Apunte - Botánica - Plantas - Ingeniería Genética I

Botánica
Ingeniería Genética
Resumen de los pasos usados en la tecnología de DNA recombinante
1.El DNA del organismo que contiene el gene deseado es cortado en piezas de un tamaño
razonable. Estas piezas son llamadas DNA pasajero.
2.Las piezas de DNA pasajero son unidas o ligadas a una segunda pieza de DNA que es capaz
de duplicarse (vectores). El resultado es una molécula de DNA recombinante que consiste de
dos clases de DNA conectadas una a la otra en un anillo molecular sencillo.
3.Las moléculas recombinantes son introducidas a la célula huésped (un proceso llamado
transformación). Solamente algunas células huéspedes son transformadas (conteniendo el
gen de interés). Luego éstas son esparcidas en un medio nutriente sólido donde crecerán en
colonias.
4.La colonia de células que contiene el gen de interés es escogida o separada de la genoteca
resultante, probándola con el DNA 32p rotulado o por la detección de anticuerpos producidas
por la proteína deseada.
Introducción
La tecnología de DNA recombinante es una nueva ciencia que permite a los científicos aislar y
reproducir secciones específicas de la hélice del DNA. Con técnicas de separación se pueden
obtener secciones deseadas de la cadena del DNA, como por ejemplo el gene de la hormona
de crecimiento humano, que puede ser aislado e insertado en células y de esta forma
programar la célula para que produzca una proteína deseada.
Los cuatro pasos mas importantes son presentados a continuación.
I.Corte del DNA
E1 primer paso en la tecnología de DNA recombinante es cortar el DNA del organismo que
contiene el gene deseado en segmentos mas pequeños para que sea mas fácil trabajar con
ellos. Estas piezas son llamadas DNA pasajero. El DNA es cortado con enzimas llamadas
endonucleasas de restricción o más simplemente enzimas de restricción. Las enzimas de
restricción son producidas por bacterias y hay diferentes tipos con nombres constituido por
letras y número romano (ej. EcoRI, Hind III, Sau III y Hpa I). E1 nombre es derivado del
organismo de donde la enzima fue aislada. Lo que hace que las enzimas de restricción sean
indispensables para la tecnología de DNA recombinante es su habilidad para cortar DNA sólo
en secuencias bien específicas, usualmente de cuatro a ocho pares de bases en longitud.
Estas secuencias son llamadas secuencias de reconocimiento porque son reconocidas por
enzimas de restricción específicas.
La segunda importancia de las enzimas de restricción es que no todas ellas hacen cortes
rectos a través de ambas hélices del DNA. Por ejemplo, la enzima de restriccion EcoRI
reconoce la siguiente secuencia.
- G-A-A-T-T-C- C-T-T-A-A-GEcoRI hace un corte bien preciso entre la G y A en cada hélice dejando el DNA de esta forma:
- G y A-A-T-T-C-
- C-T-T-A-A y GLa enzima Hind III reconoce la siguiente secuencia de nucleótidos
- A-A-G-C-T-T- T-T-C-G-A-ACortando entre las A, que resulta en:
- A y A-G-C-T-T- T-T-C-G-A y -A
Usando enzimas de restricción se crea una mezcla de fragmentos de DNA con extremos
expuestos de la cadena sencilla. Los extremos como éste son llamados cohesivos o pegajosos
porque son complementarios y pueden hibridizarse con cualquier otro extremo producido por
la misma enzima de restricción. Muchas enzimas de restricción han sido purificadas de
diferentes especies de bacterias. Por lo menos 400 enzimas de restricción han sido
identificadas. Más de 100 enzimas, muchas de las cuales reconocen diferentes secuencias de
nucleótidos están disponibles comercialmente hoy día.
II.VECTORES
El segundo paso en la tecnología de DNA recombinante envuelve la unión de fragmentos de
DNA creados por las enzimas de restricción (DNA pasajero) a una segunda pieza de DNA
llamada vector. El resultado es un DNA recombinante que consiste de dos clases de DNA
conectados uno con el otro en una pieza sencilla (muchas veces un anillo cerrado). Los
vectores mas comunmente usados son los plásmidos.
Los plásmidos son moléculas pequeñas circulares de DNA de doble hélice que existen
separados (DNA extracromosomal) o integrados al cromosoma dentro de las células
bacteriales. Los plásmidos pueden cargar uno o más genes de los cuales algunos pueden
conceder resistencia a antibióticos. Algunos pueden dirigir la síntesis de enzimas que asisten
en la producción de toxinas bacteriales. Sin embargo la propiedad mas importante de un
plásmido es que posee una región de DNA llamada origen de duplicación ("ori"), que permite
que éste se multiplique dentro de la célula independientemente de su huésped.
Vector: Molécula de DNA que se duplica por ella misma, se utiliza para insertar fragmentos de
DNA pasajeros y luego ser duplicados (reproducidos) en una célula huésped.
Para preparar el plásmido como vector éste debe ser cortado con la misma enzima de
restricción que se cortó el DNA pasajero. Los dos son mezclados y luego tratados con DNA
ligasa. Esta enzima une las dos hélices de DNA, produciendo una molécula circular
conteniendo el plásmido y su DNA pasajero (fig. 11.21).
III. Introducción de la molécula recombinante a una célula huésped
Una vez que las moléculas de DNA recombinante estén hechas, estas son colocadas en
huéspedes apropiados lo que es el tercer paso en la tecnología. La célula huésped sirve como
una copiadora biológica, haciendo muchas copias exactas de la molécula recombinante. La
célula huésped mas popular en la tecnología es la bacteria Escherichia coli. Ciertas levaduras
son también usadas como huéspedes.
En este paso el plásmido recombinado de DNA es introducido en E. coli y crecido en un caldo
nutriente con Cloruro de Calcio para permitir la entrada del plásmido, sin embargo sólo
algunas células tratadas dejarán entrarlo. Una forma de identificar bacterias que contengan
plásmidos es utilizando plásmidos que transporten genes resistentes a antibióticos. Cuando
estas bacterias son colocadas en un medio nutriente sólido conteniendo el antibiótico, la
bacteria que adquirió el plásmido recombinado (por ende el gene con resistencia a
antibiótico) crecerá en colonias. Cada colonia es llamada un clon, que significa que una
población entera surge de una célula lo que hace a estas células genéticamente idénticas.
Las células de mamíferos pueden también servir como huéspedes recombinantes. El uso de
células mamíferas mas complejas como las células del riñón de un hamster o las células del
ovario de un hamster chino le permiten a los científicos duplicar las propiedades biológicas
exactas de una proteína humana. Las proteínas humanas recién formadas muchas veces
deben modificarse para que sean completamente activas. Uno de estos procesos es
glicosilación, donde ciertos tipos de carbohidratos (azúcares) son ligados a proteínas. Este
proceso está ausente en las bacterias, ya que sus proteínas no lo requieren; pero está
presente en las células de organismos mas complejos. Si la glicosilación es necesaria para la
activación de la proteína humana deseada, las células de mamíferos deben ser utilizadas
como huésped recombinante.
Cuando la glicosilación no es esencial, un huésped bacterial es usualmente mas apropiado.
Por último nos queda identificar cuál de los clones contiene el DNA recombinante y por ende
el gene de interés. Se describirán dos técnicas disponibles para este próposito, pero existen
muchas más.
IV. Identificación de la célula con el gene deseado
La primera técnica es llamada hibridización colonial. En este procedimiento las bacterias son
inoculadas en un medio de crecimiento regular en una placa petri que se incuba por 24 horas
o hasta que la bacteria forme colonias. Luego un filtro de nitrocelulosa es colocado sobre las
colonias. Una fracción de las bacterias de cada colonia es transferida al filtro en este proceso.
La membrana de nitrocelulosa es usada para inmobilizar el DNA, el RNA o proteínas, el cual
luego puede ser reconocido con una secuencia de DNA marcada radioactivamente o rotulada
por anticuerpos. Luego las bacterias se rompen (lisan) para liberar el DNA.
El filtro es entonces expuesto con un DNA que es complementario a la secuencia de DNA de
interés. El DNA se marca radioactivamente para que este pueda ser detectado. E1 filtro es
incubado con el DNA en condiciones que propicien la hibridización (unión de ambas molécuals
de DNA).
Después de la hibridización, el filtro es lavado para remover todo el DNA que no ha sido
hibridizado. El filtro es entonces presionado contra una hoja de película de rayos X. Después
del revelado aparece una parte oscura en la película de rayos X (autoradiografía).
Autoradiografía es la imagen producida en una película de rayos X por una sustancia marcada
radioactivamente (fig. 11.25). Esa parte oscura corresponde con la colonia que adquirió el
plásmido, en otras palabras esta colonia contiene el gene de interés.
Otra técnica es utilizando anticuerpos (ab) que identifiquen a la proteína de interés. En este
proceso las colonias recombinantes son transferidas a un filtro de nitrocelulosa, se lisan las
células y una solución conteniendo la proteínas de interés es añadida. Los anticuerpos
marcados radioactivamente identificán la colonia con la proteína correcta. El resultado final
otra vez es una parte oscura en una película de rayos X encima del área donde se encuentra el
gene deseado.
Modificaciones que hay que realizar cuando se trabajan con plantas
El DNA de plantas no se puede recombinar con DNA foráneo utilizando directamente las
enzimas de restricción. Esto se ha resuelto utilizando la bacteria Agrobacterium tumefaciens.
Esta posee un plásmido llamado Ti con una región llamada T-DNA esta región se inserta
naturalmente en las plantas a infectar (fig. 11.29). El problema es que esta bacteria
solamente infecta plantas dicotiledóneas. La cosechas más importantes como el arroz, trigo,
cebada y maíz son monocotiledóneas, lo que les impide utilizar la bacteria anterior para
obtener plantas transgénicas. Con estas plantas se utilizan los siguientes métodos:
introducción del DNA deseado a las células vegetales sin pared (protoplasto) usando
electricidad para abrir temporalmente la membrana celular y el uso de una pistola cubierta
con el DNA deseado que será disparada directamente a la célula (Box 11.3).
Las siguientes características están siendo consideradas a la hora de hacer plantas
transgénicas de importancia comercial:
1.
2.
3.
4.
Resistencia a hierbicidas (fig 11.30; 11.31)
Resistencia a insectos y enfermedades (fig. 11.19)
Reducción en el proceso de fotorespiración en plantas C3
Fijación de nitrógeno atmosférico
5.
6.
7.
8.
9.
Tolerancia a inundaciones y altas concentraciones de sal en el suelo
Aumento en el almacenaje de proteínas
Aumento en la producción de sustancias químicas de interés farmacéutico o
nutricional
Tolerancia a las temperaturas bajas
Resistencia a la podredumbre (fig. 11. 19)
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