Módulo 2: Banco de Tejidos. Terapia celular y tisular

plan docente
Módulo 2: Banco de Tejidos.
Terapia celular y tisular
Coordinador:
Dr. Joan García López
Profesores:
Dr. Jordi Barquinero
Dr. Joan García López
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Presentación
2. Objetivos
3. Contenidos
4. Actividades
5. Evaluación y calendario
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Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1. Presentación
En los últimos años hemos asistido, por una parte a un crecimiento explosivo
en el conocimiento sobre los tejidos, la biología de las células madre (CM), y la
inmunología, y por otro a una serie de avances tecnológicos que, en conjunto, se
han materializado en la aparición de novedosas formas de terapia celular (TC) y
tisular, muchas de ellas todavía experimentales, pero que podrían convertirse en
rutinarias en un futuro cercano.
La TC es la principal herramienta en que se basa la denominada medicina
regenerativa, una joven disciplina que promete remedios contra males tan
comunes como la cirrosis hepática, la diabetes mellitus o la enfermedad de
Parkinson. Se ha descrito la presencia de CM en prácticamente todos los tejidos
adultos, así como la posibilidad de generar células “embrionarias” a partir de
células adultas, mediante técnicas de transferencia nuclear. Se han investigado y
caracterizado las condiciones óptimas para cultivar distintos tipos celulares en
condiciones que permitan su expansión y/o su diferenciación hacia linajes
específicos. Se han descubierto nuevas fuentes de células progenitoras como la
sangre de cordón umbilical (SCU), un material que hasta hace pocos años era
considerado de deshecho, o el tejido adiposo como una extraordinaria fuente de
progenitores mesenquimales.
Los avances tecnológicos también han contribuido a mejorar la obtención, la
manipulación y el almacenamiento de los productos celulares o tisulares para su
aplicación clínica, lo que ha redundado en un mayor número de indicaciones y
en una mejora de los resultados terapéuticos.
Muchos de estos “nuevos” productos celulares ya están en este momento
siendo utilizados en la clínica humana, en algunos casos de una manera
prácticamente rutinaria, como los trasplantes de SCU, o bien de forma
experimental, como el empleo de células mesenquimales en la regeneración ósea
o de cartílagos, o como agentes inmunomoduladores en el tratamiento de la
enfermedad del injerto contra el huésped tras un trasplante alogénico de
progenitores hematopoyéticos.
Al lado de estos productos, los bancos de tejidos, una actividad ya “clásica”,
mantienen su vigencia, con una utilización cada vez mayor de tejidos
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Módulo 2
procedentes de donantes. Ello ha motivado el desarrollo de estrategias
específicas de promoción, donación, obtención, procesamiento y control de
calidad.
La enorme complejidad de esta disciplina nos ha obligado a dividirla en 6
Unidades Didácticas (UD), como veréis en el apartado de contenidos.
Esperamos que las disfrutéis.
2. Objetivos
El objetivo general es que los alumnos se familiaricen con algunos conceptos
básicos y técnicos sobre células y tejidos, que adquieran una visión amplia de lo
que representa su empleo en la clínica humana, las bases de la medicina
regenerativa, y finalmente los aspectos legales que afectan al empleo de los
productos celulares como tratamientos en enfermedades humanas.
Los objetivos específicos para cada UD son:
UD1. Conceptos generales sobre CM.
-
Familiarizarse con los aspectos básicos y aplicados de los distintos
tipos de CM.
UD2. Terapias celulares consolidadas.
-
Conocer las principales formas de terapia celular que se aplican en
la clínica humana como tratamientos consolidados. En esta unidad
se
trataran
las
manipulaciones
de
célula
progenitoras
hemopoyéticas, el autoimplante de queratinocitos y regeneradores
dérmicos (Adela Miralles), el trasplante de islotes pancreáticos y el
autoimplante de condrocitos (Luciano Rodríguez).
UD3. Terapias celulares experimentales.
-
Familiarizarse con los aspectos básicos de las formas de terapia en
fase investigacional. Se abordará la terapia génica (Jordi
Barquinero), la inmunoterapia (Ramón Gimeno), diversos aspectos
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de la medicina regenerativa (Luciano Rodríguez) y la ingeniería
tisular (Jordi Cairó).
UD4. Banco de tejidos.
-
Adquisición de conocimientos sobre la donación y obtención de
tejidos, la selección de donantes y receptores, temas de
organización y logística (Flora Moya), y sobre implantes tisulares y
sus aplicaciones (Adela Miralles).
UD5. Banco de Sangre de Cordón Umbilical.
-
Familiarizarse con los aspectos técnicos y organizativos de un
banco público de SCU, el programa de donación y obtención, el
procesamiento, validación, almacenamiento, gestión de datos,
suministro y el propio trasplante (Marta Torrabadella).
UD6. Control de calidad y aspectos legales.
-
Conocer la legislación vigente que regula las actividades de los
Bancos de Tejidos y producción celular. Conocer las distintas
recomendaciones de actuación de sociedades científicas afines
(Adela Miralles).
3. Contenidos
UD1.
Células madre (5 horas).
Dr. Jordi Barquinero
Dr. Gregorio Martín
UD2.
Terapia celular. Terapias consolidadas (18 horas).
Obtención de progenitores hematopoyéticos. Manipulaciones ex vivo no
genéticas. Técnicas de criopreservación. Descongelación e infusión de
progenitores hematopoyéticos. Controles de calidad del procesamiento
celular (Gregorio Martín, 10 horas).
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Otros (Luciano Rodríguez, Adela Miralles y Marta Torrabadella, 8
horas):
Autoimplante de queratinocitos y regeneradores dérmicos
Trasplante de islotes pancreáticos
Autoimplante de condrocitos
UD3.
Terapias experimentales (Jordi Barquinero, Ramón Gimeno, Luciano
Rodríguez y Jordi Cairó, 13 horas)
Terapia génica
Inmunoterapia
Medicina Regenerativa
Ingeniería Tisular
UD4.
Banco de tejidos (Adela Miralles y Flora Moya, 13 horas)
Donación y obtención de tejidos. Selección de donantes y receptores:
organización y logística. Técnicas de procesamiento y criopreservación.
UD5.
Banco de sangre de cordón umbilical (Marta Torrabadella y Joan
García, 8 horas).
Programa de donación y obtención.
Procesamiento.
Evaluación y validación.
Almacenamiento.
Gestión de datos.
Suministro y trasplante.
UD6.
Legislación, acreditación y aseguramiento de la calidad (Gregorio
Martín, Adela Miralles, Marta Torrabadella y Flora Moya, 5 horas)
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4. Actividades
Se efectuará una actividad específica para cada unidad docente, que incluirán
discusiones de casos prácticos, debates, ejercicios, etc, que se irán programando
durante el desarrollo del módulo.
5. Evaluación
En cada unidad didáctica se incluirán ejercicios de autoevaluación. Al final del
módulo se realizará un examen tipo test de respuesta múltiple. En la evaluación
final también se tendrá presente la participación activa en el programa.
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Unidad didáctica 1:
Células madre
Dr. Jordi Barquinero
Dr. Gregorio Martín
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia
Celular.
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Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Células madre. Generalidades
4. Células madre embrionarias
5. Células madre adultas
5.1. Células progenitoras adultas multipotentes (Multipotent
Adult Progenitor Cells o MAPC)
5.2. Otras CM adultas
5.3. Transdiferenciación: una historia de verdades a medias
6. Células madre hematopoyéticas (CMH)
7. Células Madre Mesenquimales
7.1. Definición y nomenclatura.
7.2. Localización
7.3. Obtención
7.4. Unidades formadoras de colonia de fibroblastos (CFU-F)
7.5. Morfología y ciclo celular
7.6. Inmunofenotipo
7.7. Expansión
7.8. Diferenciación
7.9. MSC y sistema inmune
7.10. Comentarios finales sobre las CMM
8. Bibliografía
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1. Introducción
Aunque el concepto teórico de células madre (CM) o troncales es muy antiguo,
y algunas de ellas se vienen utilizando terapéuticamente desde hace décadas (p.ej.
el trasplante de médula ósea o de progenitores hematopoyéticos), en los últimos
10 años se ha producido una auténtica avalancha de nuevos conocimientos,
entre los que destaca la derivación y el cultivo de las células embrionarias
humanas, la definición de condiciones que permitan su proliferación in vitro
prácticamente indefinida, y su diferenciación en distintos linajes, así como el
descubrimiento y caracterización de CM en los tejidos adultos, habiéndose
llegado en algunos casos a la aparición de novedosas aplicaciones terapéuticas
de dichas células. En esta unidad didáctica no se ha pretendido hacer un tratado
exhaustivo sobre CM, sino plasmar unas pocas nociones, las que hemos creído
más relevantes teniendo siempre en cuenta la aplicabilidad práctica del uso de
las CM en medicina.
2. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería de ser capaz de:
-
Conocer los aspectos básicos de las CM, diferenciar los distintos tipos
de CM, tanto embrionarias como adultas, y tener nociones de las
principales aplicaciones derivadas del empleo de las CM en la clínica
humana, así como de las perspectivas futuras de la investigación con
dichas células.
-
Estar familiarizado con los aspectos básicos y aplicados de los distintos
tipos de CM.
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3. Células madre. Generalidades
Aunque por el momento la investigación en células madre (CM) no es más que
una puerta que se está abriendo y que podría conducir a la curación de algunas
enfermedades, lo cierto es que las primeras incursiones en el tema están
planteando muchas más preguntas que respuestas, y han creado una agria
polémica entre partidarios de permitir la investigación y el uso terapéutico de
células procedentes de embriones humanos y los de vetarlas, que a su vez
priorizan que se investigue en células de origen somático (adulto).
En su definición clásica, CM serían aquéllas que tienen el potencial para generar
células maduras de distintos linajes a la vez que se autorrenuevan. En la práctica,
las CM se definen por su capacidad de repoblación in vivo, y éste es el principal
criterio para demostrar experimentalmente su presencia y funcionalidad.
Hasta la fecha se han descrito varios tipos de CM, en función de su origen
(embrionario o adulto), de su grado de diferenciación (potencialidad,
plasticidad), o del tejido en que se encuentran (CM neurales, CM cutáneas, etc.).
La ontogenia o desarrollo embrionario a partir de una sola célula es la prueba
más definitiva del potencial de las CM embrionarias. De hecho, las CM
embrionarias se consideran totipotentes pues cada una de ellas es capaz de
generar los aproximadamente 200 tipos de tejido de un humano además de los
tejidos extraembrionarios. Las CM serían pluripotentes si pueden generar
cualquier estirpe celular del embrión pero no los tejidos extraembrionarios;
multipotentes si sólo pueden dar lugar a un subconjunto de tipos celulares,
oligopotentes cuando este subconjunto es más reducido (estas definiciones son
un tanto arbitrarias), o unipotentes si sólo pueden generar un tipo celular.
Una simplificación del concepto de CM sería el término de progenitor o célula
progenitora, que se refiere exclusivamente a una célula capaz de generar otras
más diferenciadas. En función de su procedencia, de embriones o de tejidos
diferenciados, podemos establecer una primera clasificación de éstas en CM
embrionarias y CM adultas. Se puede ampliar la información sobre el tema en:
http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula_madre
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4. Células madre embrionarias
Las células de la masa interna del blastocisto de un embrión humano de 5 a 7
días se denominan células ES (embryonic stem cells), y a ellas nos referimos cuando
hablamos de CM embrionarias. En este período, el embrión todavía no ha
formado las tres capas embrionarias (ectodermo, mesodermo y endodermo) y
dichas células conservan su totipotencialidad. Las células ES de ratón se han
venido cultivando con éxito desde hace 20 años, pero las condiciones para
cultivar las humanas se describieron en 1998. Las células ES murinas pueden
proliferar indefinidamente manteniendo su estado indiferenciado en medios
definidos que contengan el factor de crecimiento LIF (leukemia inhibitory factor) u
otros factores. Si se modifican las condiciones de cultivo, p. ej. retirando el LIF
o añadiendo determinados factores de crecimiento, estas células toman
decisiones y sufren procesos de diferenciación, habiéndose descrito la
generación de linajes celulares de cualquiera de las tres capas embrionarias.
Figura 1
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Módulo 2
Sobre el papel, la posibilidad de disponer de cantidades virtualmente ilimitadas
de estas células, expandidas en cultivo, y de diferenciarlas a voluntad mediante
factores de crecimiento en hepatocitos, neuronas, cardiomiocitos o células beta
productoras de insulina, además de resolver de un plumazo la escasez de
donantes, podría convertirse en una herramienta para tratar dolencias tan
prevalentes como la insuficiencia hepática, la enfermedad de Parkinson o la
diabetes. Sin embargo, a pesar de que los medios de comunicación nos
prometen a corto plazo éstas y otras muchas maravillas, los científicos y los
estudiosos del tema no son tan optimistas.
Sin entrar en el terreno de la ética, y de si está o no justificado el empleo
embriones humanos con finalidades terapéuticas, el uso clínico de CM
embrionarias debe antes resolver dos graves inconvenientes o limitaciones
todavía no resueltas. El primero es la capacidad tumorigénica de las CM no
diferenciadas (pueden formar teratomas) cuando se implantan en individuos
adultos. Por ello es imprescindible que absolutamente todas las células que se
vayan a trasplantar estén correctamente diferenciadas.
El otro gran inconveniente es que, al no tener nadie sus propias células
embrionarias disponibles para su uso terapéutico, hay que recurrir a células de
otros embriones, por tanto no histocompatibles, con todas las limitaciones de
los trasplantes de órganos (necesidad de inmunosupresión, etc). Una posible vía
para resolver esta limitación es la clonación terapéutica, que consistiría en
transferir el núcleo de una célula somática del propio individuo a un oocito de
una donante (transferencia nuclear) para dar lugar a un embrión genéticamente
similar al donante del núcleo, y cuyas células podrían expandirse en cultivo para
luego diferenciarlas hacia el linaje deseado. Este procedimiento es análogo a la
clonación reproductiva, la diferencia es que en esta última el oocito sería
transferido al útero para dar lugar a un individuo completo.
Este procedimiento es tremendamente ineficiente y mal conocido. De hecho, en
las pocas especies en que se ha logrado, los individuos obtenidos de esta manera
en su inmensa mayoría fallecen intraútero, y los escasos que no lo hacen
padecen casi indefectiblemente el denominado large offspring syndrome (LOS),
caracterizado por el tamaño anormalmente grande de las placentas y los fetos
(macrosomía). Además, los ratones generados mediante clonación reproductiva
tienden a la obesidad, tienen más incidencia de tumores y de muerte prematura.
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Módulo 2
Estas alteraciones son debidas, no a mutaciones genéticas, sino a fallos en la
reprogramación epigenética de los núcleos transferidos a los oocitos (1).
No hay que olvidar que los genes únicamente contienen las instrucciones
codificadas, pero para decidir qué genes se expresan o dejan de hacerlo en cada
célula y en qué momento, también son importantes las influencias externas del
microambiente, así como otros factores llamados epigenéticos, como pueden
ser el estado de metilación del propio DNA, o el grado de acetilación de las
histonas. Esta inestabilidad epigenética no sólo afectaría a los individuos
clonados, sino también a las células ES cultivadas y a su progenie generada in
vitro. Además, desde el punto de vista de la histocompatibilidad, se ha descrito
que ciertos polimorfismos en los genes mitocondriales, que seguirían siendo de
la donante del oocito (ya que sólo se ha transferido el núcleo celular), podrían
resultar en diferencias antigénicas capaces de inducir respuestas inmunes en los
receptores.
En este momento la investigación con células embrionarias es motivo de
controversia y de un intenso debate social e institucional a nivel mundial, con
sus defensores y sus detractores, que aducen razones de tipo ético y/o religioso
para que se prohíba el uso de embriones humanos para este tipo de aplicaciones.
Por el momento, varios países como Gran Bretaña, Suecia, Bélgica, Corea del
Sur o España han aprobado leyes favorables al uso investigacional de las CM
embrionarias, mientras que otros como Estados Unidos mantienen el veto legal
a dicho uso. En general, existe unanimidad en que no se permita la clonación
reproductiva, pero el debate se centra en si se permite o no la clonación
terapéutica, o que se investigue con los embriones criopreservados “sobrantes”
de los bancos de embriones y que ya no van a ser implantados. Con todo, es de
esperar que a corto o a medio plazo se legalice su uso investigacional en un
número creciente de países y que, una vez resueltos los problemas técnicos
actuales, se diseñen y se lleven a cabo ensayos clínicos basados en el uso
racional de estas células.
En cuanto a la disyuntiva entre CM embrionarias y CM adultas para su empleo
en medicina regenerativa, no se corresponde con ninguna realidad científica. Es
cierto que en este momento se desconoce cual de los dos tipos de CM tendrá
mayor aplicabilidad terapéutica. Ambas tendrán que demostrar sus ventajas y
sus inconvenientes, y lo más probable es que unas terminen resultando óptimas
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para unas aplicaciones y otras para otras. Para los detractores del uso de las CM
embrionarias, la raíz del problema radica en el origen de éstas. En este momento
ya existen muchas líneas celulares derivadas de embriones humanos. La opinión
mayoritaria y el sentido común nos dice que deben investigarse ambas vías,
superando cualquier prejuicio ya que, en ciencia, el único avance posible es el
que deriva del conocimiento contrastado. No hay que olvidar que, a pesar de los
fascinantes avances en el conocimiento de las CM y de la terapia génica, su
aplicabilidad clínica es todavía muy limitada. El potencial existe sobre el papel,
pero hay que investigar mucho más y no sobrevalorar las hipotéticas ventajas de
su uso terapéutico. Es tanto lo que falta por conocer sobre estas células que no
podemos permitirnos el lujo de cerrarnos puertas que se están empezando a
abrir, sin antes saber lo que esconden y lo que nos pueden aportar.
Tabla 1: Principales diferencias entre células madre embrionarias y adultas
CM embrionarias
CM adultas
Embriones humanos
(éticamente
controvertido)
Adultos (sin
problemas éticos)
Cultivables in vitro
Sí
Sí
Pluripotenciales in vitro
Sí
Sí
Pluripotenciales in vivo
(inyección en blastocisto)
Sí
Sí
Tumorigénicas en adultos
Potencialmente sí
No
Sí
No
Sí (alogénicas)
No (autólogas)
Origen
Potencial terapéutico
demostrado
Inmunogenicidad
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5. Células madre adultas
En la mayoría de órganos y tejidos de los individuos adultos se han descrito,
con mayor o menor detalle, distintos tipos de CM. Aunque se sabía de la
existencia de CM en los tejidos sujetos a autorenovación (como la piel o el tubo
digestivo), las dificultades en su estudio se deben en parte a su extrema rareza, a
la imposibilidad de distinguirlas morfológicamente de sus homólogas maduras y
a los problemas técnicos para cultivarlas ex vivo o trasplantarlas. En la regulación
de las CM juega un papel crucial el microambiente en que se encuentra, el lugar
anatómico conocido como nicho (2).
Las primeras CM adultas que se conocieron con detalle fueron las
hematopoyéticas (CMH), pero a éstas dedicaremos el siguiente capítulo.
Respecto a las no hematopoyéticas, las primeras que se identificaron y
caracterizaron con cierto detalle fueron las neurales, hace más de 10 años. Así,
se comprobó que el cerebro adulto, un órgano que hasta entonces se había
considerado incapaz de regenerarse, contenía unos progenitores sumamente
versátiles capaces de convertirse en neuronas, oligodendrocitos o astrocitos. Se
les denominó CM neurales (NSC o neural stem cells), hoy consideradas una de las
herramientas más prometedoras para tratar diversas enfermedades neurológicas.
Las CM neurales pueden ser transducidas de forma estable con genes
terapéuticos y reimplantadas en el sistema nervioso central (SNC). Se ha
comprobado que tras el implante pueden migrar a puntos lejanos del SNC y
diferenciarse a varios de los linajes propios del SNC. Otra fuente de
progenitores neurales es la llamada glía envolvente de bulbo olfatorio, que ya ha
demostrado tener potencial terapéutico. Con todo, por el momento los niveles
de regeneración que se observan con el uso de CM neurales en la mayoría de
modelos estudiados todavía distan mucho de tener utilidad terapéutica en la
clínica humana.
5.1.
Células progenitoras adultas multipotentes (Multipotent Adult
Progenitor Cells o MAPC)
En el año 2001 se describió la presencia en la médula ósea humana y murina de
un nuevo tipo de células pluripotenciales, que se denominaron células
progenitoras adultas multipotentes (Multipotent Adult Progenitor Cells o MAPC), y
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que poseían algunas semejanzas con las CM embrionarias. Se hallan en una
frecuencia aproximada de 1 entre 108 células (100 veces menor que las CMH) y
tienen un fenotipo CD45-, CD44-, HLA de clase I- y II-, y c-kit-. Pueden ser
cultivadas y expandidas in vitro durante decenas de pases sin aparentes cambios
morfológicos, fenotípicos ni funcionales detectables y, tras cambiar las
condiciones de cultivo añadiendo determinados factores de crecimiento, se
diferencian a linajes tan diversos como el hepático, el neuronal o el
mesenquimal (3).
Se ha comprobado que, tras la inyección de MAPC de ratón marcadas
genéticamente en el blastocisto, una vez desarrollado el animal, las células
marcadas habían contribuido a formar distintas clases de tejidos, incluyendo
células sanguíneas, sistema nervioso, hígado, músculo y pulmón. Además,
MAPC inyectadas en ratones inmunodeficientes adultos (NOD/scid) generaron
quimerismo hematopoyético en múltiples órganos y tejidos.
5.2
Otras CM adultas
Además de las MAPC, en la médula ósea existen al menos otras dos poblaciones
de CM distintas de las hematopoyéticas: las mesenquimales y las endoteliales.
Las primeras se han considerado tradicionalmente células estromales,
meramente de soporte, un concepto muy impreciso. De ellas se hablará con
mucho más detalle en otro capítulo de este mismo módulo. En cuanto a las CM
endoteliales, tienen un fenotipo CD133+, Flk-1+, y muchas son también
CD34+, marcador que comparten con las CMH. Las CM endoteliales pueden
circular por el torrente sanguíneo para convertirse en células endoteliales
maduras donde y cuando hay necesidad de formar nuevos vasos.
El tejido muscular también contiene distintos tipos de células progenitoras. Las
mejor conocidas son las células satélite o mioblastos, que pueden ser expandidas
en cultivo y trasplantadas para generar células musculares maduras. También se
han descrito poblaciones muy minoritarias de células SP, que expresarían CD45
y tendrían potencial hematopoyético y miogénico.
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Módulo 2
Otros tejidos en los que se han identificado CM son el hígado, la piel, el
páncreas, la próstata, el riñón, el intestino o el tejido adiposo subcutáneo, entre
otros.
5.3
Transdiferenciación: una historia de verdades a medias
Tradicionalmente se ha aceptado como un dogma que muchos órganos y tejidos
adultos sujetos a renovación celular contienen una reserva local de CM, pero
que éstas poseen un cierto grado de diferenciación, estando comprometidas a
convertirse exclusivamente en células maduras propias del tejido u órgano en
cuestión. Así, las CM de la piel sólo podían dar lugar a piel, las de médula ósea
generaban células sanguíneas, y las del hígado sólo se convertirían en
hepatocitos.
La transdiferenciación es el fenómeno por el que CM de un tejido adulto,
teóricamente comprometidas para convertirse en células maduras de aquél
tejido, se convierten en células maduras de un tejido distinto.
La misma palabra indica una transgresión del dogma sobre la irreversibilidad de
la diferenciación celular. Hasta 1997 la frontera entre las tres capas embrionarias
se consideraba infranqueable, pero a partir de esa fecha comienzan a aparecer
observaciones que sugerían que células de médula ósea podían generar o
regenerar tejidos no hematopoyéticos como el miocárdico, el hepático, el
cerebral o el óseo.
La médula ósea y el SNC contienen las CM que más plasticidad han demostrado
experimentalmente. De hecho, para algunos investigadores la médula ósea
podría actuar como un reservorio de CM pluripotenciales que en caso de
necesidad podrían migrar y transformarse en CM propias de otros tejidos, o
bien directamente en células maduras.
En este sentido, recientemente se ha comprobado que al menos una fracción de
las células ovales del hígado y de las células satélite del músculo expresan CD45
lo que muy probablemente indica un origen hematopoyético, una afirmación en
concordancia con el hecho que las evidencias de transdiferenciación mejor
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Módulo 2
contrastadas son las observadas entre la médula ósea, el hígado y el músculo
esquelético (ver figura 2).
Figura 2
Con todo, en estos últimos tiempos, se han publicado numerosos estudios
documentando o desmintiendo conversiones de unos tipos celulares a otros.
Para explicar la aparente transdiferenciación observada en estos estudios se han
postulado al menos tres mecanismos. El primero sería la presencia en los
injertos (p. ej. de médula ósea) de progenitores más inmaduros, con
potencialidad para generar tipos celulares distintos (p. ej. los llamados
hemangioblastos, progenitores comunes hematopoyéticos y endoteliales).
Alternativamente, podría ser que las poblaciones de CM con las que se trabaja
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Módulo 2
experimentalmente (p. ej. de médula ósea) sean en realidad mezclas
heterogéneas y contengan distintos tipos de CM. (p. ej. hematopoyéticas,
mesenquimales y endoteliales) (4).
En este sentido, muchos de los primeros estudios publicados fueron realizados
trasplantando médula ósea total, y hoy se sabe que ésta contiene CM de estos
tres tipos, por lo que no se puede descartar que la aparente transdiferenciación
tras el trasplante de médula ósea total sea debida en realidad a la diferenciación
de estas otras CM o de CM más inmaduras (precursoras comunes).
Otro posible mecanismo es que la aparente transdiferenciación sea en realidad
consecuencia de la fusión entre CM y células maduras de otra estirpe distinta.
Dicha fusión generaría una célula con dos o más núcleos (heterocarión) que
poseería marcadores fenotípicos de ambos tipos celulares (5). Se ha descrito que
la aparente transdiferenciación de células de médula ósea a hígado o a miocardio
podría deberse fundamentalmente a fenómenos de fusión celular (ver figura 3).
Figura 3
Para reducir la posibilidad que sean otras CM no hematopoyéticas las
responsables de esta aparente transdiferenciación muchos grupos han realizado
estudios trasplantando CMH más o menos purificadas (basándose en el
aislamiento de células con fenotipo más o menos inmaduro), en general con
resultados superponibles a los obtenidos con médula ósea total. Dado que en la
separación celular nunca se puede garantizar una pureza del 100%, nos
quedarnos con la misma duda, que otras CM contaminantes puedan ser
responsables de la aparente transdiferenciación observada.
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Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
A la vista de todo lo dicho, en este momento los nuevos conocimientos obligan,
si no a reconsiderar la validez de los resultados publicados hasta ahora, cuanto
menos a juzgar con mucha más cautela todo lo que se diga al respecto,
especialmente en foros o fuentes no científicas como son los medios de
comunicación, y sin que ello implique que las CM hayan perdido potencial o
futuro alguno para la terapia celular o la medicina regenerativa (6).
6. Células madre hematopoyéticas (CMH)
El trasplante hematopoyético ha constituido durante casi medio siglo la prueba
más palpable de la existencia de CMH adultas. De hecho, hasta hace poco más
de una década, hablar de CM adultas era referirse casi inequívocamente a la
médula ósea o a las CMH, ya que fueron éstas las primeras en conocerse con
cierto detalle y en ser aplicadas al tratamiento de enfermedades humanas
(trasplante de médula ósea).
Las CMH se encuentran en la médula ósea adulta en una frecuencia aproximada
de 1 entre 105-106 células, expresan el marcador panleucocitario CD45 y
tradicionalmente también se han considerado positivas para el marcador CD34,
presente en el 1% de las células de la médula ósea, mientras que serían negativas
o de baja expresión para CD38, para el receptor del factor de células madre
(CD117 o c-kit), así como para todos los marcadores propios de los distintos
linajes hematopoyéticos (Lin-) (ver tabla 2).
En el ratón, quizás la especie en que están mejor caracterizadas, las CMH tienen
un fenotipo CD45+, CD34-, Lin-, Sca-1+ y c-kit+. Al ser el hematopoyético un
tejido líquido trasplantable que se puede cultivar y manipular ex vivo, las CMH se
han convertido en una herramienta insustituible para numerosas formas de
terapia celular, además del trasplante hematopoyético (p. ej. para la generación
de células dendríticas en protocolos de inmunoterapia), así como en una de las
dianas preferidas para la terapia génica.
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Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Tabla 2
6.1
Células SP
Las células SP (Side Population) constituyen una rara subpoblación celular (en la
médula ósea humana normal representa menos del 0.1 % del total de las células
nucleadas). Inicialmente descrita en 1996 por el grupo de M. Goodell, se
definen por su capacidad para extruir el colorante vital Hoechst 33342 (Ho342)
(7).
Este fluorocromo es un agente intercalante del DNA que se excita óptimamente
con radiación ultravioleta y tiene una emisión dual en el azul y en el rojo. Puede
difundir pasivamente a través de la membrana celular, por lo que las células que
lo
extruyen
(expulsan
al
exterior)
acumulan
menos
fluorocromo
intracelularmente y emiten con una menor intensidad en ambos canales (azul y
rojo) tras ser excitadas con luz ultravioleta, dando lugar a una población con una
distribución característica en los histogramas de citometría de flujo (ver figura 4).
15
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 4
Esta población está enriquecida unas 1000 veces en capacidad de repoblación
hematopoyética respecto a la médula ósea total, aunque no todas las células SP
de la médula ósea son progenitores hematopoyéticos, pues también se ha
descrito que algunas células NK o de la serie roja pueden también tener un
fenotipo SP. Se han encontrado células SP en prácticamente todos los tejidos y
en todas las especies de mamíferos estudiadas.
Aunque el Ho342 puede ser extruido por distintos transportadores de
membrana, en la población SP de la médula ósea, la capacidad de extrusión se
describió mayoritariamente asociada al transportador ABCG2 (o bcrp), una
molécula que extruye distintos tipos de genotóxicos al exterior de las células y
que también se expresa en otros tejidos como la placenta, el intestino o la vía
biliar, en general lugares donde se acumulan o sufren una mayor exposición a
toxinas de manera natural (vía biliar) o que requieren una especial protección
(placenta, médula ósea).
En este momento se sabe que ni todas las CM de la médula ósea tienen el
fenotipo SP ni todas las células SP son CM, si bien se desconoce si las células
SP presentes fuera de la médula son en realidad progenitores inmaduros
equivalentes a los medulares.
16
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
7. Células Madre Mesenquimales
7.1
Definición y nomenclatura
Las Células Madre Mesenquimales (MSC) han despertado un gran interés en los
últimos años en la comunidad científica debido a sus potenciales aplicaciones
terapéuticas (8). Sin embargo, distintos autores han empleado diferentes
criterios para definirlas, sin que exista una definición aceptada por todos. Esto
hace que dichas células pueden encontrarse en la literatura con diferentes
nombres: Célula Madre Mesenquimal (MSC): Célula Progenitora Mesenquimal
(MPC), Célula del Estroma Medular (MSC), Unidad Formadora de Colonias de
Fibroblastos (CFU-F),
Fibroblastos de Médula Ósea.o Célula Madre No
Hematopoyética.
Recientemente, un comité de la Sociedad Internacional de Terapia Celular
(ISCT) haya establecido unos criterios mínimos que dichas células deben
cumplir para ser catalogadas como tales.
1.- las MSC deben ser adherentes al plástico cuando se mantienen en
condiciones de cultivo estándar.
2.- las MSC deben expresar los antígenos de membrana (en más del 95% de la
población celular) CD105, CD73, CD90 y no deben expresar en su superficie
(en menos del 2% de la población celular) CD45 (marcador panleucocitario),
CD34 (marcador de células progenitoras hematopoyéticas y endoteliales), CD14
o CD11b (expresado por monocitos y macrófagos), CD79-α o CD19
(marcadores de linfocitos B) y HLA-DR.
3.- las MSC deben poder diferenciarse in vitro a células del tejido óseo
(osteoblastos), adiposo (adipocitos) y cartilaginoso (condroblastos).
7.2
Localización
Las MSC se localizan en diversos tejidos, siendo su frecuencia mayor en médula
ósea (1 por cada 105 células mononucleadas). También se han descrito en la
circulación durante la vida fetal, en la sangre placentaria y en la sangre periférica
17
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
post-natal, aunque su frecuencia en estas localizaciones va disminuyendo desde
la vida fetal a la adulta. También se han localizado en otros tejidos, como el
tejido adiposo, una fuente rica en MSC.
7.3
Obtención
Las MSC pueden, por tanto, obtenerse de distintas fuentes, aunque los tejidos
más empleados para su obtención son la médula ósea y el tejido adiposo. La
obtención de médula ósea implica la realización de aspirados, generalmente de
las crestas ilíacas, el enriquecimiento de la capa de células mononucleadas
(generalmente en gradiente de densidad) y las del tejido adiposo se obtienen tras
liposucción y centrifugación para eliminar los adipocitos del sobrenadante.
Posteriormente las células son sembradas en placas de cultivo (generalmente a
baja densidad) en medio de cultivo apropiado. Tras unos días, las MSC se
adhieren al plástico y son separadas de forma fácil del resto de las células no
adherentes mediante lavados repetidos. Dichas células están enriquecidas en
MSC y, como se ha comentado, esta adherencia es una característica esencial
para definir a las MSC como tales.
7.4
Unidades formadoras de colonia de fibroblastos (CFU-F)
Cuando las células fuente de MSC se cultivan bajo condiciones apropiadas, se
forman diferentes agrupaciones de células (colonias), cada una de las cuales
deriva de un solo precursor, llamado CFU-F. Las CFU-F representa el ensayo in
vitro para cuantificar la cantidad de MSC obtenidas, si bien no todas las células
clonogénicas son verdaderas MSC.
7.5
Morfología y ciclo celular
La mayoría de las MSC obtenidas tras cultivo tienen una morfología similar a los
fibroblastos, son alargadas, espiculadas. La mayor parte de las MSC se
encuentran en fase G0/G1 del ciclo celular (más del 50%), un 10% aprox. en
18
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
fase G2/M existiendo un subtipo en fase G0, lo que sugiere que dentro del
cultivo de MSC existen células con diferente grado de inmadurez.
7.6
Inmunofenotipo
En la actualidad no existe ningún marcador de membrana que pueda hacer que
las MSC sean aisladas de forma prospectiva. Por tanto, las características a las
que nos referimos de las MSC son las de las células obtenidas tras un cultivo “in
vitro.
Además de los antígenos de membrana antes mencionados y que se emplean
para catalogar a las MSC como tales, dichas células también son positivas para
los marcadores de membrana CD133, CD10 y HLA de clase I.
Otros marcadores negativos en las MSC son las moléculas CD40 y CD40L,
CD80 y CD86, moléculas coestimulatorias que intervienen en el reconocimiento
inmune y la activación de las células T.
7.7
Expansión
Tras la obtención de las MSC, el cultivo primario puede dividirse (tras
“despegar” las células de las placas de cultivo mediante tripsina) y resembrarse
en placas adicionales (subcultivos). Esto puede hacerse repetidas veces (“pases”),
hasta llegar a obtener una gran cantidad de MSC. Esto es, la capacidad de
expansión es enorme y con pocos mL de aspirado de médula ósea se pueden
llegar a obtener decenas de millones de MSC tras varios pases de cultivo.
Además, y lo que es importante, mientras están en expansión, dichas células no
parecen perder su capacidad de autorenovación, la potencialidad de
diferenciarse en diferentes tejidos, su fenotipo, la estabilidad genética y además
sus cromosomas mantienen la longitud de sus telómeros (un signo de
inmadurez celular).
19
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
7.8
Diferenciación
Como se ha mencionado, bajo determinadas condiciones de cultivo las MSC
pueden diferenciarse in vitro a diferentes linajes, como adipocitos, condrocitos y
osteoblastos (son por tanto células madre multipotentes). Además, también se
ha descrito su capacidad de diferenciación a estroma de la médula ósea y a
músculo esquelético y cardíaco.
La jerarquía de diferenciación de las MSC hasta su progenie de células maduras
y diferenciadas fue propuesta por Caplan quien lo denominó “proceso
mesengénico” y es similar a la del tejido linfo-hematopoyético, de tal forma que
desde las MSC más inmaduras, las células se van diferenciando hacia células de
un tejido particular hasta dar lugar a la célula madura (ver figura 5), ya sin
capacidad de autorenovación.
Figura 5
7.9
MSC y sistema inmune
Otro aspecto interesante de las MSC es su capacidad antiinflamatoria e
inmunomoduladora. Se ha descrito que estas células escapan al reconocimiento
inmune e inhiben la respuesta inmune. Las MSC pueden modular las
poblaciones mayores del sistema inmune, como son las células presentadoras de
antígeno (APCs), los linfocitos T y B y las células NK (natural killer). El hecho
de que sean poco inmunogénicas y a su efecto inmunosupresor ha hecho que
20
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
sean catalogadas como células inmunoprivilegiadas. Si estos datos se confirman,
significa que dichas células podrían emplearse a partir de donantes no
histocompatibles con el receptor.
7.10
Comentarios finales sobre las CMM
En resumen, debido a su fácil obtención, a que pueden obtenerse de diferentes
tejidos, a su importante potencial de expansión in vitro, a su capacidad de
diferenciarse a distintos linajes mesenquimales y a sus propiedades
inmunológicas, las MSC han despertado un gran interés, por todas las
aplicaciones clínicas potenciales que pueden tener. Estas aplicaciones van desde
la reparación/regeneración de diferentes tejidos dañados (óseo, cartilaginoso,
cardíaco, muscular, estroma médula ósea, cierre de fístulas anorectales en la
enfermedad de Crohn, etc), como su aplicación en el trasplante hematopoyético,
bien para acelerar el implante de los progenitores hematopoyéticos como para
tratar o prevenir la enfermedad injerto contra el huésped en el contexto del
trasplante alogénico.
21
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
8. Bibliografía
1. Allegrucci, C., Thurston, A., Lucas, E., and Young, L. 2005. Epigenetics
and the germline. Reproduction 129:137-149.
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neighbors: stem cells and their niche. Cell 116:769-778.
3. Jiang, Y., Jahagirdar, B.N., Reinhardt, R.L., Schwartz, R.E., Keene,
C.D., Ortiz-Gonzalez, X.R., Reyes, M., Lenvik, T., Lund, T., Blackstad,
M., et al. 2002. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from
adult marrow. Nature 418:41-49.
4. Kucia, M., Ratajczak, J., and Ratajczak, M.Z. 2005. Are bone marrow
stem cells plastic or heterogenous--that is the question. Exp Hematol
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Stem cell plasticity: the debate begins to clarify. Stem Cell Rev 1:37-43.
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cells that are replicating in vivo. J Exp Med 183:1797-1806.
8. Keating, A. 2006. Mesenchymal stromal cells. Curr Opin Hematol 13:419425.
22
Unidad didáctica 2:
Autoimplante de
condrocitos
Dr. Luciano Rodríguez
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia Celular
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Tipos de cartílago
3.1
Cartílago hialino
3.2
Cartílago elástico
3.3
Fibrocartílago
4. Estructura del cartílago articular
5. Biomecánica del cartílago articular
6. Implante autólogo de condrocitos (ACI):
6.1
Evolución histórica
6.2
La técnica quirúrgica
6.3
El cultivo ex vivo de condrocitos
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Introducción
El cartílago es un tejido conectivo denso y especializado que forma el esqueleto
transitorio en el embrión y persiste en el adulto en articulaciones, tracto
respiratorio, costillas y orejas. Casi todos los huesos largos del cuerpo se forman
primero en el embrión como cartílago que actúa de plantilla reemplazada
posteriormente por hueso (osificación). En el sujeto adulto hay distintos tipos
de cartílago que se diferencian en su composición bioquímica, su
microestructura molecular, sus propiedades biomecánicas y sus funciones. Así
se distinguen: cartílago hialino, elástico y fibrocartílago.
1. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería:
-
Conocer las bases teóricas de la regeneración de cartílago hialino
mediante el implante de condrocitos autólogos
-
Comprender las limitaciones y requerimientos de esta tipo de terapia
celular.
3
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
2. Tipos de cartílago
3.1
Cartílago hialino
Se encuentra cubriendo las superficies articulares de la mayor parte de las
articulaciones y en los cartílagos costales, los nasales y las paredes de las vías
respiratorias. La palabra hialino se deriva del griego hyalos (vidrio). El cartílago
hialino aparece como una masa translucida color blanco azuloso en estado
natural. Con excepción de los cartílagos articulares, este tejido siempre esta
cubierto por pericondrio. El pericondrio es una capa resistente de tejido
conectivo denso que envuelve al cartílago, excepto el de la superficie articular.
Figura 1
Figura 2
Imágenes
disponibles
en
línia:
http://meded.ucsd.edu/hist-img-
bank/chapter_2/Slide_13_hyaline/
4
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3.2
Cartílago elástico
Este es semejante al cartílago hialino, excepto que tiene abundantes fibras
elásticas en su matriz, además de muchas fibras colágenas delgadas. También
esta rodeado por un pericondrio. Este tipo de cartílago se encuentra en los
lugares en que se necesita sostén con flexibilidad, como el oído externo, trompa
faringotimpanica, epiglotis y algunos cartílagos de la laringe.
Figura 3
Figura 4
Imágenes
disponibles
en
línia:
http://meded.ucsd.edu/hist-img-
bank/chapter_2/Slide_14_elastic/
5
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3.3
Fibrocartílago
Este tipo de cartílago se presenta donde se necesita apoyo firme; se encuentra
en los discos intervertebrales. Es el cartílago que rodea la fosa glenoidea del
hombro y del acetábulo de la cadera y esta también en los discos interarticulares
de las articulaciones esternoclavicular, acromioclavicular y temporomaxilar, así
como en la sínfisis púbica. Nunca se presenta solo, sino que se fusiona
gradualmente con el cartílago hialino vecino o con el tejido fibroso denso. El
fibrocartílago es un tipo transicional entre el cartílago hialino y el tejido
conectivo fibroso denso de tendones y ligamentos, sus células tienden a
agruparse en cápsulas separadas unas de otras por gruesos haces de fibras
colágenas.
Figura 5
Figura 6
Imágenes
disponibles
en
línia:
http://meded.ucsd.edu/hist-img-
bank/chapter_2/Slide_15_fibrous/
6
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
El cartílago hialino es el más abundante de la anatomía. Recubre la superficie
articular de los huesos, es flexible, elástico, de color blanco nacarado y
opalescente. Su grosor varía según la función y el área de cada articulación e
incluso en las distintas áreas de una misma articulación. En la rodilla su espesor
oscila entre 2 y 3 milímetros y, en condiciones normales, permanece constante
hasta la aparición de los fenómenos de fibrilación y erosión que conducen a la
degeneración artrósica.
La sustancia del cartílago no esta vascularizada y no está conectada a nervios o
vasos linfáticos; reciben su nutrición de vasos sanguíneos de tejidos conectivos
circundantes mediante difusión a través de la matriz, constituida por una
abundante matriz extracelular y un número relativamente bajo de células, los
condrocitos. Los condorcitos ocupan aproximadamente un 10% del volumen
tisular normal y se sitúan en pequeñas cavidades llamadas lagunas dentro de la
matriz. Son células de origen mesenquimal, metabólicamente muy activas y son
responsables de la formación, mantenimiento y reparación de la matriz
extracelular en la que se encuentran inmersos. La matriz cartilaginosa contiene
agua (70%), colágeno (20%) (en su mayoría tipo II (95%), trazas de tipo IX y XI
y no contiene colágeno tipo I), proteoglicanos (4-10%), lípidos, componentes
inorgánicos, elastinas, integrinas (organización de la matriz).
Figura 7
7
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3. Estructura del cartílago articular
Estructuralmente, el cartílago articular (hialino) está dividido en cuatro capas o
zonas morfológicamente distintas:
I. una zona superficial, con condrocitos aplanados, en forma de huso, y una
matriz con una proporción relativamente alta de colágeno y agua;
II. una zona de transición, con condrocitos esféricos, de pequeño tamaño y
una matriz con un mayor contenido en proteoglicanos y un menor
porcentaje en agua y colágeno;
III. una zona radial, que ocupa hasta un 95% del volumen del cartílago
articular, con condrocitos de mayor tamaño, más redondeados,
metabólicamente muy activos que, a menudo, se disponen en grupos de
células autónomos (condronas).
IV. una zona calcificada adyacente al hueso, en la que se produce el anclaje
del cartílago al hueso subcondral.
Figura 8
8
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
4. Biomecánica del cartílago articular
Biomecánicamente, en las articulaciones los segmentos óseos proporcionan la
rigidez necesaria para la locomoción mientras que el cartílago es el encargado de
amortiguar el impacto de las fuerzas. El hueso es unas mil veces más resistente
que el cartílago, aunque con deformaciones muy pequeñas, inferiores al 1%, ya
puede fracturarse, sin embargo, el cartílago puede soportar deformaciones del
50% o superiores sin aparentes fracturas microscópicas. En general, la rigidez y
resistencia del cartílago se relacionan principalmente con el contenido en
colágeno y la orientación de las fibras mientras que las propiedades de
compresión se relacionan con el contenido en proteoglicanos. Sin duda, las
relaciones entre la estructura y la función del cartílago articular dependen de la
interrelación de los condrocitos y la matriz extracelular (los condrocitos regulan
la síntesis y degradación (turnover) de la matriz).
Figura 9
Figura 10
9
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Las funciones mecánicas del cartílago hialino incluyen la transmisión y
distribución de carga (determinada por su capacidad de deformación), suavizar
el movimiento de la articulación y lubricar mediante la absorción o exudación de
fluido hacia el tejido intersticial.
Las moléculas de protoglicanos están muy cargadas negativamente y atraen
moléculas de agua hacia el tejido hialino creando una fuerte presión de
absorción hasta que satura la capacidad elástica del colágeno en el tejido. En
cuanto el cartílago recibe una fuerte presión de forma súbita, la expulsión del
agua fuera del tejido confiere la elasticidad necesaria para resistir mecánicamente.
Tal y como se apuntaba anteriormente el cartílago articular es un tejido sin
aporte vascular, nervioso ni linfático, propiedades condicionan su baja
capacidad intrínseca de curación. Cuando se produce una lesión el cartílago no
existe respuesta inflamatoria al daño tisular y por lo tanto no se producirá la
invasión macrofágica para fagocitar y eliminar el tejido desvitalizado ni la
migración de células con capacidad reparadora dentro del área lesionada. Las
lesiones condrales no se solventan por sí mismas y con el tiempo pueden
progresar a osteoartrosis (enfermedad degenerativa que evoluciona con desgaste
gradual del cartílago). Sin embargo, en lesiones profundas del tejido que llegan
hasta el hueso subcondral, el flujo de sangre resultante introduce células
progenitoras y factores de crecimiento que pueden iniciar un proceso de
regeneración. No obstante, el tejido resultante contiene una matriz de colágeno
desorganizada y heterogénea con capacidades biomecánicas reducidas. Otros
factores como la edad, enfermedad, inestabilidad estructural y predisposición
genética afectan la regeneración fisiológica del cartílago.
La resolución más adecuada de una lesión condral debería implicar la
regeneración con un tejido idéntico al cartílago hialino. La simple reparación
supone el relleno con un tejido no idéntico que debería ser capaz de sellar el
área defectuosa con una buena adhesión al hueso subcondral y una completa
integración al cartílago circundante así como de resistir el desgaste mecánico
con el paso del tiempo e incluirse gradualmente en el recambio natural del tejido
normal. En este contexto se desarrolla en implante antólogo de condrocitos
(ACI).
10
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
5. Implante autólogo de condrocitos (ACI):
6.1
Evolución histórica
El aislamiento y crecimiento de condrocitos en un medio de cultivo lo consiguió
por primera vez Smith, en el año 1965. En ese momento se inyectaron estas
células experimentalmente en la rodilla de conejo pero no se logró una
reparación significativa. En el año 1982, se diseñó e inició en el Instituto
Ortopédico de Nueva York un modelo experimental, con un grupo control, en
conejos utilizando condorcitos articulares aislados y desarrollados en medios de
cultivo. La idea consistía en utilizar condrocitos autólogos como células
encargadas de formar cartílago hialino. Los primeros resultados de esta técnica
se presentaron en 1984 y se demostró la aparición de un cartílago similar al
hialino con un relleno del 80% en el grupo tratado con células. En el grupo
control, en el que sólo se trató el defecto con recubrimiento perióstico pero no
con células, no se observó relleno de la lesión.
Desde ese año se han sucedido numerosos y extensos estudios en animales en la
Universidad de Goteborg, en Suecia. Peterson y cols en 1984 y Grande y cols en
1985 presentaron sus resultados con esta técnica en defectos condrales, en
conejos, que no afectaban hueso subcondral. En 1985, se planteó la posibilidad
de realizar esta técnica en seres humanos y así, en 1987 se llevó a cabo en Suecia
el primer trasplante autólogo de condrocitos en una rodilla humana. En 1991
Vacanti y cols producieron cartílago hialino en matrics poliméricas a partir de
condrocitos bovinos. En octubre de 1994 Brittberg y cols publicaron en el New
England Journal of Medicine los resultados de un estudio piloto realizado con
23 pacientes. Era el primer estudio que publicaba los resultados de este
procedimiento aplicado a seres humanos.
Actualmente existen productos para la regeneración de cartílago como el
Carticel de Genzime, BioSeed de BioTissue o el MACI de Verigen.
11
Más información
- Carticel de Genzime:
http://www.carticel.com/
- BioSeed de BioTissue:
http://www.biotissuetec.com/
- MACI de Verigen:
http://biomed.brown.edu/
Courses/BI108/BI108_2004
_Groups/Group01/crMA.htm
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
6.2
La técnica quirúrgica
Las indicaciones para la realización del trasplante autólogo de condrocitos están
sujetas en lo fundamental a las lesiones aisladas del cartílago que ocurren en
sujetos jóvenes después de un rauma deportivo o de otra etiología, con
superficies de lesión de entre 2 y 4 cm2 y tengan un grado IV de la clasificación
de Oustedbridge. También se seleccionan sujetos en los cuales con lesiones de
2cm2 han fallado otros métodos o en osteocondritis disecante (necrosis
simultánea de cartílago y hueso que resulta en el desprendimiento de capas de
cartílago en una articulación).
El trasplante autólogo de condrocitos es una técnica que se realiza en dos
tiempos: en una primera intervención se realiza una extracción de láminas de
cartílago articular de una zona que soporte baja carga. Esta muestra se cultiva
hasta alcanzar un número suficiente de condrocitos para el injerto. En una
segunda intervención se extirpa la lesión condral y se cubre con un injerto de
periostio al que se deja una pequeña apertura para inyectar los condorcitos
cultivados. Una vez realizado este proceso, se cierra el periostio con un par de
suturas y se sella con un pegamento biológico de fibrina.
Figura 11
Se estima que para cubrir una lesión de 4 mm de profundidad y 40mm de
diámetro (unos 5 cm3) se necesitaría una expansión de entre 125-250 veces de
la población condrocitaria aislada del paciente (asumiendo que se obtienen 2
millones de condrocitos en el cultivo primario). Esto representa una densidad
12
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Módulo 2
celular en el defecto articular de entre 50 y 100 x106 células/ cm3, o lo que es lo
mismo un total de 2,5-5 x 108 células totales.
6.3
El cultivo ex vivo de condrocitos
El condrocito es una célula embebida en el cartílago, con escasa actividad
mitótica y una capacidad de síntesis relativamente baja. Es la única célula del
cartílago adulto y por tanto la responsable de mantener la matriz cartilaginosa en
un estado de equilibrio. Al igual que ocurre con otros tipos celulares, cuando los
condrocitos se aíslan y cultivan en monocapa pueden aumentar su capacidad
mitótica, sin embargo, estas células tienen tendencia a desdiferenciarse en
cultivos en monocapa que resulta en la imposibilidad de estas células de reducir
matriz extracelular (los condrocitos presentan inicialmente una forma
redondeada y ligeramente poligonal que con el paso del tiempo y subcultivos
cambia progresivamente a una morfología de fibroblasto.
Figura 12
Este fenómeno de desdiferenciación es la limitación más importante en
el cultivo de expansión de condrocitos y aunque la siembra a bajas densidades es
una técnica habitual para aumentar la tasa de proliferación de células en cultivo
13
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
de monocapa, no es aplicable si queremos obtener condrocitos funcionales. Se
cree que la desdiferenciación se da por la expresión de fibras de actina en
respuesta a la expansión de los condrocitos en sustratos que permiten la
adherencia. La rediferenciación de los condrocitos expandidos es posible
siempre que estos se encuentren en un ambiente apropiado en el que se
prevenga la expresión de actina y se han desarrollado diferentes aproximaciones
técnicas:
Cultivos en monocapa de alta densidad son capaces de mantener el fenotipo
condrocitario. Los condrocitos así cultivados expresan proteoglicanos capaces
de agregarse con ácido hialurónico mientras que en cultivos de baja densidad
éstos no se agragan. Aun así, y a pesar de sus ventajas, los condrocitos presentan
en ellos una expresión de colágeno tipo II más lábil que la de proteoglicanos.
Cultivo en agregados (pellets): este tipo de cultivo es capaz de expandir el
número de condrocitos manteniendo su funcionalidad pero las fuertes
interacciones generadas por el contacto célula-célula disminuye enormemente la
viabilidad celular en el producto final. Normalmente estos pellets se forman
previamente y se siembran en cultivos en suspensión aunque se han descrito
regímenes de agitación durante la expansión en suspensión de células aisladas
que permiten la formación de micropellets de 10-30 µm que contienen entre 1 y
16 células.
Cultivo en hidrogeles: el cultivo sobre hidrogeles de colágeno, agarosa o
alginato así como sobre matrices tridimensionales (pe microcarriers) ha
demostrado que condrocitos desdiferenciados vuelven a adquirir las
propiedades de los condrocitos primarios en estas estructuras y su viabilidad en
cultivo no se ve afectada. La rediferenciación post cultivo en monocapa en estos
sistemas de expansión necesita de 2 o más semanas de cultivo. El cultivo sobre
soportes dotan de una alta relación área/volumen reduciendo así la necesidad de
utilizar grandes volúmenes de medio de cultivo pero en ellos se pueden producir
fenómenos de transferencia de masa reducida que limita los índices de
proliferación así como cambios inesperados en el crecimiento celular debido a la
exposición a las fuerzas de agitación en el sistema.
14
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Asimismo, se han diseñado matrices (scaffolds) que sirven de soporte a los
condrocitos que pueden dividirse en matrices biodegradables y no degradables.
Entre estas últimas cabe destacar los polímeros naturales, que son materiales
basados en la triple hélice de colágeno o sintéticos, como el ácido poliláctico
(PLA) o poliglicólico (PGA). Los condrocitos se cultivan en el biomaterial y una
vez uniformemente distribuidos en su interior se procede al implante de la
matriz en el tejido lesionado.
Figura 13
Este tipo de cultivos, capaces de mantener el fenotipo, se encuentran con la
problemática de un crecimiento celular lento.
La segunda problemática en el cultivo de condrocitos de origen humano
consiste en que el origen de la muestra recibida no es reproducible y presentan
una enorme variabilidad en sus respuestas. Por ejemplo, es un hecho conocido
que los condrocitos humanos adultos tienen una menor capacidad de
proliferación que los condrocitos procedentes de individuos más jóvenes.
Por último destacar la regeneración de tejido cartilaginoso a través de células
madre pluripotenciales. En general, se utilizan células madre somáticas y entre
ellas las más
utilizadas son las células madre mesenquimales, es decir los
progenitores no hematopoyéticos de la médula ósea adulta. Estas células tienen
15
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Módulo 2
un notable potencial condrogénico, así como una facilidad para ser cultivadas y
crecer y expandirse en dichos cultivos. Su utilización, al margen de un elevado
potencial terapéutico, obviaría la necesidad de extraer del propio paciente zonas
de cartílago sano para conseguir una regeneración de la lesión
16
Unidad didáctica 2:
Terapias consolidadas:
autoimplante de
queratinocitos y
regeneradores dérmicos
Dra. Adela Miralles
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia Celular
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. La piel
4. Anatomía de la piel
5. Propiedades ideales de los sustitutos biosintéticos de piel
6. Recubrimientos dermicos o substitutos de piel
5.1
Piel artificial de origen natural
5.2
Piel artificial sintética
7. Bibliografía
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1. Introducción
La piel, el manto protector que recubre nuestra anatomía, a pensar de su
aparente simplicidad, desarrolla un sin-número de funciones fisiológicas. Las
lesiones extensas de la piel, tienen difícil tratamiento. Concretamente las
unidades de pacientes quemados frecuentemente ven limitado su arsenal
terapéutico a la realización de implantes antólogos o heterólogos en las áreas
dañadas. La alternativa que representan las técnicas que se exponen en este
capítulo pueden ser de gran valor en la práctica médica.
2. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería:
-
Tener conocimientos generales sobre la anatomía y fisiología de la piel.
-
Conocer las alternativas terapéuticas que existen cuando se necesita
cubrir o regenerar lesiones cutáneas extensas
3
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3. La piel
La piel es un órgano esencial del cuerpo humano por sus numerosas funciones
entre las destacan la protección contra las agresiones externas y los
microorganismos, el mantenimiento del contenido hídrico y el control de la
temperatura corporal, siendo también vehículo del tacto y las sensaciones, todas
funciones primordiales que hacen que cualquier lesión de este tejido deba ser
tratada con rapidez. La reparación cutánea o cicatrización espontánea se realiza
básicamente de dos maneras diferentes: una, desde las células del borde si la
herida es de pequeñas dimensiones; la segunda se lleva a cabo a partir de las
células epiteliales contenidas en los anexos cutáneos, si la herida es amplia pero
no profunda. Si la herida es amplia y profunda, afectando a la totalidad de la
dermis, no podrá ser reparada espontáneamente, lo cual crea un grave problema
con riesgo de muerte si la lesión cubre un elevado porcentaje del cuerpo, como
ocurre usualmente en los pacientes con quemaduras de 3er grado.
Hasta el siglo veinte, los injertos de piel fueron desarrollados como una manera
de prevenir tales consecuencia, usando la piel propia del paciente (autoimplante)
o piel de cadáver (aloimplante). Mientras la piel injertada de una parte del
cuerpo del paciente a otra está inmunizada al rechazo, en casos de grandes
quemados esta opción no es factible. En estos casos, en que la extensión del
área cruenta no permite obtener suficiente epitelio autólogo, crearon un grave
problema y por esta razón, el lograr una estructura equivalente a la piel autóloga,
se convirtió en un objetivo prioritario, por ello se pensó en recurrir a las
técnicas de cultivo de tejidos que permitieran, partiendo de una pequeña
porción de piel sana, obtener grandes porciones de epitelio.
Un aporte crucial en este sentido fue hecho por Rheinwald y Green en 1975,
quienes lograron desarrollar un sistema capaz de generar grandes superficies de
epitelio cultivado a partir de una pequeña muestra de piel autóloga. Para el
desarrollo de este epitelio emplearon como feeder layer fibroblastos de ratón, la
línea celular 3T3, previamente irradiadas o tratadas con mitomicina para inhibir
su crecimiento, a la cual se le sumaron las células obtenidas tras procesar el
fragmento de piel. Los fibroblastos de ratón, sirven de soporte a los
queratinocitos humanos al proporcionarles factores de crecimiento e inhibiendo
a la vez, el desarrollo de los fibroblastos presentes en la dermis, por lo cual las
4
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
células con mayor capacidad de crecimiento en el cultivo son las células
epiteliales de la epidermis.
Por otra parte fue importante el desarrollo de una base dérmica sobre la cual el
cultivo de queratinocitos alcance gran expansión, ocurra su diferenciación y una
vez realizado el trasplante tuviese todas las posibilidades de éxito. Hasta la fecha
se han descrito distintas superficies sobre las que los queratinocitos pueden
desarrollarse, siendo tales “pseudodermis” mezclas de los componentes básicos
de la dermis natural, como el colágeno, el condroitin-sulfato los fibroblastos
humanos y la fibrina, proteína derivada del fibrinógeno disuelto en el plasma.
Se ha podido demostrar que en los geles de fibrina los fibroblastos son capaces
de sintetizar múltiples factores de crecimiento, similares a los que son
producidos y secretados por ellos in vivo. Además, la fibrina puede servir como
reservorio de otras sustancias, como los factores de crecimiento y antibióticos,
que favorecen y permiten la correcta cicatrización. Con estas características, la
fibrina puede formar parte de los denominados equivalentes dérmicos, tanto
más que del análisis de las distintas mezclas de los componentes ya descritos, se
ha observado que aquellos geles basados en fibrina y fibroblastos permiten un
rápido crecimiento de los queratinocitos, brindando también una matriz ideal
que permite un manejo fácil de la lámina de células para su transplante, aparte
de hacer posible cultivar grandes superficies sobre una base que sirve muy bien
de equivalente dérmico.
Figura 1
Más información
http://www.ir.vhebron.net
/easyweb_irvh/Activitats/
Conferencies/TerapiaCellulari
Genica/Jorcano/tabid/228/
Default.aspx
5
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
En estudios previos, donde se emplean equivalentes dérmicos en la cobertura de
grandes áreas cruentas, se dimensionaron las principales ventajas de estas “pieles
artificiales completas” en base a su menor fragilidad, escasa retracción y mayor
porcentaje de éxito al ser utilizadas en lesiones de considerable superficie.
Así,
en
clínica,
estos
equivalentes
epidérmicos
se
han
utilizado
fundamentalmente en el tratamiento de lesiones extensas como las producidas
en personas quemadas en un 50-60% de su superficie corporal epitelización de
las zonas donde han sido tomados los injertos, cobertura de lesiones donde no
hayan prendido los injertos, ulceras cutáneas crónicas, tratamiento de la
epidermolisis bullosa, cobertura tras excisión de nevus gigantes, tratamiento de
diversas lesiones de la mucosa oral y uretral y otra serie de lesiones tanto
traumáticas como de orden patológico.
4. Anatomía de la piel
La piel es el tejido más extenso del cuerpo, ocupa el 15% del peso corporal y
cubre aproximadamente 1.7m2, en el adulto promedio, es una estructura
biláminal, epidermis y dermis. La epidermis es translúcida, permite que la luz
pase a través de ella parcialmente, no contiene ningún vaso sanguíneo pero
consigue su oxígeno y nutrientes de capas mas profundas. Esta capa de células
esta compuesta de diferentes queratinocitos.
En la parte inferior de la epidermis existe una membrana muy fina, llamada
lámina basal. El colágeno es un componente de importante de esta lamina basal.
La segunda capa se encuentra a mayor profundidad y es llamada Dermis. Está
compuesta principalmente de fibroblastos, contiene vasos sanguíneos, nervios,
raíces de pelo y glándulas de sudor. Debajo de la dermis se extiende una capa de
grasa llamada Hipodermis, que se adhiere a la dermis mediante fibras colágenas.
En la mayoría de las áreas del cuerpo la epidermis es solamente 35-50 µm de
gruesa.
6
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 2
5. Propiedades ideales de los sustitutos biosintéticos de piel
Idealmente los sustitutos biosintéticos deberían cumplir las siguientes
propiedades:
•
Adhesión rápida a la herida
•
Impermeable a bacterias
•
Emisión de vapor de agua
•
Permitir la emigración de las células, la proliferación celular y el
crecimiento de nuevo de tejido
•
Flexibilidad para permitir la conformación de una superficie irregular en
la herida, elasticidad para permitir el movimiento de los tejidos
subyacentes
•
Resistencia lineal a tensiones de cizallamiento
•
Prevención de proliferación de flora en la superficie de la herida
•
Resistencia a la fuerza de tracción cuando esta es retirada
•
Biodegradable
•
Bajo costo
7
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
•
Caducidad indefinida
•
Mínimos requisitos de almacenamiento
•
Tejido compatible
•
Ausencia de toxicidad local o sistémica
Aunque el criterio más importante está relacionado con la adhesión ya que de
esta depende en buen porcentaje el éxito del injerto.
6. Recubrimientos dermicos o substitutos de piel
El principal objetivo en el tratamiento de un gran quemado cuando llega al
hospital es mantener vivo al paciente, eliminar el tejido dañado y tapar las
heridas con los materiales y técnicas que se dispongan en el centro. El segundo
paso es la sustitución de la piel quemada por piel sana lo más rápidamente
posible y con los mejores resultados estéticos y funcionales, bien con injertos de
piel del propio paciente, con injertos temporales de piel de cadáver, implante
autologo de queratinocitos cultivados o con regeneradores dérmicos.
Los sustitutos cutáneos los podemos clasificar en: temporales o permanentes
(según sean o no rechazados y/o reabsorbidos por el huésped), epidérmicos,
dérmicos o compuestos (según sustituyan a una sola capa de la piel ó a las dos),
biológicos o sintéticos (según su origen).
5.1
Piel artificial de origen natural
Cultivo de queratinocitos. Con el cultivo de queratinocitos se pretende obtener
un epitelio que se puede incorporar a una base dérmica. Básicamente, la técnica
consiste en separar los queratinocitos de la matriz celular en aproximadamente
2-4 cm de piel del propio paciente y aumentar su número mediante cultivo
celular. Después se incorporan a una matriz dérmica artificial constituyendo una
especie de piel elemental que se trasplanta al paciente y que, cuando prende, ya
forma la piel completa.
8
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
El tejido que se cultiva incrementa entre 3.000 y 6.000 veces su tamaño original,
de modo que una pieza de unos cuatro centímetros cuadrados puede
proporcionar casi un metro cuadrado de piel. Con esta terapia aunque en líneas
generales se están logrando buenos resultados, la recuperación de los pacientes
no es generalizada. El problema principal radica en que la dermis o capa
profunda de la piel, que también se daña en estas quemaduras, no se regenera
mediante el trasplante de queratinocitos cultivados. Otro problema no resuelto
es el excesivo tiempo que se necesita para obtener el cultivo celular, que oscila
entre 21 y 28 días.
AlloDerm® es una matriz proteica formada por dermis de donante
criopreservada y liofilizada, destruyendo con ello la totalidad de las células. No
incluye la capa epidérmica o sustitutoria de la epidermis. AlloDerm® esta
diseñada servir de matriz biológica para reformar tejido normal, contiene tanto
la estructura como la información bioquímica para dirigir la revascularización
normal y la repoblación celular, de vasos sanguíneos, colágenos, proteoglicanos
y elastina.
Esta matriz extracelular contiene los canales de los vasos sanguíneos que sirven
de conductos para revascularización; colágenos, proteoglicanos y elastina que
suministran a la estructura la información para la repoblación celular aún más
importante los proteoglicanos son conservados y las proteínas ordenan a las
células propias del paciente que inicien revascularización y repoblación de
celular.
Figura 3
Figura 4. Matriz de Alloderm
9
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Apligraf® es proporcionado como un sustituto de piel viviente (bicapa). De la
misma manera que piel humana, Apligraf® consta de células vivas y proteínas
estructurales. La capa dérmica más baja combina colágeno bovino tipo I y
fibroblastos humanos (células dermales), que producen proteínas adicionales a
la matriz. La capa epidérmica superior está formada por el ascenso de
queratinocitos humanos (células epidermales) primero se multiplican y luego
diferencian para reproducir la arquitectura de la epidermis humana. A diferencia
de piel humana. Apligraf® no contiene melanocitos, células de Langerhans,
macrófagos, y linfocitos, u otras estructuras como vasos sanguíneos, folículos
pilososo o glándulas de sudor.
Figura 5
Figura 7: Estructura de Apligraft
Figura 6
Figura 8: Dermagraft
Dermagraft ® consiste en un una matriz de acido poliglicólico bioabsorbible
sembrada con fibroblastos humanos neonatales. Los fibroblasts proliferan en el
interior de la matriz secretando colágeno, factores de crecimiento y citoquinas
creando un substituto cutáneo humano tridimensional.
10
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Hyalograft y Laserskin (Hyaff-11)
son matrices
de ácido hialurónico
sembradas con fibroblastos humanos neonatales se indican para el uso en
úlceras diabéticas del pie y úlceras venosas de la pierna.
Figura 9: Láminas de Hyalograft
Transcyte® está formado por 2 capas, una capa externa que es una lámina de
silicona y una capa profunda que es una malla de nylon donde se introducen
fibroblastos neonatales. Durante 3 semanas esos fibroblastos van produciendo
matriz proteica y factores de crecimiento, entonces se somete el producto a un
proceso de criopreservación con lo cual se destruyen los fibroblastos y quedan
la matriz proteica, los factores de crecimiento y la lámina de silicona superficial.
Figura 10
Figura 11
11
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
5.2
Piel artificial sintética
Biobrane® es una fibra sintética sustituta de la piel constituida por una bicapa
(análoga a la epidermis y dermis).
Figura 12
La silicona capa exterior actúa como una barrera epidérmica protectora. La
superficie interior se compone de entretejido tridimensional de filamentos de
nylon sobre cual se vincula colágeno péptido. La adherencia inicial a la herida
es el resultado de la unión entre el colágeno de la membrana con la superficie de
fibrina. La segunda fase de adherencia resulta de las células epidérmicas que
proliferan entre las matrices de nylon.
Figura 13: Estructura del Biobrane®
Integra® fue el primer sustituto cutáneo comercializado y con capacidad para
regenerar la dermis. Fue desarrollado por John Burke en el Shriners Burns
Institute y por Ioannis Yannas del M.I.T. (Instituto Tecnológico de
Massachusetts). Es un producto con 2 capas, la externa es una membrana de
silicona y la profunda es una matriz de colágeno de origen bovino con
glicosaminoglicanos. Tiene 2 funciones, como piel artificial y como regenerador
dérmico;
como
piel
artificial
proporciona
una
cobertura
fisiológica
postescisional disminuyendo el stress metabólico; como regenerador dérmico
12
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
genera una neodermis similar a la original, que ayudará a mejorar la calidad
estética y funcional de la cicatriz [9].
Omiderm® es una lámina sintética de poliuretano que permite de forma
semipermeable intercambiar con el medio ambiente pero deteniendo el ritmo de
evaporación y la penetración de bacterias. A medida que crece el tejido hacia la
lámina, el Omiderm® aumentará su adherencia, su elasticidad y su ransparencia.
Permite una aplicación fácil, movimientos completos de las articulaciones y
facilidad para inspeccionar las heridas.
El Omiderm ® es útil para proteger sitios donadores, es ampliamente usado
como único tratamiento en quemaduras de 2° grado superficial. Si se presenta
integración a la herida, el manejo de esta consistiría en cambios diarios de
apósitos solamente. Esta rutina se lleva a cabo hasta que haya buena adhesividad
a la herida. También, puede ser colocado sobre heridas ya debridadas esperando
autoinjerto y sobre injertos mallados, previniendo resequedad y deslizamiento
de estos.
13
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
7. Bibliografía
1. Next generation products for wound management. Stewart J.
Wound Healing Research Unit University of Wales College of
Medicine,
Heath
Park,
Cardiff,
UK.
Enlace:
http://www.worldwidewounds.com/2003/april/Stewart/NextGeneration-Products.html
2. Piel artificial. Ramos Lopez. Revista Colombiana de tecnologías
avanzadas
2006
vol2
nº8.
Enlace:
http://www.control-
automatico.net/PDF/Revista%208/8_6.pdf
3. Obtención de láminas de piel humana mediante ingenieria de tejidos.
Arvelo F., Perez P., Cotte C. Acta cientifica venezolana 2005: 55;74-82.
Enlace: http://acta.ivic.ve/55-1/articulo9.pdf
4.
Tratamiento de las Quemaduras en el Siglo XXI desde la Cirugía.
Gomez P., Palao R. Cirurgìa Plàstica Ibero-Latinoamericana - Vol 28 Núm. 1. Enero Febrero Marzo 2002.
Enlace: http://www.medbc.
com/meditline/review/chir_es/vol_28/num_1/text/vol28n1p69.asp
14
Unidad didáctica 2:
Terapias consolidadas:
Obtencion y procesamiento
de progenitores
hematopoyéticos
Dr. Gregorio Angel Martín-Henao
Banco de Sangre y Tejidos. Centro de Tejidos y Terapia
Celular.
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Obtención de las Células Progenitoras Hematopoyéticas:
3.1.
Procedentes de médula ósea
3.2.
Procedentes de sangre periférica movilizada
4. Transporte
5. Procesamiento de las Células Progenitoras Hematopoyéticas:
5.1.
Recepción
5.2.
Conservación
5.3.
Manipulación
5.4.
Criopreservación
5.5.
Almacenado a largo término
5.6.
Distribución
5.7.
Descongelación
5.8.
Infusión
5.9.
Otros elementos (controles analíticos, etiquetado,
gestión de datos, validaciones, desviaciones, sistema
de calidad, regulación)
6. Bibliografía
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1.
Introducción
El trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH) es una terapia bien
establecida para el tratamiento curativo de diferentes enfermedades neoplásicas
hematológicas y no hematológicas y otro tipo de enfermedades (genéticas,
autoinmunes, etc). Un programa de TPH se basa en tres pilares básicos, la
unidad de obtención, encargada de la recolección de las células progenitoras
hematopoyéticas (CPH), la unidad de procesamiento, encargada de la
manipulación, el almacenado y la distribución de las CPH y la unidad clínica,
que es la responsable de establecer la indicación del TPH y en última instancia
del cuidado y seguimiento de los pacientes. En esta unidad didáctica trataremos
de los diferentes elementos que intervienen en un programa de TPH, de las
interacciones entre ellos así como del marco que regula dicho programa.
2.
Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería conocer:
-
Los
principales
elementos
de
un
programa
de
trasplante
hematopoyético.
-
La metodología básica para la obtención de células progenitoras
hematopoyéticas, procedentes de médula ósea y de sangre periférica.
-
Realizar cálculos básicos en el procesamiento de células progenitoras
hematopoyéticas.
-
Los principales tipos, fundamentos teóricos e indicaciones de las
diferentes técnicas de manipulación ex vivo no genética.
-
Los fundamentos teóricos de las técnicas de criopreservación actuales.
-
Las técnicas de descongelación e infusión de las células progenitoras.
-
Los
principales
controles
de
calidad
realizados
durante
el
procesamiento celular.
-
Los principales elementos de soporte y estratégicos de un programa de
trasplante.
3
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3.
Obtención de las Células Progenitoras Hematopoyéticas
Las CPH, incluyendo las células más inmaduras (células madre hamatopoyéticas)
(“La Célula”) (figura 1) se utilizan a nivel clínico para el trasplante y de forma
experimental en el campo de la medicina regenerativa.
Figura 1. Célula Madre Hematopoyética
El trasplante de progenitores hematopoyético (“El Trasplante”) se puede
clasificar, según el tipo de donante, en autólogo (las CPH son obtenidas del
propio paciente), singénico (las CPH son obtenidas de un gemelo univitelino
idéntico al paciente), alogénico (procedentes de un individuo de la misma
especie distinto a un gemelo del paciente), bien sea emparentado (donante
familiar del receptor) o no emparentado o xenogénico (el donante es de distinta
especie).
Según la fuente de donde las CPH se obtengan (“La Obtención”), se distingue
entre el TPH de médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón umbilical o de
hígado fetal.
Las CPH procedentes de médula ósea (CPH-M) (“La Médula Ósea”) se
obtienen mediante punciones múltiples en las crestas ilíacas posteriores,
anteriores y de forma ocasional en el esternón o en la meseta tibial (figura 2). El
donante está en la mayoría de los casos bajo anestesia general. La cantidad de
médula ósea a obtener tiene como objetivo superar el límite de 2x108 células
nucleadas por kilogramo (kg) de peso del receptor, considerado de forma clásica
el mínimo necesario para el trasplante, con un contenido de 2x106 células
CD34+/kg de peso de receptor, pero en todo caso la cantidad máxima viene
limitada por el peso del donante y no debe exceder los 20 ml por kg.
4
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 2. Aspiración de médula ósea
En comparación con médula ósea, en sangre periférica (“La Sangre
Periférica”) existe un número muy pequeño de CPH, pero se puede aumentar
su cantidad tras movilizar dichas células desde la médula ósea –su residencia
habitual- a la sangre periférica tras la administración de factores de crecimiento
solo (el más empleado es el factor estimulante de colonias de granulocitos, GCSF) o en ocasiones, acompañado con la administración de quimioterapia (en el
caso del TPH autólogo) (“La Movilización”). El mecanismo de movilización
no es conocido de forma completa, aunque se han implicado una serie de
moléculas de adhesión, incluyendo el antígeno LFA-1 (lymphocyte functionassociated antigen-1), VLA-4 (very late antigen-4), c-kit, CD44, VCAM (vascular
cell adhesión molécula) and Mac-1, que participan en la interacción del
microambiente medular con las CPH. Otras chemocinas implicadas son el SDF1 (stromal-derived factor-1), el cual se expresa de forma constitutiva en las
células del estroma de la médula ósea y su receptor, el CXCR-4, expresado por
las CPH. La interacción entre SDF-1 y CXCR-4 parece jugar un papel
primordial en la retención de las CPH en la cavidad medular. La disrupción de
las interacciones entre estas moléculas y sus ligandos promueve la movilización
de las CHP a la circulación (figura 3).
5
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 3: Modelo de movilización inducida por estrés. El daño del DNA causado por la
quimioterapia o el G-CSF induce a través de diversos mecanismos un incremento de
citocinas, proteasas, etc, que conducen a la degradación del las señales que mantienen
retenidas las CPH en la cavidad medular (Hematology 2003, 419)
Las CPH expresan en su superficie el antígeno CD34 (“El Antígeno CD34”).
Por tanto, la cantidad de CPH que se movilizan a sangre periférica puede
medirse por citometría de flujo mediante la determinación de células que
expresan dicho marcador (“La Monitorización”). Los días en los que la
concentración de CPH en sangre periférica es mayor varía, dependiendo de la
droga empleada para la movilización (“La Cinética de Movilización”). Así,
tras administración de quimioterapia (tipo ciclofosfamida y G-CSF), la máximo
concentración de células CD34+ en sangre periférica suele ser el día +9 a +11 y
tras la administración de G-CSF solo, el día +4 a +6.
Si existe un número suficiente de estas células en sangre periférica (se considera
que al menos debe existir 5 células CD34+/µl), las CPH pueden recolectarse
por un procedimiento de aféresis (“La Aféresis”). La leucoaféresis consiste en
extraer la sangre del donante, separar dicha sangre en diferentes componentes,
generalmente mediante centrifugación, retener las células mononucleadas
(CMN), que es la fracción celular donde están contenidas las CPH, y devolver el
resto de componentes sanguíneos al donante (figura 4). El procedimiento se
realiza con una máquina, en circuito cerrado y el donante no requiere anestesia.
La cantidad de volumen extraído al donante es variable pero el objetivo es
conseguir al menos 2x106 células CD34+ por kg de peso de receptor,
considerado el mínimo para un implante hematopoyético rápido y seguro. A
6
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
veces es necesario realizar más de un procedimiento de aféresis para alcanzar la
cifra de CPH requerida para trasplante. El producto obtenido se denomina
CPH-Aféresis (CPH-A). La cantidad de células CD34+/kg de peso de receptor
obtenidas en un procedimiento de aféresis depende, entre otros factores, del
volumen de sangre que se procese y de la eficiencia en la recolección de dichas
células. La eficiencia de recolección de células CD34 se calcula según la
siguiente fórmula = (Total CD34 en sangre periférica/Total CD34 en
producto)*100.
El total de células CD34 en sangre periférica se calcula con la siguiente fórmula
= CD34/ml x Volumen procesado). La cantidad de células CD34+/kg de peso
se calcula dividiendo la cantidad total de células CD34+ en el producto de
aféresis por el peso real del paciente.
Figura 4. Representación esquemática de un procedimiento de aféresis
1) El suero fisiológico ( ) y el anticoagulante (
) entran en el circuito.
2) La sangre ( ) comienza a circular a través del separador y comienza su colección.
3) El separador separa (
) y extrae plasma ( ) y células mononucleadas (
).
4) El resto de los componentes celulares (
) son devueltos al paciente
7
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
La separación del componente celular en las máquinas de aféresis se realiza
mediante centrifugación o filtración. La centrifugación usa la fuerza centrífuga
para separar la sangre en plasma y los elementos celulares. El principio es que
cada componente sanguíneo tiene una gravedad específica (figura 5). Una
máquina de aféresis basada en centrifugación puede ser de flujo continuo, lo que
permite que la sangre sea extraída del cuerpo del donante, procesada de forma
continua y devuelta al paciente de forma simultánea.
Por el contrario, en la centrifugación de flujo discontinuo, la sangre es
procesada en cantidades pequeñas y es devuelta al donante de forma
intermitente. La filtración separa los diferentes componentes sanguíneos
basados en sus diferencias de tamaño. El proceso una la tecnología de
membranas para separar el plasma y las células. La existencia de poros de varios
tamaños permite la colección del componente celular deseado.
Figura 5. Principio de la separación celular mediante aféresis. Se muestra la gravead específica
de cada componente sanguíneo.
8
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
La siguiente tabla describe diferentes tipos de máquinas de aféresis:
Fabricante
Máquina
Tipo
Baxter Healthcare
Corporation,
Fenwal Division
CS 3000 Plus®
C/FC
Amicus®
AutopheresisC®
C/FC
SM/DF
Fresenius
Hemocare, Inc
AS 104
C/FC
Gambro BCT Inc
COBE® Spectra™
C/FC
COBE® Trima™
C/FD
V-50
C/FD
MCS®, MCS/Plus®
C/FD
PCS®
C/FD
Haemonetics
C, Centrifugación; SM, membrana de centrífuga; CF, flujo continuo; DF,
flujo discontinuo; SN.
Figura 6. Máquina de aféresis (Cobe Spectra)
9
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Durante el procedimiento de aféresis el donante puede experimentar efectos
secundarios (“Las Reacciones Adversas”) las cuales son en su mayoría leves, e
incluye escalofríos, toxicidad por el citrato (empleado como anticoagulante en la
sangre extracorpórea), hipovolemia y reacciones vasovagales. El enfriamiento de
la sangre durante el circuito extracorpóreo y la infusión de la solución salina y el
anticoagulante a temperatura ambiente causa que el donante sienta frío y
escalofríos. El anticoagulante usado durante el procedimiento es generalmente
el ACD (Anticoagualnt Citrate Dextrose) o ACD-A. Esto es debido a que no
causa, al contrario de la heparina, anticoagulación sistémica o reacciones
alérgicas y es efectivo en reducir la agregación plaquetaria durante el circuito
extracorpóreo.
La toxicidad del ACD está relacionada con la unión del citrato al calcio iónico,
lo que puede producir hipocalcemia. Esto causa síntomas que van desde leves,
como parestesias u hormigueos (alrededor de la boca y en la parte distales de las
extremidades), moderados (parestesias progresivas, náuseas, vómitos, calambres
abdominales) a efectos más graves (tetania, pérdida de conciencia, hipotensión,
arritmia cardiaca, etc). La severidad de las reacciones adversas al ACD es
dependiente de la velocidad y la duración de la infusión de citrato y su
incidencia y severidad es mayor en pacientes pediátricos que en adultos. En
estos casos, se debe disminuir la proporción de anticuagulante si se puede o
administrar gluconato cálcico por vía oral (y en casos excepcionales por vía
endovenosa).
En muchos centros, se usa una combinación de ACD-A y heparina, lo que
parece disminuir las reacciones de hipocalcemia. Las reacciones alérgicas son
raras durante la aféresis de CPH. La hipovolemia puede causar hipotensión,
taquicardia, diaforesis. Por su parte, las reacciones vasovagales se manifiestan
con
palidez de piel, debilidad, mareos, vómitos, pérdida de conciencia,
convulsiones, relajación de esfínteres, hipotensión, bradicardia.
En cuanto a la composición celular, esta varía entre la médula ósea y la sangre
periférica, conteniendo esta última un mayor número de células nucleadas
totales (x2,3 veces), de CPH (tanto de células CD34+ -x3,7 veces- como de
10
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
unidad formadora de colonias granulo-monocitarias -CFU-GM-, -x3,7 veces ) y
de linfocitos T (x6,4 veces) y B (x5,4 veces).
Las ventajas de emplear CPH de sangre periférica en relación a la médula ósea,
es la disminución en los tiempos de implante del injerto tras el trasplante, el
aumento en la cantidad de CPH infundidas, que se realiza sin anestesia al
donante, puede realizarse de forma ambulatoria y el donante necesita menos
cuidados, diminuyendo los costes del procedimiento. Todos estos factores
hacen que en la actualidad sea la fuente de CPH más empleada en el trasplante.
4.
Transporte
Con frecuencia, las CPH obtenidas son enviadas desde centros de obtención
hasta centros de procesado especializados distantes, por lo que se requiere un
paso de transporte (“El Transporte en Fresco”). El transporte de productos
celulares en fresco se realiza en contenedores especiales (figura 7) y en unas
condiciones específicas, que incluye la monitorización de la temperatura durante
el mismo.
Figura 7. Contenedor de transporte de productos en fresco
11
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
5.
Procesamiento de las Células Progenitoras Hematopoyéticas:
Tras la obtención, las CPH pueden infundirse directamente en fresco (CPH no
manipuladas) (en el caso de trasplante alogénico) o lo más frecuente es que
requieran ser procesadas
antes de su infusión al paciente (“El
Procesamiento”). El procesamiento comprende todos los aspectos de
manipulación, criopreservación, empaquetado, etiquetado, incluyendo la
preparación de las CPH para infusión o para su almacenado.
Una vez que las CPH llegan al cetro de procesamiento, el primer paso es la
recepción del producto (“La Recepción”). Cada centro de procesamiento debe
tener protocolos escritos que definan los criterios para la aceptación de un
producto para su procesamiento o en su caso para su rechazo.
Si las CPH no pueden procesarse el mismo día, se conservan a corto término
(“La Conservación”) para su procesado al día siguiente. Algunas variables a
considerar en este aspecto son la temperatura de almacenado, la concentración
celular, la solución para diluir el producto celular, el contenedor del producto, el
método de almacenado (estático o en agitación) y el tiempo máximo hasta su
manipulación. Los datos de diferentes estudios muestran que la viabilidad
celular se conserva mejor cuando las CPH se almacenan a 4ºC y cuando la
concentración celular es baja (por debajo de 3x108/ml). Para ello, el producto
celular se diluye en plasma autólogo o se emplea una
solución salina
suplementada con una fuente de proteína (ej. albúmina humana) y un
anticoagulante, en un contenedor primario que tenga intercambio gaseoso
(figura 8). La mayoría de los centros almacenan las CPH antes de su procesado
hasta el día siguiente, aunque pueden almacenarse hasta 72 horas antes de su
infusión en fresco o manipulación y congelación.
Posteriormente, las CPH pueden ser sometidas a manipulación ex vivo (“La
Manipulación”). Los componentes celulares sometidos a manipulación pueden
clasificarse en “minimamente manipulados” (los sometidos a un procesamiento
que no altera las características biológicas relevantes de las células) o “más que
minimamente manipulados” (los sometidos a un procesamiento que altera las
características biológicas relevantes de las células que generalmente implica el
uso de métodos de cultivo celular).
12
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 8. Almacenado de las CPH a corto plazo en bolsas de intercambio gaseoso.
Dentro de las manipulaciones mínimas se incluye la separación de diferentes
componentes celulares, como la reducción de plasma, lavado de plasma,
reducción de hematíes mediante sedimentación, el enriquecimiento en la capa
leucoplaquetar –obtención de buffy-coat- o el enriquecimiento en la capa de
células mononucleadas –empleando sustancias que separan las células en
función de su densidad-.
“La reducción de plasma” se lleva a cabo mediante simple centrifugación
manual (figura 9) o automática, y puede aumentarse la reducción mientras el
lavado celular. En éste último caso puede realizarse igualmente de forma manual
o empleando centrifugación semiautomática (Cobe 2991) (figura 10) o
automática (Cytomate de Baxter) (figura 11). El producto obtenido tras
reducción de plasma se denomina “CPH-reducidas de plasma”. Esta técnica está
indicada en caso de incompatibilidad ABO menor entre donante y receptor (el
donante tiene anticuerpos anti-ABO contra los hematíes del receptor). La
recuperación de células CD34+ con estas técnicas suele ser superior al 90% (ver
más adelante, “Los Cálculos”) con un grado de eliminación de anticuerpos antihematíes del receptor que debería estar por debajo de una titulación de 1/256.
Para “La reducción de hematíes”, existen diferentes aproximaciones técnicas,
como la obtención de células mononucleadas en gradiente de densidad o la
sedimentación utilizando una sustancia (hydroxyethyl Starch (HES)).
13
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 9. Centrífuga manual (tipo Sorvall)
Figura 10. Procesador celular
semiautomático (Cobe 2991)
Figura 11. Procesador celular automático (Cytomate, Baxter)
14
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
En “La separación en gradiente de densidad” se emplea una sustancia (ficoll,
densidad 1.077 g/l) que separa a las células en función de su diferente densidad,
de tal forma que los granulocitos y los hematíes pasarán a través de la capa de
ficoll, ya que tienen una densidad superior a 1.077 g/l, quedando la capa de
células mononucleares (linfocitos, monocitos y CPH) y las plaquetas por encima
de dicha capa (figura 12). Esta técnica se puede realizar de forma
semiautomática (ej. con Cobe 2991) y para volúmenes más pequeños con el
procesador celular automático Sepax (figura 13). Las principales limitaciones de
la separación en gradiente de densidad es que la eficacia es dependiente de la
ratio entre leucocitos y hematíes, del grado de contaminación de neutrófilos y la
poca reproducibilidad en la recuperación celular, además de lo tedioso de la
técnica y del hecho que el ficoll o percoll no están autorizados para su uso en
humanos.
Figura 12. Tubo donde se muestra
la capa de células mononucleadas.
La otra técnica de reducción de hematies es “La sedimentación en HES”, que
induce la formación de rouleaux y ayuda a la sedimentación de los mismos. Esto
puede hacerse de forma manual o empleando un procesador automático de
reciente aparción (Sepax, Biosafe) (figura 13). La reducción de hematíes está
indicada en caso de incompatibilidad ABO mayor entre donante y receptor (el
receptor tiene anticuerpos anti-ABO de los hematíes del donante). La
recuperación de células CD34+ con esta técnica suele ser superior al 70% con
un grado de eliminación de hematíes superior al 95%. El objetivo es conseguir
un producto final con menos de 20 ml de hematíes en adultos o de 0,3 ml/kg de
peso en caso de pacientes pediátricos. Para conseguirlo, si el producto es de
médula ósea, generalmente se requiere emplear un primer paso de reducción de
15
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
hamatíes (mediante la obtención de un buffy-coat) y posteriormente conseguir
una reducción adicional mediante el uso de HES.
Figura 13. Procesador celular automático Sepax (Biosafe)
“La obtención de buffy-coat” (figura 14) consiste en el enriquecimiento en la
capa leucoplaquetar, eliminando plasma y hematíes. Se usan técnicas de
centrifugación (bien manual, semiautomática o automática). Esta técnica está
indicada en casos de incompatibilidad menor ABO entre donante y receptor,
sobre todo si se utiliza médula ósea, como primer paso antes de una reducción
de hematíes adicional, en caso de incompatibilidad ABO mayor entre donante y
receptor. La recuperación de células CD34+ suele ser superior al 80%.
Figura 14. Tubo
donde se muestra la
capa de buffy-coat
16
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Otras indicaciones de dichas técnicas son el en caso de que el producto celular
se vaya a someter a una manipulación adicional (ej. reducción de plasma de
aféresis u obtención de buffy-coat o reducción de hematíes de médula ósea
antes de su criopreservación).
Las técnicas de manipulación mencionadas hasta ahora basan la separación
celular en función del tamaño y la densidad de las distintas poblaciones celulares
y de los medios empleados y viene determinado por la siguiente fórmula:
µ = 2 r2 (d – d0) G
9η
µ = Velocidad Sedimentación
r = Radio Celular
d = Densidad Celular
d0 = Densidad Medio (ó Plasma)
G = Centrifugación
η = Viscosidad Medio
Otras técnicas de manipulación ex vivo no genética algo más sofisticadas,
incluyen las técnicas de selección celular (“Las Selecciones”). Dentro de están
se distinguen la “selección negativa” (donde se eliminan una o más poblaciones
de células específicas), de “selección positiva” (donde se enriquece en una o más
población celular específica) o selección combinada positiva-negativa
(combinación de las dos técnicas anteriores). En otras técnicas de manipulación
se incluye la “expansión” (crecimiento de una o más poblaciones celulares en
un sistema de cultivo ex vivo).
Dentro de las técnicas de “selección negativa o purgado”, están los “métodos
no inmunológicos”, basados en la separación física (bien mediante
centrifugación o aglutinación), farmacológica (empleando drogas que alteran la
capacidad proliferativa de las células que se quieren eliminar, ej. 4HC,
Mafosfamida, VP-16, etc), lectinas (sobian aglutinina), fisico-químicos (ej.
17
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
fotoactivación), o bien los “métodos inmunológicos”, basados en el uso de
anticuerpos monoclonales –AcMo-, que son las técnicas más utilizadas en la
actualidad. Dentro de estas últimas están aquellas basadas en el uso de AcMo
que se unen a las células diana las cuales son lisadas tras la incubación y
activación del complemento (el cual es añadido a la suspensión celular) (figura
15); AcMo que se unen a la células diana y hematíes recubiertos de anticuerpos
que se unen al complejo célula diana-AcMo a través de un anticuerpo
secundario, separando a las células diana del resto mediante métodos físicos
(figura 16); AcMo unidos a toxinas –inmunotoxinas-, que consiguen la muerte
de las células diana tras su unión y penetración en las mismas; separación celular
empleando AcMo y citómetro de flujo (sorting) o bien el uso de AcMo y
partículas magnéticas, que son las más usadas en práctica clínica actual.
Los dos sistemas más empleados son el sistema de esferas inmunomagnéticas
(Dynal®) (de un tamaño aproximado de 450 µm) unidas a un anticuerpo
secundario, que se une al AcMo específico primario unido a las células diana.
Las esferas magnéticas se unes a las célula dianas (figura 17), que se separa de
forma física del resto del producto celular al pasar la suspensión celular por un
campo magnético. En este caso, se utilizan esferas magnéticas que están
recubiertas de anticuerpos (ej. anticuerpos oveja anti-ratón, SaM, Dynal®) que
reconocen al AcMo primario (aj. Anticuerpo ratón anti-humano) unido a las
células diana. Los complejos células diana-esferas magnéticas (“inmunorosetas”)
quedarán retenidos en el campo magnético. La máquina usada en esta técnica es
el separador celular magnético Max-Sep (figura 18).
Figura 15. Selección negativa con anticuerpos monoclonales y
complemento.
18
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 16.
Selección
negativa con
anticuerpos
monoclonales y
hematíes.
Figura 17.
Selección
negativa con
anticuerpos
monoclonales y
esferas
magnéticas.
Figura 18.
Separador
celular
magnético
Max-Sep.
Otra técnica de selección negativa de reciente incorporación es la basada en el
método MACS (magnetic activated cell sorting). El sistema MACS emplea AcMo
específicos unidos a unas micropartículas magnéticas de pequeño tamaño (aprox.
50 µm) que se unen a las células diana (figura 19), ej, partícula mangética- AcMo
anti-CD3-linfocito T. Estas partículas magnéticas junto al AcMo unido a las
células diana son retenidas al pasar por un campo magnético, de tal forma que el
resto de la suspensión celular “no retenida” en el campo magnético estará
deplecionada de las células “no deseadas”. El proceso se realiza de forma
automática empleando el procesador celular CliniMACS (figura 20)
19
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 19.
Partículas
inmunomagnéti
cas (50 µm)
unidas a una
célula diana
Figura 20. Procesador celular CliniMACS
20
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Por otra parte están las técnicas de “Selección Positiva”. En el caso de
progenitores hematopoyéticos nos referimos a la selección de células CD34+
(que contiene las CPH) o de células CD133+ (también un marcador de CPH).
Los dos sistemas de selección CD34+ más usados en la actualidad son el
sistema Isolex y el sistema MACS.
En el sistema Isolex (Baxter Heathcare), se usa un AcMo anti-CD34 (clase II,
9C5),
las esferas magnéticas (de tamaño aprox. 450 µm, mencionadas
anteriormente, de Dynal) y un péptido liberador que compite con el AcMo antiCD34 y lo desplaza de las células. El procedimiento se realiza con el procesador
Isolex 300i (figura 21).
Esta máquina tiene una serie de bombas, detectores de fluidos y de presión, que
mediante el control de un software, permite realizar todo el procedimiento de
forma completamente automática y en circuito cerrado. Los principales pasos
del procedimiento son: 1º La suspensión celular es transferida a la bolsa de
reciclado; 2º en la bolsa de reciclado tiene lugar el lavado de las plaquetas, que
pasan a bolsas de desechado –no visibles en el dibujo-; 3º transferencia del
AcMo hasta la bolsa de reciclado; 4º incubación y posteriormente lavado con el
AcMo en la bolsa de reciclado; 5º transferencia de la suspensión celular ya
sensibilizada con el AcMo a la cámara; 6º incubación en la cámara con las
esferas magnéticas; 7º exposición del imán en la cámara –las células con las
esferas magnéticas quedarán retenidas en el imán y el resto de las células –no
diana- son transferidas a la bolsa de desecho; 8º transferencia del péptido
liberador a la cámara e incubación –el péptido desplaza al AcMo-esfera
magnética de las células CD34+- ; 9º exposición del imán –quedarán retenidos
los complejos AcMo-esfera mangética-péptido; 10º transferencia de las células
CD34+ desde la cámara a la bolsa de reciclado; 11º concentración de las células
CD34+ purificadas en la bolsa de reciclado y 12º transferencia de las células
CD34+ purificadas desde la bolsa de reciclado a la bolsa final.
Por otra parte, el sistema MACS emplea un AcMo anti-CD34 (clase II, QBend
10) y unas micropartículas magnéticas de pequeño tamaño (aprox. 50 µm) que
se unen a las células CD34+ (figura 19). Estas partículas magnéticas junto al
AcMo unido a las células diana son retenidas al pasar por un campo magnético y
21
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
posteriormente son eluidas. El proceso se realiza de forma automática
empleando el procesador celular CliniMACS. En este caso, tanto el lavado de
plaquetas, como la incubación y lavado de anticuerpo debe realizarse con otra
máquina (bien manual o empleando el procesador celular Cobe2991 o
Cytomate). El resto del procedimiento se realiza de forma automática con el
procesador CliniMACS, que controla el procedimiento mediante un software
incorporado.
Figura 21. Procesador celular Isolex 300i
Ambos sistemas consiguen enriquecer las células CD34+ a purezas superiores al
90% con una recuperación de células CD34+ entre 50-70%. El resto de las
células se elimina de forma pasiva, con una eliminación de linfocitos T alrededor
de 3-4 logaritmos con el sistema Isolex y 4-5 logaritmos con el sistema
CliniMACS y de linfocitos B alrededor de 2 logaritmos con ambos sistemas.
La selección de células CD133+ se realiza mediante el sistema CliniMACS y el
principio es el mismo, excepto que se utiliza un AcMo anti-CD133 en lugar de
anti-CD34.
Las técnicas de selección celular están indicadas principalmente, en el contexto
del trasplante autólogo, para reducir o eliminar las células tumorales que
contaminan el inóculo y que podrían contribuir a la recaída tras el trasplante o
22
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
para el purgado de células T autoreactivas en el contexto del trasplante en
enfermedades autoinmunes. En el caso del trasplante alogénico, para disminuir
la cantidad de linfocitos T aloreactivos y así disminuir la severidad de la
enfermedad del injerto contra el huésped, que es la principal causa de
mortalidad relacionada con el procedimiento en esta modalidad de trasplante.
Otras indicaciones son como un paso previo a la expansión de CPH, para la
generación de células dendríticas o en protocolos de terapia génica. De forma
más reciente, también se están usando en el campo de la medicina regenerativa
(ej. previa a su inyección en el miocardio en casos de infarto de miocardio).
En cualquier técnica de manipulación hay que tener en cuenta los resultados que
se esperan (“Los Cálculos”). Las principales variables a considerar son:
-Recuperación de CNT o CMN =
CNT (o CMN) en producto final ÷ CNT (o CMN) en producto inicial)*100
- Recuperación de células CD34+ =
(Células CD34+ en producto final ÷ Células CD34+ en producto inicial)*100
- Recuperación de CFUs =
(Nº total de CFUs en producto final ÷ Nº total de CFUs en producto
inicial)*100
CNT: Células Nucleadas Totales
CMN: Células Mononucleadas
CFU: Unidades Formadoras de Colonias
En determinadas técnicas, además:
- log depleción de células diana (ej, células CD3+) = -log10 (Nº total de células
CD3+ en producto final ÷ Nº total de células CD3+ en producto inicial) –en
casos de selección celular- % Reducción de células diana (ej. hematíes) = 100- (volumen de hematíes en
producto final ÷ volumen de hematíes en producto inicial)*100 – en los casos
de depleción de hematíes-.
La bondad de una técnica de manipulación debe resultar en una recuperación
aceptable de CPH (células CD34+), que mantengan su viabilidad y su potencia
(ej. funcionalidad), con una eliminación aceptable del componente objeto de la
23
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
técnica en particular (ej. grado eliminación de hematíes en la técnica de
reducción de hematíes por sedimentación en HES o grado eliminación de
linfocitos T en las técnicas de selección CD3 negativa o CD34 positiva), además
de resultar en un producto final estéril. Además debe ser una técnica que de
resultados reproducibles y consistentes.
Tras la manipulación, las CPH pueden ser enviadas a la unidad clínica para su
infusión en fresco (en caso de transplante alogénico), o ser criopreservadas (“La
Criopreservación”). La criopreservación tiene por objetivo someter a las
células a temperaturas muy bajas con lo que en teoría las reacciones bioquímicas
se detienen y las células se pueden conservar a largo plazo. Sin embargo,
durante el proceso de enfriamiento se forma hielo lo que podría conducir a
daño celular.
Hay diferentes variables a considerar en el proceso de criopreservación (cabe
tener en cuenta que una suspensión celular está formada en su mayoría por agua
y solutos). Una de las variables es la velocidad de enfriamiento a la que se
somete la suspensión celular. Si la velocidad de enfriamiento es muy lenta, se
empieza a formar hielo en el espacio extracelular con lo cual aumenta la
concentración de solutos y por tanto la osmolaridad en dicho espacio. En
consecuencia el agua contenida en el interior de las células pasa al espacio
extracelular y las células reducen su volumen –las células se deshidratan-, con lo
que se puede llegar a producir una lesión celular irreversible.
Por otra parte, si la velocidad de enfriamiento es muy rápida no da tiempo a que
el proceso de deshidratación celular tenga lugar, con lo que hay suficiente agua
en el interior de las células para que se forme hielo intracelular –
sobreenfriamiento-, lo que origina la disrupción de la membrana plasmática y la
muerte celular inmediata. Por tanto, la velocidad de enfriamiento a de ser lo
suficientemente lenta para prevenir el daño celular debido a la formación de
hielo intracelular, pero suficientemente rápida para evitar la disminución del
volumen celular debido a la exposición a ambientes hipertónicos (figura 22).
Para conseguir un punto de equilibrio se emplean unas sustancias (“Los
Crioprotectores”), que unen moléculas de agua y hacen que la concentración
de solutos sea similar dentro que fuera de las células (isotónica), protegiendo a
24
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
%
S
u
p
e
r
v
i
v
e
n
c
i
a
Daño
osmótico
Formación de
hielo intracelular
Zona óptima
Velocidad de Enfriamiento
Figura 22
las células del estrés por el ambiente hipertónico. Al mantener la concentración
similar en ambos lados de la membrana plasmática, permite al agua moverse
desde el interior al exterior de las células a una velocidad lenta como para
prevenir su deshidratación, manteniendo la concentración de sales a un nivel
correcto, evitando el daño por la formación de cristales de hielo. Los
crioprotectores se clasifican según su capacidad de penetrar en el interior de las
células en penetrantes (ej. dimetilsulfóxido –DMSO-, glicerol, metanol, etc) y no
penetrantes (ej. HES, dextrano, etilenglicol).
Dentro de la técnica en sí de criopreservación, se pueden distinguir 3 fases:
1) Preparación de la suspensión celular.
2) Preparación/adición de la solución de criopreservación.
3) Enfriamiento.
“La suspensión celular” puede someterse a una manipulación previa o
proceder directamente a la criopreservación sin manipulación alguna. La
mayoría de los laboratorios reducen el volumen de la suspensión celular
(generalmente mediante reducción de plasma) (figura 23) con el objetivo de
disminuir la cantidad de volumen a criopreservar, lo que tiene implicaciones
25
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
tanto en menores costes del procedimiento, menor espacio para su almacenado
posterior, como en mejor tolerancia para el paciente a la hora de proceder a la
descongelación e infusión.
Figura 23. Reducción de plasma de la suspensión celular previo a
la criopreservación.
“La solución de criopreservación” contiene un agente crioprotector -el más
empleado es el DMSO solo o el DMSO y un agente no penetrante a (ej. DMSO
y HES)-, una fuente de proteínas que también tiene propiedades crioprotectoras
y en algunos laboratorios un anticoagulante (ACD-A o citrato) para minimizar
el riesgo de coagulación durante el procesamiento y/o tras la descongelación.
Las diferentes sustancias de la solución de criopreservación deben estar en frío
(alrededor de 4 ºC) ya que el DMSO hace aumentar mucho la temperatura y
podría desnaturalizar las proteínas contenidas en la solución. La concentración
de las diferentes sustancias varía entre laboratorios aunque lo más frecuente es
que el DMSO quede a una concentración final del 10%, la albúmina humana al
2-4% y el anticoagulante al 5-10%.
Tras enfriar la solución de criopreservación (el DMSO es tóxico para las células
a temperatura ambiente), se añade a la suspensión celular (previamente enfriada
a 4 ºC) a una velocidad lenta –generalmente durante un periodo de 7-10
minutos- y con cantidades crecientes para minimizar el riesgo de los cambios
bruscos de osmolaridad que provocaría el DMSO añadido de forma rápida
(figura 24).
26
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 24. Adicción de la solución de criopreservacón a la suspensión celular
en circuito cerrado a través de un sistema multillaves.
La suspensión celular junto con la solución de criopreservación se almacena en
bolsas especiales (“Las Bolsas”) que pueden soportar temperaturas muy bajas
(ej. bolsas cryocyte, figura 25, bolsas macopharma, etc). Las bolsas se
introducen entre placas para protegerlas físicamente de los golpes (figura 26).
Figura 25.
Bolsas de
congelación
tipo Cryocyte
(Baxter)
27
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 26. Placas metálicas para proteger a las bolsas criopreservadas
En la mayoría de los laboratorios, “El Enfriamiento” se realiza de forma
controlada – congelación programada – a una velocidad de 1-3ºC/minutos,
que se ha mostrado la adecuada para la criopreservación de las CPH. Los
programas de congelación están diseñados por segmentos lineales en los que la
velocidad de enfriamiento es constante. Durante el descenso de temperatura, la
suspensión celular está en estado líquido (figura 27 y 28) hasta que llega un
momento en que se empizan a formar pequeños núcleos de hielo (nucleación),
lo cual provoca un desprendimiento de energía con un aumento consiguiente de
la temperatura del producto (fase de transición, donde coexisten parte de la
suspensión en estado sólido y parte en estado líquido).
Al inicio de esta fase, se induce un sobreenfriamiento (por inyección de vapor
de nitrógeno líquido), que induce la nucleación y evita el sobrecalentamiento
por la liberación del calor latente que se produce por la formación del hielo.
Una vez la nucleación ha comenzado, el cambio al estado sólido se extiende a
toda la suspensión, la cual se solidificará con la estructura de un sólido amorfo.
28
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
T
e
m
p
E
R
A
T
U
R
a
Fase Líquida
Fase Transición
Δ
F
A
S
e
Figura 27.
Diagrama de
una curva de
congelación de
CPH.
S
ó
l
i
d
a
Tiempo
•
•
•
1º C/min - 40º C
2º C/min - 60º C
10º C/min - 120º C
Figura 28.
Curva de
congelación típica
de CPH. Se
observan 3
curvas, una que
representa la
temperatura de la
muestra, otra la
de la cámara y
otra la
programada
(ambas
superpuestas).
La congelación programada se consigue de forma automática mediante el uso de
congeladores biológicos programables (figura 29), que congelan las células a una
velocidad de enfriamiento constante hasta llevarlas a –120 ºC.
De forma alternativa a la congelación programada, las CPH se pueden congelar
de forma no controlada – congelación no programada -, introduciendo el
contenedor con las células en congeladores mecánicos (-80º C). Para obtener
una velocidad de enfriamiento aproximada de 1ºC/min., la bolsa con las células
debe aislarse del congelador por medio de algodón o alcohol. Las ventajas de la
congelación no programada es su bajo coste y que es un procedimiento simple.
Por el contrario, no se puede controlar la velocidad del enfriamiento ni se puede
garantizar la repetitividad de los procesos.
29
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 29.
Congelador
Biológico
Programable
Tras su congelación, las CPH son almacenadas en tanques de nitrógeno
líquido (figura 30) (“El Almacenado”). Dentro de los tanques de nitrógeno
líquido se pueden distinguir 2 fase, una fase líquida, que permite mantener la
temperatura a –196 ºC y una fase vapor. Con menos frecuencia, las CPH
criopreservadas se almacenan en congeladores mecánicos con temperaturas
de almacenado entre –80 ºC y –135 ºC. El tiempo máximo de almacenado en
tanques de nitrógeno líquido no está establecido, pero se han realizado
trasplantes con células almacenadas durante más de 20 años. Por el contrario, el
tiempo máximo recomendado de las células almacenadas en congeladores
mecánicos antes de su uso para trasplante no debe superar los 6 meses.
30
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 30.
Tanque de
nitrógeno líquido
para el almacenado
a largo plazo de los
productos
hematopoyéticos
criopreservados.
Una vez que el paciente está programado para el trasplante, se somete a un
tratamiento (“El Tratamiento de Acondicionamiento”) que consiste en la
administración de dosis altas de quimioterapia, radioterapia o ambas, que tiene
por objetivo eliminar las CPH –y tumorales en caso de enfermedad neoplásica
del receptor- así como inmunosuprimir al paciente para evitar el rechazo de las
CPH en caso de TPH alogénico. Posteriormente se procede al envío de las CPH
para su administración al paciente (“La Distribución”).
Previo al suministro de un producto de CPH final para infusión, este debe
cumplir con una serie de requisitos de calidad, fundamentalmente en lo
referente a la seguridad y a su potencia, los cuales deben estar definidos de
forma previa (“Los Criterios de Liberación o Dispensación”). Dentro de
estos criterios están el estudio de esterilidad del producto suministrado, de
endotoxinas (en el caso de productos que hayan sido previamente cultivados), la
caracterización del producto en cuanto a contaje (células nucleadas, células
CD34+, linfocitos T –éstos en caso de trasplante alogénico-) y viabilidad celular,
tipificación ABO/Rh como punto de análisis de identidad o que los criterios de
elegibilidad de un donante alogénico han sido adecuados (elegibilidad definida
como un producto de terapia celular de un donante quien cumple con todos los
requisitos relacionados con la determinación de agentes implicados en la
31
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
transmisión de enfermedades infecciosas tal como lo define la legislación
vigente). Si el producto cumple con los criterios que están definidos, pasa a ser
un producto “Disponible para Distribución”, en caso contrario, el producto
pasa a ser “Producto No Conforme para distribución” y su utilización en un
paciente determinado se realizará bajo la forma de “Necesidad Médica
Urgente” (definida como situación en la cual no se dispone de un producto de
terapia celular comparable y que el receptor es probable que fallezca o sufra una
morbilidad seria sin el producto de terapia celular) y requerirá la aprobación por
parte del Director Médico de la unidad de procesado y del Responsable Médico
del paciente.
Una vez el producto está disponible para distribución se procede a su transporte.
Si el producto no está criopreservado previamente, se procederá al transporte
(en condiciones ya descritas para el transporte de productos en fresco) hasta la
unidad clínica para proceder a su administración. Si las células están
criopreservadas y almacenadas en centros de procesado distantes de la unidad
clínica donde está el paciente, estas deben ser transportadas. El Transporte de
las CPH-criopreservadas se realiza en unos contenedores de transporte
especiales (“dry shippers”) que tienen un sistema que absorbe el nitrógeno
líquido dentro de su paredes, permitiendo mantener temperaturas por debajo
de–120ºC por varios días. Estos contenedores van introducidos en otro
recipiento tipo carcasa (figuras 31 y 32b).
Figura 31. Esquema de un Dry-Shipper
Tapa de cerrado
Aluminio
Tubo de cuello
Sistema de retención de vacío
Absorbente hidrofóbico
Aislamiento
32
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 32a. Contenedores para el
transporte de productos hematopoyéticos
criopreservados (Dry-Shippers)
Figura 32b. Contenedores tipo carcasa,
donde se introduce el dry-shipper.
El día del trasplante (día 0), se procede a la descongelación de las CPH
criopreservadas (“La Descongelación”). La descongelación se realiza
generalmente en baño maría a 37-41 ºC (figura 33a), donde se introduce la bolsa
con las células y tras masajeo se procede a su descongelación rápida (figura 33a a
33j). Posteriormente, las células se enfrían alrededor de 4º C (que puede
conseguirse manteniendo las células en acumuladores de frió) (figura 33f).
Los siguientes pasos son, la colocación de un punto de inyección en la bolsa
descongelada (tiene por objeto sacar muestras para controles de calidad y para
limpiar la bolsa con el resto producto una vez se ha infundido), se coloca un
equipo de infusión, se introduce en una bolsa secundaria (de seguridad), se
introduce en una bolsa terciaria y en un contenedor de transporte (el cual está
con acumuladores térmicos a 4 ºC y con papel superabsorbente, por si hay fugas
de producto). Posteriormente se procede a su trasporte hasta la unidad clínica.
33
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figuras 33 a-h. Descongelación de CPH en diferentes fases de la
descongelación.
Figura 33a. Baño maría para la
descongelación de productos hemopoyéticos
Figura 33b. Extracción de la bolsa de las
placas metálicas.
Figura 33c. Introducción dentro de una
bolsa secundaria.
Figura 33d. CPH descongelándose en el
baño maría
Figura 33e. Aspecto de las CPH durante la
descongelación.
Figura 33f. CPH tras descongelación en
acumuladores térmicos de frío.
34
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 33g. Colocación de un punto de
inyección (para extraer muestras para
controles de calidad y para lavar la bolsa tras
la infusión.
Figura 33h. Colocación de un equipo de
infusión.
Figura 33i. Introducción de la bolsa dentro
de otra bolsa secundaria (de seguridad)
Figura 33j. Introducción de la bolsa en el
contenedor de transporte (con acumuladores de
frío a 4ºC)
Algunos aspectos a consideran durante la descongelación: La descongelación
debe ser rápida debido a los fenómenos de recristalización que pueden
producirse durante la misma. Estos consisten en que pequeños cristales de hielo
intracelular que pudieron formarse durante la congelación, se reorganizan en
ciristales de mayor tamaño si se realiza una descongelación lenta, lo que
conduciría a la muerte celular por destrucción mecánica.
Otro fenómeno a tener en cuenta en el proceso de descongelación es el shock
osmótico. Este es un proceso inverso al producido durante la congelación y
consiste en que conforme se va produciendo la descongelación, el medio
extracelular se va haciendo progresivamente hipotónico, por lo que el agua pasa
al interior de las células y puede llegar a la lisis celular por incremento de su
volumen. Este efecto se disminuye de forma considerable por el uso de los
agentes crioprotectores (ej. DMSO), que debido a su elevada difusividad puede
35
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
pasar desde el interior de las células al medio extracelular y retener moléculas de
agua libre.
Tras la descongelación las células son transferidas a jeringas para su infusión al
paciente o lo más habitual se infunden en la misma bolsa donde se congelaron,
lo que tiene la ventaja del menor riesgo de contaminación, de pérdida de CPH y
de mayor facilidad para el personal que realiza la administración de las células
(“La Infusión”). Lo más frecuente es que las células se infundan sin filtro,
aunque puede usarse un filtro (filtro de 170 µm o más) si se ven agregados
celulares. La infusión generalmente se realiza a través de un catéter colocado en
una vía venosa central. La infusión de las CPH descongeladas debe producirse
en el menor tiempo posible y no debe exceder 1 hora desde su descongelación
debido a que el DMSO es tóxico para las células sobre todo a temperatura
ambiente. El ritmo habitual de infusión es de 5-20 ml/min.
Un aspecto importante a considerar con la infusión son las Reacciones
Adversas producidas en el paciente (definidas como una respuesta nociva y no
intencionada a la infusión de un producto de terapia celular para el que hay una
posibilidad razonable de que dicho producto sea la causa de la respuesta). Los
efectos secundarios tras la infusión de las CPH descongeladas son frecuentes y
se deben principalmente al contenido en DMSO empleado para la
criopreservación.
Estas
suelen
ser
leves
en
forma
de
reacciones
gastrointestinales (náuseas, vómitos), respiratorias (tos, disnea), cardiovasculares
(hipo o hipertensión, bradicardia), enrojecimiento, reacciones anafilácticas,
aunque se han descrito casos graves de arritmias cardiacas, complicaciones
neurológicas e incluso el fallecimiento del paciente.
Las reacciones adversas debidas al DMSO son dosis dependiente, por lo que no
debe sobrepasarse la dosis de 1 ml de DMSO/kg de paciente, pero también son
idiosincrásicas. Otro tipo de reacciones adversas incluye reacciones de tipo
inmunológico, como la reacción hemolítica aguda (en caso de TPH-Alogénico
con incompatibilidad de grupo sanguíneo ABO), reacción febril no hemolítica
(por liberación de citocinas), TRALI (“Daño Pulmonar Agudo Relacionado con
la Transfusión”), reacciones no inmunológicas, como las producidas por
contaminación bacteriana del inóculo, transmisión de enfermedades infecciosas,
embolia grasa, hemorragias –en caso de excesiva anticoagulación-, sobrecarga
circulatoria o hipotermia.
36
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Reacciones de tipo inmunológico y no inmunológico se producen también con
la infusión de productos celulares en fresco. Para minimizar estos efectos
adversos, el paciente es sometido a una medicación previa a la infusión (con
hidratación, antihistamínicos y corticoides).
De forma alternativa, las CPH descongeladas pueden ser manipuladas para
reducir el DMSO antes de su infusión (“El Lavado de DMSO”). En teoria, el
lavado de DMSO tiene como ventajas la disminución de la osmolaridad de la
suspensión celular a infundir (la osmolaridad de una suspensión celular con 10%
de DMSO es de 1500 mOsm/L, mientras que la del plasma es de 285 mOsm/L
aproximadamente), reducir la caga de hemoglobina libre (los hematíes se lisan
durante el proceso de descongelación) y detritus celulares, disminuir el volumen
de infusión y principalmente disminuir la toxicidad del DMSO. Como
desventajas está la posible pérdida adicional de CPH producidas durante el
procedimiento de lavado. Las técnicas de lavado automático (ej. Cytomate)
resultan en una recuperación de CPH superiores al 90% con un grado de
eliminación de DMSO superior al 95% lo que resulta en una osmolaridad del
producto lavado similar a la del plasma)
Un aspecto importante a considerar en el procesamiento de las CPH son los
controles analíticos (“Los Controles”) de cualificación de producto, en el
componente tras su obtención y en determinados puntos durante la
manipulación que deben estar previamente definidos. El objetivo es doble, por
una parte determinar la idoneidad del producto para transplante a un paciente
determinado y por otra monitorizar las diferentes técnicas de manipulación
utilizadas. Cada laboratorio debe establecer programas de control de calidad
para cumplir con ambos objetivos. Las recomendaciones mínimas en el
producto previo a su congelación o antes de su infusión serían la realización de
un contaje de células nucleadas, de células CD34+ para determinar la dosis
celular infundida, el hematocrito, para determinar el volumen de hematíes
infundido, la viabilidad de las células infundidas, la determinación del grupo
sanguíneo ABO/Rh (por razones de trazabilidad) y la esterilidad (para
bacterias –aerobias y anaerobias- y hongos).
En todos los diferentes pasos que hemos descrito en esta unidad didáctica, los
componentes celulares deben estar marcados con la etiqueta apropiada. Debe
37
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
existir un procedimiento de etiquetado (“El Etiquetado”) donde se definan las
operaciones para identificar el producto de CPH original en la colección y
cualquiera de las modificaciones adicionales, la revisión del contenido de la
etiqueta y su fijación al contenedor primario que contiene las CPH. De igual
forma, el contenido de la etiqueta debe identificar de forma clara los datos del
paciente, su número de identificación único, los datos del donante y su número
de identificación (en caso de trasplante alogénico), el número de identificación
único del producto, el nombre adecuado del producto, los datos del centro
donde se ha obtenido y donde se ha procesado, y otros datos como se muestra
en la figura 34 (el contenido de la etiqueta viene definido en los estándares, ver
más adelante).
Figura 34.
Ejemplo de etiqueta
para infusión
alogénica y autóloga
que se emplea en la
actualidad en
nuestro laboratorio.
38
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Todos los datos generados durante el procesamiento de las CPH, incluyendo los
controles de calidad deben ser gestionados de forma ideal también de forma
electrónica (“La Base de Datos”). El objetivo es identificar de forma unívoca a
pacientes y productos, facilitar el trabajo con la introducción de los datos
mientras estos se vayan generando, ayudar a la gestión de las técnicas (ej. ayuda
en los cálculos que se tienen que realizar), gestionar los registros (con su
posibilidad de impresión), ayudar en el control del proceso, gestión del
almacenado de los productos criopreservados, facilitar el análisis de los datos,
etc.
Figura 35. Menú principal de la base de datos de nuestro laboratorio, desde donde se accede a cada una de las
etapas del procesado
Todas las técnicas de procesamiento empleadas deben ser asépticas y deben
estar validadas (“Las Validaciones”) con el objetivo de proporcionar una
recuperación y viabilidad aceptables de las CPH. Los aspectos claves de un
proceso de validación son: 1) El protocolo de validación, donde se describe el
proceso o técnica a ser validada, incluyendo los equipos y como se llevará a
cabo la validación, lo que incluye la definición de objetivos, producto y
características del proceso, la descripción de unas especificaciones predefinidas y
39
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
la identificación de factores que determinarán la obtención de resultados
aceptables. 2) El proceso de validación, que es establecer a través de evidencia
documentada, un alto grado de aseguramiento que un proceso específico
producirá de forma consistente un producto que cumple con las
especificaciones predeterminadas y las características de calidad. 3) El método
de validación, que establece, a través de evidencia documentada, un grado alto
de aseguramiento que un método analítico dará de forma consistentes
resultados precisos que reflejan las características de calidad del producto
analizado. De la validación de un procedimiento o técnica resultará en la
definición de parámetros críticos dentro de rangos aceptables que pueden usarse
en última instancia como criterios de liberación o dispensación de un
determinado producto final. La validación no solo afecta a las técnicas de
manipulación, sino a los aspectos del procesamiento incluyendo máquinas,
reactivos, registros, etiquetas, base de datos, etc.
El proceso de validación de una técnica determinada finalizará en la escritura de
la misma (“Los Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT)”), con su
consiguiente registro para cada vez que se usa esa técnica particular (“Los
Registros”). Además, los registros deben cumplir con la misión de mantener la
trazabilidad de un producto determinado desde su donante a su receptor y
viceversa.
La incorporación de nuevas técnicas validadas en la rutina de un centro de
procesamiento requerirá la adecuada formación de los profesionales que la
vayan a realizar (“La Formación”). Cada una de las unidades que forman un
programa de trasplante deben tener un “Plan de Formación” escrito que
establezcla las actividades a desarrollar por dichos profesionales con el objetivo
de asumir la habilidad necesaria para desarrollar una técnica en particular. Una
vez la aptitud sea adquirida y documentada dichos profesionales estarán
capacitados para la realización de dicha técnica (“La Capacitación”). Además,
dichos profesionales deben demostrar de forma periódica su aptitud para
desarrollar dicha técnica (“La Competencia Continuada”).
Durante cualquier etapa desde la comunicación para la obtención de CPH hasta
su suministro para infusión, pueden existir errores, fallo en las máquinas, no
seguimiento de lo escrito en un determinado PNT, accidentes, producto final
que no cumple con sus especificaciones, problemas durante el transporte o
40
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
durante la infusión, etc (“Las Desviaciones”). Debe existir un procedimiento
escrito que defina dichas incidencias, las documente cuando se produzcan y que
establezca los mecanismos para la comunicación de las mismas a las personas
que intervienen el en programa de trasplante (“Procedimiento de incidencias,
errores, accidentes y reacciones adversas”). Cuando se produce una
desviación, deben realizarse las acciones correctoras apropiadas (“Acciones
Correctoras”) y en su caso las acciones preventivas (“Acciones Preventivas”)
para evitar en lo posible que dichas incidencias puedan repetirse.
Todos los aspectos desde las obtención de CPH hasta el suministro de un
producto final para infusión deben estar definidos dentro de una organización
particular y formar una parte de un sistema de gestión de la calidad (“El
Sistema de Calidad”) donde se definan de forma clara las directrices, políticas
y requisitos que se deben satisfacer en una empresa. Formando parte del sistema
de calidad está toda la estructura documental (“Los Documentos”), desde el
Manual de Calidad – que implica a toda la empresa – hasta los procedimientos,
técnicas y registros de un proceso en particular. Formando parte del sistema de
calidad, cada laboratorio debe tener un sistema de aseguramiento de calidad
(“El Aseguramiento de la Calidad”), incluyendo la definición de indicadores
de calidad (“Los Indicadores”) de cada proceso o técnica, que permitan
establecer si un determinado procedimiento o técnica a lo largo del tiempo está
cumpliendo con las expectativas.
De igual forma existen unos estándares (“Los Estándares”) internacionales
diseñados para proporcionar unas guías en el campo del trasplante de CPH
incluyendo la obtención y el procesamiento de las mismas (estándares
CAT/JACIE). De forma reciente, el procesamiento de CPH también está
además regulado (“Las Regulaciones”) por una ley europea (ya transpuesta en
España,
REAL DECRETO 1301/2006).
El trasporte de CPH (material
biológico) está regulado por una directiva de la comunidad europea. Dicha
directiva
puede
consultarse
en
el
siguiente
link:
http://www.cit.gva.es/fileadmin/conselleria/images/Documentos/transportes
/tmercancias/pdf/dir96_86ce.pdf
41
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Desde que un paciente entra en programa de trasplante debe pasar por una serie
de etapas que comienza con la programación por parte de la unidad clínica de la
obtención de las CPH y/o manipulación. En la actualidad, con más frecuencia
los centros de obtención de CPH de sangre periférica y
los centros de
procesamiento están integrados en los bancos de sangre, y puede estar
geográficamente distantes de las unidades clínicas adscritas a los hospitales
donde el paciente será tratado. Esto hace que deba existir una organización
óptima para que un determinado programa de trasplante pueda llevarse a cabo
con las máximas garantías de seguridad y calidad (“La Organización y La
Logística”) y en ocasiones implica a empresas externas (ej. empresas de
transporte). Es importante que dichas empresas tengan experiencia en el campo,
las personas sean debidamente formadas para tal misión y su relación con los
centros de trasplante sea contractual con responsabilidades definidas.
De igual forma, entre las distintas unidades que constituyen un programa de
trasplante (unidad de obtención, unidad de procesado y unidad clínica), debe
existir un documento de acuerdo técnico (“Los Acuerdos”) donde se recojan
los términos de colaboración entre las mismas y se definan las responsabilidades
y compromisos durante todo el proceso, desde la notificación de la recolección
de CPH hasta la distribución/infusión de un producto final para trasplante.
Existen una serie de sociedades internacionales y nacionales especialmente
focalizadas en el ámbito del trasplante hematopoyético y la terapia celular (“Las
Sociedades Científicas”). La web de dichas sociedades se puede consultar en
los siguientes links:
Grupo europeo para el trasplante de sangre y médula (EBMT):
http://www.ebmt.org
Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT):
http://www.celltherapysociety.org
Sociedad Americana de Aféresis (ASFA):
http://www.apheresis.org
Sociedad Española de Hematología y Hemoterapia (AEHH):
http://www.aehh.org
42
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
6.
Bibliografía
-
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S Heilborn A, Kadidlo D, McCullough J. Patient care during infusion
of hematopoietic progenitor cells. Transfusion 2004; 44: 907
43
Unidad didáctica 2:
Terapias consolidadas:
trasplante de islotes
pancreáticos
Dr. Luciano Rodríguez
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia
Celular)
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Islotes Pancreáticos.
4. Diabetes Mellitus tipo 1.
4.1.
Tratamiento
5. Trasplante de islotes pancreáticos.
5.1.
El protocolo de Edmonton.
6. Bibliografía
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1. Introducción
La Diabetes es una enfermedad de elevada prevalencia y graves consecuencias
médicas. En una proporción elevada de casos, los tratamientos clásicos se
vuelven ineficaces o no consiguen estabilizar los pacientes que sufren esta
enfermedad. Ello ha estimulado la investigación no farmacológica, cuyo
exponente mas mediático es la investigación con células madre. No obstante,
mucho antes, hace más de 20 años, se inició una aproximación muy lógica al
problema: El tratamiento mediante el trasplante de islotes pancreáticos.
Actualmente, aunque su práctica no se ha diseminado de manera amplia, es una
alternativa que puede útil en un grupo de pacientes de difícil tratamiento
convencional.
2. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería de ser capaz de:
-
Conocer los aspectos más importantes relacionados con:
o
Las técnicas de procesamiento
o
El trasplante de islotes pancreáticos.
3
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3. Islotes pancreáticos
El páncreas (del griego: todo carne) es una glándula de secreción, tanto exocrina
como endocrina, de forma lobulada situada detrás de la parte inferior del
estómago por su parte más ancha, entre la concavidad del duodeno y el hilio
esplénico, y a la izquierda del abdomen junto al bazo por su cola. Tiene forma
cónica, un peso de entre 50 y 70 g y una longitud que oscila entre 15 y 20 cm, su
anchura es de unos 3,8 cm y su grosor de 1,3 a 2,5 centímetros (el tamaño
aproximado de una mano).
El páncreas produce y segrega insulina, glucagón, polipéptido pancreático y
somatostatina para regular la cantidad de glucosa en sangre. También produce y
secreta enzimas al duodeno que ayudan la digestión de alimentos. Asimismo
secreta grandes cantidades de bicarbonato de sodio para neutraliza el ácido
proveniente del estómago a través del conducto pancreático.
Figura 1
Figura 2
La parte exocrina del páncreas contiene unas glándulas redondas u ovaladas
llamadas acinos serosos y compuestas por células acinosas y centroacinosas. Su
función es básicamente asistir a la digestión de grasas, proteínas y carbohidratos.
Sin los enzimas liberados al intestino delgado por el páncreas, estos alimentos
pasarían por los intestinos sin ser absorbidos. La glándula exocrina y los
conductos de liberación al intestino representan Más del 95 % de las células del
páncreas.
4
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
La parte endocrina de este órgano representa 1 gramo de peso del total de un
páncreas y se agrupa en los islotes de Langerhans (2.5 -106 por páncreas). Estos
“micro órganos” se ven en una histología normal como grupos celulares de
tonos pálidos en un inmenso tejido exocrino oscuro, tienen un diámetro de 150
µm y son más numerosos en la zona de la cola del páncreas.
En los islotes se encuentran distintos tipos celulares especializados:
-
Las células beta son del 60 al 90 % del total y producen insulina
(disminuye los niveles de glucosa sanguínea).
-
Las células alfa producen glucagón (eleva el nivel de glucosa en la
sangre), se distribuyen de forma periférica y representan entre el 10 y el
20% del volumen del islote.
-
Las células delta producen somatostatina (inhibe la secreción de
insulina y glucagón).
-
Las células γ producen y liberan polipéptido pancreático).
Figura 3
5
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 4
Figura 5
4. Diabetes Mellitus tipo 1
La diabetes mellitus tipo 1 (diabetes insulino-dependiente o juvenil) es una
enfermedad autoinmune en la que el organismo es incapaz de producir insulina,
provocando la permanencia constante de glucosa en cantidades superiores a las
normales en sangre. Esta enfermedad aparece, generalmente, en personas de
menos de 30 años aunque puede ocurrir a cualquier edad, esta es una
enfermedad de por vida para la cual aún no existe cura.
6
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 6
El proceso de desarrollo de la diabetes tipo 1 es gradual, pudiendo ser
necesarios varios años antes de su manifestación clínica. La enfermedad se
desarrolla por el ataque del sistema inmune contra las propias células beta del
páncreas, encargadas de producir la insulina. En este proceso intervienen
múltiples factores: existe primero una susceptibilidad o predisposición genética
con la que se han relacionado varios genes y parece necesario que ocurra un
factor desencadenante ambiental (infección viral, estrés, toxinas, etc.), tras el
cual, aparece el ataque inmunológico frente a las propias células beta que son
destruidas.
Existe reacción inmunológica mediada por anticuerpos (reacción humoral) y
células (reacción celular), habiéndose detectado autoanticuerpos frente a
proteínas presentes en la superficie de las células beta como la descarboxilasa
del ácido glutámico (GAD). Otros anticuerpos incluyen los IA2, dirigidos
contra una fosfatasa presente en el interior de las células beta y anticuerpos
contra la propia insulina. Estos anticuerpos pueden ser detectados en el suero
de los pacientes meses y años antes del desarrollo de la enfermedad, y se han
convertido en marcadores de un estado conocido como prediabetes.
7
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
La destrucción progresiva de las células beta reduce la capacidad reproducir
insulina, y sin suficiente insulina, la glucosa se acumula en el torrente sanguíneo
en lugar de penetrar en las células. El cuerpo, a pesar de los altos niveles de
glucosa en el torrente sanguíneo, es incapaz de utilizarla como energía, lo que
lleva a que aumente el apetito. Los altos niveles de glucosa en la sangre hacen
que el paciente orine más, lo que a su vez causa sed excesiva. En un lapso de 5 a
10 años después del diagnóstico, las células beta del páncreas productoras de
insulina están completamente destruidas y el cuerpo ya no puede producir más
insulina. Los síntomas generalmente son severos y se desarrollan con rapidez.
Figura 7
4.1
Tratamiento de Diabetes tipo1
Las personas que carecen de insulina no pueden procesar la glucosa como
fuente de energía, y cuando la glucosa no está disponible, la grasa corporal es
descompuesta en su lugar. Los subproductos del metabolismo de las grasas, las
cetonas se acumulan en la sangre. Cuando la sangre se vuelve más ácida que los
tejidos del organismo, se presenta una afección llamada cetoacidosis. Al mismo
tiempo, los niveles de glucosa se elevan, generalmente por encima de los 300
mg/dL, por que el hígado produce más glucosa para tratar de combatir el
problema de que las células no puedan absorber ese azúcar.
8
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
En el momento del diagnóstico de la diabetes tipo 1, los objetivos inmediatos
son tratar la cetoacidosis diabética (también denominada coma diabético) y los
altos niveles de glucosa sanguínea. Debido a la aparición súbita y gravedad de
los síntomas en la diabetes tipo 1, el tratamiento para las personas
diagnosticadas recientemente puede implicar la hospitalización.
Los objetivos a largo plazo del tratamiento son prolongar la vida, reducir los
síntomas y prevenir complicaciones relacionadas con la diabetes tales como
ceguera, insuficiencia renal y amputación de extremidades. Estos objetivos se
logran por medio de educación, uso de insulina, control riguroso de la ingesta,
control de peso, ejercicio y un autocontrol atento y vitalicio de los niveles de
glucosa en sangre. Alternativamente, el trasplante de islotes pancreáticos se ha
definido como una terapia útil en el tratamiento de esta enfermedad.
Hay gran expectativa por el trasplante de islotes pero esta técnica no está
disponible en todo el mundo, ni siquiera en modo experimental, aunque se ha
demostrado que independiza de la insulina a los trasplantados. Además, aún en
países con muchos donantes, como España, no hay número suficiente para
hacer frente a la demanda porque hay unos cien mil pacientes afectos de
diabetes Tipo 1 y hay 1350 donaciones por año. Asimismo, cada año se suman
dos mil pacientes menores de treinta años y se necesitan por lo menos dos
páncreas para lograr éxito con un paciente.
5. Trasplante de Islotes pancreáticos
Después de varios años de evolución de la enfermedad, un porcentaje de los
pacientes, y dependiendo del control metabólico que hayan tenido, puede
presentar complicaciones secundarias como retinopatías (llevando a la ceguera),
neuropatía periférica (resultando principalmente en pérdida de sensibilidad en
los miembros inferiores), nefropatía (diálisis), micro y macroangiopatía
(amputaciones) así como un aumento del riesgo cardiovascular. La incidencia de
estas complicaciones está relacionada estrechamente con los episodios repetidos
de hiperglucemia.
9
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Así, el objetivo terapéutico del trasplante de páncreas es diferente según el
momento en el que se realice. En pacientes que ya se encuentran en diálisis, la
mejor opción es el trasplante simultáneo de páncreas entero y riñón, mientras
que los que aún no presentan complicaciones, o están en una etapa incipiente se
beneficiarían con un trasplante de islotes pancreáticos. El trasplante de islotes
pancreáticos puede otorgar todos los beneficios del trasplante de órgano entero,
con mucho menor riesgo asociado porque el trasplante de páncreas entero es
una cirugía de alta complejidad.
Aunque los potenciales beneficios del trasplante de islotes pancreáticos fueron
demostrados por Paul Lacy (Universidad de Minnesota) hacia comienzos de
1970, el trasplante en pacientes no logró responder a las grandes expectativas
que se habían creado porque, básicamente, no existían en ese momento
protocolos de inmunosupresión adecuados y la cantidad de islotes trasplantados,
en la mayoría de los casos, resultaba insuficiente. En cuanto a la
inmunosupresión, una de las dificultades que se presentaba era que estas mismas
drogas, en especial los corticoides, podían causar daño en las células
trasplantadas. En el año 2000 la respuesta a estos problemas llegó desde la
Universidad de Alberta (Edmonton, Canadá), donde se desarrolló el conocido
método de trasplante “Protocolo de Edmonton”
5.1
El protocolo de Edmonton
El Protocolo de Edmonton combina el uso de enzimas especializados para la
disgregación del tejido pancreático y utiliza un régimen de inmunosupresión sin
esteroides que incluye sirolimus (Rapamune), bajas dosis de tacrolimus (Prograf)
y dacluzimab (Zenapax) así como anticuerpos anti receptor de IL2. Este
protocolo consistió en trasplantar a pacientes diabéticos insulinodependientes,
jóvenes y sin falla renal, pero con dificultades para mantener la glucemia a pesar
de las múltiples aplicaciones diarias de insulina, islotes pancreáticos obtenidos
de páncreas de donante cadáver.
Este método utiliza enzimas especiales durante la extracción de islotes del
páncreas del donante y no emplea glucocorticoides para la inmunosupresión, así
se pueden trasplantar un promedio de 11500 islotes por Kg. de peso corporal
del paciente. Para la inmunosupresión se utilizó una combinación de drogas a
10
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
dosis menores que las empleadas para el trasplante de otros órganos y los
pacientes tratados requirieron entre 2 y 4 trasplantes secuenciales de islotes.
Actualmente permite pasar del 13% al 85% de independencia del uso de
Insulina para regular la glucemia durante 2 años post-trasplante. Los páncreas se
obtienen de donantes multiorgánicos y se logran entre trescientos mil y
ochocientos mil islotes por cada páncreas. Los islotes se inyectan en el hígado
del receptor y se puede hacer en fresco o después de uno o un par de días de
cultivo en laboratorio.
Figura 8
Durante el proceso los islotes son aislados, purificados y transferidos al receptor.
Una vez implantados las células beta comienzan a producir y liberar insulina
aunque la funcionalidad completa de los islotes y su vascularización lleva tiempo.
A causa de la labilidad de los islotes el trasplante se realiza en la mayoría de los
casos en el menor tiempo posible y el paciente recibe una dosis media de 104
islotes por Kg de peso. El trasplante es realizado a menudo por radiólogos que
utilizan rayos x y ultrasonidos para guiar el catéter que introduce las células en el
receptor.
11
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 9
Los pasos de aislamiento y purificación en el trasplante de islotes pancreáticos
se realizan mediante la digestión del tejido endocrino del exocrino en la cámara
de Ricordi y se utiliza colagenasa o liberasa (conjunto de isoformas I y II de
colagenasa y termolisina altamente purificadas y de bajo contenido en
endotoxina) conjuntamente con un homogenizador (cámara Recordi) que
realiza una disgregación mecánica. Posteriormente se realiza la Purificación de
los islotes mediante separación en gradiente de densidad utilizando Ficoll,
dextrano o algún otro gradiente de densidad no iónico.
Figura 10
12
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Los pacientes candidatos a trasplante de islotes (sin trasplante simultáneo de
riñón) deben reunir estas características: Edad entre 18 y 65 años. Diabetes tipo
1 (insulinodependiente) con más de 5 años de diagnóstico de la enfermedad.
Labilidad metabólica, con severas variaciones glucémicas a pesar de haber
estado bajo un régimen estricto de tratamiento con insulina. Aparición de
complicaciones progresivas, que no pudieron ser evitadas o detenidas por el
tratamiento previo con insulina. Función renal normal.
Quedan varios desafíos por delante. Uno de ellos es optimizar los métodos de
obtención de islotes de tal manera que un sólo páncreas sea suficiente para
alcanzar la insulinoindependencia. Sin embargo, debido a la escasez de donantes
de órganos, aun cuando el objetivo anterior pudiera lograse, no habría
suficientes páncreas para trasplantar a todos los potenciales candidatos. Es
posible que la solución provenga del cultivo de islotes pancreáticos a partir de
células pluripotenciales o madre o de órganos de otra especie.
El rechazo post-trasplante sigue siendo la principal causa de pérdida de las
células trasplantadas y para evitarlo se utiliza medicación inmunosupresora. Pero
debido a que baja las defensas de los pacientes, éstos se hallan más expuestos a
infecciones. Por lo tanto, otro de los desafíos futuros será lograr que las células
trasplantadas sean aceptadas por el receptor, creando tolerancia a las mismas,
con mínima o ninguna inmunosupresión. A diferencia de las estrategias
convencionales, en las cuales se interviene sobre el sistema inmune del receptor,
se buscaría modificar las células antes de ser trasplantadas para hacerlas menos
antigénicas.
Otra alternativa que está siendo explorada es la de proteger los islotes dentro de
cápsulas. Las más serias limitaciones a este último método consisten en que las
cápsulas, una vez trasplantadas, se recubren de un tejido fibroso que dificulta el
ingreso de oxígeno y nutrientes para los islotes, los cuales pierden vitalidad en
un plazo relativamente corto. Además esta aproximación es económicamente
poco viable y no demostrado buenos resultados en modelos animales.
En todo el mundo se están realizando numerosos esfuerzos abocados a resolver
los problemas planteados en esta clase. Por el momento, el Protocolo de
Edmonton ha demostrado que el trasplante de islotes es capaz de lograr
insulinoindependencia sin los temidos riesgos de la inmunosupresión, aunque
13
Para conocer el estado
actual del tema:
Balibrea del Castillo, JM y
cols. Estado actual del
trasplante de islotes pancreáticos
Disponible en:
http://www.aecirujanos.es/
revisiones_cirugia/2007/
Abril2_2007.pdf
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
hará falta algo más de tiempo para comprobar que también se podrían prevenir
las complicaciones secundarias de la diabetes.
6. Bibliografía
1. AABB: Technical manual, 15th ed.. American Association of Blood
Banks 2005.
2. Estándares de Acreditación en Transfusión Sanguínea. CAT 3ª ed.
2006. Capítulo 6: Transfusión de componentes sanguíneos
3. BOE nº 255 del 20/09/2005: Real Decreto 1088/2005 del 16-de
Septiembre por el que se establecen los requisitos técnicos y
condiciones mínimas de la hemodonación y de los centros y servicios
de transfusión.
4. Guía práctica de medicina transfusional. M. Petrides, G. Stack. Edición
Española 2005.
5. Guía sobre la transfusión de componentes sanguíneos y derivados
plasmáticos. SETS 3ªed. 2006
6. Guidelines for compatibility procedures in blood transfusion
laboratories. Transfusion Medicine 14(1): 59-73, 2004
Sitios Web
1. Página web de la Sociedad Española de Transfusión Sanguínea:
www.sets.es
2. Página web de la Nacional Health and Medical Research Council:
www.nhmrc.gov.au
3. Guias de la British Committee for standards in Haematology:
www.bcshguidelines.com
4. Página con información muy útil sobre medicina transfusional:
www.hemoterapiamedicos.net
14
Unidad didáctica 3:
Ingeniería tisular
Dr. Joan García López
Banc de Sang i Teixits. Hospital de la Vall d’Hebrón.
Barcelona
Dr. Jordi Joan Cairó
Departamento de Bioingeniería. Facultad de Ingeniería
Química. Universidad Autónoma de Barcelona
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Concepto de ingeniería tisular
4. Características físicas de los tejidos y sus matrices
5. Elementos de la ingeniería tisular
6. Células madre
7. Matrices y polímeros biocompatibles
8. Factores de crecimiento, diferenciación y angiogénesis
9. Potencial terapéutico de la ingeniería tisular y aplicación clínica
10. Bibliografía
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1. Introducción
La Ingeniería Tisular es un campo de investigación dentro de la medicina
regenerativa que utiliza células, matrices, factores de crecimiento y
diferenciación y biorreactores para la obtención de un tejido vivo,
tridimensional y fisiológicamente funcional, para su trasplante en tejidos
enfermos o dañados.
2. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería:
-
Conocer la importancia de la ingeniería tisular en el ámbito de la
medicina regenerativa.
-
Ser capaz de definir los conceptos básicos.
-
Conocer los 4 pilares en que se basa la ingeniería tisular: las células
madre, los biomateriales biocompatibles, los factores de crecimiento y
diferenciación y, finalmente, los biorreactores de cultivo, que permiten
el mantenimiento de las variables fisicoquímicas óptimas durante el
proceso de generación del tejido.
3
Lectura
Consultar el documento del
Directorate for Engineering of the
National Science Foundation,
Emergence of Tissue Engineering,
Final Report, el documento de
Lavik y Langer 2002, y el
documento Regenerative
Medicine del National Institute of
Health (Referencias 1, 2 y 3 de
la bibliografía)
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3. Concepto de ingeniería tisular
Esta área nueva de la medicina surge, en su concepción inicial, como
consecuencia de la necesidad y desequilibrio existente entre la demanda y la
oferta de órganos para el trasplante. Actualmente en esta disciplina se aplican
principios y métodos de ingeniería y ciencias biomédicas para obtener
información relevante sobre las relaciones de estructura-función en tejidos con
alguna patología y el desarrollo de sus substitutos para remplazar, restablecer,
reparar, regenerar, reconstruir, mantener o mejorar la función tisular afectada.
Para ello se presupone que las células, cultivadas en un ambiente tridimensional
y fisicoquímico adecuado, serán capaces de organizarse en un tejido que se
asemeje al máximo al tejido original. Por tanto, esta disciplina intenta reproducir
un tejido ex vivo que se parezca lo más posible al original (Figura 1). La génesis
de estos tejidos in vitro ha de ser rápida, para evitar los procesos de reparación
propios del cuerpo humano, ya que tienden a cicatrizar la zona afectada sin
conservar las características estructurales y funcionales originales.
Figura 1
4
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
4. Características físicas de los tejidos y sus matrices
En el cuerpo humano encontramos alrededor de un trillón de células, que
conforman los aproximadamente 260 fenotipos de los más de 100 tejidos que
configuran un organismo humano.
Entre los más importantes para la ingeniería tisular están el hueso, el cartílago,
los tendones y ligamentos, la piel, el músculo, los vasos sanguíneos, el miocardio
y válvulas cardíacas, la córnea, el oído, los nervios periféricos, la espina dorsal, el
hígado, el riñón, el páncreas, la vejiga, la tráquea, los pulmones, el esófago,
estomago e intestinos, los órganos genitales y las encías y dientes.
Las características citológicas, histológicas, funcionales y estructurales de cada
uno de ellos son completamente diferentes, por lo que su génesis requiere de
multitud de combinaciones, básicamente de 4 elementos esenciales: células,
matrices extracelulares, factores de crecimiento y/o diferenciación y un entorno
fisicoquímico ex vivo.
5. Elementos de la ingeniería tisular
La base de la ingeniería tisular radica en la combinación de las células adecuadas,
con un elemento arquitectural que permita la generación de la estructura
tridimensional, el cual debe tener unas propiedades muy determinadas de
composición química y de respuesta mecánica. Todo ello debe permitir la
generación del tejido en un entorno fisicoquímico muy controlado. La correcta
elección de las fuentes celulares, de las matrices tridimensionales y los sistemas
artificiales donde deben alojarse y como deben estimularse fisicoquímicamente
las células son la base de la ingeniería tisular (Figura 2).
5
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 2
6. Células madre
La utilización de células en ingeniería tisular es un campo en constante
evolución. Como premisa para la regeneración de muchos tejidos, la cantidad de
células requeridas hace necesario su expansión en condiciones y cantidades
suficientes para su utilización a partir de la fuente de extracción.
Las principales fuentes celulares utilizadas en ingeniería tisular van desde células
diferenciadas a células progenitoras y células madre (stem cells). Actualmente,
muchos de los trabajos se llevan a cabo con células madre adultas obtenidas de
diferentes fuentes del propio paciente. La percepción actual es que las tanto las
células madre embrionarias y las adultas serán los pilares en los que se basará la
ingeniería tisular del futuro (Figura 3), dado que las células diferenciadas, en
general, no pueden expandirse in vitro.
6
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 3
En cualquier caso, las células madre adultas (autólogas o heterólogas) son los
candidatos preferidos en la actualidad para llevar a cabo los estudios de
ingeniería tisular. Esas células tienen la capacidad de duplicarse ex vivo, así como
la capacidad de diferenciarse y especializarse mediante la adquisición de las
características y funciones específicas de las células adultas (multipotencia). A
diferencia de las células embrionarias, su obtención es difícil, ya que sólo
conforman un porcentaje muy bajo de las células totales del tejido fuente (entre
un 0,01 y un 0,001%). Entre ellas cabe destacar las hematopoyéticas (médula
ósea), las neuronales (cerebro), las epidérmicas (piel), y las progenitoras
mesenquimales (médula ósea, tejido graso, cartílago…).
Quizá las más interesantes para ingeniería tisular son las progenitoras
mesenquimales. Estas se distinguen por sus antígenos específicos de superficie,
los receptores específicos de citocinas y factores de crecimiento así como la
producción específica de citocinas y factores de crecimiento propios y
moléculas de la matriz extracelular.
Se ha probado experimentalmente su diferenciación a adipocitos, condrocitos,
osteoblastos, tenocitos, estroma, músculo esquelético, músculo liso, músculo
cardíaco, y a astrocitos, oligodendrocitos y neuronas.
La fuente mejor estudiada de células mesenquimales es la médula ósea, pero se
pueden obtener de músculo, cartílago, tendón, tejido adiposo y vascular, así
7
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
como de la placenta y cordón umbilical. La fuente de obtención es uno de los
elementos más críticos para la ingeniería tisular. Es obvio que su obtención de
tejidos como el graso es simple, segura, indolora y quizá una de las fuentes
preferidas, pero cada tipo de fuente presenta unas peculiaridades diferenciales,
ya que en función del origen pueden ser más eficientes para un tipo de
diferenciación con respecto a otros.
7. Matrices y polímeros biocompatibles
Diseño y arquitectura tisular. (Consultar el documento del Tissue Engineering
Research del International Technology Research Institute (WTEC), el documento de
Lavik y Langer 2002 y el documento Regenerative Medicine del National Institutes of
Health)
Como se ha comentado, el material para la construcción tridimensional del
tejido es de vital importancia en ingeniería tisular. Las características
arquitecturales, de composición y mecánicas son críticas en la creación del
nuevo tejido.
Las células deben adherirse, proliferar (si es el caso) y diferenciarse en su
interior. Deben tener una buena red interconectada de poros para la
transferencia de nutrientes y eliminación de subproductos. Deben ser
moldeables para poder guiar la forma y estructura del nuevo tejido. Deben ser
biodegradables y absorbibles en tasas controladas que coincidan con la
formación del tejido in vivo e in vitro, de manera que permitan a éste generar su
propia matriz extracelular. Sus propiedades mecánicas (compresible, tensil,
flexible, elástica, no deformable) son de vital importancia según el tejido a
mimetizar. Deben ser biocompatibles, de nula toxicidad y mínimamente
inmunogénicos.
Respecto a su naturaleza y composición, se han usado multitud de compuestos
para generar la matriz en función del tejido a regenerar:
Los metales y materiales cerámicos (como la hidroxiapatita, Figura 4) se han
utilizado con éxito en el tejido óseo en aplicaciones ortopédicas, pero no se
8
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
pueden utilizar en otros tejidos. Los materiales poliméricos, tanto naturales
como sintéticos, han sido los más empleados en todas las aplicaciones descritas.
Figura 4
Los polímeros naturales incluyen colágeno (Figura 5), matrigel, agarosas,
alginatos, ácido hialurónico, elastina, laminina, gelatina y fibrina. Tienen
importantes limitaciones en cuanto a sus propiedades mecánicas y sobre todo a
su tasa de reabsorción.
Figura 5
Los polímeros artificiales tienen un abanico mucho más amplio de manipulación
de sus propiedades mecánicas y químicas. Los no degradables como el teflón y
el polietileno se han utilizado de manera muy restringida en regeneración
vascular e implantes.
Los degradables ocupan una posición muy importante en la ingeniería tisular.
Los ácidos poliláctico (PLA), poliglicólico (PGA) y sus copolímeros (PLGA)
han sido de los más utilizados (Figura 6), sobretodo por estar aprobados por la
FDA. Junto a éstos, los polialcanoatos (poli-4-hidroxibutirato) y las
policaprolactonas, son también los preferidos en procesos de regeneración
tisular. Existen, además, todo un conjunto de polímeros que van adquiriendo
gran
importancia
en
este
área,
como
los
poliaminoácidos,
el
polipropilenfumarato, los poliortoésteres, los polianhídridos, las polidioxanonas
y los polifosfazenos.
9
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 6
La manera de realizar la polimerización también es de especial importancia en la
elaboración de la matriz y en sus características fisicoquímicas finales. Como
premisa general, la inclusión de las células debería ir asociada a la polimerización,
pero muchos métodos de polimerización son letales para las células, de manera
que el polímero debe ser colonizado posteriormente a la elaboración del mismo.
La polimerización puedes ser física (temperatura, presión, separación de fases,
disolución, fotopolimerización láser o eléctrica) química (formación de enlaces
iónicos, covalentes) y se pueden obtener o bien hidrogeles, cuando el material
de partida es hidrosoluble, o esponjas, donde el material es soluble en medios
orgánicos y éste es retirado y eliminado totalmente al final del proceso.
Actualmente, para la polimerización y obtención de la forma y arquitectura
requerida se utilizan técnicas de prototipado rápido y de impresión
tridimensional asistidos por modelos CAD/CAM que pueden producir
estructuras 3-D con resoluciones de hasta 200 micras (con aparatos parecidos a
impresoras de tinta muy sofisticados)
8. Factores de crecimiento, diferenciación y angiogénesis
Tanto en las etapas de expansión de células madre (donde mayoritariamente se
utilizan factores de crecimiento en forma de sueros fetales bovinos como sueros
humanos tanto autólogos como heterólogos), como en las de diferenciación en
las matrices, es necesaria la utilización de factores de crecimiento y
10
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
diferenciación que también suelen ser específicos de cada célula y tejido a
obtener.
Otro de los apartados fundamentales en la generación de tejidos, y en concreto
de los vasculares (que son la mayoría), radica en el proceso de vascularización o
angiogénesis que debe garantizar la llegada futura de nutrientes una vez
transplantado el tejido.
Entre la gran cantidad de estos factores destacan todas las familias del factor de
crecimiento fibroblástico (FGF), del factor de crecimiento epidérmico (EGF),
del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), las IGFs (Insulin e
Insulin like growth factors), diversas interleucinas (ILs), interferones, así como todo
un conjunto de vitaminas y hormonas no peptídicas.
También hay que añadir los factores de angiogénesis y vascularización y los de
morfogénesis ósea (BMPs) entre la multitud de substancias biológicas que se
utilizan para la expansión y diferenciación en Ingeniería Tisular.
Tanto para la obtención de cantidades suficientes de células madre como para la
elaboración del tejido, el entorno controlado en el que debe llevarse a cabo el
proceso implica el uso de biorreactores que varían en su sofisticación en
función del producto final que se pretende obtener.
El biorreactor proporciona un ambiente adecuado para expandir y proliferar las
células, para promover la colonización de los polímeros en los que no se han
co-polimerizado las células y para hacer el crecimiento-diferenciación y
estimulación fisicoquímica (mecánica o eléctrica según el tejido) de los tejidos
de nueva construcción.
El reactor se diseña en función de las necesidades de cada célula-tejido para que
no exista limitación en la transferencia de materia o energía en los procesos de
ingeniería tisular. Por otra parte garantizan la esterilidad y calidad durante todo
el proceso de reconstrucción tisular.
Normalmente en ellos se monitorizan y/o controlan la temperatura, el pH, la
concentración de oxígeno y CO2, diversos nutrientes, factores de crecimiento y
diferenciación, etc. Por otra parte, en el biorreactor se emplazan también los
11
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
elementos de estimulación mecánica, que permiten la orientación correcta de la
matriz extracelular bajo esfuerzos mecánicos y la estimulación eléctrica en
tejidos como los musculares y el neuronal.
Los biorreactores pueden ser discontinuos, donde se realiza una carga de
células-tejido y medio al inicio del proceso, semicontinuos, donde hay entrada
continua de nutrientes pero no salida, y perfundidos, donde hay una entrada y
salida constante de nutrientes del sistema. La agitación también determina el
tipo de biorreactor, pudiéndose distinguir los que son estáticos de los agitados
(Figura 7). Los agitados utilizan sistemas mecánicos, sistemas pendulares, ejes de
agitación acoplados a turbinas o bien rotación del reactor o elementos externos
que producen un efecto similar al oleaje.
Figura 7
La utilización de elementos de monitorización es recomendable pero encarece y
sofistica mucho el reactor. En cuanto a los materiales que los conforman, se
encuentran según la aplicación desde metálicos, pasando por vidrio a materiales
plásticos.
9. Potencial terapéutico de la ingeniería tisular y aplicación clínica
Actualmente, en mayor o menor medida, la ingeniería tisular se utiliza para
aplicaciones en obtención de piel artificial, substitución/regeneración de
cartílago, tendón, ligamentos y hueso, sustitución de córnea y también en
12
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
odontología. Las perspectivas futuras son muy esperanzadoras, dada la variedad
de tejidos del cuerpo humano, citados con anterioridad, y reportados
ampliamente en el material de lectura, susceptibles de ser mimetizados mediante
Ingeniería Tisular.
10. Bibliografía
1. Directorate for Engineering of the National Science Foundation,
Emergence of Tissue Engineering, Final Report,
2. Lavik y Langer, 2002
3. Regenerative Medicine (National Institutes of Health)
Estos documentos estarán disponibles en el
apartado
de recursos
correspondiente a la UD3.
13
Unidad didáctica 3:
Inmunoterapia
Dr. Ramón Gimeno
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia Celular
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Enfermedades de base inmune
4. El sistema inmune como red
5. Inmunoterapia
5.1
Anticuerpos
5.2
Adyuvantes
6. Inmunoterapia celular
7. Bibliografía
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1. Introducción
El desarrollo de la inmunología como especialidad y el advenimiento, en los
últimos años, de tecnologías que permiten analizar e incluso separar células
antígeno-específicas ha permitido concebir y poner a punto novedosas
estrategias terapéuticas, algunas de las cuales ya se han llevado a la práctica con
éxito para tratar infecciones o tumores. A pesar de ello, y debido a su enorme
complejidad, distan mucho de ser terapias consolidadas, por lo que las hemos
incluido en la categoría de experimentales. En esta clase se analizarán los
principios básicos de esta prometedora disciplina, que se complementarán con
ejemplos prácticos.
2. Objetivos
Hay tres ideas fundamentales que deben asimilar los alumnos:
-
La inmunoterapia tiene carácter funcional.
-
Es un tipo de terapia que exige una cualificación muy elevada por parte
del personal médico tanto para su aplicación como para la evaluación
de su eficacia.
-
La inmunoterapia celular no es una técnica de primera elección. La
decisión de emplearla debe ser consensuada entre los diferentes
profesionales que atienden al enfermo y los inmunólogos del centro.
3
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3. Concepto
Conjunto de procedimientos destinados a restaurar de forma terapéutica el
funcionamiento normal del sistema inmune.
El sistema inmune tiene como función preservar la integridad del organismo
mediante la eliminación de elementos potencialmente dañinos, ya sean
microbiológicos o de cualquier otra naturaleza.
A efectos didácticos podemos considerar que el sistema inmune está dividido en
dos grandes sistemas. La inmunidad innata y la inmunidad adquirida o específica,
cada una con sus componentes y sus mecanismos de actuación. La realidad es
que estos dos sistemas actúan de forma coordinada y a menudo interrelacionada.
4. Enfermedades de base inmune
Con respecto a la inmunopatología podemos considerar dos grandes grupos:
-
Enfermedades causadas por la falta de respuesta del sistema inmune, y
-
Enfermedades causadas por una reactividad excesiva del sistema
inmune.
La primera categoría incluye las inmunodeficiencias, que pueden ser primarias,
de origen genético y las secundarias a otros procesos. Entre las primeras
podemos encontrar inmunodeficiencias que por el defecto genético afectan
exclusivamente a un componente celular o inmunodeficiencias más complejas
que
afectan
a
más
componentes
celulares.
También
podemos
ver
inmunodeficientes más específicas del sistema innato y otras que afectan de
forma preferente a la inmunidad adquirida.
Las inmunodeficiencias secundarias no suelen ser tan específicas dando son
cuadros mas generales. Una situación particular se da en casos en los que el
sistema inmune no actúa aunque no exista ninguna alteración detectable. Es el
caso de los tumores. El sistema inmune dispone de linfocitos que pueden
reconocer diversos antígenos tumorales Sin embargo, el tumor es un tejido
4
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
propio y por tanto el sistema inmune no considera que sea algo nocivo y que
haya que eliminar. Los mecanismos que previenen este ataque son múltiples
yendo desde la baja afinidad de los receptores a la secreción por parte de las
células tumorales de sustancias que previenen la activación de los linfocitos T.
En el otro extremo se encuentran las enfermedades causadas por la reactividad
excesiva del sistema inmune. Aquí también podemos distinguir varios escenarios.
Las enfermedades autoinmunes están causadas porque el sistema inmune ha
perdido la capacidad de distinguir entre lo que le es propio y lo que no.
Consecuentemente ataca estructuras propias. Aquí distinguimos enfermedades
que están más restringidas a un órgano, como la diabetes y otras de afectación
más sistémica como el lupus.
En las enfermedades de base alérgica lo que ocurre es que hay una reacción
excesiva hacia a antígenos frente a los que la mayoría de la población reacciona
de forma moderada.
5. El sistema inmune como red
De una forma muy simplista, y centrándonos en la inmunidad específica
podríamos explicar la respuesta inmune de forma secuencial. Existen células que
captan el antígeno allá donde se encuentre, lo procesan y lo presentan a los
linfocitos T en los órganos linfoides secundarios. Los linfocitos T, ya sean CD4
o CD8, se activan y sufren un proceso madurativo cuya fase final es la
adquisición de una serie de funciones que les permiten eliminar los agentes
nocivos bien directamente o bien modulando la actuación de otras células.
En realidad todos los elementos, celulares y solubles del sistema inmune actúan
de forma interrelacionada y sujetos a unos mecanismos de regulación muy
delicados. En la diapositiva se ejemplifica este hecho con unas ilustraciones que
intentan reflejar la actuación de las células CD8 con capacidad reguladora y la
existencia de relaciones entre el sistema innato y el adaptativo mediadas por las
células dendríticas.
5
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Esta complejidad se traduce en una consideración conceptual que se ha de tener
muy presente desde el punto de vista terapéutico. La inmunoterapia celular trata
de restaurar equilibrios, es por tanto una terapia funcional y no una mera
infusión de células. A este respecto los avances en el campo de la inmunología
permiten hacer un seguimiento de la efectividad de la actuación que se deben
realizar como complemento de la administración del producto terapéutico.
6. Inmunoterapia
Dejando a un lado los tratamientos farmacológicos clásicamente se ha
distinguido entre inmunoterapia pasiva y activa. En el primer caso son los
productos finales de la respuesta inmune los que se transfieren a los pacientes
mientras que el objetivo de la inmunoterapia activa es que el propio organismo
reaccione y elimine o neutralice al agente nocivo. Actualmente se han añadido
aproximaciones más enfocadas a la inmunomodulación de la respuesta. En el
siguiente cuadro aparecen algunos ejemplos de inmunoterapia, algunos ya en
uso clínico y otros todavía en experimentación.
•
Vacunas (toxinas, patógenos muertos o atenuados, DNA)
•
Adyuvantes
•
Anticuerpos (IVIG, anticuerpos humanizados)
•
Citocinas o antagonistas de sus receptores (anti-TNF)
•
CTLA4-Ig
•
Terapia Celular (Células T específicas,…)
•
Péptidos antagonistas del TCR
•
Inducción de tolerancia oral
6
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Anticuerpos
En el mercado podemos encontrar preparados de inmunoglobulinas purificados
a partir del suero de animales inmunizados frente a determinadas toxinas o
agentes
infecciosos
y
preparados
de
inmunoglobulinas
humanas
de
administración intravenosa que tienen un efecto inmunosupresor y que se
emplean para frenar una respuesta inmune exacerbada (síndrome de GuillainBarré).
También se pueden encontrar anticuerpos monoclonales dirigidos frente a
diversas estructuras. Inicialmente estos anticuerpos eran de origen murino, y por
tanto el organismo reaccionaba contra ellos y pronto dejaban de ser funcionales.
Con el tiempo partes de estos anticuerpos se han ido sustituyendo por las
porciones equivalentes en humanos y ahora se habla de anticuerpos
humanizados, que son menos inmunogénicos. Ejemplos de estos anticuerpos
son el Rituximab dirigido frente al CD20 que se usa en el tratamiento de
algunos tipos de linfoma o el infliximab, un anticuerpo dirigido frente al TNF
que se usa en la enfermedad de Crohn y otras enfermedades inflamatorias.
Algunos de estos anticuerpos se emplean conjugados a toxinas o radiooisótopos
para potenciar sus efectos.
La vacunación es la forma más eficaz de inmunoterapia.
Las fuentes de antígeno y las vías de administración son muy diversas. Se
pueden utilizar organismos vivos atenuados, microorganismos muertos,
fragmentos subcelulares o toxinas. El empleo de la biología molecular ha
permitido sintetizar pequeños fragmentos peptídicos o genes enteros que se han
utilizado para la producción industrial de vacunas altamente eficaces como la
vacuna frente a la hepatitis B.
Una fase más en el desarrollo de vacunas, utilizando también la tecnología del
ADN recombinante, es la producción in situ, en el propio organismo, de grandes
cantidades de antígeno. Para ello el gen de interés se clona en un vector que se
inyecta en la proximidad de un ganglio linfático y allí se replica y con él el
antígeno. Una variante de esta técnica utiliza el ADN correspondiente al
7
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
antígeno de interés sin necesidad de un vector en el que se pueda replicar,
inyectándolo directamente. En otras ocasiones los vectores van a ser las propias
células del enfermo, inyectando células tumorales como fuente de antígeno o
células dendríticas preparadas para expresar los antígenos de interés. Ya sea
frente a antígenos correspondientes a microorganismos o tumorales, en los
casos anteriores se pretende establecer una respuesta frente a un agente nocivo,
en las vacunas antialérgicas, el objetivo es cambiar el tipo de respuesta que el
paciente da frente a un alergeno, de una respuesta predominantemente humoral,
con producción de IgE y liberación de mediadores vasoactivos a una respuesta
celular y más limitada.
Adyuvantes
De forma inespecífica podemos aumentar el grado de respuesta mediante el uso
de diversas substancias conocidas con el nombre genérico de adyuvantes. El
más utilizado en la producción de vacunas es el hidróxido de aluminio. También
se pueden utilizar productos bacterianos, como extractos de B. pertussis. Parece
que el mecanismo de acción de los adyuvantes es doble. Por una parte,
concentra los antígenos en un determinado lugar, facilitando la tarea de las
células presentadoras de antígeno y, por otra, activa una respuesta inflamatoria
con la consiguiente producción de citocinas y factores quimiotácticos.
Muchos de los componentes que se han empleado como adyuvantes en la
preparación de vacunas también se han usado para potenciar la actividad del
sistema inmune. Un caso particular son las citocinas y factores de crecimiento.
Algunas de ellas ya con un uso regular en la clínica. Como ejemplos tenemos el
interferón, principalmente en el tratamiento de enfermedades virales y
autoinmunes pero también en el de algunos tumores, la interleucina 2, también
en el tratamiento de ciertas formas de cáncer y el G-CSF que se utiliza para
acelerar la reconstitución mieloide tras un trasplante hematopoyético. En el otro
extremo se esta estudiando el uso de agentes que puedan bloquear la acción de
estos factores, interfiriendo la unión a sus receptores.
Otras modalidades terapéuticas centran su actividad en prevenir la activación de
una respuesta que pueda resultar prejudicial. Entre estos agentes encontramos el
Copaxone (Copolímero 1) que se utiliza en el tratamiento de la esclerosis
múltiple. Entre los mecanismos de acción que se han descrito para explicar sus
8
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
propiedades inmunomoduladoras se encuentra la activación parcial y por tanto
la inducción de tolerancia de las células específicas que reconocen la proteína
básica de la mielina, uno de los antígenos diana en la esclerosis múltiple. La
molécula CTLA-4-Ig bloquea la interacción de CD28 con sus ligandos dando
origen a una señal inhibitoria en los linfocitos T. Además, se puede unir a las
moléculas B7 en las células dendríticas activando el catabolismo del triptófano,
lo cual da origen a señales tolerizantes en los linfocitos que interactúan con las
células dendríticas.
7. Inmunoterapia celular
La inmunoterapia también puede utilizar células como producto terapéutico.
Hemos señalado con anterioridad la infusión de células dendríticas que, como
presentadoras de antígeno tenían la misión de activar in vivo una respuesta
inmune. Utilizando la inmunoterapia de forma pasiva lo que inyectamos son
células efectoras, linfocitos T con la capacidad de actuar eliminando los agentes
nocivos.
El trasplante de progenitores hematopoyéticos es hasta la fecha el
procedimiento de inmunoterapia pasiva más eficaz.
El trasplante requiere un tratamiento de acondicionamiento previo y de
intensidad variable que irremediablemente daña al sistema hematopoyético. En
casos
de
neoplasias
hematológicas
este
tratamiento
incluye
la
quimio/radioterapia necesaria para la eliminación de las células cancerosas. Con
la infusión de progenitores hematopoyéticos lo que se consigue es la
regeneración del sistema hematopoyético que en el caso de los trasplantes
alogénicos ha sido destruido.
La inmunología ha puesto en evidencia el hecho de que el trasplante no es una
mera operación de relleno, sino que es una actuación inmunoterapéutica. En el
injerto se incluyen un numero variable de linfocitos T que van a reconocer
9
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
disparidades a nivel de los antígenos de histocompatibilidad mayores y menores
en el receptor, un aspecto que ya ha sido tratado en otros capítulos del máster.
Muchos de estos antígenos, especialmente los menores, se expresan
mayoritariamente en las células del sistema hematopoyético y son fácilmente
reconocibles por el sistema inmune del donante, representado por las células T
del injerto. La importancia de la contribución de los linfocitos T del donante en
el tratamiento antitumoral se evidencia en los casos en los que el injerto se trata
para eliminar o reducir el número de linfocitos T con el objetivo de reducir el
número y/o gravedad de los episodios de enfermedad del injerto contra el
huésped (graft versus host disease o GVHD). En estos casos se ha visto que hay en
primer lugar mayores dificultades para el injerto además de un aumento franco
del número de recaídas que se explican por la pérdida del efecto antitumoral.
La administración de linfocitos del donante (DLI, del inglés donor lymphocyte
infusions) con posterioridad al trasplante es un procedimiento controlado que
pretende eliminar las células tumorales en casos de recaída tras un trasplante
alogénico una vez superada la fase de injerto y cuando ya se ha establecido el
quimerismo celular. Al seguir siendo un procedimiento carente de especificidad
el riesgo de GVHD se mantiene. En 1994, un grupo del Memorial Sloan Kettering
Cancer Center pudo conseguir la remisión de un proceso linfoproliferativo
causado por el EBV en pacientes tratados con trasplante de medula ósea
utilizando linfocitos del donante sin someterlos a ningún tipo de selección
previa. Sin embargo, esta falta de especificidad llevó a la aparición de cuadros de
GVHD y dos de los pacientes murieron.
La evolución lógica de estas aproximaciones es la infusión de linfocitos con
especificidad definida. Las enfermedades infecciosas y el cáncer son los dos
grandes grupos de patologías que se pueden abordar con inmunoterapia. Entre
las primeras las causadas por virus, especialmente el citomegalovirus (CMV) y el
virus de Epstein-Barr (VEB), son las que más estudios han generado. Entre las
neoplásicas, los mayores avances se han conseguido en el tratamiento del
melanoma.
10
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 1
Aislar células T
Generar in vitro células T con
especificidad frente al antígeno
de interés
Infecciones víricas
Tumores
Expansión in vitro
Terapia celular
Las líneas generales del procedimiento se esbozan en la figura 1. En el caso de
los tumores, la fuente principal de linfocitos con especificidad frente a los
antígenos tumorales son las células que infiltran el tumor. El principal problema
en estos casos es la baja afinidad de los receptores de los linfocitos que pueden
reconocer estos antígenos. Otros factores a considerar son los mecanismos de
escape de los tumores. Esto hace que la terapia anti-tumoral no haya conseguido
todavía los efectos deseados. En el caso de la terapia antiviral, hay numerosos
estudios que avalan su utilización en diferentes contextos. En lo que resta de
exposición nos centraremos en explicar esta aplicación.
En líneas generales se pueden dar dos situaciones:
A. El paciente es una persona que no ha tenido contacto con el virus.
B. El paciente ha estado expuesto previamente al virus.
La diferencia se encuentra en el número de células T específicas frente al virus.
Un contacto previo presupone que el repertorio inicial ha aumentado. Al tener
un número de precursores mayor la generación de linfocitos con actividad
citotóxica resulta menos complicada que tenerlos que expandir a partir de la
dotación original.
11
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Existen diversas técnicas que permiten hacer una estimación del porcentaje de
células que van a reaccionar frente a un antígeno determinado. Con tetrámeros
o pentámeros y citometría de flujo se puede determinar el número de células
que son capaces de establecer un contacto con un péptido determinado
presentado por una molécula de histocompatibilidad concreta.
En el mercado existen diferentes combinaciones disponibles, aunque no cubren
ni todos los antígenos ni todas las posibles moléculas de histocompatibilidad.
En www.proimmune.com o www.immunomics.com se puede encontrar
información referente a estas técnicas. Otras técnicas permiten la cuantificación
desde un punto de vista funcional. Las más usuales miden la producción de
interferón en respuesta al estímulo. Mediante citometría de flujo se puede
detectar el interferón intracelular. Becton Dickinson® explica en su página web
los
principios
de
la
técnica
(ver
http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols/Intracellular_Cytokine
s.shtml).
El ELISPOT detecta la producción local de interferón utilizando una técnica
similar al ELISA que en lugar de medir la concentración de un producto en
solución cuantifica mediante el contaje de puntos (spots) el número de células
que responden secretando interferón ya que éste queda retenido en una
membrana. Mabtech® es una de las casas comerciales que sirve este producto.
En su página web se detallan los principios fundamentales del procedimiento
www.mabtech.com.
Una vez establecida la reactividad del paciente, el porcentaje de células que
potencialmente van a responder al estímulo condiciona el tipo de procedimiento
a seguir. Mediante restimulaciones in vitro se consigue seleccionar y expandir la
población reactiva y en el caso de donantes no relacionados, evitando la
presencia de células aloreactivas. Se han descrito diferentes estrategias para
generar linfocitos con reactividad frente a antígenos virales. Para estimular los
linfocitos se han utilizado fibroblastos autólogos infectados con CMV, células B
activadas transformadas con el VEB, células dendríticas presentando péptidos o
antígenos virales o modificadas genéticamente.
Algunos de estos métodos se han empleado para generar linfocitos T utilizados
eficazmente en protocolos de terapia celular. Sin embargo, todavía hay que
resolver algunas cuestiones antes de que estos procedimientos puedan ser
12
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
aplicados de manera habitual en la clínica. Una de ellas es la necesidad de largos
periodos de cultivo in vitro antes de la infusión. Para reducir este tiempo, y con
ello el coste del proceso, en los últimos años se han ido introduciendo técnicas
que permiten la purificación previa de las células T reactivas, de forma que se
puede hacer la expansión celular de forma selectiva.
Una de estas técnicas emplea tetrámeros diseñados para identificar células que
reconocen un péptido presentado en una molécula de histocompatibilidad
definida y partículas magnéticas. Cobbold y sus colaboradores han descrito
recientemente como la infusión de una mínima cantidad (menos de 1 millón por
paciente) de células purificadas de esta forma es capaz de combatir la
reactivación de la infección por CMV tras un trasplante de médula ósea.
Otra de estas técnicas emplea la producción de interferón, un criterio funcional,
para seleccionar las células de interés utilizando igualmente un sistema de
Más información
purificación magnética. De esta forma no existe la necesidad absoluta de
conocer los epítopos más immunogénicos ni las limitaciones que impone el
MHC y se puede aplicar para luchar contra patógenos que ni siquiera están
caracterizados desde el punto de vista de su inmunidad. Los últimos ensayos
clínicos publicados combinan ambas aproximaciones: la selección funcional y
los procedimientos de expansión.
13
En la página web del NIH
http://clinicaltrials.gov/ se
puede encontrar
información referente a los
ensayos clínicos aprobados
en terapia celular.
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
8. Bibliografía
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Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
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18
Unidad didáctica 3:
Medicina regenerativa
Dr. Luciano Rodríguez
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia
Celular.
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Medicina regenerativa. Conceptos básicos
4. Células madre
4.1
Conceptos básicos
4.2
Clasificación
4.2.1
Según su capacidad de diferenciación
4.2.2
Según su origen
5. Estrategias prácticas en medicina regenerativa
5.1
Terapia celular
5.2
Regeneración sobre matrices
5.3
Regeneración con biomoléculas activas
6. Células mesenquimales
6.1
Aplicación clínica de las MSC. Terapia Celular. Trasplante
de Progenitores Hematopoyéticos (TPH)
6.1.1
Facilitación de injerto
6.1.2
Tratamiento de la Enfermedad de Injerto Contra
el Huésped (EICH)
6.1.3
TPH de progenitores de sangre de cordón
umbilical (SCU)
7. Aplicaciones de Medicina Regenerativa
7.1
Traumatología
7.2
Infarto de miocardio
8. Bibliografía
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
1. Introducción
Nuestro organismo tiene una capacidad natural de autorenovar algunos de sus
tejidos y frente a una lesión en la piel, un músculo, incluso un hueso, el tejido
dañado se regenera con el tiempo. Además, muchas de las patologías que
afectan al ser humano se relacionan con el desgaste o degeneración de sus
tejidos bien sea de forma aguda (p.e.: accidentes vasculares) o crónica (desgasteenvejecimiento). Sin embargo, esta capacidad de autorenovación es limitada y
depende, en general, de la extensión del daño tisular. Así, la muerte de gran
cantidad de tejido de forma aguda no puede ser reparado por mecanismos
naturales debido a que resulta incompatible con la vida o a que falla alguno de
los procesos que sigue una regeneración fisiológica; las células encargadas de la
regeneración no llegan de forma eficiente al lugar del daño (bien sea porque no
se encuentran en número suficiente o no reciben señales adecuadas para su
movilización) o porque el proceso de inflamación, una infección o la falta de
vascularización sitúa a esas células en un escenario que impide el resto de
mecanismos necesarios para llevar a cabo la sustitución del tejido dañado. En
este contexto, el de la regeneración natural, y para el tratamiento de diversas
patologías vienen desarrollándose diferentes aproximaciones terapéuticas que se
engloban dentro de la denominada medicina regenerativa.
2. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería de ser capaz de:
-
Definir los conceptos básicos a nivel teórico y práctico que se utilizan
en medicina regenerativa.
-
Entender y valorar objetivamente la información que surge cada día en
esta disciplina.
3
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
3. Medicina regenerativa. Conceptos básicos
La medicina regenerativa busca la mejora, mantenimiento o restitución
funcional de un órgano o tejido mediante el uso de células vivas como agentes
terapéuticos (terapia celular), bien sean aisladas o como parte de estructuras
complejas que mimetizan la estructura histológica del órgano o tejido a reparar
(ingeniería tisular).
Esta última disciplina aplica los principios de la ingeniería y de las ciencias de la
vida para conocer los fundamentos básicos de la relación estructura-función
tanto en tejidos normales como patológicos con el objetivo de desarrollar
sustitutos que reemplacen funcionalmente un tejido.
Esta nueva especialidad, por definición multidisciplinar, se encuentra en pleno
desarrollo y ofrece una alternativa a los medicamentos “clásicos” que basan su
acción terapéutica en la mejora de los síntomas pero que generalmente no
representan una solución definitiva para la restitución funcional de un órgano o
tejido dañado. Adicionalmente, la medicina regenerativa se vislumbra como el
punto de partida de tratamientos efectivos de enfermedades para las que hoy
por hoy no existe ninguna terapia efectiva como el parkinson o las lesiones
medulares.
Figura 1
4
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
Actualmente se acepta que las células con más posibilidades de traslación clínica
a corto-medio plazo, por su fácil accesibilidad, la ausencia de controversia éticolegal en su utilización y el hecho de que son las más activamente ensayadas en
humanos, son las células madre adultas (células madre específicas de tejido).
Estos tipos celulares se encuentran en muy baja proporción en el tejido en el
que residen y necesitan, en la mayoría de los casos, un proceso de aislamiento y
posterior expansión ex vivo para su uso clínico. Un ejemplo en la clínica actual
son las células mesenquimales derivadas de la médula ósea o de grasa
subcutánea. Por último, destacar que la producción industrial, el mercado y la
comercialización de estas herramientas terapéuticas para uso humano ya han
sido reguladas por la Comisión Europea y reciben la denominación de
medicamentos de terapias avanzadas.
4. Células madre
4.1
Conceptos básicos
Las células madre son células indiferenciadas con capacidad de autorenovación
(pueden replicarse de forma infinita sin perder sus propiedades) y capaces de
dar lugar a células especializadas maduras de distintos linajes (con diferentes
características y funciones).
Estas cualidades hacen de ellas algo único en organismos donde la gran mayoría
de sus unidades funcionales son células diferenciadas con una única función,
pero lo más importante es que son una fuente, en teoría casi inagotable, de
células que pueden regenerar un órgano o tejido que ha sufrido un daño o
traumatismo imposible de ser superado por un proceso de regeneración natural.
5
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
Figura 2
En general, los términos célula madre, troncal (stem), progenitora o precursora
se utilizan sin mucha rigurosidad y de forma indistinta porque todos ellos hacen
referencia a la capacidad de diversos tipos celulares de “regenerar” algún nicho
biológico. No obstante, estos términos, heredados de la experiencia con
progenitores hematopoyéticos CD34+, no hacen referencia a un mismo tipo
celular sino que incluyen en realidad una miscelánea que va desde células con
capacidad de autorenovación y diferenciación (progenitoras) hasta células
comprometidas a linaje con poca o ninguna capacidad de autorenovación
(precursoras). Troncal (stem) es un término descrito inicialmente para células
procedentes del estado embrionario pero que ha sido acuñado dentro del
contexto de las células madre adultas (origen NO embrionario).
Del conocimiento adquirido con las células madre hematopoyéticas se
desprende que la transición desde el compartimiento stem, aquel que puede
regenerar totalmente un nicho biológico funcional, hasta el de célula progenitora
(compromiso a linaje) se asocia con una disminución de las capacidades de
autorenovación y proliferación. Estas capacidades se pierden cuando una célula
progenitora se compromete a un linaje concreto (pérdida de la capacidad de
autorenovación) o inicia su maduración hacia un tipo celular concreto (pérdida
de su capacidad de proliferación). Se entiende que el compartimiento de células
6
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Módulo 1. Área Transfusión
progenitoras está formado por células con una capacidad de diferenciación más
limitada y pueden ser uni-, bi- o multipotenciales (capacidad de diferenciación a
diversos linajes).
En términos prácticos, lo que suscita tanto interés sobre las células madre es
que en un microambiente determinado, es decir, bajo la influencia de señales,
interacciones y una estructura tridimensional correcta pueden diferenciarse a
uno u otro tejido. Las células maduras totalmente diferenciadas bajo las mismas
condiciones no tienen la posibilidad de dar lugar a células que funcionalmente
sean diferentes a lo determinado en su origen. El gran reto, y el campo en el que
se están invirtiendo más esfuerzos y recursos, es el de conocer cuáles son las
señales y los factores determinantes que influyen en la decisión de una célula
progenitora para dar lugar a uno u otro tipo funcional para así poder utilizarlas
terapéuticamente.
En este sentido las primeras experiencias clínicas se han basado en la
introducción de células madre esperando que las señales de regeneración
producidas en el lugar de la lesión sean suficientes para activar y dirigir la
diferenciación de estas células hacia el tejido a sustituir. Los resultados
experimentales obtenidos muestran claramente que esta aproximación no es
suficiente y que una decisión crítica en el desarrollo de terapias útiles es elegir
qué células madre son más adecuadas en cada aplicación.
4.2
Clasificación
La bibliografía científica propone diferentes fuentes de células madre:
a) Embriones almacenados en clínicas de fertilidad que no fueron
utilizados por las parejas donantes.
b) Embriones creados por medio de fertilización in vitro para el propósito
específico de obtener células madre.
c) Embriones clonados por medio del método de transferencia somática
nuclear.
d) Fetos de desarrollo temprano que han sido abortados.
e) Cordones umbilicales.
f)
Tejidos u órganos de individuos adultos obtenidos mediante cirugía.
7
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g) Cadáveres: El aislamiento y supervivencia de células progenitoras
neurales de tejidos post-mortem (hasta 20 horas después de la muerte)
ha sido reportado.
h) De células adultas reprogramadas para desdiferenciarse.
Figura 3: Clasificación de las células madre
Desarrollo embrionario
2 días.
3-4 días.
Post-natal
Mórula.
Blastocito.
Tejido placentario.
Adulto.
Cordón Umbilical.
Líquido Amniótico.
Totipotenciales
Pluripotenciales
Células Madre Embrionarias.
4.2.1
Pluripotenciales o Multipotenciales
Células Madre Adultas.
Según su capacidad de diferenciación
Independientemente del origen de las células madre a las que se refieren los
textos científicos, podemos clasificarlas en:
-
Células totipotenes: Pueden dar lugar a un organismo completo y por
tanto a todos los tejidos de un organismo adulto. Cualquier célula
totipotencial colocada en el útero de una mujer tiene la capacidad de
originar un feto y un nuevo individuo. Se incluirían aquí cualquier célula
embrionaria desde el zigoto hasta la formación del blastocito.
8
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Módulo 1. Área Transfusión
-
Células pluripotentes: Capaces de producir la mayor parte de los
tejidos y cualquier tipo de célula de un organismo aunque no pueden
generar un embrión. Podrían dar lugar a un tejido funcional de
cualquiera de las tres capas embrionarias (ecto-, meso- o endodermo).
Las células de la masa interna del blastocito son pluripotenciales pero se
han publicado diferentes trabajos que señalan la existencia de células
pluripotenciales en tejidos adultos.
-
Células multipotentes: Se encuentran en los individuos adultos.
Pueden generar células especializadas de un solo tejido concreto aunque
in vitro puedan producir otros tipos, indicando que en las condiciones
necesarias pueden tener más versatilidad de la que muestran.
Aunque las células madre embrionarias se han considerado como
pluripotenciales y las células madre adultas solo multipotenciales, la bibliografía
actual sugiere que algunos tipos concretos de células madre adultas incluye
células pluripotenciales en algunos tejidos y órganos. Cuando una célula madre
multipotencial es capaz de diferenciarse a tejidos ajenos a aquellos derivados de
su capa embrionaria de origen hablamos de plasticidad o capacidad de
transdiferenciación.
4.2.2
Según su origen:
Células embrionarias
Estas células derivan de la masa celular interna del embrión en estadio de
blastocisto (7-14 días), y son capaces de generar, en teoría, todos los tipos
celulares del cuerpo. De estas células se supone derivaran, tras diversas
divisiones celulares, las células madre órgano-específicas.
El cigoto formado tras la fecundación de un óvulo por un espermatozoide es
una célula capaz de generar un nuevo individuo completo con todos sus
órganos y tejidos. Entre los días primero al cuarto del desarrollo embrionario, la
célula original va dividiéndose en varias células que, si fueran separadas del
resto, podrían generar un individuo completo. A partir del cuarto día del
desarrollo embrionario humano se forma el blastocito que está formado por una
9
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Módulo 1. Área Transfusión
capa externa, una masa celular interna y una gran cavidad interior. La capa
externa (trofoblasto) formará la placenta y las envolturas embrionarias y la masa
celular interna (embrioblasto) formará todos los tejidos del cuerpo humano.
Las células de un blastocisto ya no son totipotentes, porque una sola de estas
células no es capaz de generar un individuo completo. Las células de la masa
celular interna del blastocisto son células pluripotentes. Si en las primeras fases
del desarrollo del embrión extraemos las células de la masa celular interna del
blastocisto y logramos especializarlas, podríamos obtener cualquier tejido para
trasplante.
Figura 4
Las células embrionarias con las que se experimenta en medicina regenerativa
provienen, en la mayoría de los casos, del aislamiento directo de la masa interna
de un blastocito (aprox. 30 células) sobre un plástico de laboratorio en el que se
incuban sobre estromas epiteliales de ratón (actualmente existen alternativas que
evitan el uso de las células murinas) que actúa como capa alimentadora y
soporte físico al que se adhieren. Si estas células proliferan durante más de seis
10
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meses sin diferenciarse y sin ningún tipo de modificación genética se consideran
como pluripotenciales y determinan una línea de células madre embrionarias.
Destacar que las células embrionarias en cultivo, si se permite su unión para
formar colonias o cuerpos embriónicos (embryoid bodies), por ejemplo
cultivándolas en suspensión, éstas diferenciarán espontáneamente.
Para la caracterización de células madre embrionarias se utiliza uno o varios de
los siguientes métodos:
- Cultivo y resiembra de las células candidatas durante varios meses para
asegurar que son capaces de autorenovación. Durante el cultivo, estas
células son inspeccionadas para asegurar que su morfología se mantiene
y por tanto que siguen indiferenciadas. Además, se examinan los
cromosomas para verificar si existe un cariotipo correcto.
- Identificar en las células candidatas marcadores de superficie,
Marcadores
proteínas o factores de trascripción propios de células indiferenciadas
(http://stemcells.nih.gov/info/scireport/appendixe.asp#eii).
- Examinar la capacidad pluripotencial permitiendo a las células
candidatas diferenciarse espontáneamente en cultivo y examinar que los
diferentes tipos celulares a los que puede dar lugar pertenecen a las tres
capas embrionarias. Manipular las células candidatas para inducir algún
tipo de diferenciación específica o introducirlas en animales
inmunosuprimidos para examinar la formación de teratomas.
Las células madre embrionarias presentan ventajas respecto a las células madre
adultas porque poseen el potencial de formar cualquier célula del cuerpo, son
inmortales y por tanto un linaje celular puede potencialmente suministrar una
cantidad infinita de células con características definidas y son fácilmente
accesibles porque los embriones humanos pueden ser obtenidos de las clínicas
de fertilidad.
Sin embargo, la diferenciación de estas células es difícil de controlar y una vez
activado un programa de diferenciación, actualmente resulta técnicamente
imposible pararlo pudiendo generar células no deseadas. Adicionalmente, estas
células podrían activar respuestas inmunes porque las células trasplantadas
difieren en su perfil inmune de las del recipiente y serán rechazadas. Por último
11
El siguiente enlace contiene
amplia información sobre las
CM:
http://stemcells.nih.gov/info/
basics/defaultpage.asp
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destacar la controversia ético-legal que supone destruir embriones congelados
para desarrollar este tipo de terapias y que imposibilitan en muchos casos su
utilización.
Células específicas de tejidos
Célula derivada o residente de un tejido post-natal o adulto. Incluye las células
placentarias, de cordón umbilical y aquellas derivadas del líquido amniótico. Se
han identificado células madre adultas (células madre somática) en casi todos los
tejidos del organismo entre los que se destacan el cerebro, el corazón, la sangre
periférica, la médula ósea, la grasa, la piel y el hígado. Sin embargo no se conoce
el origen de estas células y se supone que provienen del desarrollo embrionario
y se mantienen en los tejidos adultos en un estado quiescente hasta que son
activadas para reparar el tejido dañado.
Figura 5
Para identificar células madre adultas se utiliza uno o varios de los siguientes
métodos:
- Se marcan las células candidatas con marcadores moleculares y se
introducen en un tejido vivo para determinar qué tipos celulares son
capaces de generar.
12
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
- Se aíslan las células, se marcan durante su cultivo in vitro y se inyectan
en un nuevo individuo para observar si pueden repoblar su tejido de
origen.
- Las células son aisladas y expuestas in vitro a factores de crecimiento o
modificación genética para observar qué tipos celulares genera.
Adicionalmente, estas células han de demostrar crecimiento clonal, es decir que
pueden dar lugar in vitro a una línea celular genéticamente idéntica a la célula
origen.
Es de destacar que estos tipos celulares residentes de tejido muestran en
diversos casos algún tipo de especialización o programas de diferenciación que
prevalecen sobre otros y por tanto la inducción de la diferenciación a algunos
tipos celulares concretos puede resultar más sencilla que en el caso de las células
embrionarias. Además, el hecho que pueden ser utilizadas de forma autóloga,
extraídas y reimplantadas en un mismo paciente, presenta ventajas
inmunológicas respecto a las células madre embrionarias. Sin embargo, el hecho
de que se encuentren en pequeñas cantidades en los tejidos de origen introduce
una clara desventaja para su utilización porque estos tipos celulares crecen con
cinéticas lentas y no es fácil obtenerlas en grandes cantidades. Además, se ha
reportado la aparición de aberraciones cromosómicas después de 30 pases en
cultivo con estos tipos celulares.
Las células madre somáticas (adultas o tejido-específicas), en la mayoría de los
casos descritos, no se diferencian significativamente del resto de células del
tejido en el que se localizan, tanto morfológica cómo fenotípicamente son
prácticamente iguales al resto de células del tejido, lo que dificulta enormemente
su identificación y en consecuencia su aislamiento. Únicamente puede
identificarse una célula progenitora por su capacidad de dar lugar a tipos
celulares diferentes funcionalmente y siendo estrictos debería demostrarse que
es capaz a nivel clonal (a partir de una sola célula) de dar lugar a una estructura
funcional y no transitoria in vivo.
Las células que tienen que ser cultivadas o manipuladas ex vivo para uso humano
son consideradas medicamentos y en la legislación actual están definidas como
medicamentos de terapia celular somática en el grupo de medicamentos de
13
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
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terapia avanzada (ley 29/2006), y como tales deberán demostrar efectividad y
seguridad en el balance beneficio riesgo antes de ser una realidad clínica.
Adicionalmente, las instalaciones donde se producirán, expandirán o
manipularan estas células-medicamento deberán ser legalizadas por las
autoridades competentes como laboratorios farmacéuticos (RD 2183/2004) y
los procesos de fabricación serán del mismo nivel de seguridad y trazabilidad
que los utilizados en la industria farmacéutica. Pero el proceso de fabricación de
este tipo de medicamentos es complejo y todavía está en pleno desarrollo.
Debemos tener en cuenta que el proceso de producción y el producto final
están íntimamente ligados, es decir, el proceso define la totalidad del producto,
que además está vivo y debe permanecer así cuando se implante en el paciente
(se necesitan múltiples manipulaciones, normalmente son manuales y el
producto final debe ser estéril y hasta el empaquetado de éste debe cumplir
requisitos médicos) y como no se ha definido si esta clase de terapias serán “a
medida” o bajo la base de grandes producciones, no están todavía bien
definidos ni los productos ni los procesos productivos.
14
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Módulo 1. Área Transfusión
5. Estrategias prácticas en medicina regenerativa
En general, todas las aproximaciones técnicas de terapia regenerativa se basan
en la combinación de algún tipo de células progenitoras con matrices / soportes
y la presencia o no de moléculas reguladoras. Dependiendo del tipo de tejido a
reparar o sustituir se emplean una o varias combinaciones de las estrategias
básicas que se exponen a continuación:
Figura 6
5.1
Terapia celular
Se basa en situar nuevas células sanas, progenitoras o diferenciadas ex vivo, en el
tejido a reparar esperando que puedan sustituir la estructura dañada o
defectuosa directamente o bien facilitando el reclutamiento de otras células que
ayuden a su reparación. Aunque debemos ser conscientes que estamos todavía
dando los primeros pasos en la definición de qué células pueden ser las más
adecuadas para cada una de las necesidades, la terapia ideal sería aquella que
15
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
permita que las células lleguen de forma preferente al lugar donde se requiere su
acción, se integren funcionalmente en el contexto tisular existente y que no
produzcan rechazo inmunológico.
En este contexto se sitúan tanto el uso de células mesenquimales para
regeneración ósea como para el control de la enfermedad de injerto contra el
huésped en el trasplante hematopoyético, pasando por la utilización de células
madre de limbo corneal para regenerar córneas, hasta la infusión de células
inmunocompetentes (linfocitos T específicos, dendríticas) para reforzar o
restituir la funcionalidad de sistemas inmunes comprometidos.
5.2
Regeneración sobre matrices
Se basa en la siembra de una estructura porosa y biodegradable con células y/o
factores de crecimiento que actúa de andamiaje (estructura primaria) a modo de
matriz extracelular fisiológica que soporta y dirige la diferenciación de las células
hacia el tejido funcional. Este primer paso es seguido de un cultivo ex vivo que
persigue la expansión y colonización de la estructura temporal para su posterior
implante. El objetivo final es una sustitución progresiva del andamiaje
biodegradable por matriz extracelular generada por las células sembradas que
actúe, cual matriz fisiológica, como soporte y regulador funcional.
En este sentido, los puntos clave para el desarrollo de este tipo de
aproximaciones son actualmente: qué composición y dimensiones deben tener
las matrices, cómo colonizarlas para asegurar una distribución que no
comprometa la funcionalidad pero que permita el aporte de nutrientes y gases y
cómo integrar estas estructuras en los tejidos in vivo. Para este tipo de estrategia
sin duda será imprescindible el desarrollo de materiales y tecnología de micro
ingeniería.
Sin duda el mejor ingeniero de tejidos que ha existido nunca es la propia
naturaleza. Así, el diseño de soportes tridimensionales (scaffolds) sobre los que se
siembran, crecen y se diferencian las células progenitoras deberían mimetizar las
estructuras de las matrices extracelulares fisiológicas, tanto en lo que se refiere a
su composición, comportamiento mecánico como a su estructura jerárquica. Sin
embargo, la composición exacta de muchas de estas matrices fisiológicas no se
16
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
conoce con suficiente precisión y en aquellas en las que se conoce lo
suficientemente bien, se está experimentando con la tecnología que permita
crear un proceso de nano-fabricación efectivo para uso clínico. Adicionalmente
estas estructuras deben ser biocompatibles y en lo posible biodegradables y han
de permitir que las células vivas de las que se componen sean vascularizadas in
vivo o que lleguen al paciente con algún tipo de vasculatura funcional. En este
sentido una de las estrategias que se baraja para el desarrollo de la medicina
regenerativa es la del “bioreactor in vivo”, es decir, la creación de primordios
tisulares in vitro que son implantados in vivo para permitir el desarrollo del tejido
que se está reparando o sustituyendo.
Figura 7
5.3
Regeneración con biomoléculas activas
Regeneración con biomoléculas activas es la utilización de factores de
crecimiento para guiar la expansión y diferenciación tejido específica de las
células progenitoras. Sobre la utilización de biomoléculas activas debemos
tomar en consideración no solo qué tipo de factores se utilizan sino cómo se
integran en el tejido o estructura desarrollada, durante cuanto tiempo deben ser
activas para producir un efecto funcional, cómo interaccionan las diferentes
17
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
señales para dirigir una diferenciación y por último, como controlar su acción
una vez introducidas en el organismo.
Figura 8
Estas aproximaciones, únicas o en combinación, pueden aplicarse básicamente
de dos formas: generando un tejido ex vivo para su posterior implantación o
acelerando la regeneración el tejido in vivo, es decir, que la maduración del tejido
funcional se da en el propio individuo y no in vitro.
18
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
6. Células mesenquimales
El término “célula mesenquimal” define un grupo altamente heterogéneo de
células, progenitoras o no, que provienen del tejido conectivo (mesénquima)
Más información
derivado de la capa mesodérmica embrionaria. Asimismo, este término se utiliza
En el enlace:
para denominar a las llamadas células madre mesenquimales (MSC, mesenchymal
http://arthritis-research.com/
content/pdf/ar2116.pdf
stem cells), células multipotentes con capacidad de diferenciación a diversos
encontraréis una reciente
revisión sobre estas células.
tejidos mesodérmicos; hueso, cartílago, tejido adiposo y estroma medular.
Las células MSC son candidatas preferentes para el desarrollo de nuevos
protocolos clínicos de terapia celular debido, principalmente, a su rápida
accesibilidad y capacidad de supervivencia en diferentes tejidos. Adicionalmente,
su alta tasa de proliferación sin pérdida de potencial de diferenciación, sus
propiedades inmunomoduladoras, la seguridad de su utilización en humanos (se
ha reportado que la infusión de hasta 5x107 no provoca toxicidad en pacientes
con enfermedades hematológicas en completa remisión) y la carencia de
controversias ético legal para su obtención avalan su uso clínico a corto plazo.
Figura 9
19
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
La médula ósea es la fuente de MSC más estudiada y se estima que la frecuencia
de estas células es de 1 cada 104-106 células nucleadas totales, asimismo se ha
reportado el aislamiento de MSC de sangre de cordón umbilical, placenta
humana, fluido amniótico y sangre periférica movilizada con G-CSF. La
presencia de MSC en estas fuentes es igual o menor que en el caso de la médula
ósea haciendo de la expansión ex vivo un requerimiento previo para el inicio de
cualquier estudio clínico.
Las células MSC crecen formando colonias adherentes características
compuestas de, principalmente, dos grupos celulares fibroblásticos con tamaños
y capacidades proliferativas distintas. Estas colonias se expanden con una
cinética inicial lenta (2-4 días), seguida de una etapa de gran proliferación y una
fase final estacionaria que permiten expandir, por resiembra a baja densidad,
hasta 3 logaritmos la población inicial. Se ha estimado teóricamente que las
MSC aisladas de solo 2 mL de médula ósea pueden expandirse hasta una
población de 12-35 x 109 células en tres semanas.
La adherencia al plástico es el método más utilizado para el aislamiento de MSC
y su identificación se basa fundamentalmente en la coexpresión de algunas
proteínas de membrana (coexpresión de CD105, CD73, CD90) y falta de
expresión de marcadores hematopoyéticos (CD45) y endoteliales. Este perfil
fenotípico no es exclusivo de estas células y se suele acompañar de un ensayo de
diferenciación de la población expandida a tres linajes mesodérmicos; tejido
adiposo, cartílago y hueso para su identificación como MSC. Aunque se ha
descrito la capacidad de estas células para diferenciarse in vitro a tejidos de las
capas ecto y endodérmicas del embrión, fenómeno conocido como plasticidad o
transdiferenciación celular, este es un punto de extenso debate y controversia
porque las condiciones de los cultivos in vitro de larga duración, los fenómenos
de fusión celular y la expresión de genes confluente en distintos programas
genéticos de diferenciación pueden haber actuado como artefactos en la
determinación de la capacidad de diferenciación de estas células in vivo.
Se han descrito diferentes protocolos de aislamiento y expansión de MSC a
partir de médula ósea que varían en el método y densidad de siembra del cultivo
primario, la densidad celular en los pases de expansión y en la utilización de
medios de cultivo. Asimismo, los diferentes métodos de obtención y el tiempo
de cultivo rinden poblaciones celulares que aunque con perfiles fenotípicos
20
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
similares muestran características morfológicas, capacidades de diferenciación y
cinéticas de crecimiento muy diversas. Esto se debe, principalmente al hecho de
que en un cultivo MSC existe sólo una pequeña proporción de células con
capacidad de diferenciación a tres linajes mesodérmicos mientras que la mayoría
de células exhiben una capacidad uni o bipotencial. La proporción de cada
subpoblación en el producto celular final está directamente relacionada con las
condiciones y extensión cultivo y queda por demostrar si un determinado
protocolo de expansión favorece una determinada aplicación clínica en
detrimento de otras.
Los actuales protocolos de expansión ex vivo de MSC incluyen sueros de origen
animal como suplemento nutricional del cultivo celular que no se asocian con la
posibilidad de transmisión de enfermedades priónicas pero presentan un riesgo
real de desarrollo de reacciones inmunes o inflamatorias locales por la presencia
de proteínas xenogénicas en el cultivo de expansión que pueden no ser
eliminadas incluso después de intensos lavados celulares. En estas circunstancias,
la formación de anticuerpos podría alterar los procesos de injerto o provocar
rechazo inmunológico sobretodo en aquellas aplicaciones que necesiten dosis
repetidas de este producto. Asimismo, se ha reportado que el uso de suero
autólogo en sustitución de sueros animales durante el cultivo de expansión
reduce la posibilidad de arritmias después de una cardiomioplastia celular.
6.1
Aplicación clínica de las MSC
Terapia Celular. Trasplante de Progenitores Hematopoyéticos (TPH)
6.1.1
Facilitación del injerto.
Se ha reportado que la coinfusión de MSC y progenitores hematopoyéticos es
una técnica abordable que resulta en una disminución significativa del tiempo de
recuperación hematológica después de un TPH. Además, en modelos animales
NOD/SCID se ha reportado que en condiciones de recuentos mínimos de
CD34+, sólo aquellos trasplantes realizados mediante coinfusión con MSC
mostraron el injerto. Más recientemente, un ensayo clínico con 36 pacientes ha
reportado que la infusión de 1-2.5 106 MSC/kg con CD34+ de sangre periférica
resultó en mejores índices de recuperación hematológica así como ausencia de
21
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
toxicidad, sugiriendo que la coinfusión de progenitores y MSC puede rendir
beneficios clínicos significativos.
Existen evidencias de que las MSC expandidas ex vivo y trasplantadas no injertan
en la médula ósea y por tanto parece difícil que regeneren el estroma medular
del recipiente, mecanismo propuesto para la facilitación de injerto con estas
células. Así, se ha sugerido que los efectos clínicos beneficiosos observados en
la coinfusión de MSC es debida a la producción local de citoquinas y factores de
crecimiento (SDF-1, TGF-ß, MIP-1α) que favorecerían la localización y/o la
expansión in vivo de los precursores trasplantados.
6.1.2
Tratamiento de la Enfermedad de Injerto Contra el Huésped
(EICH)
La enfermedad del injerto contra el huésped es una de las complicaciones más
graves del TPH y una importante fuente de morbilidad y mortalidad post
trasplante. El tratamiento preventivo actual de la EICH incluye la depleción de
linfocitos T del injerto y/o la administración de agentes inmunosupresores. Sin
embargo, estas medidas pueden aumentar la aparición de infecciones
oportunistas y en casos graves una reducción significativa de la recuperación
hematológica.
En este contexto las MSC han demostrado que pueden evadir el
reconocimiento del sistema inmune del recipiente (no expresan MHC-II)
pudiendo además modular y/o suprimir la respuesta inmune frente a células
alogénicas hasta de origen xenogénico. Aunque los mecanismos exactos de estos
efectos no se conocen, se ha reportado que incluso la administración de MSC de
un tercer donante aumenta la tasa de supervivencia en el TPH alogénico de
médula ósea. Asimismo se ha descrito que la infusión de MSC en un paciente
que recibiendo un TPH alogénico no relacionado había desarrollado un EICH
grado IV resistente a tratamiento pudo revertir los síntomas hasta un año post
trasplante. Estos resultados sugieren que la infusión de MSC puede desarrollarse
como una terapia profiláctica y de tratamiento de la temida EICH.
6.1.3
TPH de progenitores de sangre de cordón umbilical (SCU)
22
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
La mayor limitación para el uso de la SCU en el TPH es la dosis celular del
injerto, la limitación de progenitores hematopoyéticos causa, sobretodo en
pacientes adultos, retraso en la recuperación hematopoyética y un mayor índice
de fallo de injerto. En este sentido, las aproximaciones experimentales más
interesantes que se están investigando actualmente incluyen la expansión de
progenitores mediante el cocultivo con MSC y la coinfusión de dos o más
unidades de cordón.
Las MSC forman en cultivo un estroma que no sólo interacciona físicamente
con las células progenitoras CD34+ sino que produce señales reguladoras
mediante la producción de citocinas y factores de crecimiento. Se ha descrito el
uso de soportes estromales de MSC de médula ósea y de SCU para la expansión
de progenitores de cordón resultando en una mayor producción de CD34+ (x37)
que los cultivos líquidos a partir de células seleccionadas y aporte de citocinas
(x20). Además, el cocultivo y coinfusión del producto puede beneficiarse de la
aparente actividad facilitadora de injerto de las MSC.
En el contexto de un TPH de varias unidades de UCB, la coinfusión de MSC
(multidonante) disminuye la predominancia de una unidad sobre las otras,
principal causa de los limitados resultados de esta aproximación terapéutica,
facilitando así el uso de múltiples unidades de UCB en el TPH cuando no exista
médula ósea compatible o la dosis celular de la unidad de SCU baje de unos
determinados límites (107 células nucleadas totales/kg; 105 CD34+/kg).
7. Aplicaciones de Medicina Regenerativa
7.1
Traumatología
Una de las aplicaciones in vivo más exitosas en el ámbito de la medicina
regenerativa ha sido la reparación de hueso y cartílago mediante la aplicación
local de MSC aisladas o embebidas en matrices de soporte, normalmente
hidroxiapatita / fosfato-tricálcico. No en vano, de las tres líneas de
diferenciación mesodérmicas que exhiben las MSC, la diferenciación
23
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
osteogénica en cultivo es predominante y representa un 60% de los clones de
células estromales aislados de médula ósea.
Adicionalmente, se ha utilizado el trasplante alogénico de MSC para tratar
pacientes pediátricos diagnosticados de osteogénesis imperfecta grave. Pocos
meses después del trasplante, la masa mineral corporal total se incrementó
significativamente en todos los casos y se observó aumento de la densidad ósea
en el hueso trabecular. La falta de reacciones adversas y los resultados clínicos
reportados avalan la utilización de MSC en esta disciplina.
7.2
Infarto de miocardio
Diferentes ensayos clínicos en humanos han mostrado que la administración
local de la fracción mononuclear de médula ósea mejora, tanto a corto como a
largo plazo, la perfusión ventricular después de un episodio de infarto de
miocardio (IM). Estos efectos beneficiosos se han relacionado con la formación
de nuevos vasos sanguíneos así como con el aumento de la producción de
factores angiogénicos en la zona infartada. En este sentido, la aplicación de
MSC aisladas o cotrasplantadas con la fracción mononuclear podría ser una
mejora en el tratamiento del IM.
Resultados recientes demuestran que la inyección intracoronaria de MSC mejora
de forma sustancial y sostenida el aumento de la fracción de eyección del
ventrículo izquierdo, mostrando resultados más beneficiosos que los publicados
mediante la aplicación de células mononucleadas. Destacar que estos resultados
proporcionan a su vez evidencias de que la infusión de MSC no está asociada a
efectos adversos mediados por el tamaño celular tal y como se había reportado
anteriormente que avalan su utilización terapéutica.
24
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
Figura 10
25
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 1. Área Transfusión
8. Bibliografía
Se incluirá como material docente un par de revisiones recientes sobre células
mesenquimales, una sobre su biología y otra sobre su efecto inmunomodulador.
26
Unidad didáctica 3:
Terapia génica
Dr. Jordi Barquinero
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia Celular
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Terapia génica. Generalidades.
3.1.
Vectores
4. Ensayos clínicos
4.1
Aplicación a enfermedades monogénicas
4.2
TG en células madre hematopoyéticas: los primeros
éxitos
5. Bibliografía
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1. Introducción
Desde los primeros ensayos de terapia génica (TG), a principios de los 90, y a
pesar de los notables avances producidos en esta joven disciplina, son todavía
muy pocos los pacientes en el mundo que se han beneficiado de ella. Las
razones son muy diversas: vectores subóptimos, limitaciones técnicas, escaso
conocimiento en biología celular, precipitación, exceso de optimismo, falsas
expectativas, o la nefasta influencia de los medios de comunicación, entre otras.
En esta unidad abordaremos las bases de la TG, así como los riesgos y los
beneficios de los ensayos clínicos más relevantes que se están realizando.
2. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería:
-
Conocer las bases teóricas de la terapia génica, sus actuales limitaciones,
y la situación y resultados de los primeros ensayos clínicos que podrían
considerarse exitosos con esta nueva forma de terapia.
3
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Módulo 2
3. Terapia génica. Generalidades. En este capítulo vamos a revisar el concepto de TG, los tipos de vectores que se
están empleando en la actualidad, así como una visión general de los primeros
ensayos clínicos que han llegado a tener éxito. En primer lugar, recordar que un
gen es un segmento de ADN que lleva la información para transcribirse en un
ARN mensajero que posteriormente se traducirá a una o más proteínas. Las
mutaciones, o cambios en la secuencia de ADN, para ser patológicas tienen que
conllevar un aumento o disminución de la función de la proteína.
Distinguimos entre enfermedades monogénicas y poligénicas si se originan por
alteración de uno o varios genes. La idea de la TG surgió en los años 80,
inicialmente como una posible solución para las enfermedades monogénicas. Es
una forma de intervención médica basada en la modificación del material
genético de las células. Se puede aplicar in vivo, es decir, introduciendo el
material genético en el interior del organismo o ex vivo con células extraídas del
paciente que posteriormente se implantan (ver figura).
Figura 1
En los protocolos de TG hay que considerar en primer lugar dos elementos
básicos: los genes terapéuticos y los vectores a utilizar. Los genes terapéuticos
pueden reemplazar genes que producen proteínas no funcionales, inhibir el
efecto de genes que están patológicamente activos, o incluso pueden ser genes
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Módulo 2
tóxicos o suicidas con la idea de eliminar células tumorales. Los vectores son los
vehículos que van a transportar estos genes a las células diana y de ellos
dependerá que el gen se integre o no en su genoma, el porcentaje de células que
expresan el gen terapéutico, el que la expresión del gen sea estable o transitoria,
o que la expresión del gen sea selectiva y específica en un particular tejido. El
diseño de nuevos vectores es uno de los grandes desafíos actuales en TG.
3.1
Vectores
Existen dos grandes categorías de vectores, según deriven de virus o no. Los
vectores no virales suelen ser compuestos macromoleculares basados en lípidos
o en polímeros catiónicos que se unen al ADN y que facilitan su transporte a las
células diana. La transferencia de ADN desnudo o envuelto en liposomas se
utiliza cuando existen posibilidades terapéuticas sin necesidad de transducir
eficientemente el tumor, por ejemplo, cuando se busca la inducción de una
respuesta inmune antitumoral. Cuando, por el contrario, se requiere una elevada
eficiencia de transducción o que ésta sea estable, hay que usar vectores virales.
Para generar vectores se han utilizado diversos tipos de virus: retrovirus, virus
adenoasociados, adenovirus, herpesvirus, etc. Los retrovirus son virus de ARN,
con un genoma de 8 kilobases mayoritariamente substituible por genes
terapéuticos (ver esquema de su estructura en la siguiente figura). Los vectores
retrovirales basados en el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV)
sólo se integran en el genoma de células en división, mientras que los derivados
de lentivirus (otro tipo de retrovirus cuyo representante más conocido es el
virus del SIDA) tienen la ventaja de no requerir división celular para integrarse y
expresarse. La integración conlleva la presencia estable del ADN terapéutico en
la célula diana pero por otra parte tiene el potencial para producir alteraciones
genéticas secundarias de tipo oncogénico, como luego se verá.
En general los retrovirus no se pueden concentrar a títulos superiores a 107
partículas infectivas por mL y son inactivados por el complemento de la sangre
lo que limita su uso in vivo. Los virus adenoasociados (AAV) son virus de ADN
de doble cadena de 5 kilobases que, como los retrovirus, se pueden integrar en
la célula transducidas. Los AAV pueden concentrarse hasta títulos de 1013
viriones por mL y no se inactivan en sangre con lo que son aptos para su
administración in vivo. Al contrario que los retrovirus y AAV, los adenovirus son
5
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Módulo 2
Figura 2
muy inmunogénicos y no se integran en la célula transducida. Se usan
mayoritariamente en TG del cáncer o en situaciones en las que la expresión
estable del transgén no sea esencial.
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Módulo 2
Figura 3
7
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Módulo 2
4. Ensayos clínicos
4.1
Aplicación a enfermedades monogénicas
Las enfermedades monogénicas constituyen el paradigma de las candidatas a
máximas beneficiarias de la TG. De las casi 10000 enfermedades genéticas
descritas, por el momento sólo unas pocas son un objetivo de este tipo de
terapia por el mejor conocimiento que se tiene de sus bases moleculares, por el
órgano o tejido afectado, por la necesidad de regulación en la expresión del gen
terapéutico, o porque ya se dispongan de los vectores y de la experiencia
preclínica adecuada en su corrección a nivel molecular.
Desde los inicios de la TG a principios de los 90, y hasta la actualidad se han
iniciado más de un centenar de ensayos clínicos para enfermedades
monogénicas, lo que representa casi un 10% del total de ensayos aprobados en
el mundo (ver http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical). La corrección
permanente de los defectos genéticos requiere generalmente de vectores que
integren los genes terapéuticos en el genoma de las células diana, de forma que
éste se transmita a toda su progenie. Los vectores retrovíricos basados en el
MoMLV fueron los primeros en ser utilizados como vectores en los ensayos
clínicos y siguen siendo, casi dos décadas después, los vectores integrativos más
utilizados, sobretodo en aplicaciones basadas en las células madre.
Dada la relativamente alta prevalencia de la hemofilia, la TG para las diversas
formas de esta enfermedad ha sido objeto de intensa investigación en los
últimos años. Actualmente, los modelos caninos de hemofilia (A y B) son
curables mediante TG. Sin embargo, los ensayos en humanos no han sido tan
exitosos. Ha finalizado un total de tres ensayos clínicos y otros dos están
todavía en marcha, que incluyen diversas estrategias (músculo esquelético,
hígado y fibroblastos cutáneos como tejido diana), así como distintos tipos de
vectores (retrovirus, adenovirus y AAV). En general sólo se ha conseguido
producción del factor (VIII o IX) de forma subóptima y/o transitoria.
4.2
TG en células madre hematopoyéticas: los primeros éxitos
Para los defectos genéticos que afectan a los distintos linajes hematopoyéticos
las dianas ideales son las células madre hematopoyéticas (CMH), ya que una vez
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Módulo 2
trasplantadas son capaces de reconstituir la hematopoyesis (incluyendo el
sistema inmune) de por vida. A pesar de no estar completamente caracterizadas,
las CMH humanas pueden ser enriquecidas unas 100 veces seleccionando la
fracción CD34+, transducidas en cultivo y trasplantadas, de forma análoga a un
trasplante convencional de progenitores hematopoyéticos.
Con todo, la primera ola de ensayos realizados desde 1990 se saldó
mayoritariamente con fracasos, de forma que un panel de expertos recomendó
en 1995 una vuelta a los laboratorios y a la investigación básica. Los clínicos se
habían precipitado en iniciar los ensayos con herramientas que aún no estaban a
punto. A finales de los 90 se volvió a la carga con mejores herramientas y más
conocimientos hasta que en verano del 2000 un equipo francés reportó el
primer gran éxito de TG en niños con inmunodeficiencia combinada severa
ligada al cromosoma X (SCID-X1). La enfermedad se caracteriza por un defecto
en el gen de la cadena gamma común (γc), que codifica para una subunidad de
los receptores para las interleucinas 2, 4, 7, 9, 15 y 21.
Figura 4
Se hereda de forma ligada al cromosoma X, representando aproximadamente la
mitad de todos los casos de SCID. Cursa con una ausencia casi total de células
B, T y NK funcionales, lo que resulta en infecciones graves y frecuentes que
suelen ser fatales durante los primeros años de vida.
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Módulo 2
Figura 5
El ensayo del grupo francés se basó en la introducción del gen γc utilizando un
vector retrovírico en las células CD34+ de la médula ósea de los propios
pacientes, que se reinfundieron de nuevo a los pacientes en ausencia de
tratamiento mieloablativo. Pocos meses después de la infusión de las células
corregidas genéticamente, los recuentos de células T alcanzaron cifras normales
y la función inmunitaria mejoró significativamente en prácticamente todos los
niños tratados. Estos resultados fueron confirmados independientemente por
investigadores británicos usando un protocolo similar en otros seis pacientes. La
clave del éxito radicaba en el hecho que las células genéticamente modificadas,
con su receptor para las interleucinas ya funcional y por tanto capaces de
responder a los factores de crecimiento adecuados, podían proliferar y
diferenciarse y tenían una ventaja selectiva para repoblar los nichos (células T y
NK, y secundariamente B) virtualmente vacíos, mientras que las células no
corregidas seguían muriendo por apoptosis, lo que dió como resultado una
repoblación completa por células T y NK genéticamente corregidas.
El segundo éxito reconocido de la TG para enfermedades monogénicas fué
publicado en el 2002 por investigadores italianos en pacientes con otra forma de
inmunodeficiencia primaria llamada SCID-ADA. El enzima ADA cataliza la
desaminación de la desoxiadenosina a adenosina, resultando su ausencia en un
acúmulo de metabolitos altamente tóxicos para las células T. Como ocurre en la
SCID-X1, el trasplante de médula ósea de un donante compatible (hermano), si
está disponible, constituye la mejor alternativa terapéutica. Si no hay
disponibilidad de donante, los pacientes pueden ser tratados con ADA bovino
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Módulo 2
pegilado (PEG-ADA), que corrige parcialmente la deficiencia inmune en la
mayoría de casos, aunque esta terapia resulta extremadamente cara.
Curiosamente, el primer ensayo clínico de TG se realizó en niños con
deficiencia de ADA en Estados Unidos en 1990. Consistió en la inserción de
una versión funcional del gen ADA en células T autólogas o bien en células
progenitoras hematopoyéticas, que fueron reinfundidas de nuevo a los pacientes.
Doce años más tarde, los pacientes tratados, a los que se les mantuvo la terapia
con PEG-ADA, expresaban el enzima, pero a unos niveles subterapéuticos.
Este ensayo clínico se consideró fallido, probablemente porque la terapia
substitutiva con ADA recombinante estaba anulando la ventaja selectiva para las
células genéticamente modificadas. Los investigadores italianos fueron más
atrevidos, acondicionaron a los pacientes con una dosis moderada de busulfán,
con el fin de facilitar el injerto, y retiraron el tratamiento substitutivo con PEGADA, de manera que se pudiera poner de manifiesto la potencial ventaja
selectiva de las células genéticamente “corregidas”.
Estos primeros éxitos aportaron renovadas esperanzas a esta joven disciplina. El
hecho que dos tipos de SCID fueran las primeras enfermedades en ser curadas
mediante TG no fue una sorpresa. Ya hemos comentado la fuerte ventaja
selectiva que opera en las células genéticamente corregidas para proliferar o
escapar de la apoptosis, y por ello también para repoblar in vivo. Por desgracia,
no se espera que resulte tan fácil para la mayoría de enfermedades candidatas a
ser corregidas usando células madre en las que no existe ninguna ventaja
selectiva para las células modificadas (que son la inmensa mayoría). Una
prometedora línea consiste en el empleo de genes seleccionables que, una vez
introducidos junto al gen terapéutico permiten la selección in vivo de las células
“corregidas” usando agentes farmacológicos.
Inserciones retrovirales y riesgo oncogénico
Por definición, todas las inserciones en el genoma son mutagénicas. Sin
embargo, el riesgo de oncogénesis por inserción tras los procedimientos de
transferencia génica estándar usando vectores integrativos en los modelos
preclínicos se consideraba extraordinariamente remoto. Por ello, el hallazgo que
cuatro de los once niños tratados en el ensayo clínico francés para SCID-X1
antes mencionado desarrollaran leucemias, años después de recibir la TG,
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Módulo 2
sorprendió a toda la comunidad médica y científica, especialmente cuando se
descubrió la existencia de una zona “caliente” para la inserción retroviral y
crítica para la transformación leucémica en el locus del protoncogén LMO2.
Figura 6
Previamente no se habían descrito efectos adversos similares en los cerca de 200
pacientes tratados en ensayos clínicos similares que también usaban vectores
integrativos, incluyendo la SCID- ADA, o, exceptuando casos puntuales, en los
miles de animales experimentales sometidos a procedimientos de transferencia
génica integrativa. Esto planteaba la pregunta crucial de si la TG basada en este
tipo de vectores era más peligrosa de lo que se pensaba, o de si estos dos casos
estaban más relacionados con factores dependientes del contexto, y por lo tanto
eran excepcionales y no podían ser extrapolables a otras situaciones.
Buscando en una base de datos de varios miles de cánceres hematológicos
murinos
inducidas
por
inserciones
retrovirales
(IR)
experimentales
(http://RTCGD.ncifcrf.gov), Dave et al. encontraron dos casos asociados a
inserciones cercanas al locus LMO2 y dos con inserciones en el locus IL2RG (el
del gen terapéutico en esta enfermedad). Una de ellas contenía una inserción en
cada uno de ambos loci. Las probabilidades de que esos dos eventos se
produjeran en la misma célula son tan remotas que el hallazgo sugiere que la
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Módulo 2
expresión no regulada del transgén γc dirigida por el LTR retroviral se convirtió
en un inesperado cofactor para la transformación leucémica.
Estos casos de leucemia descritos por los investigadores franceses generaron
una respuesta desmedida por parte de los medios de comunicación y la sociedad,
así como escepticismo hacia la TG por parte de la comunidad científica. Las
agencias reguladoras de diversos países prohibieron los ensayos clínicos basados
en vectores integrativos. En conjunto, estas reacciones condujeron a una
profunda recesión en el campo, llegándose a la paradoja que a los niños con
SCID-X1 se les vetaba una terapia que podía salvarles la vida. A pesar del riesgo
de desarrollar una leucemia tras el tratamiento genético (por otra parte
potencialmente curable), la única alternativa terapéutica es un trasplante
alogénico de medula ósea, con una probabilidad de éxito del 90% si el donante
es un hermano compatible (para los europeos disponible en menos de un tercio
de los casos), y alrededor de un 70% si el donante es no emparentado (no
familiar). Esto representaba un gran dilema ético, ya que la TG para dicha
enfermedad era probablemente una alternativa superior al transplante no
relacionado, y de hecho la realidad era que la TG había salvado a la mayoría de
los pacientes tratados. En este momento, muchos países han levantado el veto a
los vectores integrativos, que se han rediseñado y optimizado para minimizar
sus potenciales riesgos.
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Módulo 2
Bibliografía
1. Cavazzana-Calvo, M., Hacein-Bey, S., de Saint Basile, G., Gross, F.,
Yvon, E., Nusbaum, P., Selz, F., Hue, C., Certain, S., Casanova, J.L., et
al. 2000. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency
(SCID)-X1 disease. Science 288:669-672.
2. Aiuti, A., Slavin, S., Aker, M., Ficara, F., Deola, S., Mortellaro, A.,
Morecki, S., Andolfi, G., Tabucchi, A., Carlucci, F., et al. 2002.
Correction of ADA-SCID by stem cell gene therapy combined with
nonmyeloablative conditioning. Science 296:2410-2413.
3. Fischer, A., and Cavazzana-Calvo, M. 2005. Integration of retroviruses:
a fine balance between efficiency and danger. PLoS Med 2:e10.
4. Naldini, L. 2006. Inserting optimism into gene therapy. Nat Med
12:386-388.
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Unidad didáctica 4:
Banco de tejidos. Donación y
obtención de tejidos.
Selección de donantes y
receptores: organización y
logística
Dra. Flora Moya
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia Celular
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Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Donantes. Consideraciones generales
3.1
La donación de tejidos
3.2
Proceso de donación
3.2.1. Tipos de Donantes
3.2.2. Normativa Legal.
3.2.3. Gratuidad de las Donaciones.
3.2.4. Confidencialidad.
3.2.5. Finalidad.
3.2.6. Publicidad y Promoción.
4. Consentimiento informado
4.1
Condiciones del Consentimiento
4.2
Criterios de selección
5. Requerimientos técnicos – quiroófano extracción BST
5.1
Climatización
5.2
Entorno
5.3
Iluminación
5.4
Mesa operatoria
6. Bibliografía
2
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Módulo 2
1. Introducción.
Los bancos de tejidos son estructuras funcionales complejas que abordan todos
los aspectos de la cadena operativa, desde la obtención del tejido hasta su
suministro a los prescriptores finales, para su utilización clínica.
Como se ha podido comprobar en otras secciones de este módulo, la mayor
parte de sus procesos son eminentemente técnicos y, aunque complejos, son
asequibles y estandarizables. No obstante, todos ellos están supeditados a la
existencia de tejidos, la materia prima, que solo puede ser asegurada a través de
un exquisito proceso de promoción de la donación y consentimiento del
donante.
Esta es una actividad médica con una gran carga positiva de valores humanos
que generalmente es llevada a cabo por los coordinadores hospitalarios de
trasplante. En el presente capítulo se desarrollan las bases fundamentales de la
promoción y donación de tejidos, así como los aspectos regulatorios de esta
actividad.
Como podrán comprobar, gran parte de la información que se presenta está
basada en el modelo español, especialmente referenciado a nivel internacional y
pionero en muchos aspectos.
2. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería:
- Conocer los aspectos generales del proceso de donación de tejidos
- Conocer los criterios de evaluación de donantes de tejidos
- Conocer los estándares y aspectos legales y regulatorios de esta actividad.
- Conocer los aspectos técnicos asociados al proceso de donación de tejidos
3
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Módulo 2
3. Donantes. Consideraciones generales
3.1
La donación de tejidos
La donación de tejidos es una gran desconocida. Es tal la divulgación en los
medios de comunicación de la donación de órganos, que la donación de tejidos
queda en el terreno de lo secundario i parece que si no sirve para “salvar vidas”
no sea importante su obtención. En algunos medios ni tan solo se cree que sean
verdaderos “trasplantes” ya que la dinámica es totalmente distinta y se habla de
tejido implantado y no de tejido trasplantado.
El origen es común. Obedecen a un acto de altruismo, totalmente desinteresado.
Hay una organización de profesionales sanitarios que detectan el potencial
donante. Se evalúa la causa de la muerte mediante historia i análisis, i un vez
que se cumplen los requisitos, se procede a solicitar a los familiares el
consentimiento de donación. Una vez obtenido se organiza el operativo de
extracción de los tejidos.
Fiura 1. Evaluación del donante. Proceso multidisciplinar (Dra. Teresa Pont, Dra. Núria
Masnou, Dr. Pere Salamero. Direcció de Planificació i Avaluació de Trasplantaments
d’Òrgans i Teixits. H. V.H. Barcelona)
Intensivistas
Patólogos
Radiólogos
Inmunólogos
Hepatólogos
Microbiólogos
Neumólogos
Bioquímicos
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Módulo 2
El Coordinador de Trasplante es la figura médica que se ocupa de todo el
proceso de donación, junto a un equipo de profesionales, ( fig.1) y avisa a los
distintos equipos de extracción.
Figura 2. Misión del coordinador (Dra. Teresa Pont, Dra. Núria Masnou, Dr. Pere
Salamero Direcció de Planificació i Avaluació de Trasplantaments d’Òrgans i Teixits)
Una vez obtenido el tejido, en la mayor parte de ellos el equipo de extracción lo
remite a los Bancos de Tejidos que se encargan de procesarlos, conservarlos y
prepararlos para su aplicación clínica. En algunos casos el mismo equipo
extractor se encarga de la evaluación i trasplante. Es el caso del tejido corneal.
Todas estas actividades son reguladas por disposiciones y normas por los
organismos competentes. La Organización Nacional de Trasplantes (ONT) es
quien tiene la responsabilidad de redactar y desarrollar una reglamentación que
rija el trasplante de órganos y Tejidos en España, elabora estadísticas e informes
de todo el estado. www.ont.es . En Catalunya es la Organització Catalana de
Trasplantaments (OCATT) quien se ocupa de su control a nivel autonómico
(www.ocatt.net).
Las sociedades científicas tales como la Asociación Española de Bancos de
Tejidos, www.aebt.es, consensúan estándares de calidad que aseguran la calidad
de los tejidos, desarrollándose una política de calidad propia validada por
distintos organismos de calidad.
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Módulo 2
3.2
Proceso de donación
3.2.1.
Tipos de Donantes
a.
Donante vivo: persona que dona tejidos o células
humanas para
trasplante autólogo y homólogo de forma altruista
b. Donante cadáver: persona fallecida en muerte encefálica o asistolia, que
no habiendo manifestado en vida su oposición, dona, de forma altruista,
tejidos y células destinados a ser aplicados en el ser humano.
3.2.2.
Normativa Legal. El Real Decreto 1301/2006, de 10 noviembre por el
que se establecen las normas de calidad y seguridad para la donación, la
obtención, la evaluación, el procesamiento, la preservación, el almacenamiento y
la distribución de células y tejidos humanos y se aprueban las normas de
coordinación y funcionamiento para su uso en humanos.
3.2.3.
Gratuidad de las Donaciones. La donación de tejidos y células será
voluntaria y altruista, no pudiéndose percibir contraprestación económica o
remuneración alguna.
3.2.4. Confidencialidad.-Se debe garantizar la confidencialidad de los datos de
los donantes en relación a la salud, resultados y trazabilidad de sus donaciones
de acuerdo con la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de noviembre, de Protección de
Datos de Carácter Personal. Los establecimientos de tejidos deben tratar los
datos relacionados con los donantes siguiendo las medidas de seguridad más
estrictas que se prevén en el Reglamento de medidas de seguridad de los
ficheros automatizados que contengan datos de carácter personal, Real Decreto
994/1999, de 11 de Junio.
3.2.5. Finalidad. La obtención de tejidos humanos de donante cadáver podrá
realizarse con fines terapéuticos y/o científicos y la de donantes vivos será
exclusivamente
terapéutica,
sin
perjuicio
de
las
investigaciones
que
adicionalmente se puedan realizar.
3.2.6. Publicidad y Promoción. La promoción y publicidad de la donación de
tejidos debe realizarse con carácter general y señalando su carácter voluntario,
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Módulo 2
altruista y desinteresado. El beneficio de la promoción y publicidad no debe en
ningún caso buscar un beneficio para personas ni instituciones concreta
Las diferentes organizaciones de trasplantes estatales i autonómicas, ofrecen
modelos de promoción de la donación de tejidos basados en la información de
las diferentes modalidades de donación y de la necesidad del trasplante de
tejidos. En la web de l’Organització Catalana de Trasplantament OCATT:
www.gencat.net/catsalut/ocatt/es también en ONT: www.ont.es hay ejemplos
de este sistema de promoción
4. Consentimiento informado
4.1
Condiciones del Consentimiento
En España toda persona que no haya manifestado explícitamente su oposición a
ser donante, es donante. Pero, en cambio siempre se consulta a la familia o
allegados si consideran que lo puede ser. Este protocolo de actuación obedece a
que una vez la persona ha fallecido, sus familiares i herederos son los
responsables de decidir todo lo referente al finado, incluso si puede o no ser
donante. Los familiares que obran en conciencia deben respetar en todo caso la
voluntad del fallecido, tanto en caso afirmativo como en caso negativo.
•
En el caso de que se trate de menores o personas incapaces de consentir, la
oposición de la donación podrá hacerse constar por quienes hubieran
ostentado en vida de aquellos su representación legal.
•
En el caso del donante vivo, la obtención de células o tejidos humanos para
trasplante o investigación requiere de su autorización a través del
consentimiento informado. El consentimiento podrá ser revocado en
cualquier momento antes de la obtención de la célula o tejido.
•
En el donante cadáver, la donación requiere de un documento donde
conste la ausencia de conocimiento de oposición expresa a la donación,
declarada y firmada por los familiares o personas allegadas al donante
cadáver. obteniendo la voluntad de donar sin ningún tipo de coacción.
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Módulo 2
En este tipo de donante y más aún en el caso de una muerte no esperada es
cuando más difícil es abordar a la familia para solicitar su consentimiento. En
estos casos se produce un bloqueo i una negación de muerte del familiar, más
importante según la relación que exista entre ellos y su idiosincrasia particular.
Es importante que el personal sanitario y no sanitario del entorno de la
donación de tejidos conozca los rasgos fundamentales de lo que significa la
obtención del consentimiento familiar para una donación. La inversión en
cultura de la donación de tejidos redundará en un mayor respeto a la donación y
a una mayor valoración del producto a implantar.
Figura 3: Ejemplo de taller de formación para el personal de Banc de Sang i Teixits
Así como se debe explicar la necesidad de realizar una evaluación de la historia
médica y social, determinaciones serológicas con la finalidad de evitar la posible
transmisión de enfermedades al receptor.
En el caso del donante cadáver, si las circunstancias no permiten obtener el
consentimiento en persona, éste podría ser obtenido por teléfono, dejando
constancia escrita del consentimiento, especificando que éste ha sido dado por
teléfono y con testimonio de la conversación telefónica. Se registrarán los datos
identificativos de la persona que ha dado el consentimiento, la relación que tiene
con el donante, el número del teléfono al que se ha llamado y a través del cual se
ha obtenido el consentimiento, la firma de la persona responsable que lo ha
obtenido así como la del testigo de la conversación. Es recomendable, sí las
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Módulo 2
condiciones técnicas lo permiten grabar la conversación previa explicación y
consentimiento.
De igual forma podría hacerse a través de la transmisión de un fax. La persona
responsable de obtener el consentimiento envía el documento a través del fax,
que deberá firmar la persona que autoriza la donación, y éste lo remitirá
completado y firmado.
Hay diferentes modelos para el consentimento. Lo más seguro es seguir el
formulario propuesto por los organismos oficiales.
4.2
Criterios de selección
Generales
A diferencia de la donación de órganos hay unos criterios excluyentes por edad,
más o menos seguidos por los distintos Bancos de Tejidos para cada tejido en
concreto. Recomendamos consulta de los estándares de la AEBT. El proceso
que causó la muerte, excepto en la donación de tejido corneal, no debe
corresponder a una neoplasia ni a un proceso infeccioso sin controlar. El detalle
de procesos que contraindican y no contraindican lo pueden consultar en el
Real Decreto de noviembre del 2006 que podrán consultar en las Webs de
OCATT y ONT.
Examen Físico
Estará encaminado a descartar la presencia de lesiones sugestivas de
drogadicción.
Requisitos de la Historia Médica
Es fundamental que la evaluación descarte la presencia de cáncer con mención
especial en los tumores del Sistema Nervioso Central que contraindican y no
contraindican. Para recalcar su importancia los resumimos en la tabla 1.
Con respecto a infecciones hay también valoración.
Contraindican: causas sistémicas
•
Infecciones diseminadas causantes de la ME
•
Sepsis bacteriana activa
•
Funguemia activa
9
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•
Meningitis per Listeria, M tuberculosis , hongos y protozoos.
•
Encefalitis herpética
No contraindican:
•
Meningitis bacteriana correctamente tratada de manera eficaz.
•
Endocarditis bacteriana ( sin abscesos a otros órganos) por gérmenes
identificados y con tratamiento eficaz
•
Bacteriemia (5% de los donantes) por gérmenes poco virulentos y
correctamente tratados.
•
Infecciones locales ( valorar cada tejido)
Tabla 1: Valoración específica de las tumoraciones cerebrales en la donación de tejidos
10
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Módulo 2
Análisis Serológicos
Requerimientos Generales
Las muestras de sangre que se obtienen para realizar tests o determinaciones
analíticas relacionadas con el donante deben ir debidamente etiquetadas con la
información relativa al lugar y el momento en que se han recogido las muestras.
Valoración de los análisis con transfusión de sangre reciente del paciente
Cuando los donantes han recibido transfusiones de sangre, componentes
sanguíneos y/o coloides dentro de las 48 horas previas a la muerte, o
cristaloides en la hora previa, si se espera una hemodilución superior al 50%,
debe aplicarse un algoritmo de decisión.
Se podrán aceptar los donantes de tejidos y/o células con tasas de hemodilución
superior al 50% si se dispone de una muestra de sangre previa a la transfusión o
si los tests de laboratorio están validados para muestras hemodiluidas. En caso
contrario se debe descartar al donante por el efecto de la hemodilución sobre
los resultados de las determinaciones serológicas.
Obtención de Muestras de Sangre
En los donantes fallecidos las muestras deberían obtenerse antes del
fallecimiento o lo antes posible siempre antes de transcurridas 24 horas desde la
muerte.
En el caso de donantes vivos las muestras de sangre para realizar las serologías
se obtienen en el momento de la donación o en el margen de los 7 días
siguientes a la donación cuando los tejidos no son almacenados. Cuando los
tejidos y/o células de donantes vivos se almacenan durante largos periodos se
requerirá una segunda determinación a los 180 días.
En estos casos la muestra de sangre obtenida en el momento de la donación se
puede tomar entre los 7 días previos y 30 posteriores. La segunda determinación
podrá evitarse si se realizan técnicas de amplificación de DNA para HIV, HBV
y HLV.En los donantes neonatos la muestra se debe obtener de la madre para
evitar procedimientos médicos innecesarios al niño.
11
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 4: Ejemplo de algoritmo para el cálculo de la hemodilución de un donante que ha
recibido sangre, componentes sanguíneos, o expansores de volumen plasmático, en las 48 horas
previas a la muerte.
12
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Notificación de Resultados Positivos Confirmados
Los resultados positivos para HBs Ag, anti-VHC, anti-VIH y, en general, para
cualquier marcador que tenga significación clínica, deberán confirmarse
mediante los procedimientos adecuados antes de su notificación. Una vez
confirmados, se deberán comunicar al donante vivo o al familiar más próximo
en el caso del donante cadáver. Así mismo, si se trata de enfermedades
infecciosas de declaración obligatoria, serán notificadas a las autoridades
sanitarias locales o nacionales.
Seroteca
Los establecimientos de tejidos deberán mantener un archivo de sueros de los
donantes al menos 10 años a partir de la última aplicación clínica o de la fecha
de caducidad de las células/tejidos, con el fin de realizar los controles biológicos
cuando sean necesarios.
Cribado Serológico
1. Pruebas biológicas indispensables para los donantes de tejidos y células (salvo
los donantes de células reproductoras):
• VIH 1 y 2: Anticuerpos Anti VIH 1 y 2. Debería realizarse la determinación de
anticuerpos frente a VIH 1 y 2 con una prueba con capacidad para detectar el
Grupo O del VIH. El resultado positivo es suficiente para la exclusión del
donante. Los falsos negativos debidos a periodos ventana pueden minimizarse
con una técnica NAT para los distintos virus.
• Hepatitis B:
-
HBs Ag El resultado positivo es suficiente para la exclusión del
donante.
-
Anti HBc cuando el resultado sea positivo y el HBs Ag sea negativo,
deben realizarse pruebas adicionales para determinar si los tejidos y
células pueden ser utilizados o, por el contrario, deben descartarse, (por
ejemplo: Ac HBs, DNA VHB).
13
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Mostramos algoritmo para Virus B en la Tabla 2.
• Hepatitis C:
-
Anticuerpos Anti VHC: El resultado positivo es suficiente para la
exclusión del donante.
-
En caso de progenitores hematopoyéticos se requerirá además PCR.
• Sífilis: Se aplicará un algoritmo diagnóstico para excluir la presencia de
infección activa por Treponema Pallidum:
-
Test negativo, específico o no: permite la utilización de tejidos o células.
-
Test no específico positivo: deberá utilizarse un test específico; si éste
último es negativo, podrán utilizarse tejidos o células.
-
Test específico positivo: es necesaria una evaluación específica del
riesgo para determinar el uso o no de las células y tejidos.
Aunque el treponema puede ser erradicado por distintos métodos, el resultado
positivo para treponema deberá ser considerado como un factor de riesgo para
las enfermedades de transmisión sexual.
2. Virus de la Leucemia de células T:
• Anticuerpos Anti HTLV I y II: deben, al menos, realizarse en aquellos
donantes que viven o proceden de zonas endémicas. También debe realizarse en
los donantes que sean parejas sexuales o hijos de personas que viven o vienen
de dichas zonas endémicas. Es recomendable realizarlo en todos los donantes
de tejidos. El cribado serológico se lleva a cabo mediante la detección de
anticuerpos IG G específicos mediante la utilización de pruebas que deberían
detectar conjuntamente los anticuerpos IgG frente al HTLV I y II (ELISA). La
positividad contraindica la donación.
3. En determinadas circunstancias es recomendable realizar tests adicionales
dependiendo de la historia del donante o las características de las células o
tejidos a utilizar (CMV, Trypanosoma Cruzi, Toxoplasma, Plasmodium sp,
Dengue, VEB, HLA, RhD).
14
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Tabla 2: Algoritmo utilizado en el Centre de Teixits i Terapia Cel·lular
4. Donante vivo:
• Donante vivo autólogo: si las células o tejidos obtenidos van a ser
almacenados, cultivados o sometidos a algún proceso de transformación “ex
vivo” deberán realizarse los mismos tests que en el donante alogénico. Los
resultados positivos de cualquiera de los tests no impedirán el reimplante de las
células, los tejidos o los productos derivados.
15
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
• Donante vivo alogénico: en los casos de trasplante de progenitores
hematopoyéticos pueden aceptarse donantes con marcadores virales B y C
positivos. En la donación de gametos dentro de la pareja se seguirán los criterios
especificados al efecto y recogidos en el anexo IV del R.D. 1301/2006 de 10 de
noviembre.
• Cuando las células y tejidos se vayan a almacenar durante largos periodos, será
necesaria una segunda determinación a los 180 días, o bien, pueden emplearse
técnicas de amplificación de DNA o RNA para determinar la presencia de VIH,
VHB y VHC. Tampoco sería necesaria si durante la fase de procesamiento del
tejido o grupo celular se incluye algún proceso validado de inactivación viral.
5. Si bien en la actualidad las diferentes técnicas utilizadas para detectar
marcadores de trasmisibilidad poseen una elevada calidad en términos de
sensibilidad, especificidad y valores predictivos, todavía existe la posibilidad,
poco frecuente, de falsos negativos obtenidos en período ventana. Con objeto
de minimizar este riesgo, además de un minucioso estudio de la historia
médicosocial es recomendable adoptar alguna de las siguientes determinaciones:
• Antígeno P24 (VIH): El resultado positivo es suficiente para la exclusión del
donante.
• Antígeno core del VHC (HCcAg): El resultado positivo es sugestivo de
infección por VHC en período ventana y suficiente para la exclusión del
donante.
• PCR para VIH, hepatitis B y hepatitis C: El resultado positivo es suficiente
para la exclusión del donante. Por otro lado, también es recomendable realizar:
-
Hemograma y fórmula leucocitaria, para el despistaje de posibles
enfermedades hematológicas malignas.
-
Bioquímica hepática para el despistaje de procesos infecciosos o
neoplásicos hepáticos agudos o crónicos que no consten en la historia
clínica.
-
Determinación de Beta HCG para el despistaje de procesos tumorales
tanto en el varón como en la mujer (ej: cariocarcinoma, tumor testicular
de origen embrionario).
-
Grupo sanguíneo y antígeno rhesus (Rh (d)): los tejidos procedentes de
individuos positivos para el antígeno Rh (d), podrían sensibilizar a los
16
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
receptores que son negativos para dicho antígeno. Tal tejido no debería
ser implantado en mujeres en edad potencial de embarazo. Esta
decisión es responsabilidad del cirujano que trasplanta.
Estudios Bacteriológicos del donante. Realización de hemocultivos
La realización de hemocultivos para el aislamiento en sangre de
microorganismos aerobios y anaerobios podría ser útil para la evaluación del
donante y para la interpretación de los resultados de los cultivos en los propios
tejidos extraídos. Como principios básicos para la correcta interpretación de
dichos resultados se debe tener en cuenta la correcta extracción de las muestras,
realizar al menos dos hemocultivos (para poder discriminar las contaminaciones
de las infecciones) y utilizar los viales adecuados para pacientes que hayan
estado o no en tratamiento antibiótico.
OBTENCIÓN DE TEJIDOS Y/O CÉLULAS
Consentimiento e Identificación del Donante
Antes de iniciar la extracción de los tejidos y/o células, la identidad del cadáver
deberá ser confirmada por el Coordinador de Trasplantes y por el responsable
del equipo extractor o por una persona autorizada por el centro de tejidos,
comprobando que los datos registrados corresponden al donante identificado.
La verificación de la identidad del donante deberá ser documentada en el
registro de la extracción. También deberá confirmarse que el consentimiento
para la extracción se ha obtenido conforme a lo establecido en la legislación
vigente, tanto si el donante es vivo o cadáver.
Número de Identificación del Donante, Tejidos y Células
Se deberá asignar un código de identificación único a cada donante y a cada
tejido y/o grupo de células donadas, en el momento de su obtención o a su
llegada al centro de tejidos, que asegure su identificación adecuada y la
trazabilidad de todo el material donado. Se deberá elaborar un registro para
introducir todos los datos de la codificación referente al donante, y a los tejidos
y células. El diseño del sistema de codificación de los tejidos y células se
ajustará a los requisitos mínimos exigidos en el Anexo VII del Real Decreto
1301/2006 de 10 de Noviembre que regula las actividades relacionadas con los
17
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
tejidos y células humanas; se tendrá en cuenta la identificación de la donación,
del centro de tejidos, el código de producto básico, el número de partición y la
fecha de caducidad.
Lugar de realización de la Extracción y Procesamiento
La obtención tendrá lugar en instalaciones apropiadas, mediante procedimientos
que minimicen la contaminación de tejidos y células que se obtengan. En la hoja
1, se recoge el documento de requerimientos técnicos para el Necroquirófano
del Banc de Sang i Teixits.
Deberán ser lugares de acceso restringido al personal implicado en dichos
procesos. En las donaciones de vivo se llevarán a cabo en instalaciones que
garanticen su salud y seguridad y que respeten su intimidad. Cuando se lleve a
cabo el procesamiento de tejidos o células en condiciones de exposición abierta,
se deberán especificar las condiciones de calidad de aire y limpieza para
minimizar los riesgos de contaminación incluyendo la contaminación cruzada.
La efectividad de las medidas necesarias para cumplir estas condiciones deberá
validarse y monitorizarse. Siempre que los tejidos o células se procesen en
exposición abierta y sin
un procedimiento de inactivación microbiológica
posterior se exigirá una calidad de aire con un número de partículas y de
colonias microbiológicas equivalente a la especificada como Grado A en el
anexo I de la Guía Europea de Normas de Correcta Fabricación en el lugar del
procesamiento, excepto en las siguientes condiciones:
•
Cuando se vayan a aplicar procedimientos de esterilización o
inactivación microbiológica validada.
•
Cuando esté demostrado que la exposición a un ambiente de Grado A
tiene efectos perjudiciales sobre las propiedades biológicas que se
requieren al tejido o grupo de células afectado.
•
Cuando no sea técnicamente posible realizar el procesamiento de los
tejidos o células en un ambiente Grado A.
•
Cuando esté demostrado que la vía o procedimiento de aplicación de
los tejidos o las células implican un riesgo de transmisión de
•
enfermedades bacterianas o fúngicas significativamente menor que el
trasplante de tejidos o células.
18
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
En estas circunstancias se deberán especificar las condiciones del aire ambiente
y demostrar y documentar que se alcanzan las normas requeridas de calidad y
seguridad de los tejidos y células, teniendo en cuenta la vía o modo de
aplicación, el objeto terapéutico o de aplicación y la situación inmunológica del
receptor. Para el aire ambiente del resto del local de trabajo se exigirá una
calidad adecuada para las actividades que se van a llevar a cabo, al menos
equivalente al Grado D de dicha guía europea.
Deberán desarrollarse procedimientos y normas para el acceso a los locales del
establecimiento, para la circulación interna, la higiene y el mantenimiento, para
la eliminación de residuos y material sucio o de desecho, y para la restauración
de todos los servicios tras una situación de emergencia.
Tabla 3. Establecimiento de circuitos y normas para la extracción en necroquirófano
CIRCUITOS DEL NECROQUIRÓFANO
1) TIP0 DE TEJIDO; Cuando Coordinacion obtiene un donant, este puede tratarse
d
Donante solo
de córneas
Extracción
Córneas
Las extracciones=
residents d’oftamo,
pueden hacerse en
el
pre-quirófano
Donante de
córneas & otros
tejidos
MULTITEIJIDO
(-CV, AL, PIEL)
Extracción equipo
multitisular
EXTRACCIÓ
¾Huesos
¾Piel
¾vasos
19
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
5. Requerimientos técnicos – quiroófano extracción BST
De acuerdo al consenso del BST y el equipo de extracción de tejidos, y según lo
señalado en el RD. 1301/2006 del Ministerio de Sanidad y Consumo que
establece las normas de calidad y seguridad para la donación, obtención y
procesamiento de células y tejidos, consideramos oportunas las siguientes
mejoras locativas en el quirófano de extracción del BST.
5.1
Climatización
El quirófano debe tener un sistema de regulación de temperatura, humedad y
filtrado de partículas. El sistema deberá incorporar
pre-filtros, filtros
intermedios, filtros absolutos (HEPA), además de sistema de control de
humedad (50%), presión (10) y renovación del flujo de aire. Estos estándares
equivalen a un quirófano de la Clase A ó B.
5.2
Entorno
Suelos, paredes y techos deben ser duros, no porosos, resistentes (fuegomanchas-golpes), impermeables y de fácil limpieza. Las uniones suelo – pared
deben ser redondeadas para evitar el deposito de suciedad y facilitar su limpieza.
Los materiales idóneos son PVC o Resinas, en colores verde o blanco, poco
brillantes.
5.3
Iluminación
La iluminación general debe ser uniforme y proporcional al tamaño del
quirófano. La iluminación quirúrgica debe ser intensa y sin reflejos, de color
azul-blanco (luz diurna), no producir calor, ajustable en posiciones y de fácil
manipulación y limpieza. La lámparas sialiticas (de techo) cumplen con estos
requerimientos.
20
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
5.4
Mesa operatoria
Debe ser adaptable a las diferentes posiciones quirúrgicas. Consta de dos partes,
un tablero operatorio (segmentado - articulado) y una base fija o móvil. El
mecanismo hidraulico/mecanico o electro/hidraulico es el mas adecuado.
Personal Extractor y Material de Extracción
La obtención de tejidos y células deberá ser realizada por personal
específicamente formado por un equipo clínico de especialistas en la obtención
de tejidos y células que deban obtenerse, o un centro de tejidos autorizado para
tal fin, y en la reconstrucción del cadáver del donante, con programas de
formación continuada. El personal deberá disponer de una descripción detallada
de los puestos de trabajo, tareas, responsabilidades y relaciones con otros
puestos de trabajo.
Dicho personal deberá usar indumentaria adecuada para cada tipo de obtención,
incluyendo lavado estéril, prendas y guantes estériles, visera facial, mascarilla y
gorro. Se deberá utilizar instrumentos y aparatos estériles, de buena calidad,
validados o certificados específicamente para la obtención de los tejidos y
células, mantenidos a intervalos regulares, y siempre que sea posible con el
marcado CE. Cuando se utilice material reutilizable se deberá crear
procedimientos validados de limpieza y esterilización para eliminar los agentes
infecciosos. La utilización del material y equipos de obtención se realizará
conforme a las normativas nacionales e internacionales pertinentes, las normas y
directrices relativas a la esterilización de los medicamentos y productos
sanitarios. Todo el personal involucrado deberá recibir información sobre su
utilización.
Límites de Tiempo para la Extracción
Dependerá de cada tejido y de las condiciones de conservación del cadáver. En
general se recomienda no superar las 15 horas si el cuerpo ha sido mantenido a
temperatura ambiente, o 24 horas si el cuerpo ha sido enfriado en las primeras 6
horas después de la asistolia y se mantiene a dicha temperatura. Será preceptivo
que en los formularios se recoja el dato de si el cuerpo ha estado en
refrigeración o no.
21
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Procedimientos de Obtención de Tejidos y Células
Los procedimientos de obtención deberán ser apropiados para cada tipo de
donante y para cada tipo de tejido y/o células, y deberán realizarse mediante
diversos procedimientos operativos estandarizados, debidamente documentados
y validados. Estos procedimientos deberán ser adecuados para proteger las
propiedades de los tejidos y células necesarias para su uso clínico, a la vez que se
minimizan los riesgos de contaminación microbiológica. Deberán existir guías
de procedimientos estandarizados disponibles para minimizar el riesgo de
contaminación por parte del personal que pudiera estar infectado con
enfermedades transmisibles.
A. Donantes cadavéricos:
La obtención de tejidos y células de personas fallecidas se podrá realizar según
lo dispuesto en el artículo 11 de la Ley 41/2002 de 14 de Noviembre. En el caso
de menores de edad o personas incapaces de consentir, la oposición a la
donación podrá hacerse constar por quienes hubieran ostentado en vida su
representación legal. Se deberá facilitar a los familiares y allegados información
sobre la necesidad, naturaleza y circunstancias de la obtención, especificando
qué procedimientos de restauración y conservación del cadáver y prácticas de
sanidad mortuoria se llevarán a cabo.
La obtención de tejidos y/o células de donantes fallecidos se realizará después
de la certificación de la muerte y del consentimiento judicial si así fuera
requerido. Además deberá registrarse el lugar de la extracción, la hora del
fallecimiento y de la extracción. También deberá registrarse cualquier suceso que
ocurra durante la extracción y que haya sido o pueda ser perjudicial para el
donante y/o tejidos y células, así como cualquier investigación adicional que se
derive de estos hechos para determinar su causa.
La obtención de material reproductor de personas fallecidas con finalidad
reproductiva se regirá por lo dispuesto en la Ley 14/2006 de 26 de Mayo, sobre
técnicas de reproducción asistida.
B. Donantes vivos:
Sólo podrá realizarse si el donante es mayor de edad, cuenta con plenas
facultades de obrar, estado de salud adecuado y da por escrito su
consentimiento informado. La información que el médico responsable transmite
al receptor debe incluir: el objetivo y la naturaleza de la obtención de los tejidos
22
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
y/o células, consecuencias y riesgos, pruebas de laboratorio que se vayan a
realizar, registro y protección de datos y los fines terapéuticos. El
consentimiento podrá ser revocado en cualquier momento antes de la obtención
de los tejidos y/o células, excepto en los casos de obtención de progenitores
hematopoyéticos de sangre periférica o de médula ósea, en que la revocación
sólo podrá producirse antes del inicio del tratamiento de acondicionamiento del
receptor.
Procedimientos de Empaquetado, Etiquetado y Transporte de
Tejidos y Células
El empaquetado, etiquetado y transporte de tejidos y células se deberá realizar
mediante
procedimientos
operativos
estandarizados,
debidamente
documentados y validados. Si los tejidos y células son enviados a un centro de
tejidos para su procesamiento, el procedimiento de obtención, empaquetado,
etiquetado, mantenimiento y transporte hasta dicho centro deberá constar de un
documento acordado entre la unidad de obtención y el centro de tejidos.
El empaquetado y transporte de los tejidos y/o células deberá realizarse de
manera que se minimicen los riesgos de contaminación microbiológica y se
asegure la temperatura y condiciones requeridas para prevenir el deterioro de las
propiedades biológicas y funcionales necesarias para su uso clínico, y quedar
especificados en procedimientos documentados según el tipo de tejido y/o
grupo de células a transportar. Deberán utilizarse contenedores adecuados para
el transporte de material biológico y para mantener su calidad y seguridad.
Las muestras de tejido o sangre (que acompañen a los tejidos y células extraídas)
que se obtengan con el fin de servir para ulteriores tests o determinaciones de
laboratorio, deberán ir adecuadamente etiquetadas, figurando la identificación
del donante, y la información relativa al lugar y el momento en que se recogió la
muestra. En los contenedores internos de los tejidos y/o células extraídos
deberá figurar una etiqueta con la identificación del donante y el tipo de tejido
y/o células. Si sus dimensiones lo permiten, en el contenedor deberá además
figurar la fecha y hora de obtención, precauciones y aditivos utilizados (si
procede), el receptor (en caso de donaciones directas).
23
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
En los contenedores externos de los tejidos y/o células extraídos deberá
figurar una etiqueta con:
•
“Muestra biológica de tejidos/células - Manejar con cuidado”.
•
Identificación del centro de tejidos de origen del tejido y/o grupo
celular, incluyendo la dirección, el teléfono y la persona de contacto
para cualquier contingencia.
•
Identificación del centro de tejidos de destino del tejido y/o grupo
celular, incluyendo la dirección, el teléfono y la persona de contacto a
quien se debe entregar el contenedor.
•
Fecha y hora de inicio del transporte.
•
Especificaciones para mantener las características biológicas de los
tejidos o células durante el transporte (si procede).
•
Especificaciones de almacenamiento (si procede).
•
En caso de que los tejidos y/o células puedan verse afectados por los
rayos X debe figurar claramente: “NO IRRADIAR”.
•
En casos de productos que se conoce que son potencialmente
contaminantes o de los que se desconoce los resultados de los tests
serológicos debe especificarse: “RIESGO DE CONTAMINACIÓN
BIOLÓGICA”.
Reconstrucción del Cuerpo
Una vez finalizada la obtención de los tejidos y células, el cuerpo del donante
deberá ser reconstruido de manera que se aproxime lo más cercanamente
posible a su configuración anatómica original y para hacer posibles los
procedimientos funerarios habituales. Deberá disponerse del personal y equipos
necesarios para la reconstrucción del cadáver del donante, quien procederá a tal
reconstrucción.
Documentación
Los centros de tejidos dispondrán de un sistema de recogida y custodia de la
información relativa a sus actividades que asegure la trazabilidad de todos los
tejidos y células procesadas. En caso de que el sistema sea electrónico deberá
asegurarse la disposición de copias de seguridad.
Deberá existir un procedimiento documentado de la recogida y custodia de la
información con un responsable de dicho sistema, designado por el propio
centro de tejidos. Para cada donante se preparará un fichero que contenga:
24
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1. Identificación del donante (nombre, apellidos y fecha de nacimiento).
2. En neonatos, sangre de cordón u otro tejido o grupo de células
obtenidos en el momento del parto, se registrará el nombre y fecha de
nacimiento de la madre, la fecha de nacimiento del donante y su
nombre si se conoce).
3. Edad, sexo, historial médico-social.
4. Resumen de la exploración física.
5. Fórmula de cálculo de la hemodilución (si procede).
6. Documento de consentimiento para la obtención.
7. Datos clínicos, resultados de los tests de laboratorio y cualquier otra
determinación o prueba realizada.
8. Resultado del informe del examen necrópsico, en caso de haberse
realizado.
9. En caso de tratarse de progenitores hematopoyéticos se registrará la
documentación relativa a la idoneidad del donante para un determinado
receptor.
10. Informe del equipo responsable del procedimiento de la extracción del
cual se enviará una copia al centro de procesamiento de tejidos, donde
se recogerá:
•
Identificación, nombre y dirección del centro de destino que va
a recibir el tejido y/o grupo celular extraídos.
•
Identificación del donante, incluyendo cómo se llevó a cabo y
quién lo realizó.
•
Causa, fecha y hora de asistolia (en donante cadavérico).
•
Descripción e identificación de los tejidos y células extraídos y
de las muestras obtenidas para la evaluación.
•
Identificación del responsable del equipo extractor y firma del
mismo.
•
Fecha y hora de inicio y finalización de la extracción.
•
Lugar de la extracción.
•
Descripción del procedimiento utilizado, el área y las
condiciones en las que se realizó la extracción (si procede).
•
Incidentes ocurridos durante la extracción.
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Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
•
Información sobre los métodos y condiciones de la
conservación del cadáver: refrigeración, temperatura, inicio, fin
(en donantes cadavéricos).
•
Reactivos
y
soluciones
de
preservación
utilizados
(Identificación de lotes, control de la caducidad).
•
En los casos de donantes de esperma la información mínima a
consignar será: nombre del centro de tejidos de destino, datos
de identificación del donante y fecha y hora de obtención. La
historia del donante será confidencial y completa. Todos los
archivos deben ser legibles e indelebles y mostrarán los
resultados de los tests así como la interpretación de dichos
resultados. Los datos serán tan detallados como sea necesario
para un entendimiento claro de cada paso, por una persona
con experiencia en los centros de tejidos y estarán disponibles
para una inspección solicitada por personas autorizadas, dentro
de los límites de la confidencialidad médico-legal. Los datos
identificarán al donante, documentarán la evaluación clínica y
microbiológica del mismo. La información relativa al donante
deberá ser archivada y protegida como mínimo hasta 30 años
después del uso clínico o caducidad de los tejidos o células
obtenidas, en la unidad de Coordinación de Trasplantes, y/o
en el Banco de Tejidos.
Control de la Viabilidad del Donante y los Tejidos
Antes de procesar los tejidos, la persona designada como responsable revisará la
historia médico-social del donante, el examen físico, los resultados de las
determinaciones analíticas y microbiológicas, que se hayan realizado. Revisará
las solicitudes de los que todavía no se tengan los resultados y no calificará su
viabilidad hasta que se tenga el resultado de la autopsia si ésta se hubiera llevado
a cabo.
Los tejidos permanecerán en cuarentena mientras no se hayan completado
satisfactoriamente todos los resultados. Cuando el donante y los tejidos sean
considerados viables pasarán a estar disponibles para su distribución.
26
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
6. Bibliografía
-
Real Decreto de Células y Tejidos 1301/ 2006.
-
Estándares de la Asociación Española de Bancos de Tejidos
-
Recomanacions per a la prevenció de les infeccions quirúrgiques.
Barcelona: Generalitat de Catalunya, 2002
-
Resúmenes de la Jornada de Donación de Órganos y Tejidos. ONT,
Madrid noviembre 2006
-
Criterios de evaluación del Donante de órganos y Tejidos. Reúmenes
del 6º Curs de Donació i Trasplantament. 2007. Formació continuada
per a personal sanitari
-
Paredes D, Valero R, Navarro A, Miranda B, Viedma M, Cabrer C,
Manyalich M.: Transplant procurement management: a training tool to
increase donation. Transplant Proc. 1999 Sep;31(6):2610-1
27
Unidad didáctica 4:
Banco de tejidos. Implantes
tisulares. Aplicaciones
Dra. Adela Miralles
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia Celular
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Bancos de tejidos: organización y funcionamiento
3.1
Legislación vigente aplicable a la preservación de tejidos
3.2
Organización general
3.3
Centros extractores
3.4
Obtención y envío al Banco
3.5
Procesamiento y controles de calidad del material
biológico aplicables en el Banco de Tejidos
3.5.1
Manipulación
3.5.2
Serologia
3.5.3
Estudio anatomo patológico
3.5.4
Aspecto macroscópico
3.5.5
Determinación de la viabilidad
3.5.6
Microbiologia
3.5.7
Validación
3.6
Distribución desde el Banco de Tejidos a los usuarios
3.7
Condiciones del transporte
3.8
Seguimiento
3.9
Devolución del material no utilizado
3.10
Registros
4. Preservación de células y tejidos
4.1
Métodos de preservación
4.1.1
Preservación en Isotermia
4.1.2
Preservación en hipotérmia o refrigeración
4.1.3
Liofilización
4.1.4
Congelación
4.1.4.1 Agentes crioprotectores
4.1.4.2 Descongelación
4.1.4.3 Vitrificación
4.1.4.4 Congelación a altas presiones
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
5. Preservación de tejidos
5.1
Tejido ocular
5.2
Tejido vascular
5.3
Piel
5.4
Membrana amniótica
5.5
Tejido músculo-esquelético
5.6
Tejido paratiroideo
5.7
Tejido reproductor
5.7.1
Tejido ovárico
5.7.2
Oocitos
5.7.3
Tejido testicular
5.7.4
Semen
5.7.5
Embriones
6. Conclusión
7. Bibliografía
3
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1. Introducción. Antecedentes históricos y estado actual
El interés por descubrir los mecanismos que permiten detener temporalmente
las funciones vitales de un ser vivo viene de antiguo. En 1683, Robert Boyle,
publica New Experiments and Observations Touching Cold, donde relata sus
experiencias sobre la observación de
los efectos de la congelación en
organismos vivos. Aunque estas experiencias, podrían considerarse como la
semilla que daría lugar a la Criobiología, no fue hasta 1949, cuando el
descubrimiento por parte de Polge, Smith y Parkes de las propiedades
crioprotectoras del glicerol, abrió definitivamente las puertas de la preservación
a largo plazo de células y tejidos, dando lugar al nacimiento y desarrollo de los
actuales Bancos de Tejidos.
Hoy en día se aplican técnicas criobiológicas a distintos modelos celulares y
tisulares, con la finalidad de restituir con el implante una función biológica
deteriorada, con las máximas garantías de calidad y adecuación del tejido a las
necesidades del receptor. Así mismo, los Bancos de Tejidos han incorporado
otros métodos de preservación a corto y medio plazo.
2. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería:
-
Conocer la organización básica y funcionamiento de los Bancos de
Tejidos.
-
Conocer las diferentes opciones terapéuticas que los Bancos de Tejidos
ofrecen a la sanidad para contribuir a mejorar la calidad de vida de los
pacientes.
-
Conocer los diferentes métodos de preservación celular y tisular a corto,
medio y largo plazo.
-
Conocer la legislación vigente que regula las actividades de los Bancos
de Tejidos.
-
Conocer el alcance de las actividades desarrolladas en los Bancos de
Tejidos. Estadísticas de actividad.
4
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3. Bancos de tejidos: organización y funcionamiento
3.1
Legislación vigente aplicable a la preservación de tejidos
La preservación de células y tejidos para un posterior uso clínico viene regulada
por una legislación que determina los procedimientos a seguir. El marco
regulador básico en España es el Real Decreto 1301/2006 de 10 de noviembre
de 2006, que define al Banco de Tejidos como la unidad técnica que tiene por
misión garantizar la calidad de los tejidos después de la obtención y hasta su
utilización clínica como aloinjertos o autoinjertos y regula la donación,
obtención,
preparación,
procesamiento,
preservación,
almacenamiento,
transporte, entrada y salida de España, distribución y suministro e implante.
3.2
Organización general
Los Bancos de Tejidos deberán contar como mínimo con:
-
Área de recepción de muestras.
-
Área de trabajo que disponga del utillaje necesario para la correcta
manipulación de los tejidos.
-
Área de almacenamiento, conservación de muestras y archivo.
-
Sistema de protección contra robos en el área de conservación de
muestras y archivo.
-
Sistemas de seguridad que garanticen el almacenamiento de las
muestras en las condiciones térmicas adecuadas.
-
Sistemas de seguridad que eviten la contaminación cruzada de las
muestras.
3.3
Centros extractores
Podrán ser Centros extractores de Tejidos, todos aquellos debidamente
autorizados para esta actividad por la Administración competente.
5
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3.4
Obtención y envío al Banco
Los tejidos se han de extraer en condiciones de esterilidad y depositar en un
recipiente de plástico, estéril, apirógeno y con cierre hermético, debidamente
etiquetado y conteniendo una solución isotónica en cantidad suficiente para
evitar la desecación a excepción, del tejido osteotendinoso que no requieren de
solución de conservación.
El tejido se enviará al Banco acompañado de una ficha técnica en la que han de
constar como mínimo:
-
Datos de identificación del paciente.
-
Causa de la muerte y antecedentes médicos de interés.
-
Equipo extractor, hora de la extracción y condiciones de conservación.
-
Medios de resuspensión utilizados.
-
Caracterización del tejido.
El plazo límite para el procesamiento en el Banco de Tejidos tras la obtención
varía según el tejido de que se trate.
3.5
Procesamiento y controles de calidad del material biológico
aplicables en el Banco de Tejidos
3.5.1
Manipulación
La manipulación y procesamiento del tejido debe hacerse en condiciones de
asepsia, en cámara de flujo laminar en un entorno que tenga una certificación de
calidad del aire. Todo el tejido deberá ser procesado de forma aséptica, el
material de contacto con el tejido debe ser estéril. El método de preservación a
sguir dependerá del tipo de Tejido y del periodo deseado de conservación como
se describe en el apartado 4 de este documento.
6
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 1: Procesado de Tejidos en condiciones de esterilidad en sala blanca
3.5.2
Serologia
Toda intervención destinada a obtener Tejido para uso clínico, deberá estar
precedida de las oportunas pruebas de detección de marcadores, siendo de
obligado cumplimiento la determinación de los marcadores para los virus de las
hepatitis B y C , del virus de la inmunodeficiencia humana y sifilis. Del resultado
se dejará la correspondiente constancia y certificación. El resultado positivo en
estas pruebas no invalidará la utilización clínica del Tejido como autoinjerto, sin
embargo, su conservación en el Banco de Tejidos se realizará de manera
separada a otros Tejidos.
En caso de no haberse realizado ninguna de las pruebas necesarias, el tejido
debe ir acompañado del tubo con la sangre o el suero extraído al donante para
llevar a cabo el mencionado cribaje y posterior custodia y mantenimiento del
suero.
3.5.3
Estudio anatomo patológico
Ante cualquier sospecha de alteración susceptible de contraindicar la donación
se remitirá un fragmento del Tejido extraído a Anatomía Patológica para
verificar la idoneidad del mismo y descartar cualquier anomalía. El envío a
Anatomía Patológica puede hacerse directamente desde quirófano, antes de ser
remitido al Banco.
7
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3.5.4
Aspecto macroscópico
La simple observación, de la apariencia física o morfológica, puede dar una idea
general del estado del tejido. Debe realizarse un cribaje macroscópico del tejido
a procesar y deben anotarse en la ficha técnica las características, número de
fragmentos recibidos y tamaño de los mismos. Se determinaran también otras
características del tejido como peso, longitud, diámetros, celularidad, según el
modelo biológico de que se trate.
3.5.5
Determinación de la viabilidad
Dependiendo del Tejido, se realizará un estudio de la viabilidad celular. Una
opción en tejido sólido es centrifugar el medio en el que se ha disecado el Tejido
y mediante una tinción vital tipo azul de tripano, determinar la viabilidad celular
en el botón celular resultante.
3.5.6
Microbiologia
Se recomienda la realización de cultivos aerobios, anaerobios y hongos de la
solución de recogida y/o de la solución crioprotectora en la que se ha
suspendido el Tejido para la congelación. Si la muestra objeto de estudio
microbiológico contiene agentes antibióticos, se tomarán las medidas adecuadas
para minimizar el riesgo de falsos negativos.
Este tipo de controles tienen una doble finalidad, por una parte, la detección de
posibles septicemias o micosis no documentadas en la paciente y por otra, el
control de la esterilidad durante todas las manipulaciones que sufre el tejido
desde el momento de su obtención hasta su posterior implante. En función de
los resultados obtenidos en los controles bacteriológicos, se decidirá la
actuación posterior:
-
Los tejidos contaminados en el momento de la extracción podrán
utilizarse si se identifica y elimina el microorganismo demostrándose la
negativización en cultivos posteriores.
-
Un tejido positivo para un Gram-negativo no se utilizará a no ser que
se demuestre la eficacia en la destrucción y eliminación de endotoxinas
en procesos posteriores.
8
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Dependiendo de las características de los gérmenes aislados (microorganismos
constituyentes de la flora bacteriana habitual de la piel), su uso puede estar
sujeto a una valoración individual, por los responsables del banco de tejidos.
Descontaminación Antibiótica
Cuando los tejidos no han sido obtenidos en condiciones de esterilidad
garantizada, es necesario realizar una esterilización posterior. El método a seguir
debe garantizar la esterilización, minimizando a su vez, el riesgo de alteración
de la viabilidad y funcionalidad. Como método de descontaminación se suele
utilizar el tratamiento con antibióticos que permitan la destrucción de aerobios,
anaerobios, miccobacterios y hongos. En ningún caso se empleará sin embargo
penicilina, a fin de evitar posibles reacciones adversas en los receptores.
3.5.7
Validación
El responsable del Banco informará al médico responsable del paciente de
cualquier anomalía detectada en el control de calidad. Será el médico
responsable del paciente quien decidirá la utilización o no del Tejido para
autotrasplante.
3.6
Distribución desde el Banco de Tejidos a los usuarios
Los Bancos podrán remitir Tejidos exclusivamente a centros autorizados para
su utilización clínica, previa solicitud por escrito del médico responsable del
paciente. El responsable del Banco informará al Centro implantador del
resultado de los controles de calidad efectuados. La responsabilidad final de la
utilización clínica corresponde al equipo implantador, con el consentimiento
informado del receptor.
La documentación que obligatoriamente deberá acompañar al envío del tejido al
Centro implantador será:
-
Descripción de las características del tejido y de las soluciones de
preservación.
-
Relación de las pruebas efectuadas.
-
Instrucciones, en su caso, para la descongelación y la utilización.
-
Código del Banco que permita el seguimiento de los tejidos enviados.
9
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Módulo 2
3.7
Condiciones del transporte
Si la preservación del tejido se ha realizado a 4º C el transporte al Centro
implantador se realizará en estas condiciones térmicas. En caso de que el tejido
haya sido conservado mediante congelación, si el implante se va a realizar en el
recinto en que está el Banco o cercano a él, se podrá enviar el producto
descongelado, en un recipiente que conserve una temperatura de 4º C, en caso
contrario, el transporte se hará en fase vapor de nitrógeno o nieve carbónica. El
recipiente debe garantizar la temperatura adecuada de conservación, la
integridad del Tejido y debe llevar un etiquetado exterior en el que figure:
-
Tipo de muestra.
-
Procedencia y destino del paquete: instituciones involucradas con el
nombre de los responsables del envío y la recepción, sus direcciones y
teléfonos de localización.
-
Día y hora de salida del Banco.
-
Instrucciones de transporte.
Figura 2: Recipiente para el de transporte de Tejidos
3.8
Seguimiento
Será responsabilidad del facultativo encargado del implante, informar al Banco
sobre las condiciones de recepción y calidad del Tejido recibido, así como de las
incidencias que hubieran podido sobrevenir.
10
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Módulo 2
3.9
Devolución del material no utilizado
Como norma general, se recomienda evitar el retorno al Banco de los Tejidos
que por cualquier causa no hayan podido ser implantados, salvo en
circunstancias especiales. El envío sólo podrá ser devuelto y aceptarse por el
Banco, si el producto no ha sido descongelado, si puede ser demostrada la
integridad del embalaje (no se han roto los precintos) y la temperatura de
almacenamiento/congelación adecuada ha sido mantenida en todo momento.
3.10
Registros
Los registros recogerán la información de cada una de las etapas del proceso,
desde datos del donante, como nombre y diagnóstico, entre otros, al resultado
de las pruebas efectuadas al Tejido, manipulación, procesamiento y el destino
final de los mismos, de forma que en todo momento pueda garantizarse la
trazabilidad.
4. Preservación de células y tejidos
Las Células y Tejidos destinados a preservación en un Banco de Tejidos pueden
tener distintos orígenes:
-
Donación para uso alogénico:
-
Donantes vivos.
-
Donantes a corazón parado.
-
Donantes en estado de muerte encefálica.
-
Preservación para uso autólogo.
11
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Módulo 2
4.1
Métodos de preservación
Entre los métodos de preservación Celular y Tisular más utilizadas destacan:
-
La isotermia.
-
La refrigeración.
-
La liofilización.
-
La congelación.
La elección de uno método u otro va a depender de si se pretende:
-
Conservar la estructura tisular.
-
Conservar las funciones vitales.
-
Promover la proliferación celular.
-
La conservación a corto, medio o largo plazo.
El período máximo de almacenamiento vendrá determinado por el método de
preservación utilizado:
-
Isotermia (32 - 37º C): días o semanas.
-
Refrigeración (2 - 8º C): días o semanas.
-
Congelación entre -20º C y -40º C: 6 meses.
-
Congelación entre -40º C y -80º C: 5 años.
-
Criopreservación a temperatura inferior a -80º C: indefinido.
-
Liofilización: al vacío, indefinido; en ausencia de vacío, 5 años
-
Desecación: al vacío, indefinido; en ausencia de vacío, 5 años.
4.1.1
Preservación en Isotermia
También denominada Cultivo Celular consiste en la aplicación de técnicas que
permiten el mantenimiento de las Células/Tejidos in vitro, conservando al
máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Permite la
propagación, aumentando notablemente la masa celular a lo largo del tiempo.
12
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 3: Cultivos Celulares en incubación en una estufa a
37º C en un ambiente al 5% de CO2
4.1.2
Preservación en hipotérmia o refrigeración
Tiene como objetivo disminuir o detener el metabolismo a fin de evitar la
degradación Celular/Tisular, permitiendo el mantenimiento de las características
fisiológicas.
13
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Módulo 2
4.1.3
Liofilización
La liofilización es un proceso en el que se pretende la deshidratación mediante
la congelación inicial del producto seguida de la sublimación del agua congelada
mediante
aplicación
del
vacío.
Mediante
diversos
ciclos
de
congelación/sublimación, se consigue eliminar prácticamente la totalidad del
agua libre contenida en el producto original. La duración del proceso va a
depender del volumen del producto.
La eliminación del agua tiene como
objetivo reducir las pérdidas de calidad debidas a reacciones químicas, causadas
por degradación enzimática y no enzimática.
Los productos liofilizados,
retienen las propiedades físicas, químicas, biológicas y organolépticas de sus
estados frescos. Los productos liofilizados pueden ser reconstituidos a su forma
y estructura original por la adición de líquidos.
El contenido de agua residual en el Tejido debe ser inferior o igual al 5% del
peso inicial en fresco, (método gravimétrico o de Karl Fisher); o inferior al 8%
cuando se analice mediante resonancia magnética nuclear.
Formula para el cálculo del agua residual:
H2O residual = (m x 100)/M
m: el peso perdido y M: el peso inicial, en fresco.
4.1.4
Congelación
Es un hecho conocido que las bajas temperaturas son capaces de detener los
procesos biológicos y metabólicos, conservando las estructuras morfológicas.
Utilizando adecuadamente los parámetros implicados en un proceso de
enfriamiento y técnicas específicas, es posible conservar además, la capacidad
funcional de diversos especímenes tras períodos más o menos prolongados de
almacenamiento. Esta tecnología es la base del desarrollo de una nueva
disciplina científica: La Criobiología.
Un proceso clásico de criopreservación incluye la exposición inicial del material
biológico a una solución crioprotectora, el enfriamiento previo al cambio de
14
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
estado, la congelación y el almacenamiento a temperaturas bajo cero, la
descongelación y finalmente, la dilución y extracción del crioprotector, con el
retorno a las condiciones fisiológicas. Al final del proceso, si se ha desarrollado
adecuadamente, el material biológico criopreservado deberá mantener, su
estructura morfológica y su actividad funcional.
Con la aplicación de esta nueva tecnología, la conservación a largo plazo del
material biológico adquiere cada vez mayor importancia, siendo utilizada en
distintos campos de la medicina y la biología entre otros.
Actualmente, son muchas las especies celulares y tejidos, a los que se aplican las
técnicas criobiológicas, con un interés que va desde la necesidad de mantener
una provisión celular de características estables para experimentación in vitro,
hasta su manipulación ex vivo para la ulterior utilización en clínica. En este
sentido, se están congelando entre otros, precursores hematopoyéticos, córneas,
segmentos vasculares, válvulas cardíacas, huesos, paratiroides y concretamente,
en el ámbito de la reproducción asistida, semen, embriones y oocitos.
A pesar de ello, las técnicas implicadas en los procesos de criopreservación no
están exentas de problemas de tipo teórico y técnico, que derivan
fundamentalmente, del precario conocimiento que aún hoy se posee sobre los
mecanismos físico-químicos que condicionan la respuesta de la célula viva ante
el cambio de estado y sobre la génesis de las lesiones crioinducidas
Un proceso clásico de criopreservación incluye la exposición inicial del material
biológico a una solución crioprotectora, el enfriamiento previo al cambio de
estado, la congelación y el almacenamiento a temperaturas bajo cero, la
descongelación y finalmente, la dilución y extracción del crioprotector, con el
retorno a las condiciones fisiológicas. Al final del proceso, si se ha desarrollado
adecuadamente, el material biológico criopreservado deberá mantener, su
estructura morfológica y su actividad funcional.
Dado que la exposición del material biológico a los crioprotectores, en las
concentraciones necesarias para producir un efecto protector no suele afectar
significativamente
a
la
supervivencia
celular,
las
dificultades
de
la
criopreservación derivan principalmente de los procesos de congelación y
descongelación, que son muy críticos, especialmente en el rango de
15
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
temperaturas entre -5º y -20º C. El punto de congelación de la mayoría de
células, se sitúa alrededor de los -2 °C. Sin embargo, la mayoría de células se
congelan a temperaturas por debajo de los -5 °C, incluso, cuando el medio
extracelular contiene hielo.
El daño en las células sometidas a temperaturas bajo cero, parece debido
principalmente a dos factores físico-químicos: la concentración de solutos que
acompaña a la formación de hielo y la aparición de cristales de hielo en el
interior celular. La incidencia de la lesión, en estos casos depende de diversos
parámetros y especialmente de la permeabilidad de la membrana celular, que
determina notablemente la probabilidad de la nucleación intracelular y también
de la relación superficie/volumen celular. Si el enfriamiento es lo
suficientemente lento, la célula va perdiendo agua de manera que se incrementa
la concentración intracelular de solutos y el potencial químico del agua
intracelular se equilibra con el agua extracelular. Así la célula se deshidrata pero
no se produce cristalización intracelular. Si el enfriamiento es rápido, la célula
no consigue perder agua suficiente para conseguir el equilibrio y se produce un
sobreenfriamiento que conduce a la cristalización del agua intracelular. El
tamaño de los cristales de hielo intracelulares dependerá de la velocidad de
enfriamiento. A más velocidad, los cristales son más pequeños.
Tanto una excesiva deshidratación celular, como la formación de hielo
intracelular son causas de muerte celular durante la congelación. El que ocurra
una de ambas situaciones depende de la permeabilidad de la membrana
plasmática al agua. La exposición a soluciones hipertónicas puede producir
desnaturalización de proteínas y desestabilización de membranas. La muerte
celular por efectos osmóticos también puede deberse a la reducción a un
volumen mínimo del cual la célula ya no puede recuperarse. Más recientemente,
propone como causa de muerte celular por efectos osmóticos, la rotura de las
membranas celulares a consecuencia de la presión que supone el flujo de agua
hacia el exterior celular, hecho, que a su vez permitiría la entrada de hielo
extracelular.
Cada modelo celular, en función de sus características intrínsecas, tiene una
velocidad óptima de congelación en la cual la supervivencia es máxima. Siendo
esta velocidad un compromiso entre la excesiva deshidratación y la aparición de
16
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
hielo intracelular, aunque una velocidad de congelación idónea no es suficiente
para asegurar el máximo de viabilidad del material criopreservado.
Figura 4
S
up
er
vi
ve
nc
i
70
Embriones murinos
60
Stem Cells
Células hámster
Hematies
50
40
30
Levaduras
20
10
0
0
1
10
10
100
Velocidad de congelación (ºC/min)
1000
Mazur, Nature, 1970
4.1.4.1 Agentes crioprotectores
Si se expresa la supervivencia en función de la velocidad de enfriamiento se
delimita un rango de velocidades dónde la viabilidad es máxima, aunque
bastante reducida (de un 10 al 20% en el mejor de los casos), de forma, que
interaccionando estrictamente con la regulación de la velocidad de congelación,
difícilmente se podrán conseguir buenas recuperaciones de viabilidad tras un
proceso de congelación. Únicamente, alterando el comportamiento físicoquímico de las soluciones implicadas, se puede mejorar considerablemente el
resultado de un proceso de congelación.
Desde que Polge en 1949 descubrió las propiedades crioprotectoras del glicerol,
se han descubierto múltiples sustancias que adicionadas a las soluciones o
medios de congelación, aumentan considerablemente la supervivencia después
de este proceso. Clásicamente, se han clasificado en dos grupos según puedan o
no atravesar las membranas celulares:
-
Penetrantes. Son moléculas de bajo peso molecular que actúan
provocando inicialmente, una disminución del volumen celular por
deshidratación y luego un aumento del mismo, por la entrada del
17
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
crioprotector ligado al agua. El grado de permeabilidad, está
determinado además de su peso molecular, por la propia permeabilidad
y relación superficie/volumen celular, el gradiente de concentraciones
establecido entre el interior y el exterior celular y la temperatura de
exposición.
-
No penetrantes. Tienen un peso molecular más elevado y no pueden
penetrar
la
membrana
celular,
pero
actúan
favoreciendo
la
deshidratación celular por aumento de la concentración osmótica en el
medio
extracelular.
Se
suelen
utilizar
en
combinación
con
crioprotectores penetrantes y en especial cuando se utilizan velocidades
de congelación rápidas.
Los crioprotectores, son sustancias muy hidrosolubles que además de contribuir
a la deshidratación celular por efectos osmóticos, actúan modificando el
comportamiento físico-químico de las soluciones acuosas. Modifican la
estructura de las moléculas de agua, por una parte rompiendo uniones de
hidrógeno y por otra, ligando las moléculas de agua. Al actuar ligando moléculas
de agua e impidiendo así la formación de hielo contribuyen a favorecer la
vitrificación, especialmente, a partir de ciertas temperaturas. Cuando el
crioprotector alcanza una cierta concentración a bajas temperaturas, la
viscosidad es suficientemente alta para impedir la cristalización (en función de la
velocidad de enfriamiento) en favor de la vitrificación.
Un aspecto a tener en cuenta en la utilización de crioprotectores es que la
permeabilidad celular al crioprotector es menor que al agua, lo que implica un
efecto osmótico durante su introducción y extracción con cambios de volumen
celular transitorios A esto cabe añadir, el posible efecto adverso de la exposición
de las proteínas intracelulares a concentraciones bajas y altas de electrólitos. Por
tanto, la introducción y extracción del crioprotector son pasos de extrema
importancia para la posterior supervivencia de las células sometidas a procesos
de criopreservación.
18
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
4.1.4.2 Descongelación
Durante la descongelación, pueden ocurrir al menos tres fenómenos capaces de
provocar por si mismos la pérdida de la viabilidad celular:
-
Recristalizacion. Está directamente relacionada con la velocidad de
congelación y descongelación. Tras una congelación rápida, con una
deshidratación celular insuficiente, es muy probable que se forme hielo
intracelular si la descongelación es lenta. La forma de evitarlo es
aumentar la velocidad de descongelación especialmente en la
proximidad al punto de fusión.
-
Efectos osmoticos.
Si tras una congelación lenta, se realiza una
descongelación rápida, la concentración extracelular se diluye al
deshacerse el hielo, pudiéndose producir shock osmótico si el
crioprotector no tiene tiempo de salir evitando la entrada de agua y la
dilatación celular. La muerte celular también puede deberse a la
reducción a un volumen mínimo del cual la célula es incapaz de
recuperarse.
-
Burbujas de gas. Es un fenómeno a tener en cuenta especialmente en
cultivos celulares que han permanecido en incubación en una atmósfera
con una composición de gases determinada. El gas solubilizado por el
descenso térmico y desplazado por el frente de hielo, al aumentar la
temperatura y retornar a su forma gaseosa puede reagruparse,
formando unas burbujas de dimensión tal, que pueden llegar a provocar
el estallido celular.
19
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 5: Esquema de un proceso clásico de criopreservación de Células y/o Tejidos
Figura 6: Congelador biológico programable CM 2000. Carburos Metálicos
20
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 7: Descenso térmico clásico de congelación de células y
tejidos utilizando un congelador biológico programable
Dos modalidades de conservación a largo plazo de aplicación mas reciente son
la vitrificación y la congelación a altas presiones
4.1.4.3 Vitrificación
Consiste en la solidificación de un líquido por aumento de su viscosidad con el
descenso de la temperatura, por interacción de agentes químicos con las
moléculas de H2O evitando que contacten entre ellas y precipiten en forma de
hielo. Al descender la temperatura, la energía térmica para mover las moléculas
también disminuye. Al detenerse el movimiento el líquido pasa a estado sólido.
Este líquido detenido en su movimiento molecular es lo que se conoce como
vidrio y el proceso, vitrificación.
Para conseguir la vitrificación de un órgano, aproximadamente la mitad del
líquido que contiene debe sustituirse por agentes crioprotectores, pero a unas
concentraciones tan altas que pueden resultar tóxicas.
Una opción consiste en incrementar la concentración del crioprotector a medida
que se va disminuyendo la temperatura. Así se ha conseguido la vitrificación y
trasplante con éxito de 2 riñones de rata conservados a –46 ºC.
Existe una dificultad añadida que resolver, y es la devitrificación: la cristalización
del vidrio con el incremento de la temperatura en el proceso de retorno a
temperaturas fisiológicas
21
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Para prevenir la devitrificación es necesario un incremento rápido y homogéneo
de la temperatura: por ondas electromagnéticas de manera que se consiguiera un
ascenso térmico superior a 300 ºC/min.
4.1.4.4 Congelación a altas presiones
Una forma de reducir la concentración de crioprotector para conseguir la
vitrificación de un órgano, es mediante la aplicación de una presión hidrostática
de 1000 atmósferas. Sin embargo, estas presiones se han demostrado que no
son bien toleradas por los órganos.
5. Preservación de tejidos
5.1
Tejido ocular
Existen referencias bibliográficas de protocolos de criopreservación corneal que
ofrecen una supervivencia endotelial y conservación de las características
corneales dentro de los límites considerados válidos para trasplante. Además, la
criopreservación ofrece como ventaja la posibilidad de tipificar antigénicamente
el tejido, de manera que puede permitir mejorar el rendimiento del acto
quirúrgico en trasplantes con alto riesgo de rechazo.
Sin embargo, la criopreservación de córneas no es una practica habitual en los
Bancos de Ojos, probablemente debido a que la demanda de este tejido es muy
superior a la oferta, por lo que la relación coste-beneficio de la aplicación de
estas técnicas no aconseja su uso, siendo las técnicas habituales de preservación,
la conservación a 4º C por un periodo de alrededor de 7 días o a 31 – 37º C por
un periodo de unos 30 días, en ambos casos, utilizando como solución de
preservación, medios de cultivo suplementados con antibióticos.
Otro tipo de tejido ocular ampliamente utilizado es la esclerótica, que suele
conservarse en etanol y a temperatura ambiente.
22
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
La preservación de globo ocular entero, cuya demanda esta incrementando
últimamente, se realiza a 4º C en cámara húmeda y el periodo de preservación
en estas condiciones no debería exceder de las 48 h para no comprometer la
calidad del tejido.
Figura 8: Córnea en medio de preservación
Figura 9: Análisis de la densidad de células endoteliales mediante analizador de imagen
Figura 10: Esclera conservada en etanol
23
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Módulo 2
5.2
Tejido vascular
El objetivo de la preservación de segmentos vasculares, es poder disponer de un
depósito arterial, que poder utilizar para implante en enfermos con isquemia
crítica en extremidades, cuando es imposible utilizar venas autológas, por no
disponer de safena propia o cuando éstas son de calibre inadecuado o han
sufrido un proceso tromboflebítico previo. Otro ámbito de aplicación, es en
enfermos con isquemia crítica de extremidades sometidos a intervenciones
previas de revascularización, destinados a la amputación de la extremidad y en
los que sólo sea posible evitar implantando un injerto en los troncos distales de
pequeño calibre.
Como método de preservación se suele utilizar la criopreservación, pues otros
métodos de preservación a largo plazo como la liofilización, se han mostrado
menos eficaces, observándose acelularidad y calcificación tisular tras el proceso,
al igual que ocurre, cuando se aplican estos métodos a la preservación de
válvulas cardíacas. Un estudio publicado con una serie amplia y un largo periodo
de seguimiento, mostró que un tercio de las válvulas fallaban y que la mayoría
de las funcionantes, a los tres años estaban calcificadas.
Otro método de preservación consiste en el almacenamiento a 4º C en medio
nutritivo, sin embargo, no se pueden mantener en estas condiciones, con
garantías de calidad, por un periodo superior a 8 semanas, por lo que no es un
método aconsejable a no ser que se sepa seguro que se van a utilizar dentro de
ese periodo.
Figura 11: Bifurcado aortoileofemoral
24
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
5.3
Piel
De todas las alternativas posibles para el recubrimiento cutáneo en un quemado,
la opción de elección es el trasplante autólogo. De todas maneras, según la
magnitud de la lesión, esto no siempre es posible y con el objetivo de reducir el
riesgo de contaminación bacteriana, de pérdida de agua, electrolitos y proteínas,
de reducir el número de curas y el dolor así como, mejorar la cicatrización, se
han de buscar alternativas. Entre las opciones posibles, la más habitual es la
utilización de piel de cadáver criopreservada.
Otra modalidad de preservación de piel a largo plazo es la liofilización y más
recientemente, la conservación utilizando elevadas concentraciones de glicerol.
Estos métodos, tienen como ventaja, que permiten el almacenamiento del tejido
a temperatura ambiente. Además, la piel así preservada, tiene reducida la
posibilidad de transmisión de agentes infecciosos y de rechazo pero por el
contrario, tiene nula capacidad de prendimiento y de efecto cicatrizante.
Figura 11: Piel preparada para criopreservación
5.4
Membrana amniótica
La membrana amniótica es un tejido cuya demanda está incrementando en los
últimos tiempos. Es de fácil obtención y manejo y es eficaz en el tratamiento de
patología de la superficie ocular, en casos de resección conjuntival, erosión o
defectos epiteliales y procesos inflamatorios de diversa índole. Su capacidad
para regenerar tejidos dañados y minimizar lesiones superficiales lo hace muy
útil. Otra aplicación de demanda creciente es para reconstrucciones vaginales
en operaciones de cambio de sexo.
25
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Como método de preservación a largo plazo se utiliza la criopreservación, pues
otros métodos como la desecación o liofilización, por las características
intrínsecas de elasticidad y escaso grosor del tejido, no ofrecen de momento,
una buena alternativa.
Figura 12: Membrana amniótica
5.5
Tejido músculo-esquelético
El método de preservación de tejido óseo más extendido, es la congelación
directa en un congelador convencional a -80° C, ya que es un método, sencillo,
rápido, económico y eficaz, cuando no se requiere la conservación de la
viabilidad celular y el único objetivo que se pretende lograr con el implante, es la
aportación de un entramado óseo o soporte estructural en el receptor. Otra
ventaja importante de este método es que la respuesta inmunitaria es
generalmente escasa y clínicamente inapreciable, por lo que no es necesaria la
aplicación de ningún método profiláctico.
Cuando realmente se requiere conservar la viabilidad celular, como se puede
pretender del material cartilaginoso, es necesaria la utilización de agentes
crioprotectores y descensos controlados de temperatura y, en estos casos, el
almacenamiento se realiza en fase vapor de nitrógeno líquido.
26
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Otro sistema de preservación a largo plazo, de aplicación creciente, es la
conservación mediante liofilización o desecación. Estos métodos tienen como
gran ventaja respecto a la congelación, que el producto se almacena y transporta
a temperatura ambiente, pero son métodos complejos, costosos y poco
apropiados para grandes fragmentos. Con estos métodos, se producen
importantes cambios biomecánicos y la incorporación de los injertos es más
lenta que cuando que con la congelación.
Figura 13: Fémur
Figura 15: Hemitendones rotulianos
5.6
Figura 14: Tejido óseo esponjoso
Figura 16: Polvo de hueso esponjoso
liofilizado
Tejido paratiroideo
La criopreservación de tejido paratiroideo, es una práctica establecida en el
ámbito de la medicina endocrinológica y cuya finalidad es contribuir a la
restauración de la función paratiroidea tras una ablación quirúrgica. El
hiperparatiroidismo, aparece frecuentemente en pacientes diagnosticados de
insuficiencia renal crónica. Las manifestaciones clínicas pueden variar en grado y
severidad, pero, indefectiblemente, entre un 10 y un 25% de los pacientes
sometidos a hemodiálisis acaban desarrollando un elevado grado de
osteodistrofia. El tratamiento de elección suele ser la paratiroidectomía subtotal,
intentando conservar la mínima cantidad de tejido glandular necesario para
27
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
asegurar
un
adecuado
paratiroidectomía
metabolismo
subtotal,
puede
del
en
calcio.
ocasiones
No
obstante,
devenir
en
esta
un
hipoparatiroidismo definitivo. Por este motivo, se suele recurrir a la
criopreservación del material extraído, por si fuera necesario intentar restituir la
función paratiroidea. Sin embargo, a pesar del importante auge de estas técnicas,
en las dos últimas décadas, la aparición de importantes fibrosis en el lugar
anatómico del implante está provocando un retroceso en su aplicación.
5.7
Tejido reproductor
5.7.1
Tejido ovárico
La criopreservación de tejido ovárico, es una práctica establecida recientemente
en el ámbito de la medicina endocrinológica y de la reproducción. Tiene como
finalidad el restituir la función ovárica, cuando ésta ha fallado de forma
prematura, debido en la mayoría de los casos, a los efectos secundarios o
colaterales de los tratamientos oncológicos en mujeres jóvenes. Se aconseja su
aplicación lo antes posible una vez efectuado el diagnóstico y antes de iniciar el
tratamiento antineoplásico. Se desaconseja su aplicación en pacientes mayores
de 35 años, debido a la reducción drástica en la dotación folicular que se
presenta a partir de esa edad.
Figura 16: Fragmentos de cortical ovárica
28
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 17: Tejido ovárico descongelado y reinsertado en
el ovario residual. Inserción ortotópica
Figura 18: Tejido ovárico Tejido ovárico descongelado y
reinsertado en el espesor del músculo recto anterior del
abdomen. Inserción heterotópica
5.7.2
Oocitos
La criopreservación de oocitos sigue sin ser una práctica habitual en
reproducción asistida, a pesar de las importantes aplicaciones que podría
suponer y entre las que destacan:
•
Solventar la problemática de tipo ético y social que conlleva la congelación
de embriones.
•
Preservar la fertilidad de pacientes susceptibles de esterilidad por
enfermedad o tratamiento médico específico.
•
Permitir la creación de un banco de donantes, evitando la necesidad de
sincronización de los ciclos ovulatorios de donante y receptora, así como un
mayor seguimiento serológico en la donante.
29
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
5.7.3
Tejido testicular
La idea de criopreservar muestras obtenidas de una biopsia testicular en
pacientes con azoospermia obstructiva o no obstructiva, surge sobre la base de
minimizar el riesgo de no lograr espermatozoides en el momento de la ICSI
(Intracytoplasmatic Sperm Injection), así como evitar tener que repetir la
microcirugía si se requieren posteriores ciclos, en particular, para evitar lesionar
el tejido testicular y el epidídimo. Otra aplicación es en pacientes oncológicos
que no puedan acogerse a la criopreservación de semen, bien por ser
prepuberales, o adultos azoospérmicos. Otros beneficiarios son los lesionados
medulares.
5.7.4
Semen
La criopreservación de semen humano es una práctica habitual en el medicina
reproductiva. Las principales aplicaciones son:
•
Creación de un banco de donantes para el tratamiento de la esterilidad
masculina.
•
Conservación de semen de individuos sometidos a vasectomía.
•
Conservación preventiva en pacientes portadores de semen patológico que
requiera un proceso de concentración o mejora.
•
Preservación de la fertilidad en pacientes oncológicos.
Figura 19: Espermatozoides
30
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Figura 20: Criopreservación de semen en tubos
5.7.5
Embriones
La criopreservación de embriones es un complemento a las técnicas de FIV
(Fertilización in vitro) que aporta múltiples ventajas y posibilidades diagnósticas
y terapéuticas:
•
Preservar la fertilidad de determinadas pacientes.
•
Reducir el riesgo de embarazo múltiple.
•
Evitar la pérdida de embriones en un ciclo de reproducción asistida.
•
Facilitar la donación de embriones.
•
Permitir el diagnostico de anomalías genéticas.
Figura 21: Embriones en estadio de 8 células
31
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
6. Conclusión
Gracias al desarrollo y aplicación de las técnicas criobiológicas, son miles los
pacientes que anualmente consiguen una mejoría en su calidad de vida. Aunque
se han desarrollado otros métodos de preservación celular y tisular a largo plazo,
la criopreservación sigue siendo el método más extendido.
32
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
7. Bibliografía
-
Evolución de la actividad de trasplante de tejidos en Cataluña. Período
1999-2005. Organización Catalana de Trasplantes.
http://www10.gencat.net/catsalut/ocatt/es/htm/est_evolucio_transpl
antaments_teixits.htm
-
Actividad de obtención e implante de tejidos humanos. Revista
española de trasplantes, 2002.
http://www.medynet.com/elmedico/publicaciones/trasplantes2/99116.pdf
-
Memoria actividad de Tejidos, 2006. Organización Nacional de
Trasplantes. ONT
http://www.ont.es/Estadistica?accion=1&id_nodo=19&id_estadistica
=39&perfil=
-
Legislación vigente aplicable a la preservación de tejidos. Organización
Nacional de Trasplantes.
http://www.ont.es/Legislacion?id_nodo=35&accion=0&&keyword=
&auditoria=F
-
Asociación
Española
de
Bancos
de
Tejidos,
AEBT.
http://www.aebt.org/
-
Asociación
Europea
de
Bancos
de
Tejidos,EATB.
http://www.eatb.de/
-
Asociación
Americana
de
Bancos
de
Tejidos,
AATB.
http://www.aatb.org/
33
Unidad didáctica 5:
Los Bancos de sangre de
cordón umbilical
Dr. Joan García y Dra. Marta Torrabadella
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia Celular
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Historia y Situación actual de los Bancos de Sangre de Cordón
Umbilical (en adelante BSCU)
4. Organizaciones relacionadas con los BSCU
4.1. EUROCORD
4.2. NETCORD
4.2.1. Los Estándares NETCORD/FACT
4.2.2. La “Virtual Office”
4.3. ASIACORD
5. Funcionamiento de los BCU
5.1. El Programa de Sangre de Cordón Umbilical (PSCU) del
BST
5.1.1. Área de donación
5.1.1.1.
Obtención de la Sangre de Cordón (SCU)
5.1.2. Procesamiento y almacenamiento de la SCU
5.1.3. Registro búsquedas y suministro de la SCU
6. Legislación vigente que afecta a los BSCU
7. Conclusión
8. Bibliografía
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1. Introducción
El trasplante de progenitores hemopoyéticos es una herramienta terapéutica
consolidada en el tratamiento de numerosas enfermedades de base hematológica.
No obstante, solo un tercio de los pacientes cuentan con un donante adecuado.
Este hecho ha motivado el desarrollo de alternativas, como la utilización de
donantes familiares no compatibles o donantes voluntarios no emparentados
procedentes de registros internacionales. En este sentido, los bancos y registros
de sangre de cordón, han representado un paso adelante aumentando
significativamente las
posibilidades de hallar donantes adecuados y,
consecuentemente, mejorar las expectativas de curación de pacientes carentes
de ellos.
En la presente unidad didáctica se exponen los conocimientos básicos sobre el
funcionamiento de los BSCU, su logística y su organización tanto a nivel local
como internacional, finalizando con una breve cita a la legislación vigente.
2. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería:
-
Conocer la organización básica y funcionamiento de los Bancos de
Sangre de Cordón
-
Conocer los métodos de procesamiento y preservación de la Sangre de
Cordón.
-
Conocer la organización de los BSCU a nivel Nacional e Internacional.
3
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3. Historia y Situación actual de los BSCU
Durante la gestación, la placenta y la circulación sanguínea feto-placentaria
tienen cubren una importante número de funciones imprescindibles para el
correcto desarrollo fetal. A pesar de ello, hasta la década de los noventa, la
placenta y la sangre contenida en ella eran consideradas, después del parto,
productos de desecho.
Lógicamente, unas estructuras tan cruciales durante el largo periodo de la
gestación debían poseer ciertas características que podían ayudar a entender
ciertas áreas de la ontogenia y, en última instancia, ser de alguna utilidad. De
hecho, el reducido conocimiento que se poseía de éstas era, básicamente, un
exponente de la limitación de los métodos de investigación y análisis vigentes.
En el ámbito de la hematología, el desarrollo de nuevas posibilidades de estudio
fenotípico y funcional de las células madre y progenitores hemopoyéticos hizo
que, durante los ochenta, numerosos investigadores volvieran a situar sus miras
en el estudio de la ontogenia hemopoyética descubriendo, entre otras cosas, que
la sangre de la placenta, fácilmente accesible a través de la punción de la vena
umbilical, posee unas cualidades diferentes de la sangre adulta e incluso de la de
los recién nacidos de más de 48 horas.
Dos de estas cualidades son de especial relevancia: a) la sangre placentaria posee
una concentración relativamente elevada de células madre hemopoyéticas de
elevada capacidad proliferativa y, b) las células responsables de la respuesta
inmune son relativamente “naive”, como posible exponente de la tolerancia
feto-materna y de su falta de contactos previos con antígenos externos.
Estas características convirtieron la sangre de cordón umbilical (SCU) en una
fuente de progenitores hemopoyéticos potencialmente útil en trasplantes; hecho
que se demostró en modelos animales y, posteriormente, en una primera
experiencia exitosa publicada en 1989 por E. Gluckman. Se trataba de un niño
que sufría una aplasia de Fanconi que recibió un trasplante de SCU de su
hermano recién nacido.
Una vez demostrada la capacidad de implante de los progenitores de la SCU
entre familiares histocompatibles, con la experiencia previa del desarrollo
estratégico de los registros de donantes no emparentados de médula ósea y la
4
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
premisa
de
la
mayor
permisividad
inmunológica
de
las
células
inmunocompetentes de la SCU, se propuso la utilización de donaciones no
emparentadas con el objetivo de completar el abanico de posibles donantes
alternativos de progenitores hemopoyéticos para aumentar las posibilidades
terapéuticas de pacientes que carecen de un donante familiar idóneo.
Para posibilitar esta estrategia fue necesario el desarrollo de programas de
donación, obtención, manipulación y almacenamiento de la SCU; en resumen, la
creación de los bancos de sangre placentaria o de cordón umbilical (BSCU), con
el objeto de poder suministrar este producto, con las máximas garantías de
calidad, a los centros de trasplante.
En este sentido, a pesar de la limitación que le confiere su escaso volumen y
contenido de progenitores obtenidos, la SCU tiene una serie de ventajas
adicionales sobre la MO procedente de registros de donantes no emparentados:
a) menor incidencia y mejor control de enfermedades transmisibles, b)
disponibilidad casi inmediata, c) ausencia de pérdidas del registro d) coste
económico menor.
El banco de sangre de cordón umbilical de Nueva York fue el pionero,
iniciando su actividad en 1993, y también fue el primero que suministró una
unidad de SCU no emparentada, durante el mismo año, para la realización del
primer trasplante de este tipo en la “Duke University” de Durham.
A esta iniciativa se sumaron los BSCU de Milan, Duesseldorf y Barcelona, entre
1994 y 1995, a los que progresivamente se sumaron otros hasta un total de más
de 100 en el año 2007. En la actualidad hay más de 270.000 unidades de SCU
disponibles de las cuales, aproximadamente la mitad, están situadas en BSCU
Europeos y se han contabilizado más de 7000 trasplantes aunque esta cifra,
probablemente esté subestimada ya que se están reportando más de 1500
nuevos trasplantes cada año.
5
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Fig 1. Crecimiento anual de las unidades de SCU registradas en BMDW
4. Organizaciones relacionadas con los BSCU
Generalmente, los BSCU transfieren los datos de sus unidades a los registros
nacionales (en España, el Registro Español de Donantes de Médula Osea
“REDMO” patrocinado por la Fundación Internacional José Carreras)
e
internacionales (Netcord, Bone Marrow Donors Word Wide “BMDW”,
National Marrow Donors Program “NMDP”, etc.) de manera relativamente
homogénea, haciendo accesible, la mayor parte del inventario internacional a los
centros de trasplante.
Que ello sea posible hoy en día, se debe al trabajo y colaboración de diversas
entidades, organizaciones y comités. Entre ellos cabe destacar: el BSCU de
Nueva York, EUROCORD, NETCORD, ASIACORD y los registros
nacionales de donantes de médula ósea; concretamente, en España, el Registro
Español de Donantes de medula Ósea –REDMO– gestionado por la Fundación
Internacional José Carreras.
El BSCU de Nueva York fue el primero en establecerse, posee el más grande
inventario de unidades de SCU del mundo y ha contribuido a, prácticamente, un
6
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
tercio de todos los trasplantes no emparentados de SCU realizados hasta ahora.
Además ha generado contribuciones significativas al desarrollo de tecnologías
para el procesamiento, almacenamiento, control de calidad y, por supuesto, al
análisis del comportamiento clínico de los trasplantes de SCU.
4.1.
EUROCORD
EUROCORD es un registro internacional, liderado por la Dra. Eliane
Gluckman, que actúa dentro del seno del European Blood and Marrow
Transplant group (EBMT), que colabora con centros de trasplante europeos y
no europeos que realizan trasplantes de SCU emparentados y no emparentados.
Las bases de datos de EUROCORD y EBMT son cuidadosamente contrastadas
y comprobadas para asegurar y validar todos los datos que se comunican. Los
análisis del registro EUROCORD contribuyen al control y estudio de las
respuestas clínicas, suministrando periódicamente estos datos a los BSCU
asociados.
Los resultados mas importantes generados por EUROCORD fueron los que
demostraron la menor incidencia de enfermedad del injerto contra el huésped –
EICH–, comparada con los trasplantes de medula ósea, lo que confirmaba la
posibilidad de realizar trasplantes no compatibles, desde el punto de vista del
sistema HLA y, también, en 1997, el grupo EUROCORD demostró, que el
número de células de SCU trasplantadas (más de 0,37 x108/kg) era el factor
pronostico mas importante para el implante y la supervivencia de los pacientes
sometidos al TSCU. Ello modificó substancialmente la logística de los BSCU ya
que, desde entonces, la mayor parte de los BSCU decidieron recolectar y
almacenar unidades de gran volumen y contenido celular.
EUROCORD
ha
demostrado
que
existen
tres
factores
asociados
significativamente a la probabilidad y velocidad de recuperación de los
neutrófilos
post
trasplante:
diagnóstico
diferente
a
anemia
aplásica,
compatibilidad HLA y número de células recolectadas e infundidas.
Los mismos tres factores están asociados con la recuperaciones de las plaquetas
y la mortalidad relacionada con el trasplante. Análisis mas recientes han
demostrado que el trasplante de un numero elevado de células disminuye la
7
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
influencia de la incompatibilidad en el sistema HLA y que, inversamente, el
numero de células necesario para producir un implante es inferior en los
trasplantes con mejor histocompatibilidad.
En este sentido, un número ≥
2x107/kg recolectadas o, alternativamente ≥ 1,5x107/kg infundidas, debería ser
suficiente para implantar en pacientes adultos, siendo la compatibilidad HLA el
segundo factor en importancia para determinar el donante de elección.
Estos datos, por supuesto, plantean la cuestión de la factibilidad del trasplante
de SCU en individuos de mayor peso, aunque, la proporción creciente de
unidades de SCU que contienen un número elevado de células y los resultados
alentadores demostrados en niños han incrementado substancialmente el
numero de trasplantes realizados en pacientes adultos.
Como se ha mencionado, el registro EUROCORD realiza análisis periódicos;
en uno de ellos, con casi 700 trasplantes analizados, ya se pudo demostrar una
mejora en la mortalidad relacionada con el procedimiento, a los cien días del
trasplante, en los pacientes adultos sometidos a este tipo de tratamiento a partir
de 1998, confirmándose la cifra de células infundidas como el factor pronóstico
mas relevante en relación al implante y la supervivencia.
De hecho, el número de células infundidas fue el único factor estadísticamente
diferente entre los pacientes que recibieron un trasplante antes o después de
1998. Actualmente es ampliamente reconocido el relevante papel que tiene el
grupo EUROCORD en el ámbito del trasplante de la sangre de cordón
umbilical.
4.2.
NETCORD
En 1998 los BSCU pioneros (Milan, Duesseldorf, Barcelona, Londres, París,
Bélgica, Tokio, Denver, San Luis, Nueva York y Leiden) crearon el embrión de
una organización internacional, NETCORD, a la que posteriormente se han
sumado otros bancos hasta llegar a poseer mas de 25 BSCU asociados.
La fundación NETCORD (www.netcord.org) se estableció en 1998, para
promover los bancos de alta calidad y el uso de la sangre de cordón umbilical en
el trasplante alogénico.
8
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
NETCORD es una organización internacional, sin ánimo de lucro, que
promueve el establecimiento de BSCU de alta calidad. Para ello ha generado
unos estatutos, estándares y guías para promocionar estudios e investigación en
torno a la obtención, procesamiento, caracterización y preservación de la sangre
placentaria con el objetivo primario de promover la calidad en un entorno
internacional. (Ver presentación 1 que se adjunta)
4.2.1. Los estándares NETCORD/FACT
A fin de asegurar que dicha calidad elevada y uniforme, especialmente, en las
unidades mostradas en su inventario, NETCORD ha establecido unos
estándares de específicos, en colaboración con la Foundation for the
Accreditation of Cellular Therapy (FACT), sobre la obtención, criopreservación,
almacenamiento y suministro de las unidades de SCU.
Fig.2: Estándares Netcord FACT (segunda y tercera edición)
Todos los BSCU de NETCORD deben obtener la acreditación de
NETCORD/FACT para ser miembros definitivos de esta organización. Estos
estándares han sido adoptados por un numero importante de organizaciones
internacionales y nacionales como: ASBMT, EBMT, ISCT, JACIE, ONT,
CBMTG y WMDA, entre otras, y son objeto de frecuentes actualizaciones.
El aseguramiento de la calidad, los procesos de validación y los procedimientos
operativos basados en los estándares son la base de las inspecciones del proceso
9
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
de acreditación formal que, así mismo, deben observar las normativas de cada
país.
Hasta ahora mas de mas de BSCU han solicitado esta acreditación en EEUU,
Europa, Australia y Asia. Ya se han realizado un número importante de
inspecciones, mas de quince bancos ya han sido formalmente acreditados y
otros diez están
cubriendo las ultimas etapas del proceso. Cuarenta y un
inspectores con experiencia específica en BSCU han sido entrenados y
participan activamente en esta actividad. La FACT esta reclutando un numero
creciente de inspectores a fin de poder cubrir las necesidades de acreditación a
escala internacional.
4.2.2. La “Virtual Office”
A fin de facilitar las búsquedas directas de unidades de SCU desde los centros
de trasplante y los registros internacionales, NETCORD ha establecido un
programa de búsqueda y asignación de unidades “on-line”, en forma de oficina
virtual (Virtual Office –VO–). Este programa permite búsquedas, en tiempo real,
de las unidades compatibles entre las disponibles en un momento dado. En la
VO se puede obtener información detallada de las unidades pertenecientes al
inventario de NETCORD en el que constan, actualmente, mas de 150000
perfectamente caracterizadas y disponibles.
Tabla 1. Inventario y número de trasplantes de los BSCU asociados a NETCORD
10
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Los informes iniciales incluyen el tipaje HLA (muy frecuentemente, de alta
resolución), volumen, contenido celular y análisis de marcadores de
enfermedades transmisibles. De esta manera cuando un centro de trasplante
solicita información a la VO, a los pocos minutos reciben un informe unificado
de todas las unidades aceptables existentes en el inventario de NETCORD. La
VO además posee información actualizada de la disponibilidad de unidades para
evitar posibles conflictos o coincidencias enen su asignación. Hasta ahora, la
VO ha facilitado la utilización de mas de 6000 unidades de SCU en todo el
mundo y, recientemente, ha establecido un convenio de colaboración con
diversos registros de donantes no emparentados, entre los que cabe destacar el
Nacional Marrow Donor Registry (NMDP).
La posibilidad de compartir las búsquedas de sangre de cordón umbilical en una
única base de datos en la VO, facilita la rápida identificación de la mejor unidad
posible para un paciente dado. Por otra parte, la interacción directa entre los
centros de trasplante y el BSCU elegido, optimiza la programación del
procedimiento y minimiza el trabajo burocrático requerido para el suministro a
los centros de trasplantes.
4.3.
ASIACORD
Un fenómeno especial es el acaecido en Asia, donde la adopción de la
tecnología del trasplante de sangre de cordón se ha difundido rápidamente, en
parte debido al pequeño tamaño de las familias, que hace difícil hallar un
donante adecuado que permita un trasplante hemopoyético.
Para facilitar la búsqueda de unidades de SCU y fomentar su trasplante, la red
asiatica de bancos de SCU fundó ASIACORD en el año 2000 en Bangkok. Los
miembros de ASIACORD son los BSCU lideres en Asia: Bangkok, Pekin, Ho
Chi Minh City, Seul, Taipei, Tianjin y Tokio.
También han establecido unos estatutos y estándares basados, en parte, en los
NETCORD/FACT. Además un sistema similar a la VO, adaptado al entorno
asiático, esta en fase de implementación. El inventario actual en ASIACord
incluye mas de 55000 unidades y mas de 400 trasplantes realizados (mas de 2/3
en Tokio ). (Ver información ampliada en manuscrito adjunto)
11
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
5. Funcionamiento de los Bancos de Sangre de Cordón
Después de múltiples análisis consecutivos (grupo EUROCORD, BSCU de
Nueva York, Universidad de Minesotta, la Universidad de Duke i CIBMTR) se
desprenden ya una serie de conclusiones relevantes: a) La SCU es capaz de
implantar correctamente en la mayoría de los pacientes, aunque la velocidad de
este implante es menor que la que se obtiene con progenitores de médula ósea o
sangre periférica b) La incidencia de complicaciones inmunológicas, como la
enfermedad del injerto contra el huésped, es comparativamente menor y por
ello, c) El trasplante de SCU es más permisivo en cuanto a su
histocompatibilidad aunque, a mejor compatibilidad mejores resultados, y, d)
Los resultados clínicos, en términos de recuperación inmunológica y
supervivencia, son comparables (en ocasiones incluso mejores) a los obtenidos
con médula ósea o sangre periférica adulta de donantes no emparentados.
En este contexto, los BSCU juegan un papel crucial ya que son el primer
eslabón que condiciona el resultado clínico final. Los BSCU deben conjugar una
serie de estrategias, técnicas y funciones encaminadas a la obtención de un
producto con las máximas garantías de calidad.
Precisamente, la aplicación de criterios comunes de calidad ha generado un
elevado nivel de estandarización entre los diferentes bancos diferenciándose
relativamente poco las estrategias y técnicas adoptadas en la mayoría de ellos.
Por ello, nos permitimos documentar su funcionamiento siguiendo el hilo
conductor del sistema organizativo del Programa de Sang de Cordó del Banc de
Sang i Teixits de Cataluña que, en muchos aspectos, es similar a los programas
de parecidas dimensiones. (Se recomienda revisar las presentaciones 2 y 3 durante la
lectura del texto)
5.1. El Programa de Sangre de Cordón Umbilical (PSCU) del BST
El primer embrión se constituyó en Septiembre de 1995, en forma de proyecto
de investigación, con el objetivo de almacenar 10000 unidades de SCU
perfectamente caracterizadas y de óptima calidad para su uso en programas
clínicos de trasplante no emparentado. Desde entonces el proyecto ha crecido
progresivamente hasta tener un inventario y una actividad trasplantadora
12
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
considerable.
Actualmente, a un año de culminar este primer objetivo,
entendemos que, a tenor de los datos presentes, una cifra deseable estaría
alrededor del doble de la cantidad propuesta inicialmente. Por ello, hemos
incrementado nuestra actividad con el objeto de alcanzar las 22000 unidades en
cinco años.
La actividad del PSCU se establece en tres áreas de actuación: el área de
donación, u obstétrica, el laboratorio de procesamiento/almacenamiento y la
unidad de registro, búsquedas y suministro.
5.1.1.
Área de donación
El área de donación se ha modificado profundamente desde el inicio del
programa: desde dos maternidades activas en el año 1996 hasta más de 27 en
Cataluña en el año 2007. Además, durante los últimos años, nuestro programa
ha establecido unas fructíferas colaboraciones con algunas CCAA para
establecer programas de sangre de cordón en su propio territorio. De esta
manera, Illes Balears, Aragón, Navarra y Extremadura (a las que próximamente
se añadirá Andorra) han implantado sus programas de Sangre de Cordón, en
muy corto espacio de tiempo, beneficiándose de los aspectos técnicos y
logísticos aportados por el PSCU de Cataluña. De esta manera se han añadido al
proyecto unas 25 maternidades adicionales.
Fig 3: Composición del Programa Inter-autonómico de BSCU
Programa Inter autonómico de
BSCU
Programa SCU
Aragón
Programa
Nodal
Programa SCU
Illes Balears
Programa SCU
Navarra
Programa SCU
Extremadura
Programa SCU
Andorra
13
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Las donantes son incluidas en el programa durante la gestación. Para ello es
necesario descartar antecedentes personales y familiares de enfermedades
transmisibles, genéticas o infecciosas, y la realización de análisis durante el
embarazo, para descartar las infecciones por HIV, hepatitis y sífilis.
Tabla 2: Analíticas obligatorias en la gestante (de los estándares NETCORD/FACT)
Las
madres
seleccionadas
e
informadas
apropiadamente
consentimiento para la donación previo al parto.
firman
un
No se debe solicitar el
consentimiento para la donación una vez iniciado el trabajo de parto.
5.1.1.
Obtención de la Sangre de Cordón
Todas las madres incluidas en el programa con una gestación que supere las 32
semanas son potenciales candidatas a la recogida de SCU existiendo unos
criterios consensuados de inclusión.
Tabla 3. Criterios de Inclusión de las donantes de Sangre de Cordón Umbilical
Antecedentes personales y familiares
Serología anti-infecciosa de la madre
Consentimiento
Descartar enfermedades genéticas transmisibles en
los padres y familiares de primer grado
Negatividad para VIH, VHC, Lues (RPR), y
antígeno de superficie de VHB
Entender y aceptar las condiciones de donación
antes del parto
14
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Transfusiones el último año
Enfermedades autoinmunes
Criterios de exclusión maternos
Enfermedades neoplásicas
Factores de riesgo para VIH
Enfermedades neurodegenerativas
Tª materna < 38ºC
Gestación > 32 semanas
Características del parto
No existan complicaciones obstétricas
No exista isoinmunización
No se evidencie sufrimiento fetal
El material necesario para la recogida de la SCU y las muestras anexas es:
• Bolsa de recogida con anticoagulante, específica de este procedimiento.
• Tubos con anticoagulante para controles de la sangre materna y SCU.
• Frasco para guardar un fragmento de cordón como fuente extra de
ADN del donante
Fig. 4. KIt de obtención de SCU
15
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
La SCU se obtiene cuando la placenta está “in útero” y el recién nacido ha sido
separado de ella. Es posible (y, es práctica habitual de algunos bancos
prestigiados) la obtención de la SCU “ex útero”, una vez la placenta ha sido
alumbrada. La obención de la SCU se realizará por parte de personal sanitario,
médico o diplomado, que específicamente realizará la recogida y será distinto
del personal que asiste directamente el parto.
La técnica “in útero” es la siguiente:
• Doble “clampaje” y sección del cordón umbilical a 3-4 cm del ombligo.
• Aseptización de la zona de punción.
•
Identificación y punción de la vena umbilical lo más distalmente posible.
• Recolección por gravedad en la bolsa específica, agitando suavemente
para evitar la formación de coágulos.
• Expresión suave del cordón para ayudar al vaciado del mismo.
• Practica de una segunda punción en zona mas cercana al periné.
• Una vez recogido el máximo volumen posible se espera al
alumbramiento de la placenta, cuyas venas de la cara fetal también se
puncionan
para
obtener
sangre
adicional
para
las
pruebas
complementarias.
Fig. 5. Punción de la vena umbilical
• Se secciona un fragmento de cordón, y se guarda en el frasco
correspondiente.
La conservación y transporte del material se realiza a 4ºC durante un máximo de
40 horas desde la obtención.
16
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Fig 5. Maleta homologada para transporte “en fresco”
Seguimiento posparto: Aunque no es obligado por estándares, es
recomendable realizar un seguimiento clínico y analítico de la madre y el recién
nacido durante el puerperio hospitalario, después de la cuarentena y, si es
posible, a los seis meses, registrándose todas las incidencias que presenten la
madre y el recién nacido.
5.1.2.
Procesamiento y almacenamiento de la SCU
El procesamiento consta de 4 fases diferenciadas:
a) Caracterización inicial de la muestra: Se aceptan las muestras recibidas
dentro de las 24 horas post-recogida. La caracterización inicial consiste en
un recuento automático de células nucleadas (incluyendo eritroblastos), una
extensión en portaobjetos para citología convencional. También se envían 4
ml para realización de tiraje HLA (A, B y DRB1), y una muestra para
grupo sanguíneo.
b) Reducción de volumen: Con el fin de almacenar las unidades en bolsas de 25
ml,
17
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Fig 6. Separación manual de la capa de células nucleadas de la unidad de SCU
Método manual: inicialmente, se realizaba una reducción de volumen utilizando
una técnica similar a la reportada por Rubinstein et al. Brevemente, se mezcla la
SCU recibida con HES 6% en salino (HES Grifols, Barcelona) hasta una
concentración final del 2,4%. Se centrifuga a 50xg, 5 minutos. Se obtiene un
sobrenadante rico en células que se separa mediante extractor manual de plasma.
Para ello se utiliza un kit de bolsas interconectadas cerrado donde están unidas
la bolsa de procesamiento, la del plasma y la bolsa de criopreservación. El pellet
de hematies resultante se utiliza para obtener ADN del donante. Se realiza una
segunda centrifugación para desplasmatizar y obtener un sobrenadante sin
células a 400xg, 15 minutos. Se separa el plasma y se ajusta por peso a 20 ml
finales de células y hematíes residuales.
Método automático: a fin de estandarizar y optimizar los resultados obtenidos hace
siete años introdujimos un método automático de centrifugación y separación
celular (Sepax® de Biosafe SA), que utilizando un sistema cerrado de bolsas,
rotor y válvulas de separación permite centrifugar, separar las fracciones y
depositar en la bolsa de congelación el producto final en menos de 30 minutos.
18
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Fig 7. Separador celular
Sepax® de Biosafe SA
Figs. 8 y 9. Esquemas de equipo desechable i secuencias del proceso de separación
19
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
c) Caracterización final: Se obtienen 0,3 ml de sangre separada para realización
de recuento automático de células nucleadas y citometría de flujo para
CD34. También se realiza test de esterilidad en frascos de hemocultivo
pediátrico tras adición de DMSO (1 ml).
Tabla 3. Caracterización de la muestra
INICIAL1
FINAL2
CONTROL CRIOP3
CONTAJE AUTOMATICO4
0,3
0,2 ML
0,2 ML
EXTENSION5
ML
-
-
ABO Rh
1
-
-
GOT
-
0,1 ML
A
-
0,1 ML
0,1
0,1 ML
-
ML
1 ML
-
HLA6
Unidades Formadoras de
CD34 (citometria de
Colonias7
flujo)8
ESTERILIDAD (hemocultivo)
4 ML
Sobre la muestra a la recepción, sin ningún tipo de manipulación
Sobre la muestra que va a ser criopreservada
3 Sobre un tubo control o segmento conteniendo la muestra,
criopreservado junto con la bolsa
4 Contaje mediante el contador automático JT3 (Coulter)
5 Extensión sanguínea sobre porta y tinción rápida
6 Clase I (A,B) y DRB1 por SBT (sequencing-based typing)
7 CFU-GM, BFU-E y CFU-Mix
8 Población positiva para el anticuerpo HPCA-2-PE, sobre
población de células vivas de tamaño y complejidad baja, CD45+
1
2
d) Criopreservación: Se añaden 5 ml de DMSO y dextrano (peso molecular:
40,000 KD) para obtener un producto final consistente en células nucleadas
de SCU, DMSO 10%, Dextrano 40 1% y HES 0,8%. Esta maniobra se
realizaba, históricamente, en 15 minutos utilizando acumuladores de frío.
Actualmente, se utiliza un sistema automático (Coolmix®, Biosafe), de
enfriamiento controlado a 4ºC con agitación constante de la muestra y
registro de temperatura
La congelación programada y el almacenamiento se realizan utilizando el
sistema Bioarchive (Thermogenesis). Este sistema criopreserva la muestra
en 20 minutos con una cinética en la fase de cambio de estado de –
5ºC/minuto, en la fase de vapor de un tanque de nitrógeno. Una vez
criopreservada (temperatura de la muestra inferior a -50ºC) es almacenada
en el mismo tanque mediante un brazo robótico. La historia térmica de la
muestra queda registrada.
20
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Fig. 10. Aparato
Coolmix® de mezcla con
Del crioprotector con
control de temperatura
y tiempo
Fig 10. Sistema Bioarchive® de Thermogénesis
MUESTRAS PARALELAS:
Con el fin de garantizar la trazabilidad y proceder a re-tipajes o re-análisis de las
muestras, cada unidad criopreservada posee muestras en paralelo, identificadas
con el mismo código y congeladas a –80ºC. Estas corresponden a:
-
Plasma de la madre del día del parto, para realización de test anti-
infecciosos: HbsAg, Ac-HCV, Ac-HIV1+2, RPR, Ac-CMV IgG+IgM.
-
Células de la madre, para trazabilidad, utilizando sistema HLA
(confirmación de haplotipo)
21
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
-
Plasma de la SCU (obtenido durante la reducción de volumen)
-
Fragmento tisular de cordón umbilical (para extracción de ADN del
donante)
-
Células de SCU obtenida de las venas de la cara fetal de la placenta
para obtención de ADN.
-
Durante la visita de cuarentena, la maternidad realiza un
seguimiento post-parto de la madre y del recién nacido. En este
momento se obtiene una muestra de sangre para realización de pruebas
de “screening” serológico contra enfermedades transmisibles.
5.1.3.
Registro, búsquedas y suministro de la SCU
Todas las unidades son registradas con un código interno. El nombre de la
madre es mantenido de forma confidencial para poder informarla de cualquier
anomalía analítica observada. Todas las unidades validadas son incluidas en dos
registros de datos con la información mínima necesaria para la búsqueda: código,
celularidad nucleada criopreservada, volumen inicial obtenido, Células CD34+ y
HLA (A,B, DRB1). Estos registros son REDMO (nacional, en el caso de
España) y NETCORD (internacional).
A través de estos registros se pueden consultar las unidades. Si existe alguna
compatible para un paciente el centro de trasplante puede ponerse en contacto
directamente con el banco para realizar las gestiones necesarias para el envío de
la muestra. Estas incluyen, además de las propiamente administrativas,
comprobación del tipaje, ampliación del estudio de enfermedades transmisibles,
verificación de trazabilidad y estudios de viabilidad y estudios funcionales de la
unidad.
Las unidades se envían, a través de una empresa especializada, utilizando “dry
shippers” capaces de mantener temperaturas de -140ºC durante una semana.
Estos son validados antes de cada transporte e incluyen un registrador de
temperatura que permite reconstruir toda la evolución térmica durante todo el
recorrido. Cada unidad se acompaña de un formulario donde se registran las
incidencias de la descongelación y los eventuales efectos adversos y que debe
ser remitido al BCU.
22
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Fig 11. Dry Shipper, con recipiente protector y registro de temperatura
Una vez se ha suministrado la unidad, el BSCU notifica a EUROCORD el
trasplante realizado, a la par que suministra los datos biológicos de la unidad.
A partir de este momento, EUROCORD realizará el seguimiento de la
evolución clínica de los pacientes, realizando informes periódicos para el BSCU.
6. Legislación vigente, en España, que afecta a los BSCU
Hemos creído interesante incluir esta información, ya que España ha sido uno
de los primeros países en realizar la transposición de la reciente directiva de la
UE sobre células y tejidos. Siendo, quizás, una de las mas avanzadas en este
momento.
El RD 1301/2006, por el que se establecen las normas de calidad y seguridad
para la donación, la obtención, la evaluación, el procesamiento, la preservación,
el almacenamiento y la distribución de células y tejidos humanos contempla el
uso autólogo eventual: las células o tejidos así obtenidos pueden ser preservados
para su aplicación hipotética futura en la misma persona pero siempre y cuando
se cumplan los siguientes requisitos:
•
La donación de células y tejidos será en todo caso voluntaria y altruista.
23
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
•
La promoción y publicidad de la donación se realizará de forma general,
sin buscar un beneficio para personas concreta y señalándose su
carácter voluntario, altruista y desinteresado.
•
Las actividades de los establecimientos de tejidos no podrán tener
carácter lucrativo.
•
En todo caso se mantendrá confidencialidad de los datos.
•
Los centros y unidades de obtención de células y tejidos deberán tener
autorización administrativa
•
Deberá asegurarse la trazabilidad de las donaciones
•
Existirá un sistema de codificación y de bio-vigilancia
•
Las autoridades competentes de las comunidades autónomas efectuarán
inspecciones periódicas para garantizar que los establecimientos de
tejidos autorizados cumplen los requisitos del RD 1301/2006 y aplican
las medidas de control de calidad exigidas en él.
•
Los BSCU en España deberán cumplir unos requisitos de calidad y
estar acreditados.
Los BSCU que desarrollen actividad para eventual uso autólogo deberán:
-
Estar autorizados.
-
Disponer de un convenio o acuerdo entre la maternidad donde nazca el hijo
y el banco donde se almacene la SCU del recién nacido.
-
Además debe informarse a las donantes que todas las unidades de SCU
almacenadas en este tipo de bancos quedarán a disposición del Registro
Español de Donantes de Médula Ósea (REDMO) y podrán ser utilizadas
para tratar a cualquier paciente que necesite un trasplante de SCU y sea
compatible con alguna de las unidades de SCU
La SCU de donantes españolas podrá sacarse fuera de España siempre que lo
desee la donante, sin embargo deben cumplirse las siguientes circunstancias:
-
El centro donde nazca el niño debe tener una autorización específica para
extraer SCU
-
El banco de SCU al que se envíe la unidad de SCU de su hijo debe estar
autorizado para la actividad de almacenamiento.
24
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
-
Debe existir un convenio o acuerdo entre la maternidad donde nazca el
niño y el banco donde se almacene la SCU.
-
Además, y en el caso de que el banco a donde envíe la SCU se encuentre
fuera de la Unión Europea, debe cursarse una solicitud de salida de nuestro
país de la unidad de SCU a la Organización Nacional de Trasplantes. Esta
solicitud podrá realizarla directamente a la Organización Nacional de
Trasplantes o a través de la Coordinación Autonómica de la CCAA donde
resida. La maternidad es la que debe cursar la solicitud al Director de la
Organización Nacional de Trasplantes para que se le autorice la salida de
dicha unidad de SCU de nuestro país. Para ello, junto con la solicitud,
deberá presentar:
o
Certificación o documento que demuestre que el banco de SCU al
que se vaya a enviar para almacenamiento la unidad de SCU del
recién nacido esta autorizado para tal actividad
o
Certificación o documento que demuestre la existencia de un
convenio o acuerdo entre la maternidad donde nazca el niño y el
banco donde se almacene la SCU del niño.
Los BSCU para eventual uso autólogo deben: mantener los mismos estándares
de calidad en la obtención, procesamiento y almacenamiento que los bancos de
SCU públicos, asegurar que en caso de cese de actividad las unidades de SCU
almacenadas serán transferidas a otro banco sin ningún riesgo de perdida ni
deterioro y poner a disposición del Registro Español de Donantes de Médula
Ósea (REDMO) todas las unidades almacenadas para que puedan ser utilizadas
para tratar a cualquier paciente que necesite un trasplante de SCU y sea
compatible con alguna de las unidades almacenadas en el banco.
25
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
7. Conclusión
El trasplante de SCU es una actividad terapéutica establecida, aunque en
continua evolución y mejora. Su “éxito” se debe, en parte, al desarrollo e
implantación de los BSCU. Estos, a través de la innovación continuada y a la
aplicación de rigurosos estándares de calidad han conseguido que la sangre de
cordón haya pasado de ser un producto de desecho a ser, prácticamente, un
medicamento celular de composición y cualidades cada vez las reproducibles y
definidas. Sin haber llegado al final del camino, se puede afirmar que los BSCU
han contribuido de manera decisiva a la mejora de las expectativas de vida de
pacientes que, hasta hace poco carecían de un donante adecuado.
26
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
8. Bibliografía
1. Gluckman E, Broxmeyer HE, Auerbach AD et al. Hematopoietic
reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of
umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. New Engl J Med
1996; 335:157-66.
2. Broxmeyer HE, Douglas GW, Hangoc G et al. Human umbilical cord
blood as a potential source of transplantable hematopoietic
stem/progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86;3828-32.
3. Rubinstein P, Taylor PE, Scaradavou A et al. Unrelated placental blood
for bone marrow reconstitution: organization of the placental blood
program. Blood Cells 1994; 20: 587-600.
4. Gluckman E. European organization for cord blood banking. Blood
Cells 1994; 20: 600-8.
5. Rubinstein P, Carrier C, Scaradavou A, Kurtzberg J, Adamson J,
Migliaccio, AR, Berkowitz RL, Cabbad M, Dobrila NL, Taylor PE,
Rosenfield RE, Stevens CE. Outcomes among 562 recipients of
placental-blood transplants from unrelated
donors. N
Engl J Med. 1998;339:1565-77.
6. Rubinstein P, Dobrila L, Rodsenfield R et al. Processing and
cryopreservation of placental/umbilical CB for unrelated marrow
reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92:10119-22.
7. Gluckman E, Rocha V, Chastang C. Cord blood banking and transplant
in Europe. Eurocord. Vox Sang. 1998;74 Suppl 2:95-101.
8. Querol S, Gabarro M, Amat L, Gonzalez S, Gomez MD, de la Calle O,
Madoz P, Badell I, Garcia J. The placental blood program of the
Barcelona Cord Blood Bank. Bone Marrow Transplant. 1998;22 Suppl
1:S3-5.
27
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
9. Rocha V, Cornish J, Sievers EL et al. Comparison of outcome of
unrelated bone marrow and umbilical cord blood transplants in
children with acute leukemia. Blood 2001; 97: 2962-2971.
10. Laughlin MJ, Eapen M, Rubinstein P et al. Outcomes after
transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors
in adults with leukaemia. N Engl J of Med 2004; 351: 2265-2275.
11. Rocha V, Labopin M, Sanz G et al. Transplants of umbilical-cord blood
or bone marrow from unrelated donors in adults with acute leukaemia.
N Engl J Med 2004; 351: 2276-2285.
12. Eapen M, Rubinstein P, Zhang MJ et al. Outcomes of transplantation
of unrelated donor umbilical cord blood and bone marrow in children
with acute leukaemia: a comparison study. Lancet 2007; 369: 1947-1954.
28
Unidad didáctica 6:
Legislación, acreditación y
aseguramiento de la calidad
Dra. Adela Miralles
Banc de Sang i Teixits. Centro de Tejidos y Terapia Celular
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Sumario
1. Introducción
2. Objetivos
3. Legislación, acreditación y aseguramiento de la calidad
4. Estándares de Calidad generales de aplicación en Bancos de
Tejidos y Terapia celular
5. Bibliografía
2
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
1. Introducción
El marco regulador básico en España referente a la obtención, procesamiento,
preservación y distribución de células y tejidos para implante es el Real Decreto
1301/2006 de 10 de noviembre de 2006, que define al Banco de Tejidos como
la unidad técnica que tiene por misión garantizar la calidad de los tejidos
después de la obtención y hasta su utilización clínica como aloinjertos o
autoinjertos.
2. Objetivos
Después de estudiar esta unidad, el alumno debería:
-
Conocer la legislación vigente que regula las actividades de los Bancos
de Tejidos y producción celular.
-
Conocer los distintos modelos de gestion de calidad aplicables en las
actividades de Banco de Tejidos.
-
Conocer las distintas recomendaciones de actuación de sociedades
científicas afines.
3
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
3. Legislación, acreditación y aseguramiento de la calidad
Partiendo de la base del cumplimiento de la legislación vigente y como valor
añadido a sus líneas de actuación, los Bancos de Tejidos están optando por la
implantación de sistemas de calidad y normas de correcta de fabricación (NCF)
o normas GMP (Good Manufacturing Practices). La jerarquia de normas
aplicables en la gestión de los Bancos de Tejidos se distribuye como sigue:
-
Legislación nacional e internacional específica
-
-
Real Decreto 1301/2006
Recomendaciones de asociaciones científicas afines o Estándares de calidad
-
Asociación Española de Bancos de Tejidos (AEBT)
-
Asociación Europea de Bancos de Tejidos (EATB)
-
Asociación Americana de Bancos de Tejidos (AATB)
-
Estándares FAHT/JACIE (Foundation for the Acreditation of Cell
Therapy/ Joint Accreditation Committee ISCT-EBMT)
-
Netcord
-
Sistema de calidad
-
Norma ISO 9001:2000
-
Normas de Correcta fabricación
Estándares de calidad
Los estándares de calidad tienen como objetivo proporcionar unas guías
mínimas para las intituciones y las personas que implicadas en la obtención,
procesamiento, preservación almacenamiento y suministro de células y tejidos
para implante.
Sistema de calidad
Se entiende por sistema de calidad el conjunto de directrices, políticas y
requisitos que se deben satisfacer en una empresa con el fin de dar
cumplimiento a los estándares de calidad definidos o acordados con el cliente
para un producto o proceso. Los sistemas de calidad se diseñan para establecer
y facilitar las tareas productivas de la empresa, mediante métodos relacionados
con la actividad; que permiten controlar, evaluar y resolver de manera
permanente el proceso operativo y los problemas inherentes, tomando en
cuenta los aspectos directos e indirectos respecto de la calidad.
4
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
La norma ISO 9001 elaborada por la Organización Internacional para la
Estandarización especifica los requisitos para un sistema de gestión de la
calidad que pueden utilizarse para su aplicación interna por las organizaciones,
para certificación o con fines contractuales. La actual versión de ISO 9001 data
de diciembre de 2000, por ello se expresa como ISO 9001:2000 y ha sido
reorganizada en 5 secciones de requisitos que reflejan el ciclo de Deming
"Planificar, Hacer, Comprobar, y Actuar", bien conocido en el mundo de la
calidad. Las 5 secciones son:
-
Sección 4: Sistema de Gestión de Calidad
-
Sección 5: Responsabilidades de Dirección
-
Sección 6: Gestión de los Recursos
-
Sección 7: Realización del Producto
-
Sección 8: Mediciones, Análisis y Mejora
Las Normas de Correcta Fabricación (NCF) o normas GMP (Good
Manufacturing Practice) es el conjunto de normas y procedimientos a seguir en
la industria farmacéutica para conseguir que los productos sean fabricados de
manera consistente y acorde a ciertos estándares de calidad. Este sistema se
elaboró para minimizar errores en la manufactura de productos farmacéuticos.
Ya que nunca se puede asegurar al 100% que los errores vayan a detectarse al
someter al producto a las pruebas finales, es decir, antes de ser distribuido. Las
normas GMP abarcan todos los aspectos de la fabricación de productos
farmacéuticos.
Existen varias GMPs: las de la unión europea, las americanas (FDA, las
japonesas, todas tienen contenido similar y un objetivo común. Las GMPs de la
unión europea se dividen en dos partes principales: una dedicada a la
producción de principios activos farmacéuticos (APIs) y otra dedicada a la
fabricación de medicamentos. Estas dos partes son ampliadas mediante anexos,
actualmente 18) que se revisan periódicamente. Se puede encontrar el contenido
en http://ec.europa.eu/enterprise/pharmaceuticals/eudralex/homev4.htm
Es importante destacar que las Normas de Correcta Fabricación tienen tres
objetivos claros: evitar errores, evitar contaminación cruzada del producto
fabricado con otros productos y garantizar la trazabilidad hacia adelante y hacia
atrás en los procesos. Sin embargo, la base de estas normativas de calidad es la
5
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
seguridad del paciente durante el uso de los medicamentos destinados a la
prevención, atenuacion y recuperación de la salud.
La gestión de calidad tiene que ver con la organización interna que ejerce la
determinación de los procesos productivos y de las características y cualidades
de los productos, es decir es la gerencia o el manejo de los proceso productivos
enfocada al mejoramiento continuo.
El Control de Calidad realiza o participa en la caracterización de los nuevos
productos en sus diferentes fases de desarrollo y en el establecimiento de las
especificaciones de calidad de los mismos. Desarrolla, ejecuta o coordina la
ejecución de los métodos de ensayo para determinar las características de
calidad de las materias primas, materiales, productos intermedios y productos
finales. Diseña y realiza los estudios de estabilidad de los productos intermedios.
Participa en el desarrollo, ejecución y perfeccionamiento del Sistema de Calidad.
El aseguramiento de la calidad, se puede definir como el conjunto de
acciones para plantear, organizar, dirigir y controlar la calidad en un sistema de
producción con el objetivo de dar al cliente productos con la calidad adecuada.
Es simplemente asegurar que la calidad sea lo que debe ser. Estas acciones
deben ser demostrables para proporcionar la confianza adecuada (tanto a la
propia empresa como a los clientes) de que se cumplen los requisitos del
Sistema de la Calidad.
La verificación del cumplimiento de las normas mencionadas se realiza de
acuerdo a dos modalidades:
-
Acreditación
-
Certificación
La Acreditación es el procedimiento por el cual un organismo autorizado
reconoce formalmente que una entidad o persona es competente para llevar a
cabo unas funciones específicas.
6
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
http://miro.h3m.com/~s04be433/calidad/aseguramiento/aseguramiento.html
En España ENAC (Entidad Nacional de Acreditación) es el único organismo
para acreditar:
-
Laboratorios de ensayo y calibración
-
Organismos de control (inspectores de instalaciones)
Organismos de certificación (de productos, empresas o personas): de estos solo
ha sido acreditado AENOR y solo para certificar.
La acreditación de un determinado programa de trasplante es documentar que
dicho programa cumple los requisitos definidos en los estándares y se lleva a
cabo tras pasar por una inspección in situ realizada por personas cualificadas y
con experiencia. La acreditación actualmente es voluntaria y debe ser solicitada
por cada institución. Cada una de las partes que intervienen en el trasplante
pueden acreditarse de forma independiente (programa clínico, centros de
obtención y centros de procesamiento), pero últimamente el programa clínico
7
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
requiere que el centro de obtención y el centro de procesamiento asociados
estén acreditados.
La Certificación es el procedimiento mediante el que una tercera parte da
garantía escrita de que un producto, proceso o servicio es conforme a unos
requisitos específicos.
En el ámbito de los Bancos de Tejidos la certificación del sistema de calidad se
refiere al cumplimiento de la norma ISO/GMP correspondiente. La
acreditación se refiere al cumplimiento de los estándares de instituciones y
sociedades científicas afines. Organismos acreditadores son:
-
CAT (Comite de Acreditación Transfusional): acredita la extracción,
procesado, análisis, almacenamiento y suministro para implante de tejidos
-
JACIE (Join Acreditation Commitee of ISCTe-Europe and European Bone Marrow
Transplantation): acredita la extracción, procesado y trasplante de precursores
hematopoyético de sangre periférica y médula ósea
-
NETCORD-FAHCT:
acredita
la
extracción,
procesado,
análisis,
almacenamiento y suministro para implante de la sangre de cordón
umbilical.
4. Estándares de Calidad generales de aplicación en Bancos de
Tejidos y Terapia celular
A modo de resumen, los distintos estándares emanados de las diferentes
asociaciones científicas contienen básicamente cuatro apartados, el primero
(Parte A) dedicado a “terminología, abreviaciones y definiciones”, una parte
(Parte B) que desarrolla los estándares de programa clínico, la Parte C y D,
desarrollan los estándares de la colección y del procesamiento de los productos.
Los puntos desarrollados en los estándares clínicos son:
•
B1 General –tamaño del programa y organización-
•
B2 Instalaciones de la Unidad Clinica
•
B3 Personal
•
B4 Gestión de la calidad
8
Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
•
B5 Politicas y procedimientos
•
B6 Valoración de donante
•
B7 Administración de altas dosis de terapia
•
B8 Investigación clínica
•
B9 Gestión de datos
•
B10 Registros
Los puntos desarrollados en los estándares de la unidad de obtención son:
•
C1 General
•
C2 Instalaciones de la unidad de obtención
•
C3 Personal
•
C4 Gestión de la calidad
•
C5 Politicas y procedimientos
•
C6 Selección del donante, evaluación y gestión
•
C7 Etiquetado
•
C8 Procedimiento para la colección de productos de terapia celular
•
C9 Almacenado de productos de terapia celular
•
C10 Transporte de productos de terapia celular
•
C11 Registros
•
C12 Distribución directa al programa clínico
Los puntos desarrollados en los estándares de la unidad de procesado son:
•
D1 General
•
D2 Instalaciones de la unidad de procesado
•
D3 Personal
•
D4 Gestión de la calidad
•
D5 Politicas y procedimientos
•
D6 Control de proceso
•
D7 Etiquetado
•
D8 Distribución
•
D9 Almacenado
•
D10 Recepción y transporte
•
D11 Eliminación de productos
•
D12 Registros
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Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
Aparte de estos estándares generales, sociedades científicas internacionales han
publicado sus propios estándares de calidad en lo que hace referencia a las
células progenitoras hematopoyéticas. Cada uno de ellos establece sus propios
criterios para que una determinada institución –unidades clínicas, centros de
obtención de CPH o laboratorios de procesamiento- llege a estar acreditáda
para tales estándares. La diversidad de criterios a la hora de acrediatar a un
determinado programa ha conducido a que se forme un grupo común
denominado “Alliance for Harmonisation of Cellular Therapy Accreditation –
AHCTA-“. En dicho grupo se integran las siguientes sociedades científicas
europeas y americanas: EBMT (European Group for Blood & Marrow
Transplantation), JACIE (Joint Accreditation Committee ISCT-EBMT),
WMDA (World Marrow Donor Association), ISCT (International Society for
Cellular Therapy), FACT (Foundation for the Accreditation of Cellular
Therapy) , FACT-Netcord (International NETCORD Foundation), EFI
(European Federation for Immunogenetics), ASBMT (American Society for
Blood & Marrow Transplantation) y la AABB (American Association of Blood
Banks). La misión de dicho grupo es alcanzar la armonización de los diferentes
estándares y últimamente alcanzar unos estándares consistentes en cuanto a la
calidad, seguridad y requerimiento profesional para la terapia celular, incluyendo
el trasplante de progenitores hematopoyéticos.
Actualmente en España se ha constituido un grupo conjunto formado por la
ONT (Organización Nacional de Trasplante), CAT (Comité para la
Acreditación en Transfusión) y JACIE. Dicho grupo co-ordinará la inspección y
últimamente la acreditación de los diferentes programas de trasplante de
progenitores hematopoyéticos.
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Programa de Postgrado en Medicina transfusional y Terapia tisular y celular
Módulo 2
5. Bibliografía
-
Legislación vigente aplicable a la preservación de tejidos. Organización
Nacional de Trasplantes.
http://www.ont.es/Legislacion?id_nodo=35&accion=0&&keyword=
&auditoria=F
-
AEBT. http://www.aebt.org/
-
EATB. http://www.eatb.de/
-
AATB. http://www.aatb.org/
-
International standards for cellular therapy product collection,
processing, and administration. http://www.jacie.org/
-
Norma ISO 9001:200
http://www.homoqualitas.com/castella/infos/iso90002000/portada.ht
m
http://www.buscarportal.com/articulos/iso_9001_2000_gestion_calida
d.html
-
Aseguramiento de la calidad.
http://miro.h3m.com/~s04be433/calidad/aseguramiento/aseguramie
nto.html
http://es.wikipedia.org/wiki/Calidad#Gesti.C3.B3n_Interna_y_Asegur
amiento_de_la_Calidad
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