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Recombinación y
Ligamiento Génico
Recombinación y Ligamiento Génico
•
Teoría cromosómica de la herencia
–
–
–
–
•
Evidencias citológicas de Sutton-Boveri
Evidencias adicionales (Carothers, Blakeslee, etc.)
Caracteres asociados al sexo
Evidencias de Morgan en Drosophila
Ligamiento génico y mapas genómicos
– Mapas de ligamiento
9 Terminología
9 Modelos alternativos
– Recombinación génica
– Entrecruzamiento o crossing over
9 Quiasmas
9 Interferencia
– Análisis y cálculo de distancias genéticas
– Mapas de 2 y 3 puntos
•
Ligamiento génico en humanos
– Lod scores
– Uso de pedigrí
Teoría Cromosómica de
la Herencia
Ligamiento, recombinación y mapeo
•
2da ley de Mendel: Durante la formación de los gametos la
segregación de una pareja génica se produce de manera independiente
de las otras parejas génica.
S/s
SY
25%
Y/y
Sy
sY
sy
25%
25%
25%
Teoria cromosómica de la herencia
• Observación de gametas
• Evidencias citológicas
– Sutton-Boveri
– Carothers y otros
• Correlaciones genotipo-fenotipo
– Blakeslee y otros
• Genes ligados al sexo
– No disyunción de cromosomas sexuales
– Experimentos de Morgan-Bridges en Drosophila
Interfase
Profase
Teoría cromosómica de la herencia
(Sutton-Boveri): el paralelismo entre el
comportamiento de los genes (Mendel) y
los cromosomas llevó a pensar que los
genes están situados en cromosomas.
Metafase I
Anafase I
Explica la distribución
igualitaria y la segregación
independiente
Telofase I
Anafase II
Telofase II
Meiosis de una célula diploide con
genotipo A/a:B/b
Correlación Cromosoma-Fenotipo (Blakeslee)
• Plantas datura stramonium con distintas trisomías
• Objeciones:
Integridad de los cromosomas en interfase?
Solamente se aparean los cromosomas homólogos?
Correlación genotipo-fenotipo
Estricta correlación sexo – cromosoma dimórfico
Determinación sexual
• 2 tipos de determinación
sexual en vertebrados:
– Genética (GSD)
9 SRY (familia SOX), DMRT1 (aves)
9 Gen sin intrones, baja conservac.
9 DNA b protein
– Ambiental (TSD)
9 T° como factor clave
9 Bias poblacional
9 T° altera los niveles de
estrógenos y/o
receptores de
estrógenos
Ambas estrategias son
cuantitativas y no cualitativas
(umbrales)
Determinación sexual
•Genética:
•Cromosomas sexuales (heteromórficos)
Sistemas XY (macho heteromorfo), X0, ZW (hembra
heteromorfa) y cromosomas múltiples
•Ploidía (himenópteros)
•Cromosomas múltiples (nematodos)
•Genes no asociados a cromosomas heteromórficos
(hongos,...)
•Ambiental
•Temperatura (salamandras, reptiles, peces)
•Substrato de fijación (gusanos y gasterópodos marinos)
•Tamaño corporal (anélidos marinos, algunos peces)
Determinación sexual
•
Determinación sexual genética:
– Cromosomas sexuales tienen
origen en autosomas por adquisición
de male-determining role(s).
– Adquisición de male-determining role(s)
conlleva una diversificación de uno de ellos
por falta de recombinación meiótica.
– Acumulación de mutaciones, deleciones y
rearreglos genómicos en el cromosoma
heterogamético
– Dimorfismo cromosómico (excepciones)
– ¿El punto final de este proceso sería la
desaparición de un miembro del par
sexual?
Cromosomas
Cromosomas sexuales
sexuales en
en humanos
humanos
Porción no homóloga, genes ligados al X
X
X
Región
pseudoautosómica
Y
Genes holándricos
Experimentos con cromosomas sexuales
Estricta correlación sexo – cromosoma dimórfico
Experimentos con Drosophila
Experimentos de Morgan-Bridges en Drosophila
Cruzamiento:
Parental XwXw
F1
x X+wY
XwX+w ; XwY
(1:1)
- Se observan proporciones fenotípicas distintas
entre los dos sexos de la progenie.
- Los cruzamientos recíprocos dan proporciones
diferentes.
- Sin embargo 1/2000 de F1 eran hembras de ojos
blancos o machos de ojos rojos!
Experimentos con Drosophila
Morgan sugiere que el “sexo” es un carácter y, como tal, tiene
determinacion genetica (cromosomas heteromorfos).
Propone que gen white está localizado en el cromosoma X y ausente en el
Y.
Morgan sugiere que los resultados observados en gallinas y polillas son
análogos a los suyos, sólo que son las hembras las que tienen
cromosomas sexuales heterogaméticos.
Bridges explica la progenie excepcional postulando que eventos meióticos
anormales originan hembras viables XXY y/o machos viables XO. Para
probar este modelo, examina microscópicamente los cromosomas de esta
progenie y obtiene el patrón genotípico predicho.
Ligamiento Génico
Hongos ascomicetos
gametos
Genotipos F1
A B
-- -a b
AB
Ab
A
A
a
a
A
A
B
A
A
b
B
B
b
aB
a
a
B
50%
recombinanB
tes
b
B
b
ab
a
a
b
b
Proporción 1:1:1:1
Ligamiento: Estudios de Morgan con
Drosophila melanogaster
Mutantes de Drosophila melanogaster
+: salvaje
Cy: Curly sd: scalloped
+: salvaje
w: white
ap: aptera vg: vestigial dp: dumpy
sepia
D: Dichaete
c: curved
Bar
Ligamiento: Uso de cruz. prueba (Morgan)
1:1
1:1
1:1
1:1
El cruz. prueba permite inferir las proporciones de los gametos del heterocigota
Ligamiento: hipótesis de Morgan
Cuando dos genes se encuentran en el
mismo par de cromosomas (ligados) no
segregan en forma independiente.
¿Cómo se explican los recombinantes?
El grado de ligamiento no es completo,
porque durante la meiosis hay
intercambio entre cromosomas
homólogos.
Crossing-overs
• Uso de algas y hongos, que permiten visualizar las 4
tetradas resultantes de 1 meiosis, y múltiples marcadores:
– Los cruzamientos ocurren en el estadio de 4 cromátidas
– Los cruzamientos pueden ser múltiples e involucrar distintas
cromátidas, incluyendo las cromátidas hermanas
quiasmas
Crossing-overs
• Evidencia física del crossing-over
quiasmas
Conclusiones
• Entre genes no ligados, la recombinación se produce por
segregación independiente y es su frecuencia es ~ 50%
(gametas recombinantes/gametas totales: Ab+aB /
AB+ab+Ab+aB)
• Entre genes ligados, la recombinación se produce por
entrecruzamiento y su frecuencia es menor al <50% (o, a lo
sumo, igual).
• Si el ligamiento es total no hay recombinación y todos los
gametos producidos tienen el genotipo parental.
Ligamiento: simbología y terminología
•
Nomenclatura:
pr vg / pr+ vg+ (conformaciones parentales en cis o en acoplamiento): dos alelos
dominantes o tipo salvaje se encuentran en el mismo cromosoma.
pr vg+ / pr+ vg (conformaciones recombinantes en trans o en repulsión): dos alelos
dominantes o tipo salvaje se encuentran en cromosomas homólogos diferentes.
•
Los alelos que se encuentran sobre el mismo cromosoma homólogo no llevan puntuación
entre ellos.
•
Los alelos siempre se escriben en el mismo orden.
•
Genes que se sabe se encuentran en cromosomas diferentes (o genes no-ligados) se
separan con punto y coma. Ej: A/a; C/c
•
Genes que no se sabe si están ligados se representan separados por un punto.
Ej: A/a . D/d
Recombinación
•Recombinación: producción de nuevas combinaciones alélicas.
•Recombinación meiótica: cualquier proceso meiótico que genera un producto
haploide con combinaciones de alelos nuevas, distintas a las presentes en los
genotipos haploides que se unieron para formar el meiocito dihíbrido.
– Los genotipos resultantes (output) son distintos de los originales (input)
– Sólo se puede determinar directamente en organismos haploides
•Se producen recombinantes por dos procesos celulares diferentes:
- segregación independiente
- entrecruzamiento
Ambos procesos rinden frecuencias de recombinación diferentes, indicando si los
genes están ligados o no.
Detección de Recombinación Meiótica
Detección de recombinación en haploides
Detección de recombinación en diploides
Mapas de ligamiento:
Postulado de Sturtevant-Morgan
•
•
•
•
•
•
La frecuencia de entrecruzamientos es
directamente proporcional a la distancia
entre 2 genes ligados.
La frecuencia de recombinantes es
inversamente proporcional a la distancia
entre los genes y sirve para mapearlos entre sí.
Se puede definir 1 unidad de mapa (m.u)
como la distancia entre dos genes para los
que 1/100 de sus gametas es recombinante.
Recombinantes / totales x 100: Unidades de
recombinación o de mapa aprox. igual a un
CentiMorgan (función de mapeo)
1 m.u = 1 cM
frec. de recomb de 0,01 o 1%
Mapas de ligamiento:
Postulado de Sturtevant-Morgan
• Las distancias son aditivas
• Se define el concepto de locus
Prueba de los tres puntos: permite determinar si tres genes están ligados y, si lo están, en qué orden se
ubican y qué distancia guardan entre sí.
Cruzamiento de prueba
18,5%=18,5 m.u
13,2%=13,2 m.u
6,4%=6,4 m.u
Todos los loci están ligados ya que las frecuencias de recombinación son menores al 50% en
todos los casos. Los loci v y cv muestran el mayor valor de FR, lo cual indica que deben estar
más distantes. El mapa podría ser:
El cruzamiento de prueba entonces era:
v+ ct cv/v ct+ cv+ x
v ct cv/v ct cv
18. 5 ó 19.6 m.u?
268 + 3 + 3 + 5 + 5 = 284
19.6%
Recombinantes dobles
Los cruzamientos de prueba de tres puntos permiten evaluar el ligamiento entre 3 (ó más)
genes en un solo cruzamiento.
Interferencia
•
La frecuencia de dobles recombinantes es menor que la de recombinantes simples
porque se necesitan dos eventos para producirlas.
•
Sin embargo, la frecuencia de estos recombinantes dobles es aún menor de lo
esperado…
En nuestro ejemplo:
Frec. Recomb. v-cv (recomb. dobles) = frec. v-ct x frec. ct-cv
Frec.v-cv = 0.132 x 0.064 = 0.0084 (0.84%), o sea 12 recomb. Dobles esperados, sin
embargo se observaron sólo 8.
Los entrecruzamientos adyacentes son eventos independientes?
•
Interferencia (I) = 1 - c.o.c =
I = 1 - 8/12 = 4/12 =
1/3 ó 33%
Por regla general, a medida que disminuye la distancia entre los loci, < c.o.c y > I. Cabe
esperar que tres loci con distancias cortas muestren pocos o ningún entrecruzamiento doble.
c.o.c = coeficiente de coincidencia
Mapas de ligamiento: test de χ2
Si hay un distanciamiento de la segregación independiente hay ligamiento y si la
frecuencia de recombinación es menor al 50 % los genes están ligados.., ¿pero
cuánto menor? Por otro lado, la recombinación no es lo único que afecta las
proporciones de la progenie producida. Algunas clases recombinantes pueden
originarse por azar, por fallas experimentales o no observarse porque son
letales.
Para dar validez estadística se aplica el test de χ2, tomado como hipótesis nula
el no ligamiento de los genes o mejor dicho que estos segregan
independientemente.
El rechazo de esta hipótesis se considera como prueba de
P
que existe ligamiento.
Ejemplo:
Proporciones
gaméticas del
dihíbrido
Se cruzan 2 homocigotas (A/A . B/B) x (a/a . b/b)
La F1 se cruza con un tester homocigota doble recesivo
225/500 = 45 % recombinantes
El porcentaje de recombinantes es <50%, pero… Hay ligamiento?
Prueba de χ2
Proporciones alélicas:
Según la 1era y 2da ley de Mendel, los
valores esperados de gametas serían:
Sin embargo…no todos los genotipos son
igualmente viables, de modo que la
proporción A:a o B:b no siempre es 0.5:0.5
Se calculan las proporciones
alélicas reales en caso de segregación
independiente.
A = 255/500
a = 245/500
B = 254/500
b = 246/500
gl: (nº de filas -1) x (nº de columnas -1)
gl = (2 -1) x (2 - 1) = 1
Ho: los loci (o genes) no están ligados
Para un valor de χ2 de 4.97 con 1 gl, según tablas p < 0.025 (2.5%)
Como esta probabilidad es menor del 5% la hipótesis nula debe ser rechazada y por lo tanto hay
probabilidad de que haya ligamiento.
Estudios de ligamiento en humanos
El mapeo de grupos de ligamiento en humanos es mas difícil de calcular debido a:
1.
2.
3.
No es posible hacer entrecruzamientos controlados en humanos dificultando el calculo de
frecuencias de recombinación a partir de dihibridos producidos por azar.
En general se produce un bajo numero de progenie dificultando la obtención de datos que
puedan ser tratados estadísticamente.
El genoma humano es demasiado grande, lo que significa en que promedio las distancias
entre genes son grandes.
Para obtener valores de frecuencias de recombinación confiables se pueden combinar datos
de muchos cruzamientos idénticos. La forma de hacer esto es calculando los Lod Scores
(Lod= log of odds (logaritmo de la relación) entre la probabilidad de que 2 genes estén
ligados / que segreguen independientemente)
Mapas genéticos vs mapas físicos
Mapeo genético:
• Análisis de cruzamientos planificados, pruebas de progenie y análisis de pedigrí. Es
decir, mediante el análisis comparativo de fenotipos recombinantes.
Mapeo físico:
• Análisis de clones genómicos mediante mapeo de contigs (de los cuales se conocen,
por ejemplo, sus mapas de restricción), combinado con secuenciación nucleotídica, por
hibridación in situ, u otros métodos que NO involucran cruzamientos y análisis de
recombinantes.
• Las distancias se calculan en nucleótidos o mediante medición de cromosomas.
• El orden físico de los genes en el cromosoma coincide con el orden que surge de su
mapeo genético pero no es proporcional para todo el cromosoma (distinto cerca del
centrómero que cerca del telómero) porque las frecuencias de formación de quiasmas
son distintas
¿Para qué se usa el mapeo genético en la era de los genomas completamente
secuenciados?
Organismos no secuenciados
Determinación de función y expresión génica
Asignación de genes a fenotipos (enfermedades)
Estudios evolutivos
Análisis de QTL (quantitative trait loci)
Mapa genético
(fenotípico) en
tomate
Desde el mapa genético al mapa físico