de la superficie lamelar y no se incluyen en el interior vesicular. El éxito de
este tipo de estrategias ha sido claro desde el principio y actualmente da cuenta del
mayor número de protocolos en ensayo clínico dentro de los vectores no virales.
130
Existe un número bastante elevado de estos lípidos tanto en explotación como agentes de transfección como en desarrollo para su utilización como vectores
de transferencia en terapia génica. Entre los más populares se encuentran DOT-
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Vectores de transferencia en terapia génica
MA (Lipofectin), DOTAP, DMRIE, DOGS (Transfectam), DOSPA (LipofectAMINA) y DC-Colesterol. Presentan niveles de eficacia aceptablemente altos, una inmunogenicidad casi nula, una capacidad de transporte de DNA sin restricción de
tamaño, gran estabilidad de almacenaje y sencillez de uso. Sin embargo, son difíciles de caracterizar estructuralmente y no presentan especificidad celular, aunque
ambos puntos están en desarrollo.
Los lípidos catiónicos utilizados están formados por estructuras anfifílicas,
compuestas de un dominio hidrofóbico y una cabeza polar. La naturaleza de esta última es la que marca la diferencia entre ellos. Los grupos catiónicos más
frecuentes son aminas cuaternarias y poliaminas (espermina, espermidina, polilisina...). Su eficacia de transfección depende, en la mayoría de los casos, de la
presencia de un lípido neutro adicional, DOPE, que actúa como "lípido de apoyo", posibilitando la fusogenicidad del liposoma y la entrada del DNA en el citosol. La compactación del DNA con policationes, especialmente protamina, an-
Tabla 2.
M. Físicos
Lipoplexes
Poliplexes
Peptiplexes
Soporte génico
Cualquiera
Cualquiera
Cualquiera
Cualquiera
Capacidad transportadora
Ilimitada
Ilimitada
Ilimitada
Ilimitada
Inmunogenicidad
Muy baja
Muy baja
Baja (en
algunos casos)
Baja (en
algunos casos)
Eficacia de transfección
Elevada, pero
muy localizada
Media
Media
Media
Dependencia del estado
de división celular
Relativa
Relativa
Relativa
Relativa
Integración del transgén
No
No
No
No
Estabilidad
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Características
Especificidad
Elevada
Baja (con
(aplicación local) excepciones)
Elevada, en
algunos casos
Elevada, en
algunos casos
Otras
Aplicación
Experiencia
bastante limitada farmacológica
Económicos,
rel. controlables
Versátiles,
biodegradables
131
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Vectores de transferencia en terapia génica
tes de la adicción del liposoma ha supuesto un incremento importante en la
efectividad del sistema. Otras modificaciones interesantes incluyen la utilización
adicional de lípidos aniónicos, que activan su capacidad fusogénica en el microambiente ácido del endosoma, la inclusión de ligandos o de anticuerpos para generar especificidad celular y la optimización de formulaciones que eviten su opsonización, una de las principales limitaciones de su utilización in vivo.
Quimeras HVJ-liposomas (Virosomas)
Un concepto muy interesante, desarrollado por un grupo japonés, es la obtención de liposomas quiméricos por fusión con el virus hemaglutinante del Japón (HVJ), también llamado virus Sendai. La estrategia consiste en la encapsulación de complejos DNA-HMG1 en liposomas clásicos (fosfolípidos,
colesterol) y su fusión posterior con HVJ inactivado con luz ultravioleta. De
esta forma se combinan las ventajas del vector no viral con la capacidad de
unión celular y la fusogenicidad aportadas por las proteínas de la envuelta vírica. A diferencia de los vectores virales, esta nueva quimera resulta muy poco
inmunogénica y permite administraciones repetidas.
Conjugados moleculares (Poliplexes)
Estos vectores se basan en moléculas bifuncionales obtenidas por unión covalente entre un policatión, (polilisina), que posibilita la unión y condensación
del DNA, y un ligando o anticuerpo monoclonal, que confiere especificidad celular. Estas moléculas forman complejos con DNA de estructura definida (toroidal)
que permite su fácil captura por la célula, siguiendo una ruta endocítica mediada
por receptor. La ventaja más clara del sistema es su especificidad. Sin embargo,
la mayor parte de los complejos que entran en los endosomas finalizan en los lisosomas, donde son degradados. Esta importante limitación ha tratado de solucionarse mediante la adicción de reactivos que bloqueen la acidificación del endosoma (cloroquina, monensina, bafilomicina A1...) o la incorporación de
actividades fusogénicas que se activen con la disminución del pH que tiene lugar
en el endosoma. Entre estos últimos se incluyen adenovirus inactivados con pso-
132
ralen y luz UV (generan eficacias de transfección muy altas) y péptidos fusogénicos. Para su utilización in vivo se necesita la incorporaración de esta nueva actividad en los complejos, en lugar de su utilización in trans.
Policationes (Poliplexes)
De nuevo, el carácter catiónico es la directriz para el desarrollo de un vector
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Vectores de transferencia en terapia génica
no viral. Este carácter permite, no sólo la interacción con el DNA (polianión), sino
también su condensación y la interacción de los complejos resultantes con las
membranas celulares, que poseen cargas negativas en su superficie. Para ello se
requiere que los complejos policatión-DNA sean electropositivos, lo que se consigue con un exceso del policatión. Por tanto, la determinación de la estequiometría
óptima es fundamental para obtener un buen rendimiento de transferencia génica.
Los policationes más desarrollados y de mayor eficacia en la actualidad
son los basados en polímeros ramificados. Entre ellos destacan los dendrímeros
de poliamidoaminas (PAMAM) y la polietilénimina (PEI). Los primeros son
estructuras esféricas con una arquitectura muy definida y controlable. La presencia de grupos protonables con diferentes pKs le confiere un carácter tamponador que bloquea la acidificación del endosoma, incrementando la eficacia de
escape al citosol. El fraccionamiento parcial del dendrímero, mediante la eliminación de alguna de sus ramificaciones, ha permitido una mejora sustancial del
vector. El dendrímero fracturado actúa como una "esponja" en el interior del
endosoma, posibilitando una liberación más efectiva del DNA.
PEI es también una alternativa muy interesante. Comparte la funcionalidad
tamponadora de los dendrímeros y su coste de producción es muy bajo. Sin
embargo, es de naturaleza polidispersa y más difícil de caracterizar. Actualmente se ha conseguido introducir con éxito diversos tipos de ligandos, que le
confieren selectividad celular.
Vectores de naturaleza peptídica (Peptiplexes)
Existe un grupo heterogéneo de vectores que se basan en estructuras de
naturaleza peptídica. De ellos sólo voy a mencionar dos tipos. El primero utiliza proteínas multidominio, basadas en el carácter modular de las toxinas bacterianas. El concepto general es similar al de los conjugados moleculares, pero
con la ventaja de la utilización de técnicas de ingeniería genética. El sistema
incorpora, en una sola cadena peptídica, diferentes dominios estructurales, que
confieren actividades específicas necesarias para la eficiente introducción de
DNA en las células dianas. Las proteínas quiméricas obtenidas poseen un do-
133
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Vectores de transferencia en terapia génica
minio de reconocimiento y unión celular (ligando o anticuerpo monocatenario),
un dominio que posibilita el escape del endosoma (el dominio de translocación
de la toxina) y un dominio de unión a DNA (específico o inespecífico). Una de
las ventajas de este sistema es su versatilidad, que le permite la adaptación a
requerimientos específicos mediante la simple sustitución de un dominio. Sin
embargo, presenta limitaciones en cuanto a la expresión a gran escala de proteínas tan complejas, así como su posible inmunogenicidad.
El segundo tipo está basado en la utilización de una estrategia similar mediante el uso de péptidos modulares: la aplicación de péptidos con funcionalidades específicas (unión a DNA, reconocimiento celular, fusogénesis, tropismo nuclear...) como sillares estructurales. De esta forma, se permite el establecimiento
de complejos de tamaño controlado (el mínimo posible) y de reducida inmunogenicidad, que han permitido mejorar la eficacia de la transferencia génica.
Para finalizar, sólo quiero recordar que éste es un campo en continuo desarrollo y evolución, y que aún quedan estrategias por explotar. Probablemente,
la solución no se encuentre en ninguno de los vectores como se conocen en la
actualidad. La combinación de varios de ellos se está empleando con éxito en
algunos sistemas. En cualquier caso, cuantas más alternativas se exploren, mas
cerca estaremos de la obtención de un buen vector de transferencia.
En paralelo al desarrollo de vectores, los avances en el diseño del soporte
(promotores inducibles y específicos de tejido, secuencias reguladoras, aislantes génicos, sistemas de integración, replicación episómica en el huésped...)
compensan y complementan a aquéllos, permitiendo una evolución integral del
sistema que posibilitará una mayor eficacia y una disminución de sus limitaciones. Mientras tanto, vamos conociendo con mayor detalle los mecanismos biológicos que permiten la introducción de material genético heterólogo en una
célula y eso repercutirá positivamente en el diseño de las nuevas generaciones
de vectores.
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Wiley & sons), p351 (1998).
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Vectores de transferencia en terapia génica
135
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
TERAPIA GÉNICA EN ENFERMEDADES
MONOGÉNICAS Y CÁNCER
Juan A. Bueren1 y Antonio Bernad2
1División
de Hematopoyesis y Terapia Génica. CIEMAT
de Inmunología y Oncología
Centro Nacional de Biotecnología. CSIC
2Departamento
INTRODUCCIÓN
Los avances en el campo de la genética molecular están teniendo una importante repercusión en nuestra capacidad para comprender, diagnosticar, y tratar una variedad
de enfermedades
congénitas y adquiridas. Así, la
posibilidad de introducir genes en
células eucariotas ha permitido
Figura 1. Modalidades
dar comienzo a nuevos protocolos de marcado y de terapia génica
básicas en las que se
humana (TG), que no resultaban abordables hace unos pocos
fundamentan los protocolos
años, y que en esencia se fundamentan en dos estrategias que se
de transferencia y terapia
recogen en la Figura 1.
génica.
137
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
En términos teóricos existen dos posibilidades técnicas para realizar TG.
En primer lugar, podríamos plantear una "terapia de sustitución" en la que el
gen afectado (mutado) fuese sustituido por una versión correcta. Esta aproximación sería perfecta, puesto que el gen introducido se encontraría en su entorno natural y bajo los sistemas de control/regulación de la expresión fisiológica.
Sin embargo, debido fundamentalmente al bajo índice de recombinación homóloga demostrada en las células eucarióticas (incluidas las de mamífero), ésta
aproximación no se plantea en términos prácticos, aunque muchos grupos de
investigación trabajan activamente en el desarrollo de procedimientos para aumentar dicho fenómeno (Li J. y Baker M.D., 2000), y se han comunicado algunos intentos con éxito (Hatada et al. 2000). En segundo lugar nos encontramos
con la denominada "terapia de adición", que pretende introducir una construcción de diseño que permita aportar la función génica afectada, generar un circuito secundario que incida sobre las vías afectadas o promueva una respuesta
fisiológica que elimine las células malignas o defectivas. La mayoría de los
protocolos en desarrollo actualmente utilizan esta alternativa, combinando un
sinfín de posibilidades técnicas que vienen principalmente determinadas por el
tipo de afección con la que se enfrenta el equipo de investigación. El resumen
de la experiencia acumulada hasta el momento indica que no existe una fórmula universal de TG. Cada patología, y por ende cada tipo celular afectado e incluso cada paciente, tiene más posibilidades de éxito con un determinado procedimiento que con otro, y esto es necesario probarlo en la arena clínica.
En esencia, el proceso de TG se puede realizarse tanto in vivo (inoculando el
vector de transferencia en el paciente), como in vitro. En este caso, la transferencia
génica se realiza sobre células extraídas del paciente, las cuales, una vez modificadas genéticamente, serán reinoculadas en él mismo. En general, los vectores de
transferencia actuales presentan una eficacia de transducción notablemente superior
cuando éstos se utilizan in vitro sobre las células diana a transducir, frente a cuando
éstos se inoculan in vivo. Por ello, una gran parte de los protocolos actuales de TG
tienen su fundamento en la obtención, transducción y reinfusión de las células
transducidas. A pesar de ello, los vectores adenovirales, y en menor medida los retrovirales, se han comenzado a utilizar in vivo en protocolos de terapia génica antitumoral, mediante inoculaciones directas en la masa tumoral del paciente.
138
La revista Journal of Gene Medicine ha reportado que a finales del año
2005 estaban en marcha un total de 678 ensayos clínicos de terapia génica
en fase I; 219 en fases I/II, 147 en fase II y tan sólo 32 en fases II/II ó III.
Los vectores retrovirales y los adenovirales son los vectores de uso más frecuente en estos ensayos, pues cada uno de estos vectores se está utilizando
en un 25% de los protocolos. Le siguen los ensayos en los que se utiliza
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
DNA desnudo (16%), lipofección (8%), y el resto está muy repartido entre
ensayos que utilizan vectores adenoasociados, virus vaccinia, y hasta 20 tipos diferentes de vectores.
TERAPIA GÉNICA DE ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
Criterios para definir el vector de transferencia a utilizar
El éxito terapéutico de los tratamientos de TG depende fundamentalmente
de dos variables. En primer lugar, resulta necesario insertar eficazmente el transgén en las células diana deseadas. Por otra parte, es también necesario que el
gen se exprese adecuadamente, produciendo niveles suficientes de la proteína
terapéutica. En el caso de enfermedades metabólicas asociadas a defectos genéticos hereditarios, resulta evidente que la curación de la enfermedad sólo se obtendrá cuando a las células de los tejidos afectados les llegue de manera estable
en el tiempo niveles umbrales de la proteína deficitaria. Una de las aproximaciones más directas para lograr este objetivo es la de transducir la población celular afectada y/o sus células progenitoras con vectores que permitan la integración estable del transgén en el genoma celular. En los protocolos clínicos
diseñados al efecto, se han utilizado fundamentalmente vectores retrovirales, en
particular los derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV).
En un grupo significativo de aplicaciones clínicas -por ejemplo las relacionadas
con la terapia de la hemofilia- se ha comenzado a hacer uso de vectores adenoasociados (AAV). Tal como ocurre con los vectores retrovirales, estos vectores
permiten la inserción estable del transgén, si bien en este caso suelen ser varias
las copias integradas, con lo que parece que se consiguen mayores niveles de
expresión del transgén en las células diana. Los vectores lentivirales constituyen
también una herramienta ya considerada para su uso en protocolos clínicos de
TG humana, ya que mediante estos vectores se facilita la integración del transgén en células poco o nada proliferativas, con lo que se confía poder transducir
de manera muy eficaz las células madre de los diferentes tejidos.
139
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Figura 2. Correción genética
de células madre
hematopoyéticas de
pacientes con
enfermedades hereditarias.
140
El esquema básico seguido
en estos ensayos clínicos es el
que se muestra en la Figura 2.
Las células de la médula ósea
del paciente se extraen de la
médula ósea, se purifican y se
translucen con los vectores terapéuticos. Finalmente, la población conteniendo células
madre corregidas genéticamente son infundidas en el paciente, el cual en ocasiones puede
hacer recibido un tratamiento
submieloablativo para facilitar
el prendimiento del inóculo.
Principales enfermedades monogénicas que son
objeto de terapia genética
Hasta que los laboratorios de genética molecular ofrezcan alternativas eficaces para el tratamiento de mutaciones dominantes,
el tratamiento genético de las enfermedades metabólicas se está centrando en la
terapia de mutaciones monogénicas recesivas, en las cuales la expresión de una
copia funcional del correspondiente transgén pueda ser suficiente para la curación de la enfermedad.
En aquellas patologías metabólicas en las que no resulta posible o no es
del todo eficaz la administración exógena de la proteína deficitaria, se han
planteado alternativas de terapia celular o génica sobre estos pacientes. En relación a los protocolos clínicos de terapia celular, del orden de treinta enfermedades metabólicas pueden ser tratadas mediante trasplante de progenitores hematopoyéticos procedentes de donantes histocompatibles sanos. No obstante,
debido a las limitaciones de donantes histocompatibles y a los riesgos asociados al trasplante alogénico, una larga serie de enfermedades metabólicas monogénicas han sido consideradas para su tratamiento mediante la transferencia del
gen deficitario en las células que manifiestan la patología.
De todos los protocolos de TG de enfermedades asociadas a defectos monogénicos, a continuación se muestra el fundamento de algunos de los han sido
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
más relevantes, bien por su relevancia histórica, por su eficacia terapéutica o
por las expectativas generadas.
Inmunodeficiencias genéticas
Entre las inmunodeficiencias consideradas para su tratamiento genético
son de destacar las inmunodeficiencias severas combinadas asociadas a mutaciones en los genes de la Adenosina Deaminasa (ADA) y la inmunodeficiencia
SCID-X1.
La ausencia de la ADA implica una acumulación del sustrato desoxiadenosina trifosfato en las células, resultando particularmente tóxico para los linfocitos T (Figura 3). Ésta fue una de las primeras patologías en ser tratadas mediante protocolos de TG con vectores retrovirales, primero en el NIH de
Estados Unidos (Blaese et al., 1995; Khon et al., 1998), y luego en el Hospital
S. Raffaelle de Milán (Bordignon et al., 1993; 1995; Ferrari et al., 1992; Aiuti
et al 2002). Las dos alternativas que se han considerado para el tratamiento genético de esta enfermedad estuvieron basadas en la transferencia del
gen ADA en las células T de pacientes y también en células madre
hematopoyéticas (CMH). En todos
los casos se comprobó la presencia
de células transducidas en los pacientes y evidencias de mejora en
su inmunocompetencia. Muy recientemente se ha comunicado que
pacientes con deficiencia de ADA,
que fueron acondicionados con protocolos poco agresivos y trasplantados con células de médula ósea corregida genéticamente, han podi-
Figura 3.
Inmunodeficiencia
severa combinada ADA.
do hacerse independientes de la administración exógena del ADA
bovino y recuperado su función inmune (Aiuti et al 2002).
La inmunodeficiencia SCID-X1 representa aproximadamente la mitad de
todas las inmunodeficiencias severas y está asociada a un defecto en la cadena
γc, una proteína que forma parte de numerosos receptores de interleuquinas (Figura 4). La TG de estos pacientes se ha realizado mediante la transferencia de
la versión funcional del transgén a CMH, utilizando para ello técnicas optimi-
141
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
zadas de transferencia retroviral. Las
CMH se han trasplantado a once pacientes no acondicionados, habiéndose observado en diez de ellos la aparición de células del sistema inmune
conteniendo el transgén y una evidente mejoría clínica de los pacientes,
que les permitió abandonar las unidades de aislamiento a las pocas semanas del tratamiento (Cavazzana-Calvo
et al., 2000).
Figura 4. Señalización por
receptores de citoquinas
Se considera que este protocolo, desarrollado en Francia por
en la inmunodeficiencia
el grupo de A. Fischer, es el primer protocolo de TG de una enfer-
X1-SCID.
medad metabólica que ha demostrado una eficacia terapéutica incuestionable. Desgraciadamente, dos de los once pacientes actualmente tratados han desarrollado una leucemia linfocítica como
consecuencia de la activación del oncogén LMO2 en las células que habían incorporado el gen terapéutico. Esta observación supone, por tanto, también el
primer efecto patogénico asociado a una inserción retroviral en un paciente, y
pone de manifiesto la necesidad de evaluar el delicado equilibrio
beneficio/riesgo asociado a la práctica de la TG insercional (Hacein-Bey-Abina
142
et al 2003) en cada indicación clínica.
La granulomatosis crónica constituye otra inmunodeficiencia que ha
recibido atención particular para su tratamiento genético. Esta enfermedad
se caracteriza por un fallo por parte de las células fagocíticas para generar
el anión superóxido, por lo que se manifiesta mediante un síndrome recurrente de infecciones y formación de granulomas (Figura 5). Estudios experimentales sugieren que la corrección genética de aproximadamente un 5%
de los granulocitos circulantes será suficiente para reportar un beneficio terapéutico (Malech et al., 1999). Los estudios clínicos basados en el trasplante de células CD34+ transducidas sobre pacientes no acondicionados
no han mostrado beneficio terapéutico. No obstante, un ensayo clínico comenzado en Alemania con pacientes sometidos a un modelo de acondicionamiento modesto con busulfán ha evidenciado mejoría clínica en los dos
pacientes tratados.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Como conclusión
a los estudios realizados para tratar genéticamente pacientes con
enfermedades monogénicas, la Figura 6
muestra el número de
pacientes con inmunodeficiencias severas, así como los que
han mostrado evidencias de mejoría clínica. De estos estudios
se pone de manifiesto
que existe un número
de enfermedades monogénicas, para las
cuales la terapia génica comienza a ser una realidad
terapéutica. En este momento, son las cuestiones
de seguridad las que limitan el mayor desarrollo de
estos ensayos en la clínica
(Ver apartado 4).
Figura 5. Granulomatosis
crónica.
Enfermedades
de acumulación
de sustratos tóxicos
Un número relativamente elevado de genes se
han asociado a este tipo de
enfermedades. De entre todas ellas, la enfermedad de Gaucher es la
Figura 6. Beneficio clínico
de pacientes con
más frecuente, por lo que ésta es la enfermedad de acumulación li-
inmunodeficiencias
sosomal que ha sido objeto de más estudios de TG. La enfermedad
tratados mediante
de Gaucher está asociada a una deficiencia en glucocerebrosidasa
terapia génica.
143
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
(GC), por lo que se presentan importantes acumulaciones de glucocerebrósido
en macrófagos y en células derivadas de los mismos, produciéndose patologías
de la médula ósea, hígado, bazo y cerebro. Para que la TG de esta patología sea
eficaz se requerirá, por tanto, que las células corregidas alcancen órganos hematopoyéticos y no hematopoyéticos. En particular, para el tratamiento de la patología que afecta a la microglía del sistema nervioso central será necesario que
las células modificadas genéticamente migren al SNC y confieran allí el efecto
necesario sobre la manifestación neurológica. Hasta el momento se han realizado pocos estudios piloto, aunque los mismos se encuentran todavía en fases
tempranas de estudio clínico. Otras enfermedades de acumulación de sustratos,
tales como la mucopolisacaridosis de tipo II (síndrome de Hunter) han recibido
atención para su tratamiento genético, aunque su desarrollo no se encuentra tan
avanzado como en el caso de la enfermedad de Gaucher.
Hemofilia
Tanto la hemofilia A, producida como consecuencia de un defecto en la producción del factor VIII de coagulación, como la hemofília B, asociada al defecto
en el factor IX, han sido consideradas para su tratamiento por TG. Un estudio clínico reciente (Kay et al., 2000) ha mostrado las primeras evidencias de eficacia clínica asociada al tratamiento con vectores AAV que codifican el factor IX. En este
estudio, los vectores AAV se inocularon en el músculo de pacientes de hemofilia
B, obteniéndose resultados que sugieren que la hemofilia B podría transformarse
en una enfermedad más leve mediante la aproximación genética propuesta.
Enfermedades asociadas a defectos en la hemoglobina
La talasemia-β y la anemia falciforme constituyen las dos patologías de
este grupo más estudiadas para su tratamiento mediante TG. Constituyen las
dos enfermedades monogénicas más frecuentes, y su patología molecular ha sido ampliamente investigada. El remplazamiento de la globina-β, defectiva o
ausente en pacientes con talasemia β puede ser curativa. Los altos niveles de
expresión del gen que codifica la globina-γ normal en las células eritroides de
pacientes con anemia falciforme, se confía que sean beneficiosos, debido al en-
144
samblaje preferente de los tetrámeros α y γ, y la relativa inestabilidad de las
cadenas βs. La TG de esta enfermedad requerirá, sin embargo, muy altos niveles de expresión del transgén, lo cual supone una taréa todavía pendiente.
Anemia de Fanconi
La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosómica recesiva poco
frecuente entre la población, pero de muy mal pronóstico. Los pacientes suelen
desarrollar anomalías congénitas múltiples (en un 65% de los casos), fallo de
médula ósea y predisposición a cáncer. En promedio, la manifestación de la
aplasia se observa alrededor de los 8 años de edad, siendo la supervivencia media de estos pacientes de 16 años. Una de las características de esta enfermedad que la hacen particularmente apropiada para su tratamiento por TG radica
en la ventaja selectiva que parecen tener las células corregidas, respecto a las
células defectivas en los genes de Fanconi. La AF es consecuencia de mutaciones o deleciones en cualquiera de los ocho genes que en la actualidad se sabe
están implicados en una función celular relacionada con la estabilidad del genoma de estas células. Los resultados publicados sobre los ensayos realizados
en fase I no manifiestan beneficios terapéuticos evidentes (Liu et al., 1999). No
obstante, nuevos ensayos con protocolos optimizados de transducción están actualmente en marcha.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Fibrosis quística
El gen de la fibrosis quística (FQ) está localizado en el cromosoma 7 y
posee un tamaño de 6,7 kB. En un 75% de los pacientes enfermos de FQ la
enfermedad se produce por un defecto en la posición 508. Como consecuencia de las deficiencias de este gen se produce una alteración física y
química de las secreciones de las vías respiratorias y de las enzimas pancreáticas. Como consecuencia del defecto en el transporte del cloro entre
las células, las mucosidades se hacen muy densas, dificultando la expulsión
del moco bronquial y facilitando su infección con patógenos difíciles de
eliminar. La TG prioritaria de esta enfermedad radica en la inserción del
gen de la FQ en las células respiratorias. Hasta la actualidad se han desarrollado diversos ensayos clínicos en fase I utilizando vectores adenovirales, adenoasociados y liposomas (Alton et al., 1998). Los protocolos con
vectores adenovirales han mostrado ventajas respecto a su eficacia de transducción de las células diana; sin embargo, también han puesto de manifiesto su inmunogenicidad, al haberse generado anticuerpos que neutralizaron
la eficacia de los vectores adenovirales. Es de esperar que los protocolos
actuales, con vectores menos inmunogénicos y más eficaces, faciliten la
mejoría clínica de estos pacientes.
145
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER (TGC)
En los años 60 y 70 se sucedieron las primeras propuestas teóricas para el
tratamiento de enfemedades humanas mediante la introducción de material genético en los órganos o células afectados. En 1968 se reportó el primer experimento en el que se utilizó un virus oncogénico modificado como transportador
de material genético potencialmente terapeútico (Rogers S. y Pfuderer P. 1968).
Hubo que esperar al año 1979 hasta que apareciera el primer modelo animal
(Andreson W.F. y Fletcher J.C. 1979), lo que catapultó la investigación general
en el área. Sin embargo, la aplicación al campo de la terapia en cáncer se retrasó hasta el año 1987, cuando se abordó el tratamiento de leucemias (Howell et
al. 1987; Merz, B. 1987; Bank et al. 1987).
Biología molecular del cáncer
Figura 7. Bases
moleculares del cáncer
(Adaptada de Hanahan
2000).
146
El principal problema al que se enfrenta la TGC es que, en sus formas
más habituales, no se trata de una enfermedad monogénica y las células cancerígenas presentan un gran número de
anomalías genéticas y cromosómicas.
Por tanto, las filosofías y formas de trabajo habituales en el campo, más centradas en conseguir una mayor eficiencia de transducción en los órganos
diana, son sólo una parte del problema
en la TGC.
En base a esta premisa general, ha
sido necesario avanzar en el conocimiento molecular y fisiológico del
enemigo a batir, antes de contar con
herramientas suficientemente eficaces para afrontar el reto que
supone conceptualmente. Actualmente, y contando con que en cada tipo de tumor humano los circuitos implicados principales
pueden ser distintos, conocemos varios principios de la fisiología
tumoral sobre los que poder incidir con garantías razonables de
éxito. Las principales vías afectadas (en solitario o en combina-
ción) en los tumores humanos (Hanahan, D. y Weinberg, R.A., 2000), y en
las que se conocen genes importantes, son las siguientes (ver Figura 7):
1)
2)
3)
4)
5)
6)
Bloqueo de los programas de muerte celular programada.
Insensibilidad a señales antiproliferativas.
Generación de circuitos de supervivencia alternativos.
Proliferación descontrolada.
Invasividad y metástasis.
Inducción de angiogénesis asociada al desarrollo de tumores sólidos.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Todas estas vías pueden cooperar sin solución de continuidad y dependiendo del tumor humano concreto, de forma casi aleatoria (al menos poco predecible), por lo que ha sido necesario acumular esta información antes de poder
realizar un diseño terapéutico racional. Esta situación se resume en varias sinergias bien caracterizadas en tumores humanos.
Este desarrollo ha llevado a un cambio conceptual del "tumor", asumiéndose actualmente que se trata de un nuevo "tejido", con necesidades fisiológicas específicas. Frente a la visión "reduccionista" del tumor, asumiendo que es un
conjunto de células, relacionadas
clonalmente pero
heterogéneas por
su inestabilidad génica intrínseca, la
nueva visión emergente entiende el
tumor
como
"neotejido"
un
en
constante evolución, con unas necesidades cambiantes, tanto en términos metabólicos como protectores. El tumor
Figura 8. El tumor como
un tejido complejo.
genera señales y sustancias que "manipulan" su entorno fisioló-
Adaptada de Hanahan
gico en su propio beneficio; se está jugando su propia supervi-
y Weinberg (2000).
147
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
vencia. Los tumores primarios crecen autónomamente hasta que sus necesidades nutricionales les obligan a reclutar más recursos. Este es un momento
crítico (denominado angiogenic switch) en el que el tumor se estructura
atrayendo células de soporte, promueve la neovascularización de su entorno
(angiogénesis) y atrae células inmunes circulantes y las estimula para que
secreten metaloproteasas (p.e.) para favorecer su expansión y extravasación
(Figura 8).
En cada una de las vías anteriormente descritas se conocen algunos de los
mediadores o reguladores moleculares principales (master genes) sobre los que
se plantean las distintas aproximaciones terapéuticas. Dependiendo de cuál sea
la vía principal y cuál el mecanismo molecular afectado, los argumentos y estrategias terapéuticas son diferentes. A modo de ejemplo, ya que es imposible
ser exhaustivo en el marco de esta charla, comentaremos las principales estrategias desarrolladas y los protocolos técnicos asociados.
Terapia génica
del cáncer
Figura 9. Definición
de dianas en terapia
148
génica antitumoral.
Adaptada de Hanahan
y Weinberg (2000).
Lo primero a
tener en cuenta es
que los tratamientos
clínicos contra el
cáncer son tremendamente eficaces,
eliminando un altísimo porcentaje de
las células malignizadas. Los problemas fundamentales
derivan bien de la
agresividad de los
tratamientos, de la
aparición de quimioresistencias cruzadas, o bien de la existencia de
pequeños focos que no se eliminan y que pueden dar lugar a la reaparición de los procesos neoplásicos. En la actualidad, la mayoría
de los procedimientos desarrollados en base a la utilización de TGC
distan mucho de ser capaces de sustituir a los tratamientos clínicos actuales,
aunque pueden aspirar a combinarse con ellos.
La Figura 9 presenta de forma muy esquemática las principales estrategias, agrupadas de acuerdo con las distintas vías implicadas en la transforma-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
ción tumoral.
En términos generales, si el principal proceso afectado es la eliminación de los
mecanismos de control negativo de la proliferación, se intentan introducir versiones
correctas de estos genes (p.e. los genes p53 o p16; Chen y col, 2000; Swisher S.G.
y Roth, J.A., 2000; Cowen et al., 2000; Kawacabe et al., 2000). Si el defecto consiste en la resistencia a los mecanismos naturales de inducción de muerte celular
programada, se intentan expresar genes que la pueden promover o hacerla más
efectiva (caspasas, FasL, etc). Un buen ejemplo es el tratamiento de gliomas mediante la expresión de caspasa-8 con vectores adenovirales (Shinoura et al., 2000)
Si el tumor es muy dependiente de la inducción de neovascularización o es muy
propenso a metastatizar, se introducen genes que puedan bloquear o disminuir dichos procesos (VEGF-R, análogos de angiostatina, moduladores de integrinas o
metaloproteasas, etc; Chen et al., 2000; Carmeliet, 2000; Abruzzese et al., 2000).
Los procedimientos empleados para realizar la transferencia génica son
muy variados y dependen fundamentalmente de la biología y fisiología del tumor, pero esta etapa es crítica para el resultado final del tratamiento. Se emplean vectores virales (adenovirus, adeno-asociados, virus herpes, retrovirus, y
vectores derivados de lentivirus), vectores no-virales (liposomas, dendrímeros,
péptidos, bombardeo con micropartículas de oro que transportan las construcciones génicas, etc), y el procedimiento puede ser in vivo o ex vivo.
Como es imposible en esta presentación hacer una revisión exhaustiva de
todo el panorama en desarrollo del área, nos restringiremos a aquellas aproximaciones más específicas del campo o aquellas que más se han desarrollado.
Una rama especialmente desarrollada en la TGC es la introducción de genes
pro-citotóxicos en las células tumorales (fundamentalmente la timidina kinasa del virus herpes-HSV-TK-, y la proteína citidin-deaminasa -CDA-) lo que las susceptibiliza
a distintos compuestos (el más empleado es el ganciclovir, GCV) de forma diferencial con respecto a las células sanas. La administración de estas sustancias al modelo
animal o al paciente elimina las células tumorales transducidas y aquéllas que se encuentran en sus cercanías por un fenómeno conocido como "bystander", que está mediado por la transferencia de la droga metabolizada a las células circundantes.
149
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Dos son los modelos tumorales que más atención han recabado de las expectativas de la TGC, y lógicamente, son los tumores que peor pronóstico presentan
con los tratamientos clínicos actuales: glioma maligno y melanoma avanzados. El
tratamiento de gliomas ha sido evaluado por numerosos autores (revisado por
Klatzman et al., 1998), obteniendo resultados variables. Sandmair y col. han comparado la eficiencia del tratamiento, bien utilizando vectores retrovirales, bien con
adenovirus (Sandmair y col. 2000). Sus resultados demuestran claramente que los
efectos secundarios del tratamiento son aceptables, y que los pacientes tratados
con vectores adenovirales han mostrado una duplicación del tiempo de supervivencia (MRI), 15.0 meses, en comparación con los pacientes tratados con vectores
retrovirales, 7.4 meses, y el grupo control, 8.3 meses.
De 1998 a febrero de 2000 se han hecho públicos varios estudios clínicos
(Fase I/II) para el tratamiento de pacientes con melanoma cutáneo maligno y metastásico, mediante la administración intra-lesión de vectores adeno expresando
HSV-TK en combinación con dosis escaladas de ganciclovir (Klantzman et al.,
1998; Morris et al. 2000). En estos estudios se pretende determinar la dosis máxima de GCV que puede ser administrada en combinación con la administración autorizada del vector, evaluar la tasa terapéutica objetiva del ensayo y determinar si
existe efecto "bystander" en otras localizaciones lejanas al punto de tratamiento.
Esta estrategia es bastante efectiva, aunque todavía presenta algunos inconvenientes como los derivados de: 1) aparición de células tumorales resistentes al tratamiento, 2) eficiencia del proceso de transferencia y 3) generación de
inmunogenicidad por la expresión de una proteína de origen bacteriano (TK).
De forma adicional existe una rama casi exclusiva de la TGC que lidia
con mejorar la respuesta inmune del organismo frente a los tumores (inmunoterapia bioquímica y/o celular). En esta aproximación se utilizan también distintas aproximaciones que se pueden resumir en las siguientes:
1) Aislamiento, amplificación ex vivo, modificación génica (en algunos
casos) y retrasplante en el paciente de linfocitos autólogos del paciente (TILs,
LAKs, ALTs) que presentan afinidad por el tumor (Weijtens et al., 1998; Bolhuis R.L. y Gratama J.W., 1998).
2) Inmunización con DNA de oncogenes tumor-específicos (p.e - neu en
el caso de cáncer de mama-; Reilly et al., 2000; Amici et al., 2000).
150
3) Generación de vacunas autólogas, utilizando células tumorales inactivadas, primando células dendríticas (revisado por Kirk C. y Mule J., 2000), o
potenciando la inmunogenicidad de las células tumorales mediante la introduc-
ción de genes que favorecen el proceso (HGFs, ILs, moléculas accesorias, etc).
Ésta es una de las aproximaciones más evaluadas, con distintas filosofías. Miller y col. han demostrado que la administración intratumoral de células dendríticas modificadas con adenovirus que expresan IL-7, aumenta la respuesta in-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
mune antitumoral (cáncer de pulmón) hasta conseguir su erradicación (Miller
et al., 2000). El tratamiento del melanoma también se ha intentado mediante
técnicas de vacunación. Osanto y col. han publicado el tratamiento con éxito
de 33 pacientes afectados por melanoma metastásico, mediante su vacunación
con una línea celular de melanoma alogénica, manipulada para producir IL-2
(Osanto et al., 2000). Otros autores han tratado cinco pacientes con células tumorales autólogas transducidas para que secreten GM-CSF (Chang et al.,
2000), demostrando una remisión total en uno de los pacientes.
Cualquiera de estas aproximaciones presenta la gran ventaja respecto a los
tratamientos más convencionales que, al menos teóricamente, sería capaz de alcanzar los reservorios residuales del tumor (santuarios) que no son eliminables
por las terapias convencionales (cirugía, quimio y radioterapia), por lo que los
tratamientos más prometedores podrían ser utilizados en combinación con los
que actualmente se utilizan en clínica. Desde mi modesta opinión, estas aproximaciones parecen las más realistas y prometedoras para aumentar el arsenal terapéutico en la lucha contra el cáncer.
Finalmente se han introducidos nuevos vectores virales citotóxicos con una
particularidad esencial: se replican y amplifican preferentemente en las células tumorales (conditional replication-competent vectors). Actualmente existen varios
modelos preliminares (Alemany et al., 2000; Rancourt et al., 1999) que necesitarán
una posterior etapa de refinamiento y de bioseguridad, pero que son muy interesantes. En este último estudio se ha desarrollado un modelo para controlar la producción de partículas infecciosas tras la infección con un vector adenoviral (Ad5dl312)
al que se le había delecionado la función E1A, y sustituido por una función de síntesis activada por IL-6. La generación de partículas infecciosas depende de la producción celular de IL-6, por lo que el modelo terapéutico tiene un gran interés en
tumores que poseen un ciclo autocrino de IL-6, como el cáncer de ovario.
Una variante de esta última aproximación, que todavía se encuentra en fase de desarrollo, es la utilización de vectores retrovirales replicativos (RRV).
Solly y col. han publicado recientemente un primer estudio en el que comparan
la eficacia de transducción in vivo de los RRV (>85%) en comparación con los
151
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
vectores convencionales (<1%), para modificar masas tumorales desarrolladas
en modelos animales inmunocompetentes; los autores proponen el uso de estos
modelos para el tratamiento de tumores cerebrales en los que han demostrado
una eficiencia 1.000 veces mayor que los adenovirus deficientes en replicación
(Solly et al., 2003). Si se consiguen derivar vectores RRV condicionales se obtendrá una nueva y valiosa herramienta para la lucha contra el cáncer mediante
técnicas de manipulación genética.
LA SEGURIDAD EN TERAPIA GÉNICA
Problemas ocurridos en el tratamiento de la deficiencia
de la Ornitín Transcarbamilasa
Esta es una enfermedad en la que los pacientes carecen de una enzima clave del metabolismo de aminoácidos -la Ornitín Transcarbamilasa (OTC)- lo
que da lugar a una acumulación potencialmente fatal de amoniaco en la sangre.
Puesto que la actividad OTC está normalmente presente en el hígado, se considera que éste es el tejido diana de vectores que expresen la versión correcta del
gen OTC. En virtud de la eficacia de los adenovirus para infectar células hepáticas, se propuso utilizar tales vectores para transducir las células hepáticas de
estos pacientes con el gen OTC. Estudios in vitro, y también en animales de
experimentación, mostraron la eficacia del protocolo propuesto. El tratamiento
de 17 pacientes con dosis progresivamente crecientes del vector no manifestó
efectos tóxicos severos. No obstante, en uno de los pacientes tratados con la
dosis más alta se manifestó un proceso febril seguido de inflamación hepática
y aumento descontrolado de los niveles de amonio, dando lugar a la entrada en
coma del paciente. Lamentablemente el paciente falleció poco después, estando
todavía en investigación la causa primaria de su muerte. El fallecimiento de este paciente como consecuencia de la inoculación del vector viral disparó las
alarmas de los organismos reguladores, principalmente en lo que se refiere a la
inoculación in vivo de vectores de la familia de los adenovirus. En la actualidad se han generado nuevos vectores adenovirales desprovistos de la mayor
152
parte del esqueleto viral implicado en la inmunogenicidad de los mismos, por
lo que se confía en que su uso prevenga de la generación de respuestas inmunogénicas no previstas.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Incidencia de leucemias en pacientes X1-SCID tratados
mediante terapia génica
Desgraciadamente, tres de los diez pacientes X1-SCID que han sido tratados en el Hospital Necker, mediante terapia génica, han desarrollado leucemias
asociadas a la inserción del gen terapéutico en la proximidad de oncogenes
(Hacein-Bey-Abina et al. 2003). De particular significado ha sido la observación que en dos de estos pacientes la inserción se ha observado próxima al oncogén LMO2, implicado en leucemias linfocíticas. Como se recoge en la Figura 10, en ninguno de los otros protocolos en marcha, ni tampoco en los
pacientes X1-SCID tratados en Londres, se han observado efectos adversos severos similares.
El conocimiento de las bases moleculares por las cuales se han producido
las leucemias en estos pacientes aún está por resolver. No obstante, estas evidencias sugieren la conveniencia de proseguir los trabajos que tienen por objeto mejorar la seguridad de
los vectores dirigidos a
tratar pacientes por esta
nueva aproximación terapéutica.
Como también sucedió con la quimioterapia o
la radioterapia, los primeros efectos severos adversos asociados a la terapia
génica también han quedado ya de manifiesto. En
los próximos años los investigadores habrán de ser
capaces de demostrar que
Figura 10. Incidencia
la relación entre el beneficio clínico y el riesgo asociado a la terade efectos adversos
severos en pacientes
pia génica es positiva para el paciente. Este hecho repercutirá en la
con inmunodeficiencias
expansión de una nueva herramienta terapéutica para pacientes que
tratados con
no tienen otra opción terapéutica eficaz.
terapia génica.
153
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
155
FARMACOCINÉTICA DE LOS MEDICAMENTOS
OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍA
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
Alfonso Domínguez-Gil Hurlé. Servicio de Farmacia. Hospital Universitario de Salamanca
FARMACOCINÉTICA
Toda sustancia con actividad farmacológica queda definida no solamente
por su configuración estructural sino también por sus propiedades físico-químicas y biológicas, entre las que se incluye el perfil farmacocinético que cuantifica, mediante diversos parámetros, los procesos de absorción, distribución, metabolismo y excreción1.
La farmacocinética se ha consolidado durante los últimos años como una
disciplina de gran interés sanitario. Su aplicación se dirige, principalmente, hacia
el desarrollo de nuevos medicamentos y a la optimización de los tratamientos
farmacológicos2. Otras aplicaciones menos conocidas son la detección diagnóstica de respuestas anómalas, el análisis retrospectivo de errores terapéuticos o tratamientos inadecuados y las actividades educativas encaminadas a asegurar el
uso seguro y eficaz de los medicamentos. Dentro de la investigación farmacológica, la farmacocinética puede dirigirse también a la resolución de aspectos clínicos concretos como la detección de interacciones, problemas de biodisponibilidad o a la definición de parámetros útiles para el diseño de regímenes de
dosificación individualizados. La farmacocinética es hoy de gran utilidad para todos aquellos profesionales implicados en el desarrollo, evaluación y uso de los
157
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
158
medicamentos. La farmacodinamia expresa
la variación del efecto
con la concentración y
asociada a la farmacocinética constituye la
base para la definición
de la respuesta en los
tratamientos farmacológicos.
Figura 1. Relación de la
La actividad intrínseca que presenta un fármaco es condición
farmacocinética y
necesaria, pero no suficiente, para asegurar la eficacia terapéutica. El
farmacodinamia
fármaco precisa, necesariamente, alcanzar su lugar de acción, no
con la respuesta
siempre bien definido, en ocasiones difícilmente accesible o cuya acterapéutica.
cesibilidad se modifica con la gravedad de la enfermedad. Para ello
se puede requerir, por ejemplo, una biodisponibilidad elevada, una
amplia distribución tisular o un lento aclaramiento plasmático. Unas propiedades farmacocinéticas desfavorables pueden llegar a condicionar el potencial terapéutico de un nuevo fármaco y aconsejar la interrupción de los ensayos clínicos programados en su desarrollo. La Figura 1 muestra esquemáticamente la
contribución de la farmacocinética y la farmacodinamia en la respuesta a un
tratamiento farmacológico3.
Es posible establecer distintos tipos de relaciones entre la farmacocinética
y la farmacodinamia de péptidos y proteínas de interés terapéutico. Así, los valores del área bajo la curva de niveles séricos de algunos agentes trombolíticos
se correlacionan directamente con la permeabilidad en el infarto vascular. Un
modelo PK-PD ha sido utilizado para el diseño de las pautas de dosificación de
reteplasa, un agente trombolítico recombinante.
Con frecuencia no es posible establecer, para péptidos y proteínas, una relación directa concentración-efecto debido a que la variable medida suele ser la
resultante a dos o más procesos cinéticos que ocurren después de la fijación a
receptores. La Figura 2 recoge el modelo PK-PD con respuesta indirecta establecido para la hormona de crecimiento utilizando diferentes vías de administración4. En algunos casos, se requieren modelos PK-PD complejos para poder
definir una relación entre las concentraciones séricas y la respuesta, como se ha
demostrado con interleuquina-2, eritropoyetina, etc.
Los resultados
obtenidos en los estudios farmacocinéticos
junto a los procedentes
de los ensayos de eficacia y seguridad configuran el perfil farmacológico de un nuevo
medicamento, permitiendo establecer los
principios básicos para
Figura 2. Modelo
su correcta utilización en la práctica clínica.
farmacocinéticoLa investigación de nuevos fármacos se orienta, con frecuencia,
farmacodinámico
a mejorar algunas características farmacocinéticas, especialmente la
establecido para la
hormona de crecimiento.
absorción gastrointestinal, la distribución tisular y la velocidad de
eliminación. Ello se consigue mediante cambios en la estructura química o en la formulación farmacéutica que puede modificar la cinética de liberación, el acceso a los tejidos e incluso los procesos de metabolismo y excreción5. Estos cambios permiten mejorar la efectividad de los tratamientos bien
por cambios en el perfil de la respuesta o facilitando la administración y mejorando el cumplimiento de la prescripción.
La estructura química que presentan la mayoría de los productos biotecnológicos condiciona algunas propiedades, que pueden dificultar su utilización terapéutica y que se refleja en su perfil farmacocinético. Entre ellas destacan la
baja biodisponibilidad por vía oral, ciertas exigencias en la distribución tisular
y celular y un aclaramiento plasmático elevado.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
MEDICAMENTOS BIOTECNOLÓGICOS
Los medicamentos obtenidos por Biotecnología constituyen una clase terapéutica emergente en la clínica que presenta unas características diferenciales
no solo por su origen, sino también por su estructura química y algunas propiedades farmacocinéticas y farmacológicas.
Aunque la biotecnología moderna nace en 1953 al conocerse la estructura
del ácido desoxirribonucleico (ADN), su incorporación a la terapéutica humana
159
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
no se produce hasta comienzos de los años 80 con la utilización de la insulina
y de la hormona de crecimiento recombinantes en terapia sustitutiva. Desde entonces se han incorporado al arsenal terapéutico unos 100 medicamentos, aunque cerca de 700 moléculas, para el tratamiento de unas 250 enfermedades, se
encuentran en diferentes fases de investigación clínica. Diversos analistas clínicos coinciden en afirmar que los medicamentos biotecnológicos llegarán a representar, en un futuro, el 20-25% de todos los recursos farmacológicos6.
Los medicamentos biotecnológicos incluyen proteínas obtenidas por ingeniería genética, anticuerpos monoclonales producidos mediante la tecnología
del hibridoma, vectores para el transporte de material genético, fragmentos de
anticuerpos, oligonucleotidos antisentido, vacunas, etc. Estos productos presentan algunas características que los diferencia de los medicamentos tradicionales. Su estructura química, por ejemplo, es más compleja ya que se trata, con
frecuencia, de proteínas que contienen un número elevado de aminoácidos (filgastrin 174, somatropina 191, alteplasa 527, etc.) con una determinada secuencia, con especificidad en el número y localización de los puentes disulfuro e
incorporación de una o varias moléculas de carbohidratos que son necesarias
para la actividad biológica. La cadena proteica puede presentar, además, hélices en distinto número, tamaño y configuración. Asimismo, algunas proteínas
activas requieren la asociación de varias subunidades proteicas para formar un
gran agregado activo, estructura cuaternaria, como ocurre, por ejemplo con el
interferon-α-1b formado por dos proteínas idénticas de 165 kDa unidas por
uniones no covalentes7.
BIODISPONIBILIDAD ORAL
Los péptidos y proteínas presentan una baja biodisponibilidad por vía oral,
generalmente inferior al 1%, por lo que en principio no son candidatos idóneos
para utilizar esta vía de administración. Ello es debido a su inestabilidad en el
medio fuertemente ácido del estómago, al efecto producido por las peptidasas
intestinales, y especialmente a su escasa permeabilidad como consecuencia del
tamaño molecular, la carga eléctrica y la elevada polaridad. La mayoría de las
160
proteínas recombinantes se incluyen dentro de la clase III del sistema de clasificación biofarmacéutica; solamente algunas pertenecen a la clase IV y es excepcional que algunas biomoléculas se incluyan en la clase I. Es decir, los pro-
ductos obtenidos por Biotecnología suelen presentar una solubilidad en agua
alta o moderada y una permeabilidad intrínseca baja o muy baja8.
La capacidad de los fármacos para atravesar las barreras biológicas constituye un parámetro biofarmacéutico de gran interés del que depende no sólo la
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
absorción, sino también la distribución, metabolismo y excreción. Aunque las
diferentes membranas biológicas presentan unas características específicas, los
principales constituyentes siempre son: fosfolípidos, colesterol, esfingolípidos y
glicolípidos. Por tanto, para que un fármaco supere las diferentes membranas
biológicas y alcance su lugar de acción debe presentar un balance adecuado entre hidrofilia y lipofilia, que se expresa habitualmente por el coeficiente de reparto octanol-agua (P) o más fácilmente por log P. Este parámetro es un buen
predictor de la permeabilidad de muchos fármacos y puede ser correlacionado
con diversos parámetros farmacocinéticos. Ello no es posible cuando se trata
de péptidos y proteínas, debido a que en su estructura están presentes numerosas funciones polares que forman puentes hidrógeno con los grupos hidroxilo
de la fase acuosa. Los péptidos presentan, en consecuencia, coeficientes de reparto más altos, que no se corresponden con la permeabilidad. No obstante,
pueden obtenerse buenas correlaciones cuando se determina el número de
puentes de hidrógeno potenciales que pueden establecerse con el agua. Los coeficientes de reparto heptano-etilenglicol o la diferencia entre los coeficientes
de reparto octanol-agua y ciclohexano-agua (ΔlogP) permiten estimar los puentes hidrógeno o la desolvatación potencial de las moléculas peptídicas que son
buenos predictores de la permeabilidad. De esta forma es posible anticipar el
efecto de las modificaciones estructurales en la absorción oral de péptidos de
interés terapéutico, lo que es de gran utilidad en el desarrollo de nuevas moléculas. La desolvatación potencial que presentan diferentes péptidos ha podido
ser relacionada con parámetros farmacocinéticos que describen el proceso de
absorción como Cmax y AUC.
Factores fisiológicos como el tiempo de tránsito gastrointestinal, la dilución y las interacciones con componentes de los alimentos reducen la fracción
de dosis disponible para la absorción de péptidos y proteínas. Finalmente, el
efecto del "primer-paso" y las "bombas de eflujo" también son responsables de
la escasa biodisponibilidad oral que presentan los productos obtenidos por biotecnología.
La Figura 3 muestra algunos de los factores más importantes que reducen
la biodisponibilidad oral de moléculas proteicas.
161
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
Pese a esta situación, sabemos que algunos medicamentos
con estructura peptídica como antibióticos
β-lactámicos, inhibidores de la ECA o la
ciclosporina presentan
valores de biodisponibilidad que permiten
su administración por
vía oral y tienen acreditado su valor terapéutico. Asimismo, pequeFigura 3. Efecto del
metabolismo y del
ños péptidos procedentes de la digestión de las proteínas de la dieta
contratransporte por
o incluso algunos antígenos naturales solubles se absorben intactos.
gliclop-P en la
A diferencia de otros fármacos algunas proteínas recombinantes
biodisponibilidad oral de
presentan una actividad intrínseca muy elevada, hasta el punto de poproteínas.
der admitir que una biodisponibilidad del 10% podría ser suficiente
para alcanzar los objetivos terapéuticos cuando se administran por vía oral.
La Figura 4 recoge algunas de las alternativas en desarrollo para mejorar
la biodisponibilidad oral de péptidos y proteínas.
Figura 4. Proteínas por vía oral: ¿es posible?
- Modificaciones estructurales:
• Emisphere Technologies y Nobex Corporation (insulina, hormona del
crecimiento y paratohormona).
• Generes Biotechnology Corp: Oral-lyn® (oral insulin spray*).
- Sistemas endógenos de transporte celular:·
• Inhibidores de la P-glicoproteína, G-CSF-transferrina.
- Partículas como sistemas de transporte:
• Liposomas recubiertos con mucoadhesivos, hidrogeles.
- Nanosistemas (<500 nm):
• Nanopartículas vectorizadas (β1 Integrinas, lectinas).·
162
• Vacunas orales.
*primera formulación oral de insulina comercializada
ADMINISTRACIÓN PARENTERAL
Debido a las limitaciones de la vía oral, los péptidos y proteínas se admi-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
nistran habitualmente por vía parenteral, preferentemente endovenosa. La mayoría de estas moléculas presentan un rápido aclaramiento, lo que conduce a
valores bajos en la semi-vida de eliminación
Los problemas que surgen con la administración parenteral de macromoléculas que presentan un rápido aclaramiento ha estimulado el desarrollo de diferentes actuaciones dirigidas, en principio, a modificar el perfil farmacocinético
y, en consecuencia, facilitar su administración. Ello se ha conseguido mediante
cambios estructurales, por conjugación con diversos polímeros, por hiperglicosilación de las proteínas y con el desarrollo de formulaciones parenterales de
liberación controlada9-11.
Entre las modificaciones estructurales pueden citarse las derivadas de la
insulina de acción ultralarga como el (Fmoc)2-insulina, un profármaco cuya
transformación en insulina presenta un t1/2 = 12 ± 1 días en ratas. No se han
publicado aún los resultados de los estudios en humanos.
La conjugación de péptidos y proteínas con diversos polímeros constituye
actualmente un área de gran interés especialmente en la terapéutica oncológica
a la que se han incorporado proteínas antitumorales, enzimas, citoquinas, etc.
La conjugación con polímeros produce cambios significativos en el perfil farmacocinético de las macromoléculas, permitiendo superar algunas de las limitaciones que presentaban para su utilización clínica. El principal cambio es un
incremento en la semi-vida de eliminación con un aumento de la captación celular por endocitosis. Una vez en sangre se produce la liberación del conjugado
a los compartimentos endosómicos y lisosómicos de la célula con descenso del
pH (5,5-6,0). Una vez alcanzado el lisosoma se produce la degradación metabólica por acción de las hidrolasas intracelulares, como se puede observar en la
Figura 5.
La pegilación de proteínas con una o varias cadenas de polietilenglicoles
(PEG) es, posiblemente, el mecanismo de conjugación más desarrollado. Los
PEG son polímeros lineales o ramificados constituidos por unidades de óxido
de etileno (-CH2-O-CH2-) que presentan dos grupos hidroxilo terminales, los
cuales pueden ser activados químicamente 12. La reacción de pegilación más
frecuente implica al grupo ε-amino de la lisina o grupos amino terminales de
163
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
164
las proteínas. Las biomoléculas conjugadas
presentan propiedades
físico-químicas diferentes de las proteínas
originales, como cambios conformacionales,
impedimento estérico,
capacidad de unión
electrostática, valores
de pK locales de la lisina, hidrofobicidad
punto isoeléctrico, etc.
Estos cambios pueden
quedar reflejados, en
principio, por cambios
Figura 5. Captación
en la actividad detectada mediante ensayos in vitro y en la eficacia,
celular de un polímero
establecida utilizando ensayos in vivo. La fijación a receptores se repor endocitosis.
duce progresivamente al aumentar la masa molecular del polímero,
lo que produce un descenso de la actividad cuando se utilizan ensayos in vitro con tiempos de incubación cortos. Sin embargo, la eficacia de la
proteína se incrementa como consecuencia de los siguientes mecanismos:
a) Retraso en el aclaramiento renal de la proteína que produce un incremento en la semi-vida de eliminación y en el valor del área bajo la curva de
niveles séricos. Este último parámetro refleja el "periodo de exposición" y se
relaciona, en ocasiones, con la eficacia en modelos pK-pD.
b) Mayor estabilidad frente a los enzimas responsables de la degradación
de peptidos y proteínas frecuentemente como consecuencia del impedimento
estérico.
c) Menores efectos adversos debido a que el PEG reduce significativamente la inmunogenicidad y antigenicidad de las proteínas.
La pegilación de interferones también produce cambios significativos en el
perfil farmacocinético-farmacodinámico que pueden suponer un progreso en el
tratamiento de la hepatitis C y otras indicaciones. La Figura 6 muestra el efecto
provocado en las concentraciones séricas del interferón-α-2a como consecuencia de su conjugación con el PEG. El efecto depende del tamaño del polímero
y se ha considerado
que dos cadenas ramificadas de 20 kDa proporcionaban un perfil
farmacológico idóneo
para el desarrollo clínico13.
Durante los pasados 20 años han sido
estudiados numerosos
conjugados de proteínas con PEG (citotóxiFigura 6. Farmacocinética
cos, antioxidantes, enzimas, trombolíticos, citoquinas y factores de
de interferón y dos
crecimiento hematopoyético, etc.) aunque sólo algunos se encuentran
derivados pegilados.
en fase de desarrollo clínico. La conjugación con PEG ha sido aplicada también a oligonucleótidos y lípidos para aumentar su solubilidad, estabilizar las moléculas, incrementar la permeabilidad o disminuir el aclaramiento14.
Los glicoconjugados son aquellos compuestos resultantes de la unión covalente de una fracción glucídica con otro compuesto que puede ser protídico o
lipídico. La eritropoyetina recombinante es una glicoporteína utilizada desde
hace más de 10 años en el tratamiento de la anemia renal. Su excreción renal
es mínima, pero es ampliamente metabolizada en el hígado vía receptores de la
galactosa. Los residuos de ácido sialico eliminados en el proceso de biotransformación aseguran la estabilidad de la hormona y su actividad biológica. El
metabolito desprovisto de ácido sialico es rápidamente eliminado, siendo la semi-vida de eliminación de la eritropoyetina de 4-8 horas.
Diversos estudios experimentales han demostrado que hay una relación
directa entre el contenido de ácido sialico y la semi-vida de eliminación de
las glicoproteínas, lo que ha sido un estímulo para la búsqueda de nuevas
moléculas.
La darbepoetina alfa es un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina que
presenta distintas propiedades físico-químicas y biológicas. La Figura 7 recoge
la estructura de ambas moléculas estimulantes de la eritropoyesis así como la
evolución de los niveles séricos obtenidos tras su administración por vía intravenosa. La principal consecuencia del cambio producido en el perfil farmacoci-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
165
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
166
nético será de modificación del intervalo
posológico, que pasará
de 3 a 4 días con la
eritropoyetina a 7-14
días con NESP15.
En los últimos
años se han desarrollaFigura 7. Estructura y
do numerosas matrices poliméricas biodegradables y biocompatibles
farmacocinética de
que se han incorporado a microcápsulas, microesferas, nanoesferas e
eritropoyetina y NESP.
implantes para conseguir una liberación prolongada de pequeñas moléculas. Actualmente, algunos de estos polímeros se utilizan en el diseño de formulaciones parenterales de medicamentos obtenidos por biotecnología16. Entre ellos destacan los poli (α-hidroxiácidos) como el ac.poliláctico y el
ac.polihidroxibutírico y co-polímeros, especialmente el ac.láctico-ac.glicólico.
Estos productos no son inmunogénicos y permiten, por sus propiedades físicoquímicas controlar la velocidad de liberación de péptidos y proteínas. El diseño
y fabricación de estas formulaciones difiere de los habitualmente utilizados con
fármacos de bajo peso molecular que presentan, en general, una mayor estabilidad durante los procesos de separación de fases, evaporación de disolventes,
emulsión, atomización, etc. Estos procesos exigen temperaturas elevadas, concentraciones altas de tensoactivos, mezcla de disolventes, etc. que provocan, en
muchos casos, una degradación acelerada de proteínas. Para evitar la pérdida
de actividad asociada a la degradación química debe recurrirse a la liofilización
de las proteínas, homogeneización de la suspensión proteína-polímero, secado
por atomización en nitrógeno liquido, eliminación del disolvente del polímero
con etanol y filtración y secado bajo vacío17. Estas técnicas han sido utilizadas
en el desarrollo de microesferas de liberación controlada de proteínas recombinantes, como la hormona de crecimiento interferón-α, interleuquina-2, calcitonina, hormona liberadora de tirotropina, etc.
La liberación de las proteinas microencapsuladas en el organismo es un
proceso complejo e incluye habitualmente la hidratación de las partículas, disolución del fármaco con difusión a través de los poros de la matriz polimérica y
biodegradación del polímero. La duración del proceso de liberación está condicionada por diversos factores como la composición del polímero, la presencia
de modificadores de la liberación, etc.
La posibilidad de modular el proceso de liberación ha permitido el diseño
de vacunas para administración en dosis únicas. Las micropartículas (1-200
mm) del copolímero láctico-glicólico están siendo utilizadas como portadores
de antígenos para la inmunización frente a bacterias, virus y parásitos. Sin em-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
bargo, el progreso es lento debido a que no existe un consenso sobre la cinética
óptima de liberación y por las dificultades para mantener la estabilidad física y
química de los antígenos.
La mayor complejidad de estas formulaciones en relación con las de liberación inmediata obliga a adoptar precauciones especiales en la optimización
de su producción industrial. Los principales puntos críticos son la integridad de
la proteína y el valor del Cmax en ratas, utilizado como parámetro farmacocinético que refleja la eficacia del proceso de encapsulación.
DISTRIBUCIÓN TISULAR Y CELULAR
La incorporación de los fármacos a órganos y tejidos corporales es un proceso cinético complejo con una gran repercusión en la respuesta terapéutica. La
velocidad de distribución puede estar limitada por la perfusión sanguínea o por
la permeabilidad lo que condiciona el acceso y permanencia en su lugar de acción. La fracción de la dosis de un fármaco que alcanza finalmente los tejidos,
o incluso los espacios intracelulares, depende de numerosos factores, muchos
de ellos dependientes de sus propiedades físico-químicas. Por ello, las pequeñas moléculas con un óptimo coeficiente de reparto acceden con facilidad a los
compartimentos periféricos y presentan valores elevados del volumen aparente
de distribución, a diferencia de los péptidos y proteínas que presentan valores
relativamente pequeños. El elevado peso molecular que presentan algunas biomoléculas constituye un factor limitante de la distribución tisular. Sin embargo,
en algunos casos es posible alcanzar el lugar de acción en concentración suficiente para producir una respuesta terapéutica adecuada.
La especificidad en la localización del lugar de acción de muchos fármacos obtenidos por Biotecnología obliga a mayores exigencias en su perfil de
distribución. El desarrollo de los factores de crecimiento y genes recombinates
para promover la angiogénesis en el infarto de miocardio es un buen ejemplo
de la importancia de esta característica farmacocinética18. La administración
endovenosa del factor de crecimiento de fibroblastos (FCF) no produce res-
167
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
puesta angiogénica en modelos experimentales de isquemia miocárdica. Por
ello ha sido necesario recurrir a la administración directa en el miocardio, en el
saco pericárdico o en el espacio perivascular, para alcanzar la respuesta terapéutica deseada. La eficacia de estas alternativas fue confirmada y evaluada
por medida del flujo y función miocárdica, aunque se hace preciso aún aplicar
nuevas técnicas, como la tomografía de emisión de positrones o la resonancia
magnética, para establecer, de forma más precisa, la extensión de la respuesta
angiogénica.
Una situación más problemática se plantea cuando se precisa el acceso intracelular de genes y oligonucleótidos antisentido, cuya diana está localizada en
el compartimento citosol/núcleo19. Se han propuestos diferentes mecanismos para explicar la internalización de estas moléculas como la endocitosis en fase
fluida y la endocitosis mediada por receptores, ya que no hay evidencia de paso
por difusión pasiva, ni siquiera recurriendo a biomoléculas neutras. En el momento actual la escasa capacidad de internalización y la inadecuada compartimentalización intracelular constituyen un problema básico en el progreso de la
terapéutica antisentido. Recientemente se han desarrollado diferentes métodos
físicos (microinyección, permeabilización, electroporización, etc.), que mejoran
la captación celular de los oligonucleótidos en relación a los métodos convencionales de conjugación o aquéllos que recurren a transportadores (liposomas,
lipoplexes, policationes, etc.). También puede recurrirse a la administración de
estos medicamentos en el tejido diana, como el fomivirsen administrado por inyección intravítrea directa en el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus.
La selectividad en la distribución permite mejorar la relación beneficioriesgo de numerosos medicamentos, lo que puede incrementar su potencial terapéutico. Esta última consideración ha vuelto a poner de actualidad el concepto de "bala mágica", idealización introducida por Paul Erlich hace casi un siglo
y que gracias a la Biotecnología puede convertirse en una realidad20.
Los sistemas de transporte coloidal como liposomas, nanopartículas, microsferas, etc. han sido utilizados para prolongar el tiempo de circulación de
numerosas moléculas, protegerlas de la degradación y dirigirlas a tejidos diana.
Estos sistemas tienen dificultades para acceder a los tejidos sanos, debido, entre otros factores, a su tamaño, especialmente si supera 20 nm, considerado el
168
tamaño crítico para la mayoría de los tejidos.
Los liposomas son opsomizados por las proteínas plasmáticas en la circulación sistémica y reconocidos por el sistema reticuloendotelial (SRE) acumu-
lándose preferentemente en el hígado. Los liposomas son vehículos adecuados
para el transporte de péptidos y proteínas inmoduladoras debido a su absorción
linfática y a la captación y metabolismo por los macrófagos. Ello ha impulsado
el desarrollo de liposomas conteniendo interleuquina-2, factores de crecimiento
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
eritropoyético e interferones. Además, los liposomas, como algunas macromoléculas, pueden acumularse también en los tumores debido a la falta de drenaje
linfático normal y a la lenta velocidad de difusión.
Para evitar o reducir la captación por el SRE, se ha optado preferentemente por incrementar la hidrofilidad superficial mediante sialoconjugados sintéticos y más recientemente con PEG. Estos liposomas de lento aclaramiento han
sido utilizados para la vectorización activa y pasiva de medios diagnósticos y
terapéuticos.
Las mayores dificultades se plantean para dirigir los liposomas a aquéllos
tejidos donde normalmente no se acumulan. Ello ha obligado al desarrollo de
diferentes tipos de vectores como oligosacáridos, oligonucleótidos, péptidos,
proteínas, vitaminas, anticuerpos monoclonales y receptores.
En principio sería posible dirigir los liposomas a todo tipo de células,
siempre que los vectores sean adecuados, aunque algunos problemas como el
acceso a los tejidos y el rápido aclaramiento pueden disminuir las posibilidades
terapéuticas.
El desarrollo de los anticuerpos monoclonales representa una de las técnicas
más poderosas para dirigir fármacos, tóxicos, isotopos y enzimas a su lugar de
acción. El gemtuzumab es un anticuerpo recombinante humanizado dirigido frente al antígeno CD33 y unido a la calicheamicina, un potente antibiótico tumoral.
Se trata del primer fármaco vectorizado introducido en quimioterapia y ha sido
aprobado por la FDA a finales del año 2000 en el tratamiento de la leucemia
mieloide aguda en casos de recidivas. Gemtuzumab se une al antígeno CD33, expresado en el 80-90% de los pacientes con leucemia mieloide aguda, penetrando
en la célula y liberando el agente citotóxico que provoca la muerte celular.
El potencial terapéutico de estos agentes se ha incrementado desde la introducción de la tecnología del hibridoma en los años 70 y actualmente se dispone de fármacos inhibidores de la reactividad aloninmune y autoinmune, antitumorales, antiplaquetarios antivirales, etc. En España se han introducido
recientemente transtuzumab, infliximab y rituzimab, aunque otros muchos se
encuentran en diferentes fases de desarrollo, alcanzando casi un 25% de todos
los productos obtenidos por Biotecnología21.
169
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
A pesar de las ventajas potenciales que presentan al fijarse selectivamente
a las células diana, su incorporación a la terapéutica presentó mayores dificultades de las inicialmente previstas. Entre ellas figuran la capacidad limitada de
penetración tisular que depende, entre otros factores, de las dimensiones del
anticuerpo. Los anticuerpos convencionales son proteínas de elevado peso molecular que presentan una baja capacidad de acceso a tejidos, especialmente
aquéllos que tienen escasa vascularización. En terapéutica oncológica con anticuerpos monoclonales, la relación de concentraciones entre el tumor y la circulación sistémica se incrementa lentamente durante varios días debido a la eliminación del anticuerpo y, en menor grado, a la captación tumoral22.
METABOLISMO Y EXCRECIÓN
Los péptidos y proteínas se eliminan del organismo por metabolismo y excreción renal. El metabolismo se produce principalmente por proteolisis en diferentes localizaciones del organismo como consecuencia de la amplia dispersión que presentan los enzimas proteoliticos. La velocidad y extensión de la
degradación metabólica es muy variada y depende de la estructura química, vía
de administración etc.
El tracto gastrointestinal constituye el ambiente más hostil para las proteínas debido a los numerosos enzimas proteolíticos que se encuentran, a elevadas
concentraciones, a lo largo del tubo digestivo. La encapsulación con materiales
entéricos no es suficiente para proteger su integridad química durante el periodo de tiempo que transcurre entre la liberación y la incorporación a la circulación sistémica. En el pasado se trató de superar este inconveniente asociando a
las proteínas inhibidores enzimáticos (p.e. aprotinina), pero actualmente su uso
está desaconsejado. Sin embargo, se han obtenido resultados esperanzadores incorporando las proteínas en partículas biodegradables mucoadhesivas, que contienen inhibidores metabólicos unidos de forma covalente con diferentes polímeros23.
Una de las principales limitaciones de los agentes antisentido es la degradación enzimática por las nucleasas que se produce en sangre y en el interior
170
de las células. La semi-vida de degradación de los oligonucleótidos que contienen uniones fosfodiester es próxima a 5 minutos lo que impide su utilización
en clínica.
Ello ha impulsado el desarrollo de nuevos oligonucleótidos más estables
frente a las nucleasas y que mantengan su capacidad para fijarse al lugar de acción. Para mejorar la estabilidad metabólica se han modificado las uniones fosfodiester, los azúcares y las bases heterocíclicas. Los derivados mejor conoci-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
dos son los fosforotionatos en los que los átomos de oxígeno del fosfato han
sido sustituidos por azufre. Sin embargo, aún estos derivados son metabolizados en animales experimentales en mayor extensión que las previsiones apoyadas en los resultados de estudios en cultivos celulares. Por ello, se hace preciso
introducir mejoras en el perfil farmacocinético de los agentes antisentido, incrementando su estabilidad metabólica24.
La excreción renal se produce por los mismos mecanismos que afectan a
los fármacos de bajo peso molecular. Las macromoléculas menores de 68
kDa podrían experimentar una filtración glomerular, aunque la capacidad de
filtración depende también de la carga y rigidez de la molécula. La influencia de la carga se pone especialmente de manifiesto con moléculas cuyo radio es superior a 2 nm. Después de la filtración, los péptidos complejos y las
proteínas son reabsorbidos en los túbulos proximales por endocitosis e hidrolizados a fragmentos peptídicos o aminoácidos que retornan a la circulación
sistémica. En consecuencia, sólo cantidades mínimas de las proteínas intactas son detectadas en la orina. Los péptidos y proteínas pueden también experimentar una secreción tubular desde los capilares postglomerulares, acompañada también de una degradación metabólica. Esta vía de eliminación es
utilizada por diversas hormonas como calcitonina, insulina, vasopresina, angiotensina II, etc.
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APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA
RECOMBINANTE VEGETAL A LA TERAPÉUTICA
HUMANA
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
Fernando Ponz. Departamento de Biotecnología. INIA, Madrid
DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Aproximadamente, durante las dos últimas décadas se han producido, en
el conjunto de las actividades ligadas a la investigación genética en plantas,
una serie de innovaciones y cambios tecnológicos que se han englobado bajo la
denominación de biotecnología vegetal, y que constituyen una verdadera revolución, ya no sólo de la investigación y el desarrollo agrario, sino de toda una
concepción de la agricultura tradicional y de la utilización económica de las
plantas. Sin duda, la capacidad de generar plantas transgénicas constituye una
de estas nuevas tecnologías sobre las que pivota el cambio global que se está
produciendo. Hoy día, prácticamente ya no hay ninguna especie vegetal cultivada importante para la que no se disponga de la capacidad de transgénesis.
Transgénesis vegetal mediante Agrobacterium tumefaciens
La transgénesis vegetal no se realiza en la actualidad de un modo único.
Los primeros desarrollos, todavía ampliamente utilizados, se basaron en la ca-
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Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
pacidad natural de la bacteria Agrobacterium tumefaciens y relacionados para
integrar de forma estable parte de su material genético en el genoma de sus
plantas huésped. La manipulación subsiguiente del genoma de Agrobacterium
permitió disponer, en breve plazo, de vectores desarmados (exentos de la capacidad de inducir enfermedad que poseen los aislados naturales de la bacteria)
para llevar a cabo integraciones estables de genes foráneos. El clonaje de estos
genes en los vectores de Agrobacterium permite que la bacteria los integre en
el genoma de las futuras plantas transgénicas. En general, el proceso de transformación se complementa con un conjunto de tecnologías de cultivo in vitro
de tejidos vegetales, que permiten regenerar plantas enteras fértiles a partir de
determinados tejidos transformados cultivados. Como queda dicho, esta tecnología de generación de plantas transgénicas se utiliza todavía ampliamente. Sin
embargo, más recientemente se han desarrollado otras formas de transformación de plantas, lo cual a su vez ha permitido ampliar el abanico de especies
transformables.
Otros métodos de transformación de plantas
De entre todos los desarrollos habidos desde las primeras transformaciones
de discos de hojas de tabaco con Agrobacterium, merecen destacarse dos por la
simplicidad que han añadido al proceso. En primer lugar la biolística, que implica el disparo de microproyectiles de oro, wolframio, etc., recubiertos del
ADN que se desea integrar en el genoma de la planta. Esta técnica permite evitar el uso de la bacteria en el proceso de transformación y es especialmente interesante en los casos de especies vegetales que no son huéspedes naturales de
la bacteria, como es el caso de los cereales (en general de las plantas monocotiledóneas). El otro desarrollo reciente es el que permite en algunas especies,
sobre todo experimentales, llevar a cabo la transformación con la bacteria directamente sobre las flores, lo que posibilita la obtención directa de semillas de
plantas transgénicas sin necesidad de recurrir al cultivo in vitro.
Genómica y proteómica vegetales
174
Disponer de plantas transgénicas constituye un hito importante en el desarrollo de la Biotecnología Vegetal, pero no es el único. En efecto, la capacidad para el análisis pormenorizado de los genomas vegetales, tanto en su ver-
tiente estructural como funcional, se ha desarrollado en paralelo con la transgénesis y está empezando a permitir la racionalización de muchos de los procesos clásicos de la mejora genética y, también de la propia transgénesis. La
nuevas disciplinas de la genómica y la proteómica, cuyas aplicaciones al estu-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
dio del genoma humano están provocando toda una nueva forma de buscar y
diseñar fármacos, están también teniendo un fuerte impacto en la Biotecnología Vegetal. La conjunción de ambas tecnologías supone un potencial enorme
de incidencia en procesos de desarrollo controlado de las plantas, así como de
su utilización para otras áreas biotecnológicas, como por ejemplo la farmacia.
Como en tantas otras ocasiones anteriores, el desarrollo tecnológico ha permitido poner de manifiesto conceptos de índole más fundamental, en un proceso
de alimentación mutuo muy característico de todas las actividades de I+D. Así
por ejemplo, fenómenos como la cosupresión y el silenciamiento génico mediado por ARN se han descubierto y estudiado por primera vez en plantas,
gracias al propio desarrollo tecnológico de la Biotecnología Vegetal. Tras su
descubrimiento en plantas, se ha demostrado en los últimos 2-3 años la existencia de fenómenos similares en animales, incluido el hombre, incluyendo todo un nuevo sistema de regulación de la expresión génica basado en microARNs. Las implicaciones de este descubrimiento en las aproximaciones
terapéuticas a enfermedades, tanto genéticas como infecciosas, se están revelando en la actualidad como de una enorme importancia.
GENERACIONES DE PRODUCTOS VEGETALES
BIOTECNOLÓGICOS
Primera generación de plantas y productos vegetales
transgénicos
Las primeras variedades transgénicas de algunas plantas de gran cultivo
mundial como, por ejemplo, el maíz, la soja, la colza o el algodón, ya han llegado al mercado y tanto ellas como sus productos derivados están en estos momentos en el centro de una fuerte polémica social que se está desarrollando en
varios frentes a diferentes niveles. Los ejemplos citados forman parte de lo que
se ha dado en llamar la primera generación de plantas y productos transgénicos. La principal característica de esta primera generación de productos vegeta-
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Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
les transgénicos es que las modificaciones genéticas que se les han introducido
van dirigidas a mejorar características de las plantas que son de interés fundamentalmente para sus productores, o sea, para los agricultores. Así, plantas que
expresan constitutivamente un gen de una toxina para insectos procedente de
una bacteria, que sobreexpresan una enzima que inactiva la acción de un herbicida o que son resistentes a una virosis gracias a la resistencia conferida por la
producción en planta de fragmentos del propio virus, son plantas de un interés
obvio e inmediato para el productor primario. La OCDE, que ha venido estudiando intensamente el fenómeno de la Biotecnología desde muchos ángulos
en los últimos años, ha definido esta primera generación de cultivos transgénicos como que "se ha centrado en características agronómicas para conferir mayores rendimientos en las cosechas mediante la reducción de pérdidas y espaciamientos menores entre hileras, y para reducir costes de insumos mediante la
disminución del uso de plaguicidas y herbicidas". Otras dos características de
los productos de la primera generación son su irrelevancia para el consumidor
final, así como que no suponen un cambio de mercado. Se trata, en definitiva,
de plantas cuyos productos van dirigidos a los mismos mercados que sus parientes no transgénicas y que no suponen cambios sustanciales para el consumidor, excepto quizá su menor precio, consecuencia de unos menores costes de
producción.
Segunda generación de plantas y productos vegetales
transgénicos
Existen ya una segunda y una tercera generación de plantas transgénicas,
cuya llegada al mercado se está produciendo aún con timidez, pero de las que
se espera mucho mayor impacto comercial en los próximos años. De nuevo según la OCDE, la segunda generación de plantas transgénicas "se centra en una
serie de caracteres relacionados con la calidad, que mejorarán su uso en los sistemas de producción de alimentos, así como sus características de uso finales.
Cosechas con modificaciones en las grasas, aceites y almidones para mejorar el
procesamiento y la digestibilidad, tales como sojas de alto contenido en ácido
oleico, colzas de alto estearato o ácido láurico (cultivándose ya en los Estados
176
Unidos), maíz de bajo fitato o ácido fítico. Desde un punto de vista industrial
se pueden esperar, por ejemplo, plantas de algodón coloreado que eviten o disminuyan la necesidad de tintes químicos (algunas ya disponibles)". Se aprecian
en esta segunda generación algunos cambios sustanciales en relación con la
primera. En primer lugar hay un cambio de mercado final. Las modificaciones
genéticas ya no se hacen pensando fundamentalmente en el productor, sino en
el consumidor del producto final al cual se le proporciona un producto de ma-
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Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
yor calidad. Por supuesto, es posible combinar características típicas de esta segunda generación con otras de la primera, si se desea o el mercado lo demanda. Así por ejemplo, es posible producir patatas con unas características de
almidón más adecuadas para su congelación y fritura directa en freidora, que
además sean resistentes al escarabajo de la patata mediante la expresión de la
toxina bacteriana. La otra característica de algunos de los productos de la segunda generación es que presentan un aspecto de interfase con cuestiones más
clásicamente relacionadas con problemas de salud humana que con consideraciones meramente agroalimentarias. Por ejemplo, la producción de aceite de
soja con un mayor contenido en ácido oleico se hará teniendo muy en cuenta
factores de salud relacionados con enfermedades cardiovasculares, además de
otros factores de producción agraria. O algunas de las modificaciones en los
metabolismos de hidratos de carbono de plantas, como la patata o algunos cereales, considerarán el tamaño creciente de mercado que suponen los consumidores diabéticos.
Tercera generación de plantas y productos vegetales
transgénicos
Si la segunda generación de productos biotecnológicos vegetales supone un
grado de sofisticación considerable en relación con los de la primera, será así
más aún con los productos de la tercera generación. La OCDE predice que estas
plantas "producirán más factores de calidad de cara a un producto final tales como productos de nutricéutica o 'alimentos funcionales', que son cosechas modificadas para producir medicinas o suplementos alimentarios en la planta. Estas
plantas podrían inducir inmunidad a enfermedades o mejorar características sanitarias de los alimentos tradicionales, por ejemplo colza con β-carotenos o
arroz suplementado con vitamina A. También se prevén plantas que fijen nitrógeno con mayor eficacia, disminuyendo por tanto la necesidad de abonos o
plantas resistentes a la sequía, las inundaciones y las temperaturas extremas, así
como plantas que se puedan utilizar en procesos de biorremediación de suelos y
aguas. También se ha sugerido la posibilidad de producir plantas de algodón in-
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Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
combustible o que no se arrugue, o plantas de colza que produzcan plásticos
biodegradables (esto ya se ha conseguido)". Es, en estos productos de tercera
generación, donde se producirá el verdadero cambio que aporta la Biotecnología
a la producción vegetal. Los mercados a los que se dirigen estos productos pueden ser tradicionales del producto agrario, pero serán básicamente mercados
nuevos. La interfase entre la producción vegetal e industrias que son en estos
momentos ajenas a la agricultura, o utilizan productos agrarios de manera muy
minoritaria, se verá fuertemente incrementada cuando estos productos alcancen
masivamente el mercado. De entre todas estas industrias es quizá la industria
farmacéutica la que se prevé que se afecte antes en sus estructuras de producción de determinados productos por el impacto de la Biotecnología Vegetal. Se
prevén dos niveles de impacto entre productos biotecnológicos vegetales y la
producción de medicamentos. El primero es el de utilizar las plantas como biofactorías de producción de medicinas o productos de interés farmacéutico. Esta
actividad constituye el factor más importante de lo que se ha venido a llamar
"agricultura molecular" (molecular pharming) y se describe con algo más de detalle en el siguiente apartado. La otra constituye una verdadera síntesis entre la
agricultura, la alimentación y la farmacia y es la base de una nueva disciplina
científica emergente, la "nutricéutica", como parte de un concepto más general,
que es el del "alimento funcional". Conferir una funcionalidad sanitaria al hecho
de alimentarse supone profundizar en una tendencia creciente en las sociedades
avanzadas, como es la de la "comida sana", confiriendo al hecho de alimentarse
una vertiente curativa, o más bien, y en mayor medida, preventiva. Quedan
mencionadas anteriormente las posibilidades de plantas con suplementos vitamínicos, pero quizá el paradigma de lo que puede ser esta nueva actividad farmacéutica lo constituyan las llamadas "vacunas comestibles". Esta idea intenta explotar la inmunidad mucosal de las personas y los animales (también
aplicaciones veterinarias) mediante la presentación de antígenos con potencial
vacunal a través de alimentos procedentes de plantas transgénicas que expresen
dichos antígenos. Algunas de las primeras pruebas hechas en animales de experimentación han resultado muy prometedoras y las pruebas clínicas ya han empezado en algún caso. Además de la posible implantación de este tipo de vacuna
alimenticia en las poblaciones infantiles de países desarrollados, lo cual resulta
178
algo cuestionable desde el punto de vista de la rentabilidad y ventajas económicas y de gestión, esta aproximación presenta una vertiente social de indudable
valor, como es el poder alcanzar segmentos de población que en estos momen-
tos no están sometidos a programas de vacunación, fundamentalmente por motivos económicos, especialmente en países no desarrollados. Ello podría incluir
enfermedades infecciosas tropicales de baja incidencia en países desarrollados,
como el cólera, la malaria o la fiebre amarilla, para las que se podrían plantear
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Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
vacunaciones fundamentadas en vacunas comestibles basadas en productos de
alto consumo (yucas, bananas, etc.).
PRODUCCIÓN DE FÁRMACOS EN PLANTAS
Producción en plantas transgénicas
La agricultura molecular ha comenzado su andadura fundamentalmente
orientada a la producción de fármacos en plantas y, de entre ellas, los primeros
productos que han despertado el mayor interés entre los biotecnólogos vegetales han sido las proteínas terapéuticas. Existen ya en la literatura científica numerosos ejemplos de plantas transgénicas productoras de proteínas humanas
con valor terapéutico. Los resultados obtenidos hasta el momento permiten ser
muy optimista con respecto a la evolución creciente de esta tecnología, pero al
tiempo ilustran con claridad la complejidad de situaciones que se pueden producir al generar las plantas productoras. Algunos de los puntos que se están revelando claves para el éxito o el fracaso de esta aproximación global son tan
variados como, por ejemplo, las enormes diferencias de expresión del transgén
que se encuentran en los distintos casos, la problemática de extracción de las
proteínas producidas, el grado de similitud en el procesamiento post-traduccional de las proteínas, etc. Cada uno de estos puntos va a requerir un esfuerzo de
afinamiento de las condiciones de producción que necesitará soluciones parcialmente distintas para cada caso, por lo que es difícil, en estos momentos, ir
mucho más allá en las generalizaciones. En la actualidad no hay todavía ninguna proteína terapéutica humana producida en plantas que se encuentre en el
mercado, pero ya hay algunas en las fases de pruebas clínicas. Quizá la más
avanzada sea un anticuerpo producido en tabaco que se pretende utilizar, a través de chicles de mascar, en el tratamiento y prevención de las caries y enfermedades infecciosas de las encías. Los costes menores de producción de grandes volúmenes de un anticuerpo de estas características en plantas de tabaco
posiblemente permitan lanzar al mercado ese tipo de producto sin disparar el
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Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
precio para el consumidor final. Al margen de los problemas nuevos que se vayan poniendo de manifiesto en la producción de fármacos en plantas según se
vayan desarrollando los procesos, esta estrategia de producción presenta algunas ventajas inherentes respecto de los métodos tradicionales de extracción de
tejidos humanos y animales o de procesos de fermentación. Queda ya mencionado el probable menor coste, pero hay más. Por ejemplo, el de la seguridad
sanitaria del fármaco. La reciente crisis de las encefalopatías espongiformes
bovinas, y su probable relación con algunas enfermedades humanas del tejido
nervioso, ha puesto claramente de manifiesto el riesgo de arrastrar, desde tejidos animales en los procesos de extracción, patógenos de difícil detección o
eliminación. Este riesgo se elimina totalmente en las plantas, ya que éstas no
permiten la multiplicación de estos patógenos (priones, virus del SIDA, virus
de las diferentes hepatitis, etc.). Además, las plantas pueden constituir el único
sistema capaz de producir eficientemente ciertas proteínas humanas, tales como
reguladores del crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que tendrían un impacto negativo en los animales transgénicos o en las células animales cultivadas en las que se expresaran. Otra consideración es la de capacidad de producción del fármaco, la cual puede llegar a ser limitante en algunos casos. Un caso
citado con frecuencia de esta última situación es el del potencial tratamiento
del cáncer mediante inmunoterapia. Cálculos efectuados en los Estados Unidos
predicen que cada paciente puede llegar a necesitar 10-200 mg de anticuerpo
recombinante antitumoral, lo cual, dado el ritmo de diagnóstico de nuevos casos al año (650.000 de cánceres de mama, pulmón y colon sólo en los Estados
Unidos), puede llegar a crear una demanda de unos 130 kg por año en ese país.
Prácticamente, sólo la producción en plantas puede asegurar ese nivel de producción a un precio razonable.
Producción mediada por virus vegetales
El punto de la producción de grandes cantidades del fármaco que se desea producir ha puesto de manifiesto un problema al que se enfrentan las plantas transgénicas como vía de producción. Como se ha mencionado previamente, con la tecnología disponible en la actualidad es prácticamente imposible
180
predecir los niveles de expresión del gen foráneo que se alcanzarán en una línea transgénica determinada y, de todas formas, parece razonable pensar que
la expresión a partir de un promotor tiene que presentar límites cuantitativos
difíciles de sobrepasar. Por otra parte, establecer un línea transgénica productiva y genéticamente estable puede llevar muchos meses, incluso años. Situaciones como la de los anticuerpos antitumorales, mencionada anteriormente,
son claramente incompatibles con estas limitaciones, pues se trata de fármacos
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
personalizados de los que se necesitan grandes cantidades en períodos breves
de tiempo (semanas a unos pocos meses). Este tipo de consideraciones, junto
con algunas otras de carácter más cercano a la estrategia comercial, han hecho
que bastantes investigadores y empresas de Biotecnología se hayan fijado en
los virus vegetales como vehículos de expresión de los genes foráneos. Los
virus vegetales suelen ser agentes infecciosos muy simples genéticamente, por
lo que su manipulación genética no resulta excesivamente compleja. Generalmente se multiplican hasta alcanzar niveles de acumulación de viriones bastante elevados, lo cual se encuentra también para algunos de sus productos génicos individuales y, por extrapolación, para proteínas producidas a partir de
genes foráneos introducidos en ellos. Además, desde el punto de vista de la
rapidez de producción, resulta mucho más rápido generar un virus transgénico
que una planta transgénica. Estas características hacen de los virus vehículos
de expresión muy interesantes y que se están desarrollando rápidamente en la
actualidad. Una consideración adicional para algunas aplicaciones es que es
factible combinar ambas estrategias (plantas transgénicas y vectores virales),
lo cual permitiría elegir lo mejor de ambas.
La estructura de la empresa biotecnológica farmacéutica
vegetal
El rápido desarrollo de la Biotecnología Vegetal está contribuyendo también, junto con otros desarrollos biotecnológicos, a la profunda transformación
que se está experimentando en la actualidad en la estructura empresarial de varios sectores industriales ligados a las ciencias de la vida. Hay características
muy llamativas de la nueva situación. Por un lado, surgen constantemente (sobre
todo en los Estados Unidos) nuevas pequeñas empresas con un alto contenido
tecnológico que contribuyen de manera muy significativa al rápido desarrollo de
la Biotecnología. Muchas de estas empresas fracasan en su proyecto empresarial
o son finalmente absorbidas por otras empresas mayores. Por otro lado, este
proceso de absorción empresarial se da también entre grandes empresas multinacionales, lo cual está generando una situación de concentración empresarial sin
181
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
precedentes. Otra característica nueva es la de la creación de un sector industrial
completamente nuevo, que se ha venido a denominar de empresas de ciencias
de la vida. Este tipo de empresas se diferencian de las clásicas empresas farmacéuticas o de productos agrarios o alimentarios en que integran en su seno ambos mundos, reflejo de la interfase creciente entre ambas actividades, que se ha
comentado varias veces a lo largo de este artículo. En lo referente al futuro es
razonable pensar que ambas tendencias (nuevas pequeñas empresas tecnológicas
y grandes grupos empresariales) seguirán desarrollándose, creando una estructura de producción farmacéutica nueva. Sin embargo, el fenómeno es todavía muy
reciente y habrá que estar atento a su evolución.
BIBLIOGRAFÍA
182
El número de trabajos que abordan de manera pública los temas referidos a la producción de fármacos en plantas mediante Biotecnología es aún limitado, dada su relativa
novedad. Además, bastantes de estos trabajos se publican en revistas especializadas de
investigación en plantas de menor difusión en los ambientes médicos o farmacéuticos.
Sin embargo, en los últimos años se han publicado un número importante de buenos artículos de revisión sobre este tema, que proporcionan un visión general y un buen nivel
de información al lector interesado. Se presenta a continuación, como orientación, una
lista de algunas de estas revisiones.
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
183
INNOVACIÓN TECNOLÓGICA Y
NUEVAS TERAPIAS. OBTENCIÓN
DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
TOTALMENTE HUMANOS:
PANITUMUMAB
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Innovación tecnológica y nuevas terapias
José Luis Motellón. Amgen S.A.
La innovación en la producción de anticuerpos ha permitido
la producción de anticuerpos totalmente humanizados. Un
claro ejemplo es el panitumumab. A lo largo de este capítulo
se presentan las aportaciones y diferencias de este tipo de
anticuerpos sobre los tradicionales, y en concreto, las
ventajas clínicas del panitumumab en su uso en Oncología.
INTRODUCCIÓN
Las terapias dirigidas se han convertido en la punta de lanza de la innovación en nuevas tratamientos. Dentro de ellas, los anticuerpos son el
ejemplo más claro y quizás más revolucionario. Los anticuerpos monoclonales están cada vez más instaurados en la farmacopea. Hoy en día, estamos asistiendo a un nuevo paradigma en la producción y utilización clínica de estas terapias, con el desarrollo de los anticuerpos monoclonales
totalmente humanos. Esta tecnología presenta claras ventajas en su utilización clínica sobre los anticuerpos monoclonales no totalmente humanos.
Entre ellos, el panitumumab representa el mejor ejemplo dentro del área
de la Oncología.
185
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Innovación tecnológica y nuevas terapias
DESARROLLO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES TOTALMENTE
HUMANOS
Los anticuerpos son biomoléculas de naturaleza proteica que se caracterizan por poseer la capacidad de reconocer y unirse específicamente a un antígeno. En el año 1975, Kholer y Milstein describieron que si se fusionaban células
plasmáticas productoras de anticuerpos con una célula de un tumor llamado
mieloma, se conseguían células, las llamadas hibridomas, que tenían las propiedades de los dos tipos celulares iniciales, esto es: eran células productoras
de anticuerpos, como las células plasmáticas y que podían mantenerse de manera indefinida en cultivo (como las células mielomatosas). La posterior selección de la mejor de dichas células y su expansión, dando lugar a un clon, permitía producir anticuerpos procedentes de un único clon y, por lo tanto,
homogéneos (anticuerpo monoclonales, AcM) en cantidades ilimitadas1. Inicialmente, la inmunización con el antígeno para obtener las células plasmáticas
se hacía sobre roedores (habitualmente ratones), por lo que los AcM obtenidos
eran de ratón. Esto limitaba su utilización en la clínica, ya que su inyección en
humanos generaba una respuesta inmunológica frente al propio AcM, la denominada HAMA (siglas en inglés de Human anti-murine antibody) que neutralizaba la posterior utilización del anticuerpo y limitaba su uso, en muchos casos,
a una única administración2,3. Por consiguiente, la investigación en la utilización terapéutica de los AcM ha ido, en buena medida, dirigida a disminuir dicha capacidad inmunogénica (3)
El primer intento ha consistido en producir AcM quiméricos en los que la
región variable del anticuerpo, que es la que se une al antígeno (aproximadamente un 34% de la proteína), sigue siendo de origen murino, mientras que el
resto del anticuerpo es de origen humano4-6. Entre los AcM quiméricos aprobados para ser utilizados en la clínica están, por ejemplo, rituximab (Rituxan®),
cetuximab (Exbitux®) e infliximab (Remicade®). Si bien la utilización de estos AcM quiméricos ha reducido significativamente la inmunigenicidad de los
AcM, el desarrollo de anticuerpos humanos frente a la quimera (o respuesta
HACA, human anti-chimeric antibody) sigue siendo un problema potencial-
186
mente importante, que requiere monitorización de los pacientes a los que se les
administra, así como, en algunos casos, el tratamiento concomitante con corticosteroides3.
Otro avance en la minimización de la inmunogenicidad producida por
los AcM lo constituye la producción de AcM 'humanizados', proceso inicialmente llamado reshaping con los que se consigue que los AcM contengan sólo un 5 a 10% de proteína murina4. Esta técnica consiste en utilizar tecnología de DNA recombinante para insertar las regiones determinantes de la
complementariedad (CDRs- complementary determining regions) de origen
murino en un anticuerpo humano7. Con ello se esperaba poder eliminar prácticamente la inmunogenicidad, aunque en realidad todavía se sigue observando respuesta inmunogénica frente a dichos AcM humanizados, la llamada
HAHA (human anti-human antibody)3. Por otra parte, el proceso de humanización no es simple, ya que en ocasiones se compromete la afinidad por el
antígeno3,7. Bevacizumab (Avastin®) y trastuzumab (Herceptin®) son anticuerpos humanizados.
La generación de AcM totalmente humanos es un paso adelante en la consecución de AcM todavía más seguros y eficaces3. Entre las técnicas que se
han utilizado para producir AcM totalmente humanos, está la creación de ratones transgénicos (XenoMouse®)4,8,9. La Figura 1 ilustra los pasos implicados
en la creación del XenoMouse®. En primer lugar, se toman células embrionarias de ratón, y mediante técnicas de deleción de genes diana, se
inactivan los loci de los genes que codifican para la inmunoglobulinas (Ig) endógenas de ratón. La descendencia consiste en ratones homocigóticos incapaces de producir inmunoglobulinas murinas. A
Fig. 1. Tecnología de la
continuación se toman grandes fragmentos de DNA correspondientes
producción de
a la cadena pesada y la cadena ligera de las Ig humanas se clonan y
XenoMouse®
se introducen también en
células embrionarias de
ratón. Finalmente, estas
dos cepas de ratones
(una incapaz de producir
Ig y otra que produce
tanto Ig humanas como
de ratón) se cruzan entre
sí, para producir el XenoMouse®, que es capaz
de expresar Ig totalmente humanas e incapaz de
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Innovación tecnológica y nuevas terapias
187
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Innovación tecnológica y nuevas terapias
producir las Ig murinas. Estas cepas de ratón se pueden utilizar para producir
hibridomas, con la diferencia de que los AcM producidos serán humanos y no
murinos (4).
PANITUMUMAB
Panitumumab es el primero de estos AcM totalmente humanos producidos
por tecnología XenoMouse®10 en incorporarse al arsenal terapéutico, puesto
que el pasado 27 de septiembre de 2006, Amgen anunció la aprobación por
parte de la FDA de panitumumab (con el nombre comercial de Vectibix™) para el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal metastásico11. Por lo que
respecta a Europa, el pasado 28 de abril de 2006 fue presentada la solicitud de
autorización de comercialización de panitumumab en la EMEA.
Panitumumab es un anticuerpo monoclonal IgG2 totalmente humano que se
une con alta afinidad al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFr),
que se encuentra sobreexpresado en el 25-77% de los cánceres colorrectales12,13.
El bloqueo de la vía de señalización del EGFr en las células cancerosas por panitumumab determina no sólo la inhibición de la tirosina quinasa del receptor y la
proliferación celular, sino también otros efectos que son críticos para la supervivencia tumoral, crecimiento y metástasis10. A continuación se resumen los datos
de los ensayos clínicos de panitumumab en cáncer colorrectal.
Farmacocinética de panitumumab, bases para la dosificación
Un estudio de fase 1 llevado a cabo por Weiner et al. en pacientes con
cáncer colorrectal, de pulmón no microcítico, renal, de próstata, páncreas o
esófago, evaluó los datos farmacocinéticos de panitumumab administrado a dosis de 0,01 mg/kg a 5 mg/kg una vez por semana, 6 m/kg/cada dos semanas y
9mg/kg/cada tres semanas. La dosis de 2,5 mg/kg/semana fue escogida como
dosis óptima sobre la base de la incidencia de exantema, saturación del aclaramiento no linear de panitumumab y consecución de los niveles séricos asociados con la regresión tumoral en modelos. El modelado farmacocinético utiliza-
188
do en este estudio predijo que la dosis de 6 mg/kg/cada dos semanas y 9
mg/kg/cada tres semanas conseguirían concentraciones mínimas similares a 2,5
mg/kg/semana (aproximadamente 50 mcg/mL). Los resultados farmacocinéti-
cos de los pacientes de este estudio confirmaron esto, y en consecuencia la dosis de 6 mg/kg/cada dos semanas se escogió para los ensayos de fase 314.
Eficacia terapéutica en cáncer colorrectal (CCRm)
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Innovación tecnológica y nuevas terapias
Estudio pivotal de fase 3
Peeters et al. llevaron a cabo un estudio multicéntrico, abierto, aleatorizado y
controlado de panitumumab administrado a dosis de 6 mg/kg/cada dos semanas
junto con el mejor tratamiento de soporte frente al mejor tratamiento de soporte
solo en pacientes con CCRm con progresión documentada radiológicamente (durante o en los seis meses tras la quimioterapia más reciente consistente en fluoropirimidinas, irinotecan y oxaliplatino), los pacientes tenían un estado funcional
ECOG de 0-2 y al menos un 1% de la membrana de las células tumorales presentaban tinción de EGFr por técnica de inmunohistoquímica (evaluada centralmente). A los pacientes en el brazo del tratamiento de soporte que progresaban se les
permitía que se cruzasen a recibir panitumumab en un protocolo aparte. Las respuestas tumorales por RECIST modificado se analizaron mediante un proceso ciego de valoración y revisión centralizada en las semanas 8, 12, 16, 24, 32, 40, 48,
y cada 12 semanas a partir de entonces hasta progresión. La valoración principal
del estudio era determinar si panitumumab mejoraba la supervivencia libre de progresión frente al tratamiento de soporte. Otros objetivos eran seguridad, supervivencia global, tasa de respuesta objetiva y duración de la respuesta. Un total de
463 pacientes fueron aleatorizados (231 en el brazo de panitumumab más tratamiento de soporte y 232 en el brazo de tratamiento de soporte solo) con características basales bien equilibradas entre los dos grupos. Considerando todos los pacientes, 67 (14%) tenían una puntuación ECOG de 2, 172 (37%) habían recibido
al menos 3 líneas previas de quimioterapia (el 100% había recibido al menos 2 líneas), y la mediana de edad era de 63 años15.
Se observó una mejora significativa de la supervivencia libre de progresión en el brazo panitumumab (p<0,0001) con una disminución en la tasa de
progresión relativa del 46% en los pacientes que recibieron panitumumab frente a los que recibieron tratamiento de soporte (HR= 0,54, IC 95%: 0,44, 0,66).
Ya en la primera valoración programada para la semana 8, un mayor porcentaje
de pacientes estaban vivos sin progresión en el grupo panitumumab que en el
grupo control (49% vs 30%, respectivamente); con una diferencia que conti-
189
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Innovación tecnológica y nuevas terapias
Tabla 1. Mejor respuesta objetiva de panitumumab más mejor tratamiento de
soporte frente a tratamiento de soporte solo15
Análisis primario,
Revisión centralizadaa
Panitumumab más
tratamiento de soporte
(n= 231)
Tratamiento de soporte
solo (n= 232)
Respuesta parcial
- n (%)
19 (8)
0 (0)
Enfermedad estable n (%)
64 (28)
24 (10)
Control de la enfermedad
(RP más EE) - n (%)
83 (36)
24 (10)
Tiempo hasta respuestasemanas
Mediana (min, máx)
8 (97, 15)
n/a
Duración de la respuestasemanas
Mediana (min, máx)
17 (4, 40)
n/a
a Por
RECIST modificado, las tasas de respuesta se confirmaron al menos 4 semanas tras la
consecución del primer criterio de respuesta.
nuaba hasta las semana 40 (Figura 2). Un análisis de subgrupos demostró un
efecto coherente de panitumumab en función del estatus del ECOG, regímenes
de quimioterapia previa, estatus del EGFr o la edad. Debido probablemente al
diseño cruzado, un análisis interino de la supervivencia global mostró que no
Figura 2. Estimado
de Kaplan-Meiera
de supervivencia
libre de progresión
de panitumumab
más tratamiento de
soporte frente a
190
a Análisis
central.
primario, conjunto de todos los análisis aleatorizados, radiología
tratamiento de
soporte solo15.
Tabla 2. La mejor respuesta objetiva de panitumumab más tratamiento de
soporte en el Estudio Cruzado15
Revisión local
Pacientes
Pacientes que recibieron
panitumumab
Respuesta completa - n (%)
174
1 (1)
Respuesta parcial- n (%)
16 (9)
Enfermedad estable - n (%)
55 (32)
Control de la enfermedad
(RP más EE) - n (%)
72 (42)
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Innovación tecnológica y nuevas terapias
había diferencias entre los dos grupos con un hazard ratio de 0,93 (IC 95%:
0,73, 1,19). Las mejores respuestas objetivas vistas en este estudio y en el estudio cruzado se resumen en las Tablas 1 y 215.
Más pacientes en el grupo de panitumumab con tratamiento de soporte
frente al tratamiento de soporte sólo presentaron toxicidades cutáneas (91% vs
15% con exantema grado 3 /4 en el 14% y 0% respectivamente). También se
observaron: fatiga (24% vs 15%), dolor abdominal (23% vs 17%), náusea
(22% vs 15%), y diarrea (21% vs 11%) respectivamente. Doce pacientes (5%)
presentaron potenciales reacciones a la infusión (ninguna fue de grado 3 /4); 1
paciente interrumpió panitumumab debido a una reacción de hipersensibilidad
de grado 215.
Estudio de fase 2
Este estudio llevado a cabo por Malik et al. era multicéntrico, abierto, de
un único brazo para evaluar la seguridad y la eficacia de panitumumab en monoterapia en pacientes con CCRm que habían fracasado al tratamiento con 5Fu con o sin leucovorin e irinotecán u oxaliplatino o ambos. La cohorte A incluyó pacientes con tinción de EGFr por inmunohistoquímica de 2+ ó 3+ en al
menos el 10% de las células tumorales y la cohorte B incluyó pacientes con
suma de las tinciones de EGFr de 1+, 2+ y 3+ en al menos el 10% de las células tumorales, pero con suma de 2+ y 3+ en menos del 10% de las células tumorales. Panitumumab se administró como infusión IV a 2,5 mg/kg/semana
durante 8 ciclos hasta progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable o
muerte. Un total de 148 pacientes recibieron al menos una dosis de panitumu-
191
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Innovación tecnológica y nuevas terapias
Tabla 3. Resultados de Eficacia para el estudio de fase 2 en monoterapia de
panitumumab en CCRm16
Parámetro de
Cohorte A
Cohorte B
Total
eficacia
(n= 105)
(n= 43)
(N= 148)
Respuesta global,
n (%)
7 (7%)
6 (14%)
13 (9%)
Enfermedad estable,
n (%)
36 (34%)
7 (16%)
43 (29%)
Enfermedad
progresiva, n (%)
35 (33%)
24 (56%)
59 (40%)
18,3 (16,7, 26,4)
26,1 (16,3, 35,9)
24,7 (17,0, 26,4)
8,3 (8,0, 16,3)
13,6 (8,3, 16,1)
37,5 (24,1, 47,7)
37,6 (25,6, 42,4)
Medianaa (IC
95%)
Duración de la
enfermedad estable
(Revisión
centralizada)
Medianaa (IC 95%)
Supervivencia sin
progresión, semanas 16,0 (9,6, 16,4)
Medianaa
(IC 95%)
Supervivencia
global, semanas
aMediana
39,9 (23,3, 44,7)
de Kaplan-Meier
mab con una media de edad de 59 años (21-88 años), 111 (75%) con un estado
funcional ECOG de 1, y 65 (44%) habían recibido 3 agentes quimioterápicos
previos. Se observó control de la enfermedad en 43 (41%) de los pacientes en
la cohorte A y 13 (30%) de los pacientes en la cohorte B. La duración mediana
de la enfermedad estable fue 18,3 semanas (IC 95% 16,7-26,4) para los pacientes en la cohorte A y 26,1 semanas (IC 95% 16,3 - 35,9) para los pacientes en
la cohorte B. Los resultados de eficacia se muestran en la Tabla 316.
Los cuatro acontecimientos adversos grado 3/ 4 relacionados con el tratamiento notificados con mayor frecuencia fueron exantema 5 (3%), fatiga 4
(3%), vómitos 2 (1%) y náusea 1 (1%). Acontecimientos adversos relacionados
con toxicidad cutánea fueron notificados por 141 pacientes (95%) y 5% eran
192
grado 3 y ninguno grado 4. Una reacción relacionada con la infusión se observó en un paciente que no requirió modificaciones de la dosis. No se observaron
anticuerpos anti-humanos en ninguno de los 145 pacientes testados16.
Estudios clínicos en primera línea en CCRm
En un estudio de fase 2, de dos partes, brazo único, llevado a cabo
en pacientes con CCRm, los pacientes fueron tratados con panitumumab
2,5 mg/kg/una vez por semana y IFL (parte 1) o FOLFIRI (parte 2; enmienda al protocolo debido a la toxicidad del esquema IFL). Los criterios
clave de eligibilidad incluyeron estatus ECOG de 0 ó 1, no tratamiento
previo con quimioterapia, expresión de EGFr en al menos el 10% de las
células tumorales. La valoración principal fue la incidencia de diarrea
grado 3 /4. Diecinueve pacientes se incluyeron en la parte 1 y 24 pacientes en la parte 2, 14 (73%) y 19 (79%), respectivamente, de los pacientes presentaron control de la enfermedad (incluye respuestas completas, respuestas parciales y enfermedad estable). La mediana de
supervivencia sin progresión fue de 5,6 meses y 10,9 meses, y la supervivencia mediana global fue de 16,8 meses y no estimable (23 de los 24
pacientes seguían vivos en el momento del análisis). La incidencia de
diarrea grado 3 /4 fue 11 (58%) y 6 (25%) para la parte 1 y la parte 2,
respectivamente. Todos los pacientes (de ambas partes) presentaron toxicidad cutánea, de los cuales 3 (16%) y 4 (17%) eran de grado 3 /4 para
la parte 1 y parte 2, respectivamente. No se observaron reacciones a la
infusión graves o formación de anticuerpos anti-humanos inducidos por
panitumumab 17.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Innovación tecnológica y nuevas terapias
CONCLUSIÓN
La innovación tecnológica en el desarrollo de AcM ha ido en la línea de
disminuir cada vez más el componente exógeno, generalmente murino, de los
mismos para minimizar su inmunogenicidad, lo que se espera que se asocie
con una mejora en su perfil de eficacia y seguridad. Panitumumab es el primer
AcM totalmente humano aprobado para ser utilizado en la clínica. En concreto,
la FDA lo ha aprobado para el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal
metastásico con sobreexpresión de EGFr en progresión durante o después del
tratamiento con esquemas de quimioterapia que contengan fluoropirimidinas,
irinotecan y oxaliplatino18. Actualmente, panitumumab está en fase de registro
por la EMEA.
193
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Innovación tecnológica y nuevas terapias
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Innovación tecnológica y nuevas terapias
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195
EVALUACIÓN DE MEDICAMENTOS
BIOTECNOLÓGICOS EN LA AGENCIA EUROPEA
DE MEDICAMENTOS (EMEA)
BWP (GRUPO DE BIOLÓGICOS) Y CHMP
(COMITÉ DE MEDICAMENTOS DE USO HUMANO)
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
Sol Ruiz y Gonzalo Calvo
Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios
ABREVIATURAS
BWP
Biologics Working Party (previamente Biotechnology Working
Party)
CHMP Committee for Human Medicinal products (previamente CPMP)
COMP Committee for Orphan Medicinal Products
CPMP
Committee for Proprietary Medicinal Products (actualmente
CHMP)
CVMP Committee for Veterinary Medicinal Products
EM
Estado(s) Miembro(s)
EMEA European Medicines Agency
HMCP Committee for Herbal Medicinal Products
197
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
ICH
International Conference for Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use
OMS
Organización Mundial de la Salud
PhEur
Farmacopea Europea
RMS
Reference Member State
UE
Unión Europea
INTRODUCCIÓN
Durante la década de los 80, los avances en ingeniería genética y en el
establecimiento y cultivo de líneas celulares han permitido la obtención de
multitud de proteínas terapéuticas (ej. eritropoyetina, hormona de crecimiento, interferón) que nunca hubiese sido posible obtener en cantidad suficiente
de sus fuentes naturales. Además, el desarrollo de las técnicas de ingeniería
de proteínas ha permitido disponer de proteínas modificadas respecto a sus
equivalentes naturales que presentan una mejor eficacia clínica, un mejor
perfil de seguridad o una nueva aplicación terapéutica. Así, se encuentran
disponibles análogos de insulina o eritropoyetina, (ej. insulina lispro, darbepoetin alfa), proteínas de fusión que combinan características de dos proteínas diferentes (ej. etanercept), proteínas conjugadas a polietilénglicol (ej.
peginterferon, pegfilgrastim) o anticuerpos monoclonales "humanizados" (ej.
alemtuzumab).
Desde la creación de la agencia europea de medicamentos (EMEA) en
1995, la evaluación de estos medicamentos obtenidos mediante tecnología
del ADN recombinante se realiza, por requerimiento legal, mediante un procedimiento de tipo centralizado, es decir, efectuado en todos los países de la
Unión Europea a la vez y coordinado por la EMEA. Hasta la fecha se han
autorizado más de 70 productos biotecnológicos y se espera que este número
siga aumentando durante los próximos años. Además, la investigación en
nuevos sistemas de expresión permitirán obtener medicamentos biotecnológicos de fuentes "menos convencionales" como por ej. animales transgénicos o
plantas. Así, la EMEA autorizó en junio de 2006 el primer medicamento bio-
198
tecnológico (antitrombina III humama recombinante) producido en la leche
de cabras transgénicas. Otros productos obtenidos en conejos transgénicos,
tales como C1 inhibidor, lactoferrina y fibrinógeno humanos, se encuentran
en fase de desarrollo clínico o preclínico. Otros medicamentos considerados
de alta tecnología incluyen las denominadas "terapias avanzadas" que incluyen terapia génica, terapia celular somática e ingeniería de tejidos. Las solicitudes de comercialización para estos productos se evalúan también mediante
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
el procedimiento centralizado (solamente la autorización de ensayos clínicos
es responsabilidad nacional).
La legislación comunitaria actual permite la autorización de medicamentos biosimilares, es decir, medicamentos biotecnológicos equivalentes a
otros ya autorizados y cuya patente ha expirado. Su autorización es también
mediante el procedimiento centralizado coordinado por la EMEA. Hasta
ahora se han autorizado dos medicamentos (ambos son preparaciones de
hormona de crecimiento humana recombinante) siguiendo esta nueva vía de
autorización.
Marco legal y bases para la creación de una agencia europea de
evaluación de medicamentos
Los fundamentos de la Unión Europea (UE) se recogen en el Tratado de
Roma, ratificado inicialmente por seis países en 1957. Aunque el tratado comprometía a sus signatarios a establecer un amplio rango de medidas de armonización, dejaba la organización de la sanidad y los sistemas de seguridad social
a la decisión de cada país. Cada estado miembro (EM), por tanto, desarrolló su
propia regulación farmacéutica.
Desde 1965 (fecha de adopción de la primera directiva de la UE), la legislación farmacéutica comunitaria ha buscado dos objetivos fundamentales: la
protección de la salud pública y la creación de un mercado común que permita
la libre circulación de medicamentos.
La Comisión Europea (en adelante referida como Comisión) comenzó
en 1965 a promulgar Directivas (del inglés, Directives), es decir, leyes o
disposiciones comunitarias de carácter obligatorio, relacionadas con la regulación farmacéutica. La Directiva 65/65/EEC del Consejo de 26 de enero de 1965 estableció el principio de concesión de autorizaciones de comercialización de especialidades farmacéuticas en todos los EM sobre criterios
científicos de calidad, seguridad y eficacia, sin tener en cuenta consideraciones de tipo socioeconómico. Diez años más tarde, los EM consolidaron
la experiencia adquirida y se pusieron de acuerdo sobre principios comunes
199
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
para la autorización y control de medicamentos de uso humano (Directivas
75/318/CEE y 75/319/CEE del Consejo de 20 de mayo de 1975). No obstante, cada EM mantenía la responsabilidad de conceder o denegar la autorización para comercializar cada medicamento en particular. Actualmente,
tanto las directivas citadas anteriormente como otras relacionadas con medicamentos humanos han sido derogadas y sustituidas por la Directiva
2001/83/EC del 6 de noviembre, posteriormente modificada y ampliada por
la Directiva 2003/63/EC del 25 junio. Estas dos directivas constituyen actualmente la legislación básica que regula los medicamentos para uso humano. Otra directiva posterior, 2004/27/EC, y la Regulación (EC) No.
726/2004 modifican y delimitan también el ámbito de aplicación de la directiva 2001/83/EC.
En 1977, el denominado Comité de Especialidades Farmacéuticas o
CPMP (Committee for Proprietary Medicinal Products), formado por representantes de todos los EM y de la Comisión, a solicitud de un EM o de la Comisión, podía emitir un dictamen consultivo sobre temas relacionados con la
autorización de medicamentos y sobre el control de reacciones adversas de los
mismos (farmacovigilancia).
En 1981, se adoptaron provisiones similares para medicamentos de uso
veterinario (Directivas 81/51/CEE y 81/52/CEE del Consejo de 28 de septiembre de 1981), incluyendo la creación del Comité de Medicamentos Veterinarios o CVMP (Committee for Veterinary Medicinal Products). Al igual que para medicamentos humanos, estas directivas han sido sustituidas por otra más
reciente, la Directiva 2001/82/EC.
La creación de estos comités supuso también el inicio de un procedimiento coordinado de evaluación, con dictamen no vinculante, que marcó un paso
importante en la cooperación entre EM. Aparte de los procedimientos de registro nacionales, las compañías farmacéuticas podían utilizar dos tipos de procedimiento de registro comunitario: el "procedimiento multi-estado" (ampliación de la autorización existente en un EM a dos o más de los restantes EM) o
el "procedimiento de concertación" (evaluación coordinada de la solicitud de
autorización en todos los EM; ningún EM podía tomar una decisión individual
sobre una autorización de comercialización antes de su discusión previa y dic-
200
tamen por el CPMP). Este último procedimiento estaba reservado a los medicamentos obtenidos por procesos biotecnológicos y para otros medicamentos de
alta tecnología.
Con el objeto de colaborar con el CPMP en determinados aspectos de la
evaluación de medicamentos, se crearon grupos de trabajo sobre calidad, seguridad y eficacia con objeto de aproximar la forma en que cada EM ponía en
práctica las obligaciones derivadas de las directivas comunitarias. Estos gru-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
pos de trabajo han tenido su continuación en grupos equivalentes en el seno
de la EMEA.
Primeros pasos en la creación del Grupo de Biotecnología
En 1985 se creó el denominado Ad Hoc Working Group on Biotechnology/Pharmacy (precedente del grupo de Biotecnología de la EMEA) con dos
objetivos fundamentales: asesorar al CPMP sobre solicitudes de autorización de
productos biotecnológicos y establecer recomendaciones específicas sobre la
producción y control de calidad y seguridad de estos productos.
Esta segunda finalidad se llevó a cabo mediante la elaboración de directrices o "guidelines" (i.e. disposiciones de carácter no obligatorio basadas en los conocimientos científicos del momento sobre un aspecto concreto). Se ha preferido la utilización de directrices, que no obligan
jurídicamente, en vez de un instrumento jurídico formal, como una directiva,
con el fin de mantener la flexibilidad y no poner obstáculos legales al progreso científico. Se admite que en algunos casos, como resultado de los
avances científicos, pueda ser adecuado otro enfoque. Sin embargo, cuando
un solicitante decida no seguir una determinada directriz debe explicar y
justificar dicha decisión en los informes que presente la compañía en apoyo
de su solicitud.
El Ad Hoc Working Group on Biotechnology/Pharmacy estaba formado
por expertos (alrededor de 20) procedentes de diferentes áreas relacionadas
con la Biomedicina, desde autoridades reguladoras, laboratorios nacionales
de control o investigadores, y un representante (observador) de la Farmacopea Europea (PhEur). En esta etapa inicial se completaron y/o iniciaron varias directrices sobre citoquinas, anticuerpos monoclonales y reducción del
riesgo de transmisión de encefalopatías espongiformes a través de medicamentos. Este grupo ha tenido continuación como el Biotechnology Working
Party (BWP) dentro de la estructura de la EMEA. Recientemente este grupo
ha pasado a denominarse Biologics Working Party (BWP), aunque sus funciones no han variado.
201
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
LA AGENCIA EUROPEA DE MEDICAMENTOS. PROCEDIMIENTOS
DE AUTORIZACIÓN
A finales de 1990 se publicaron varias propuestas relacionadas con la creación de la agencia y el nuevo sistema comunitario para autorización de medicamentos. En 1993 se decidió fijar la sede de la EMEA en Londres y comenzó
a funcionar como tal en febrero de 1995. La función principal de la EMEA es
coordinar y organizar el sistema de autorización de medicamentos en Europa.
Este sistema evalúa cualquier solicitud de comercialización bien mediante el
denominado "procedimiento centralizado" (autorización de comercialización
en todos los países de la UE a la vez; decisión unánime o por mayoría) o "descentralizado" (también conocido como "reconocimiento mutuo", equivalente
al anterior procedimiento "multi-estado" (extensión de la autorización existente
en un EM a otros). El procedimiento centralizado de autorización está reglamentado por la Regulación (EC) No. 726/2004. Este procedimiento es obligatorio para los medicamentos que se describen a continuación:
• medicamentos obtenidos a partir de tecnología del ADN recombinante, o
de la expresión controlada de genes que codifican proteínas biológicamente activas en procariotas o eucariotas, incluyendo las células de mamífero transformadas, u obtenidos a partir de hibridomas o que emplean
anticuerpos monoclonales durante su producción
• medicamentos veterinarios empleados como potenciadores para aumentar el crecimiento o rendimiento de los animales tratados
• medicamentos humanos para el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida, cáncer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas.
A partir de 2008 también será aplicable a enfermedades autoinmunes u
otras alteraciones inmunitarias y para enfermedades virales.
• Medicamentos huérfanos (según la Regulación (EC) No 141/2000).
Existen actualmente cuatro comités científicos dentro de la EMEA:
CHMP (comité de medicamentos humanos; previamente CPMP), CVMP (comité de medicamentos veterinarios), COMP (Committee for Orphan Medicinal
Products; encargado de la concesión este tipo de clasificación a un medica-
202
mento) y HMPC (Committee for Herbal Medicinal Products; encargado de
plantas medicinales). Cada uno de estos comités está formado por un representante de cada uno de los EM. La EMEA actúa como el eje central del sistema
europeo, organizando y coordinando el trabajo de evaluación que es llevado a
cabo por expertos nacionales de cada una de las agencias reguladoras.
EVALUACIÓN DE MEDICAMENTOS DE USO HUMANO Y
VETERINARIO: EL CHMP Y CVMP
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
Desde la creación de la EMEA, ambos comités de medicamentos humanos y
veterinarios, CHMP y CVMP, respectivamente, continúan su labor mediante reuniones mensuales de varios días de duración. Una gran parte de la agenda consiste
en la discusión y emisión de dictámenes respecto a nuevas solicitudes de comercialización, bien por el procedimiento centralizado o por el descentralizado. En el
procedimiento centralizado, dos miembros del comité (representantes de países
distintos) son designados como ponentes (rapporteur y co-rapporteur) para coordinar la evaluación de cada solicitud. Tras la evaluación en el ámbito nacional, los
informes de cada uno de los ponentes son discutidos en las reuniones del comité
científico correspondiente (CHMP o CVMP), y se emite un informe final vinculante sobre dicho producto. La decisión final se transmite a la Comisión, que convertirá dicha opinión en una única autorización de comercialización para toda la
UE. Solamente quedan a decisión nacional los aspectos relacionados con el precio
del medicamento y su posible financiación por el sistema nacional de salud.
El procedimiento descentralizado está basado en el principio de reconocimiento mutuo de autorizaciones nacionales. Permite la extensión de una autorización de comercialización dada por un EM (denominado EM de referencia o
RMS) a otro(s) EM identificados por el solicitante. Cuando no sea posible llegar a un acuerdo porque algún EM no acepte la autorización nacional original
concedida por el RMS, los puntos de desacuerdo serán discutidos en el recientemente creado Grupo de Coordinación. Si el desacuerdo permanece, la decisión del comité correspondiente (CHMP o CVMP) es siempre vinculante.
Independientemente del procedimiento seguido, la decisión final es tomada por la Comisión Europea o, en caso de desacuerdo importante entre EM,
por el Consejo de la UE.
Aquellos productos que vayan a comercializarse únicamente en un EM
pueden continuar utilizando la vía de autorización nacional (como se ha descrito anteriormente, los productos biotecnológicos nunca podrían utilizar esta vía
de autorización).
203
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
Grupos de trabajo del CHMP
Con objeto de emitir una opinión sobre cualquier cuestión planteada a la
EMEA relacionada con medicamentos, el CHMP cuenta con el apoyo de grupos de trabajo que le asesoran en aspectos específicos relacionados con la calidad, eficacia y seguridad de medicamentos y que participan en las actividades
de armonización internacionales (ICH).
Actualmente existen diferentes grupos de trabajo del CHMP y uno conjunto del CHMP/CVMP:
• Grupo de Biológicos (Biologics Working Party o BWP - previamente
Biotechnology Working Party): asesora al CHMP y COMP sobre aspectos relacionados con la producción y control de productos biológicos y
biotecnológicos.
• Grupo de Eficacia (Efficacy Working Party o EWP), responsable de
elaborar recomendaciones metodológicas en áreas terapéuticas establecidas y documentos de opinión sobre aspectos de eficacia de medicamentos en áreas en desarrollo clínico.
• Grupo de Seguridad (Safety Working Party, SWP), discusión y recomendaciones sobre aspectos de seguridad preclínicos.
• Grupo de Farmacovigilancia (Pharmacovigilance Working Party,
PhWP), grupo de discusión y evaluación de aspectos relacionados con la
seguridad o cambios en la relación riesgo/beneficio de medicamentos
autorizados.
• Grupo de Hemoderivados (Blood Products Working Group, BPWG),
encargado de aspectos de seguridad y evaluación clínica de productos
derivados de sangre o plasma humanos.
• Grupo de Vacunas (Vaccine Working Party, VWP), evaluación y discusión
de aspectos relacionados con la calidad, eficacia y seguridad de vacunas;
• Grupo de Terapia Génica (Gene Therapy Working Party, GTWP), grupo asesor en temas de terapia génica.
• Grupo de Terapia Celular e Ingeniería de Tejidos (Working Party on
Cell-based Products, CTWP); grupo asesor en temas de terapia celular e
204
ingeniería de tejidos.
• Grupo de Biosimilares (Similar Biological (Biosimilar) Medicinal Products, BMWP), grupo encargado de aspectos de seguridad y evaluación
clínica de medicamentos biológicos o biotecnológicos que se presentan
como equivalentes a otro ya autorizado.
• Grupo de Farmacogenética (Pharmacogenetics Working Party, PgWP),
grupo asesor del CHMP en materias relacionadas con farmacogenética.
• Grupo de Calidad (Quality Working Party, QWP), grupo conjunto del
CHMP y CVMP para armonizar y asesorar sobre aspectos de calidad de
medicamentos humanos y veterinarios.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
El grupo de Biológicos (BWP)
Desde 1995 hasta ahora el BWP viene celebrando unas 10-12 reuniones
anuales, de varios días de duración, en la sede de la EMEA. Este grupo está
formado por un representante de cada uno de los EM de la UE, un representante de la Comisión, un representante de la Farmacopea Europea, personal técnico de la EMEA y, desde febrero de 2000, un representante de Noruega y otro
de Islandia se han incorporado como miembros de pleno derecho (presentes
desde 1999 en calidad de observadores).
El BWP es responsable de proporcionar asistencia técnica al CHMP sobre
aspectos relacionados con la fabricación y control de medicamentos biotecnológicos y de origen biológico, incluyendo aquellos derivados de sangre o plasma y productos inmunológicos. El BWP es también el grupo asesor del COMP
para productos de origen biológico o biotecnológico y de la OMS en aquellos
casos en que este organismo lo solicite.
Las actividades principales del BWP se describen a continuación:
• Elaboración de informes sobre los procesos de producción y control de
las solicitudes de comercialización de medicamentos humanos de origen
biológico y biotecnológico. Los aspectos relacionados con la calidad de
este grupo de medicamentos se discuten en la reunión correspondiente
del BWP y se emite un informe para su consideración por el CHMP
que, tras la discusión de los aspectos toxicológicos y clínicos del medicamento en cuestión, emitirá un dictamen final sobre la aprobación o rechazo de la solicitud correspondiente.
• Elaboración de directrices o recomendaciones europeas e internacionales sobre temas específicos relacionados con productos biológicos
y biotecnológicos. Al igual que el resto de grupos de trabajo, una de
las tareas fundamentales del BWP es la elaboración de directrices o
205
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
recomendaciones, que serán después aprobadas por el CHMP, sobre
temas específicos relacionados con productos biológicos y biotecnológicos. Con este fin, se suelen crear subgrupos dentro del BWP que
elaboran un documento inicial sobre un tema especifico que es discutido posteriormente en las sesiones plenarias del BWP. En general,
las directrices elaboradas por el BWP son objeto de evaluación continua a medida que se producen avances científicos en temas específicos. Expertos del BWP participan también en grupos de trabajo internacionales para armonizar criterios y recomendaciones entre la UE,
Norteamérica y Japón (actividades ICH) sobre este grupo particular
de medicamentos.
El BWP también proporciona asesoramiento al CHMP en forma de documentos de opinión o recomendaciones puntuales (Points to Consider) sobre aspectos concretos relacionados con un grupo particular de medicamentos (p. ej.
aspectos relacionados con la evaluación de posibles vacunas de gripe atenuadas), introducción de nuevos requerimientos de control (p. ej. test de PCR para
la detección del virus de la hepatitis C en volúmenes de plasma para la obtención de hemoderivados), etc.
• Asesoramiento científico. Las compañías farmacéuticas tienen la posibilidad de solicitar asesoramiento científico en cualquier momento durante
el desarrollo de un medicamento previo a la presentación de una solicitud de autorización de comercialización o antes de introducir determinados cambios en la fabricación de un medicamento ya autorizado. El asesoramiento en aspectos de producción y control de medicamentos
biotecnológicos lo realiza el BWP.
• Organización de "workshops" y reuniones sobre temas relacionados con
medicamentos biológicos y biotecnológicos. El BWP organiza reuniones
con expertos europeos e internacionales con objeto de discutir los últimos avances científicos en determinadas áreas que permitan la elaboración de recomendaciones especificas, p. ej. productos de terapia génica,
ensayos para la detección de marcadores de encefalopatías espongiformes y su posible aplicación a medicamentos, etc. El BWP también lleva
a cabo reuniones con representantes de la industria farmacéutica impli-
206
cados en temas concretos con objeto de evaluar las implicaciones o consecuencias de la introducción de determinadas medidas de control o de
discutir la aplicación de las mismas de forma coordinada, p. ej. con re-
presentantes de fabricantes de gelatinas y derivados de grasas animales
empleados en la fabricación de medicamentos.
• Reuniones con otros grupos de trabajo de la EMEA y de la PhEur.
Miembros del BWP participan también en reuniones conjuntas con
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
miembros de otros grupos de trabajo con objeto de coordinar y facilitar
la adopción de recomendaciones concretas, p. ej. la discusión sobre aspectos de seguridad del tiomersal (empleado en la fabricación de determinadas vacunas) se llevó a cabo junto con los Grupos de Seguridad
(SWP) y el de Farmacovigilancia (PhWP). Miembros del BWP también
forman parte de grupos de trabajo de la PhEur para coordinar actividades y recomendaciones en temas relacionados con el control de calidad
de productos biológicos y biotecnológicos en general.
WEBLIOGRAFÍA
www.emea.europa.eu
pharmacos.eudra.org
Información adicional sobre el BWP y actividades de la EMEA
en general (incluyendo los documentos elaborados por los grupos de trabajo)
Regulación relacionada con la autorización de medicamentos
en la Unión Europea
207
IMPACT OF PHARMACOGENETICS ON DRUG USE IN
INDIVIDUALLY OPTIMISED PHARMACOTHERAPY
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Impact of pharmacogenetics on drug use
Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl MPharm. Department of Hospital Pharmacy.
Erasmus University Medical Centre Rotterdam. The Netherlands
Traditional pharmacotherapy is rather inefficient; on
average only 40% of patients will benefit from a particular
drug as compared with placebo. Interindividual variability in
drug disposition and effect can be partly explained by
genetic variants. In the science of pharmacogenetics the
influences of genetic differences on patients' drug response
are studied. The major causes of inefficient drug treatment
(like lack of effectiveness or the occurrence of side effects
or toxicity) are heterogeneity of the disease, variations in
drug disposition (pharmacokinetics) and drug response
(pharmacodynamics).
Genetic variants can be detected by amplification of DNA
using the Polymerase Chain Reaction (PCR) followed by
sequence analysis. Other techniques, like micro-arrays,
enable us to screen the whole genome.
The influence of pharmacogenetics becomes more and more
important in clinical practice and on drug development. In
this review we will discuss the principles of
pharmacogenetics and the practical implications, illustrated
with examples taken from clinical practice.
Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!
INTRODUCTION
When looking at the demographic evolution one can observe that there
has been an impressive increase in life expectancy of the population in the
developed world during the last century. Currently, it is not expected that, on
209
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Impact of pharmacogenetics on drug use
average, we can add many more years to the general population. The formidable increase in life expectancy was caused by a general increase in standard of living, including better hygiene standards such as the availability of
clean (and thus safe) drinking water and a reliable sewage system in crowded
areas. Although difficult to quantify, improved medical care may have contributed as well. With a traditional medical approach, we are able to cure infectious diseases and postpone deleterious effects of systemic diseases like diabetes, hypertension, COPD, etc. However, we may have reached a plateau
with this rather crude and population-based approach. When treating risk factors (e.g. hypertension) medically, we are grossly overtreating the general population; only a minority will actually benefit from these treatments. A good
measure to evaluate treatment effect is the Numbers Needed to Treat (NNT):
the total number of people that are exposed to treatment to prevent one incident. For example >1000 patients younger than 60 years with hypertension
should be treated to prevent one death. From this perspective, traditional
drug treatment is rather inefficient and causes a serious morbidity problem
(due to inherent side effects).
The reason for this inefficiency is that we cannot point out beforehand
which patients will benefit from the treatment. For many drugs, the exact doseresponse relationship is uncertain. So, on top of inefficiency, there is also a certain degree of inaccuracy. Patients do not only show a considerable variation in
disease-development but also in drug disposition (pharmacokinetics) and drug
effects (pharmacodynamics) (Evans et al; 2003). As a result, some experts state
that only some 40% or less of all used drugs benefit individual patients (i.e.
60% or more of all drugs do not clearly benefit our patients).
The mapping of the human genome is slowly changing this scene. Based
on genetic analysis drugs can be produced tailor-made for specific patients,
based on their genetic constitution. Many applications can be envisaged. Genetic predisposition can be spelled out: which patients carry a serious disease
risk and should be treated with priority? Which patients will benefit most
from certain types of drugs? It may become possible to repair genetically determined risk factors, or to repair genetic defects (gene therapy). Gene therapy
can also be employed to change the biochemical repertoire of a cell in such a
210
way that the body is producing its own drugs. But also in the use of traditional drugs, the scene will change. Factors like absorption and metabolism are
genetically determined by the structure of so-called P-glycoprotein pumps in
the cell membrane and polymorphism of the cytochrome P450 family of drug
metabolising enzymes in the liver. In addition, it may become feasible to assess the sensitivity of target-tissues or even become possible to change it in a
desirable fashion.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Impact of pharmacogenetics on drug use
GENETIC VARIATION
The whole DNA sequence is called the human genome. The arsenal of
proteins is the proteome. 99.9% of the genome of two unrelated persons is
identical, but still there is genetic variability in 0,1% of 3.3 billion base pairs
(on average one variant per 1000 bases).
The most common type of variant is a single nucleotide polymorphism
(SNP), a single-base difference in the DNA sequence that can be observed between individuals in the population. A polymorphism has been defined as the
minor allele occurring in more than 1% of the population, whereas mutations
are rare. Many mutations have been discovered in coding sequences of genes
causing rare inherited diseases.
The specific set of alleles observed on a single chromosome is called a haplotype. Haplotypes are formed by recombination when the paternal and maternal chromosomes exchange corresponding segments of DNA. The coinheritance of SNPs on these haplotypes leads to associations between these alleles
(linkage disequilibrium). Not a single SNP but the haplotype is associated with
the disease. This advantage leads to optimal genotyping: carefully chosen SNPs
in a specific region will provide enough information to predict much of the information about the remaining SNPs in that region. These SNPs are called
'tagSNPs' and are used to screen the whole genome (Burton et al; 2005).
The human genome is diploid (one paternal and one maternal allele). A
SNP can be present on 0, 1 or 2 alleles. If an individual has no polymorphism
on both alleles, this individual is called homozygous wildtype. One speaks of
homozygous mutant if both alleles are affected. An individual with one wildtype
and one variant allele is heterozygous. A SNP could lead to no functional enzyme activity or decreased enzyme activity. To simplify different combinations
the term semiquantitative gene dose (SGD) is introduced. Functional alleles have a SGD of 1, completely dysfunctional alleles 0 (e.g. CYP2D6*4) and 0,5
for variant alleles with decreased enzyme activity (Steimer et al; 2004).
211
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Impact of pharmacogenetics on drug use
SOURCES OF VARIATION
Figure 1. Variability in
drug response scheme.
The major causes of inefficient drug treatment are heterogeneity in disease, variations in drug
disposition (pharmacokinetics)
and drug response (pharmacodynamics). The figure shows the relationships in relation with the
drugs response / therapy outcome
and the targets we can use to optimise pharmacotherapy. In the following sections we will present
some illustrative examples of genetic variability with practical
consequences for the quality of
pharmacotherapy.
Heterogeneity in disease
212
One of the interesting examples of diseases showing the importance of genetic heterogeneity is Alzheimer-disease. Currently, we know that at least 3 gene-mutations are involved. In addition, there are polymorphisms in susceptibility genes. Such genes may not cause the disease themselves but may make an
individual more sensitive to acquire the disease if conditions make this permissive.
The E4 variant of APOE (apolipoprotein E) is associated with an increased risk of Alzheimer disease. Homozygosity of the E4 allele increases the risk
of Alzheimer by a factor 33 in Japaneses, 15 in Caucausians and 6 in African
Americans. Although this increased risk is known for 12 years, its identification did not help to develop effective medicines or prevention strategies.
Alzheimer is also an illustrative example to show heterogeneity in drug
response. When the cholinesterase-inhibiting drug tacrine was investigated in
clinical trials, the overall efficacy was disappointing: only about 1/3 of the patients benefited from the drug, in 1/3 there was no apparent effect and the drug
had to be discontinued in another 1/3 due to side effects. Only later (when the
drug was already dead) is was found that patients with a ApoE 2/3 genotype
showed a 80% response while the ApoE 4 genotype predisposed for no effect /
worsening of the disease and suffering from side effects. This example shows
the potential promise of genome technology. Some drugs are very efficacious
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Impact of pharmacogenetics on drug use
in some patients, but not in others. But how can we learn this beforehand? That
means that we have to study the origins of variability in drug response in more
detail, and these may have to do with disease state, pharmacokinetics and pharmacodynamics.
On the other hand success stories are also know. The drug trastuzumab has
a high affinity for the HER2 transmembrane protein. HER2 (human epidermal
growth factor) is a member of the epidermal growth factor receptor (EGFR) family of tyrosine kinases and is involved in regulation of cell proliferation. In patients with overexpression of HER2 or an amplification of the gene, breastcancer is more aggressive: enhanced growth and proliferation, increased invasive
and metastatic capability and stimulation of angiogenesis. In these patients treatment with trastuzumab leads to a response rate of 34%. In combination with cytotoxic agents the response rate is further increased (Hortobagyi et al; 2005).
Heterogeneity in Pharmacokinetics
Absorption / P-glycoprotein and Multi-Drug Resistance (MDR) Genes
The P-glycoprotein efflux pump, which is encoded for by the MDR1 gene,
plays an important role in the export of substances from the inside of cells and
from membranes to the outside. PGP (P-glycoprotein) protects cells from toxic
substances and many drugs by permitting or inhibiting transportation through
the intestine and other epithelial barriers. To date at least 105 variants of the
MDR1 gene have been discovered. Not all these SNPs lead to an effect on
PGP; most of them are intronic or non-coding. Of the 15 most common variants
the C3435T mutation at exon 26 is well known. This silent mutation leads to an
alteration in the effect of PGP. The TT genotype (homozygous variant allele) is
associated with a twofold lower MDR-1 expression level in the duodenum
compared with the CC genotype (wildtype) and resulted for instance in a higher digoxine plasma concentration (Kerb; 2006).
HIV-protease inhibitors are known substrates of PGP resulting in a low
bioavailability and a limited penetration in targets. Patients who were ho-
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Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Impact of pharmacogenetics on drug use
mozygous for the 3435TT genotype had low plasma concentrations of nelfinavir and efavirenz, but for not fully understood reasons, they had a better
antiviral response and CD4+ immune recovery than patients with the CC- or
CT genotype (Fellay et al; 2002). This can be explained by low PGP levels
in the membrane of (infected) cells and therefore enhanced concentration
build-up of anti-retroviral drugs in these cells. The frequency of the TT genotype is very low in Africans comparing to Caucasians (25%), which explains the difference in response between Caucasians and black Africans to
these drugs.
Metabolism / polymorphism in drug metabolising enzymes
214
Many drugs are metabolised by the oxidative cytochrome P450-enzyme
complex. One member of this family, CYP2D6, is extremely polymorphic,
with more than 75 allelic variants. CYP2D6*4 is the most common variant
(21% allele frequency in Caucasians), which leads to a non-functional allele.
Subjects homozygous for a non-functional variant allele lack enzyme activity
and are defined as 'poor metabolisers' (PMs). The CYP2D6 PM pheFigure 2. Schematic
notype results in an increased plasma concentration of drugs predopresentation of the
minantly metabolised by CYP2D6 e.g. tricyclic antidepressants, corelationship between the
deine, tramadol. In case of a narrow therapeutic window this will
debrisoquine metabolic
lead to toxicity.
ratio and CYP2D6 genotype
CYP2D6 gene duplication/multiplication occurs relatively infrequent
in caucasians (Dahl et al;
among
northern Europeans (1-2% of the Swedish population), but increa2002).
ses in southern direction: 710% of Spaniards and Southern Italians, and as high as
29% of Ethiopians. Such
subjects can have an inadequate response to standard
doses of drugs metabolised
by CYP2D6 and are called
'ultrarapid metabolisers'
(UMs) (Dahl et al; 2002).
These polymorphisms
are illustrated in Figure 2.
The following case is a nice example showing the influence of CYP2D6
polymorphisms in daily practice (Gasch et al; 2004).
A 62-year-old man with a history of chronic lymphocytic leukaemia had complaints of fever, fatigue, dyspnea and a cough. Therapy with ceftriaxone, clari-
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Impact of pharmacogenetics on drug use
thromycine and voriconazol was initiated for pneumonia infected by yeast. The
patient received a modest dose of codeine (25 mg 3 times daily) to relieve the
cough. After 4 days, the patient's level of consciousness deteriorated. His neurological status (a score of 6 on the Glasgow Coma Scale) was poor. After the administration of naloxone, the patient recovered rapidly. Extremly high plasma levels
of codeine and morphine were found despite of the modest dose of codeine. After
analysis of the patients CYP2D6 genotype, the patient seemed to be an ultrarapid
metaboliser. Along with the CYP2D6 gene duplication, a drug interaction may have contributed to the observed toxic effects. Voriconazole and clarithromycine both
inhibit CYP3A4, thereby decreasing the amount of the metabolite norcodeine (and
increasing codeine concentration). At last due to renal failure the excretion of the
morphine metabolites was reduced, leading to the observed respiratory problems.
A similar example demonstrating the impact of the CYP2D6 genotype on
codeine toxicity was published in the Lancet (Koren et al; 2006). A full term
baby boy died due to an increased morphine concentration (70 mg/ml instead
of 0-2,2 ng/ml). The mother, who was breast-feeding her child, was prescribed
codeine in a standard dose. After genotyping for CYP2D6, the mother seemed
to be an ultrarapid metaboliser (gene duplication). This genotype leads to increased formation of morphine from codeine, which she passed on to her boy.
Genetic variations do not only determine drug response and toxicity but
also side effects. A polymorphism (C677T) in 5,10-methylenetetrahydrofolate
(MTHFR) polymorphism for example, can determine MTX toxicity. MTHFR
is a folate-metabolizing enzyme that is inhibited by MTX metabolites. The activity of the enzyme is reduced in the TT and CT genotypes to 30% and 60%
respectively. Patients with these genotypes often experience MTX toxicity as a
result of low folate levels. As the prevalence of MTHFR variant allele is very
high, (TT 10-12% and CT 40%) genotyping with subsequent adaptation in therapy will reduce the risk of MTX toxicity (Ulrich et al; 2001).
Unless proven evidence that genotyping contributes to better drug response, genotyping is hardly performed in clinical practice to predict drug response.
It is mostly carried out afterwards to explain clinical symptoms as seen in the
cases mentioned above.
215
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Impact of pharmacogenetics on drug use
Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) genotyping comprises an exception: it is clinically used to prevent life-threatening myelosuppression in patients with acute lymphoblastic leukemia, treated with mercaptopurine (PuriNethol®) or azathioprine (Imuran®).
The immunosuppressant thiopurine drugs mercaptopurine and azathioprine
are metabolised by thiopurine S-methyltransferase (TMPT) and xanthine oxidase
(XO). Variation in TPMT is of much greater impact than XO. Three important
SNPs are found in the TPMT gene: TPMT*3A, *3B and *3C. The presence of
one of these mutations leads to reduced enzyme activity. Subjects homozygous
for the variant allele TPMT*3A (0,3% of the Caucasians) are of increased risk of
myelosuppression, a known side effect of thiopurine drugs. *3C is the most common variant allele in Asian subjects, while *3B is very rare (Wang et al; 2006).
Phenotypic assays for TPMT, performed on red blood cells, have also
been developed. However, the phenotypic assay is labor-intensive, requires
qualified knowledge and expensive instruments.
Some authors have doubts about the benefit of genotyping, since TPMT
polymorphism fails to explain all cases of myelosuppression. However, certainty is rare in clinical medicine. TPMT genotyping predicts myelosuppression
and is proven to be cost-effective (van den Akker et al; 2006).
Heterogeneity in Pharmacodynamics
Pharmacodynamics of a drug is regulated by the whole genome. We know
for example that drug response depends on the presence of sufficient numbers and
sensitivity of receptors. Receptors are proteins that are encoded for by genes. This
means that the gene expression level determines the amount of receptors and is
thus closely associated with drug response. Gene expression itself however, is determined by several transcriptional, translational and post-translational regulatory
effects of other genes. In this way the whole genome is involved in drug response.
Small genetic variations, such as variability in receptors, can have a large
impact on the pharmacodynamics of a drug. It is no surprise that the list of
drugs that are subject to such an effect is increasing almost daily.
In some cases a SNP or a point mutation can modify drug response. Gene-
216
tic variability in receptors is either inherited or acquired. Resistence to imatinib
is for example associated with mutations in the kinase domain of BCR-ABL
that interfere with drug binding. Acquired mutation in a theronine residue of
the ABL kinase is the cause of resistance to imatinib in about 67% of the cases
(Gorre et al;2001). Increased expression of BCR-ABL from genomic amplification could also be a mechanism for resistance.
One of the first well documented examples that in literature relates to the
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Impact of pharmacogenetics on drug use
efficacy of cholesterolsynthesis-inhibitors of the statin-type. Carriers of so called B1-alleles on the receptor benefit more from statin-therapy than individuals that have just one allele (Kuivenhoven et al;1998).
Another example relates to the tachyphylaxis of beta-2-agonists, a well
known effect from drugs like salbutamol. The 2-receptor has three main polymorphisms and two of them (Arg16Gly and Gln27Glu) are found in the general population. The two SNPs are in strong linkage disequillibrium and can be
considered together in haplotypes. It is demonstrated that homozygous carriers
of Gly16/Gly16 desensitise faster than Arg16/Arg16 carriers. Arg16Gly and
Gln27Glu are associated with a decreased effect of 2-agonists.
Patients with variant alleles of the promoter gene of ALOX5 (5-lipoxygenase) have a diminished gene transcription, and therefore a decreased receptor
activity, which leads to a decreased response to treatment with leukotriene antagonists (like montelukast) (Drazen et al;1999).
DETECTING GENETIC VARIATION
One of the most frequently used techniques in identifying genetic variability
is the Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR is a simple method by which a
part of DNA or a transcript (RT-PCR) is amplified. Subsequent sequence analysis
on the PCR product will reveal the presence of mutations or polymorphism. PCR
is not only used to detect sequential variability but also variability in gene expression. By applying real-time PCR, we are able to measure gene expression
precisely. In this way single nucleotide polymorphism can be detected in genes
encoding drug metabolising enzymes, transporters and receptors.
Micro-arrays have been developed to detect many SNPs in a short time
period. The Amplichip CYP450 GeneChip® is an oligonucleotide microarray
hybridization method for genotyping CYP2D6 and CYP2C19. This test distinguishes 29 polymorphisms in the CYP2D6 gene including gene deletion (*5)
and gene duplication. In this way the phenotype of a patient (PM, IM, EM or
UM) can be predicted. For CYP2C19 the test discriminates between PM and
217
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Impact of pharmacogenetics on drug use
EM by determining 2 common polymorphisms in CYP2C19 (*2 and *3). The
main disadvantage of the test is its price (600 euro per patient). It is expected
that these costs will decrease due to a higher demand and mass production.
For detecting disease related genes 'whole genome screening' can be used.
Commercially available kits based on hybridisation technology (Illumina®, Affymetrix®) contain more than 550 000 tagSNP's evenly distributed across the genome (1 tagSNP every 5.5 Kb). None of these arrays covers all variation in the human genome, but come close by using haplotype tagging SNP's.
A different technique to detect chromosomal aberrations is spectral karyotyping (SKY). SKY is based on the hybridisation of certain molecules (probe) to
chromosomes, creating colour in exposure to light. As a result, each chromosome
has a specific and distinguished colour. Parts of chromosome can be translocated,
or swapped between one chromosome and another. Other chromosomes can be
deleted or duplicated either in whole or in part.
SKY is routinely used to identify birth defects and genetic abnormalities behind
certain cancers, like leukaemia. Based on chromosomal aberrations in leukaemia different therapeutic approaches are undertaken. For example, patients with a translocation between chromosome 15 and 17 t(15;17), are successfully treated with all-trans
retinoic acid (ATRA). Targeted therapy in these patients leads to an enhanced eventfree survival (80-90% at 3 years). Without such targeted therapy the overall survival
is relatively poor, ranging from 6-20%. Recently, many clinical studies are going on
with Imatinib, a signal transduction inhibitor with effect against tyrosine kinase activity. Imatinib is developed especially for leukemic patients with a translocation between chromosome 9 and 22. The so-called t(9;22) or Philadelphia positive leukaemia generates high amounts of an abnormal tyrosine kinase protein and is associated
with a very poor prognosis. It seems however that Imatinib is changing the prospects
of Philadelphia positive leukemic patients. Ongoing trials indicate that after some
time resistance occurs frequently (see before). Research is aimed at new kinase
inhibitors or combination of compounds to overcome this resistance (Tallman; 2002).
INFLUENCE ON DRUG DISCOVERY
218
Pharmacogenomics can enhance drug discovery in two ways:
• Identification of new drug targets.
• Subpopulation-specific drug development.
Pharmaceutical companies are interested in carrying out smaller, less expensive trials using pharmacogenetics. Identification of a genetic variant associated with drug response can lead to smaller phase III studies involving only
those individuals who are more likely to respond that lead to improved effi-
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Impact of pharmacogenetics on drug use
cacy, decreased toxicity and less side effects.
Many genetic variants vary in frequency among ethnic populations. If a
marker for drug response has a low prevalence in a certain population, that population might be excluded from research or treatment.
An example is the drug BiDil, a combination of isosorbide dinitrate and
hydralazine. This drug was not sufficiently effective in treating heart failure in
two large ethnically mixed clinical trials. But in a subpopulation of African
Americans BiDil decreased the risk of death by 43%. The FDA approved this
drug for a single racial group (Service; 2005).
CONCLUSION
Pharmacogenetics constitutes a rapidly evolving research field. Thousands
of studies are published annually with great promise. However, incorporation
of these discoveries in medical practice has been slower than expected.
Promising prospects are complicated by several factors. Diagnostics have
to be changed in such a way that genotyping of relevant PK/PD systems is included. Who will translate this kind of sophisticated information to a prescribing physician? By now, proper dosing and avoiding drug interactions is already a formidable task. The number of disease-targets will become almost
incomprehensible for the average physician. That means that an incredible information dissemination barrier has to be solved. As a result, a new speciality
will develop: genetic information specialist. Not aimed at diagnosing inherited
diseases but at inherited risk factors and drug-treatment success-factors. And
last but not least: the costs of these developments -both for diagnosis and for
more individualised drug preparations- will be impressive. There will be no
way to deny patients the results of these new developments because they may
prove highly efficacious and possibly also cost-effective (although very costly
on an individual basis).
Hospital pharmacists and other healthcare professionals should be aware
of the upcoming developments and should prepare both for a proper informa-
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Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Impact of pharmacogenetics on drug use
tion structure and sufficient expertise to advise doctors in the rapidly approaching era of genetically based medicine (pharmacogenetics). And of course of
the formidable resources needed to pay for this.
Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!
ACKNOWLEDGEMENT
We wish to thank Dr. A. Vermes, hospital pharmacist, for critically reading
the manuscript.
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Impact of pharmacogenetics on drug use
221
Notas
NOTAS
222
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Notas
223
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Notas
224
CURSO DE
BIOTECNOLOGÍA
APLICADA
7ª Edición
DIRECCIÓN DEL CURSO
Este curso es posible gracias a una aportación educacional de
7º Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA
DR. JUAN BUEREN Y DR. JOSÉ LUIS MOTELLÓN
Fundación
Centro Nacional de
Investigaciones
Cardiovasculares
Carlos III
Madrid, 13-16 de febrero de 2007