Evaluación de la Diversidad Genética en una Colección de

 EVALUACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA EN UNA COLECCIÓN DE GERMOPLASMA DE FRÍJOL COMÚN (Phaseolus vulgaris L.) DE RUANDA (ÁFRICA) LAURA FERNANDA GONZÁLEZ MARTÍNEZ PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA BIOLOGÍA Bogotá 18 de Febrero de 2008 EVALUACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA EN UNA COLECCIÓN DE GERMOPLASMA DE FRÍJOL COMÚN (Phaseolus vulgaris L.) DE RUANDA (ÁFRICA) LAURA FERNANDA GONZÁLEZ MARTÍNEZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título de: BIÓLOGA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA BIOLOGÍA Bogotá 18 de Febrero de 2008 ii Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
iii EVALUACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA EN UNA COLECCIÓN DE
GERMOPLASMA DE FRÍJOL COMÚN (Phaseolus vulgaris L.)
DE RUANDA (África).
LAURA FERNANDA GONZÁLEZ MARTÍNEZ
APROBADO
_________________________
Matthew W. Blair, Ph.D
Director
___________________________
María del Pilar Márquez, MSc.
Codirectora
_________________________
Manuel Ruíz García, Ph.D
Jurado
________________________
Wilson Terán, Ph.D
Jurado
ii EVALUACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA EN UNA COLECCIÓN DE
GERMOPLASMA DE FRÍJOL COMÚN (Phaseolus vulgaris L.)
DE RUANDA (África).
LAURA FERNANDA GONZÁLEZ MARTÍNEZ
APROBADO
______________________
ANGELA UMAÑA
Decana Académico
_______________________
ANDREA FORERO
Directora de Carrera
iii Bogotá, 6 de Febrero 2008
Señores
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Cuidad
Estimados Señores:
Yo Laura Fernanda González Martínez, identificada con C.C. No. 52966299 de
Bogotá , autora del trabajo de grado titulado “Evaluación de la diversidad genética
en una colección de germoplasma de fríjol común (Phaseolus vulgaris L.) de
Ruanda (África)”, presentado como requisito para optar al título de Bióloga en el
año de 2008; autorizo a la Pontificia Universidad Javeriana a:
a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrónico con el fin de ofrecerlo para la
consulta en la Biblioteca General
SI ..
b) Poner a disposición para la consulta con fines académicos, en la página web de
la Facultad, de la Biblioteca General y en redes de información con las cuales tenga
convenio la Universidad Javeriana No .
c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea seleccionado
para participar en concursos de trabajos de grado
SI .
d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades educativas
con las que la facultad tenga convenio de intercambio de información, para que este
sea consultado en las bibliotecas y centros de documentación de las respectivas
entidades SI EN TEXTO, NO EN DOCUMENTO ELECTRÓNICO ..
e) Todos los usos, que tengan finalidad académica
SI EN TEXTO, NO EN
DOCUMENTO ELECTRÓNICO
Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo
establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión
Andina 351 de 1993, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables
e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que se consulte la obra, mediante
cita bibliográfica se debe dar crédito al trabajo y a su(s) autor(es). Este documento
se firma, sin perjuicio de los acuerdos que el autor(es) pacte con la Unidad
Académica referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad industrial que
puedan surgir de la actividad académica.
__________________________
Laura Fernanda González M
C.C 52.966.299
iv FORMATO DESCRIPCIÓN TRABAJO DE GRADO
AUTOR
Apellidos: González Martínez
Nombres: Laura Fernanda
DIRECTOR
Apellidos: Blair
Nombres: Matthew W.
ASESOR
Apellidos: Márquez
Nombres: María del Pilar
TRABAJO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE: Bióloga
TÍTULO COMPLETO DEL TRABAJO: Evaluación de la diversidad genética en una
colección de germoplasma de fríjol común (Phaseolus vulgaris L.) de Ruanda
(África).
FACULTAD: Ciencias
PROGRAMA: Carrera: Biología
CIUDAD: Bogotá 2008
NÚMERO DE PÁGINAS: 130
TIPO DE ILUSTRACIONES:
- Ilustraciones
- Mapas
- Tablas
- Gráficos y diagramas
DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES: Diversidad genética, Microsatélites,
Fríjol común.
v Dedico este trabajo a Dios, porque fueron sus manos las que lo
elaboraron; por ser mi guía y mi fortaleza, por haber puesto los mejores
regalos en mi camino.
Al regalo mas hermoso que Dios me ha dado, Mi Familia, especialmente a mis
padres, José y Julia y mis abuelitos Belén y Mardoqueo por su infinito anhelo por
verme feliz siempre; por entregarme su sabiduría y sus consejos; y simplemente
porque a ustedes les debo mi vida. Las lágrimas, el sacrificio y las mil risas que lleva
este trabajo son dedicadas a ustedes por ser los artífices de la mujer que ahora soy.
vi AGRADECIMIENTOS
Al doctor Matthew Blair por esta magnífica oportunidad de dejarme hacer parte de su equipo
de trabajo y por haber depositado su confianza en mi.
A Tito Sandoval por su felicidad e inmensa entrega; por darme tanta tranquilidad y hacerme
brotar una sonrisa cada día… por hacer esto parte de su vida. Gracias por ser mi ángel y mi
fuerza durante esta travesía de la tesis.
A Myriam Cristina Duque por su INCONDICIONAL apoyo en el desarrollo de la parte
estadística y en general en la elaboración del documento; por sus consejos llenos de
sabiduría y en especial por su amistad.
A Héctor Fabio Buendía, por sus invaluables consejos y por el inmenso aporte de
conocimientos académicos y de la vida. A Lucy Milena Díaz por su confianza y su esfuerzo
depositados en este trabajo. A Natalia Moreno por la colaboración en todas las etapas de mi
paso por CIAT.
A Louis Butare por el inmenso aporte de conocimientos de Ruanda, por las apreciaciones
hechas y sus buenos consejos; por su alegría y su apoyo.
A los demás compañeros de laboratorio, Marcela, Asrat, Teshale, Juliana, Hernán, Carolina
A, Carlos, Gina, Carolina Ch, Gloria, Alejandra, Aura, y Alejandro, por su compañía, sus risas
y en especial por las oportunidades de crecimiento profesional y personal brindadas en el
ambiente que compartimos.
A los trabajadores del patio de fríjol, Don Luis, Alcides y en especial a Agobargo Hoyos por
su paciencia y su ánimo en los momentos difíciles.
A la doctora Ingrid Schuler y a María del Pilar Márquez por creer siempre en mí y por su
ayuda para mi vinculación en el CIAT.
A Piedad Medina y toda la familia por su inmenso apoyo emocional y porque en realidad me
hicieron sentir parte de su hogar.
A Clara Yalexy Delgado por brindarme su amistad sincera durante tantos años, por ser mi
alegría y calma en los momentos más difíciles.
A mis amigas Natalia Galindo, Andrea Barrera, Ivonne Salamanca, Martica Melo, Xamara
Albarán y Luisa Castellanos, por su paciencia, alegría y compañía durante todos estos años.
vii TABLA DE CONTENIDO
1 INTRODUCCIÓN ________________________________________ 3 2 MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA_____________ 5 2.1 GENERALIDADES DEL FRÍJOL __________________________________________ 5 2.1.1 Características Taxonómicas y Botánicas _____________________________________ 5 2.1.2 Origen, distribución y domesticación ________________________________________ 7 2.1.3 Cultivo, producción y Usos _______________________________________________ 10 2.1.4 Composición Química y Calidad nutricional __________________________________ 11 2.1.4.1 Composición Química _______________________________________________ 11 2.1.4.2 Calidad Nutricional _________________________________________________ 11 2.2 SITUACIÓN DEL FRÍJOL EN ÁFRICA _____________________________________ 13 2.2.1 Generalidades Ruanda __________________________________________________ 15 2.2.2 Fríjol en Ruanda _______________________________________________________ 17 2.2.2.1 Producción y consumo ______________________________________________ 18 2.2.2.2 Problemática Nutricional ____________________________________________ 19 2.2.2.3 Estrategias para combatir la problemática nutricional _____________________ 21 2.2.3 Perspectivas del cultivo de Fríjol ___________________________________________ 23 2.3 DIVERSIDAD GENÉTICA Y ANALISIS MOLECULAR MEDIANTE MICROSATLITES __ 23 2.3.1 Marcadores Moleculares ________________________________________________ 23 2.3.2 Microsatélites analizados mediante fluorescencia y Análisis secuenciador automático 26 2.3.3 Estudios de diversidad genética en Fríjol común ______________________________ 27 2.3.4 Estudios de diversidad en fríjol Africano ____________________________________ 30 2.4 CUANTIFICACION DEL CONTENIDO DE MINERALES EN FRÍJOL ______________ 31 Cuantificación por Absorción Atómica (AA) __________________________________ 31 Estudios de cuantificación de minerales en Fríjol Común _______________________ 32 2.4.1 2.4.2 3 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ________________________ 34 3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ______________________________________ 34 3.2 JUSTIFICACIÓN ____________________________________________________ 35 4 OBJETIVOS ___________________________________________ 37 4.1 Objetivo General __________________________________________________ 37 4.2 Objetivos Específicos _______________________________________________ 37 5 MATERIALES Y MÉTODOS ______________________________ 38 5.1 Población de Estudio _______________________________________________ 38 5.2 MÉTODOS ________________________________________________________ 40 viii 5.2.1 Procesamiento del material vegetal: _______________________________________ 40 5.2.1.1 Germinación de la semilla: ___________________________________________ 40 5.2.1.2 Procesamiento Post‐germinación _____________________________________ 40 5.2.2 Extracción y cuantificación de ADN ________________________________________ 41 5.2.3 Amplificación mediante PCR de microsatélites analizados con fluorescencia ________ 42 5.2.4 Análisis en secuenciador Analítico ABI 3730xl ________________________________ 44 5.2.5 Cuantificación de hierro y zinc ____________________________________________ 46 5.2.6 Identificación de características de grano ___________________________________ 46 5.3 ANÁLISIS DE DATOS ________________________________________________ 47 5.3.1 Análisis de Diversidad Genética ___________________________________________ 47 5.3.1.1 Parámetros de uso común de diversidad para población total _______________ 48 5.3.1.2 Parámetros de uso común de diversidad para grupos formados a partir de PCoA 49 5.3.1.3 Coeficiente de similaridad ___________________________________________ 49 5.3.2 Análisis de cuantificación de minerales _____________________________________ 50 5.3.3 Características morfológicas ______________________________________________ 51 6 RESULTADOS ________________________________________ 52 6.1 ANÁLISIS DE DIVERSIDAD GENÉTICA ___________________________________ 52 6.1.1 Diversidad Genética y estructura Poblacional ________________________________ 52 6.1.1.1 Determinación de alelos ____________________________________________ 52 6.1.1.2 Población Total ____________________________________________________ 53 6.1.1.3 Análisis de Ordenación ______________________________________________ 56 6.1.1.4 Grupos definidos mediante PCoA _____________________________________ 64 6.1.2 Posibles eventos de introgresión entre acervos _______________________________ 65 6.1.3 Agrupación mediante índice de disimilaridad ________________________________ 69 6.2 ANÁLISIS DE MINERALES ____________________________________________ 71 Contenido de minerales en semilla de fríjol __________________________________ 71 Asociación contenido de minerales y estructura genética _______________________ 74 6.2.1 6.2.2 6.3 7 CARACTERISTICAS DEL GRANO DE FRÍJOL ______________________________ 76 DISCUSIÓN DE RESULTADOS ___________________________ 79 7.1 ANÁLISIS DE DIVERSIDAD GENÉTICA ___________________________________ 79 7.1.1 Población Total ________________________________________________________ 79 7.1.2 Grupos definidos mediante PCoA __________________________________________ 83 7.1.3 Agrupación mediante índice de disimilaridad ________________________________ 85 7.1.4 Posibles eventos de introgresión en la población estudiada _____________________ 86 7.2 ANÁLISIS DE MINERALES ____________________________________________ 87 8 CONCLUSIONES ______________________________________ 90 9 RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS __________________ 92 10 ANEXOS ____________________________________________ 100 ix INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Contenido nutricional de semilla de fríjol. Contenido total en semilla y por
100g de semilla (Geil y Anderson, 1994 En: (Sandoval, 2006)..........................12 Tabla 2. Áreas de producción de Fríjol en 20 países de África, modificado de “Atlas
of common bean production in Africa” (Wortmann et al, 1998). .........................15 Tabla 3. Comparación de los indicadores poblacionales y económicos de Ruanda y
África Sub-Sahariana (ISAR, 2000). ..................................................................17 Tabla 4. Concentraciones de Hierro, Zinc y proteína en cultivares producidos en
África Oriental, Central y del sur (CIAT, 2005a) .................................................22 Tabla 5. Controles Diversidad utilizados en este estudio con su respectivo origen
(acervo al que pertenecen) ................................................................................39 Tabla 6. Marcadores microsatélite fluorescentes utilizados en la caracterización de
la diversidad genética de 355 genotipos de una colección de germoplasma de
Ruanda. ..............................................................................................................42 Tabla 7. Reactivos necesarios para coctel PCR, condiciones necesarias y
concentraciones originales (stock). ....................................................................43 Tabla 8. Parámetros de descripción para características de la semilla de fríjol;
basado en el catalogo de líneas avanzadas. .....................................................47 Tabla 9. Rango de valores medidos en ppm para interpretación de resultados de
cuantificación de minerales (hierro y zinc). ........................................................50 Tabla 10. No de Alelos, Diversidad Genética y Heterocigocidad observada de los 30
microsatélites (16 Genómicos y 14 Génicos) utilizados en este estudio. ..........54 Tabla 11. Prueba t para comparar parámetros de diversidad (Heterocigocidad
Observada y Diversidad Genética) entre marcadores genómicos y génicos.....56 Tabla 12. Descriptores de diversidad para 6 grupos definidos por PCoA. ................64 x Tabla 13. Descriptores de diversidad (Número de alelos y Diversidad genética de
Nei) para 30 loci SSR en población definida a partir de PCoA. .........................65 Tabla 14. Análisis de los parámetros de diversidad (Número de alelos y Diversidad
genética de Nei) para 7 grupos formados incluyendo el nuevo grupo
considerado como introgresado (Mesi-Intro)......................................................68 Tabla 15. Estadística descriptiva para contenido de (ppm) de hierro y zinc en 355
accesiones de frijol provenientes de Ruanda.....................................................71 Tabla 16. Estadística descriptiva para contenido en ppm de hierro y zinc en las
poblaciones generadas mediante PCoA. ...........................................................75 xi INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Mapa de Ruanda, organización política (UnitedNations, 2007) .................16 Figura 2. Producción anual, en Toneladas, de Fríjol en Ruanda (Musoni, 2006) .....19 Figura 3. Sistema de flujo de la información obtenida a partir del archivo de la
muestra dentro del software de auto-análisis. Modificado de (Joe et al., 2004).
...........................................................................................................................27 Figura 4. Localización geográfica de Ruanda en el continente Africano...................38 Figura 5. Diagrama del procedimiento que sigue la muestra a analizar (líneas azules
gruesas señalan cada paso). Modificado de (Joe et al., 2004). .........................45 Figura 6. Electroferograma obtenido a partir del análisis por ABI 3730xl y generado
por el software GeneMapper v.3.7. ....................................................................52 Figura 7. Electroferograma obtenido a partir del análisis por secuenciador ABI
3730xl y generado por software GeneMapper v.3.7. .........................................53 Figura 8. Representación gráfica en tres dimensiones de la distribución y ubicación
espacial de los genotipos de Ruanda a partir del Análisis de Coordenadas
Principales (PCoA), teniendo en primer plano horizontal la dimensión 2. .........57 Figura 9. Representación gráfica en tres dimensiones de la distribución y ubicación
espacial de los genotipos de Ruanda a partir del Análisis de Coordenadas
Principales (PCoA), teniendo en primer plano horizontal las dimensiones 1 y 2
...........................................................................................................................58 Figura 10. Individuos considerados como raros a partir del análisis de coordenadas
principales. .........................................................................................................59 Figura 11. Dendrograma de acervos genéticos obtenido por distancia euclidiana
aplicada a coordenadas obtenidas por PCoA. ...................................................60 Figura 12A. Dendrograma de acervos genéticos obtenido por distancia euclidiana
aplicada a coordenadas obtenidas por PCoA. Muestra dos grupos formados en
el acervo Mesoamericano (MI y MIII). ................................................................61 xii Figura 13. Individuos que se presentan como posibles eventos de introgresión
dentro del estudio ...............................................................................................66 Figura 14. Individuos pertenecientes a Meso-Intro (agrupados por PCoA como Meso
II pero que posiblemente presenten eventos de introgresión) ...........................69 Figura 15. Dendrograma basado en el índice de disimilaridad de DICE para la
colección de germoplasma de Ruanda.. ............................................................70 Figura 16. Histogramas de cuantificación de minerales mediante la metodología de
AA. .....................................................................................................................72 Figura 17. Genotipos con mayor y menor contenido de hierro y zinc .......................73 Figura 18. Gradiente de concentración de zinc encontrado en grupos
mesoamericanos indicado por las flechas azules. .............................................75 Figura 19. Distribución porcentual de color, tamaño y patrón de coloración de semilla
en la población de estudio. ................................................................................76 Figura 20. Distribución del color de la semilla dentro de cada grupo poblacional
formado a partir de PCoA...................................................................................77 xiii RESUMEN
La presente investigación, adelantada mediante la realización de un trabajo
interinstitucional entre la Pontificia Universidad Javeriana y el Centro Internacional
de Agricultura Tropical (CIAT) ubicados en Colombia, es una contribución de la
ciencia para enfrentar uno de los más importantes problemas mundiales
relacionados con el hambre en países en desarrollo. El fríjol común Phaseolus
vulgaris L. es una de las leguminosas más comunes a nivel mundial, siendo uno de
los alimentos más consumidos en los países en vías de desarrollo; en Ruanda
(África) éste es el principal alimento en la dieta diaria. Debido a estos hechos
trascendentales esta planta es el foco de muchos estudios de diversidad genética
alrededor del mundo. El objetivo de este estudio fue caracterizar la diversidad
genética de una colección de fríjol común proveniente de Ruanda. Un total 355
genotipos y 4 individuos (pertenecientes a los dos acervos principales del fríjol)
usados como controles, fueron analizados mediante el uso de 30 marcadores
moleculares tipo microsatélites fluorescentes. Se utilizaron dos tipos de marcadores
genómicos (16) y génicos (14). Un total de 301 bandas fueron generadas con un
promedio de 10.16 alelos por marcador y una diversidad total de 0.62. El análisis de
coordenadas principales identificó la presencia de los dos acervos principales del
fríjol (Andino y mesoamericano) y un posible grupo de genotipos introgresados. Se
presentó mayor diversidad dentro del grupo de los mesoamericanos. Adicional a
esto se realizó un análisis de datos minerales (hierro y zinc), mediante la técnica de
absorción atómica (AA), encontrando valores altos para estos dos minerales. La
caracterización de la diversidad genética de este grupo de genotipos de Ruanda
permitió observar altos niveles de variabilidad genética y un importante contenido de
minerales lo cual puede ser muy útil en futuros planes de mejoramiento.
1 ABSTARCT
This research work, carried out through an interinstitutional work between Pontificia
Javeriana University and The International Center of Tropical Agriculture –CIATlocated in Colombia, is a contribution of science to face one of the most important
global issues dealing with hunger in developing countries. Common bean Phaseolus
vulgaris L. is one of the most important legumes worldwide, belonging to the most
consumed food in developing countries. In Rwanda (Africa), beans provide the
centre-piece of the daily diet. Due to its great significance, common bean forms a
focal point in many studies of genetic diversity throughout the world. The objective of
this thesis is the genetic diversity characterization of a common bean collection
originating from Rwanda. A total of 355 genotypes and 4 individuals used as controls
(belonging to the two major gene pools of common bean) were analyzed through the
use of 30 molecular markers which were fluorescent microsatellites. Two types of
markers were used: genomic (16) and cDNA markers (14). A total of 301 bands were
generated with an average of 10.16 alleles per marker and a total diversity of 0.62.
Principal component analysis identified the presence of two major gene pools of
common bean (Andean and Meso-American) and a possible group of introgressed
genotypes. Most diversity was found in the group of the Meso-American genotypes.
Additionally, an analysis of mineral content (iron and zinc) was realized using the
method of atomic absorption (AA). High amounts were found for both minerals. The
characterization of genetic diversity of this genotype collection of Rwanda allowed to
observe high levels of genetic variability and high contents of minerals. This
information may be very useful in future breeding projects.
2 1
INTRODUCCIÓN
La desnutrición es uno de los grandes problemas que actualmente aqueja a la
humanidad. Alrededor de 800 millones de personas en todo el mundo la padecen,
esto ha llevado a buscar soluciones encaminadas al mejoramiento y conservación
de las especies y hacía una mayor producción de las mismas, especialmente, en
países en vía de desarrollo.
Una consideración importante para iniciar esta investigación, radica en el hecho de
que tres de los principales centros de estudio en el mundo son África, el
subcontinente Asiático y América Latina; estos con frecuencia basan su dieta en
alimentos como yuca, maíz, arroz, trigo, entre otros, que son ricos en carbohidratos,
pero pobres en proteínas y minerales. Por tanto, especies vegetales como las
leguminosas, que son el grupo de plantas que produce grano más rico en proteínas
y minerales, juegan un papel crucial en la dieta de sus habitantes.
Dentro de este grupo de plantas se encuentra una de las especies mas importantes
en la que la humanidad fundamenta su alimentación, el fríjol común Phaseolus
vulgaris L. América y África son los principales productores y consumidores de esta
leguminosa. Más de 100 millones de personas en África, la mayoría de bajos
recursos pertenecientes tanto a áreas rurales como urbanas, consumen fríjoles
dentro de su dieta diaria, por ser estos una fuente importante y económica de
proteínas, energía y micronutrientes. Específicamente en Ruanda el fríjol es un
cultivo de gran relevancia, alrededor de 8 millones de Ruandeses consumen fríjol y
se estima un consumo anual de 60 Kilogramos per capita. Este alimento provee el
84% de proteínas de leguminosas o 65% de todas las proteínas vegetales y
animales (y 32% de energía) consumidas. Adicional a esto, el fríjol es un cultivo
tradicional y de importancia cultural ya que se usa como ofrenda o regalo.
Sólo en África, cerca de 4 millones de hectáreas son cultivadas anualmente con una
producción de 2 millones de toneladas. A pesar de que en sus países la producción
es alta, debido a la gran demanda que existe de este alimento, se presentan
problemas fitosanitarios o ambientales que afectan el rendimiento de los cultivos.
3 Por todo lo anteriormente expuesto, y por su alta variabilidad genética, el fríjol
común P. vulgaris L se constituye en una especie de gran importancia dentro de
estudios de mejoramiento, lo que generó el interés por adelantar esta investigación
realizada en el Laboratorio de Caracterización de Germoplasma de Fríjol (LCGF),
ubicado en el CIAT, en torno al siguiente problema: El fríjol común (P. vulgaris L.),
como renglón importante de la economía y alimentación de la mayoría de países en
vía de desarrollo de África específicamente Ruanda, requiere la profundización en
estudios a nivel molecular que permitan caracterizar su diversidad genética con
miras a apoyar su mejoramiento nutricional.
El presente estudio tiene como objetivo: Caracterizar la diversidad genética de 355
genotipos de fríjol común provenientes de diferentes regiones de Ruanda (África)
mediante el uso de marcadores moleculares tipo microsatélites fluorescentes. El uso
de los microsatélites en estudios de diversidad es muy importante debido a que
ofrecen gran cantidad de información por su naturaleza multialélica, son
codominantes, tienen alto poder discriminatorio, son reproducibles, tienen herencia
mendeliana y presentan fácil detección dentro de sistemas automatizados. Adicional
a la caracterización de la diversidad se realizó un análisis del contenido de hierro y
zinc a partir de la técnica de Absorción Atómica.
En este trabajo se logró encontrar altos niveles de diversidad genética y de
contenidos de minerales para los genotipos en estudio, lo cual despierta la atención
debido a las necesidades alimentarias por las que atraviesa Ruanda, siendo esto un
paso importante para el inicio de programas que favorezcan la producción de la
especie en este país.
4 2
MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
El sustento teórico para la realización de esta investigación se basa en aportes de
autores reconocidos e investigaciones acerca de las generalidades de fríjol,
características de Ruanda, los cuales se contemplan a continuación:
2.1
GENERALIDADES DEL FRÍJOL
El fríjol común (Phaseolus vulgaris L.) es una de las especies más importantes en el
mundo pues hace parte del grupo de plantas en las cuales la humanidad encuentra
la principal fuente de proteína para su alimentación. La mayor parte de su
producción se presenta en los países de bajos recursos, como los pertenecientes a
los continentes Africano y Americano (Broughton et al., 2003). Sin embargo, esta
fuente alimenticia se ve amenazada por problemas que afectan la producción,
debido a proliferación de plagas y enfermedades que generan pérdidas del 10 y
100%
(Beebe et al., 2000b).Esto hace del fríjol, una especie interesante para
estudios de diversidad enfocados hacia mejoramiento.
2.1.1
Características Taxonómicas y Botánicas
El fríjol común Phaseolus vulgaris L. es una planta leguminosa dicotiledónea. La
superfamilia Leguminosae, familia Fabaceae que comprende casi 10.000 especies
agrupadas en 643 géneros encontrados en diferentes ambientes y temperaturas. El
género Phaseolus comprende aproximadamente 35 especies, entre las que se
encuentran Phaseolus vulgaris, Phaseolus lunatus, Phaseolus coccineus, Phaseolus
polyanthus y Phaseolus acutifolius, las cuales corresponden a las cinco cultivadas
comercialmente (Betancour & Dávila, 2002; Fonnegra, 1996). El genero Phaseolus
se caracteriza por la presencia de la Faseolina, una proteína de almacenamiento en
el tejido cotiledonal de la semilla; determina la cantidad y calidad nutricional de las
proteínas en las semillas de frijol (Gepts et al., 1986); existen diferentes tipos de
faseolinas asociados con el tamaño de la semilla, por ejemplo la de tipo ‘S’ (Sanilac)
se relaciona con semilla pequeña, mientras que la ‘T’ (Tendergreen) y ‘C’ (Chile) con
mediana y grande (Islam et al., 2002b; Singh et al., 1988).
5 Como planta anual y herbácea se cultiva esencialmente para obtener y consumir las
semillas, que son las que más aporte nutricional hacen, al presentar alto contenido
de proteínas (22% en materia seca). En cuanto a la morfología, presenta un sistema
radicular que desarrolla raíces secundarias y terciarias, es superficial ya que el
mayor volumen de la raíz se encuentra en los primeros 20 cm de profundidad del
suelo; presenta nódulos distribuidos en las raíces laterales de la parte superior
radical, estos nódulos son colonizados por bacterias del género Rhizobium las
cuales fijan nitrógeno atmosférico (Debouck & Hidalgo, 1989).
El tallo es cilíndrico y sub-glabro o pubescente, puede ser verde, morado o rosado.
Tiene un incremento progresivo en la longitud de internodos y se pueden identificar
4 tipos de hábitos de crecimiento según la terminación apical del tallo y de las
ramas, dependiendo de si se forma un racimo o un meristema apical,
respectivamente (Betancour & Dávila, 2002):
Los dos primeros tipos corresponden a los arbustivos, TIPO I: determinado
arbustivo, sus ramas terminan en racimos; la inflorescencia desarrollada es terminal,
es decir detiene el crecimiento de la rama; carecen de la habilidad de trepar. TIPO
II: indeterminado arbustivo, tienen tallos cortos erectos de 30 a 50 internodos y
ramas; las plantas terminan en guías cortas y son semi-trepadoras (Beebe et al.,
2000b; Debouck & Hidalgo, 1989; Schoonhoven & Oswaldo, 1994). Los otros dos
son: TIPO III indeterminado postrado, con ramificación bien desarrollada y altura
superior a los 80cm; el hábito TIPO IV, se le conoce como indeterminado trepador,
el cual desarrolla la capacidad de torsión, sus ramas son poco desarrolladas,
pueden alcanzar alturas de más de dos metros (Schoonhoven & Oswaldo, 1994).
Las hojas son trifoliadas con pecíolo y raquis acanalado; la inflorescencia es
racimosa, en el caso del tipo determinado es terminal y para los indeterminados es
axilar; la flor es la típica de la familia Fabaceae es decir, con forma de mariposa,
bilateralmente simétrica, encerrada por bractéolas verdes, la corola es estándar, dos
alas y una quilla asimétrica, los colores de la colora son usualmente verde, blanco,
rosado o morado; el fruto es una vaina con dos valvas, las cuales provienen del
ovario comprimido; presenta placentación marginal (Beebe et al., 2000b; Debouck &
Hidalgo, 1989; Schoonhoven & Oswaldo, 1994).
6 La semilla puede ser redonda, esférica o arriñonada, de acuerdo con la variedad de
fríjol, al igual que el hilum y el micrópilo. La semilla no es endospermica sino
consiste en embrión con dos cotiledones simétricos, su germinación es epigea y
consume estos cotiledones que sirven de almacenamiento para el crecimiento. Las
hojas primarias son simples, opuestas, cordiformes y acuminadas y caen antes de
que la planta esté completamente desarrollada; mientras que las hojas secundarias
son compuestas, trifoliadas con venación reticular, pueden ser de forma ovalada a
triangular (Debouck & Hidalgo, 1989; Debouck & Tohme, 1988).
2.1.2
Origen, distribución y domesticación
El fríjol común Phaseolus vulgaris L. (2n=2x=22) fue domesticado en el Nuevo
mundo aproximadamente hace 7000 a 10000 años atrás El fríjol ha evolucionado a
través de su domesticación, desde las formas silvestres ancestrales como
Phaseolus vulgaris var. aborigineus [Burk] Baudet, una enredadera anual que se
distribuía en altitudes medias 1500-2000 msnm, en bosques claros o en las regiones
del neotrópico en un rango superior a 8000km, desde el norte de México hasta el
norte de Argentina (Beebe et al., 1997; Chrispeels & Savada, 2003; Koenig & Gepts,
1989).
Estudios bioquímicos asociados con los patrones geográficos (Koenig & Gepts,
1989), evidencias de proteínas de la semilla (Gepts & Bliss, 1986), rasgos
morfológicos (Singh et al., 1991b) y marcadores moleculares (Beebe et al., 2001;
Beebe et al., 2000b), incluyendo los microsatélites (Blair et al., 2007; Blair et al.,
2006; Díaz & Blair, 2006), han revelado que existen dos centros de diversidad
primarios, un origen Mesoamericano y un origen Andino. En fríjol silvestre, según
Koenig y Gepts (1989), Gepts y Bliss (1986), Beebe et al (1997), se ha hecho
referencia a un tercer acervo en el norte de los Andes. Un estudio de la colección
núcleo de CIAT por Islam (2002) quien evaluó 1072 accesiones, dio soporte a la
evidencia de la existencia de este otro acervo. Hasta ahora éste no ha sido
caracterizado como recurso potencial para el mejoramiento del fríjol y tampoco se
ha realizado una evaluación nutricional de concentraciones de sus elementos (Islam
et al., 2002b).
7 Estos centros de diversidad, actualmente llamados acervos, reflejan múltiples
eventos de domesticación dentro de las distintas poblaciones silvestres (Gepts &
Bliss, 1986). El acervo Mesoamericano se caracteriza por presentar genotipos con
semillas pequeñas a medianas, con faseolinas tipo ‘S’, ‘CH’, ‘Sb’, ‘Sd’ y ‘M’, mientras
que en el acervo Andino se encuentran semillas medianas a grandes con tipo de
faseolina ‘T’, ‘H’ y ‘C’ (Islam et al., 2004; Kami et al., 1995; Singh et al., 1991a).
Dentro de cada acervo se pueden distinguir razas, cuatro para Mesoamericano y
tres para Andino, las cuales han surgido debido a procesos de domesticación (Singh
et al., 1991a); para su clasificación y caracterización se han basado en las
diferencias morfológicas de la planta (Hábito de crecimiento), de la semilla (Tamaño,
forma, color) y a partir de estudios moleculares como Beebe et al 2000 quienes
utilizaron RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) y posteriormente Beebe et al
2001 con la técnica de AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) o por
medio de microsatélites (Blair et al., 2007; Blair et al., 2006; Díaz & Blair, 2006;
Gomez et al., 2004).
Los genotipos del acervo Mesoamericano predominan en México, América central
(Guatemala, El Salvador, Honduras, Nicaragua y Costa Rica) y Brasil; se pueden
distinguir las razas Mesoamérica (M), Durango (D), Jalisco (J) y Guatemala (G).
(Beebe et al., 2000b; Broughton et al., 2003; Islam et al., 2004).
La raza Mesoamérica es común en México y América Central, se caracteriza por
tener un tamaño de semilla relativamente pequeño, por su adaptación a tierras bajas
y por presentar principalmente los hábitos de crecimiento Tipo II o III, y en algunos
casos Tipo IV. Las clases comerciales de esta raza incluyen semilla pequeña negra,
semilla roja pequeña y semilla blanca. La raza Durango está compuesta
principalmente por plantas con tipo de crecimiento III con hojas pequeñas, semillas
de tamaño medio y con adaptación a ambientes secos de tierras altas en México;
las clases comerciales incluyen pinto, grande del norte y rojo mexicano. La Raza
Jalisco, se encuentra en ambientes más húmedos de las tierras altas de México y
está compuesta principalmente por plantas trepadoras (Tipo IV), los genotipos
presentan tamaño medio de semilla (Beebe et al., 2000b). Y por último la Guatemala
8 formada por especies trepadoras en regiones húmedas montañosas (Islam et al.,
2004).
Análisis mediante AFLP (de las siglas en Inglés Amplified Fragment Length
Polymorphism) revelan que las poblaciones de fríjol silvestre en la zona Andina han
sido aisladas la una de la otra, resultando poblaciones discretas en Ecuador y el
norte de Perú; en el sur de Perú, Bolivia y el norte de Argentina (Tohme et al.,
1996). Con base en estudios morfológicos y criterios ecológicos, el acervo Andino
puede ser subdividido en tres razas; Raza Nueva Granada (NG), Perú (P) y Chile
(C). La primera representa a los genotipos con tamaño de semilla medio a grande y
con hábito de crecimiento arbustivo, e incluye la mayoría de cultivares comerciales
de semilla grande. La raza NG es la más cultivada dentro del acervo Andino,
prosperando principalmente en alturas medias de África y América; en ambientes de
tierras bajas de Brasil, México y el Caribe y en climas templados de Norte América y
Europa. A la raza Perú pertenecen las plantas trepadoras, la mayoría de las cuales
están adaptadas a tierras altas por encima de los 2000 msnm, mientras que la raza
Chile se característica por presentar habito de crecimiento tipo III, semilla de tamaño
medio, de forma redonda u ovalada, y usualmente colores pálidos que se
encuentran en latitudes altas en Turquía, Irán y China (Beebe et al., 2001).
Hallazgos arqueológicos en Perú y en el sur occidente de los Estados Unidos,
determinaron que el Nuevo mundo es el centro de origen del fríjol; sin embargo en la
actualidad este se encuentra distribuido mundialmente (Diaz, 2005a; Singh, 2001).
Los centros secundarios de diversidad están en África, Brasil, Europa, Medio
Oriente, así como América del Norte (Broughton et al., 2003). Es posible que el fríjol
halla sido introducido a África por los exploradores Árabes y Europeos y por los
comerciantes de Brasil y el sur de los Andes en los siglos XVI y XVII (Debouck &
Hidalgo, 1989; Musoni, 2006).
Ruanda es considerado como un centro secundario de diversidad de fríjol. Existe
gran diversidad de genotipos pertenecientes a los dos acervos; mezclas de plantas
de diferentes granos crecen normalmente en las fincas de este país. Algunos
materiales considerados como extintos en los centros de origen de América Latina
existen en Ruanda (Musoni, 2006).
9 La alta variedad de ambientes en los cuales se cultiva el fríjol ha llevado a
incrementar la variabilidad fenotípica, especialmente de caracteres como el hábito
de crecimiento, el tipo de grano, la fenología y la sensibilidad al fotoperiodo. Los
altos niveles de polimorfismo, la diversidad fisiológica y amplia distribución
geográfica hacen difícil el establecimiento de patrones de domesticación y relación
entre genotipos (Becerra & Gepts, 1994).
El fríjol común tiene varios centros posibles de domesticación en América latina. De
las especies conocidas del género Phaseolus, 5 de ellas se domesticaron durante la
época precolombina; el fríjol común fue de gran importancia en los imperios azteca
e inca siendo utilizado como elemento para el pago de tributos (Diaz, 2005a)
El progenitor del fríjol y los descendientes cultivados generalmente dan una
progenie fértil y viable, muestran diferencias contrastantes constituyendo así el
síndrome de la domesticación; los genotipos cultivados, muestran un hábito de
crecimiento más compacto comparado con los parentales silvestres, menos nodos
vegetativos, hojas de mayor tamaño e internodos más largos. En cuanto a las
semillas, éstas son más grandes y tienen menor pigmentación por antocianina.
Algunos genotipos cultivados no poseen sensibilidad a la longitud del día (su
progenitor solo florecía en días cortos), estos florecen más temprano (Koinange et
al., 1996). Dos de los atributos más importantes en el proceso de domesticación
son: pérdida de la habilidad de dispersión de semilla y la dormancia de la semilla
(fundamentales para la adaptación a cultivo) (Broughton et al., 2003). La
domesticación, fue un proceso rápido lo que puede indicar que la adaptación a las
condiciones ambientales cambiantes involucró genes con mayores efectos
genotípicos (Koinange & Gepts, 1992).
2.1.3
Cultivo, producción y Usos
El fríjol es extremadamente diverso en términos de métodos de cultivo, usos, rangos
de ambientes a los cuales ha sido adaptado y variabilidad morfológica. Puede
cultivarse en terrenos ubicados
desde la altura del nivel de mar hasta 3000
m.s.n.m, es cultivado en monocultivos, en asociaciones o en rotaciones. Los frijoles
son consumidos como granos maduros, también como semilla inmadura, tanto
como vegetales, hojas y vainas (Broughton et al., 2003).
10 Su recurso genético existe como un arreglo complejo de acervos genéticos mayores
y menores, razas y tipos intermedios con introgresión ocasional entre tipos salvajes
y domésticos. El cultivo de fríjol es entonces uno de los que mejor se adapta a
diferentes ambientes; la producción mundial de fríjol alcanza los 23 millones de
toneladas, de los cuales 7 millones se producen en países tropicales de
Latinoamérica y África (Pastor-Corrales & Schwartz, 1994).
Las condiciones donde se produce el fríjol son muy variables, van desde zonas muy
húmedas a zonas semi-desérticas como el noreste de Brasil, el centro y el altiplano
nororiental de México, el valle de Rift del oriente de África y entre las zonas
montañosas de Estados Unidos (Singh, 2001). Sin embargo, la producción de fríjol
está reducida a pequeños terrenos con agricultores de bajos recursos y en
ambientes no óptimos para la especie con sequías estacionales (Broughton et al.,
2003; López et al., 1985). El fríjol es uno de los principales cultivos, después del
maíz, en el centro y este de África. Cerca de 4 millones de hectáreas de fríjol son
cultivadas anualmente en éste continente, con una producción de dos millones de
toneladas (Chrispeels & Savada, 2003).
2.1.4
Composición Química y Calidad nutricional
2.1.4.1 Composición Química
Al 11 % del contenido de humedad, la semilla tiene 17-30% de proteína,
generalmente bajos en amino ácidos azufrados (metionina y cisteína) pero alto en
lisina. También tiene 57.8% del complejo de azucares, 1.6% de grasa, 4% de fibra y
grandes cantidades de ácido fólico; en cuanto a los micronutrientes esenciales,
presenta cerca de 34-89 ppm de hierro y 21-54 ppm de zinc(Beebe et al., 2000a;
Musoni, 2006). Las hojas frescas son ricas en hierro y vitamina A. En África del este
ESCABREN identificó ciertas variedades como ‘Ngwinurare’, ‘Gofta’, ‘Maharagi
Soya’, con altos contenidos de minerales en hojas y semillas (Kimani et al., 2000)
2.1.4.2 Calidad Nutricional
Más de 300 millones de personas basan su dieta diaria en la leguminosa comestible
más importante del mundo, el Fríjol común, por ende hace una contribución
11 importante a la nutrición (Beebe et al., 2000a). Los fríjoles proveen proteína a la
dieta y son alimento de gran importancia por complementar cereales que son fuente
primaria de carbohidratos; como en otras leguminosas, los fríjoles contienen
grandes cantidades de hierro y otros minerales (Beebe et al., 2000b; Broughton et
al., 2003). El valor nutricional del fríjol radica en que su semilla es una fuente importante de
calorías, vitaminas, proteínas, carbohidratos y grandes concentraciones de
minerales esenciales, el contenido nutricional de la semilla se puede detallar en la
tabla 1.
En América Latina y en el continente Africano, el fríjol es utilizado
totalmente para consumo humano y mundialmente el fríjol es conocido como la
“carne de los pobres”, por ser fuente muy importante de proteína y de bajo costo
(MINAGRI/MINEDUC, 1993). El contenido de proteína del fríjol varía según la
variedad pero en general es de un 24% superando a la papa y al maíz (Betancour &
Dávila, 2002).
Tabla 1. Contenido nutricional de semilla de fríjol. Contenido total en semilla y por 100g de
semilla (Geil y Anderson, 1994 En: (Sandoval, 2006).
Contenido Total en
Semilla
Contenido por 100g de
semilla
Calorías (kcal)
110-143
Proteínas (%)
21-25
Carbohidratos (%)
60-65
Fibra (%)
3-7
Grasa (%)
0.8-1.5
Vitaminas (%
RDA)
Ácido fólico
30
Tiamina
25
Piridoxina
Minerales (% RDA)
10-12
Niacina
10
Riboflavina
10
Hierro
29-55
Fósforo
20-25
Calcio
10
Zinc
10
% RDA: porcentaje que aporta de acuerdo a los requerimientos mínimos recomendados
12 El hierro es uno de los minerales vitales en la dieta del hombre, ya que participa en
importantes procesos de oxido-reducción, está presente en numerosas enzimas
involucradas en el mantenimiento de la integridad celular, tales como las catalasas,
peroxidasas y oxigenasas y a su vez forma parte estructural y/o funcional de
algunas enzimas como la hemoglobina. La forma de absorción en el organismo
depende de la forma química presente en la dieta, ya sea como hierro hemo (en
alimentos de origen animal) o hierro inorgánico (en alimentos de origen vegetal), en
este último caso su absorción no es proporcional a su contenido ya que se ve
afectada por factores químicos presentes en los alimentos, tales como oxalatos,
taninos y fitatos (Barrios et al., 2000).
El zinc es importante para la formación de enzimas, se encuentra directamente
involucrado con el crecimiento y desarrollo, la insuficiencia de este mineral impide el
crecimiento normal; adicional a esto se ha observado su importancia en el
mantenimiento de la función y la estructura de las biomembranas; inhiben el daño
oxidativo al atrapar radicales libres a través de su enlace con la metalotioneina o
bien mediante la unión a las membranas en sitios que pueden ser ocupados por
metales con potencial redox, estabiliza los grupos “tio” (O´Dell, 1981 En: (Moreno,
2007).
2.2
SITUACIÓN DEL FRÍJOL EN ÁFRICA
En términos de producción y consumo, el fríjol común es la leguminosa de grano
más importante en el oriente, centro y sur de África, mas de 100 millones de
personas en este continente lo consumen; se estima que éste es el segundo recurso
de proteína, y el tercero de calorías más importante de la región; los agricultores
cultivan muchas variedades de fríjol. Típicamente 6 cultivares cuentan para el 95%
de la producción en muchas comunidades, pero la diversidad es más alta en las
regiones de los grandes lagos y áreas adyacentes a Uganda, donde las mezclas
son la norma.
13 Las mezclas son también importantes en parte de Malawi, Mozambique y Tanzania
(Martin & Adams, 1987). Sin embargo, hay una tendencia a producir cultivares más
orientadas hacia el mercadeo, en poblaciones urbanas que demandan mayor
uniformidad para el consumo de fríjoles (Broughton et al., 2003; CIAT, 2005a).
Millones de hectáreas son cultivadas en más de 20 países de África (Tabla 2), en
estos lugares los agricultores de bajos recursos e ingresos, producen fríjoles
principalmente en escala pequeña; las mujeres siembran mucho más que los
hombres. Gran cantidad de cultivos se pierden debido a enfermedades, pestes de
insectos, sequía, baja fertilidad en los suelos u otros factores de estrés abiótico
(David & Sperling, 1999).
Gran cantidad de variedades de fríjol se cultivan en África, siendo notorio en la
diversidad del tipo de semilla y su adaptación. La elección de las variedades más
populares para el mercado, pueden estar dictadas por la resistencia a variabilidad
climática y a condiciones agronómicas, en algunos casos dicha elección puede
producirse por el tamaño grande de la semilla, pero la mayoría de agricultores
especialmente del oriente y del centro de África hacen mezclas de todas las formas
y colores de las semillas (Broughton et al., 2003; Musoni, 2006).
Las semillas pequeñas y medianas suelen ser seleccionadas con mayor frecuencia
debido a que se puede sembrar mayor área y además estas confieren mayor
resistencia a factores ambientales y a enfermedades (Comunicación Personal B.
Lewis investigador programa fríjol Ruanda CIAT, 2007).
El comercio de la semilla de esta planta es muy importante, y puede ocurrir
localmente, entre ciudades o informalmente entre países, usualmente se establecen
rutas de comercio hacia áreas urbanas dentro del mismo país de producción; las
hojas de esta planta también hacen parte del comercio(David & Sperling, 1999).
14 Tabla 2. Áreas de producción de Fríjol en 20 países de África, modificado de “Atlas of
common bean production in Africa” (Wortmann et al, 1998).
Países
Área (%)
Área (ha x 10-3)
Burundi, DR Congo,
Etiopia, Kenia, Ruanda,
Tanzania, Uganda
62
2490
Africa del Sur
Lesotho, Madagascar,
Malawi, Mozambique, Sur
África, Swaziland,
Tanzania, Zambia,
Zimbabue
31
1290
Africa Occidental
Angola, Cameroon, Cape
Verde, Togo
3
135
Algeria, DR Congo,
Egipto, Mali, Malawi,
Mauritius, Morocco,
Nigeria, Sudan, Tunisi
4
200
100
4025
Región
Africa Oriental- tierras
altas y alturas medias
Tierras bajas- estación
de invierno
TOTAL
Se considera que en el oriente y sur de África el consumo de fríjol es mayor que el
de Latinoamérica, las estadísticas muestran que 66kg por persona son consumidos
en algunas zonas rurales de Kenia mientras que en Ruanda y Burundi el consumo
promedio nacional excede 40kg por persona por año (Broughton et al., 2003). Los
dos acervos principales de Phaseolus vulgaris L. están representados en África. El
61% de las cultivares presentes corresponden a semillas grandes típicas del acervo
Andino; el resto pertenecen al acervo Mesoamericano, caracterizado por las
semillas pequeñas o medianas (CIAT, 2005b).
2.2.1
Generalidades Ruanda
Ruanda se encuentra localizado en una región conocida como África Subsahariana
(término utilizado para describir a los países del continente africano ubicados al sur
del desierto del Sahara y que no forman parte de la región conocida como Noráfrica)
específicamente en la parte oriental de África Central (MINAGRI/MINEDUC, 1993).
El país tiene una población de 8.6 millones de personas viviendo en un área de
26,368 Km2, haciendo de Ruanda uno de los países más densamente poblados en
África, 322 habitantes por Km2 (ISAR, 2000). En la Figura 1 se muestra el mapa de
organización política de Ruanda.
15 Fig
gura 1. Mapa
a de Ruanda, organización
n política (UnitedNations, 2007)
2
L mayoría de los hab
La
bitantes vive
en en núcleo
os familiaress dispersos por la región
m
montañosa.
La població
ón está form
mada por tress grupos étn
nicos: los hu
utus (cerca del
d
9
90%),
cuya lengua es el
e bantú; loss tutsis (9%)), destacado
os criadores de ganado, y
l twa (1%
los
%), pueblos pigmeos
p
y presuntamen
p
nte habitante
es originaless de la región
(
(ISAR,
op cit). En la acttualidad la tasa
t
de creccimiento anu
ual es de 2.9
9%, se espe
era
q
que
crezca a 11.4 millo
ones de perrsonas en el
e año 2010;; para ese mismo
m
año se
c
calcula
que la població
ón urbana se
e duplique y que la rura
al crezca a 9.8
9 millones; el
p
país
ha enc
contrando muchos retoss para satisffacer las neccesidades alimenticias
a
de
s gente (Ng
su
girumwami, 1992)
L agriculturra aporta el 91.1% de lo
La
os empleos para la pobllación activa
a y permane
ece
c
como
el priincipal recurso de creccimiento eco
onómico. Ell sector de la agricultu
ura
c
contribuye
en
e un 36.6%
% al PIB (P
Producto Intterno Bruto)) (Ferris et al., 2002). El
p
principal
pro
oducto de exxportación es
e el café, el cual en 19
997 contribuyó en un 52
2%
d las gana
de
ancias nacio
onales, mie
entras que en
e el mism
mo periodo el
e té como el
s
segundo
pro
oducto más importante de
d exportación, aportó un
u 24% de las
l ganancia
as;
16 sin embargo es necesario tener en cuenta que más del 40% de la comida es
importada (ISAR, op cit). Ruanda es un país con menor PIB que otros en áfrica,
pero desde la guerra civil de 1994 ha comenzado a recuperarse económicamente
(Ferris et al., 2002; Sperling, 2001), en la Tabla 3 se muestran los principales
indicadores poblacionales de Ruanda y de África Subsahariana, teniendo en cuenta
el porcentaje de población activa dentro de cada sector económico.
Tabla 3. Comparación de los indicadores poblacionales y económicos de Ruanda y África
Sub-Sahariana (ISAR, 2000).
Indicador
Tamaño poblacional
Densidad Poblacional
Población Activa:
•
•
•
Sector Agrícola
Sector Industrial
Sector
de
servicios
PIB
2.2.2
Ruanda
África Subsahariana
7.7 millones
303 por km2
596 millones
26 por km2 .
•
•
•
91.1 %
1.7%
7.2 %
US$ 240
•
•
•
70.0 %
7.5 %
22.5 %
US$ 490
Fríjol en Ruanda
El fríjol común (Phaseolus vulgaris L.) puede ser llamado una comida casi perfecta,
por ser rico en proteínas carbohidratos, vitaminas y minerales como hierro, zinc y
ácido fólico, componentes esenciales para el crecimiento y desarrollo del cuerpo
humano y para el buen mantenimiento de la salud y desarrollo cognoscitivo (Ferris
et al., 2002; ISAR, op cit).
Los fríjoles son el principal componente en la nutrición de la vida de los Ruandeses;
la mayoría de familias consumen al menos una vez al día esta leguminosa y no sólo
en la forma más común como es el grano seco sino también utilizan en sus platos
las hojas, las vainas verdes y las semillas verdes. El cultivo del fríjol es el más
tradicional y de mayor importancia cultural, con frecuencia se usa como ofrenda o
regalo (Sperling, 2001).
17 A pesar de su importancia se puede reconocer algunos problemas en la producción
del fríjol y en gran parte se debe a que las tierras destinadas para los cultivos no
presentan procesos de rotación o tratamientos adecuados que ayuden a mejorar la
calidad del suelo. Adicional a esto el suelo carece de nutrientes esenciales tales
como nitrógeno, fósforo y potasio (Kelly et al., 2001). Algunos suelos son ácidos,
contribuyendo a la toxicidad de elementos minerales como aluminio y manganeso.
Los problemas bióticos también son de resaltar, dentro de los cuales se encuentran
enfermedades por patógenos como hongos, bacterias y virus, que atacan hojas,
tallos, raíces y el grano (Ferris et al., 2002; ISAR, 2000).
Las pérdidas se estiman hasta 305,700 toneladas por año en África oriental
(Musoni, 2006). Las enfermedades (mancha angular de la hoja, antracnosis,
pudrición de raíz) que atacan al fríjol causan pérdidas anuales de 761,900 toneladas
en el oriente de África (Wortmann et al., 1999). En Ruanda estas enfermedades
causan pérdidas de 219,575 toneladas, equivalente a 89 millones de dólares por
año (Musoni, op cit).
2.2.2.1 Producción y consumo
La producción de fríjol en Ruanda fluctuaba entre 150mil y 200mil toneladas al inicio
de la década de los 70’s; a partir del año 1974 hubo un rápido incremento que llegó
a tener su máximo valor en año de 1985 cuando se produjo más de 300mil
toneladas; en el periodo comprendido entre 1998 y 2000 se encontró un total de
200mil y 300mil toneladas. Las epidemias de la enfermedad de pudrición de raíz y
la guerra civil contribuyeron a la caída en la producción a mediados de los 90’s
(Sperling, 2001); durante el periodo del 2000 al 2001 la producción tuvo un
incremento, sin embargo los siguientes años hasta el 2004 por causa de problemas
climáticos (aumento de lluvias) la producción se tuvo una amplia reducción
(Comunicación Personal L. Butare
investigador programa fríjol Ruanda CIAT,
2007). La figura 2 muestra las fluctuaciones de la producción anual de frijol entre
1979 y el 2004.
18 Figura
a 2. Producció
ón anual, en Toneladas, de Fríjol en Ru
uanda (Muson
ni, 2006)
L frijoles son
Los
s cultivad
dos por el 95
5% de los campesinos
c
Ruandeses sobre el 30
0%
d la tierra cultivada; se
de
s pueden encontrar
e
en
n monocultivvos o cultivo
os mixtos con
m
maíz,
banan
nos, tubérculos y sorgo, los campessinos individu
ualmente pu
ueden manejjar
p
por
encima de tres mezclas
m
durrante la missma época de siembrra; es común
e
encontrar
es
stas mezcla
as tanto en el
e consumo como para la producciión (Sperlin
ng,
2
2001).
La prroductividad es de 800kkg/ha, un terrcio del rend
dimiento possiblemente son
d estacion
de
nes de investigación (F
Ferris et al., 2002; ISA
AR, 2000). Se
S estima un
c
consumo
an
nual de 60 Kg
K per capitta; este alim
mento provee el 84% de
e proteínas de
l
leguminosas
s o 65% de todas las prroteínas vegetales y animales (y 32% de energía)
c
consumidas
s; ofrece un
n recurso alternativo
a
p
para
los aliimentos pro
ovenientes de
a
animales,
es
specialmentte dentro de
e la població
ón rural que
e es la meno
os privilegiada
(
(Kelly
et al., 2001; Muso
oni, 2006).
al
2.2.2.2 Problemática Nutriciona
L malnutric
La
ción es reco
onocida en la
a actualidad
d como uno de los retoss más grandes
q la salud
que
d enfrenta en
n muchos se
ectores de la población Africana, particularmen
nte
e mujeres y niños de
en
e bajos recu
ursos. Dentrro de las principales deficiencias
d
se
e
encuentran
las de micronuetriente
es (aún máss prevalente
e que las de proteínass o
19 carbohidratos), las cuales incluyen las de hierro, zinc, vitaminas y aminoácidos
azufrados (Comunicación Personal M.Blair mejorador de fríjol CIAT, 2007). La
principal causa de esto es que las dietas son abundantes en energía pero pobres en
proteínas, minerales y vitaminas; dicha situación adquiere mayor complejidad en
estos países en donde la mayoría de personas no tienen acceso a los alimentos
provenientes de animales ya que son muy costosos y además el conocimiento del
valor nutricional del alimento que se encuentra a su disponibilidad es limitado (CIAT,
2005b; Donovan & Bailey, 2005).
Debido a este desconocimiento muchas personas de bajos recursos en África basan
su alimentación en los cereales, papas blancas y yuca, estos alimentos
generalmente presentan bajos niveles de micronutrientes (CIAT, 2005b). La
deficiencia en hierro afecta a millones de individuos durante todo su ciclo de vida,
en especial a los lactantes, niños pequeños y las mujeres embarazadas, pero
igualmente a los niños mayores, los adolescentes y las mujeres en edad
reproductiva; los organismos vivos requieren hierro para que sus células funcionen
normalmente (Donovan & Bailey, op cit; OPS, 2002).
El hierro es necesario para el desarrollo de tejidos vitales —incluido el cerebro— y
para transportar y almacenar oxígeno en la hemoglobina y la mioglobina muscular.
La anemia ferropénica es la forma grave de carencia de hierro, puede dar lugar a
una baja resistencia a infecciones, limitaciones en el desarrollo psicomotor y la
función cognoscitiva en los niños, bajo rendimiento académico, así como fatiga y
una baja resistencia física y bajo rendimiento en el trabajo (OPS, 2002). La
prevalencia de esta anemia por falta de hierro varia en África desde un 8% de la
población en Etiopía, 67% en Tanzania hasta el 69% en Burundi (CIAT, 2005b).
Dietas deficientes en hierro frecuentemente son deficientes en zinc. Las
consecuencias de la deficiencia de zinc pueden incluir crecimiento y desarrollo
anormal, inmadurez sexual, complicaciones en el embarazo, mortalidad maternal e
infantil, baja defensa inmunológica, por lo que hace necesario su consumo
especialmente en personas que han sido diagnosticadas positivas para VIH/SIDA
(Donovan & Bailey, 2005; Islam et al., 2002a). Sin embargo, la deficiencia de zinc es
20 un problema que hasta ahora se empieza a evidenciar como un serio tema de salud
pública en los países de África (CIAT, 2005b).
2.2.2.3 Estrategias para combatir la problemática nutricional
Existen tres estrategias de intervención que pueden contribuir en la prevención y
disminución
del
abastecimiento
problema
con
de
productos
deficiencia
de
farmacéuticos
micronutrientes
a
poblaciones
en
África:
vulnerables
(micronutrientes), la fortificación de alimentos y el mejoramiento de la dieta
(Biofortificación) (OPS, 2002).
La primera estrategia, es efectiva para lograr un acceso con facilidades médicas en
grupos vulnerables. Sin embargo solo sería efectiva en un grupo pequeño y requiere
de un gran capital y una elaborada y costosa red de distribución; por lo que dejaría
por fuera a muchos grupos de riesgo que no podrían recibir dicho abastecimiento
(CIAT, 2005b). La fortificación de alimentos ha tenido un grado limitado de éxito en
África debido a que la industria de alimentos se encuentra subdesarrollada y carece
de una efectiva legislación. Hasta el momento los programas de fortificación se
encuentran operando en dos países de África oriental y central: Kenya y Uganda.
Este programa es más efectivo en áreas urbanas, dejando a un lado a comunidades
pobres del área rural (HarvestPlus, 2006).
El mejoramiento de la dieta es probablemente la estrategia más efectiva y sostenible
para reducir la deficiencia de micronutrientes en África. Ésta ayuda a incrementar la
disponibilidad de alimentos, permite que exista consumo de alimentos ricos en
minerales en poblaciones de alto riesgo (CIAT, 2005b). La Biofortificación
(incremento de concentraciones de los principales micronutrientes), se logra con la
creación de variedades superiores agronómicamente hablando, es decir con valor
nutritivo mejorado o variedades que presenten características más atractivas para
los agricultores, tales como tolerancia a sequía o baja fertilidad de suelo. La
Biofortificación del fríjol común podría producir los mejores resultados en áreas
donde el fríjol es el suplemento de una proporción significativa de nutrientes en la
dieta. Estas áreas incluyen partes de África Oriental, Central y del Sur; y América
Central y Brasil (HarvestPlus, 2006).
21 Dentro de este mejoramiento se incluye promover el consumo de fríjol en la dieta,
por ser ésta una especie de amplia producción y consumo (especialmente en África
oriental y central). Por tal razón en 1995 el CGIAR inició un proyecto que busca
desarrollar variedades ricas en minerales (hierro y zinc) y vitaminas especialmente
la A, (CIAT, 2005b). El contenido de minerales (hierro y zinc) y proteínas de los
cultivares analizados dentro de este proyecto se muestran en la Tabla 4, al igual que
algunas características morfoagronómicas (tipo de hábito de crecimiento, color y
tamaño de semilla). Los datos de contenido de minerales fueron tomados a partir de
método de ceniza y no están confirmados.
Tabla 4. Concentraciones de Hierro, Zinc y proteína en cultivares producidos en África
Oriental, Central y del sur (CIAT, 2005b)
Cultivares
ricos en
micronutrientes
AND 620
País de
origen
Hábito de
crecimiento
Trepadora
Color
de
Semilla
Rojo
Moteado
Rojo
Moteado
Café
Tamaño
semilla
Zinc
(ppm)
Hierro
(ppm)
Proteína
(%)
RDC
Arbusto
Grande
38
147
20.4
GLP 2
Kenia
Arbusto
Grande
28
124
16.2
G59/1-2
RDC
Grande
24
106
-
Kiangara
RDC
Trepadora
Café
Pequeña
44
104
20.1
LIB 1
RDC
Trepadora
Amarillo
Mediana
52
94
20.8
MLB-49-98A
RDC
Arbusto
Negro
Pequeña
55
124
-
Naindeky
RDC
Arbusto
Blanco
Pequeña
30
106
21.4
VCB 87013
RDC
Trepadora
Blanco
Pequeña
25
122
19.4
VNB 81010
RDC
Trepadora
Negro
Pequeña
62
77
-
Cultivares ricos
en Proteínas
País de
origen
Hábito de
crecimiento
Tamaño
semilla
Zinc
(ppm)
Hierro
(ppm)
Proteína
(%)
Awash-1
Etiopia
Arbusto
Color
de
Semilla
Crema
Pequeña
24
-
23
Awash Melka
Etiopia
Arbusto
Blanco
Pequeña
28
-
25.3
K 131
Uganda
Arbusto
Carioca
Pequeña
31
-
25
VCB 81012
RDC
Trepadora
Café
Mediana
32
86
26.4
RDC: República Democrática de Congo
Estos datos indican que existe un considerable potencial para el mejoramiento de
proteínas y micronutrientes mediante la promoción del consumo de cultivares ricos
22 en estos nutrientes. Otros cultivares pueden ser mejorados a través de cruzas y
programas de Fitomejoramiento.
2.2.3
Perspectivas del cultivo de Fríjol
Se requiere la adquisición y la adopción de nuevas tecnologías para el cultivo de
fríjol, con el fin de mejorar su producción y elevar el consumo y comercio. Las
investigaciones se enfocan hacía la creación de nuevas tecnologías generadas por
los estudios en patología, agronomía y aspectos socio-económicos. Algunos de los
avances se han centrado en generar nuevas variedades por programas de
entrecruzamiento e investigaciones en colección (Ferris et al., 2002; ISAR, 2000).
Un avance adicional es una caracterización molecular de colecciones con el fin de
conocer la base genética del germoplasma de estudio que permitan la adecuada
selección de genotipos para cruzar con fuentes de alto contenido de minerales,
proteínas o vitaminas en semilla.
2.3
DIVERSIDAD
GENÉTICA
Y
ANALISIS
MOLECULAR
MEDIANTE
MICROSATLITES
2.3.1
Marcadores Moleculares
Los marcadores moleculares son definidos como “todo y cualquier fenotipo
molecular oriundo de la expresión de un gen o estado alélico” (Ferreira &
Grattapaglia, 1998); son herramientas que permiten conocer la variabilidad genética
de un germoplasma. Existen diferentes tipos de marcadores: morfológicos, se
refieren a rasgos fenotípicos; bioquímicos, incluyen variantes alélicas de enzimas
llamadas isoenzimas; y marcadores de ADN que revelan sitios de variación del
ADN. Las principales desventajas de los marcadores bioquímicos y morfológicos es
que ellos están limitados en número y son influenciados por los factores ambientales
o de la etapa de desarrollo de la planta. Sin embargo estos han sido de gran utilidad
para los mejoradores (Winter & Kahl, 1995).
Los marcadores de ADN son el tipo de marcador más ampliamente usado debido a
su abundancia. Ellos surgen de diferentes clases de mutaciones de ADN tales como
23 mutaciones por sustitución (mutaciones puntuales), rearreglos (inserciones o
deleciones) o errores en la replicación de tandems de repetición del ADN. Estos
marcadores son selectivamente neutrales ya que ellos usualmente están localizados
en regiones no codificantes del ADN. Dentro de los usos de este tipo de marcadores
se encuentran, la elaboración de mapas de ligamiento y la evaluación del nivel de
diversidad genética (Collard et al., 2005).
Los marcadores moleculares pueden clasificarse en tres grupos de acuerdo a su
fundamento: Marcadores basados en la hibridación del ADN, marcadores basados
en la secuenciación de fragmentos de ADN y marcadores basados en la
amplificación de fragmentos mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Estos últimos son generalmente menos costosos y revelan mayores cantidades de
polimorfismo. La PCR está diseñada para amplificar ADN en procedimiento cíclico y
automatizado el cual resulta en un incremento exponencial en la cantidad de una
secuencia específica del ADN. La selección del fragmento de ADN para la
amplificación es el resultado del alineamiento, en la cual un “primer” o cebador (5 a
30 bases de largo) se une a una cadena simple de ADN genómico presentada en la
reacción. El complejo primer-ADN se convierte en el punto de inicio para la
replicación de la secuencia de ADN adyacente
por la intervención de una
polimerasa termoestable en la reacción de esta mezcla (Reisch, 1998).
Uno de los marcadores más importantes basados en PCR son los microsatélites,
fundamentados en el descubrimiento de secuencias simples repetidas (SSR) en el
genoma; también se puede llamar ocasionalmente sitios de microsatélite de
secuencia etiquetada (STMS) o polimorfismo de repeticiones de secuencia simple
(SSRP) (Hajeer et al., 2000; Reisch, 1998). Estos hacen parte de los marcadores
que permiten visualizar las diferencias genéticas entre individuos, organismos o
especies. Generalmente ellos no representan genes “blanco” pero, sí actúan como
señales o banderas. Estos marcadores están localizados cerca de los genes
“blanco” y no afectan el fenotipo del rasgo de interés porque ellos están
simplemente localizados cerca de los genes que controlan el rasgo. Todos los
24 marcadores genéticos ocupan una posición específica dentro de los cromosomas
(como los genes), llamados “loci” (en singular locus) (Collard et al., 2005)
Los microsatélites son repeticiones cortas en serie cuya secuencia básica tiene una
longitud entre 1 y 10 pb, los más típicos de 2 a 4 pb. Son altamente variables y
están distribuidos por igual en todo el genoma. Este tipo de ADN repetitivo es
común en organismos eucariotas, y el número de unidades repetidas varía
ampliamente entre los organismos, hallándose en algunos hasta 50 copias o más de
la unidad repetida. Para identificar estos polimorfismos, se construyen cebadores o
primers para la amplificación mediante PCR de la región del ADN que flanquea el
microsatélite. Las regiones adyacentes a los microsatélites tienden a conservarse
dentro de las especies, aunque a veces se conservan también en niveles
taxonómicos mayores (Hajeer et al., 2000)
La variación en tamaño de los productos de la PCR para un microsatélite se debe a
las diferencias en el número de las unidades repetidas en el locus. El polimorfismo
de los microsatélites es generado por la pérdida o ganancia de repeticiones, aunque
se cree que se deba en mayor medida a la ganancia. Éste fenómeno no es conocido
completamente, pero se piensa que esta expansión es debida a procesos de
mutación durante la replicación (Roizès, 2000).
Los polimorfismos de SSR se pueden visualizar mediante electroforesis en geles de
agarosa o de poliacrilamida. Los alelos del microsatélite se detectan usando
diversos métodos: tinción con bromuro de etidio, nitrato de plata, radioisótopos o
fluorescencia. Si se usan cebadores marcados con fluorescencia, y los productos
son suficientemente diferentes en tamaño y no se sobreponen, se pueden generar
varios productos de forma simultánea, lo que aumenta enormemente la eficiencia de
estos marcadores (Dean et al., 1999).
Debido a que estos marcadores presentan grandes ventajas fueron seleccionados
para este estudio. Dentro de estas características se encuentran: alto poder
discriminatorio, ofrecen gran cantidad de información por su naturaleza multialélica,
son codominantes, reproducibles, tienen herencia mendeliana, tienen relativa
abundancia con una cobertura uniforme del genoma y presentan fácil detección
25 dentro de sistemas automatizados (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Gaitan-Solis et al.,
2002).
2.3.2
Microsatélites
analizados
mediante
fluorescencia
y
Análisis
secuenciador automático
Las soluciones que sean altamente eficientes y a bajo costo, son esenciales en la
actualidad en todos los campos de la investigación. La implementación de nuevas
tecnologías y metodologías de trabajo proveen dichas soluciones; tal es el caso de
los secuenciadores analíticos de ADN, los cuales permiten el estudio de
microsatélites de una forma más eficiente, y vienen acompañados del uso de
software que aumenta la precisión, sensibilidad, resolución y eficiencia en el
genotipaje (Joe et al., 2004).
Los microsatélites pueden ser marcados con etiquetas fluorescentes (fluorocromos)
de diferentes colores por ejemplo verde, azul, amarillo y rojo, y posteriormente
detectados automáticamente en secuenciadores de ADN; este método es
económico y eficiente. Se pueden realizar combinaciones (multiplex) de marcadores
en un mismo panel, lo cual puede incrementar la eficiencia ya que tiene en cuenta
muchos fragmentos de ADN polimórficos y representa diferentes loci a lo largo del
genoma.
En los paneles, los marcadores etiquetados con el mismo fluorocromo deben tener
diferente tamaño, mientras que los marcadores que se sobrelapan en tamaño deben
ser diferenciados mediante el uso de colores diferentes. Muchos marcadores
pueden ser mezclados después de la amplificación o bien amplificados juntos en
una reacción común de PCR (Blair et al., 2002). Estos productos de PCR son leídos
por un secuenciador analítico de ADN, por ejemplo el ABI serie 3730xl.
El procesamiento de la información dentro del software funciona como se muestra
en la figura 3. Los datos de la muestra leída mediante el secuenciador analítico de
ADN, son convertidos en un archivo y éste es auto-analizado directamente por un
software que interpreta el lenguaje análogo de las lecturas que hace el
26 secuenciador, realiza la identificación de picos y tamaños. Este software combina la
información del archivo de la muestra con análisis preconfigurados y calibraciones
estándar; las muestras procesadas pueden ser vistas, editadas y analizadas en una
ventana generada por el software (Joe et al., 2004).
Método de análisis
Detección de pico
Tabla de genotipo
Confirmación de tamaño
Etiquetado de tamaño
Asignación de Auto‐Bin
Etiquetado de Alelo
Figura 3. Sistema de flujo de la información obtenida a partir del archivo de la muestra
dentro del software de auto-análisis. Modificado de (Joe et al., 2004).
2.3.3
Estudios de diversidad genética en Fríjol común
Debido a la importancia económica y nutricional del fríjol se ha llevado a cabo gran
cantidad de estudios de diversidad genética en distintas partes del mundo,
principalmente en el continente americano por ser centro de origen. Los estudios en
el continente Africano se presentan en menor número pero han tomado mayor
fuerza, al ser este continente un centro secundario. Las metodologías varían desde
descriptores morfológicos, bioquímicos (isoenzimas y faseolinas) o técnicas
moleculares con marcadores de ADN.
Gepts & Bliss en 1986 estudiaron material silvestre y mostraron la presencia de
faseolina
(principal proteína de almacenamiento de la semilla de fríjol) tipo ‘S’,
además un nuevo patrón denominado ‘CH’ (Chibcha); mientras que para materiales
cultivados presentaron ‘S’, ‘T’ y ‘C’ y un nuevo tipo de faseolina denominada ‘B’
(Boyacá).
27 Estudios complementarios confirmaron la diversidad de los acervos genéticos, pues
adicional a los tipos de faseolinas ya encontrados, se registraron nuevos tipos para
las accesiones Andinas cultivadas: H (Huevo de Huanchaco), mientras que en
materiales silvestres de Mesoamérica se encontró el tipo M (Mesoamérica) (Gepts
et al., 1986).
Koenig et al. 1989 consideraron que las accesiones de fríjol de Mesoamérica y de
los Andes tienen diferentes tipos de faseolinas, en el primer grupo se distinguen las
faseolinas tipo ‘S’ y ‘M’ mientras que en el grupo Andino predominaron las 'T', 'C',
'H', 'A', 'J' y la 'I'. Además encontraron una relación entre el tamaño de la semilla y el
tipo de faseolina.
Estudios como el realizado por Koenig y Gepts en 1989, en poblaciones silvestres
analizadas mediante aloenzimas y características morfológicas, definen los dos
grandes centros de diversidad. Sus resultados fueron consistentes con la diversidad
encontrada en estudios previos con faseolinas.
En otro estudio, se evaluaron accesiones pertenecientes a Centroamérica y
Suramérica (desde México hasta Argentina y Chile) mediante la evaluación de
patrón de aloenzimas; en este estudio fue posible distinguir dos grupos mayores con
formas Andinas y Mesoamericanas. Las aloenzimas encontradas en los genotipos
cultivados son un reflejo de las encontradas en cada uno de los dos grupos de
genotipos silvestres analizados en las mismas áreas (Singh et al., 1991b).
La técnica RFLP (Restriction fragment length Polymorphism) fue utilizada en 1994
por Becerra y Gepts (1994), quienes confirmaron la divergencia entre genotipos
Mesoamericanos y Andinos. Sugieren la existencia de un aislamiento reproductivo,
confirmando que en los cruces entre genotipos del acervo Mesoamericano y Andino
hay debilidad del híbrido F1.
Análisis mediante AFLP (de las siglas en Inglés Amplified Fragment Length
Polymorphism) revelan que las poblaciones de fríjol silvestre en la zona Andina han
sido aisladas la una de la otra, resultando poblaciones discretas en Ecuador y el
norte de Perú; en el sur de Perú, Bolivia y el norte de Argentina(Tohme et al., 1996).
28 Beebe et al (2000), analizaron 269 genotipos de fríjol común implementando la
técnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) con el fin de determinar la
estructura del acervo genético de fríjol cultivado en América central y México. Los
análisis permitieron relacionar la agrupación en razas que se había realizado
previamente mediante criterios morfológicos y agronómicos, con las agrupaciones
formadas a partir de este estudio molecular. Este germoplasma resultó ser más
complejo de lo que se pensaba anteriormente, se conservaron las agrupaciones de
las razas Mesoamérica, Jalisco y Durango. Pero las accesiones del germoplasma
de Guatemala no se agruparon con ninguna de las razas mencionadas previamente
definiéndose así como una nueva raza.
Análisis reportados por Beebe et al. (2001) determinaron la estructura genética de
una muestra de 182 genotipos Andinos, analizados mediante el uso de 189 primers
polimórficos AFLPs. Dentro de su estudio incluyeron genotipos Mesoamericanos y
silvestres; un análisis de correspondencia múltiple permitió separar los grupos
Andinos de los Mesoamericanos; dentro de los silvestres los genotipos
Mesoamericanos y del sur del Perú se separaron de los del sur de los andes. El
Acervo Andino no hubo una clasificación de accesiones como la encontrada por
Tohme et al 1996, y la tendencia a formar razas discretas no se detectó. Las razas
Nueva Granada, Perú y Chile del acervo Andino fueron definidas esencialmente
basadas en la morfología, los resultados de Beebe y colaboradores sugieren que las
tres razas pueden tener un origen común, estas razas pudieron haber resultado de
la intensiva intervención humana y de la selección para estos rasgos.
Un estudio reciente, por Blair et al en 2006, estima la diversidad alélica y la
Heterocigocidad de 129 microsatélites en un panel de 44 genotipos de fríjol. Fueron
evaluados marcadores génicos y genómicos; el análisis del contenido de
información polimórfica (PIC) permitió reconocer un grupo de marcadores con gran
capacidad de discriminación que pueden ser útiles en estudios de diversidad
genética. Se evaluó la distribución y el rango del tamaño de alelos. Este estudio
sugirió que los marcadores genómicos proveen mayor polimorfismo que los génicos
arrojando valores en número de alelos de 6.0 vs 9.2 y valores de PIC de 0.446 vs
0.594.
29 Los
microsatélites
fueron
útiles
para
distinguir
genotipos
Mesoamericanos, para revelar las razas de cada acervo
Andinos
de
y para separar las
accesiones cultivadas de las silvestres. Se encontró mayor polimorfismo (53%
Andino y 33.4% Mesoamericano) y estructura de razas dentro del acervo Andino y la
tasa de polimorfismo entre los genotipos fue consistente con el acervo y la identidad
de razas. La diversidad intrapoblacional fue mayor dentro del acervo Andino que
dentro del Mesoamericano y este patrón fue observado para los dos tipos de
marcadores evaluados (génicos y genómicos) (Blair et al., 2006).
Uno de los últimos estudios realizado con el fin de describir la estructura de razas
del acervo Mesoamericano usando microsatélites es el de Díaz & Blair en el 2006,
en cual evaluaron 60 genotipos con 52 marcadores; el análisis de correspondencia
identificaron dos grupos principales equivalentes a la raza Mesoamérica y un grupo
que contenía las razas Durango y Jalisco. El análisis con estos marcadores permitió
identificar estos subgrupos, los cuales coinciden con las divisiones de clases
comerciales.
En una investigación realizada por Blair y colaboradores en el 2007, se buscó
caracterizar la estructura de razas de una colección de 123 genotipos
representantes del acervo Andino con 33 marcadores; adicional a esto se evaluó
una
colección
de
individuos
provenientes
de
Colombia.
El
análisis
de
correspondencia múltiple de los genotipos Andinos identificó dos grupos
predominantes correspondientes a las razas Nueva Granada y Perú; algunos
individuos representantes de la raza Chile se agruparon de forma separada pero
muchos individuos definidos en estudios anteriores dentro de esta raza fueron
incluidos dentro de las otras razas.
2.3.4
Estudios de diversidad en fríjol Africano
Se destacan los trabajos de Martin & Adams (1987) y Khairallah et al. (1990), ambos
desarrollados en Malawi, para los que se emplearon dos técnicas importantes para
el estudio de la diversidad. En el primero se recurrió al estudio de datos
morfológicos, fenológicos y agronómicos, mientras que en el segundo se emplearon
marcadores mitocondriales. Estos estudios permitieron encontrar una gran
variabilidad morfológica en genotipos cultivados (variedades criollas y líneas
30 mejoradas) de fríjol Africano, aunque estos sólo se agruparon en los dos grandes
acervos en términos de variabilidad genética: Andino y Mesoamericano.
Por otra parte, en un reciente trabajo llevado a cabo por Moreno en el 2007, en el
CIAT, se evaluó la diversidad genética existente en 221 variedades comerciales
africanas de fríjol común, siendo este análisis una base para un programa de
mejoramiento nutricional en donde la meta final será aumentar el contenido de
hierro y zinc.
2.4
CUANTIFICACION DEL CONTENIDO DE MINERALES EN FRÍJOL
2.4.1
Cuantificación por Absorción Atómica (AA)
La Absorción Atómica es una de las principales técnicas utilizadas en la
cuantificación del contenido de minerales en muestras orgánicas. Ésta técnica
espectroscópica tiene como fundamento la absorción de radiación de una longitud
de onda determinada por parte de átomos libres, por lo tanto existe la necesidad de
liberar el analito de la matriz que lo contiene. Esta radiación es absorbida
selectivamente por átomos que tengan niveles energéticos cuya diferencia en
energía corresponda a la energía de los fotones incidentes (Rocha, 2000; Skoog et
al., 2001).
El principio en que se fundamenta la absorción atómica se puede describir de la
siguiente forma: cuando se hace pasar una disolución por una llama, los elementos
presentes son parcialmente llevados a su forma atómica. Y si a través de la llama se
hace pasar un haz de luz proveniente de una lámpara cuyo cátodo contiene el
elemento que se desea determinar y que, por tanto, emite las líneas características
de ese elemento, los átomos del elemento en cuestión presentes en la llama
absorberán esa radiación obedeciendo leyes cuantitativas de forma análoga a la
espectrofometría molecular (Muñiz, 1980).
Para llevar a cabo esta técnica se requiere que la muestra esté de forma líquida o
en solución. Las muestras sólidas son preparadas para el análisis mediante su
disolución en un solvente apropiado, en el caso de tejido vegetal se usa ácido
31 perclórico o nítrico; cuando la muestra no es soluble, ésta puede ser digerida a altas
temperaturas (Harvey, 2000).
La muestra se hace pasar en la forma de una dispersión de gotas muy finas a un
atomizador de llama, la disolución de la muestra es nebulizada mediante un flujo de
gas oxidante, mezclado con gas combustible, y se transporta a una llama donde se
produce la atomización. En la llama se produce una desolvatación, se evapora el
disolvente hasta obtener un aerosol rico en moléculas y luego la disociación de la
mayoría de estas moléculas produce un gas atómico. La mayoría de los átomos
formados así se ionizan originando cationes y electrones (Skoog et al., 2001).
Existen dos formas de atomización dentro de la técnica de AA, bien sea por llama o
atomización electrotérmica; la elección de cualquiera de estos dos métodos está
determinada principalmente por la concentración del analito en la muestra a
analizar. La principal ventaja de la absorción atómica con atomizador de llama es la
reproducibilidad con la cual la muestra es introducida dentro del espectrofotómetro,
y su desventaja significativa es que la eficiencia de la atomización puede ser
bastante pobre.
Independientemente del método de atomización, la AA es una técnica ideal para
cuantificación de trazas y ultratrazas de metales, debido a su sensibilidad,
selectividad, precisión y exactitud; adicionalmente, su análisis es rápido y no implica
mayor costo.
2.4.2
Estudios de cuantificación de minerales en Fríjol Común
Uno de los principales estudios que se han realizado para el análisis del contenido
de minerales en el fríjol común, es el de Beebe et al. (2000), en el que se analizaron
mas de mil accesiones de la colección núcleo de fríjol del CIAT con el fin de
determinar el grado de variabilidad genética del fríjol por contenido mineral, usando
la tecnología de Plasma Acoplado Inductivamente ó ICP (Inductive Coupling
Plasma), para la cuantificación de hierro y zinc. Encontraron un rango de 34 a 89
ppm con un promedio de 55 ppm para hierro, sin que hubiera evidencia de
correlación entre el contenido de hierro y la distribución geográfica; sin embargo, las
accesiones Andinas tendían a presentar valores más altos que las Mesoamericanas.
32 El contenido de Zinc en los fríjoles fue uno de los más altos dentro de las plantas; en
la evaluación de la colección núcleo se encontraron rangos de 21 a 45 ppm en el
contenido de Zinc , con un valor promedio de 35 ppm (Beebe et al., 2000a).
Islam et al (2002), analizaron cinco elementos nutricionales (Ca, P, S, Fe y Zn), en
la colección núcleo de CIAT, 1072 accesiones, mediante la implementación del
método ICP. El producto del ICP fue usado para Espectroscopía de emisión atómica
(AES). Obtuvieron un valor mínimo para hierro de 34,60 y máximo de 91,90 ppm y
un valor promedio de 54,81 ppm. Para zinc, el valor mínimo fue de 20,7 y valor
máximo de 59,40 ppm; el promedio correspondió a 34,40 ppm.
En otro estudio se analizaron los contenidos de hierro y zinc en una población de
líneas recombinantes, cruce entre G21242 (fríjol trepador colombiano con alto
contenido de hierro y zinc) y G21078 (fríjol trepador Argentino con bajo contenido de
hierro y zinc). Dos métodos de análisis de minerales fueron implementados, Plasma
acoplado inductivamente (ICP) y Espectroscopia de Absorción Atómica (AA). La
población fue analizada en dos localizaciones en Colombia (Popayán y Darién), el
contenido promedio de hierro y zinc calculado en ppm en la progenie del cruce de
poblaciones (G21242 x G21078). Se encontró correlación entre minerales y entre
ambientes (Blair et al., 2005).
33 3
3.1
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
El fríjol común (Phaseolus vulgaris L.), es un renglón importante de la economía y
alimentación de la mayoría de países en vía de desarrollo; Ruanda (África) es un
país con uno de los índices más altos de consumo de ésta leguminosa, por lo tanto
se requiere de la profundización en estudios a nivel molecular que permitan
caracterizar la diversidad genética de esta especie con miras a apoyar su
mejoramiento nutricional.
Ruanda, como la mayoría de los países en vía de desarrollo de África Central basa
sus ingresos, oportunidades de empleo y en general su economía en la agricultura,
ya que cerca del 90% de sus habitantes se encuentra en las áreas rurales (Ferris et
al., 2002). La perspectiva económica de Ruanda es un gran reto. El país
experimenta un aumento en las tasas de crecimiento de la población, lo que afecta
directamente en la disminución de terreno útil para el uso de la agricultura per cápita
y a su vez genera un aumento en la demanda de alimentos, lo que trae como
consecuencia que la seguridad alimentaria y el alivio de la pobreza estén en su
punto más crítico. También se responsabiliza esta presión por tierra como causa de
la guerra civil de 1994 que encajó un genocidio de más de un millón de personas en
ese país (Sperling, 2001).
Para garantizar seguridad alimentaria y que los ingresos rurales aumenten es
necesario incrementar la productividad en el sector agronómico. Dicho incremento
es posible con el mejoramiento de los principales cultivos del país. Dentro de éstos,
se encuentra el fríjol (Phaseolus vulgaris L.), el cual forma parte integral del sistema
de producción y consumo en Ruanda; principalmente es apreciado por su larga vida
durante el almacenamiento y buenas propiedades nutricionales. Es uno de los
alimentos centrales de la dieta en Ruanda, aportando cerca del 60% y 30% de todas
las proteínas y calorías ingeridas respectivamente, siendo el segundo en
importancia después del maíz (Ferris et al., 2002).
34 Lo anterior indica la necesidad de adelantar procesos de caracterización y
evaluación de la diversidad genética de una colección de fríjol de Ruanda, con el fin
de establecer un punto de partida en el camino de la implementación de un
programa eficiente de mejoramiento, ya sea este nutricional o meramente genético,
de esta especie y así poder contar en un futuro cercano con materiales promisorios
que suplan las necesidades de consumo. Por otra parte, las accesiones africanas
han sido poco estudiadas a nivel molecular lo que genera mayor interés al realizar
este estudio.
3.2
JUSTIFICACIÓN
El fríjol común (Phaseolus vulgaris L.) es la leguminosa de grano más importante en
el mundo siendo uno de los principales productos de la dieta de los países en vía de
desarrollo. Es especialmente importante en países en desarrollo de América y en
África, regiones donde se produce el 47% y 24% respectivamente, de la producción
mundial de fríjol seco (Becerra & Gepts, 1994). El valor nutritivo del fríjol se centra
en el alto contenido de proteínas, carbohidratos, grasas, vitaminas y minerales
(Bazel & Anderson, 1994).
Aún cuando el fríjol es una de las especies más importantes del sistema de
producción y consumo en el continente Africano, específicamente en el país de
Ruanda, su consumo sobrepasa la producción siendo necesaria su importación;
además éste cultivo presenta diversos problemas, por ejemplo la baja fertilidad del
suelo, plagas y enfermedades (Ferris et al., 2002).
Teniendo en cuenta estos factores que han afectado la economía y la seguridad
alimentaria de sus habitantes, se hace imperiosa la necesidad de emprender
estudios del conocimiento de la diversidad genética, encaminados hacía un futuro
fitomejoramiento de la especie. La diversidad de los recursos genéticos facilita la
adaptación a necesidades y condiciones siempre cambiantes y hace posible la
agricultura sostenible en muchos de los diferentes ambientes de producción. Los
recursos genéticos de una especie vegetal constituyen la materia prima con la que
los fitomejoradores producen nuevas variedades (FAO, 1996).
35 Estas son las principales razones por las que se motivó la realización de un estudio
de caracterización de la diversidad genética de la colección de germoplasma del
fríjol de Ruanda, como apoyo a los procesos de mejoramiento de esta especie en
ese país, especialmente dirigido a un mejoramiento nutricional.
La caracterización y evaluación de la colección de fríjol se realizará mediante el uso
de marcadores genéticos, lo que permitirá el conocimiento de la composición
genotípica de estos materiales. Por lo tanto, la presente propuesta se centra en
determinar la variabilidad genética mediante marcadores microsatélites y a su vez la
composición de minerales (hierro y zinc) de una colección de fríjol de Ruanda.
Se recurre a las técnicas moleculares como los microsatélites, ya que se han
utilizado con mucho éxito en la estimación de la variabilidad genética dentro y entre
poblaciones, así como en muestras de accesiones de especies cultivadas o
silvestres, de manera efectiva y rápida (Mitchell et al., 1997) y específicamente se
utiliza un marcaje fluorescente, por ser una técnica automatizada que garantiza
mayor precisión, sensibilidad, resolución y eficiencia en el genotipaje (Joe et al.,
2004).
36 4
4.1
OBJETIVOS
Objetivo General
Caracterizar la diversidad genética de 355 genotipos de fríjol común provenientes de
Ruanda (África), mediante el uso de marcadores moleculares tipo microsatélites
marcados con fluorescencia.
4.2
Objetivos Específicos
i)
Evaluar el polimorfismo alélico para 355 genotipos de fríjol de Ruanda
(África) mediante el uso de marcadores moleculares tipo microsatélites
analizados con una técnica de fluorescencia.
ii)
Analizar la relación que presentan los genotipos entre sí mediante su
similaridad evaluada con criterios de diversidad genética y el uso de
métodos estadísticos.
iii)
Relacionar por medio de estadística descriptiva los caracteres de grano
(color y tamaño) y el contenido de minerales de los genotipos, con las
agrupaciones generadas a partir de la evaluación del polimorfismo
alélico.
37 5
MATE
ERIALES Y MÉTODOS
S
L elaboración de este trabajo
La
t
(el procesamiento de las mu
uestras, análisis molecular
y análisis estadístico de los da
atos), se lle
evó a cabo
o en el Laboratorio de
C
Caracterizac
ción de Germoplasma
G
a de Fríjo
ol (LCGF), ubicado en
e el Centtro
Internaciona
al de Agriicultura (CIAT), situado en el municipio de Palmira
d
departamen
to del Valle del Cauca, Colombia.
C
5
5.1
Poblac
ción de Estu
udio
P
Para
el desarrollo de este
e
proyecto
o se utilizó semilla de fríjol
f
proveniente Ruand
da,
e
específicam
ente de ISA
AR (Instituto de Cienciass Agronómiccas de Ruan
nda); este pa
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e
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ado en la parte oriental de
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entral en una
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nocida como
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S
Subsaharian
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grandes lago
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eográficas de
e 1° 57′ S 30°
3
4 E, en la fig
4′
gura 4 se muestra la ubicación de Ruanda
R
en el
e continente
e Africano.
Fiigura 4. Loca
alización geog
gráfica de Rua
anda en el co
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Las
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acterización de Germop
plasma de Fríjol
F
del CIA
AT
e Palmira, Valle. La muestra
en
m
para
a la evaluacción de la diversidad ge
enética fue de
3
355
genotip
pos y adicionalmente se utilizaro
on 4 materiiales como controles de
d
diversidad,
en
e la tabla 5 se muestra
an los genotipos y su resspectivo orig
gen.
38 Tabla 5. Controles Diversidad utilizados en este estudio con su respectivo origen (acervo al
que pertenecen)
CONTROLES
ACERVO
GENÉTICO
DOR 364 Mesoamericano
FOTO
ICA-PIJAO Mesoamericano
CALIMA Andino G19833 Andino El modelo de tamaño de muestra propuesto por Leung et al. (1993), predice que con
una confiabilidad del 95%, son necesarios 29 genotipos de un acervo genético para
capturar o incluir alelos con una frecuencia de hasta el 10%, lo que se cumpliría
para el caso de las accesiones provenientes de Ruanda escogidas para este estudio
y es conforme con lo propuesto por Li y Nei (1987) quienes aconsejan utilizar un
mínimo de 20 a 30 individuos por locus sí el número de loci a examinar es 25. Para
este estudio se tiene una muestra de 355 individuos, lo que indica que se tiene un
buen número para el análisis de diversidad.
39 5.2
MÉTODOS
5.2.1
Procesamiento del material vegetal:
5.2.1.1 Germinación de la semilla:
Se seleccionaron 10 semillas de cada uno de los 355 genotipos las cuales se
germinaron en condiciones de laboratorio, de la siguiente manera: Las diez semillas
de cada genotipo fueron lavadas superficialmente con agua bidestilada y
posteriormente escarificadas (corte longitudinal de la testa en el lado opuesto del
micrópilo de la semilla) para asegurar una rápida y uniforme germinación, ya que
mediante este proceso se facilita la absorción de agua a la semilla.
Las semillas se colocaron de forma lineal y espaciada en el centro de un rectángulo
de papel de germinación de 30 x 25cm, debidamente rotulado con el número de
identificación de cada genotipo. Cada rectángulo de papel se enrolló y se amarró
con un alambre con el fin de asegurar las semillas. Cada rollo se colocó en
imbibición en una bandeja con una solución de Sulfato de Calcio (Ca2SO4) 0.5 mM
para evitar contaminación con patógenos.
Las bandejas con los rollos de papel de germinación se almacenaron bajo
condiciones de oscuridad, para evitar el desarrollo de tejidos fotosintéticos ya que
éstos pueden afectar la calidad del ADN por la acumulación de almidones. Después
de 8 días de crecimiento las hojas cotiledonares habían emergido; se escogió un
trifolio etiolado de cada planta, se colectaron en total 10 trifolios por genotipo y se
distribuyeron en tres tubos Eppendorf de 2mL (3-3-4 trifolios).
5.2.1.2 Procesamiento Post-germinación
Los tubos marcados con la identificación de cada genotipo, fueron almacenados en
un congelador a -80°C hasta el momento de su liofilización. La liofilización es un
método para deshidratar el tejido por medio de choques congelantes y secado en el
estado de congelación bajo condiciones de vacío, haciendo que el hielo pase
directamente
a
vapor
de
agua
(sublimación).
El
material
celular
y
las
macromoléculas secas mantienen su actividad biológica y pueden almacenarse por
40 este estado por periodos largos (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Este proceso se
llevó a cabo durante dos días en un equipo Dryer MODULYoD-115 marca Thermo.
Una vez secas las muestras, se procedió a su maceración con morteros especiales
para tubos de microcentrífuga y con la ayuda de un motor manual.
5.2.2
Extracción y cuantificación de ADN
Una vez macerados los trifolios se combinó el material de los tres tubos de cada
genotipo en un solo tubo Eppendorf de 1,5mL; es necesario aclarar que debido a
que la semilla llevaba aproximadamente dos años almacenada en el cuarto de
conservación de semillas del CIAT, durante el proceso de germinación se
presentaron problemas y en muchos casos los trifolios colectados eran muy
pequeños, por lo que la cantidad macerada de los tres tubos cabían perfectamente
en un solo tubo de 1,5mL.
El proceso de extracción, se realizó empleando el método de Mahuku (2004), que
utiliza la acción combinada de la Proteinasa K y del EDTA para inhibir o degradar
completamente a las nucleasas (Anexo 1), este método funciona muy bien con poco
tejido (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Mahuku, 2004). El producto de la extracción se
almacenó a -20°C. Con el fin de determinar la calidad del ADN, se sembraron 2 µL
de ADN total de cada muestra en un gel de agarosa al 1%, teñido con Bromuro de
etidio. La cuantificación del ADN extraído se realizó mediante electroforesis en gel
de agarosa utilizando el software Quantity one® v 4.0.3, el cual calcula la cantidad
de ADN en cada una de las bandas, de acuerdo a las extrapolaciones que realiza
con los patrones de concentración de ADN conocidos (Bio-Rad, 1998), para este
caso se utilizaron ADN lambda de [50ng], [100ng], [200ng] y [400ng].
La electroforesis, se realizó en gel de agarosa al 1% y se tiñó con bromuro de etidio;
en cada pozo del gel se sembró una mezcla de 2µL de ADN, 6µL de agua grado
HPLC y 4µL de Blue Juice (Glicerol + Azul de Bromofenol) y se sometió a
electroforesis durante 20 minutos aproximadamente a 120 V. Posteriormente se
tomó una fotografía del gel con el equipo GelDoc 2000 de BioRad acoplado a un
trasniluminador de luz U.V.
41 Con el fin de corroborar los datos obtenidos a partir de la cuantificación realizada
con el software Quantity one®, se realizó una segunda cuantificación del material
mediante el uso del Fluorometro DyNA Quant, (Hoefer Pharmacia Biotech Inc.,
1995) con base en la solución de colorante HoeschtH 33258
5.2.3
Amplificación mediante PCR de microsatélites analizados con
fluorescencia
La caracterización de los genotipos se realizó a partir del uso de 30 marcadores tipo
microsatélites marcados con fluorocromos (tabla 6) seleccionados de 6 paneles
según Blair et al 2007, de los cuales 14 eran génicos y 16 genómicos; este grupo de
marcadores fue seleccionado por ser altamente polimórfico (Blair et al., 2003; Diaz,
2005a; Diaz, 2005b; Gaitan-Solis et al., 2002):
Tabla 6. Cebadores fluorescentes para la amplificación de microsatélites utilizados en la
caracterización genética de la colección de germoplasma de Ruanda.
Marcador
AG01
BM139
BM143
BM156
BM160
BM165
BM172
BM175
BM183
BM187
BM188a
BM188b
BM201
BM205
GATs54
GATs91
BMd01
BMd02
BMd08
BMd16
BMd17
BMd18
BMd20
BMd45
BMd46
BMd47
Pv-ctt001
Pv-ag003
Pv-gaat001
Pv-cct001
Motivo
Fluorescencia
Genómicos
(GA)8GGTA(GA)5GGGGACG(AG)4
6-FAM
(CT)25
PET
(GA)35
6-FAM
(CT)32
6-FAM
(GA)15(GAA)5
NED
(TC)14
TET
(GA)23
PET
(AT)5(GA)19
VIC
(TC)14
TET
(CT)10T(CT)14
HEX
(CA)18(TA)7
NED
(CA)18(TA)7
NED
(GA)15
6-FAM
(GT)11
PET
(GA)5AACAGAGT(GA)8
HEX
(GA)17
6-FAM
Génicos
(AT)9
6-FAM
(CGG)8
PET
(CT)7
NED
(CATG)4
VIC
(CGCCAC)6
TET
(TGAA)3
HEX
(TA)5
VIC
(AG)5
TET
(TCT)4
TET
(AT)5
HEX
(AT)9
6-FAM
(AG)8
NED
(AT)4(T)2
TET
(CTT)3(T)3(CTT)6
VIC
PET: rojo, VIC: verde, 6-FAM: azul, NED: amarillo TET: verde
42 Panel
7
6
8
6
6
3
5
5
7
7
5
5
7
5
7
5
6
6
5
6
7
9
5
3
8
8
6
6
9
6
Los marcadores fueron diseñados a partir de regiones codificantes (génicos) y no
codificantes (genómicos) de Phaseolus vulgaris (Blair et al., 2003; Gaitan-Solis et
al., 2002; Yu et al., 2002). Dicha amplificación fue hecha en el laboratorio de
Caracterización de Germoplasma de Fríjol del CIAT; los modelos de los
termocicladores usados para tal fin fueron PTC-100TM y PTC-200TM (Programmable
Thermal Controller) del fabricante MJ Research, INC. Los pasos básicos para
realizar una PCR se muestran el la figura 5.
Amplificaciones individuales de PCR de cada microsatélite fueron llevadas a cabo
en un volumen final de 15 µL por reacción con 15ng de ADN; los reactivos
necesarios y condiciones requeridas para realizar el coctel o mezcla para la
amplificación de los microsatélites marcados con fluorocromos se muestran en la
tabla 7. El extremo 5’ (Forward), de los primers seleccionados, estaba marcado con
los
siguientes
fluorocromos:
hexachloro-6-carboxyfluorescein
(HEX),
6-
carboxyflourescein (6-FAM), (NED), (PET), y (VIC), y sintetizada en Applied
Biosystem 3730xl (Applied Biosystem, Foster City, Calif), facilitado por el centro de
recursos biotecnológicos (BRC) de la universidad de Cornell, USA.
Tabla 7. Reactivos necesarios para coctel PCR, condiciones necesarias y concentraciones
originales (stock).
Reactivo
Condiciones
Requeridas
[ ] soluciones
Originales
1X
10X
MgCl2
1.5mM
25mM
dNTP's
0.2mM
20mM
Primer
3pmol/rxn
2µL
Buffer PCR
taq [1:10]
0.15µL
ADN
25ng/µL
Volumen final = 15µL (5µL ADN + 10µL mix)
La composición del buffer PCR (100 mM Tris HCl pH 7.2; 500 mM KCl)
43 El programa de PCR para la amplificación consistió en una denaturacion fuerte
durante 2 minutos, seguida de 30 ciclos de denaturación a 95°C cada uno de 30
segundos; una etapa de hibridación a 55°C durante 30 segundos; extensión a 72°C
durante 50 segundos; y una extensión final de 72°C durante 45 minutos. Se tomaron
2µL del producto de PCR de cada reacción de cada microsatélite y 9µL de agua
HPLC, se realizó una mezcla en una placa nueva de 96 pocillos, teniendo en cuenta
que la mezcla de cada reacción debía tener producto de los cuatro primers teñidos
con fluorocromos (PET: Rojo; VIC: Verde; 6-FAM: Azul; NED: Amarillo) (Blair et al.,
2002).
Se establecieron 5 paneles (5, 6, 7, 8 y 9) cada uno con la presencia de 4
marcadores (Comunicación Personal M.W Blair mejorador de fríjol, CIAT 2006),
teniendo en cuenta que para hacer esta mezcla los marcadores deben tener
diferente tamaño y sí éstos se sobrelapan en tamaño, deben ser diferenciados
mediante el uso de colores diferentes (Joe et al., 2004). En el Anexo 2 se muestran
los marcadores utilizados para este estudio y la forma de organización de estos
dentro de cada panel. Se determinó que se debían agregar dos marcadores más
(BM165 y BMd45), por lo que se hizo el arreglo de un panel adicional.
De esta mezcla se tomaron 0.5 µL para adicionarlo con 9 µL de Formamida Hi Di,
0.06µL de Liz 500 estándar, 0.44µL de agua, es decir un volumen final de 10µL para
cada reacción; cada placa de 96 pozos se sometió a denaturación a 94°C durante 3
minutos para finalmente ser analizada en el secuenciador ABI 3730xl.
5.2.4
Análisis en secuenciador Analítico ABI 3730xl
Los microsatélites marcados con etiquetas fluorescentes (fluorocromos) de colores
verde, azul, amarillo y rojo, fueron analizados automáticamente en un secuenciador
de ADN Applied Biosystem 3730xl (Applied Biosystem, Foster City, Calif) facilitado
por el centro de recursos biotecnológicos (BRC) de la universidad de Cornell USA,
el cual detecta la muestra a través de un sistema de electroforesis capilar; en el
anexo 3 se puede observar el ciclo que sigue la muestra en el secuenciador.
44 Los datos de la muestra leída mediante el secuenciador ABI 3730xl, fueron
analizados automáticamente por el software GeneMapper v.3.7, el cual interpreta el
lenguaje análogo de las lecturas que hace el secuenciador y realiza la identificación
de picos y tamaños en los electroferograma generados por la evaluación de
unidades fluorescentes por tiempo de elución. Este software combina la información
del archivo de la muestra con análisis preconfigurados y calibraciones estándar; las
muestras procesadas luego fueron vistas, editadas y analizadas en una ventana
generada por el software (AppliedBiosystems, 2004; Joe et al., 2004).
En la figura 5 se observa el procedimiento que sigue la muestra una vez se han
efectuado las amplificaciones y se ha realizado la mezcla. La muestra entra al
secuenciador, posteriormente un software colecta la información analizada y
procede a ser leída en otro software autoanalizador el cual puede encontrarse en
otro computador con conexión remota, el cual recoge los datos mediante un
servidor.
Secuenciador ABI 3730
Muestra Preparada Software colector de datos
Servidor
Software Auto‐analizador GeneMapper
Figura 5. Diagrama del procedimiento que sigue la muestra a analizar (líneas azules
gruesas señalan cada paso): entra al secuenciador ABI 3730xl, es colectada por un software
y se analiza con GeneMapper v.3.7. Modificado de (Joe et al., 2004).
45 5.2.5
Cuantificación de hierro y zinc
Los genotipos analizados en este estudio corresponden a la colección de frijol de
Ruanda, que incluye semilla de color blanco, rojo, rojo moteado, café, crema y
crema moteado, amarillo y amarillo moteado, rosado, púrpura y negro; con tamaños
de semilla que se encontraban desde pequeña, mediana y grande. El contenido de
minerales, hierro y zinc, fue evaluado mediante la técnica de espectroscopía por
absorción atómica (AA). El proceso de obtención de datos para la realización del
análisis de minerales, fue realizado previamente a este estudio en el laboratorio de
caracterización de germoplasma de fríjol de CIAT.
Para llevar a cabo este procedimiento, se pesaron aproximadamente 3 gramos de
semillas por cada genotipo, las cuales fueron lavadas y limpiadas con agua
destilada y gasa, posteriormente se secaron en un horno a 40°C durante dos días y
finalmente se molieron en un molino Retsch modificado en cámaras de teflón y con
balines de zirconio con volumen de 25 ml. El polvo obtenido se envasó y etiquetó en
frascos de plástico herméticamente sellados.
Una vez obtenido el material, las muestras fueron enviadas al Departamento de
Servicios Analíticos del CIAT para analizarlas por AA. Las ecuaciones de calibración
para predecir el contenido de hierro y zinc fueron obtenidas mediante el software
winISI III Project Manager v 1.60, con el modelo matemático de Mínimos Cuadrados
Parciales (PLS).
5.2.6
Identificación de características de grano
La semilla fue registrada fotográficamente mediante el escaneo digital de 4 semillas,
esto con el fin de tener la información visual del color, tamaño y forma de cada
genotipo. Se realizó una clasificación de la semilla de acuerdo con su patrón de
coloración siguiendo el Catálogo de líneas avanzadas de fríjol del CIAT 1995, ver
tabla 8, en donde cada color se representa con un número (1-9), al igual que el brillo
de la semilla (1-3) y el patrón de coloración con una letra (R, J, M, P, V), Anexo 4:
46 Tabla 8. Parámetros de descripción para características de la semilla de fríjol; basado en el
catalogo de líneas avanzadas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 5.3
Color de Semilla Blanco Bayo, Crema Amarillo Café, Marrón Rosado Rojo Morado, Púrpura Negro Gris o Raros Brillo de Semilla 1 Opaco 2 Semi‐Brillante 3 Brillante Patrón de Color M Moteado J Jaspeado R Rayado P Punteado V Venación ANÁLISIS DE DATOS
5.3.1
Análisis de Diversidad Genética
Como primer paso para el análisis de la diversidad se llevó a cabo la determinación
de alelos mediante el software GeneMapper v.3.7 (AppliedBiosystems, 2004), el
cual generó un archivo en Excel que registró para cada genotipo los alelos en cada
uno de los loci.
A continuación se construyó una matriz de similaridad genética basada en la
proporción de alelos compartidos (PS) calculado con el módulo IML/SAS, esta es
una medida adecuada para datos de individuos diploides analizados con
microsatélites; este proceso realizado de esta manera es una herramienta útil para
los análisis de similaridad genética cuando existe una pequeña porción de datos
faltantes por la no amplificación de determinados loci (Comunicación Personal M.C.
Duque consultora estadística CIAT, 2007). La elaboración de esta nueva matriz de
similaridad se llevó a cabo mediante el paquete estadístico SAS el cual utiliza la
siguiente fórmula:
/
i locus número total de loci 30. Psi proporción de alelos compartidos en locus i.
47 A partir de la construcción de la matriz de similaridad fue posible efectuar dos tipos
de análisis: un análisis multivariado de Coordenadas Principales (PCoA) y la
obtención de dos representaciones gráficas: una gráfica de 3D y un dendrograma
utilizando distancia Euclidiana.
El PCoA es una técnica descriptiva de análisis multivariado que representa en un
espacio multidimensional la asociación de las bandas alélicas derivadas de los
genotipos estudiados; el nivel de asociación se determina de acuerdo a la cercanía
que presenten los genotipos en el gráfico de tres dimensiones resultante. Resuelve
relaciones complejas en interacciones de factores más simples y menos numerosos
(Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Las coordenadas de ubicación obtenidas para cada genotipo fueron graficadas
mediante SAS-GRAPH modulo G3D para gráficas, Proc cluster para generación de
grupos, lo cual permitió determinar conjuntos de genotipos de acuerdo con el perfil
molecular obtenido; en NTSYS se hizo una descomposición espectral mediante el
módulo EIGEN, se crearon las coordenadas de cada punto en el nuevo espacio
definido por las coordenadas principales; se realizó un proceso de agrupamiento en
SAS y con el criterio de R2 y se eligió el número de grupos (Comunicación Personal
M.C Duque consultora estadística, CIAT 2007). Esta representación gráfica refleja la
similaridad genética entre genotipos en términos de distancias geométricas, definida
por la proporción de alelos compartidos; esto permitió establecer la estructura del
conjunto de individuos estudiados (Ayad et al., 1997).
El siguiente paso fue la obtención del dendrograma el cual tiene las coordenadas
del PCoA utilizando distancia euclidiana y el método de agrupamiento UPGMA
mediante los módulos GRAPHICS y TREE PLOT del programa NTSYS v 2.10
(Rohlf, 2002).
5.3.1.1 Parámetros de uso común de diversidad para población total
Se midieron los parámetros de uso común tales como: Heterocigocidad Observada,
Diversidad Genética de Nei (1987) y número de alelos encontrados para cada
marcador, mediante el programa estadístico Powermarker V3.25 (Liu & Muse,
2005),
48 La Heterocigocidad observada corresponde a la proporción de individuos
heterocigotos en la población. Para un locus es estimada como (Weir, 1996):
1
locus l‐ésimo Frecuencia del genotipo
en el locus
é
en la población
La diversidad genética se define en términos de frecuencias génicas y usualmente
se refiere a la Heterocigocidad esperada; es definida como la probabilidad de que
dos alelos que sean escogidos aleatoriamente de la población sean diferentes.
Según Weir en 1996 un estimador insesgado de la diversidad genética en el locus
th es (Liu & Muse, 2005):
1
/ 1
1
= alelos en el locus l locus lth Frecuencia del alelo en el locus th en la población
Número de individuos muestreados
coeficiente de endogamia
5.3.1.2 Parámetros de uso común de diversidad para grupos
formados a partir de PCoA
Los parámetros tenidos en cuenta fueron los mismos que se utilizaron
en la
caracterización de la diversidad genética polimorfismo, Heterocigocidad observada,
Diversidad genética, entre los grupos definidos a partir de PCoA, para este fin se
utilizó el software Popgene v1.32 (Yeh et al., 1997).
5.3.1.3 Coeficiente de similaridad
Con el fin de observar otra forma de agrupación de los datos se utilizó un método
diferente al de PCoA, usando el software Darwin v. 5.0.149. A partir de una matriz
binaria de los alelos presentes en el estudio, se estimó el índice de disimilaridad de
49 DICE, que utiliza la fórmula a continuación expuesta. El módulo para dibujar el árbol
fue NeighborJoining.
2
: disimilaridad entre unidades i y j : número de variables donde xi presencia y xj presencia : número de variables donde xi presencia y xj ausencia
: número de variables donde xi ausencia y xj presencia
Este método fue propuesto por Saitou y Masatoshi Nei (1987), basado en el
principio de parsimonia y consiste en la unión de los genotipos más cercanos
(vecinos) tratando de minimizar la longitud total del árbol.
5.3.2
Análisis de cuantificación de minerales
Con base en estudios previos de cuantificación de minerales realizados para la
colección núcleo del CIAT (Beebe et al., 2000a; Islam et al., 2002a), se consideró lo
siguiente (tabla 9):
Tabla 9. Rango de valores medidos en ppm para interpretación de resultados de
cuantificación de minerales (hierro y zinc).
Bajo
Medio
Alto
Hierro
Zinc
<50ppm
<20ppm
51-60ppm
21-30ppm
>61ppm
>31ppm
Se analizaron los datos mediante estadística descriptiva en el programa SAS, este
análisis incluyó valores máximos, mínimos, promedio, coeficiente de variación,
desviación estándar, varianza y curtosis. Se elaboraron histogramas con el fin de
determinar la distribución de datos en la población de estudio. Se elaboraron
pruebas ANOVA con el fin de comparar los grupos generados a partir del análisis de
diversidad (PCoA) y poder reconocer si había o no diferencias significativas,
50 posteriormente se realizó una prueba para ajustar medias llamada Least Square
Means y se hizo una prueba de separación de medias de rango múltiple (RyanEinot-Gabriel-Welsch), mediante el paquete estadístico SAS.
5.3.3
Características morfológicas
Se realizaron gráficas que muestran la distribución porcentual de cada característica
morfológica presentada por los individuos dentro de la población total. Adicional a
esto se realizaron tablas de contingencia que permitieron describir la distribución de
cada característica dentro de los grupos formados a partir de PCoA
51 6
6.1
RESULTADOS
ANÁLISIS DE DIVERSIDAD GENÉTICA
6.1.1
Diversidad Genética y estructura Poblacional
6.1.1.1 Determinación de alelos
Una vez se obtuvieron los electroferogramas se realizó la lectura de alelos
presentes para cada marcador. En la figura 6 se muestra la amplificación de 4
marcadores para un mismo individuo, (GATs91, BMd20, BMd08 y BM172)
pertenecientes al panel 5A. Como se puede observar cada marcador fue etiquetado
con un fluorocromo de color diferente: 6-FAM (azul), NED (amarillo), PET (rojo), y
VIC (verde).
MARCADOR
Figura 6. Electroferograma obtenido a partir del análisis por ABI 3730xl y generado por el
software GeneMapper v.3.7. Se muestra la amplificación de 4 microsatélites marcados con
fluorocromos 6-FAM (Azul), PET (Rojo), VIC (Verde) y NED (Amarillo; en la gráfica con color
negro), para un mismo individuo. Los picos representan la intensidad de fluorescencia (eje
vertical) y tamaños estimados en nucleótidos (eje horizontal).
52 En la figura 7 se presentan los mismos 4 marcadores de la figura anterior; en este
caso se sitúan en un solo plano con el marcador estándar denominado LIZ 500, el
cual fue efectivo para estimar los pesos moleculares de todos los productos de PCR
amplificados a lo largo de los paneles.
Figura 7. Electroferograma obtenido a partir del análisis por secuenciador ABI 3730xl y
generado por software GeneMapper v.3.7. Se muestra la distribución de los picos (zapote)
del marcador estándar LIZ-500 junto con los marcadores del panel 5A. Nuevamente los
picos representan la intensidad de fluorescencia (eje vertical) y tamaños estimados en
nucleótidos (eje horizontal).
6.1.1.2 Población Total
Para el análisis de la población de 359 genotipos (incluyendo los 4 controles de
diversidad genética) mediante el uso de 30 microsatélites marcados con
fluorescencia, fue posible encontrar 301 alelos en total para toda la población en
estudio, un valor alto sí es comparado con otros estudios también de microsatélites
(Blair et al., 2007; Díaz & Blair, 2006) en los que no se encontró un valor superior a
270 alelos. Uno de los promedios de alelos más altos fue el encontrado por Blair y
53 colaboradores en el 2006, quienes obtuvieron 7.8 por marcador, sin embargo el
valor encontrado en este estudio sigue siendo superior (ver tabla 10).
Tabla 10. No de Alelos, Diversidad Genética y Heterocigocidad observada de los 30
microsatélites (16 Genómicos y 14 Génicos) utilizados en este estudio.
Marcador
AG01
BM139
BM143
BM156
BM160
BM165
BM172
BM175
BM183
BM187
BM188-a
BM188-b
BM201
BM205
GATs54
GATs91
Media Genómicos
Marcador
BMd01
BMd02
BMd08
BMd16
BMd17
BMd18
BMd20
BMd45
BMd46
BMd47
Pv-ctt001
Pv-ag003
Pv-gaat001
Pv-cct001
Media Génicos
MEDIA TOTAL
Genómicos
No de Alelos
6
11
31
18
16
9
9
12
14
40
4
16
9
7
3
19
14
Génicos
No. ind obs.
No de Alelos
349
16
355
2
356
5
344
6
359
5
357
5
356
5
357
4
349
4
350
4
358
5
355
3
358
9
349
4
353.7
5.5
354.18
10.16
No. ind obs.
355
358
353
358
356
358
356
359
357
348
358
353
337
356
357
354
354.6
: Marcadores con mayor número de alelos
Ve
Verde: Marcadores con alta diversidad genética
Diversidad Genética
0.32
0.52
0.89
0.88
0.66
0.85
0.51
0.78
0.81
0.92
0.51
0.85
0.72
0.66
0.52
0.91
0.71
Ho*
0.14
0.13
0.44
0.31
0.13
0.18
0.13
0.14
0.17
0.41
0.01
0.65
0.18
0.02
0
0.2
0.2
Diversidad Genética
0.81
0.5
0.53
0.57
0.67
0.32
0.66
0.49
0.5
0.51
0.72
0.51
0.56
0.02
0.53
0.62
Ho*
0.61
0.12
0
0.11
0.3
0.12
0.22
0.09
0
0.01
0.39
0
0.43
0.01
0.17
0.19
Magenta: Marcadores con mayor Heterocigocidad observada
*Ho: Heterocigocidad Observada
54 Todos los marcadores fueron polimórficos; se destacaron BM143 y BM187 por
presentar el número más alto de alelos dentro de la población de estudio, lo cual
coincide con el estudio de razas andinas (Diaz, 2005a), en el que se reporta al
marcador BM143 como muy polimórfico. Estos dos marcadores junto con GATs91
presentan también los valores más altos de diversidad genética.
Los marcadores BM188b y BMd01 presentaron alto número de individuos
heterocigotos (tabla 10), lo que indica que estos marcadores son menos útiles para
estudios en un futuro por la posible presencia de bandas inesperadas que pueden
inflar el resultado de la Heterocigocidad observada, ya que la mayoría de
marcadores presentan este valor por debajo de 0.20; otros marcadores
problemáticos pueden ser: BM143, BM156, BM187, BMd17, BMd20, Pv-ctt001 y Pvgaat001, por presentar altos valores para este índice.
Al hacer la comparación del promedio de número de alelos entre los dos tipos de
marcadores utilizados, es posible observar que los genómicos presentan valores
más altos que los marcadores génicos. De la misma forma el índice de diversidad
genética fue mayor para los genómicos. Estos resultados son coherentes y
corresponden con los presentados por Blair y colaboradores y Díaz & Blair en 2006,
quienes reportan que los marcadores genómicos presentan mayor número de alelos
y diversidad genética. Por otra parte se observa que el número de alelos en los
marcadores genómicos fluctúa entre 3 y 40, mientras que en los génicos presentan
valores muy similares, es decir no están variando de la misma forma que los
genómicos.
Para los marcadores Pv-cct001 (génico) y AG01 (genómico) se encontraron los
valores más bajos de diversidad genética, sin embargo es posible observar una
amplia diferencia numérica entre estos dos valores, mostrando que los marcadores
genómicos tienen diversidad mucho más alta. Por otra parte, los marcadores BM187
(genómico) y BMd01 (génico) presentaron el número máximo de alelos encontrados
para un locus dado dentro del conjunto completo de genotipos; se aprecia una
amplia diferencia numérica entre los dos tipos de marcadores.
Se realizó una prueba F para comparar las varianzas de los parámetros de
diversidad para los dos tipos de marcadores; esta prueba demostró que las
55 varianzas no son estadísticamente diferentes. Luego se realizó una prueba t de
comparación de medias para los mismos parámetros y se encontró que la
diversidad genética promedio para los marcadores génicos difiere significativamente
del promedio encontrado para los genómicos. En la tabla 11 se muestran los
resultados para cada parámetro dentro de cada tipo de marcador, la prueba
completa se muestra en el anexo 5.
Tabla 11. Prueba t para comparar parámetros de diversidad (Heterocigocidad Observada y
Diversidad Genética) entre marcadores genómicos y génicos.
Tipo de
marcador
N
Genómicos
Génicos
16
14
Het. Obs
Prom
0.2
0.17
Var
0.02
0.03
D. Genética
Prom*
0.7
0.52
Var
0.034
0.035
* : Promedios significativamente diferentes P<0.013
NOTA: en cada prueba realizada, hubo homogeneidad de varianza
6.1.1.3 Análisis de Ordenación
El análisis de ordenación permitió determinar de forma contundente la existencia y
separación de los dos acervos principales del fríjol común, en la colección de
germoplasma de Ruanda. Mediante el método de ordenación conocido como
Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) y su representación gráfica en tres
dimensiones (Figuras 8 y 9), se mostró la presencia de agrupamientos dentro de los
genotipos analizados, los cuales tienen correspondencia con la estructura de
acervos Andino y Mesoamericano propuesta en diversos estudios morfológicos
(Singh et al., 1991b), bioquímicos (Gepts & Bliss, 1986; Koenig & Gepts, 1989) y
moleculares (Beebe et al., 2001; Beebe et al., 2000b; Blair et al., 2006; Díaz & Blair,
2006). La representación gráfica en tres dimensiones permite observar la estructura
y las distancias geométricas del conjunto de los genotipos estudiados, definidas por
la proporción de alelos compartidos, siendo esto un reflejo de la similaridad genética
existente entre los mismos. Una de las grandes ventajas de este tipo de gráficos en
3D es que se puede observar las relaciones de cada genotipo con todos los demás
del estudio, siendo ésta representación mucho más didáctica y menos lineal que los
dendrogramas en los cuales no se permite observar todas las diferentes relaciones
que ocurren entre uno y todos los genotipos; es posible decir que las distancias que
manejan los dendrogramas pueden estar solapando otras importantes ya que
56 muestran una agrupación de un individuo a un grupo específico pero teniendo en
cuenta solo un criterio de distancia (Comunicación Personal M.C Duque consultora
estadística, CIAT 2007).
Andino
CONTROLES
Meso I
Meso II
DOR 364
Meso III
ICA‐PIJAO
Meso IV
CALIMA
G19833
Introgresados
Individuo Raro 1
Individuo Raro 2
Figura 8. Representación gráfica en tres dimensiones de la distribución y ubicación espacial
de los genotipos de Ruanda a partir del Análisis de Coordenadas Principales (PCoA),
teniendo en primer plano horizontal la dimensión 2. Controles de cada acervo encerrados en
círculos. El grupo señalado corresponde un posible grupo de individuos introgresados.
Las
accesiones
utilizadas
como
controles,
andinas
(círculos
azules)
y
Mesoamericanas (círculos rojos), se ubicaron respectivamente como se esperaba
57 en los diferentes grupos, Calima y G19833 dentro del grupo Andino y en el grupo de
los Mesoamericanos DOR364 e ICA-PIJAO. Figura 9. Representación gráfica en tres dimensiones de la distribución y ubicación espacial
de los genotipos de Ruanda a partir del Análisis de Coordenadas Principales (PCoA),
teniendo en primer plano horizontal las dimensiones 1 y 2
De acuerdo a lo visualizado en la figura 8 en la que se tiene como primer plano la
dimensión 2, se puede describir la forma en la cual se distribuye la variabilidad de la
siguiente manera: la dimensión 2 separa por completo los acervos Andino y
Mesoamericano dejando en el centro algunos individuos que posiblemente sean
candidatos de introgresión ya que tienden a fluctuar entre los dos grupos
principales, algunos de estos genotipos corresponden al grupo de Mesoamericanos
II (trébol verde encerados por una línea azul) y los otros son los genotipos
representados con cruces azules.
58 A diferencia del grupo de Andinos, dentro del acervo Mesoamericano se puede
observar que hay una subdivisión a nivel de la dimensión 3 que parte a este grupo
en cuatro: Mesoamericanos I (círculo azul), Mesoamericanos II (trébol verde),
Mesoamericanos III (Rombo fucsia) y Mesoamericanos IV (estrella negra). Sin
embargo comparten elementos en las dimensiones 1 y 2 razón por la cual se
encuentran agrupados dentro del gran grupo Mesoamericano, reflejando similaridad
en su composición alélica.
El grupo de las cruces constituye individuos muy diversos que pueden estar en parte
relacionados con el grupo de Mesoamericanos I y con los Andinos puesto que están
a la misma altura y forma un puente a través de la dimensión 2. Además, estos
individuos pueden estar compartiendo características con los grupos de los
Mesoamericanos III y nuevamente los Andinos, ya que se observa en la dimensión 2
la aparición de parte de estos individuos dentro de estos grupos. Por lo tanto, de
acuerdo a esta distribución en estos diagramas este grupo (cruces azules) puede
corresponder a eventos de introgresión
En la figura 9 los individuos candidatos a ser determinados como introgresados se
muestran dispersos en el diagrama, entrando al conjunto de los dos acervos
principales. Por otra parte, se puede observar que los dos individuos RW226 y
RW269 se consideran como raros debido a que en esta perspectiva se muestran
como individuos completamente separados en el estudio; en la figura 10 se muestra
su registro fotográfico, se caracterizan por ser de grano pequeño de color rojo,
características típicas del acervo mesoamericano.
RW226
RW269
Figura 10. Individuos considerados como raros a partir del análisis de coordenadas
principales.
59 Por otra parte, a partir del análisis de coordenadas principales se elaboró un
dendrograma (figura 11) en el que se muestran la separación y definición de dos
grupos principales con una similaridad promedio de 0.85. De acuerdo con los
controles de diversidad que se tuvieron en cuenta fue posible establecer a que
acervo
pertenecían
los
genotipos
en
estudio.
Es
posible
determinar
la
predominancia del acervo Mesoamericano con respecto al Andino, con un total de
208 genotipos contra 132; el resto de individuos son los que posiblemente sean
introgresados, sin embargo no se ubican en esta figura ya que a la distancia de
Mesoamericanos
similaridad de 0.85 solo se dividen los dos acervos principales.
ICA
DOR
Andinos
1 0 3 MW
G19
CAL
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Coeficiente de distancia euclidiana
Figura 11. Dendrograma de acervos genéticos obtenido por distancia euclidiana aplicada a
coordenadas obtenidas por PCoA. En la parte superior izquierda en rojo se encuentra el
grupo Mesoamericano con sus respectivos controles en azul y en la inferior el grupo Andino
en verde y sus controles en amarillo.
60 En los dendrogramas de las figuras 12A, 12B y 12C se determina de manera más
detallada las agrupaciones formadas dentro de cada acervo, se observa que el
grupo de los Andinos no sufrió una subdivisión mientras que el Mesoamericano tuvo
4. Con fines ilustrativos la gráfica se dividió en tres partes.
103
438
596
257
595
MI: Mesoamericanos grupo 1
MII: Mesoamericanos grupo 2
MIII: Mesoamericanos grupo 3
MIV: Mesoamericanos grupo 4
A: Grupo de Andinos
I: Grupo de Introgresados
134
400
175
266
465
500
586
151
258
415
152
158
606
273
181
211
556
582
238
518
207
77
557
59
563
110
MI
119
145
96
440
112
122
121
124
128
126
143
185
240
267
328
147
605
270
87
166
187
429
436
242
95
156
572
21
550
23
39
421
38
530
408
445
284
285
101
136
492
140
196
153
186
102
441
682
73
76
69
71
133
188
434
679
61
M III
157
277
64
180
176
182
235
72
244
74
177
66
184
62
70
428
150
444
410
234
281
676
105
107
142
287
137
149
209
141
146
192
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Coeficiente de distancia euclidiana
Figura 12A. Dendrograma de acervos genéticos obtenido por distancia euclidiana aplicada a
coordenadas obtenidas por PCoA. Muestra dos grupos formados en el acervo
Mesoamericano (MI y MIII).
En la figura 12A se observan algunas discrepancias para genotipos de un grupo
determinado que fueron asignados en otro diferente; por ejemplo dos individuos
(marcados con color fucsia) del MIII se ubican dentro de MI (marcados con color
azul claro). Algunos individuos que aparecieron como posibles candidatos a ser
61 introgresados en las figuras 8 y 9 se ubicaron dentro de los grupos de
Mesoamericanos I y IV, (fig 12A se señalan con líneas azules oscuras gruesas).
199
144
109
139
154
MI: Mesoamericanos grupo 1
MII: Mesoamericanos grupo 2
MIII: Mesoamericanos grupo 3
MIV: Mesoamericanos grupo 4
A: Grupo de Andinos
I: Grupo de Introgresados
278
459
575
127
16
243
155
ICA
104
274
259
12
597
170
DOR
114
115
275
116
118
Individuos raros: Líneas rojas
en MIV y en I.
130
319
M II
320
236
117
129
131
312
58
570
159
81
94
212
82
80
93
88
271
24
260
25
564
461
647
272
509
255
507
171
172
568
174
92
10
103MW
17
15
574
11
554
M IV
165
224
539
567
90
19
1
27
28
540
269
603
26
3
601
37
536
522
M-I?
573
20
620
667
247
498
279
655
I
426
613
604
268
611
357
678
226
162
44
36
41
40
193
386
A
227
231
4
89
204
32
31
45
229
526
5
35
552
523
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Coeficiente de distancia euclidiana
Figura 12B. Dendrograma de acervos genéticos obtenido por distancia euclidiana aplicada a
coordenadas obtenidas por PCoA. Muestra los grupos formados en el acervo
Mesoamericano (MII y MIV), al igual que un grupo de introgresados y parte de los andinos y
un posible grupo nuevo de introgresados que se separa de MII.
En el dendrograma 12B se ve delimitado el grupo de los MII (color verde) dentro del
cual se ubican los dos controles; al igual que en las gráficas 8 y 9, se puede
observar que un grupo de individuos de MII se separó del gran grupo y se ubican
hacía la posición de los Andinos muy cerca de los introgresados; lo que podría
sugerir que las dos gráficas muestran a estos individuos como un posible nuevo
62 grupo de introgresados, sugiriendo flujo de genes entre acervos. Por otra parte en la
representación del dendrograma 12B se ubican los individuos raros como líneas
rojas dentro del grupo de MIV y dentro de un grupo de posibles Introgresados.
475
201
220
6
253
MI: Mesoamericanos grupo 1
MII: Mesoamericanos grupo 2
MIII: Mesoamericanos grupo 3
MIV: Mesoamericanos grupo 4
A: Grupo de Andinos
I: Grupo de Introgresados
325
479
78
55
7
9
219
609
630
385
397
404
221
538
249
290
303
298
299
625
481
216
302
516
310
454
316
468
389
640
514
205
223
333
218
206
297
54
8
214
373
33
340
34
215
232
217
321
383
375
335
A
542
359
103MW
336
371
288
291
368
341
50
345
338
296
47
G19
191
476
399
246
289
480
245
393
474
636
631
637
634
295
194
497
311
56
329
377
46
49
478
283
292
464
48
384
672
282
332
376
374
CAL
370
390
394
379
301
164
230
674
30
189
43
326
163
528
642
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Coeficiente de distancia euclidiana
Figura 12C. Dendrograma de acervos genéticos obtenido por distancia euclidiana aplicada a
coordenadas obtenidas por PCoA. Muestra dos grupos formados en el acervo
Mesoamericano (MI y MIII).
El grupo de los genotipos pertenecientes al acervo Andino, líneas de color rosado
pálido, se ubica en parte de la figura 12B y se completa este grupo en la figura 12C;
para este estudio este acervo no tiene subdivisión; los controles están mucho más
separados que los controles Mesoamericanos lo que puede sugerir la presencia de
razas diferentes. Mientras tanto hay una agrupación de individuos mayormente
introgresados que se ubican dentro de los andinos al final de la figura 12C.
63 6.1.1.4
Grupos definidos mediante PCoA
El análisis de coordenadas principales permitió definir 6 grupos en total: un grupo de
Andino, 4 grupos dentro de Mesoamericanos: I, II, III y IV y un grupo llamado
introgresados. Como se muestra en la tabla 12, el grupo de Andinos fue el que más
individuos y número de alelos presentó, no obstante este alto valor puede estar
relacionado con el hecho que este grupo no se dividió en subgrupos. A pesar de
esto, el valor más alto para diversidad genética, medida a partir del índice de Nei, se
encontró en el grupo de los individuos que posiblemente sean considerados como
introgresados. El segundo valor más alto calculado para diversidad se encuentra en
el grupo de los Mesoamericanos II, sin embargo dentro de este grupo puede existir
un grupo de individuos introgresados (figura 8), por lo que se podría sobrestimar la
diversidad de este grupo.
Tabla 12. Descriptores de diversidad para 6 grupos definidos por PCoA. Con fines
ilustrativos, las celdas se han coloreado para diferenciar las variables; el tamaño de la barra
de color es proporcional al número que aparece en la misma permitiendo hacer una
comparación de cada variable entre grupos.
Grupos Poblacionales No Indiv
Andino
Meso I
Meso II
Meso III
Meso IV
Introgresados
132
65
79
43
21
17
Media No
Alelos
7.53
5.33
6.46
4.03
3.73
4.86
H(Nei)
0.420
0.433
0.495
0.354
0.391
0.586
No loci
polimorficos
29
29
30
28
28
29
% loci
polimorficos
96.67
96.67
100
93.33
93.33
96.67
Con el fin de hacer una comparación más general de los acervos de fríjol es posible
establecer 3 grupos, uniendo los 4 Mesoamericanos a partir de los datos generados
por PCoA; en la tabla 13 se presenta la comparación de estos. El comportamiento
observado para cada una de las poblaciones fue similar al de la población total pues
los marcadores genómicos fueron más polimórficos y presentaron mayor diversidad
que los génicos. Por otra parte, la diferencia numérica en cuanto al polimorfismo
entre los grupos Mesoamericano y Andino no fue muy amplia, ya que solo se
diferenciaron en un alelo; de la misma forma sucede con el índice de diversidad no
existe una amplia diferencia numérica entre estos dos grupos. El grupo de
introgresados sigue presentando el valor más alto para la diversidad genética.
64 Tabla 13. Descriptores de diversidad (Número de alelos y Diversidad genética de Nei) para
30 loci SSR en población definida a partir de PCoA. Con fines ilustrativos, las celdas se han
coloreado para diferenciar las variables; el tamaño de la barra de color es proporcional al
número que aparece en la misma y permite hacer una comparación de cada variable entre
marcadores génicos y genómicos.
Mesoamericanos
Marcador
AG01
Andinos
Introgresados
No de Alelos
H(Nei)
No de Alelos
H(Nei)
No de Alelos
H(Nei)
6
0.0982
3
0.4954
3
0.4239
BM139
7
0.0801
8
0.7836
7
0.4446
BM143
20
0.8181
24
0.8845
7
0.7949
BM156
10
0.7818
13
0.8462
8
0.8183
BM160
9
0.2086
15
0.8788
9
0.6522
BM165
8
0.8155
7
0.5212
6
0.7889
BM172
6
0.0613
8
0.7876
6
0.4014
BM175
10
0.6158
7
0.5605
7
0.7093
BM183
11
0.7301
11
0.5437
4
0.6436
BM187
17
0.8706
35
0.9320
9
0.8547
BM188-a
4
0.5454
2
0.1400
3
0.6016
BM188-b
15
0.8604
12
0.7775
12
0.84
BM201
9
0.6602
6
0.1145
5
0.6348
BM205
6
0.4284
5
0.4955
5
0.7266
GATs54
3
0.4355
3
0.3585
2
0.3599
GATs91
16
0.8516
12
0.7799
10
0.8564
BMd01
15
0.7353
13
0.5996
7
0.8244
BMd02
2
0.2523
2
0.0301
2
0.4922
BMd08
5
0.5746
2
0.2829
3
0.6367
BMd16
6
0.3910
5
0.1940
3
0.4941
BMd17
5
0.6146
4
0.1288
4
0.6436
BMd18
5
0.3981
3
0.1783
3
0.2145
BMd20
5
0.5491
3
0.1168
3
0.6228
BMd45
2
0.0959
4
0.0965
2
0.4844
BMd46
3
0.3085
2
0.2159
3
0.5547
BMd47
3
0.2320
3
0.0543
2
0.4983
Pv-ctt001
5
0.6460
4
0.4873
4
0.6436
Pv-ag003
3
0.2584
1
0.0000
2
0.4297
Pv-gaat001
7
0.4253
7
0.5162
4
0.5069
Pv-cct001
4
0.0239
2
0.0239
1
0
Suma Total alelos
227
226
146
Media Genómicos
9.813
5.000
0.554
0.393
10.688
3.929
0.619
0.209
6.438
0.659
Media Génicos
3.071
0.503
MEDIA TOTAL
7.567
0.479
7.533
0.427
4.867
0.587
6.1.2
Posibles eventos de introgresión entre acervos
A partir del análisis de coordenadas principales se puede observar que existe un
grupo de individuos que pueden describirse como eventos de introgresión. En las
figuras 8 y 9 se muestran con un ícono azul en forma de cruz y se ven claramente
distribuidos en la mitad de cada gráfico, es decir fluctuando entre los dos grupos
principales.
65 Aunque en este estudio no se tengan los datos morfoagronómicos suficientes que
permitan establecer de manera definitiva rasgos aceptables para hablar de
introgresión, es posible observar que a pesar de que algunos individuos presenten
ciertas características morfológicas de semillas típicas de un acervo, estos son
clasificados o agrupados dentro de otro como respuesta a su perfil molecular
evaluado en 30 loci. Por ejemplo, en la figura 13a los individuos muestran
caracteres de semilla propios del acervo Mesoamericano (tamaño pequeño), sin
embargo en el dendrograma mostrado en la figura 12C se agrupan dentro del
acervo Andino.
RW 30
a
c
RW 105
RW 230
RW 43
RW 268
RW 285
RW 142
b
RW 674
RW 301
RW 426
RW 357
RW 107
RW 604
d
RW 284
RW 611
RW 613
RW 678
Figura 13. Individuos que se presentan como posibles eventos de introgresión dentro del
estudio; se divide la imagen de acuerdo con la agrupación observada en el dendrograma. a)
Individuos agrupados dentro de acervo Andino; b) Individuos agrupados dentro de acervo
Mesoamericano grupo I; c) Individuos agrupados dentro de acervo Mesoamericano grupo II;
d) Individuos agrupados dentro de acervo Mesoamericano pero no incluido dentro de ningún
grupo de Mesoamericano.
66 En el caso de los demás individuos presuntos de ser introgresados, se puede
observar (figura 13 b, c y d) que morfológicamente su semilla tiene características
típicas del acervo Mesoamericano (semilla de tamaño mediano-pequeño) y en
efecto en el dendrograma (figura 12A y B) se agrupan dentro de algunos grupos de
este acervo; no obstante se puede presumir a partir de los datos moleculares
obtenidos, que estos genotipos presentan algún tipo de introgresión ya que al
realizar el análisis de ordenación PCoA, éstos no se encuentran definidos dentro de
un grupo en particular sino que fluctúan entre los dos acervos principales (como se
muestra en las figuras 8 y 9).
Dentro de este mismo contexto, es de gran importancia resaltar la posible aparición
de un segundo grupo de introgresión, señalado en la gráfica 8 con un circulo azul.
Algunos individuos que se agruparon dentro del grupo de Mesoamericano II (a partir
del análisis de coordenadas principales), se encuentran formando un puente entre
éste y los andinos, como se señala en la misma gráfica, razón que permite pensar
que existe un posible flujo de genes entre acervos.
Se llevó a cabo un nuevo análisis de los parámetros de diversidad (tabla 14)
teniendo en cuenta el nuevo grupo de posibles introgresados, al cual se le ha
denominado Meso-Intro; como era de esperase, los valores no cambiarían dentro
de los grupos anteriormente analizados, excepto para el grupo de Mesoamericanos
II, debido a que se separaron 17 individuos de éste. El nuevo grupo formado (MesoIntro) tiene el segundo valor más alto de diversidad en comparación con los
Mesoamericanos y Andinos, lo cual resulta interesante ya que los dos grupos con
diversidad más alta son los que posiblemente sean considerados como
Introgresados.
La diversidad y el promedio de número de alelos en el grupo Mesoamericano II
disminuyen cuando se separa el grupo de posibles introgresados, esto se muestra
en la parte inferior de la tabla 14, al igual que la comparación de valores entre el
grupo general de los Mesoamericanos antes de la separación de Meso-Intro y
después de esta.
67 Tabla 14. Análisis de los parámetros de diversidad (Número de alelos y Diversidad genética
de Nei) para 7 grupos formados incluyendo el nuevo grupo considerado como introgresado
(Mesi-Intro). Se resaltan las columnas en azul claro para identificar los cambios obtenidos
con respecto a los análisis realizados para 6 grupos. Se muestra una tabla adicional en la
parte inferior que muestra los valores obtenidos en el grupo Meso II y Meso general, para los
mismos parámetros, antes y después de la separación del grupo Meso-Intro.
Meso I
Marcador
Meso II
No de H(Nei) No de
Alelos
Alelos
H(Nei)
Meso III
Meso IV
Introgresados
Meso-Intro
H(Nei)
No de
Alelos
H(Nei)
0.395
AG01
4
0.089
3
0.078
2
0.045
1
0.000
3
0.495
3
0.424
4
BM139
3
0.031
3
0.078
1
0.000
3
0.092
8
0.784
7
0.445
4
0.393
BM143
14
0.835
12
0.735
13
0.833
4
0.364
24
0.885
7
0.795
8
0.649
BM156
7
0.758
6
0.777
5
0.686
4
0.609
13
0.846
8
0.818
8
0.808
BM160
5
0.145
4
0.122
3
0.246
2
0.047
15
0.879
9
0.652
7
0.666
BM165
6
0.751
6
0.801
4
0.570
4
0.693
7
0.521
6
0.789
6
0.803
BM172
3
0.030
2
0.032
1
0.000
3
0.092
8
0.788
6
0.401
3
0.348
BM175
6
0.483
7
0.548
3
0.152
3
0.176
7
0.561
7
0.709
8
0.803
BM183
9
0.695
7
0.667
5
0.602
6
0.594
11
0.544
4
0.644
8
0.796
BM187
13
0.853
14
0.844
9
0.767
5
0.523
35
0.932
9
0.855
9
0.784
BM188-a
3
0.480
4
0.541
4
0.112
3
0.177
2
0.140
3
0.602
2
0.360
BM188-b
12
0.840
11
0.864
8
0.657
9
0.862
12
0.778
12
0.840
10
0.822
BM201
7
0.580
8
0.670
5
0.102
3
0.395
6
0.115
5
0.635
5
0.662
BM205
4
0.368
5
0.416
4
0.389
4
0.458
5
0.496
5
0.727
5
0.621
GATs54
2
0.401
2
0.271
3
0.511
2
0.172
3
0.359
2
0.360
2
0.484
GATs91
12
0.839
9
0.840
8
0.604
8
0.750
12
0.780
10
0.856
12
0.884
BMd01
10
0.696
11
0.712
9
0.715
12
0.795
13
0.600
7
0.824
8
0.760
BMd02
2
0.281
2
0.121
2
0.110
2
0.387
2
0.030
2
0.492
2
0.500
BMd08
3
0.555
4
0.599
4
0.522
3
0.390
2
0.283
3
0.637
3
0.519
BMd16
5
0.367
5
0.253
4
0.394
4
0.359
5
0.194
3
0.494
2
0.430
BMd17
4
0.522
5
0.562
4
0.395
3
0.595
4
0.129
4
0.644
3
0.638
BMd18
4
0.309
4
0.368
2
0.427
4
0.581
3
0.178
3
0.215
3
0.337
BMd20
4
0.560
4
0.511
2
0.392
3
0.520
3
0.117
3
0.623
4
0.545
BMd45
2
0.030
1
0.000
2
0.023
2
0.278
4
0.097
2
0.484
2
0.438
BMd46
2
0.346
2
0.228
2
0.093
3
0.335
2
0.216
3
0.555
2
0.469
BMd47
2
0.142
2
0.180
3
0.068
2
0.408
3
0.054
2
0.498
2
0.498
Pv-ctt001
3
0.601
4
0.581
3
0.641
4
0.472
4
0.487
4
0.644
4
0.647
Pv-ag003
3
0.119
3
0.177
2
0.357
2
0.091
1
0.000
2
0.430
2
0.469
Pv-gaat001
5
0.301
2
0.453
2
0.206
3
0.526
7
0.516
4
0.507
4
0.548
Pv-cct001
1
0.000
3
0.063
2
0.023
1
0.000
2
0.024
1
0.000
1
0.000
Suma Total alelos
Media Genómicos
Media Génicos
MEDIA TOTAL
160
155
121
112
226
146
6.438 0.518 4.875 0.392 4.000 0.375 10.688 0.619 6.438
3.714 0.343 3.071 0.312 3.429 0.410 3.929 0.209 3.071
5.333 0.434 5.167 0.436 4.033 0.355 3.733 0.391 7.533 0.427 4.867
6.875
3.571
0.511
0.345
Meso II
Meso General Antes Después Antes Después No Alelos 6.46 5.17 7.57 6.77 Div genética 0.49 0.44 0.48 0.46 Separación Meso‐Intro 68 Andinos
No de H(Nei) No de H(Nei) No de H(Nei) No de
Alelos
Alelos
Alelos
Alelos
143
0.659
0.503
0.587
6.313
3.000
4.767
0.642
0.486
0.569
A continuación se muestra el registro fotográfico de los 17 individuos pertenecientes
al grupo denominado como Meso-Intro, se puede observar que dentro de este
registro es posible encontrar individuos con colores raros (grises) o semillas con
colores mezclados; estos rasgos podrían esperarse en un grupo de genotipos
introgresados.
RW3
RW20
RW26
RW37
RW163
RW247
RW279
RW498
RW522
RW528
RW536
RW573
RW601
RW620
RW642
RW667
RW655
Figura 14. Individuos pertenecientes a Meso-Intro (agrupados por PCoA como Meso II pero
que posiblemente presenten eventos de introgresión)
6.1.3
Agrupación mediante índice de disimilaridad
En la figura 15 se muestra claramente la subdivisión de la población de estudio en
los dos acervos principales y posiblemente dos grupos de introgresados, lo cual
coincide con lo encontrado a partir del análisis de coordenadas principales. Se
encontró un total de 205 genotipos para el grupo Mesoamericano, 127 para el grupo
Andino, 15 para Introgresados I y 12 para Introgresados II; de tal manera es posible
decir que aunque no se recurra a la elaboración de una minuciosa comparación de
69 las dos metodologías (matriz de similaridad e índice de disimilaridad), si es posible
decir que la cantidad de individuos asignados para cada grupo es comparable entre
las dos formas de asociación, ya que sigue siendo mayor el número de individuos
para Mesoamericano. El agrupamiento de los controles también fue similar en las
gráficas generadas por ambas metodologías, ya que en el caso de los Meso, éstos
aparecen más unidos que los andinos.
Figura 15. Dendrograma basado en el índice de disimilaridad de DICE para la colección de
germoplasma de Ruanda. Muestra en verde (parte superior) al grupo de los
mesoamericanos y sus dos respectivos controles en azul; en la parte inferior en rojo el grupo
de los andinos y sus controles en amarillo. Los dos posibles grupos de introgresados se
observan en la mitad de la gráfica.
70 6.2
ANÁLISIS DE MINERALES
6.2.1
Contenido de minerales en semilla de fríjol
En la evaluación de minerales de los 355 genotipos de la colección de germoplasma
de fríjol de Ruanda, mediante la técnica de Absorción Atómica, fue posible observar
que los valores para el contenido de hierro estuvieron en el rango esperado en
semilla de fríjol de acuerdo con estudios previos (Beebe et al., 2000a; Blair et al.,
2005; Islam et al., 2002a); sin embargo al comparar el contenido promedio se
encuentra que para este estudio los valores de hierro resultaron más altos que los
encontrados en los trabajos mencionados, excepto por el de Blair et al. (2005)
quienes obtuvieron un valor de 83.3 ppm. En este caso se hallaron 68.24 ppm,
como se muestra en la tabla 15, mientras que en el trabajo de Islam et al. 2002 el
contenido de hierro correspondió a 54.8 ppm y en Beebe et al. (2000) fue de 55ppm.
Tabla 15. Estadística descriptiva para contenido de (ppm) de hierro y zinc en 355
accesiones de frijol provenientes de Ruanda.
Fe (ppm)
Zn (ppm)
Contenido Medio
68.24
34.46
Desviación Estándar
8.41
3.39
Varianza
70.74
11.50
Mínimo
45.35
25.12
Máximo
97.55
49.05
Rango
52.20
23.92
Coeficiente de Variación
12.33
9.84
-0.0047
0.7471
Curtosis
En la tabla 15 se observa que los resultados de zinc obtenidos para este estudio
(34.5ppm) fueron congruentes con los reportados en los estudios anteriores. En su
investigación Blair y colaboradores (2005) encontraron un promedio de 32.5 ppm,
71 Beebe y colaboradores (2000) un valor de 35 ppm e Islam y colaboradores (2002)
encontraron 34,4ppm.
Con base en los datos obtenidos, se generaron dos histogramas de distribución de
contenido en minerales (figura 16) los cuales permiten detallar el comportamiento de
la distribución del contenido de estos minerales en los genotipos evaluados; se
puede ver que los datos reflejan una tendencia a distribución normal.
La curtosis permite observar lo concentrada (picuda) que está la distribución de
frecuencias de la concentración de hierro y zinc en torno a la media. De acuerdo con
los datos mostrados en la tabla 15 y al comportamiento de datos en la figura 16, se
puede observar que los valores de zinc presentan una curtosis mucho más alta que
la observada en hierro, por lo que la curva de zinc puede presentar una mayor
acumulación de datos hacía el centro lo que hace que su distribución se vea un
poco más picuda que la del hierro.
Figura 16. Histogramas de cuantificación de minerales mediante la metodología de AA.
Es posible pensar que para el mejoramiento de la calidad nutricional de un alimento
sea necesario tratar cada micronutriente por separado, pero si existe una relación
entre estos componentes es posible que con el incremento de uno se favorezca el
del otro. En este estudio se encontró que existe una correlación positiva entre el
72 hierro y el zinc, la cual es estadísticamente significativa a lo largo de los diferentes
genotipos, su valor es de 0.52 (P=0.0000).
A partir del rango de valores determinados para la interpretación de resultados de
cuantificación de minerales (ver tabla 9), se estableció que los genotipos (figura 17a)
con el contenido más alto de hierro fueron: RW 582, RW 375, RW 221, RW 500, RW
216, RW 28 y RW 298; de la misma forma se encontraron que los que presentaban
valores más bajos fueron RW 77, RW 32 y RW 40, RW 95 y RW 76 (figura 17c).
a
b
RW 375
RW 221
RW 582
RW 6
RW 257
97.55ppm
89.45ppm
87.46ppm
49.05ppm
44.94ppm
43.56ppm
RW 500
RW 216
RW 492
RW 149
RW 88
42.54ppm
42.70ppm
42.91ppm
RW 582
86.7ppm
RW 28
86.48ppm
86.55ppm
RW 298
RW 500
41.91ppm
86.36ppm
c
RW 77
RW 32
RW 40 d
RW 345
45.35 ppm
45.81 ppm
RW 95 RW 8
48.43 ppm
RW 76 25.12ppm
48.88 ppm
RW 542
26.30ppm
26.56ppm
50.45 ppm
Figura 17. Genotipos con mayor y menor contenido de hierro y zinc: (a) Genotipos con
contenido más alto de Fe; (b) Genotipos con contenido más alto de Zn; (c) Genotipos con
contenido más bajo de Fe; (d) Genotipos con contenido más bajo de Zn.
73 Para el zinc los genotipos que se muestran en la figura 17b corresponden a los de
mayor contenido: RW 582, RW 6, RW 257, RW 88, RW 149, RW 492 y RW 500, y
los de la figura 17d, son los de contenido más bajo: RW 345, RW 542 y RW 8. Sin
embargo, de acuerdo con el rango para interpretación, ningún valor de
concentración de zinc se encontró clasificado como bajo, ya que dicho rango
sugiere que los genotipos se deben determinar con contenido bajo cuando
presentan valores menores a 20 ppm y para este estudio todos los genotipos
contenían concentraciones superiores a 25 ppm.
Es importante resaltar que el individuo RW582 presentó los valores más altos para
estos dos minerales, por lo tanto es un genotipo digno de tener en cuenta en
programas de mejoramiento. Lo mismo ocurre con el individuo RW500 que estuvo
dentro de los genotipos con altos valores para ambos minerales.
6.2.2
Asociación contenido de minerales y estructura genética
De acuerdo con los datos de contenido de minerales obtenidos y con las
agrupaciones formadas a partir de PCoA, se puede decir que el grupo de los
genotipos introgresados presentó el valor numérico de contenido medio de hierro
más alto de toda la colección, aunque el genotipo de mayor contenido se localizó en
el grupo de Mesoamericanos IV. En la comparación entre grupos Andino y
Mesoamericano se observa que el primero tiene mayor valor numérico en contenido
de hierro que cualquiera de las agrupaciones formadas para el segundo. Sin
embargo se encontró que estos datos no son significativamente distintos entre sí
(ver prueba ANOVA en anexo 6).
Por el contrario en el caso del zinc se encontró que los valores entre grupos difieren
significativamente entre sí (tabla 16 y anexo 6); al realizar las pruebas de separación
de medias de rango múltiple se encontró que los introgresados no son diferentes de
ningún grupo de los mesoamericanos pero sí es diferente del grupo andino. En
general los andinos resultaron muy diferentes de los demás lo cual era de esperarse
debido que los acervos genéticos pueden diferir bastante en características
fenotípicas como genotípicas; sin embargo como contraste a esto se encontró que
no son tan diferentes con el grupo de Mesoamericanos IV.
74 En general todos los grupos presentan individuos de alto y bajo hierro y de alto y
medio contenido de zinc. Dentro del grupo de los Andinos se presentaron los
genotipos con contenido más bajo de zinc y el promedio general de este grupo fue
el más bajo con respecto a los demás, lo cual está de acuerdo con lo reportado por
Islam 2004 quien encontró el mismo patrón.
Tabla 16. Estadística descriptiva para contenido en ppm de hierro y zinc en las poblaciones
generadas mediante PCoA.
HIERRO
ZINC*
ANDINO MESO I MESO II MESO III MESO IV INTRO ANDINO MESO I MESO II MESO III MESO IV INTRO
n
Media
Desv estd
Varianza
Mínimo
Máximo
Rango
CV
132
69.19
8.39
70.39
45.81
89.45
43.64
12.13
65
68.59
8.66
75.05
45.35
86.73
41.38
12.63
79
67.43
7.07
49.99
51.86
84.10
32.24
10.49
43
66.65
10.35
107.08
50.45
97.55
47.10
15.53
21
65.49
7.99
63.88
52.04
86.48
34.44
12.20
17
70.96
7.64
58.41
59.04
84.40
25.36
10.77
132
33.02
3.10
9.62
25.12
44.94
19.81
9.39
65
35.54
3.25
10.55
29.90
43.56
13.66
9.14
79
35.48
2.82
7.93
28.42
42.91
14.49
7.93
43
35.77
3.83
14.68
31.07
49.05
17.97
10.71
21
33.98
3.00
9.00
29.15
39.51
10.36
8.83
17
35.11
3.50
12.25
27.93
39.56
11.63
9.97
*: Promedios significativamente diferentes p<0.0001
A partir de las pruebas de separación de medias de rangos múltiples se pudo
observar que existe un gradiente de distribución de concentración de zinc a lo largo
de la dimensión 3, como se observa en la figura 18.
35.10
35.48
35.53
35.77
Figura 18. Gradiente de concentración de zinc encontrado en grupos mesoamericanos
indicado por las flechas azules.
75 6.3
CARA
ACTERISTIC
CAS DEL GR
RANO DE FRÍJOL
L caracterrísticas de la
Las
a semilla ten
nidas en cue
enta para esste estudio fu
ueron el colo
or,
t
tamaño
y pa
atrón de colo
oración. Sin
n embargo es
e necesario
o aclarar que
e la coloración
d la semilla
de
a se pudo ver
v afectada
a por el largo
o tiempo qu
ue llevaba almacenada, lo
q
que
pudo haber
h
generrando un po
osible proce
eso de oxid
dación que finalmente se
p
puede
ver reflejado en
n el color observado.
o
El tamaño de semilla fue estimado
ú
únicamente
bajo criterio
o visual.
S encontró
Se
ó gran variedad de colo
ores dentro de la coleccción (figura 19), siendo el
c
color
café ell que se pressentó en ma
ayor proporcción, sin emb
bargo la dife
erencia con los
g
granos
de color
c
rojo no
o fue muy am
mplia. El patrón de colo
oración en la
a colección se
v fuerteme
vio
ente marcad
do por semilllas sin patró
ón de coloración definida
a, es decir por
p
s
semillas
de
e un solo color,
c
seguiido por el patrón motteado, el cual
c
tuvo una
r
representac
ión del 14%
%. En cuantto al tamaño
o se enconttró igual pro
oporción tan
nto
p
para
la semilla de peque
eña como pa
ara la media
ana (46%) y solo un 8% de la grande
e.
2% 2%
12%
1
1%
26%
1%
Color de
e semilla
Patrón de Coloración
Caféé/Marrón
57%
Rojo
o
9%
Amaarillo
14%
Jaspeado
Moteado
14%
17%
25%
Crem
ma
11
1%
Negro
3%
6%
Punteado
Rayado Venación
NP: Sin Patrón F
Figura
19. Distribución
D
po
orcentual de color, tamaño
o y patrón de
e coloración de
d semilla en
n la
p
población
de estudio.
L distribuc
La
ción de colo
or, tamaño y patrón de coloración dentro de
e cada grupo
f
formado
a partir
p
de PCo
oA se muesstra en la figura 20 (las tablas de co
ontingencia en
e anexo 7)). Los colorres café, am
el
marillo y cre
ema fueron constantes en todos los
g
grupos,
mie
entras que el
e color mora
ado fue excclusivo de lo
os Andinos. La semilla de
t
tamaño
med
diano y peq
queño se pre
esentó en to
odos los gru
upos; el tam
maño pequeño
e
estuvo
hom
mogéneamen
nte distribuid
do en los Mesoamerica
M
anos I, II y III; la semiilla
g
grande
fue exclusiva
e
de
e los Andino
os. Todos loss grupos pre
esentaron se
emillas que no
76 t
tenían
un pa
atrón de colo
oración es decir
d
eran de
e un solo co
olor, sin emb
bargo el patrrón
m
moteado
fue
e constante y el rayado exclusivo
e
de
el grupo And
dino.
No de Individuos
Color
140
Amarillo
120
Rojo
100
Rosado
Negro
80
Morado
60
Gris
40
Crema
20
Café
0
Blanco
MI
MII
M
MIII
MIV
A
I
Grup
po Poblacional
Tamaño
140
No de Individuos
120
100
Pequeña
80
Mediana
60
Grande
40
20
0
MI
MII
MIII
MIV
A
I
Grup
po Poblacional
No de Individuos
Patrón
140
1
1
120
1
100
80
60
40
20
0
NP
Venación
Rayado Punteado Moteado
MI
MII
MIII
MIV
A
I
Jaspeado
Grupo Poblacional
Grupos pobla
acionales: MI: Mesooamericanos grupo 1; MII: Mesoamericanoss grupo 2; MIII: Mesoamericanos grupo 3; MIV:
M Mesoamericanos
grupo 4; A: Grupo de Andinos; I: Grup
po de introgresados
Figura 20. Distribución
D
d color de la
del
a semilla denttro de cada grrupo poblacio
onal formado a
partir de PCo
oA.
77 En los grupos Mesoamericanos hubo predominio de semilla pequeña de color café
con patrón de coloración moteado, con excepción del grupo cuatro que presentó un
mayor número de individuos con patrón de coloración jaspeado. Sin embargo el
tamaño de semilla mediano también tuvo una gran presencia dentro de estos grupos
Mesoamericanos, lo cual es congruente con estudios morfológicos que resaltan que
el tamaño típico de las semillas Mesoamericanas puede ser pequeño o mediano
(Gepts & Bliss, 1986).
Por otra parte las semillas pertenecientes al grupo Andino se caracterizaron por
presentar semillas de tamaño mediano (primordialmente) y grande, lo que
concuerda con estudios previos en semilla de fríjol (Singh et al., 1991a). El color
predominante fue el rojo moteado y tuvieron prevalencia de semilla mediana a
grande. En el grupo de los introgresados el color de semilla que más se encontró
fue el amarillo con patrón moteado y los tamaños mediano y pequeño fueron los que
se presentaron en este grupo.
78 7
7.1
El
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
ANÁLISIS DE DIVERSIDAD GENÉTICA
conocimiento de la diversidad permite tener una perspectiva amplia de la
estructura de las especies y ayuda a los mejoradores a encontrar genotipos con
características óptimas para la obtención de cultivos mejorados.
7.1.1
Población Total
Para el nivel de polimorfismo (número de alelos), se encontró en su mayoría valores
más altos que los obtenidos en estudios previos (Blair, 2007; Blair et al., 2006; Díaz
& Blair, 2006), lo cual podría estar indicando el buen desempeño de la técnica. Por
otra parte, es relevante tener en cuenta que tanto para el presente estudio como en
el de Moreno (2007), ambos realizados mediante la técnica de microsatélites
fluorescentes, se obtuvieron altos valores de número de alelos (301 y 429
respectivamente). Este factor junto con el hecho de que todos los loci sean
polimórficos podría verse explicado por los niveles de divergencia entre los
genotipos estudiados o por la sensibilidad, precisión y resolución de la técnica al
momento de reconocer polimorfismos; el secuenciador ABI 3730xl permite identificar
polimorfismos de hasta un solo par de bases, los cuales ocurren por mutaciones
puntuales en los extremos de la región microsatélite amplificada (Smith et al., 1997).
Los marcadores BM143, BM187 y GATs91 presentaron los números de alelos mas
altos para la población, lo que podría indicar que estos tienen alto poder de
discriminación, este hallazgo se apoya en la caracterización realizada por Gaitán et
al. (2002) quienes reportaron que dos de estos mismos loci (BM143 y GATs91) son
bastante útiles en el genotipaje de accesiones de germoplasma de P. vulgaris. Los
marcadores genómicos en promedio presentan este valor más alto que los génicos
lo que sugeriría que con los primeros se podría llevar a cabo una mejor
caracterización en colecciones similares a la del presente estudio.
La diversidad total del conjunto de genotipos evaluados, fue alta (0.62) al
compararse con los resultados obtenidos en estudios anteriores con otras clases de
79 marcadores. Por ejemplo con RFLPs se encontró un total de 0.38 (Becerra & Gepts,
1994), en este mismo se halló que mediante marcadores tipo isoenzima el valor de
la diversidad fue de 0.19. En otro estudio también realizado con isoenzimas el valor
correspondió a 0.159 (Paredes-Lopez & Gepts, 1995) y con CAP se encontró 0.37
(Chacón et al., 2005).
Un aspecto importante a resaltar es que este alto valor de diversidad genética,
posiblemente se deba al poder de resolución y gran cantidad de información que
poseen los microsatélites, ya que en general los altos valores en cuanto a dicho
parámetro, se encuentran para este tipo de marcadores; tal y como se muestran en
otras investigaciones en las que se evaluó la diversidad, por ejemplo Díaz J.M en el
2005, encontró un valor de 0.49 para 125 genotipos Andinos evaluados con 30
marcadores y Díaz, L. en el mismo año halló una diversidad de 0.47 para
accesiones Mesoamericanas. Sin embargo se sigue encontrando un valor mas alto
para estudios realizados con microsatélites fluorescentes.
Otro posible argumento del cual se podría inferir el hecho de que estos resultados
tuvieran altos valores en diferentes parámetros de diversidad fue que se usó un
subconjunto de primers con altos valores de PIC a partir de los trabajos realizados
por
Gaitán y colaboradores (2002) y Blair y colaboradores (2006). El PIC
corresponde al contenido de información polimórfica y es un índice importante
debido a que permite determinar la capacidad discriminatoria de un grupo de
marcadores, y de esta forma poder reproducirlo en otros estudios en donde el
conocimiento y caracterización de la población sea el principal objetivo, como ocurre
en este estudio.
El número máximo de alelos encontrado en todo el conjunto de genotipos fue de 40
y correspondió al marcador BM187, este valor es alto comparado con estudios
previos como el elaborado por Blair et al (2006), en el que el número más alto que
se presentó fue 23 alelos. Al igual ocurre en el estudio de Díaz y Blair en el 2006,
quienes encontraron un número de alelos máximo de 15. Es posible hacer la misma
comparación para los valores promedio de número de alelos, ya que en este estudio
se presentaron 10 alelos en promedio para cada marcador, mientras que en
80 estudios previos fueron inferiores: 7.8 en Blair et al (2006) y 5.1 en Díaz & Blair
(2006).
Estos resultados son muy favorables si este estudio se encamina hacia objetivos de
mejoramiento genético, ya que la alta variabilidad confiere mayor probabilidad de
responder favorablemente a presiones de selección ambiental, como las que
comúnmente se presentan en Ruanda entre las que se encuentran enfermedades,
cambios climáticos drásticos, variación en la composición química del suelo entre
otros.
Por otra parte, se observó que en cuanto a la clase de marcadores evaluados los
genómicos permitieron identificar mayores niveles de diversidad y mayor número de
alelos. Las diferencias en el polimorfismo detectado entre los tipos de marcadores
también fue observada en varios estudios de diversidad genética en fríjol (Blair et
al., 2006; Blair et al., 2003; Diaz, 2005a; Díaz & Blair, 2006; Moreno, 2007), y puede
justificarse en el origen de cada clase de marcador, pues los microsatélites génicos
al provenir de secuencias codificantes, podrían no transmitir una modificación en su
secuencia a nuevas generaciones en el caso que dicha variante corresponda a un
cambio drástico o mutación ya que haría menos viable al individuo. En el caso de
los marcadores genómicos, que por estar principalmente en secuencias no
codificantes, pueden albergar mayor cantidad de variantes en la secuencia y no
comprometer la supervivencia o adaptación del organismo mutante (Diaz, 2005a).
En este estudio se encontró un valor alto de Heterocigocidad observada (Ho)
correspondiente a 0.19 comparado con el valor (0.038) obtenido para Díaz y Blair en
el 2006. Los marcadores que especialmente presentaron alta Heterocigocidad
observada son: el marcador genómico BM188b (0.65) y el génico BMd01 (0.61).
Este alto valor probablemente corresponde a una fuerte endogamia dentro del
objeto de estudio, lo que supone un enorme exceso de homocigotos en el conjunto
de accesiones y eso está en consonancia con fuerte endogamia dentro de las
accesiones (Comunicación Personal, M. Ruíz).
81 Sin embargo es necesario resaltar que los microsatélites fluorescentes permiten
identificar más fácilmente los polimorfismos, debido a la ya mencionada alta
sensibilidad; es posible que el nivel de Heterocigocidad observado, se haya visto
incrementado por esta causa, por lo que es necesario prestar mayor atención a
estos marcadores, en futuros estudios para no confundir el mérito de la técnica con
características de la población.
En general estos resultados reflejan valores altos en cuanto a parámetros de
diversidad y nivel de Heterocigocidad y pueden estar ocurriendo debido a las
mezclas de semillas que comúnmente se ve en las regiones en Ruanda. Aunque en
ciertos lugares y situaciones se haga selección de grano, en la mayoría de los casos
el consumo y producción de fríjol no se ve marcado por el tipo y tamaño de semilla
(Comunicación Personal L. Butare investigador programa fríjol Ruanda, CIAT 2007).
Las mezclas pueden ocurrir en diferentes momentos después de la cosecha, por
ejemplo cuando se ponen a secar los fríjoles bajo la incidencia de la luz solar,
resulta ser más atractivo para los campesinos ver mezcla de fríjoles, por lo tanto
ellos se encargan de organizarlas. También puede darse en el momento de la
colecta cuando recogen los granos pues hacen este proceso sin una selección
determinada; ó simplemente las mezclas pueden originarse por actividades
culturales como juegos, regalos o deudas (Martin & Adams, 1987).
El fríjol en Ruanda es producido tanto para la venta como para la alimentación
mediante sistemas de cultivos en mezcla durante dos estaciones al año. Las
semillas son cultivadas y cosechadas principalmente para consumo por parte de los
propios campesinos, sin embargo su venta es común especialmente cuando se
presentan problemas ambientales graves que afectan los cultivos o debido a los
pobres sistemas de almacenamiento de semilla que se tienen (David & Sperling,
1999).
En este proceso de venta y adquisición es cuando se maneja con más detalle el
tema de las mezclas de variedades. Los campesinos que venden la semilla se
encargan de escoger la que presente mejor calidad, lo cual garantiza el
mejoramiento del recurso genético pero no existe preferencia por un tipo de grano
(David & Sperling, op cit.). El conocimiento de los campesinos acerca de la
82 efectividad de las mezclas en la producción es amplio, ellos saben que este tipo de
método confiere mayor resistencia por parte de los genotipos a enfermedades o
fuertes cambios ambientales, siendo esta una posible causa del alto valor de la
variabilidad genética encontrado en la colección de este estudio.
Por otra parte, aunque el intercambio de semilla en forma de regalo o como red
comercial entre países ha disminuido en la actualidad (David & Sperling, op cit.),
este es un factor muy importante que podría estar afectando la diversidad, ya que
podría existir una recombinación de material genético confiriendo mayor variabilidad
en un mismo conjunto.
7.1.2
Grupos definidos mediante PCoA
Mediante el análisis de ordenación (PCoA) se mostró la presencia de grupos dentro
de los genotipos analizados, los cuales tienen correspondencia con la estructura de
acervos propuesta, esto permite inferir nuevamente la utilidad de la técnica para
diferenciar entre estos dos grupos.
El comportamiento observado para cada grupo definido a partir de PCoA fue similar
al de la población total ya que los marcadores genómicos presentaron mayor
polimorfismo que los génicos, lo que podría sugerir que las fuerzas existentes que
modelan cada patrón de cada grupo son similares (Diaz, 2005a). Sin embargo al
encontrar una mayor diversidad de los loci genómicos en el grupo de los
Introgresados insinúa que la composición alélica de los genotipos que lo conforman
puede ser diferente o tener diferentes frecuencias.
La alta diversidad total encontrada para todos los grupos generados por PCoA, en
especial para el grupo de los introgresados, podría demostrar que los agricultores
pueden estar contribuyendo al mantenimiento e incluso aumento de la diversidad a
través de entrecruzamientos intencionales o in intencionados, como ya ha sido
reportado por Martin y Adams (1987). El manejo post-cosecha en África juega un
papel importante en el mantenimiento y aumento de la variabilidad genética, ya que
en la mayoría de los casos los pequeños agricultores mezclan las semillas, lo que
podría aumentar las probabilidades de polinización cruzada.
83 Aunque en este estudio no se puede hablar de una estructura de razas debido a la
ausencia de datos que permitan confirmarlo, se puede tener en cuenta la
subdivisión del grupo Mesoamericano, infiriendo dentro de este gran grupo una
posible estructura de razas, que será resuelta en la medida en que sean utilizados
controles moleculares definidos para tal fin y que sea posible la obtención de
características, morfológicas, agronómicas y bioquímicas que permitan hacerlo.
Contrario a lo que se muestra en otros estudios en cuanto a representación de
semilla de los dos acervos principales (Blair et al., 2006; Islam et al., 2002b), el
mayor porcentaje de genotipos pertenecen al grupo de los Mesoamericanos (58.3%)
mientras que la representación andina correspondió al 37% y el resto hizo parte de
los introgresados. Es posible pensar que esto se deba a la implementación de
estrategias para combatir las amenazas a las que se ha visto enfrentada la
biodiversidad en Ruanda; dichas estrategias van encaminadas hacía la utilización
de los recursos genéticos para incrementar la productividad. Por ejemplo han
aumentado la siembra de variedades de semillas medianas y pequeñas que
presentan mayor tolerancia a las enfermedades de raíz (CIAT, 2005a) y a la sequía
(Martin & Adams, 1987).
Lo anterior puede ser confirmado por la incidencia de un alto porcentaje de semilla
de tamaño mediano y pequeño en toda la colección. De acuerdo con las
experiencias de los campesinos Ruandeses (Comunicación Personal L. Butare
investigador programa fríjol Ruanda, CIAT 2007), la tendencia de los campesinos,
que comercializan la semilla y que dependen de ella para su alimentación, es a
sembrar muchas áreas con fríjol y la semilla de menor tamaño confiere la ventaja
de poder sembrar mas semillas en una menor área, razón por la cual se pudo ver
reflejada esta incidencia. Además se produce mayor cantidad de semillas pequeñas
o medianas en una misma planta que las que se pueden producir de tamaño grande
(Martin & Adams, 1987).
La presencia de gran cantidad de tipos de fríjol (variedad de colores y tamaños)
sugiere que se mantiene la existencia de redes de distribución y que estos fríjoles
han tenido la aceptación de los consumidores (o una amplia adaptación ambiental)
(Martin & Adams, 1987). La acción de las preferencias de consumo o factores
84 ambientales, o las dos en conjunto, ha sido fundamental para la existencia de la
variabilidad existente en esta colección de germoplasma de fríjol de Ruanda.
Los colores que más se comercializan en Ruanda son rojo (moteado) y café por lo
tanto hacen parte de la gran producción de este país, esto podría explicar el porque
estos dos tipos de semilla fueron predominantes en la colección (Comunicación
Personal L. Butare investigador programa fríjol Ruanda, CIAT 2007); los fríjoles de
colores blanco y amarillo se comercializan principalmente en las ciudades y son
destinados a los restaurantes, por lo tanto son los que mayor valor comercial
presentan, sin embargo la baja incidencia de los de color blanco para este estudio,
puede verse explicada por el hecho de que muchos campesinos no siembran estos
genotipos por su difícil cocción o por tradiciones culturales. Los fríjoles de color
negro nos son muy apreciados en el mercado sin embargo éste lo producen para
consumo en mezcla (Butare op cit.).
En cuanto a los individuos que se les ha denominado como raros, debido a que no
se agruparon dentro de ningún acervo, se puede decir que son excéntricos dentro
de la población estudiada, ya que aparentemente no comparten muchas
características moleculares con los dos acervos encontrados e inclusive tampoco
se encuentran relacionados con los individuos candidatos a introgresión. Por lo que
se sugiere que se realice un seguimiento de estos, ya que su aislamiento molecular
se pudo haber originado por problemas de contaminación, errores en el
procedimiento llevado a cabo en el laboratorio, entre muchas otras causas.
La variabilidad encontrada en la colección de germoplasma de Ruanda puede ser el
resultado del conjunto de diferentes fuerzas, dentro de las que se incluye las
prácticas agronómicas, la selección humana, la selección natural, el intercambio
local y nacional de semilla y los eventos naturales de polinización cruzada.
7.1.3
Agrupación mediante índice de disimilaridad
Se observa que en este caso el grupo es dividido en los dos acervos principales y
dos posibles grupos de introgresión, lo cual coincide con el análisis de PCoA. La
agrupación de individuos en cada metodología no es muy diferente la una de la otra
ya que agrupan un número similar de individuos dentro de cada grupo; sin embargo
85 debido a que utilizan índices diferentes y sistema de graficas es muy diferente no es
posible hacer una comparación directa de estas dos metodologías, ya que esto
implicaría realizar una compleja comparación de software que no compete en este
estudio. Sin embargo se quiso mostrar esta otra forma de agrupación para
evidenciar a través de otro método las agrupaciones por acervos dadas para este
estudio.
7.1.4
Posibles eventos de introgresión en la población estudiada
De acuerdo con la caracterización molecular realizada y al análisis de ordenación
implementado, fue posible encontrar un primer grupo de 17 individuos que
presentan
características
moleculares
que
los
hacen
candidatos
de
ser
introgresados, estos fluctúan en sentido Mesoamericano-Andino. Dentro de este
grupo 5 individuos presentan características morfológicas típicas del acervo
Mesoamericano y en el dendrograma mostrado en la figura 13C se agrupan dentro
del acervo Andino. Adicionalmente se encontró un segundo grupo que presenta
características moleculares propias de introgresión; estos dos grupos son los que
presentan valores más altos de diversidad, lo cual podría ser un indicativo de que la
introgresión entre acervos tiende a aumentar la diversidad (Beebe et al., 2001)
La formación de estos grupos no es sorprendente en una región como Ruanda a la
que, al igual que el resto de África, llegaron los dos acervos principales de fríjol y a
partir de ese entonces las mezclas de estos se han realizado continuamente (Martin
& Adams, 1987). Esta formación de grupos, puede deberse a una posible
hibridación entre acervos, un evento que ha sido postulado en estudios como el de
Beebe et al (1997) quienes encontraron en mezclas de cultivares sembradas en
Colombia y en Perú, la posible ocurrencia de un proceso de alogamia. En la
producción de semillas en la que es indiferente la elección de algún tipo de grano
específico, es frecuente encontrar que los campesinos finalmente escogen todas las
semillas producidas, sin importar que estas provengan de una recombinación
genética (Beebe et al., 2001); por lo tanto en esta situación los tipos introgresados
son más probables de mantenerse en las mezclas de los campesinos que lo que
ocurriría en los cultivadores orientados hacia el mercado. Esto podría explicar la
presencia de los individuos posiblemente introgresados dentro de la colección
86 ruandesa; como se sabe la selección por color es laxa y las mezclas son aceptadas
por campesinos.
Ruanda es considerado como un centro secundario de diversidad de fríjol, por lo
que la diversidad encontrada refleja en la influencia de los dos acervos introducidos
a este país. Por lo tanto encontrar genotipos que presentan características
genéticas de los dos acervos puede representar el flujo genético entre estos o la
introgresión desde el acervo Mesoamericano al andino o viceversa; sin embargo se
sugiere confrontar estos datos moleculares con mayores evidencias morfológicas y
bioquímicas que permitan llegar a una conclusión más contundente.
7.2
ANÁLISIS DE MINERALES
Las diferencias encontradas entre este estudio y otros de minerales (Beebe et al.,
2000a; Blair et al., 2005; Islam et al., 2002a) pueden ser de origen genético y/o
ambiental; se encontraron valores altos de hierro y zinc dentro de la colección, lo
cual es de gran importancia debido a que estos minerales son fundamentales para
la nutrición de la población Ruandesa.
Es pertinente resaltar que los genotipos que presentaron los contenidos más altos
de hierro se encuentran por encima de 85ppm siendo este un valor alto teniendo en
cuenta los estudios mencionados anteriormente. Estos resultados son muy
importantes ya que el hierro es un componente esencial de la semilla de fríjol pues
interviene en importantes procesos metabólicos en el cuerpo humano siendo
esencial en la prevención de enfermedades graves como lo es la anemia
ferropénica; por ende encontrar genotipos con alto contenido de este mineral en
países en vía de desarrollo como lo es Ruanda facilita los planes de mejoramiento
de cultivos en los que se buscan incrementar los valores nutricionales y así generar
variedades de fríjol con mayor contenido de nutrientes.
Todos los valores hallados para zinc fueron considerados entre medianos y altos, es
decir fueron mayores a 25 ppm, lo que resulta ser muy interesante ya que encontrar
valores altos de zinc pueden garantizar que en futuros estudios de mejoramiento del
fríjol común en Ruanda se utilicen estos genotipos y de esta forma incrementar el
87 consumo en esta población que presenta graves problemas de malnutrición y salud
pública especialmente el VIH/SIDA. Es bien sabido que el zinc ayuda a incrementar
la defensa inmunológica del organismo por lo que es importante en el tratamiento de
enfermedades tales como VIH/SIDA.
Otro punto importante a tratar es el caso de los individuos RW582 y RW500 que
presentaron los valores más altos para hierro y para zinc; es importante resaltar que
estos genotipos no son morfológicamente atractivos para producción y/o consumo,
debido a la coloración negra que presentan, por lo tanto podrían ser importantes en
un plan de mejoramiento ya que podrían servir de progenitores donantes de
nutrientes.
Al comparar el dato de la desviación estándar encontrada con el estudio de Beebe
et al. 2005, se puede ver que la variación es similar (8.3 Beebe y 8.4 tabla 14). La
desviación estándar
y el coeficiente de variación
pueden ser un reflejo de la
variabilidad genética que existe en el material estudiado. El valor de la desviación
era de esperarse debido a que los genotipos provienen de diferentes regiones de
Ruanda y existe alto grado de combinación de material.
Se encontró un valor más alto de curtosis en zinc que en hierro lo que podría sugerir
que existe mayor varianza para este mineral, esto podría deberse a que existen
desviaciones infrecuentes en los extremos, que se oponen a desviaciones comunes
de medidas menos pronunciadas.
Al comparar este estudio con el de Beebe et al. 2002 se encontró el mismo valor
para el coeficiente de correlación de los dos minerales (0.52). Es posible proponer
que esta correlación sea un reflejo de la cosegregación de genes para estos dos
rasgos. La implicación de estas correlaciones es que algunos factores genéticos
para los minerales están cosegregando y que la selección de uno de estos
elementos puede resultar simultáneamente en un incremento en el otro, de esta
forma se multiplica el impacto y se facilita el mejoramiento.
A pesar que la diferencia entre grupos para la variable de hierro no fue significativa
es posible decir que, de acuerdo con la asociación de datos de contenido de
minerales obtenidos y las agrupaciones formadas a partir del análisis de diversidad
88 genética se observó que el grupo de los genotipos introgresados presentó el
contenido medio de hierro más alto de toda la colección. Esto podría deberse a la
influencia que ha comenzado a tener la introgresión en la evolución dentro de los
acervos del fríjol, algunos rasgos importantes como alto contenido de minerales o
resistencia a una enfermedad puede deberse a eventos de introgresión (Islam et al.,
2004).
Encontrar un gradiente de zinc en los grupos mesoamericanos podría representar
un factor importante en el conocimiento de procesos de selección para este estudio.
Se podría hablar de un proceso de domesticación o que la posible causa de la
aparición de este gradiente sea debida a procesos de selección humana, sin
embargo no se tienen argumentos claros para explicar la aparición de este
gradiente.
La baja diferencia existente entre los valores de zinc del grupo de Mesoamericanos
IV y el grupo de los andinos puede explicarse en la posible influencia de factores
ambientales o genéticos que han ayudado a moldear los genotipos permitiendo así
encontrar valores muy similares entre estos dos grupos. También se puede argüir
que posiblemente exista introgresión por parte de alguno de estos grupos pero que
esta no sea detectada a nivel molecular.
89 8
CONCLUSIONES
En la caracterización de la diversidad genética para 355 genotipos de fríjol común
de Ruanda (África), mediante el uso de marcadores moleculares analizados con
fluorescencia se observó que esta colección presentó un alto polimorfismo y altos
índices de variabilidad genética. El valor para diversidad total encontrado en este
estudio se consideró como alto en comparación con estudios en otras regiones del
mundo, lo que indica la importancia de Ruanda como centro secundario de
diversidad del fríjol común.
Los 30 marcadores utilizados presentaron un alto nivel de información y un
excelente poder de discriminación, lo que permitió dividir a la población de estudio
en los dos acervos genéticos principales para fríjol común.
La presencia de posibles eventos de introgresión permitió ver efectos relacionados
con flujo de genes o recombinación genética, siendo este un factor importante en la
conservación e incremento de la variabilidad genética.
Las características morfológicas de la semilla como el color y tamaño se pudieron
relacionar con los grupos derivados a partir de los análisis de diversidad y se
observó que cada grupo se encuentra específicamente caracterizado por alguno de
los niveles de estas dos variables. Adicional a esto se observa la presión que ha
ejercido selección humana en la caracterización de cada grupo.
El alto contenido de minerales encontrado en este estudio evidencia la importancia
que la presión de selección humana está ejerciendo sobre la colección de
germoplasma de fríjol en este país.
La correlación encontrada en el contenido de los dos minerales permite esperar que
en futuros planes de mejoramiento los dos minerales tengan un incremento
simultáneo.
90 El acervo predominante en cuanto a número de individuos en este estudio fue el
mesoamericano, siendo este resultado contrario a lo que hasta el momento se ha
observado en estudios de diversidad genética (mayor número de individuos para
andinos).
Los marcadores moleculares tipo microsatélites analizados mediante fluorescencia,
por su alta sensibilidad, permitieron obtener el mayor número de alelos descritos
para algún marcador microsatélite de P. vulgaris.
91 9
RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS
Se recomienda hacer futuros estudios de diversidad utilizando genotipos controles
pertenecientes a las diferentes razas en que se dividen los acervos ya que de esta
forma sería posible establecer una estructura poblacional más completa.
El principal factor tenido en cuenta para este estudio de diversidad fue el molecular
por lo que se sugiere ampliar el estudio con datos morfoagronómicos que permitan
definir de manera contundente las relaciones moleculares acá encontradas.
Realizar una comparación de las técnicas utilizadas para la evaluación de
polimorfismos en microsatélites, la tradicional tinción en plata y la fluorescente a
través del ABI 3730xl.
Este estudio se constituye como el primero en la caracterización de la colección de
germoplasma de fríjol de Ruanda, por lo que es imperante desarrollar
investigaciones más profundas que contemplen otro tipo de marcadores y la
experiencia directa de los campesinos para poder llegar a conclusiones que vayan
más allá de una evaluación molecular.
El haber encontrado valores altos de diversidad genética y de características
nutricionales, abre la posibilidad para la realización de futuros estudios enfocados
hacía el mejoramiento.
Existen dos individuos importantes para un plan de mejoramiento al servir de
progenitores donantes de nutrientes, estos podrían ir junto con otro genotipo que
presente características morfológicas atractivas para el consumo en este país, por
ejemplo un fríjol rojo moteado.
92 10. REFERENCIAS
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99 10 ANEXOS
Anexo 1. Protocolo de Extracción de ADN de fríjol utilizando proteinasa K (Mahuku
2004)
1. Agregar en un tubo de micro centrífuga de 2 µl: 800 μl de buffer de extracción (NaCl
5M, Tris 1M, pH 7.5, EDTA 0.5M pH 8, SDS 10%, proteinasa K 10mg/ml agua) y
0.03g de tejido. Se deja a baño maria 1 hora a 65ºC agitando cada 15 min.
2. Terminada la hora agitar el tubo y agregar 200 μl de acetato de Amonio 7.5 M, agitar
y se dejar por 15 min a temperatura ambiente.
3. Centrifugar a 12000 r.p.m. por 15 min.
4. Transferir el sobrenadante a otro tubo y agregar 500 μl de cloroformo:octanol (24:1),
mezclar bien y centrifugar a 12000 r.p.m. por 10 min.
5. Transferir el sobrenadante y agregar ½ volumen de isopropanol frío y dejar
precipitando a 20ºC mínimo dos horas, pero preferiblemente toda la noche.
6. Posteriormente centrifugar a 12000 r.p.m. por 15 min, eliminar el sobrenadante lavar
el pellet con 500 μl de etanol frío al 70%.
7. Deja evaporar el etanol totalmente
8. Preparar el agua de resuspensión (6 μl de RNAasa/ 1 mL de TE 10:1 (Tris HCL 1M
pH 8.0, EDTA 0.5 M, pH 8.0)), y agregar entre 100 a 200 μL dependiendo del
tamaño del pellet.
9. Dejar el ADN a 37ºC por 30 min y se observa su calidad en un gel de agarosa 1.0%.
100 Anexo 2. Organización en paneles de los marcadores fluorescentes, teniendo en cuenta la
secuencia, el rango de pares de bases, la fluorescencia y el motivo para cada uno. En rojo
se resaltan los marcadores que se tuvieron en cuenta en el estudio. no.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
ID Marker
GATS91
BMd08
BMd20
BM172
BM188
BM175
BM200
BM205
BM139
BM156
PV-ctt001
BM160
PV-ag003
BMd01
BMd02
BMd16
BM201
AG01
BM140
GATS54
BM187
BMd17
BM183
BMy09
BM143
BM149
BM137
BMd46
BMd47
BM141
PV-cct001
BMd15
BMd51
BMd18
Pv-gaat001
BMd56
Sequence
GAG TGC GGA AGC GAG TAG AG
TTC ATC CTC TCT CCC GAA CTT
GTT GCC ACC GGT GAT AAT CT
CTG TAG CTC AAA CAG GGC ACT
TCG CCT TGA AAC TTC TTG TAT C
CAA CAG TTA AAG GTC GTC AAA TT
TGG TGG TTG TTA TGG GAG AAG
CTA GAC CAG GCA AAG CAA GC
TTA GCA ATA CCG CCA TGA GAG
CTT GTT CCA CCT CCC ATC ATA GC
GAG GGT GTT TCA CTA TTG TCA CTG C
CGT GCT TGG CGA ATA GCT TTG
TCA CGT ACG AGT TGA ATC TCA GGA T
CAA ATC GCA ACA CCT CAC AA
AGC GAC AGC AAG AGA ACC TC
ATG ACA CCA CTG GCC ATA CA
TGG TGC TAC AGA CTT GAT GG
CAT GCA GAC GAA GCA GAG TG
TGC ACA ACA CAC ATT TAG TGA C
GAA CCT GCA AAG CAA AGA GC
TTT CTC CAA CTC ACT CCT TTC C
GTT AGA TCC CGC CCA ATA GTC
CTC AAA TCT ATT CAC TGG TCA GC
GGG AGG GTA GGG AAG CAG TG
GGG AAA TGA ACA GAG GAA A
CGA TGG ATG GAT GGT TGC AG
CCG TAT CCG AGC ACC GTA AC
GGC TGA CAA CAA CTC TGC AC
ACC TGG TCC CTC AAA CCA AT
TGA GGA GGA ACA ATG GTG GC
CCA ACC ACA TTC TTC CCT ACG TC
TGC CAC CAC AGC TTT CTC CTC
CGC CAA TTC TTC AAC CCT AA
AAA CAC ACA AAA AGT TGG ACG CAC
ACC TAG AGC CTA ATC CTT CTG CGT
AAT GCG TGA GCA TGA TTA AGG
pb min
210
176
118
82
142
160
227
135
84
210
152
183
161
165
100
135
94
126
160
114
150
100
134
170
118
242
122
320
128
160
137
163
107
156
156
186
pb max
275
190
132
110
190
195
295
153
118
315
172
265
168
199
110
150
114
142
210
117
226
118
160
330
176
258
238
330
154
350
158
202
118
242
166
192
DIFF
65
14
14
28
48
35
68
18
34
105
20
82
7
34
10
15
20
16
50
3
76
18
26
160
58
16
116
10
26
190
21
39
11
86
10
6
PANEL
5A
5A
5A
5A
5B
5B
5B
5B
6A
6A
6A
6A
6B
6B
6B
6B
7A
7A
7A
7A
7B
7B
7B
7B
8A
8A
8A
8A
8B
8B
8B
8B
9A
9A
9A
9A
FLUORESC
6-FAM
NED
VIC
PET
NED
VIC
6-FAM
PET
PET
6-FAM
VIC
NED
NED
6-FAM
PET
VIC
FAM
FAM
6-FAM
HEX
HEX
TET
TET
TET
FAM
FAM
TET
TET
HEX
HEX
FAM
FAM
HEX
HEX
TET
TET
Color
blue
yellow
green
red
yellow
green
blue
red
red
blue
green
yellow
yellow
blue
red
green
Motivo
(GA)11
(CT)7
(TA)5
(GA)23
(CA)18(TA)7
(AT)5(GA)19
(AG)10
(GT)11
(CT)25
(CT)32
(CTT)
(GA)15(GAA)5
(AG)8
(AT)9
(CGG)8
(CATG)4
(GA)15
(GA)8GGTA(GA)5GGGGACG(AG)4
(GA)30
(GA)5AACAGAGT(GA)8
(CT)10T(CT)14
(CGCCAC)6
(TC)14
(TA)22
(GA)35
(TGC)6(TAG)3
(CT)33
(TCT)4
(AT)5
(GA)29
(AT)12
(AG)6
(CT)5
(TGAA)3
(AT)4(T)2
(AT)5
Panel Adicional
ID Marker
BMd45
BM151
pb min
92
146
pb max
130
154
PANEL
ADD
ADD
FLUORESCENCE
HEX
HEX
Color
Verde
Verde
Motivo
GGTTGGGAAGCCTCATACAG
CACAACAAGAAAGACCTCCT
Sequence
BM165
BM154
TCAAATCCCACACATGATCG
TCTTGCGACCGAGCTTCTCC
177
210
192
360
ADD
ADD
HEX
HEX
Verde
Verde
(TA)3(CA)9
(CT)17
101 (AG)5
(TC)14
2
2
2
2
4
4
2
2
2
2
3
5
2
2
3
4
2
17
2
12
5
6
2
2
2
6
2
3
2
2
2
2
2
4
3
2
Anexo 3. Diagrama en el que se observa el ciclo que sigue la muestra dentro del
secuenciador ABI 3730xl
102 Anexo 4. Descripción de características morfológicas de la semilla de fríjol
Cod
Brillo
Cod
Color Principal
Color Secundario
1
Blanco
‐
‐
Mediana
Opaco
101
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
3
Color Principal
Blanco
Color Secundario
‐
Patrón de Color
Venación
Mediana
Semi‐Brillante
102
Amarillo
‐
Venación
Pequeña
Semi‐Brillante
4
Café/Marrón
Café/Marrón
Rayado
Tamaño
Mediana
Semi‐Brillante
103
‐
Venación
Tamaño
Pequeña
Brillo
Semi‐Brillante
5
Café/Marrón
Rojo
Rayado
Mediana
Opaco
104
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
6
Amarillo
Rojo
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
105
Café/Marrón
‐
Venación
Pequeña
Semi‐Brillante
7
Amarillo
Rojo
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
107
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
8
Crema
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
109
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
9
Amarillo
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
110
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
Pequeña
Semi‐Brillante
10
Jaspeado
Pequeña
Opaco
112
Café/Marrón
11
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
114
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
12
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Pequeña
Opaco
115
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Opaco
15
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Pequeña
Opaco
116
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Opaco
Café/Marrón
Negro
Café/Marrón
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Opaco
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Pequeña
Opaco
118
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Opaco
Amarillo
Café/Marrón
Jaspeado
Mediana
Opaco
119
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Opaco
‐
Pequeña
Pequeña
Opaco
117
Opaco
16
‐
Jaspeado
‐
17
Amarillo
Negro
‐
19
20
Semi‐Brillante
121
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Opaco
21
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
122
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
23
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
124
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
Semi‐Brillante
24
Amarillo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
126
Rosado
‐
‐
Pequeña
25
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
127
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
26
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
128
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Opaco
27
Amarillo
‐
‐
Mediana
Opaco
129
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
28
Amarillo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
130
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Opaco
30
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Opaco
Mediana
Semi‐Brillante
131
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Opaco
31
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
133
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
32
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
134
Negro
‐
‐
Pequeña
33
Morado/Púrpura
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
136
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
34
Rojo
Crema
Moteado
Grande
Semi‐Brillante
137
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
35
139
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
36
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
140
Negro
‐
‐
Mediana
Opaco
37
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
141
Negro
‐
‐
Mediana
Opaco
Opaco
38
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
142
Negro
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
39
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
143
Negro
‐
‐
Mediana
Opaco
40
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
144
Negro
‐
‐
Mediana
41
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
145
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
43
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
146
Negro
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
44
Amarillo
Rojo
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
147
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
45
Amarillo
‐
Mediana
Negro
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
149
Negro
‐
Opaco
Semi‐Brillante
46
Crema
Negro
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
150
Negro
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
47
Crema
Negro
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
151
Negro
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
48
Crema
Negro
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
152
Negro
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
49
Crema
Negro
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
153
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
50
Crema
Negro
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
154
Negro
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
Crema
Negro
Rayado
‐
Mediana
54
Mediana
Semi‐Brillante
155
Negro
‐
Semi‐Brillante
55
Crema
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
156
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
56
Crema
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
157
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
58
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
158
Café/Marrón
Café/Marrón
Jaspeado
Pequeña
Semi‐Brillante
Café/Marrón
59
Rojo
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
159
Gris/Raros
61
Rosado
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
162
Café/Marrón
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
62
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
163
Café/Marrón
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
Semi‐Brillante
64
Rojo
‐
‐
Moteado
Pequeña
Opaco
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
164
Crema
Negro
Rayado
Mediana
66
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
165
Café/Marrón
Negro
Moteado
Mediana
Opaco
69
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
166
Amarillo
‐
‐
Mediana
Opaco
70
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
170
Blanco
Negro
Jaspeado
Pequeña
Opaco
71
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
171
Crema
Negro
Jaspeado
Pequeña
Semi‐Brillante
72
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
172
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Pequeña
Semi‐Brillante
Semi‐Brillante
73
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
174
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Mediana
74
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
175
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
76
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
176
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
77
Rosado
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
177
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
78
Negro
Crema
Moteado
Grande
Semi‐Brillante
180
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
Semi‐Brillante
80
Amarillo
‐
Venación
Mediana
Opaco
181
Café/Marrón
Café/Marrón
Moteado
Pequeña
81
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
182
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
82
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
184
Café/Marrón
Negro
Moteado
Pequeña
Semi‐Brillante
87
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
185
Crema
‐
Venación
Pequeña
Semi‐Brillante
88
Amarillo
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
186
Crema
‐
Venación
Pequeña
Semi‐Brillante
89
Rosado
Café/Marrón
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
187
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
90
Amarillo
‐
Venación
Venación
Mediana
Semi‐Brillante
188
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
92
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Pequeña
Rojo
‐
‐
Mediana
93
Crema
Negro
Jaspeado
Mediana
Opaco
191
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
94
Amarillo
‐
Venación
Pequeña
Opaco
Opaco
192
189
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
95
Amarillo
‐
Venación
Mediana
Semi‐Brillante
193
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
96
Amarillo
‐
Venación
Mediana
Semi‐Brillante
194
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
103 Amarillo
Patrón de Color
Semi‐Brillante
Anexo 4. (cont.) Descripción de características morfológicas de la semilla de fríjol
Cod
Color Principal
Color Secundario
Patrón de Color
Tamaño
Brillo
Cod
Color Principal
Color Secundario
Patrón de Color
Tamaño
Brillo
196
Negro
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
301
Amarillo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
199
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
302
Amarillo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
201
Crema
Rojo
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
303
‐
Mediana
Semi‐Brillante
204
Crema
Rojo
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
310
Amarillo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
205
Crema
Rojo
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
311
Café/Marrón
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
206
Crema
Rojo
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
312
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
207
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
316
Amarillo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
209
Café/Marrón
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
319
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
211
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
320
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
212
Café/Marrón
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
321
Rojo
Crema
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
214
Café/Marrón
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
325
Negro
Crema
Moteado
Grande
Semi‐Brillante
215
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
326
Amarillo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
216
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
328
Crema
Café/Marrón
Jaspeado
Pequeña
217
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
329
Crema
Rojo
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
218
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
332
Crema
Rojo
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
219
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
333
Crema
Rojo
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
220
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
335
Crema
Rojo
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
221
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
336
Crema
Rojo
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
223
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
338
Crema
Negro
Rayado
Mediana
224
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
340
Crema
Negro
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
226
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
341
Crema
Negro
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
Mediana
‐
Semi‐Brillante
Semi‐Brillante
Semi‐Brillante
227
Rojo
‐
‐
Semi‐Brillante
345
Crema
Negro
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
229
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Pequeña
Semi‐Brillante
357
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
230
Amarillo
Café/Marrón
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
359
Amarillo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
231
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
368
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
232
Café/Marrón
Rojo
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
370
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
Pequeña
Semi‐Brillante
Moteado
Mediana
234
Crema
‐
‐
235
Café/Marrón
Café/Marrón
Venación
Pequeña
Opaco
373
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
236
Rojo
‐
‐
Pequeña
Opaco
374
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
375
238
371
Rojo
Crema
Semi‐Brillante
Rojo
‐
‐
Mediana
Opaco
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
240
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
376
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
242
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
377
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
243
Negro
‐
‐
Mediana
Opaco
379
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
244
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
383
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
245
Rojo
Café/Marrón
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
384
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
246
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
385
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
247
Café/Marrón
Rojo
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
386
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
249
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
389
Rojo
‐
‐
Grande
Semi‐Brillante
253
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
390
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
255
Gris/Raros
Café/Marrón
Moteado
Pequeña
Opaco
393
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
257
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
394
Rojo
‐
‐
Grande
Semi‐Brillante
258
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
397
Rojo
‐
‐
Grande
Brillante
259
Café/Marrón
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
399
Rojo
‐
‐
Grande
260
Café/Marrón
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
400
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
266
Amarillo
Café/Marrón
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
404
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
267
Crema
‐
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
408
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
Semi‐Brillante
268
Pequeña
Brillante
Rojo
‐
Punteado
Semi‐Brillante
410
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
269
Rojo
‐
Punteado
Pequeña
Semi‐Brillante
415
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
270
Amarillo
‐
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
421
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
271
Café/Marrón
‐
Punteado
Pequeña
Semi‐Brillante
426
Crema
Negro
Moteado
Pequeña
Semi‐Brillante
Semi‐Brillante
272
Crema
‐
Punteado
Pequeña
Semi‐Brillante
428
Rojo
‐
‐
Pequeña
Brillante
273
Gris/Raros
Café/Marrón
Punteado
Pequeña
Semi‐Brillante
429
Rojo
‐
‐
Pequeña
Brillante
274
Gris/Raros
Café/Marrón
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
434
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
275
Café/Marrón
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
436
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
277
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
438
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
278
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
440
Negro
‐
‐
Pequeña
279
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
441
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
281
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
444
Negro
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
‐
‐
Opaco
282
Amarillo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
445
Negro
Pequeña
Opaco
283
Gris/Raros
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
454
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
284
Blanco
‐
‐
Mediana
Opaco
459
Crema
Negro
Moteado
Pequeña
Semi‐Brillante
285
Blanco
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
461
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
287
Blanco
‐
‐
Mediana
Opaco
464
Café/Marrón
‐
‐
Grande
Semi‐Brillante
288
Crema
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
465
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
289
Crema
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
468
Rojo
‐
‐
Grande
Semi‐Brillante
290
Crema
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
474
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
291
Crema
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
475
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Pequeña
Semi‐Brillante
292
Café/Marrón
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
476
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
295
Café/Marrón
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
478
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
296
Café/Marrón
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
479
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
297
Crema
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
480
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
298
Café/Marrón
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
481
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
299
Café/Marrón
Negro
Rayado
Grande
Semi‐Brillante
492
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
Negro
104 Amarillo
Pequeña
Semi‐Brillante
Anexo 4. (cont.) Descripción de características morfológicas de la semilla de fríjol
Cod
Color Principal
Color Secundario
Patrón de Color
Tamaño
Brillo
497
Crema
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
498
Crema
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
500
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
507
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
509
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
514
Café/Marrón
Negro
‐
Grande
Semi‐Brillante
516
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
518
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
522
Amarillo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
523
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
526
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
528
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
530
Amarillo
Café/Marrón
Punteado
Mediana
Semi‐Brillante
536
Gris/Raros
Café/Marrón
‐
Mediana
Semi‐Brillante
538
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
539
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Pequeña
Semi‐Brillante
540
Crema
Negro
Jaspeado
Pequeña
Semi‐Brillante
542
Rojo
Crema
Moteado
Grande
Semi‐Brillante
550
Café/Marrón
Café/Marrón
Moteado
Pequeña
Semi‐Brillante
552
Crema
Rojo
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
554
Café/Marrón
Café/Marrón
Jaspeado
Pequeña
Semi‐Brillante
556
Crema
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
557
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
563
Crema
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
564
Crema
Negro
Moteado
Pequeña
Semi‐Brillante
567
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
568
Café/Marrón
Negro
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
570
Crema
Negro
Moteado
Pequeña
Semi‐Brillante
572
Crema
Negro
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
573
Crema
Negro
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
574
Café/Marrón
Negro
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
575
Crema
Negro
Jaspeado
Mediana
Semi‐Brillante
582
Café/Marrón
Crema
Moteado
Pequeña
Semi‐Brillante
586
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
595
Negro
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
596
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
597
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
601
Negro
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
603
Negro
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
604
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaco
605
Negro
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
606
Café/Marrón
Negro
Rayado
Mediana
Semi‐Brillante
609
Rojo
‐
‐
Grande
Semi‐Brillante
611
Rosado
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
613
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
620
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
625
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
630
Café/Marrón
‐
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
631
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
634
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
636
Morado/Púrpura
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
637
Café/Marrón
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
640
Café/Marrón
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
642
Crema
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
647
Crema
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
655
Rojo
Crema
Moteado
Mediana
Semi‐Brillante
667
Negro
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
672
Crema
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
674
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
676
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
678
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
679
Rojo
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
682
Café/Marrón
‐
‐
Pequeña
Semi‐Brillante
CALIMA
Rojo
Crema
Moteado
Grande
Brillante
DOR364
Rojo
‐
‐
Mediana
Semi‐Brillante
G19833
Café/Marrón
Rojo
Jaspeado
Grande
Brillante
ICA‐PIJAO
Negro
‐
‐
Pequeña
Opaca
105 Anexo 5. Prueba F y t de comparación de varianzas y medias para los parámetros
de diversidad analizados en la población de estudio
Two Sample Test for Variances of Het__Observada_ and Het__Observada_1 1 15:13 Wednesday, October 31, 2007 Sample Statistics Group N Mean Std. Dev. Variance ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Het__Observada_ 16 0.2025 0.1729 0.029887 Het__Observada_1 14 0.172143 0.1925 0.037064 Hypothesis Test Null hypothesis: Variance 1 / Variance 2 = 1 Alternative: Variance 1 / Variance 2 ^= 1 ‐ Degrees of Freedom ‐ F Numer. Denom. Pr > F ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 0.81 15 13 0.6832 R// varianzas no diferentes distribución prueba f 106 Anexo 5 (cont). Prueba F y t de comparación de varianzas y medias para los
parámetros de diversidad analizados en la población de estudio
Prueba t Two Sample t‐test for the Means of Het__Observada_ and Het__Observada_1 3 Sample Statistics Group N Mean Std. Dev. Std. Error ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Het__Observada_ 16 0.2025 0.1729 0.0432 Het__Observada_1 14 0.172143 0.1925 0.0515 Hypothesis Test Null hypothesis: Mean 1 ‐ Mean 2 = 0 Alternative: Mean 1 ‐ Mean 2 ^= 0 If Variances Are t statistic Df Pr > t ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Equal 0.455 28 0.6525 Not Equal 0.452 26.42 0.6551 R/// Medias no diferentes, igual se toma la primera por la prueba f que dijo que no son
diferentes
Distribucion t 107 Anexo 5 (cont). Prueba F y t de comparación de varianzas y medias para los
parámetros de diversidad analizados en la población de estudio
Para diversidad Two Sample Test for Variances of Diversidad_Gen_tica and Diversidad_Gen_tica1 1 Sample Statistics Group N Mean Std. Dev. Variance ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Diversidad_Gen_tica 16 0.706875 0.1842 0.033916 Diversidad_Gen_tica1 14 0.526429 0.1885 0.035517 Hypothesis Test Null hypothesis: Variance 1 / Variance 2 = 1 Alternative: Variance 1 / Variance 2 ^= 1 ‐ Degrees of Freedom ‐ F Numer. Denom. Pr > F ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 0.95 15 13 0.9224 R// varianzas no diferentes distribución prueba f 108 Anexo 5 (cont). Prueba F y t de comparación de varianzas y medias para los
parámetros de diversidad analizados en la población de estudio
Two Sample t‐test for the Means of Diversidad_Gen_tica and Diversidad_Gen_tica1 2 Sample Statistics Group N Mean Std. Dev. Std. Error ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Diversidad_Gen_tica 16 0.706875 0.1842 0.046 Diversidad_Gen_tica1 14 0.526429 0.1885 0.0504 Hypothesis Test Null hypothesis: Mean 1 ‐ Mean 2 = 0 Alternative: Mean 1 ‐ Mean 2 ^= 0 If Variances Are t statistic Df Pr > t ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Equal 2.649 28 0.0131 Not Equal 2.644 27.29 0.0134 R// medias diferentes distribución prueba t 109 Anexo 6. ANOVA para contenidos de minerales (hierro y zinc) a partir de las
poblaciones generadas mediante PCoA.
The GLM Procedure
Class Level Information
Class
Levels
Values
grupo_
6
1 2 3 4 5 6
Number of observations
353
NOTE: All dependent variables are consistent with respect to the presence or
absence of missing values. However only 343 observations can be used in this
analysis.
09:39 Wednesday, November 14, 2007
2
The GLM Procedure
Dependent Variable: Fe_
Sum of
Source
DF
Model
5
Error
337
Corrected Total
342
R-Square
0.022779
Source
grupo_
Coeff Var
12.25295
DF
5
Fe
Squares
549.41626
23570.50801
24119.92427
Root MSE
8.363143
Type III SS
549.4162648
Mean Square
109.88325
69.94216
F Value
1.57
Pr > F
0.1676
Fe_ Mean
68.25414
Mean Square
109.8832530
F Value
1.57
Pr > F
0.1676
09:39 Wednesday, November 14, 2007
The GLM Procedure
Dependent Variable: Zn_
Sum of
Source
DF
Model
5
Error
337
Corrected Total
342
R-Square
0.127856
Source
grupo_
Coeff Var
9.196127
DF
5
Zn
Squares
496.840452
3389.091097
3885.931549
Root MSE
3.171222
Type III SS
496.8404522
Mean Square
99.368090
10.056650
Zn_ Mean
34.48432
Mean Square
99.3680904
110 F Value
9.88
F Value
9.88
Pr > F
<.0001
Pr > F
<.0001
3
Anexo 6 (cont). ANOVA para contenidos de minerales (hierro y zinc) a partir de las
poblaciones generadas mediante PCoA.
09:39 Wednesday, November 14, 2007
The GLM Procedure
Least Squares Means
LSMEAN
grupo_
Fe_ LSMEAN
Number
1
68.5490573
1
2
69.1892573
2
3
67.4307669
3
4
66.6529650
4
5
65.4870095
5
6
70.9563438
6
Least Squares Means for effect grupo_
Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j)
Dependent Variable: Fe_
i/j
1
2
3
4
5
6
1
2
0.6202
0.6202
0.4379
0.2644
0.1480
0.3054
0.1497
0.0944
0.0607
0.4257
3
4
5
0.4379
0.1497
0.2644
0.0944
0.6359
0.1480
0.0607
0.3479
0.6052
0.6359
0.3479
0.1272
0.6052
0.0829
LSMEAN
Zn_ LSMEAN
grupo_
6
0.3054
0.4257
0.1272
0.0829
0.0496
0.0496
Number
1
35.5382718
1
2
33.0242438
2
3
35.4809358
3
4
35.7669388
4
5
33.9813857
5
6
35.1076594
6
Least Squares Means for effect grupo_
Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j)
Dependent Variable: Zn_
i/j
1
2
3
4
5
6
1
<.0001
0.9164
0.7224
0.0527
0.6285
2
3
<.0001
0.9164
<.0001
<.0001
<.0001
0.2003
0.0136
0.6461
0.0567
0.6697
4
0.7224
<.0001
0.6461
0.0374
0.4827
5
0.0527
0.2003
0.0567
0.0374
6
0.6285
0.0136
0.6697
0.4827
0.2853
0.2853
NOTE: To ensure overall protection level, only probabilities associated with
pre-planned
comparisons should be used.
111 4
Anexo 6 (cont). ANOVA para contenidos de minerales (hierro y zinc) a partir de las
poblaciones generadas mediante PCoA.
9:39 Wednesday, November 14, 2007
5
The GLM Procedure
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test for Fe_
NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate.
Alpha
0.05
Error Degrees of Freedom
337
Error Mean Square
69.94216
Harmonic Mean of Cell Sizes 34.79191
NOTE: Cell sizes are not equal.
Number of Means
Critical Range
2
4.8120927
3
4
5.2402928 5.4729326
5
5.4993403
6
5.7471385
Means with the same letter are not significantly different.
REGWQ Grouping
A
A
A
A
A
A
Mean
70.956
A
69.189
A
68.549
A
67.431
A
66.653
A
65.487
N
grupo_
16
6
130
2
62
1
74
3
40
4
21
5
09:39 Wednesday, November 14, 2007
The GLM Procedure
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test for Zn_
NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate.
Alpha
0.05
Error Degrees of Freedom
337
Error Mean Square
10.05665
Harmonic Mean of Cell Sizes 34.79191
NOTE: Cell sizes are not equal.
Number of Means
Critical Range
2
1.8246986
3
1.9870679
4
2.0752826
5
2.0852962
6
2.1792588
Means with the same letter are not significantly different.
112 6
Anexo 6 (cont). ANOVA para contenidos de minerales (hierro y zinc) a partir de las
poblaciones generadas mediante PCoA.
REGWQ Grouping
A
A
A
A
B
B
A
Mean
35.7669
A
35.5383
A
35.4809
A
35.1077
A
33.9814
B
33.0242
113 N
40
4
62
1
74
3
16
6
grupo_
21
5
130
2
Anexo 7. Tablas de contingencia que describen la distribución de cada
característica morfológica (color, patrón de coloración y tamaño) dentro de cada
grupo de PCoA formado.
vember 14, 2007
1
The FREQ Procedure
Table of clustert by color
clustert
color
Frequency|Amarillo|Blanco |Cafe/Mar|Crema
|Gris/Rar|Morado/P|Negro
|Rojo
|Rosado |
|
|
|ron
|
|os
|urpura |
|
|
|
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
1 |
14 |
1 |
19 |
5 |
0 |
0 |
16 |
8 |
2 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
2 |
23 |
0 |
17 |
31 |
1 |
2 |
2 |
55 |
1 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
3 |
14 |
2 |
28 |
11 |
4 |
0 |
15 |
5 |
0 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
4 |
2 |
0 |
14 |
2 |
1 |
0 |
8 |
15 |
1 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
5 |
4 |
1 |
14 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
6 |
5 |
2 |
2 |
1 |
0 |
0 |
2 |
4 |
1 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
7 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
Total
62
6
94
52
6
2
43
89
5
Table of clustert by patron
clustert
patron
Frequency|Jaspeado|Moteado |NP
|Punteado|Rayado |Venacion|
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
1 |
3 |
5 |
51 |
1 |
1 |
4 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
2 |
6 |
29 |
48 |
11 |
38 |
0 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
3 |
8 |
9 |
54 |
4 |
0 |
4 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
4 |
0 |
2 |
37 |
1 |
0 |
3 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
5 |
15 |
2 |
3 |
0 |
0 |
1 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
6 |
0 |
2 |
11 |
3 |
0 |
1 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
7 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
8 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
---------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
Total
32
49
205
21
39
13
The FREQ Procedure
Table of clustert by tamano
clustert
tamano
Frequency|Grande |Mediana |Pequena |
---------+--------+--------+--------+
1 |
0 |
13 |
52 |
---------+--------+--------+--------+
2 |
28 |
100 |
4 |
---------+--------+--------+--------+
3 |
0 |
29 |
50 |
---------+--------+--------+--------+
4 |
0 |
1 |
42 |
---------+--------+--------+--------+
5 |
0 |
12 |
9 |
---------+--------+--------+--------+
6 |
0 |
10 |
7 |
---------+--------+--------+--------+
7 |
0 |
0 |
1 |
---------+--------+--------+--------+
8 |
0 |
0 |
1 |
---------+--------+--------+--------+
Total
28
165
166
114 Total
65
132
79
43
21
17
1
1
359
Total
65
132
79
43
21
17
1
1
359
Total
65
132
79
43
21
17
1
1
359
Anexo 8. Comparación de agrupación de genotipos entre el índice de Disimilaridad de DICE utilizado por el software Darwin y las agrupaciones por PCoA. Pcoa
M
A
M+I
M
M
M+I
raro
raro
1
2
3
4
5
6
7
8
Total
ggd ( GRANDES GRUPOS Darwin)
A_FGHI I____E I___J M_ABCD
65
126
1
5
7
3
69
43
21
1
6
4
6
1
1
127
15
12
205
115 Total
65
132
79
43
21
17
1
1
359