Triquinelosis

CAPITULO 2.2.9.
TRIQUINELOSIS
RESUMEN
La infección que causa la Trichinella en los animales destinados a la alimentación y los de caza es
importante debido al riesgo que dicha infección comporta para los humanos que consumen carne
cruda o poco cocinada. Los adultos de las especies de la Trichinella sobreviven menos de dos
meses y se pueden encontrar en el intestino delgado de los humanos, los cerdos, las ratas, los
osos, las morsas, y en cualquier otro mamífero carnívoro y ocasionalmente en caballos. Las larvas
de la mayoría de los genotipos de la Trichinella se sitúan en los tejidos musculares de sus
hospedadores y la ingestión de tejido que contenga dichas larvas, transmite la infección a los
individuos susceptibles.
Las pruebas de diagnóstico para la infección por Trichinella se agrupan en dos tipos: 1) la
detección directa de la primera etapa de la larva enquistada o libre en tejido de músculo estriado, y
2) la detección indirecta de la infección mediante pruebas para anticuerpos específicos. La
sensibilidad y especificidad de los métodos serológicos están estrechamente relacionadas con el
tipo y la calidad del antígeno utilizados. En los cerdos se ha alcanzado un buen nivel de validación.
Sin embargo, una respuesta serológica en cerdos con indicios de infección moderada, no se
detecta comúnmente hasta las 3 semanas o más después de que las larvas de los músculos se
hacen infectivas. En tales casos se podría obtener un resultado serológico falso negativo. Se ha
descrito un índice bajo de resultados falsos positivos en las pruebas serológicas. Con el fin de
efectuar una inspección de la carcasa individual, sólo pueden recomendarse los métodos directos.
Para un seguimiento o verificación de las manadas o regiones libres de triquinas, son aceptables
los métodos serológicos.
Identificación del agente: Para detectar directamente la infección por Trichinella se utilizan dos
métodos: el método de compresión o el método de digestión del tejido muscular. Ambos métodos
prueban la presencia de parásitos en los tejidos donde la infección es más fuerte, siendo la
incidencia de los mismos en los cerdos, de mayor a menor: en primer lugar sobre el diafragma,
luego la lengua, y, los músculos maseteros y abdominales, aunque esto depende en parte del
grado de infección. En los caballos, los músculos de la lengua y los maseteros hospedan la
mayoría de las lombrices seguidos por el diafragma y los músculos del cuello.
El método de compresión consiste en una inspección visual de piezas comprimidas de tejido
muscular para comprobar la presencia de las larvas “in situ”. Este método se puede llevar a cabo
con un estéreomicrospcopio, pero generalmente se utiliza un microcopio especializado como el
triquinoscopio que tiene una eficacia estimada de detección de como mínimo tres larvas por gramo
de tejido. Este método tiene la desventaja de que requiere mucho tiempo para la inspección de
múltiples muestras de cada carcasa. También es muy difícil detectar la larva de T. pseudospiralis,
T. papuae, y T. zimbabwensis de los cocodrilos africanos, que no estén envueltas en colágeno. Por
estas razones, la compresión no está recomendada en una inspección rutinaria, pero es útil para
detectar medianas a grandes infecciones, cuando se necesita examinar unos pocos animales y las
instalaciones no están preparadas para una prueba de digestión artificial.
Los métodos de digestión artificial incluyen la digestión enzimática de muestras de tejido muscular
individuales o agrupadas, seguida de procedimientos de revisión selectiva, de filtración y de
sedimentación. Las muestras procesadas con estos métodos se examinan microscópicamente
para comprobar la presencia de larvas. Los métodos de digestión incluyen homogenización y
agitación mecánica, usándose una muestra de 1 g para cerdos y otra de 10 g para animales de
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caza y caballos y tienen una eficacia de aproximadamente 3 larvas por gramo de tejido examinado.
Estos métodos se recomiendan en la inspección individual de carcasas de cerdos, caballos y
animales de caza cuando su carne está destinada al consumo humano.
Pruebas Serológicas: El enzimoinmunoensayo (ELISA) es el único método apropiado para la
detección ante–mortem de la infección por Trichinella y en los cerdos se han detectado niveles de
1 larva/100 g de tejido. La especificidad de ELISA para detectar la infección por Trichinella está
directamente relacionada con el tipo y la calidad del antígeno empleado en la prueba. Los
antígenos secretores que se han recogidos manteniendo in vitro por breve tiempo las larvas
T. spiralis del músculo y los antígenos carbohidratados sintéticos, proporcionan actualmente la
fuente más específica y económica, aunque en algunos estudios se han obtenido índices bajos de
falsos positivos.
Se puede obtener un índice bajo de resultados falsos negativos en un ELISA con animales
recientemente infectados que tienen un grado de infección bajo. Por esta razón se recomienda el
uso de antígenos secretores en un ELISA para programas de seguimiento pero no en pruebas de
carcasas individuales. Se recomienda la digestión de 100 g o más de tejido como prueba
confirmatoria para animales serológicamente positivos.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: La vacuna para la infección por
Trichinella no es práctica en animales destinados a la alimentación. No se requieren reactivos
biológicos en los métodos directos de detección. En los métodos indirectos (serológicos) se deben
usar los antígenos TSL–1 para garantizar la especificidad de la prueba. Estos antígenos pueden
obtenerse como productos secretores recuperados a partir del mantenimiento de las larvas del
músculo in–vitro o como antígenos carbohidratados sintéticos producidos comercialmente.
A. INTRODUCCIÓN
La infección por Trichinella en animales destinados a la alimentación es importante debido al riesgo de
triquinelosis en los humanos que comen carne cruda o poco cocida. Los adultos de Trichinella sp. se pueden
encontrar en el intestino delgado de los humanos, cerdos, ratas, osos, morsas y en cualquier otro mamífero
carnívoro, pero también puede afectar a los caballos, los pájaros y los cocodrilos. El parásito tiene un ciclo de
vida directo. Las hembras son ovovivíparas. Las larvas se esparcen en las venas mamarias, entran en la
glándula linfática, alcanzan la sangre venosa y entonces muchas mueren, otras sobreviven estableciéndose en
los músculos estriados, especialmente los del diafragma y la lengua de los cerdos y la lengua y los músculos
maseteros de los caballos. Las larvas se enquistan en el tejido muscular y la ingestión del tejido que contiene
estas larvas transmite la infección a otro hospedador.
Se reconocen 8 especies de Trichinella (19, 23, 24). La Trichinella spiralis (también llamada T–1) que se
distribuye en zonas templadas de todo el mundo y se asocia comúnmente con cerdos domésticos. Es muy
infecciosa para los cerdos, ratones y ratas. La Trichinella nativa (T–2) y sus sub–especies, la Trichinella T–6
encontrada en Norteamérica, es una especie adaptada a los climas fríos. Es moderadamente infecciosa para los
cerdos, pero se encuentra comúnmente en cánidos, osos y morsas. Además se distingue por su resistencia a la
congelación. La Trichinella britovi (T–3) se encuentra principalmente en animales salvajes, aunque
ocasionalmente se pueda encontrar en cerdos o caballos. Se da en regiones templadas de Europa y Asia. La
Trichinella britovi y los genotipos con ella relacionados, Trichinella T–8 de Sudáfrica y Trichinella T–9 de Japón,
tienen algunas características intermedias de otras especies, incluyendo una cierta resistencia a la congelación,
infectividad moderada en los cerdos y formación lenta de cápsulas (en algunos casos las larvas han sido
confundidas con especies no encapsuladas). La Trichinella murrelli (T–5) es una especie de Norteamérica
encontrada en la fauna silvestre y ocasionalmente en caballos y en humanos. Es muy poco infectiva para los
cerdos domésticos, pero representa un riesgo para los humanos que comen carne de caza. Se ha aislado
Trichinella nelsoni (T–7) esporádicamente de la fauna silvestre de África. Se caracteriza por su gran resistencia a
temperaturas elevadas comparada con otras especies de Trichinella. Tres especies de Trichinella no forman
cápsula de colágeno en el músculo. La Trichinella pseudospiralis (T–4) tiene una distribución cosmopolita y ha
sido recuperada de las aves de rapiña, de los carnívoros salvajes y de los omnívoros, ratas y marsupiales, en
Asia, Norteamérica, Europa y el subcontinente Australiano. La Trichinella papuae (T–10) es una segunda especie
que no forma cápsula. Hasta la fecha sólo se ha descubierto en cerdos salvajes y en humanos de Papua en
Nueva Guinea. Es resistente a la congelación, tiene poca infectividad para los cerdos y se encuentra en una gran
variedad de animales mamíferos salvajes y ha sido señalada como causante de enfermedad en los humanos.
Recientemente se ha descubierto la Trichinella zimbabwensis (T–11) en cocodrilos de granjas de Zimbabwe. Las
especies pueden infectar a los cerdos y a las ratas. Todas las especies y los genotipos de Trichinella causan
enfermedad en los humanos.
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La triquinelosis en los humanos es una enfermedad seria que puede causar mucho sufrimiento y ocasionar la
muerte. Las lombrices pueden tener poco efecto en los intestinos, pero pueden ocurrir señales y síntomas
severos como resultado de la migración de las larvas y su presencia en los músculos estriados. La enfermedad
se transmite por comer carne infectada que no ha sido suficientemente cocinada (o que sea segura por cualquier
otro procedimiento). Para prevenir la infección en los humanos es necesario inspeccionar la carne procesándola
(bien sea cocinándola, congelándola o curándola) y evitando el contacto de los animales comestibles con carne
infectada, incluyendo desperdicios de comida sin cocinar, con roedores y con otros animales salvajes. La carne
procedente de la caza debería considerarse siempre como una fuente potencial de infección y, por tanto, dicha
carne debe ser controlada o cocinada cuidadosamente. La Trichinella que se encuentra en la carne procedente
de la caza (principalmente la T. nativa, la T–6 y, en menor grado, la T. britovi) puede ser resistente a la
congelación y, por lo tanto, la carne congelada puede también representar un riesgo para la salud pública.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Los métodos para detectar la infección por Trichinella en los cerdos y en otras especies pueden agruparse según
dos tipos de resultado: (a) la demostración directa del parásito en muestras de tejido o digesto; (b) la
demostración indirecta del parásito mediante la detección de anticuerpos específicos usando los métodos
serológicos.
1.
Identificación del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)
La demostración directa de los parásitos se limita a la inspección post–mortem de las carcasas. La sensibilidad
de los métodos de prueba directos depende de la cantidad de tejido examinado y del lugar del que se ha obtenido
la muestra. Los métodos de prueba actuales mediante la digestión artificial en los que se utiliza una muestra de 1
g (2, 3), tienen una sensibilidad de aproximadamente 3 larvas por gramo de tejido (9, 13); utilizando una muestra
de 5 g aumenta la sensibilidad a 1 larva por gramo de tejido. Los métodos directos permitirán la identificación de
cerdos, caballos u otros animales infectados en un plazo mínimo de 17 días después de la exposición al parásito,
intervalo que coincide con el tiempo necesario para que las larvas alojadas en los músculos, adquieran la
capacidad de infectar a un nuevo hospedador. Los métodos directos continúan siendo efectivos siempre y
cuando las larvas permanezcan viables. La sensibilidad de esta prueba aumenta considerablemente cuando
grandes cantidades de tejido (hasta 100 g) están disponibles para la digestión. El inconveniente de los métodos
de detección directa, en especial la triquinoscopia, radica en su larga y laboriosa ejecución.
Generalmente se utilizan dos métodos para el diagnóstico directo de la triquinelosis.
a)
Método del triquinoscopio o de compresión.
El uso de la triquinoscopía para el examen de carne de cerdo ha sido descrito con anterioridad en otras
fuentes. (2, 3). Las muestras para esta prueba se toman de los pilares del diafragma y se trocean en al
menos 28 pedazos, de un tamaño aproximado de 2 x 10 mm. cada uno. La lengua, los músculos maseteros
y los músculos abdominales son zonas alternativas para la extracción del tejido, aunque se necesitan
muestras más grandes para obtener una sensibilidad comparable. (Los sitios del músculo preferidos por las
larvas varían en función de las especies hospedadoras y sólo se han establecido con certeza en los cerdos
y en los caballos. Por regla general, la lengua es uno de los músculos más infectados). Los tejidos se
comprimen entre placas de vidrio (compresor de Hauptner Herberholz, Solingen, Alemania) hasta que se
vuelven translúcidos. Es entonces cuando se pueden examinar en busca de larvas utilizando un
microscopio de proyección diseñado especialmente a tal efecto, el triquinoscopio, aunque también cabe
usar un estéreomicroscopio convencional a 15–40 aumentos. La mayoría de las larvas aparecerán
enroscadas dentro de una fibra de músculo individual y la célula muscular tiene casi siempre una forma
ovalada debido a la formación de la cápsula. En el caso de infecciones graves pueden observarse múltiples
larvas dentro de una sola célula.
Las Trichinella no encapsulada como la T. pseudospiralis, la T. papuae y la T. zimbabwensis de los
cocodrilos puede observarse fuera de las células musculares, que por lo general no están enroscadas,
siendo muy difícil la identificación de estas especies mediante la triquinoscopía. Debido a esta limitación y a
su baja sensibilidad comparada con los métodos de digestión artificiales, la triquinoscopía y los métodos de
compresión similares no se recomiendan para el examen rutinario de la carne de animales destinados a la
alimentación y de animales de caza.
b)
El método de la digestión
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El tejido muscular puede digerirse con fluido gástrico artificial liberando las triquinas vivas de los músculos.
En la Unión Europea (2, 3) se recomiendan los procedimientos digestivos, y pueden consultarse las
Directivas de la UE para más detalles. Muchos otros países tienen una legislación similar para la inspección
post–mortem de la carne de cerdo (8) y de caballo (4). La Comisión Internacional para la Triquinelosis (ICT)
también proporciona directrices generales sobre la aplicación de los métodos artificiales de digestión.
El “método del agitador magnético para muestras agrupadas”, ampliamente usado, puede emplearse en
gran número de circunstancias con un equipamiento mínimo. He aquí un esbozo general de los principios
de este método:
•
Toma de muestras
Las muestras de músculo se toman de los pilares del diafragma o de la lengua de los cerdos, o de la lengua
o músculos maseteros de los caballos; por regla general, la lengua es uno de los músculos más infectados.
Otras zonas tienen, por lo general, un número inferior de larvas. El tamaño de las muestras puede variar.
Pueden tomarse muestras individuales de 100 g de un animal o se pueden recoger múltiples muestras de
varios animales para hacer un agrupamiento de 100 g. El tamaño de las muestras que componen este
último agrupamiento determinará la sensibilidad el método. Las directivas de la UE exigen muestras de 1–g
en agrupamientos de 100–g para los ensayos con carcasas de cerdos. En los Estados Unidos de América
(EE.UU.) se requieren muestras de 5–g para los cerdos, y en Canadá se ensayan 10 g por cerdo. En el
caso de zonas endémicas, la ICT recomienda utilizar un mínimo de 5–g. Para pruebas con carne de caballo,
la UE exige muestras de un mínimo de 5 g. Para la carne de los caballos originarios de zonas endémicas,
se recomiendan muestras de 10 g. Para facilitar la digestión de las muestras es necesario triturarlas,
desmenuzarlas o cortarlas en dados antes de la prueba.
•
Digestión y recuperación
Cada unidad de 100 g de tejido se digiere en 1 a 2 litros de fluido gástrico artificial, que contenga pepsina al
1% (w/v) (concentración 1/10.000 formulada por estándares nacionales) y ácido clorhídrico al 1% (v/v) (0,12
N final). Se introduce la muestra troceada o triturada en el fluido digestivo y se remueve la mezcla con un
agitador magnético a 37°C durante 3 horas (o durante menos tiempo a temperatura superior (por ejemplo,
30–60 minutos a 44–46°C)). Al finalizar la digestión se deja sedimentar el producto de la digestión durante
15–20 minutos y a continuación se decantan los dos tercios superiores del fluido. Se transfieren el líquido
restante y el sedimento a un vaso cónico de sedimentación haciéndolos pasar por una malla de filtro de 355
µm (177–180 µm también es aceptable) y se deja sedimentar durante otros 15–20 minutos. Transcurrido
este tiempo se aspira el máximo volumen posible de sobrenadante, sin remover el sedimento: se lava este
último con agua caliente del grifo a (37°C) y se deja reposar por otros 15–20 minutos. Esta operación de
lavado se repite tantas veces como sea necesario hasta que el sobrenadante no muestre la menor turbidez.
Se transfiere entonces el sedimento lavado a un tubo de 50–ml, se deja reposar y se aspira el contenido
hasta alcanzar un volumen final de 10 ml. Los 10 ml se vierten en una placa de Petri con rejilla y se
examinan para larvas Trichinella con un microscopio de disección (a 15–40 aumentos). Alternativamente,
tras preparar la digestión en 3 litros de fluido gástrico artificial, se puede colar la suspensión digestiva en un
embudo de separación con un tamiz (de 177–180 µm). Se enjuaga bien el tamiz dentro del embudo de
separación con agua del grifo y se deja reposar la suspensión durante 30 minutos (5). Luego se cuelan 125
ml dentro del embudo de separación de 500 ml, se le añaden 375 ml de agua del grifo y se deja reposar la
suspensión durante 10 minutos más. Finalmente, se liberan de 22 a 27 ml de sedimento en una placa de
Petri y se hace el recuento como se describió anteriormente. Este método tiene menos etapas, requiere
menos tiempo y raras veces necesita fases posteriores de clarificación.
Una vez separadas por digestión de la célula muscular, las larvas de la primera fase del ciclo tienen aprox. 1
mm. de largo y 0,03 mm. de ancho. El rasgo más característico de las larvas de Trichinella es el
esticosoma, formado por una serie de células discoides que, dispuestas a lo largo del esófago, ocupan la
mitad anterior del cuerpo de la lombriz. Las larvas de Trichinella pueden aparecer enroscadas (a baja
temperatura), móviles (a temperatura templada) o en forma de una C (media luna) (cuando están muertas).
En caso de duda, las lombrices deberían observarse con un mayor aumento y deberían examinarse más
tejidos. Si el recuento es elevado, deberá repetirse la prueba llevando antes la muestra a una dilución
apropiada. Cuando se detecten larvas en muestras de digestión agrupadas, debe aplicarse el procedimiento
completo de digestión a cada una de las muestras individuales que integran la agrupación con el fin de
identificar infecciones en las carcasas individuales.
El uso de una trituradora de tejido con control termostático (Stomacher) reduce el tiempo de digestión a
unos 12–15 minutos. Se han descrito (3) los detalles de otros métodos que utilizan el Stomacher Lab
Blender 3500T (Seward Londres, Reino Unido) o los embudos separadores dobles (8), y también puede
recomendarse un protocolo alternativo para aplicar el método del agitador magnético para muestras
agrupadas, aprobado por la Unión Europea (84/319/EEC).
•
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Garantía de calidad en la prueba de digestión
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Los laboratorios que utilicen métodos de digestión artificial deben mantener un sistema de garantía de
calidad apropiado para garantizar la sensibilidad de la prueba. Los componentes de un sistema de garantía
de calidad para la prueba de digestión están descritos por la Comisión Internacional para la Triquinelosis
(12) y en otros lugares, y deben incluir el uso regular de paneles de suficiencia.
c)
Reacción en cadena de la polimerasa
La identificación de las especies o tipos de Trichinella recuperadas del tejido muscular puede ser útil para
entender la epidemiología de los parásitos en animales y para evaluar el riesgo relativo de la exposición
humana. Se han desarrollado sondas genómicas (cebadores) específico(a)s que permiten la diferenciación
de todas las especies conocidas y genomas de la Trichinella por medio de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) (1, 25). La solicitud para aislar un tipo especial de la Trichinella puede hacerse a través
del Laboratorio de Referencias de la OIE en Roma, Italia, y en Saskatoon, Canadá (véase cuadro en la
Parte 3 del Manual Terrestre).
Algunos estudios de alcance limitado han demostrado que la PCR puede usarse para detectar larvas en la
musculatura de los animales infectados (26). Sin embargo, esta tecnología, en su forma actual, no es un
método práctico para las pruebas rutinarias con animales destinados al consumo humano.
2.
Pruebas serológicas
El uso del enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar la presencia de los anticuerpos específicos de parásitos
es un método rápido que puede realizarse en sangre o en suero recogido antes o después del sacrificio. Se han
detectado en cerdos (11) niveles de infección muy bajos, de una larva por 100 g de tejido, mediante ensayos
ELISA. Este alto nivel de sensibilidad hace de la prueba serológica mediante el ensayo ELISA un método útil
para la detección de la transmisión de la infección por Trichinella en las granjas o para los programas de
seguimiento más amplios.
Una desventaja de la serología en la detección de la infección por Trichinella es la incidencia de una tasa baja de
resultados negativos falsos en el caso de animales infectados. Tales resultados se deben a un desfase en la
cinética de las respuestas de los anticuerpos en los animales ligera o moderadamente infectados por la T. spiralis
o por las especies de la Trichinella silvestre. Esta baja tasa de producción de anticuerpos significa que los
animales infectados no pueden detectarse hasta 3–5 semanas después de la exposición (9, 13). Por esta razón,
las pruebas serológicas no son recomendables en las pruebas con carcasas individuales.
Las respuestas serológicas persisten en los cerdos durante al menos 6 meses después de la infección sin
interrupción o disminución (9); sin embargo, se han detectado la disminución de anticuerpos en los caballos a los
pocos meses de la infección, coincidiendo con una disminución de las larvas en los músculos (20). De este
modo, la evaluación serológica de la Trichinella en caballos puede no tener valor dado que los caballos que
hospeden cientos de larvas por gramo de tejido muscular pueden mostrar una serología negativa. Es poco lo que
conoce acerca de las respuestas de los anticuerpos a la infección por Trichinella en especies de caza. La calidad
de las muestras de suero de los animales de caza es de gran importancia para evitar reacciones positivas falsas.
Se han desarrollado varias preparaciones de antígenos que proporcionan un alto grado de especificidad para la
infección por Trichinella en cerdos y caballos (11, 16, 24). En las pruebas de matadero, el ensayo ELISA arrojó
menos de un 0.3% de resultados positivos falsos y cerca de un 100% de sensibilidad en la detección de cerdos
infectados con más de 1 larva por gramo de tejido. (21). Los antígenos secretores (ES) de la T. spiralis usados en
el ensayo ELISA se conservan en todos los tipos de la Trichinella (22) y, por tanto, la infección puede detectarse
en cerdos o en otros animales que hospedan alguna de las ocho especies. Otras pruebas serológicas distintas al
ensayo ELISA (por ejemplo, las pruebas de inmunoflorescencia) carecen de especificidad y no son adecuadas
para la detección de la infección por Trichinella.
•
Enzimoinmunoensayo
La diagnosis de la infección por Trichinella mediante el ensayo ELISA puede realizarse usando antígenos
de esticosomas secretados que se han tomados de las larvas de T. spiralis (11). Los antígenos reconocidos
en las secreciones de las lombrices constan de un grupo de glicoproteínas estructuralmente relacionadas
con pesos moleculares de 45–55 kDa (14, 22). En el ensayo ELISA también se ha utilizado un antígeno de
carbohidrato sintético (antígeno sintético carbohidratado), pero este antígeno no está disponible fácilmente y
ha demostrado una sensibilidad más baja.
•
Producción de antígeno
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La especificidad y sensibilidad del ensayo ELISA depende en gran medida de la calidad del antígeno
utilizado en la prueba. Los antígenos reconocidos por los animales infectados por Trichinella son los
específicamente secretados de las células de esticocitos de las larvas vivas L1 y sostienen (soportan) el
epítopo carbohidratado TSL–1. Las especies de Trichinella normalmente usadas en las preparaciones de
antígeno son la T. spiralis o la T–1. A efectos de estandarización, es recomendable que estas especies
sean utilizadas en los ensayos ELISA aplicados a la carne de animales destinada al consumo. Sin embargo,
se ha demostrado que el antígeno preparado de cualquier otra especie de la Trichinella puede usarse para
la detección de anticuerpos en animales infectados independientemente cuál sea la especie que produce la
infección (18). Los parásitos que van a usarse en la preparación de antígeno deben ser mantenidos por
pases en serie en ratones y ratas
Para preparar el antígeno que va a ser usado en ensayos ELISA (16), se recuperan las larvas de T. spiralis
(T–1) en estadio muscular de las carcasas de ratones de campo o ratas sin piel ni vísceras mediante
digestión en pepsina al 1% con HCI al 1% a 37oC durante 3 horas (como se describe arriba). Se lavan las
larvas (3 veces durante 20 minutos cada vez) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con
penicilina (500 units/ml) y estreptomicina (500 unidades/ml). Luego se colocan (a una densidad de
5.000 L1/ml) en DMEM suplementado con HEPES (hidroxietilpiperazina N–2, ácido etanesulfónico N–2)
(10mM), glutamina (2mM), piruvato (1mM) y penicilina (250 unidades/ml) / estreptomicina (250 µg/ml)
(DMEM completo) a 37°C en 10% CO2 en aire. El medio de cultivo se recupera después de 18–20 horas, se
retiran las lombrices por filtración y el fluido se concentra a presión mediante una membrana de retención de
un peso molecular de 5.000 Da. Los antígenos secretores (ES) así recuperados pueden almacenarse
congelados por cortos períodos a –20°C o por más tiempo a –70°C; estos antígenos contienen
aproximadamente 25 componentes proteicos según SDS/PAGE (sulfato dodecil de sodio / electroforesis en
gel de poliacrilamida), muchos de los cuales admiten la diagnosis del epítopo de antígeno de carbohidrato
TSL–1.
La calidad del antígeno es fundamental para la especificidad del ensayo ELISA. Deben seguirse varios
pasos para monitorizar el crecimiento de las bacterias, bien sea de forma visual con el microscopio o
recubriendo una muestra de medio. Los cultivos que muestren cualquier crecimiento bacteriano deben ser
desechados. Las larvas no deberían mantenerse más allá de 20 horas; el deterioro de las lombrices
después de este tiempo contribuye al escape de antígenos somáticos que reducen la especificidad de la
prueba. Los antígenos producidos en la forma descrita deberían tener una gama (ratio) de absorbancia
280:260 nm de >1.0. Los antígenos obtenidos a partir del mantenimiento in–vitro de las larvas de la
Trichinella deben ensayarse frente a un panel de sueros positivos y negativos conocidos.
•
Procedimiento de la prueba
Más adelante se da un ejemplo de un ensayo ELISA para detectar la infección por Trichinella en cerdos. Es
esencial que todos los reactivos usados en el ensayo estén estandarizados para una concentración óptima
con el fin de obtener resultados fiables. Los valores típicos se indican en el ejemplo.
i)
Se cubre la placa de microtitulación de 96 pocillos con 100 µl de antígenos ES de T. spiralis diluidos a
5 µg/ml en agua tamponada (50 mM de carbonato/bicarbonato tamponado, pH 9,6). Se realiza la
cobertura durante 60 minutos a 37°C o toda la noche a 4°C.
ii)
Se lavan tres veces los pocillos cubiertos con antígeno en tampón de lavado que contenga 50 mM
Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5% de leche en polvo desnatada y 1,0% de Triton X–100. Después de
cada lavado, las placas se deben secar.
iii)
Diluir a 1/10 o 1/100 suero de cerdo en tampón de lavado. Las fuentes alternativas de anticuerpos que
pueden usarse en lugar de los sueros son, entre otros, la sangre total o los fluidos de tejidos. Agregar
100 µl de suero diluido a los pocillos cubiertos con antígeno. Debe usarse en cada placa una muestra
de suero positivo conocida y una muestra de suero negativo conocida con una dilución idéntica a la de
los sueros de la prueba. Se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos.
iv)
Lavar tres veces los pocillos como en el apartado ii.
v)
Añadir a cada pocillo 100 microlitros de una IgG (inmunoglobulina G) contra cerdo obtenida en conejo,
purificada por afinidad y conjugada con peroxidasa a una dilución apropiada en tampón de lavado, por
ejemplo, una dilución 1/1.000 de IgG de conejo contra cerdo (0,1 mg/ml) producido por Kirkegaard and
Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, EE.UU. Tras añadir el segundo anticuerpo, incubar las
placas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
vi)
Lavar tres veces los pocillos como en el apartado ii. y enjuagarlos una vez con agua destilada.
vii)
Añadir 100 µl de un sustrato de peroxidasa apropiado (por ejemplo, ácido aminosalicílico–5’ [0,8
mg/ml] con 0,005% de hidrógeno de peróxido, pH 5,6–6,0).
viii) Después de 5–15 minutos, leer las placas para ver la densidad del color a 450 nm en un lector de
microtitulación automático. Los valores obtenidos de los ensayos ELISA, que son cuatro veces
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superiores a los de los controles agrupados de suero normal, se consideran positivos. Los valores tres
veces mayores que los normales se consideran sospechosos. Sin embargo el valor de corte está
determinado por la raza del cerdo.
Existen adaptaciones comerciales del ensayo ELISA en formato más corto, necesitándose menos de una
hora para su realización.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
No es práctica una vacuna para la infección por Trichinella en animales destinados al consumo. No existen
productos biológicos establecidos para métodos de detección directa. Para métodos indirectos (serológicos) debe
usarse antígenos TSL–1 para garantizar la especificidad de la prueba. Estos antígenos pueden obtenerse como
productos secretores recuperados mediante el mantenimiento de las larvas del músculo in–vitro (las larvas del
músculo se obtienen inicialmente ex vivo) o como antígenos de carbohidrato sintéticos producidos
comercialmente.
REFERENCIAS
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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Trinquinelosis (véase Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consulte la página Web de la OIE para una lista más actualizada: www.oie.int).
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004