Marcadores moleculares: Diagnóstico de mastitis y genes de

Marcadores moleculares: Diagnóstico de mastitis y genes de
resistencia a infecciones.
Patricia Cervantes A., Antonio Hernández B., Gomer H. Rivera V, Belisario Domínguez
M. y Carlos Lamothe Zavaleta.
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,
Laboratorio de Biología Molecular, Rancho Torreón del Molino
Universidad Veracruzana, Veracruz, México
[email protected]
Introducción
La leche aporta cerca del 30% de las proteínas consumidas en los países desarrollados.
Por esta razón, la lactancia ha sido objeto de diversos estudios en el campo de
genética, fisiología y nutrición. En los rebaños lecheros, la selección de animales con
alto nivel productivo, permite que características tales como la salud de las vacas se
reduzca y que algunas enfermedades como la mastitis clínica aumenten. Por ello, un
programa de mejora genética debe centrar su atención no sólo en obtener animales
con alta producción láctea y de calidad composicional óptima, sino también incluir
condiciones de salud del rebaño que favorezcan tanto al bienestar animal como a la
rentabilidad de las empresas. El desarrollo de la biología molecular abrió la posibilidad
de hacer estudios comparativos con modelos animales heterólogos, así como avanzar
en la habilidad de generar vacas lecheras que posean nuevos genes, sin embargo el
costo sustancial asociado a la aplicación de estas tecnologías en términos de tiempo e
implementación todavía se considera alto, ya que el tiempo no incluye el esfuerzo
involucrado en el diseño, ensamblaje y pruebas de la construcción de genes en los
modelos biológicos apropiados que aseguren el éxito de estas tecnologías. Por otro
lado, aún se discute la aplicabilidad de estas tecnologías en la consideración de la salud
de los consumidores y de la inocuidad alimentaria.
Palabras clave: Mastitis, Transgénicos, Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Biología molecular para el diagnóstico de mastitis
Las técnicas moleculares desarrolladas en torno a la mastitis, van desde un diagnóstico
por PCR de la cepa bacteriana y pueden incluir la detección de un gen en particular de
ese agente, por PCR en Tiempo Real, PCR anidado, hasta el análisis de mutaciones con
técnicas simples como el polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP, del
inglés, Single Strand Conformation Polymorphism) ó la T-RFLP (del inglés, TerminalRestriction Fragment Lenght Polymorphism), cuyo principio es la amplificación del 16S
rDNA de las bacterias existentes en una muestra, restricción enzimático de los distintos
fragmentos obtenidos y la detección de los fragmentos terminales resultantes de la
digestión (Ovidio et al, 2006).
Resistencia a enfermedades
Aunque las infecciones por mastitis se deben en su mayoría, a un mal manejo
higiénico-sanitario de la granja, se ha demostrado que el riesgo de un animal de
padecer o no esta enfermedad se transmite también de generación en generación. La
heredabilidad de la mastitis (es decir, lo que depende del propio animal y puede
transmitir a su descendencia) es del 10% aproximadamente (Pérez-Cabal et al, 2008).
Por ello, se considera que si se utilizan metodologías adecuadas, se pueden realizar
valoraciones genéticas que permiten detectar vacas y toros que transmitirían a las
futuras generaciones mayor resistencia a la mastitis clínica, seleccionando así animales
que presenten una menor susceptibilidad a esta enfermedad. Dentro de las estrategias
de prevención se investiga acerca de la selección de animales con genes de resistencia,
ya que una vez que un microorganismo productor de mastitis invade la glándula inicia
su multiplicación generando por parte del huésped, una respuesta inflamatoria con el
propósito de controlar o eliminar el agente invasor, ya sea recurriendo a la respuesta
humoral o a la celular (Detilleux, 2001).
Cuando una bacteria logra atravesar el canal del pezón las probabilidades de mastitis
son altas. Pero los animales muestran diferentes grados de susceptibilidad para
enfermarse y en buena parte esa resistencia es determinada genéticamente. Las bases
genéticas de la resistencia a la mastitis no son totalmente conocidas, pero es necesario
hacerse varias preguntas de tipo práctico acerca del impacto económico que tendría
este comportamiento genético (Sordillo y Streicher, 2002).
Los ensayos para incrementar la resistencia de la glándula mamaria a la mastitis
utilizando cruces o vacunas han tenido hasta el momento un impacto muy limitado. Sin
embargo la revolución contemporánea en genética animal conduce a posibilidades
tales como la modificación en la velocidad y naturaleza de la respuesta celular,
aumento de la producción local de anticuerpos o neutralización de toxinas y
metabolitos que producen daño celular (Rainard y Riollet, 2006).
Según Ovidio et al. (2006), mencionan varias vías que permitirían aumentar la
resistencia a las mastitis:
a. Mediante la creación de animales transgénicos que sintetizan en leche proteínas
antibacterianas, es posible plantear estrategias para producir y usar animales
transgénicos resistentes a la mastitis se fundamentan en la variedad de sustancias
antimicrobianas presentes en la glándula mamaria de los bovinos.
b. Terapia génica local de la glándula mamaria utilizando vectores adenovirales que
contengan un gen que codifique para una proteína antibacteriana.
Mediante estas dos tecnologías las células epiteliales mamarias sintetizarían enzimas
antibacterianas, lo cual permitiría disminuir el uso de antibióticos. Así mismo, señalan
que un tercio del total de antibióticos usados en los animales es para combatir la
mastitis, lo que aumenta el riesgo de resistencia a los antibióticos por parte de las
bacterias. Así que este tipo de biotecnologías por tratarse de la producción de
proteínas, disminuirían los riesgos para el consumidor debido a que, a diferencia de los
antibióticos estas enzimas una vez ingeridas en la leche se degradan durante el
proceso digestivo atenuándose las reacciones alérgicas.
Investigaciones tales como el aumento de la resistencia gracias a la codificación
genética que estimula la producción de péptidos antibacterianos en la glándula
mamaria, tuvieron lugar con investigadores en la Universidad de Vermont a finales de
la década de los noventa y concluyen que el uso de transgénicos es posible para
resolver problemas en la industria agrícola y pecuaria (Kerr y Wellnitz 2003; Donovan
et al., 2005).
Numerosos péptidos y proteínas antimicrobianos son producidos por
microorganismos, plantas o animales que según su actividad van desde los que tienen
un estrecho espectro como colicinas y lisostafinas hasta moléculas de mayor espectro
con actividades no específicas como lisozimas y lactoperoxidasa. Unas y otras tienen
ventajas y desventajas cuando se quiere elegir a una de ellas para la transgénesis
(Rainard y Riollet, 2006).
En el caso de la lisostafina, esta enzima posee un espectro específico anti-estafilococo.
Es una endopeptidasa que hidroliza los enlaces pentaglicina en el péptidoglicano de la
pared de Staphylococcus aureus produciendo la lisis celular. De forma natural la
lisostafina la producen especies Coagulasa Negativa del género Staphylococcus como
es el S. simulans.
Se caracteriza por ser específica para S aureus, con poca actividad para otras especies
del mismo género, no es tóxica y no afecta las células animales ni las proteínas de la
leche. En 1990 se demostró que una concentración de 10 g de lisostafina son
suficientes para prevenir mastitis en ratas en lactación y que su expresión genética
puede estar orientada a un tejido en particular o a un estado fisiológico por la adición
de sustancias promotoras o reguladoras, por ejemplo, la producción de Blactoglobulina que es una proteína que expresa la glándula mamaria (Wall et al, 2005).
Los Marcadores Moleculares
Entre los genes, marcadores QTL, SNPs, AFLP y micro-RNAs, diversas fuentes en la
literatura mencionan que existen en la vaca 943 loci involucrados tanto en el
desarrollo de la glándula mamaria, como en rasgos de producción y composición
láctea, así como en la resistencia o suceptibilidad a la mastitis (Schwerin et al, 2003;
Ogorevc et al, 2009).
Un reto para los investigadores, ha sido identificar marcadores para genes de rasgos
cuantitativos (QTL) que controlan la expresión de las variaciones fenotípicas en rasgos
particulares (Ogorevc et al, 2009). Estos marcadores pueden ser de dos tipos:
a. El primero corresponde a genes de rasgos estrechamente cercanos en un
cromosoma, en la mayoría de los casos, los alelos que sirven de marcadores y son
heredados juntos, se conocen como “marcadores ligados” y no permiten predecir
un fenotipo sin asociar los alelos y los marcadores en un proceso que se llama fase,
su estudio sólo puede llevarse a cabo en familias, con el inconveniente de sufrir por
recombinación mutaciones en generaciones posteriores.
b. El segundo tipo de marcador es un polimorfismo funcional, en un gen que controla
la variación en un rasgo. Estos marcadores se denominan "marcadores directos".
Una vez que se conoce el polimorfismo funcional, es posible predecir el efecto de
alelos particulares en todos los animales de una población, sin tener primero que
determinar la fase. Por lo tanto, "los marcadores directos" son más útiles que los
“marcadores ligados” para la predicción de la variación fenotípica de los rasgos
objetivo en una población.
Estudios de mapeo de genes relacionados con datos de vacas lecheras escandinavas
medias hermanas del mismo padre, demostraron una asociación de la incidencia de
mastitis con QTL putativos en los cromosomas 3, 4, 14 y 27. En ese estudio se tomó en
cuenta la puntuación de CCS como indicador de la incidencia de mastitis, encontrando
correlaciones que oscilaban entre 0.37 y 0.97 (Rupp y Boichard, 2003).
En la consideración de que el CCS es una medida de la respuesta inflamatoria que
ocurre en la ubre posiblemente después de la invasión de un agente patógeno, por
tanto puede no indicar necesariamente infección clínica o subclínica, sin embargo los
CCS son registradas de forma regular en rebaños lecheros comerciales, mientras que la
mastitis no lo es. Estas mediciones muestran una correlación que oscilan entre 0,37 y
0,97 (Klungland et al, 2001; Rupp y Boichard, 2003).
En varios estudios de QTL los conteos de células somáticas se han utilizados como un
indicador de mastitis, pero no se ha demostrado una relación directa entre el QTL para
CCS y la resistencia y susceptibilidad a la mastitis (Rupp y Boichard, 2003).
Genes de susceptibilidad y resistencia a enfermedades
Cuando ocurren mutaciones que generan variaciones genéticas, alterando el riesgo de
ocurrencia de una enfermedad infecciosa, se conocen como genes de susceptibilidad
(Kerr y Wellnitz, 2003). Los genes de susceptibilidad / resistencia se ponen de
manifiesto porque algunas de sus variantes:
a.
b.
c.
d.
causan o predisponen el desarrollo de una enfermedad (alelo de
susceptibilidad),
presentan mayor incidencia en individuos emparentados,
influencian la edad de ocurrencia y/o la progresión o
ayudan a proteger contra la enfermedad (alelo protector).
Diversos estudios han demostrado que las variaciones genéticas que afectan la
susceptibilidad/resistencia pueden ocurrir tanto en regiones codificantes como no
codificantes. Entre las primeras se encuentran, por ejemplo, los cambios en las
regiones de reconocimiento de los antígenos (ARS), que pueden modificar la afinidad
antígeno-anticuerpo. Entre las mutaciones en regiones no codificantes pueden
mencionarse:
a.
b.
las regiones involucradas en el corte y empalme de intrón y exón (splicing), las
que pueden modificar la funcionalidad de la proteína madura, y
las regiones promotoras implicadas en el control de la transcripción de los
genes y que por lo tanto, pueden variar los niveles de expresión.
El Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH)
Aunque la resistencia genética es un rasgo multigénico, es decir, determinado por
muchos genes, entre los cuales se encuentran los que codifican las moléculas que
forman parte del sistema inmune, en rasgos bien definidos, tales como resistencia a la
mastitis, es difícil la selección de genes candidatos que pueden controlar el rasgo,
debido al gran número de patógenos diferentes y mecanismos fisiológicos que
contribuyen a las variaciones observadas (Rainard y Riollet, 2006).
Un locus posible candidato es el locus del complejo mayor de histocompatibilidad
(CMH). En bovinos el CMH es conocido como antígeno leucocitario bovino (BoLA)
ubicado en el cromosoma 23. Uno de estos marcadores es el gen DRB3, expresado en
células del sistema inmune como macrófagos, células dendríticas y linfocitos B que
procesan y presentan antígenos a los linfocitos T ayudadores, para desencadenar la
respuesta inmune contra patógenos infecciosos.
El gen DRB3 tiene un alto polimorfismo principalmente en el exón 2. De este exón, han
sido identificados 121 alelos diferentes, algunos de los cuales han sido asociados con
susceptibilidad a mastitis. La región CMH incluye genes que codifican para proteínas de
superficie celular que participan en la unión de péptidos (por ejemplo, péptidos de
patógenos) y que presentan correctamente a las células del sistema inmunitario para
que una respuesta inmune apropiada de inicio. De esta manera el CMH es un buen
locus candidato cuando se tiene en cuenta la variación en la respuesta inmune o de
resistencia para desafiar a una enfermedad (Detilleux, 2001).
Son varios genes CMH dentro del loci de CMH, estos codifican para subunidades de
moléculas de la superficie celular Clase I y Clase II. Las moléculas de clase II son
heterodímeros compuestos por una subunidad α y una β. El gen DRβ, tiene un número
de diferentes alelos y es uno de los varios genes de CMH.
Los diferentes alelos del gen MHC difieren en la parte activa de la molécula que está
implicada en péptido de unión y la presentación. Una serie de estudios han
demostrado la asociación entre los alelos en el MHC locus DRβ y el conteo de células
somáticas (CCS). Esto sugiere que los alelos DRβ presentes en un individuo pueden
asociarse con las diferencias en la susceptibilidad o resistencia a la mastitis.
Como ejemplo, se ha reportado una correlación entre la ocurrencia de mastitis y el
CCS, asociando el alelo DRB3.2*16 se asociaba con CCS elevado, mientras que el
DRB3.2*24 se asociaba con CCS bajo. Otros autores encontraron asociación entre el
alelo DRB3.2*16 y CSCS alto; mientras que en un análisis de la asociación entre los
alelos del BoLA-DRB3 y el SCS como medida de mastitis en un rebaño canadiense de
vacas Hosltein (n=835), se encontró asociación entre el alelo DRB3.2*16 con bajos CCS,
y entre el alelo DRB3.2*23 con casos de mastitis severos (Detilleux, 2001; Rupp y
Boichard, 2003).
Estos hallazgos evidenciaron la utilidad de los alelos del DRB3 bovino como
marcadores de la resistencia/susceptibilidad a mastitis.
Las citoquinas
Los genes de citoquinas se consideran genes candidatos importantes para investigar
susceptibilidad/resistencia a enfermedades infecciosas, ya que en las especies
estudiadas se han identificado polimorfismos nucleotídicos simples (SNPs) asociados a
la susceptibilidad/resistencia. Estos altos niveles de polimorfismo han permitido el
desarrollo de marcadores genéticos asociados a enfermedades infecciosas para ser
utilizados en el control sanitario y erradicación de la mastitis (Rainard y Riollet, 2006).
Numerosos estudios recientes reflejan el progreso durante las últimas dos décadas
para desentrañar el sistema inmune de la glándula mamaria (GM) y su funcionamiento.
En la década de los 80 se prestó considerable atención a la identificación y
caracterización funcional de las poblaciones de leucocitos en la GM mediante análisis
de citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales desarrollados para
reconocer únicamente la superficie de las moléculas. Desde 1990, esta investigación se
ha ampliado al estudio de las citoquinas y de su potencial papel en la patofisiología y el
control de la mastitis (Rupp y Boichard, 2003; Rainard y Riollet, 2006).
La disponibilidad del gen de la citoquina y de las secuencias proteicas llevaron al
desarrollo de numerosas estrategias de identificación que incluyen los anticuerpos
monoclonales, cebadores para PCR y cuantificación de proteínas. Además, se
produjeron citoquinas recombinadas para explorar su posible capacidad
inmunomoduladora y terapeútica para el control de la enfermedad (Wall et al, 2005;
Rainard y Riollet, 2006).
Consideraciones finales
Para el control de la mastitis se han tratado de desarrollar diferentes estrategias, en el
caso del desarrollo de las vacunas inmunomoduladoras no se han logrado reportado
los resultados deseados, sin embargo en el estudio de los factores que intervienen en
la inmunodepresión durante el periparto podrían mejorar las tasas de éxito de las
estrategias inmunoterapeúticas (Rainard y Riollet, 2006).
Otros factores estudiados son los hormonales, ya que a través de hormonas de estrés
conocidas como reguladores cruzados de la función inmune (corticosteroides), se
disminuyen el número total, la distribución y la función de los leucocitos en sangre,
descienden las IgM en la secreción láctea e inhiben la producción de citoquinas.
En cuanto al estrés oxidativo muchos autores lo asocian con una rápida diferenciación
del parénquima secretor, el crecimiento intenso de la glándula mamaria y la
instauración de la síntesis y secreción de leche acompañada por una mayor demanda
de energía y un incremento de los requerimientos de oxígeno. Esta demanda de
oxígeno aumenta la producción de reactivos derivados del oxígeno, denominados
colectivamente cómo especies reactivas al oxígeno (ROS). La acumulación de excesivos
ROS puede llevar a la condición denominada de estrés oxidativo que juega un papel
decisivo en la mediación de las respuestas inflamatorias incontroladas y causa daño
tisular (Rainard y Riollet, 2006).
En el uso de los factores genéticos desde hace varias décadas se ha puesto especial
atención a la identificación de los marcadores genéticos e inmunológicos para
utilizarse en la selección basada en una mayor resistencia a la mastitis durante los
periodos de mayor susceptibilidad a la enfermedad. La liberación de la secuencia del
genoma de la vaca posibilitó el descubrimiento de nuevos marcadores y la creación de
mapas de proximidad filogenética con otras especies (sintenia), ha sido importante el
hallazgo reciente de miARN y los mecanismos epigenéticos que se asocian a
resistencia/susceptibilidad de mastitis (Ogorevc et al, 2009).
En México se requieren más grupos de investigación que interactúen para la
identificación tanto de los mecanismos genéticos como epigenéticos en los diversos
ecosistemas donde se desarrolla la ganadería, lo que permitirá influir en el manejo y
control de esta enfermedad.
Literatura consultada:
Detilleux J. 2001. Genetic Improvement of Resistance to Infectious Diseases in
Livestock. J. Dairy Sci. 84(E. Suppl.):E39-E46
Donovan David M, Kerr David E y Wall Robert J. 2005. Engineering Disease Resistant
Cattle. Transgenic Research. Vol: 14:5, 563-567.
Kerr D. E. y Wellnitz O. 2003. Mammary expression of new genes to combat mastitis. J
Anim Sci. 2003, 81:38-47.
Klungland H., Sabry A., Heringstad B., Olsen H.G., Gomez-Raya L., Vage D.I., Olsaker I.,
Odegard J., Klemetsdal G., Schulman N., Vilkki J., Ruane J., Aasland M., Ronningen K.,
Lien S. 2001. Quantitative trait loci affecting clinical mastitis and somatic cell count in
dairy cattle. Mamm. Genome 12, 837–842.
Ovidio CF., Rojas PP., Rodríguez Ll. 2006. New biotechnological approaches to treat
mastitis. Agro-Ciencia 22(1): 49-58.
Ogorevc J., Kunej T., Razpet A., Dovc P. 2009. Database of cattle candidate genes and
genetic markers for milk production and mastitis. Animal Genetics. 40, 832–851.
Pérez-Cabal M. A. , Yaici S. y Alenda R. 2008. Clinical mastitis in Spanish dairy cows:
incidence and costs Spanish Journal of Agricultural Research 6(4), 615-622
Rainard P. y Riollet C. 2006. Innate immunity of the bovine mammary gland. Vet. Res.
37 369-400.
Rupp R. y Boichard D. 2003. Genetics of resistance to mastitis in dairy cattle. Vet. Res.
34, 671–688.
Schwerin M, Czernek-Schäfer D, Goldammer T, Kata SR, Womack JE, Pareek R, Pareek
C, Walawski K, Brunner RM. 2003. Application of disease-associated differentially
expressed genes--mining for functional candidate genes for mastitis resistance in
cattle. Genet Sel Evol. 35 Suppl 1:S19-34.
Sordillo L.M. y Streicher K.L. 2002. Mammary Gland Immunity and Mastitis
Susceptibility. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. Vol 7:2, Pages 135146.
Wall R.J., Powell A.M., Paape M.J., Kerr D.E., Bannerman D.D., Pursel V.G., Wells K.D.,
Talbot N., Hawk H.W. 2005. Genetically enhanced cows resist intramammary
Staphylococcus aureus infection, Nat. Biotechnol. 23 (2005) 445–451.