evaluación del factor masculino en los tratamientos de reproducción

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
EVALUACIÓN DEL FACTOR MASCULINO EN LOS
TRATAMIENTOS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA
MEDIANTE INYECCIÓN INTRACITOPLASMÁTICA DE
ESPERMATOZOIDES
TESIS DOCTORAL
ELISA ESCALANTE BERMÚDEZ
MADRID 2015
Dña Antonia María Fernández Peralta, Catedrática de Genética del Departamento de
Biología de la Universidad Autónoma de Madrid, y Dña Laura de la Fuente Bitaine,
Coordinadora de la Unidad de Reproducción Humana del Hospital 12 de Octubre y
Profesora Asociada de la Universidad Complutense de Madrid, certifican que Dña Elisa
Escalante Bermúdez ha realizado, bajo su dirección, el trabajo de Tesis Doctoral
titulado: "Evaluación del factor masculino en los tratamientos de reproducción
asistida mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides".
Revisado el presente trabajo, consideran que tiene la debida calidad para su
presentación y defensa.
Dra. Dña. Antonia María Fernández Peralta
Dra. Dña. Laura de la Fuente Bitaine
A Uxío
Caminante, son tus huellas
el camino, y nada más;
Caminante, no hay camino,
se hace camino al andar.
ANTONIO MACHADO
Emprendí este camino hace muchos años fundamentalmente animada por mi
padre, he cambiado de idea muchas veces, ha sido largo y duro pero lo he conseguido,
sólo lamento que no puedas verlopapá.
Gracias a la Dra. Fernández Peralta y a la Dra.dela Fuente Bitaine que me han
guiado y acompañado durante el camino. Sin su ayuda la culminación de este proyecto
no hubiera sido posible.
Gracias Juanjo y Toñi, por vuestra dedicación, porque fuisteis vosotros los que
me introdujisteis en el mundo de la ciencia, los que me enseñasteis a desenvolverme
en un laboratorio hace ya mucho, mucho tiempo. Por ser un ejemplo al que intentar
parecerme, por vuestro cariño y por vuestro apoyo en este y en otros muchos
momentos importantes de mi vida.
Gracias Laura por tu presencia, tu disponibilidad absoluta, por caminar conmigo
por la vida, por la suerte de tenerte a mi lado.
Gracias a mis compañeras de trabajo por vuestrainmensa paciencia, por vuestra
compresión, por vuestra generosidad infinita, por empujarme cuando me desanimaba.
Por los buenos ratos que pasamos juntas, por tantas risas y porque sois una parte
importante de me guste mi trabajo.
Gracias Pilar por tu sensatez sin límites, por facilitarme tanto las cosas, por tus
consejos y por tu apoyo constante, por disfrutar conmigo de los momentos buenos y
apoyarme en los malos, por la suerte que tuve al conocerte.
Gracias Nerea por estar siempre dispuesta, por ayudarme en muchos
momentos y aspectos de este trabajo, por sustituirme cuando no he podido estar en
dos sitios a la vez y por asumir en muchas ocasiones mi trabajo con una sonrisa.
Gracias a mis amigos y a mis amigas por alegrarme la vida, por vuestro interés,
por vuestra preocupación, por los miles de buenos momentos que hemos compartido.
A Bruno, a Marta y a Alicia porque hacéis mi vida mejor, por lo agradecida que estoy
de que forméis parte de ella y por todo lo que nos queda por vivir juntos . A mis
amigas Isabel y Esther por todo lo que hemos vivido juntas, por poder contar con
vosotras en los buenos momentos y en los no tan buenos y por la suerte que tuve de
que aparecieseis un día en mi vida. A Cris, Jaime, Itziar y todo el resto de amigos y
familiares por poder contar siempre con vosotros y por estar siempre a mi lado.
Gracias a mis padres por ser un ejemplo de esfuerzo y de trabajo y por
apoyarme en todas los proyectos que he ido emprendiendo en la vida. Gracias a mis
abuelos por su cariño infinito, porque todo lo que somos os lo debemos a vosotros.
Gracias a mi madre por ser un ejemplo, por lo orgullosa que me hacía sentir
cuando era pequeña que fueras médico y lo que eso influyó en mis ganas de estudiar
una carrera y de trabajar como tú y porque, sin ti, mamá, no sería quien soy.
Gracias a mi padre por llevarme hacia el mundo de la medicina, por ser un
ejemplo de superación profesional, por insistir tanto y por la certeza de que te habrías
sentido muy orgulloso de mí en este momento y hubieras disfrutado un montón con
esto. Papá, si siguieras aquí, esto seguramente no habría sido tan largo, te echo
muchísimo de menos y me hubiese encantado que estuvieras conmigo.
Gracias a mis hermanas por ser una parte tan importante en mi vida, porque los
malos momentos son menos malos al dividirse entre tres y los buenos son mejores al
multiplicarlos. Por la tranquilidad que me da saber que podría pediros cualquier cosa,
porque todo es mejor al contar con vosotras, por lo que enriquecéis mi vida y porque
yo iría al fin del mundo por vosotras. Por haber aprendido juntas a reírnos de todo y
porque juntas podemos con todo.
Gracias a mi hermana Susana por ser una de las mejores personas que conozco,
porque te he tenido siempre a mi lado, porque durante mucho tiempo estábamos
siempre juntas y he tenido la suerte de compartir un montón de cosas contigo, por
enriquecer, junto con Jose, nuestra vida con Julia y Alberto.
Gracias a mi hermana Virginia por todo el tiempo que me has dedicado,por
cederme tu cerebro privilegiado durante tantas horas, por estar siempre dispuesta a
dejarlo todo para ayudarme, porque sin ti parecía imposible y contigo lo he
conseguido. Porque a tu lado es más divertido reír y duele menos llorar.
Gracias a Uxío, por tu apoyo y tu insistencia, por confiar siempre en mí, por
recoger el testigo de mi padre y no dejarme flaquear. Por obligarme a relativizar,
porque nada es tan grave y todo es mejor al estar tú. Por el lujo de vivir la vida contigo,
por todo lo que significas en mi vida, por todo lo que me haces reír yporque me haces
ser mejor persona y por tantas y tantas cosas...
Gracias a todos vosotros y a muchos más porque mire donde mire siempre hay
gente dispuesta a rescatarme.
RESUMEN
La esterilidad es un problema que afecta, aproximadamente, al 9-15% de las
parejas, pudiendo ser responsable el factor masculino del 50% de los casos.
El factor masculino se evalúa fundamentalmente mediante el estudio de las
características seminales. El análisis de la integridad del ADN espermático se ha
incorporado, en los últimos años, al diagnóstico de la infertilidad masculina.
En esta tesis, se han estudiado 41 parejas con objeto de determinar la relación
entre los parámetros seminales convencionales y la integridad del ADN espermático,
así como la influencia que en estos tienen la edad y el consumo de tabaco. Se ha
evaluado cómo afecta la técnica de recuperación espermática de swim-up a los niveles
de fragmentación basal de las muestras. Se ha analizado el efecto que tienen tanto los
parámetros seminales, como la fragmentación basal del ADN espermático y la
fragmentación post swim-up (ambas medidas mediante el test SCD), en los resultados
del ciclo ICSI.
La evaluación de los parámetros clásicos del seminograma que definen la
calidad seminal, como son el volumen del eyaculado, la concentraciónespermático,
motilidad progresiva y morfología espermática, y el REM, se han mostrado como
factores que no permiten predecir el grado de integridad del ADN espermático. Esto
indicaría que los parámetros seminales y la fragmentación del ADN espermático son
variables independientes, mientras que la edad del varón ejerce una influencia,
incrementando el daño del ADN espermático.
La técnica swim-up de procesamiento de muestras seminales
disminuyósignificativamente los porcentajes de fragmentación del ADN espermático y
esta disminución de los niveles de fragmentación es proporcionalmente mayor cuanto
mayor sea el porcentaje de fragmentación basal del paciente. Esto indicaría que la
técnica de procesamiento mejora la calidad de la muestra en cuando al porcentaje de
fragmentación del ADN, aun cuando dicha técnica se estableció en su origen para
seleccionar una muestra enriquecida en espermatozoides con mejor movilidad y mejor
morfología.
Finalmente se ha valorado el resultado de los ciclos de ICSI mediante los
parámetros tasa de fecundación, calidad embrionaria, tasa de implantación y
gestación, y su relación con las variables masculinas analizadas (factor masculino). Se
encontró que la tasa de fecundación guardó relación inversa con la edad y relación
directa con la morfología espermática. La tasa de gestación y la normozoospermia se
comportaron como variables positivamente dependientes. Sin embargo, el resultado
de los ciclos de ICSI no se correlacionó con la fragmentación del ADN de la muestra
seminal, con lo que el nivel de integridad del ADN espermático se mostró como un
factor independiente del éxito del tratamiento de reproducción asistida mediante
inyección intracitoplasmática de espermatozoides.
ÍNDICE
Índice
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 3
1. Esterilidad e infertilidad ............................................................................................... 3
2. El factor masculino....................................................................................................... 4
3. Espermatogénesis y espermiogénesis ......................................................................... 5
4. El espermatozoide humano ......................................................................................... 7
5. El ADN espermático ..................................................................................................... 9
5.1. El ADN nuclear y la cromatina del espermatozoide .......................................... 9
5.2. El ADN mitocondrial ......................................................................................... 15
6. Análisis y alteraciones del semen .............................................................................. 15
7. Fragmentación del ADN espermático ........................................................................ 17
7.1. Mecanismos de inducción de la fragmentación del ADN espermático ........... 18
7.2. Técnicas de detección y cuantificación de la f. del adn espermático .............. 24
7.3. Significado clínico de la fragmentación del ADN espermático ........................ 34
8. Técnicas de reproducción asistida ............................................................................. 36
OBJETIVOS ...................................................................................................................... 37
MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................. 41
1. Población de estudio ................................................................................................. 43
2. Seminograma .............................................................................................................. 43
3. Preparación de las muestras (swim-up) ..................................................................... 53
4. Test SCD (sperm chromatin dispersión) ..................................................................... 55
5. Tinción ........................................................................................................................ 56
6. Evaluación de la fragmentación................................................................................. 56
7. Recuperación y preparación de los ovocitos .............................................................. 58
8. Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) ......................................... 60
9. Evaluación de los embriones ..................................................................................... 62
10. Transferencia embrionaria ....................................................................................... 65
11. Criopreservación embrionaria .................................................................................. 66
12. Análisis estadístico.................................................................................................... 70
RESULTADOS .................................................................................................................. 71
1. Análisis descriptivo .................................................................................................... 73
1.1. Análisis descriptivo de los varones .................................................................. 73
1.2. Análisis descriptivo de las mujeres y del ciclo ICSI .......................................... 75
1.3. Analisis descriptivo de resultados del ciclo ICSI .............................................. 76
2. Análisis de los parámetros del seminograma y características de los varones ......... 80
2.1. Normozoospermia ........................................................................................... 80
2.2. Alteraciones en los parámetros del seminograma .......................................... 81
2.3. Recuento de espermatozoides móviles (REM) ................................................ 83
2.4. Correlaciones entre los parámetros seminales. .............................................. 84
3. Fragmentación del adn espermático y parámetros masculinos ............................... 86
3.1. Análisis de la fragmentación basal................................................................... 86
3.1.1. Fragmentación basal y calidad seminal ........................................................... 89
3.1.2. Fragmentación basal y REM ............................................................................ 91
3.1.3. Fragmentación basal y correlación con los parámetros seminales ................. 92
3.2. Análisis de la fragmentación post swim-up ..................................................... 93
3.2.1. Fragmentación post swim-up y calidad seminal............................................. 96
3.2.2. Fragmentación post swim-up y rem ............................................................... 97
3.2.3. Fragmentación post swim-up y fragmentación basal ..................................... 98
3.2.4. F. post swim-up y correlación con la f. basal y los parámetros seminales ..... 99
3.3. Variación de la fragmentación tras el procesamiento mediante swim-up ... 100
3.3.1. Variación de la fragmentación y calidad seminal ......................................... 103
3.3.2. Variación de la fragmentación y rem ............................................................ 105
3.3.3. Variación de la fragmentación y fragmentación basal .................................. 106
3.3.4. Variación de la fragmentacion y correlaciones ............................................. 106
4. Resultado de los tratamientos de reproducción asistida (TRA) mediante ICSI ....... 108
4.1. Resultados de los TRA mediante ICSIy parámetros seminales ..................... 112
4.2. Resultados de los TRA mediante ICSI y fragmentación del adn espermático 118
4.2.1. Fragmentación basal y resultados de ICSI ..................................................... 118
4.2.2. Fragmentación post swim-up y resultados de ICSI ........................................ 122
4.2.3. Variación de la fragmentación y resultados de ICSI ...................................... 125
4.3. Resultados de tra mediante ISCI en mujeres de buen y mal pronóstico ...... 127
4.3.1. Tasa de fecundación en mujeres de buen y mal pronóstico ......................... 127
4.3.2. Embriones de buena calidad en mujeres de buen y mal pronóstico ............ 127
4.3.3. Tasa de implantación en mujeres de buen y mal pronóstico ........................ 128
4.3.4. Gestación en mujeres de buen y mal pronóstico .......................................... 128
DISCUSIÓN .................................................................................................................... 131
1. Parámetros seminales y características de los varones .......................................... 133
1.1. Parámetros seminales y edad ........................................................................ 134
1.2. Parámetros seminales y tabaquismo ............................................................. 136
2. Fragmentación basal del ADN espermático ............................................................ 139
2.1. Fragmentación basal y parámetros seminales .............................................. 140
2.2. Fragmentación basal y edad .......................................................................... 142
2.3. Fragmentación basal y tabaquismo ............................................................... 144
3. Fragmentación del ADN espermático tras el procesamiento mediante swim-up .. 146
3.1. Fragmentación post swim-up y fragmentación basal ................................... 148
3.2. Variación de la fragmentación, edad y tabaco .............................................. 151
3.3. Variación de la fragmentación y características seminales ........................... 152
4. Factor masculino en los resultados de los ciclos de ICSI ......................................... 153
4.1. Resultados del ciclo ICSI y edad del varón ..................................................... 153
4.2. Resultados del ciclo ICSI y características seminales ..................................... 154
4.3. Resultados del ciclo ICSI y fragmentación del adn espermático ................... 155
5. Factor femenino en los resultados de ciclos de ICSI................................................ 158
CONCLUSIONES ............................................................................................................ 161
BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................... 165
ABREVIATURAS ............................................................................................................ 185
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
1. ESTERILIDAD E INFERTILIDAD
La esterilidad se define como la imposibilidad de concebir tras 1 año de
relaciones sexuales regulares sin emplear ninguna medida anticonceptiva,mientras que
la infertilidad se refiere a la incapacidad para completar un embarazo. Tanto la American
Society of Reproductive Medicine (ASRM) como laOrganización Mundial de la Salud
(OMS/WHO) la catalogan como una enfermedad del sistema reproductivo que inhibe la
capacidad del cuerpo de cumplir con la función básica de la reproducción(ZegersHochschild et al, 2009). Aunque la ASRM, la Sociedad Española de Fertilidad (SEF),la
Sociedad Española de Obstetricia y Ginecología (SEGO) y la OMSestán de acuerdo en
establecer el límite en 12 meses (OMS, 2000), otras sociedades científicas como la
Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO)y la European Societyfor
Human Reproduction and Embryology (ESHRE) prefieren definir el límite en 24
meses(The ESHRE Capri Workshop, 1996).
Es un problema frecuente que afecta aproximadamente al 9-15% de las
parejas(Boivin et al., 2007; Evgeni et al., 2014).Según los últimos datos publicados se
estima que la esterilidad afectaba, en el año 2010, a 48.5 millones de parejas a nivel
mundial(Mascarenhas et al., 2012).En los países occidentales la prevalencia de la
esterilidad es del 10 al 20%, y en España se estima que alrededor de un 14-15% de las
parejas en edad reproductiva tienen problemas de esterilidad. El 85% de las parejas que
intentan una gestación la consiguen en el periodo de un año, el 92% después de dos
años y el 93% tras tres años de relaciones (De la Fuente, 2011).Estos porcentajes de
prevalencia de la esterilidad según los expertos se irán incrementando, debido
fundamentalmente al retraso en la edad en las que las mujeres comienzan a intentar
tener descendencia, pero también a una disminución en la facilidad para concebir y a un
deterioro en la calidad del semen en los últimos años señaladopor algunos
autores(Andersen et al., 2008). La edad media de maternidad (EMM) se ha ido
incrementando hasta situarse en 31,12 años. Todo esto tiene como consecuencia que el
número de pacientes que acuden a los centros de reproducción asistida se haya ido
incrementando y que se produzca un avance y una mejora continuos en las distintas
técnicas de reproducción asistida. Probablemente en el 2020entre un 18 y un 25%de las
3
INTRODUCCIÓN
parejas en edad fértil tendrá problemas de infertilidad y se generarán del orden de
18.500 nuevos casos al año(Matorras R., 2011). Como consecuencia se producirá un
incremento en la demanda de este tipo de tratamientos y un aumento del número de
centros especializados.
En Españala natalidad se redujo a más de la mitad entre 1960 y 2011, pasando de
21,7 a 10,6 nacimientos por mil habitantes y se ha establecido en 9,14 en el 2014(INE,
2015), lo que sitúa al país por debajo de la media de la Unión Europea. El índice de
fecundidad (número medio de hijos por mujer), en nuestro país ha descendido
paulatinamente hasta llegar a 1,32 hijos por mujer en el 2014 (INE, 2015).Esto está
contribuyendo al envejecimiento de la población ya que se establece el número
necesario para mantener el tamaño de la población en 2,1 hijos por mujer (nivel de
reemplazo generacional) y que esto dará lugar aproblemas socioeconómicos(INE, 2006).
Muchos estudios han demostrado que los problemas de esterilidad afectan tanto
a hombres como a mujeres,y queel factor masculino tiene gran importancia y parece ser
el responsable, al menos en parte, del 50% de los casos aproximadamente (CortésGutiérrez el al., 2007). De este 50%, el 20% es debido exclusivamente a problemas
masculinos y el otro 30% se debe a una combinación de factores masculinos y
femeninos(Poongothai et al., 2009).
2. EL FACTOR MASCULINO
Con este término se engloba el conjunto de causas atribuibles al varón que
inciden de forma completa o parcial sobre la esterilidad de la pareja. En la práctica
puede considerarse sinónimo de infertilidad masculina. A pesar de agrupar
normalmente un variado conjunto de alteraciones seminales también puede aparecer
cuando el seminograma es normal (Practice committee of ASRM, 2015).
Aunque la infertilidad se considera un problema de pareja, en los últimos años el
llamado factor masculino ha ido incrementando su importancia, un cambio que ha sido
acompañado por una mayor concienciación por parte del varón. Efectivamente, la
responsabilidad del varón en el descenso de la natalidad parece cada vez más evidente
debido a un deterioro en la salud reproductiva masculina, tanto por el descenso de
4
INTRODUCCIÓN
lacalidad del semen (Irvine et al., 1996) como por enfermedades asociadas al aparato
reproductor.
La infertilidad masculina es un síndrome multifactorial que abarca una amplia
variedad de trastornos. Aunque en más de la mitad de los varones infértiles se
desconoce el origen de esa infertilidad (idiopática) ya sea congénita o adquirida
(Poongothai et al., 2009), existen muchas causas posibles de que afectan a la producción
espermática, al transporte o a la función espermática. Entre las causas más comunes
encontramos:
varicocele,
anomalías
que
afectan
al
aparato
reproductor
(criptorquidia,obstrucciones, traumatismos, etc.), eyaculación retrógrada, enfermedades
infecciosas o infecciones del tracto reproductor que pueden ser o no de transmisión
sexual (epididemitis, orquitis, prostatitis, vesiculitis), disfunciones sexuales, efectos
adversos de determinados medicamentos, factores ambientales y estilo de vida
(exposición a contaminantes, tabaco, alcohol, drogas, etc.), enfermedades o alteraciones
genéticas que se asocian, directa o indirectamente, con anomalías en el semen,
disfunciones hormonales y alteraciones en el semen.
Cuando una pareja acude a una consulta de esterilidad hay que realizar un
estudio de los dos miembros de la pareja. El estudio básico del varón debe incluir una
completa historia médica, una exploración física y al menos dos seminogramas
realizados con un intervalo de 2 a 4 semanas (Bassas Arnau, 2011).
3. ESPERMATOGÉNESIS Y ESPERMIOGÉNESIS
La espermatogénesis o gametogénesis masculina es el proceso mediante el cual
se desarrollan los gametos masculinos o espermatozoides,y tiene lugar en la gónada
masculina llamada testículo.La espermatogénesis empieza en la pubertad y desde
entonces tiene lugar de manera continua hasta la vejez.Este proceso tiene lugar en los
túbulos seminíferos, situados en el interior delos testículos, donde también se
encuentran las células de Sertoli que dan sostén, nutren y protegen a las células
germinales formando la barrera hematotesticular. La espermatogénesis consta de tres
etapas: etapa de proliferación, etapa meiótica o fase de reducción y etapa de
diferenciación o espermiogénesis (Fig. 1).
5
INTRODUCCIÓN
En la etapa de proliferación, como su propio nombre indica, las células
germinales primordiales ogonocitos, proliferan y se multiplican mediante divisiones
mitóticas y dan lugar a las espermatogonias.Algunas espermatogonias, las
espermatogonias tipo A, se dividen mitoticamente de forma continuada para producir
más espermatogonias, mientras que las de tipo B dan lugar a los espermatocitos
primarios (espermatocitos I o espermatocitos de primer orden), que son células de
mayor tamaño que entrarán en meiosis. Durante toda esta etapa se mantiene la
dotación cromosómica diploide de todas las células que se van generando, ya que
únicamente se dividen mediante divisiones mitóticas. Como resultado final de esta fase
nos encontramos con unas células diploides llamadas espermatocitos primarios.
La fase meiótica se caracteriza por la reducción en el número de cromosomas. Se
parte de espermatocitos primarios, que son células diploides (2n), y el producto final son
espermátidas, que tienen una dotación cromosómica haploide (n). Como cualquier
división meiótica hay que diferenciar dos periodos, la primera y al segunda división.La
primera división meiótica comienzaa partir de espermatocitos primarios,ypor cada uno
de ellos que inicia este proceso se obtienecomo resultado dos espermatocitos
secundarios (espermatocitos II o espermatocitos de segundo orden). Los espermatocitos
secundarios son ya células haploides (n) ya que esta primera etapa de la meiosis, la
meiosis I, es la etapa reductora, se separan los homólogosy disminuye el número de
cromosomas a la mitad. En la segunda división meiótica a partir de cada espermatocito
secundario, ya haploide, se obtienen dos espermátidas también haploides. En resumen,
partir de cada espermatocito primario diploide que se incorpora a la fase meióticase
obtienen cuatro espermátidas haploides como resultado final.
La última etapa es la de diferenciación, también conocida como espermiogénesis.
Es la fase final de la espermatogénesis y comprende la diferenciación y especialización
de las espermátidas que culminancon la formación de los espermatozoides ya libres del
epitelio germinal. Durante esta fase se producen un serie de cambios, como la
condensación de la cromatina nuclear, la formación del acrosoma y el desarrollo del
flagelo,que van a posibilitar la liberación de los espermatozoides de los túbulos
seminíferos. Esta
liberación
de
las espermátidas maduras,
6
ahora
llamadas
INTRODUCCIÓN
espermatozoides, se denomina espermiación y está controlada por las células de
Sertoli.A partir de cada espermátida haploide (n), que entra en la espermiogénesis, se
originan dos espermatozoides, también haploides (n).
La espermatogénesis es un proceso altamente organizado con una cinética
específica que dura 74 días. Los espermatozoides, una vez liberados, son transportados
a través del epidídimo durante otros 12 días más. Por lo tanto, un ciclo de
espermatogénesis completo, desde espermatogonia a espermatozoide maduro tiene
una duración mínima de 86 días (Holstein et al.,2003).
Figura 1.- Espermatogénesis
4. EL ESPERMATOZOIDE HUMANO
El espermatozoide maduro, o gameto masculino, es una célula haploide,
altamente especializada cuya función es la formación del cigoto al fusionar su núcleo
con el del gameto femenino, para lo que es deseable que la copia del genoma paterno
7
INTRODUCCIÓN
se cree, se transporte y llegue hasta el ovocito en perfecto estado. En el proceso de
fecundación es fundamental no sólo la integridad genética materna sino también la
paterna, y la transmisión de la molécula de ADN integra e intacta del espermatozoide al
óvulo es crucial tanto para conseguir una fecundación con ciertas perspectivas de éxito
(Cortés-Gutiérrez et al., 2007), como para que se desarrolle correctamente el embrión y
el feto.
Para que un espermatozoide se considere normal según las directrices de la
OMS(1999), la cabeza, el cuello, la pieza media y la cola tienen que ser
morfológicamente normales. La cabeza del espermatozoide normal tiene que ser lisa, de
contorno regular y en general de forma ovalada, con una longitud entre 4,0 y 5,0µm y su
anchura debe estar entre 2,5 y 3,5µm. El coeficiente largo/ancho debe ser de 1,5 a 1,75.
La cabeza está constituida por el acrosoma y el núcleo. La región acrosómica debe estar
bien definida,de color más claro, y ocupar entre el 40 y el 70% del área total de la
cabeza. La pieza media(también llamada pieza intermedia) tiene que ser
delgada,regular, con una anchura menor que 1µm y de longitud generalmente similar a
la de la cabeza (y como máximo no superando la longitud de una cabeza y media) a la
que se debe unir axialmente(los ejes mayores de la cabeza y de la pieza intermedia
deben de estar alineados entre si).Si existecitoplama residual (también llamado gota
citoplásmica), éste no debe superar el volumen de media cabeza normal. La cola o
flagelodel espermatozoide debe tener un grosor uniforme a lo largo de toda su longitudy
sermás estrecha que la pieza media. Su longitud tiene que ser de 45µm y debe estar
desenrollada.
8
INTRODUCCIÓN
Figura 2.-Espermatozoide humano
5. EL ADN ESPERMÁTICO
El espermatozoide humano contiene en su interior dos tipos de ADN con una
organización muy diferente, el ADN nuclear(ADNn) y ADN mitocondrial (ADNmt).
Mientras que ADN mitocondrialespermático no ha sido muy estudiado, el ADN nuclear
ha sido objeto de numerosas investigaciones, en parte para relacionarlo con los
resultados de las técnicas de reproducción asistida (TRA) (Morris et al., 2002; Miller et
al., 2010; Wright et al., 2014).
5.1. EL ADN NUCLEAR YLA CROMATINA DEL ESPERMATOZOIDE
La estructura de la cromatina contenida en el núcleo del espermatozoide
tienecaracterísticas diferenciales con respecto a las células somáticas(Fuentes-Mascorro
et al. 2000; Boissonneault, 2002) tanto en su composición como en su enorme
compactación, hasta 6 veces superior a la que encontramos enloscromosomas mitóticos
(Cortés-Gutiérrez et al., 2007), su escaso volumen (40 veces menos que una célula
somática) y su gran estabilidad (Gil Villa et al., 2007).Mientras que el ADN de las células
somáticas está asociado a un tipo de proteínas llamadas histonas el del espermatozoide
lo hace a otro tipo de proteínasdenominadas protaminas.Las protaminas son las
responsables de este grado de compactación ya que generan bucles de menor tamaño
que los que generan las histonas en las células somáticas. Durante la
espermiogénesiscasi todas las histonas son reemplazadas por unas proteínas llamadas
9
INTRODUCCIÓN
de transición y éstas serán posteriormente sustituidas a su vez por protaminas. Aunque
el proceso de permuta de las histonas por protaminas ha sido estudiado por muchos
investigadores no se sabe exactamente como se desarrolla. Se han diseñado numerosos
modelos para tratar de explicar el gran empaquetamiento que sufre el ADN para que se
pueda introducir en el núcleo del espermatozoide.
Para sustituir a las histonas es necesario eliminar los nucleosomas que forman la
cromatina y,aunque no se conoce el mecanismo molecular exacto por el que se
produce,si parece que tienen lugar una serie de procesos comoacetilación, metilación,
fosforilación o ubiquitinización.Al ir eliminando los nucleosomas es necesario deshacer
la tensión provocada por el superenrrollamiento de la molécula de ADN. Una vez que los
nucleosomas se han eliminado, las histonas se sustituyen por proteínas de transición
(Meistrich et al.,2003). Las proteínas de transición son un grupo heterogéneo de
proteínas básicas, de las quese han identificado cuatro aunque las más conocidas son
TP1 y TP2. LaTP1 es una proteína rica en lisina, serina y arginina (Brewer et al., 2002).La
TP2 es una proteína de mayor tamaño que la TP1. Aunque su función exacta no se
conoce parece que in vitroactúan en la reparación de roturas (Caron et al., 2001;
Boissonneault, 2002), en la descondensación del ADN en los nucleosomas (TP1) (Singh
and Rao, 1988), en la posterior condensación del ADN (TP2) y en su estabilización(Kundu
and Rao, 1995).Hay autores que defienden que la ausencia de una de estas dos
proteínas queda compensada por una mayor presencia de la otra aunque no hay certeza
de ello (Adham et al., 2001).
El siguiente paso es la sustitución de las proteínas de transición por las
protaminas. Las protaminas son nucleoproteínas básicas insolubles de bajo peso
molecular cargadas positivamente que sustituyen, casi totalmente, a las histonas a las
que está asociado normalmente el ADN y que, además, estabilizan la estructura
mediante los puentes disulfuro que forman entre ellas.Son responsables del
empaquetamiento del ADN en el núcleo del espermatozoide maduro.La compactación
del ADN espermático en el interior del núcleo es una cuestión muy relevante a la hora
de analizar la fragmentación del ADN. En mamíferos se han identificadodos tipos de
protaminas, P1 y P2, productos de los genes PRM1 y PRM2, respectivamente.P1 se
10
INTRODUCCIÓN
expresa en todos los mamíferos y es una proteína rica en arginina y cisteina. P2, de
mayor tamaño que P1, sólo se expresa en algunos mamíferos, entre ellos en
humanos(Balhornet
al.,
1977;
Balhorn,
2007;
Oliva,
2006)
y
es
rica
en
histidina.Elespermatozoide maduro es el único tipo celular en el que están presentes las
protaminas. Se ha demostrado la elevada protección que estas proteínas aportan a la
cromatina del espermatozoide cuando se unen a ella (Kuretake et al.,1996).Parece que
proporcionan protección mecánica al ADN al unirse ael y formar los complejos ADNprotaminas. Para formar estos complejos las protaminasse unen a lo largo del surco
menor de la molécula de ADN y con su carga positiva neutralizan las cargas negativas de
los grupos fosfato de manera que pueden unirse unos complejos a otros (Balhorn,
1982).
En el ADN del espermatozoide, para eliminar los nucleosomas y intercambiar las
histonas por protaminas,se necesita hacer frente al fenómeno de superenrollamiento,
que produce tensiones por excesiva torsión que van a dificultar la compactación.
Eliminando los superenrollamientos las protaminas pueden acceder al ADN y sustituir a
las histonas(McPherson and Longo, 1993), previamente reemplazadas por las proteínas
de transición. Para eliminar los superenrollamientos hay autores que han descrito la
existencia de roturas en la molécula de ADNque aparecen en etapas intermedias de la
espermiogénesis y que posteriormente deben ser repararadas porque se ha
comprobado que no se mantienen durante todo el proceso (McPherson and Longo,
1993; Sakkas et al.,1995; Marcon and Boissonneault, 2004). Las roturas pueden ser tanto
de cadena sencilla como de cadena dobleyla enzima que parece originar las roturas y
posteriormente repararlases la topoisomerasa II (Laberge and Boissonneault, 2005). Se
han propuesto varios modelos complejos para intentar explicar la regulación de estas
roturas (Meyer-Ficca et al.,2011).
Una vez sustituidas las histonas por protaminas, estas empaquetan y compactan
el ADN en unas estructuras denominadas toroides, cada uno de los cuales contiene
aproximadamente 50 kb de ADN (Hud et al.,1993).Según la cantidad de protaminas
presenteshabrá mayor o menor grado de compactación. Se desconoce el modo exacto
en el que se constituyen y se organizan los toroides de protaminas para formar la
11
INTRODUCCIÓN
estructura final de la cromatina del espermatozoide. Sí se sabe que se establecen una
serie de bucles llamados dominios que se unena la matriz nuclear cada 20-120 kb (Ward,
2010). Cada bucle o dominio contiene ADN funcional, corresponde a un toroide y se
unen entre ellos por una secuencia de ADN (toroid linker),asociada a histonas,que es
mássensible a la acción enzimática de determinadas endonucleasas como la DNAsa
I(Sotolongo et al., 2003). Estas secuencias son también los sitios por los que los toroides
de protaminas, además de unirse entre ellos, se anclan a la matriz nuclear, y reciben el
nombre de matrix attachment regions (MARs) (Fig.3). La matriz nuclear espermática está
formada por una estructura proteica que no se conoce completamenteaunque hay
evidencia de la existencia entre otros componentes de topoisomerasa IIB, actina,
miosina, citoqueratinas, espectrinay posiblemente algunos enzimas como la
transcriptasa inversa entre otros.Cada vez se incide más sobre suimportancia en la
organización estructural del ADN y en su relación con la función nuclear.Juega un papel
crucial en la regulación de la fragmentación y la degradación del ADN espermático
antesde la fecundación (Sharman et al., 2007). También parece que debe actuar para
mantener de la integridad del ADN espermático tras la fecundación (Ward, 2010).Es
necesaria para la replicación del ADNdel pronúcleo masculinoque se forma en el ovocito
una vez fertilizado y para que los embriones que se originen sean viables (Sharman et
al., 2007).
12
INTRODUCCIÓN
Figura 3.- Tres principales elementos estructurales de la cromatina espermática. A: Durante la
espermiogénesis, las histonas se sustituyen por protaminas y condensan el ADN en toroides altamente
empaquetados. Cada toroide de protamina es un dominio de bucle. B: Los toroides de protamina se
pueden organizar apilándose unos al lado de otros. Algunas secuencias grandes de ADN conservan
histonas (solenoide verde) que pueden ser dominios de bucle enteros que no se condensan por
protaminas. C: Las cadenas de ADN que unen los toroides de protamina son sensibles a lasnucleasas y
pueden estar unidos a histonas; son las regiones de unión a la matriz (MARs) (Ward, 2010).
Aunque la gran mayoría, el 85%, del ADN espermático está unido a protaminas
formando toroides, como ya hemos visto hay algunas histonas que no son reemplazadas
por protaminas y se conservan en el espermatozoide maduro. Estas secuencias de ADN
asociadas a histonas no se distribuyen al azar y parecen tener funciones específicas,
pudiendo corresponder a telómeros o a genes funcionales de la espermiogénesis o de la
fecundación, o de alguna función en el embrión(Arpanahi et al.,2009; Hammoud et
al.,2009).
Se desconoce si estas histonas que permanecen asociadas al ADN espermático se
mantienen en el zigoto tras la fecundación aunque hay modelos como el de Ward del
13
INTRODUCCIÓN
2010 que sugieren que algunas estructuras de ADN espermático unido a histonas y
asociado a la matriz nuclear se mantienen en el momento de la reestructuración de la
cromatina durante la formación del pronúcleo masculino y es necesaria para que se
produzca la replicación del ADN del pronúcleo masculino (Ward et al., 1999) y para
proteger el ADN del espermatozoide una vez que ha fecundado al ovocito (Ward, 2010)
(Fig. 4).
Figura 4.- Herencia de los elementos estructurales de la cromatina espermática.Arriba:En espermátidas
redondas las histonas empaquetan el ADN. En medio:Durante la espermiogénesis, la mayoría de histonas
se sustituyen por protaminas (rojo). Abajo: Después de la fertilización, se eliminan las protaminas y son
reemplazas por histonas suministradas por el ovocito (verde claro). Sin embargo, algunas histonas que se
mantienen en el espermatozoide (verde oscuro) probablemente también se mantenganen el pronúcleo
paterno, al igual que las regiones de anclaje a la matriz nuclear (MARs) (Ward, 2010).
14
INTRODUCCIÓN
Las protaminas que están asociadas al ADN espermático se eliminan y son
sustituidas completamente por histonas del ovocito poco tiempo después, entre 2 y 4
horas, de producirse la fecundación(Perreault and Zirkin, 1982).
5.2. EL ADN MITOCONDRIAL
El ADN mitocondrial presente en el espermatozoide está localizado en la pieza
media dentro de las mitocondrias. Es una molécula circular de doble cadena que
contiene 16.5 kb. En ella encontramos 37 genes que codifican 2 ARNr, 22 ARNt y 13
polipéptidos que forman distintas subunidades de enzimas que intervienen en la
fosforilación oxidativa. Este ADN está involucrado en que las mitocondrias provean al
espermatozoide del ATP necesario para la propulsión flagelar. No está asociado ni a
histonas ni a protaminas, es muy susceptible al daño por ROS, aunque también puede
producirlo durante el proceso de formación de ATP. Los daños que se pueden ocasionar
en el ADN mitocondrial por el efecto de ROS se pueden traducir en un cambio en el
potencial de membrana de las mitocondrias que afectará a la motilidad y al
desplazamiento del espermatozoide (Henkel, 2011).Este ADN mitocondrial es destruido,
tras la fecundación, en las primeras etapas del desarrollo embrionario por lo que no
afectará mucho al embrión (Aitken and Krausz, 2001).
6. ANÁLISIS Y ALTERACIONES DEL SEMEN
Para evaluar y diagnosticar el factor masculino en parejas que acuden a la
consulta de esterilidad se recurre rutinariamente al análisis del semen mediante
elseminograma que actualmente sigue siendo la prueba más importante que se realiza
en los laboratorios de andrología para estudiar la infertilidadmasculina. El seminograma
o espermiograma es un examen del esperma que consiste en el analizar una muestra de
semen que corresponda a un eyaculado completo. En este procedimiento se examinan
una serie de parámetros que corresponden no sólo a los espermatozoides contenidos en
esa muestra si no a todo el conjunto de la misma. En un seminograma básico se estudian
tanto aspectos macroscópicos como microscópicos de la muestra. Dentro de las
características macroscópicas se evalúan los siguientes parámetros: volumen,
15
INTRODUCCIÓN
viscosidad, liquefacción, color y pH de la muestra. El examen microscópico consiste en
analizar los siguientes aspectos: concentración, motilidad y morfología de los
espermatozoides.Todas estas determinaciones, una vez evaluadas, se comparan con los
estándares de normalidad que publica y actualiza periódicamentela OMS, lo que nos
permitirá tomar una serie de decisiones sobre la trayectoria a seguir y las opciones más
adecuadas que podremos ofertar al paciente. Aunque el seminograma hoy por hoy sigue
siendo la prueba por excelencia que se realiza en el laboratorio de andrología para
analizar la calidad espermática, no permite determinar a ciencia cierta si un individuo es
fértil o no lo es.Parámetros básicos como concentración, motilidad y morfologíano son
capaces de diagnosticar la esterilidad masculina (Guzick et al., 2001). Los estándares de
referencia que publica la OMS no son valores de referencia de esterilidad o de fertilidad;
hay varones con valores inferiores al umbral mínimo establecido por la OMS cuya
fertilidad está demostrada y, viceversa, hay muchos varones cuyos valores están dentro
de los límites marcados y no logran conseguir un embarazo.Se calcula que alrededor de
un 15% de los varones con parámetros seminales dentro de los límites de la normalidad
son estériles(Guzick et al., 1998;Cortés-Gutiérrezel al.,2007). Sin embargo, los hombres
fértiles tienen, por lo general, valores medios de los parámetros seminales
(concentración, movilidad y morfología) más elevadosy normalesque losde los hombres
infértiles(Zini et al., 2001a).
Como hemos dicho anteriormente, utilizando únicamente los resultados del
seminograma para valorar la capacidad reproductiva de un individuo se escapan
alteraciones quepadecen los espermatozoidesy que afectan a la fertilidad masculina.
Como el seminograma carece de capacidad absoluta para diagnosticar la esterilidad,
actualmente no se cuenta con una prueba definitiva que se pueda utilizar en los
laboratorios de andrología para determinar si un varón es fértil o infértil.Ante la
necesidad de disponer de pruebas diagnósticas precisas capaces de diagnosticar la
infertilidad masculina, y predecir el potencial fértil de un varón, continuamente se están
estudiando nuevos marcadores que ayuden a proporcionar información adicional sobre
la capacidad fecundante de los pacientes y a predecir, según las características del
semen, los resultados de las TRA. Entre las técnicas que han suscitado,en las últimas
16
INTRODUCCIÓN
décadas, mayor interés para estudiar la calidad espermática entre los profesionales de la
reproducción asistida está, sin lugar a dudas, la integridad del ADN y de la cromatina
espermática.
7. FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO
Se conoce como fragmentación del ADN espermático al fenómeno que tiene
lugar cuando se producen roturas tanto de cadena sencilla como de doble cadena en la
molécula de ADN del espermatozoide. Como consecuencia de las roturas en el material
genético del espermatozoide se produce una fragmentación en el ADN del
mismo.Existen multitud de estudios que intentan establecer como el daño producido en
el ADN podría influir en la infertilidad masculina y en que medida afectaríaa las
posibilidades de embarazo y a los resultados de los tratamientos de reproducción
asistida en general.
Hay numerosos estudios que comparan la fragmentación del ADN espermático
con los principales parámetros analizados en el seminograma. Algunos de estos estudios
aseguran que existe una relación negativa directa entre la fragmentación cromosómica y
parámetros seminales tales como la concentración, la motilidad o la morfología(Irvine et
al., 2000; Zini et al., 2002; Smit et al.,2007; Evgeni et al.,2014).Otros autores no
encuentranrelaciónentre la mala calidad seminal y el daño del ADN espermático
(Evenson et al.,1999;Salehet al., 2002a; Benchaib et al., 2007).La existencia de
alteraciones en el ADN, como los fallos en la condensación de la cromatina, las
anomalías en la integridad, la fragmentación del ADN en una o en las dos cadenas, o las
anomalías cromosómicas (aneuploidías o reordenaciones estructurales) afectan a la
fertilidady hay evidencias del impacto negativo que tiene la fragmentación del ADN de
los espermatozoides sobre la fertilidad (Zini et al., 2001b; Zini et al., 2002) y sobrelos
resultados de los tratamientos de reproducción asistida, tanto en las tasas de
fertilización como en las de embarazo(Bellver et al., 2010; Simon et al., 2011). Incluso la
fragmentación puede relacionarse también con enfermedades que afectan a la
descendencia (Aitken and Krausz, 2001;Silber and Repping, 2002; Cortés-Gutiérrez et al.,
2007).Aunque realmente el fenómeno de fragmentación es algo común y se observa en
17
INTRODUCCIÓN
el ADN espermático de los varones en general, lo que hacediferentes a unos individuos
de otros es que se produce en distinta proporción. Al ir aumentando el número de
lesiones en el ADN van disminuyendo las posibilidades de éxito de las técnicas de
reproducción asistida. Así se ha descrito que índices de fragmentación superiores al 30%
dan lugar a anomalías en el desarrollo embrionario y a fallos de implantación, y que los
hombres infértiles tienen un porcentaje mayor de espermatozoides con el ADN
fragmentado que los varones fértiles. (Irvine et al. 2000, Saleh et al.,2002a,Zini et al.,
2006). En parejas con tasas de fragmentaciones altas (30-40%) se observa un potencial
muy bajo de fertilidad natural (Evenson et al., 1999; Spano et al., 2000; Zini et al., 2002;
Zini et al., 2006).El ovocito tiene capacidad, en sí mismo, para reparar el daño que
presenta el ADN del espermatozoide tras la fecundación y en algunos casos es capaz de
hacerlo. La competencia del ovocito a la hora de reparar una determinada lesión va a
depender del tipo de rotura, del porcentaje de fragmentación y de la propia calidad del
ovocito. El problema viene enlos casos en los que el ovocito no es capaz de reparar las
lesiones en el material genético del espermatozoide, en cuyo caso esas alteraciones
pasarán al embrión con los consiguientes efectos que esto suponga para el desarrollo
del embrión y, en el caso de que se produzca un embarazo y este llegue a término,en el
feto (Sakkas and Álvarez,2010).
En la actualidad hay numerosos estudios que analizan y comparan las distintas
técnicas de las que se dispone para el análisis de la fragmentación del ADN espermático.
Muchos son los centros que, analizando las ventajas y desventajas de cada una de ellas,
intentan dilucidar cuál de ellas es la que más se adapta a sus condiciones y cuál de ellas
es la más apropiada para su medio de trabajo.
7.1. MECANISMOS DE INDUCCIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO
El origen de la fragmentación del ADN espermático es de naturaleza
multifactorial aunque se desconoce el mecanismo exacto que la produce. Hay autores
que han propuesto hasta seis mecanismos distintos que pueden inducir la
fragmentación del ADN, tanto nuclear como mitocondrial, del espermatozoide (Sakkas
and Álvarez, 2010) (Fig. 5).
18
INTRODUCCIÓN
La primera causa es la apoptosis producida durante la espermatogénesis. La
apoptosis es un proceso de muerte celular programada que permite eliminar células que
no son necesarias, senescentes o aberrantes (Kerr et al., 1972). Es un mecanismo
genético que provoca una serie de alteraciones morfológicas y bioquímicas en la célula,
que la conducen al suicidio (Nagata, 1997; Sinha Hikim et al., 1999).
Durante el proceso de maduración espermática las células de Sertoli inducen la
apoptosis que elimina aproximadamente el 50 o 75% de las células germinales. Este
mecanismo es necesario en la espermatogénesis normal para poder mantener el
equilibrio necesario entre células de Sertoli y células germinales y que éstas últimas no
proliferen excesivamente, controlando así la calidad de la espermatogénesis (Russell and
Peterson, 1984; Braun, 1998; Aitken and Baker, 2013). Las células germinales sobrantes
y/o defectuosas entran en apoptosis y van a ser destruidas por la vía extrínseca
(Fas/FasL), expresando elreceptor Fas (CD95)que es reconocido y al que se unen las
células de Sertoli y así las fagocitan (Billig et al., 1996; Pentikäinen et al., 1999).Cuando
este mecanismo por algún motivo falla se generan espermatozoides con el ADN
defectuoso (aunque pueden ser morfológicamente normales) que, aunque no deberían
conseguirlo, pasan al eyaculado, fenómeno denominado apoptosis abortiva (Sakkas et
al., 1999; González-Marín et al., 2012).
19
INTRODUCCIÓN
Figura 5.- Principales mecanismos de inducción del daño Del ADN en espermatozoides. Durante la
producción o el transporte: (i) apoptosis durante la espermiogénesis; (ii) roturas durante la remodelación
de la cromatina espermática durante la espermiogénesis; (iii) fragmentación post-testicular inducida
principalmente por los radicales de oxígeno, durante el transporte de los espermatozoides a través de los
túbulos seminíferos y del epidídimo (incremento del daño señalizado según el tamaño los rayos rojos y la
intensidad del oscurecimiento en el recorrido); (iv) fragmentación inducida por caspasas y endonucleasas
endógenas; (v) daño inducido por radioterapia y quimioterapia; y (vi) daños inducidos por sustancias
tóxicas ambientales. (Sakkas and Álvarez, 2010)
En segundo lugar, como otra posible causa del daño en el ADN espermático,
tenemos las roturas ocasionadas mientras se produce la remodelación de la cromatina
en la espermiogénesis. Durante el proceso de espermiogénesis se tiene que condensar
mucho el núcleo de la espermátida para transformarse en un espermatozoide. Se
pueden producir fallos en el complejo intercambio de histonas por protaminas que
podrían dar lugar a daños en el ADN espermático ya que para realizar este intercambio y
liberar el estrés torsional que se provocaes necesario que se produzcan roturas que
luego tienen que reparase (Meyer-Ficca et al.,2005;Meyer-Ficca et al.,2011). Si falla el
mecanismo que controla este proceso de cortar y ligar el ADN nos podemos encontrar
con un porcentaje variable de espermatozoides que presentan roturas residuales, no
20
INTRODUCCIÓN
reparadas, y alteraciones en el empaquetamiento de la cromatina, cuya existencia está
asociada a varios grados de subfertilidad (Meyer-Ficca et al.,2009). La existencia de
roturas en el material genético puede apuntar a una maduración incompleta de los
espermatozoides durante el proceso de espermiogénesis(Nijset al., 2009; Sakkas et al.,
2010).
El tercer mecanismo intervendría ya a nivel post-testicular yes la producción de
especies reactivas de oxígeno (ROS) durante el paso de los espermatozoides a través del
epidídimo. Las ROS son agentes oxidantes (radical hidoxilo, anión superóxido, peróxido
de hidrógeno etc.), altamente reactivos, generados como resultado del metabolismo del
oxígeno que tienen, a pesar de que su vida media es muy corta, la capacidad de oxidar
otras moléculas muy rápidamente. Niveles altos de ROS pueden provocar lesiones en el
ADN,tanto nuclear como mitocondrial (Sawyer et al.,2003), debido a la gran sensibilidad
que tienen los espermatozoides al estrés oxidativo y a que al liberarse del testículo ya no
cuentan con la protección que supone la capacidad antioxidante que presentan las
células de Sertoli. Numerosos autores defienden la utilización de espermatozoides de
testículo para su uso en técnicas de reproducción asistida frenteal uso de
espermatozoides procedentes de eyaculado en pacientes con valores elevados de
fragmentación de ADN y fallo de FIV o ICSI. Estos autores aseguran que estos últimos
pueden experimentar un daño de gran trascendencia clínica al pasar por el epidídimo
que los espermatozoides testiculares no tendrían (Álvarez, 2007). Valores elevados de
ROS puedendañar, además del ADN,la membrana plasmática del espermatozoide (Ollero
et al., 2001; Aitken et al.,1989).El que estas ROS lleguen a ocasionar estrés oxidativo se
produce por una falta de equilibrio entre el volumen de producción de especies
reactivas de oxigeno y la capacidad que tiene la célula de eliminarlas utilizando los
mecanismos antioxidantes de defensa que posee(Gharagozloo and Aitken, 2011). Hay
estudios que demuestran que espermatozoides inmaduros que producen niveles
elevados de ROS pueden inducir daño en el ADN de espermatozoides maduros cuando
están en contacto con ellos, por ejemplo durante la migración de espermatozoides
maduros e inmaduros juntos desde los túbulos seminíferos al epidídimo (Ollero et al.,
2001). A pesar de lo cual también hay evidencias de que se necesita,al menos, una
21
INTRODUCCIÓN
pequeña cantidad de ROS para que se provoquen mecanismos tan importantes en la
fecundación como la capacitación, la hiperactivación y la reacción acrosómica en los
espermatozoides (de Lamirande and Gagnon, 1995; Lamirande et al.,1997).
Una vez que los espermatozoides ya están inmersos en el plasma seminal se
benefician de las altas propiedades antioxidantes que este tiene. Hay otras células como
los leucocitos o incluso los espermatozoides inmaduros,que generan cantidades de ROS
elevadas (Gharagozloo and Aitken, 2011).A esto hay que unir el que en las muestras
espermáticas, ya procesadasque utilizamos para las técnicas de reproducción asistida
losmetabolitos procedentes de los espermatozoides que deberían pero que no han sido
eliminados por apoptosis se acumulan y tienen un efecto negativo enel resto de
espermatozoides (Cortés-Gutiérrezet al., 2007). Además estas manipulaciones que
requieren la preparación de las muestras para utilizarlas en las Técnicas de reproducción
asistida (TRA), como por ejemplo centrifugaciones,hacen que coexistan, en contacto
directo, espermatozoides inmaduros, que liberan gran cantidad de ROS, con
espermatozoides
maduros(Aitken
et
al.,
1994)
que
ven
su
ADN
dañado
significativamente como consecuencia de esta exposición in vitro a valores elevados de
ROS.
Además de las roturas en el ADN de cadena sencilla y de doble cadena, las ROS
pueden producir también otros tipos de daño como son modificaciones o pérdidas de
alguna bases, interacciones entre una o entre varias cadenas de ADN o interacciones
entre ADN y proteinas (Aitken et al., 2010; Gharagozloo and Aitken, 2011) (Fig.6).
Numerosos autores aseguran que el daño observado en la línea germinal masculina está
fundamentalmente motivado por el daño oxidativo (Thomson et al.,2011).
22
INTRODUCCIÓN
Figura 6.- Tipos de lesiones que podrían encontrarse en el ADN de espermatozoides humanos. (Aitken et
al., 2010)
El cuarto mecanismo implicadoes causado por las caspasas y endonucleasas
endógenas, propias del espermatozoide (Sakkasand Álvarez, 2010). Las caspasas son
proteasas implicadas en la apoptosis y, junto con las endonucleasas, pueden inducir la
fragmentación del ADN del espermatozoide al ser activadas por ROS. Estos dos tipos de
enzimas también se pueden activar por factores fisicoquímicosexternos como son la
temperatura y determinados agentes ambientales tóxicos (Sakkas and Álvarez, 2010).
En quinto lugar tenemos la radio y la quimioterapia como causas externas. La
exposición, como consecuencia de tratamientos médicos, a agentes quimio o
radioterápicos puede inducir la fragmentación del ADN espermático (Cai et al., 1997;
Harrouket al., 2000). Además puede también afectar negativamente a la fertilidad
masculina al reducir el número de espermatozoides por el efecto citotóxico que estos
agentes tienen en el testículo (Morris, 2002). En ambos casos las consecuencias, tanto a
23
INTRODUCCIÓN
corto como a largo plazo dependerán de los fármacos utilizados, de las dosis y de la
duración del tratamiento.
Por último se situaríaotra causa externa, la sexta, que son los tóxicos ambientales
que podrían aumentar el estrés oxidativo. Están dentro de este apartado agentes como
la contaminación atmosférica, exposición a pesticidas y otros agentes tóxicos, el
tabaquismo, las ondas electromagnéticas de los teléfonos móviles etc.(De Iuliis et al.,
2009; Taha et al., 2012; Pant et al., 2014).Su efecto en el incremento del daño en el ADN
espermático dependerá del tipo de exposición y del tipo de contaminante.
7.2. TÉCNICAS DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DELA FRAGMENTACIÓN DEL ADN
ESPERMÁTICO
Actualmente existen numerosos y diferentes métodos para analizar la integridad
del ADN espermático y cuantificar elgrado de fragmentación que presenta el ADN de los
espermatozoides (Fig. 7).
Las metodologías que miden la fragmentación del ADN se pueden englobar en
tres grupos:
1.Técnicas que marcan las roturas, tanto de cadena doble como de cadena sencilla, de la
molécula de ADN.Entre ellas se encuentran: TUNEL y ISNT.
2.Técnicas que miden la susceptibilidad diferencial del ADN para ser desnaturalizado al
exponerlo a distintos tratamientos.En este grupo se incluyen: SCSA,ensayo COMETA,
test SCD y DBD-FISH.
3.Otras técnicas, menos utilizadas, que se basan en los efectos de distintos colorantes. A
este grupo corresponden: NA, AT y CMA.
24
INTRODUCCIÓN
Figura 7.-Metodologías utilizadas para evaluar alteraciones en el ADN espermático. (Cortés-Gutiérrez et
al., 2007)
1. Técnicas que marcan las roturas, tanto de cadena doble como de cadena sencilla, de
la molécula de ADN:
-TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyUridine triphosphateNick-End Labelling)
Introducida por Gorczyca en 1993 (Gorczycaet al., 1993). Esta técnica, al igual
que el test SCD, también está comercializada en kit para su aplicación en
espermatozoides. Radica en la incorporación denucleótidos, a partir de desoxiuridina
trifosfato (dUTP)marcada con fluorocromos (biotina o digoxigenina), a los puntos de
rotura de ADN (en los extremos 3´OH de las cadenas afectadas), tanto de cadena doble
como de cadena sencilla mediante la acción de una enzimatransferasa terminal, la
desoxinucleotidil transferasa (TdT). Los resultados se analizan o bien con un microscopio
de fluorescencia (Fig. 8) o bien con un citómetro de flujo. En este caso, se cuantifica la
25
INTRODUCCIÓN
cantidad de nucleótidos incorporados, de manera quecuántas más roturas mayor será la
incorporación
deestosnucleótidos
y
mayor
la
intensidad
de
la
señal
fluorescente.Mediante microscopía de fluorescencia se cuantifica el número de
espermatozoides verdes (con ADN fragmentado e incorporación de la fluoresceína),
mientras que las cabezas azules corresponden a espermatozoides con ADN íntegro
contrateñidos con DAPI (4’,6-diamino-2-phenylindole). Los resultados obtenidos se
comparan además respecto a un control negativo, incubando en ausencia de la TdT, y a
un control positivo de muestras tratadas previamente con DNasa I (Evenson et al.,
2002).
Figura 8.-Técnica TUNEL. Núcleos espermáticos con ADN fragmentado (verde) y núcleos espermáticos con
ADN íntegro (azul). (Jee et al., 2011)
En cualquier caso,para poder utilizar esta metodología se necesitan equipos
sofisticados y personal especializado. Además, presenta otros inconvenientes, entre los
que destacan que es necesario fijar la cromatina para poder realizar esta técnica, y que
los kits comerciales se desarrollaron para células somáticas, cuyo ADN presenta un
grado de compactación mucho menor que el espermático,lo que puede dificultar el
acceso de la enzima a la cromatinay puede subestimarse el daño. Hay diversos estudios
26
INTRODUCCIÓN
sobre el valor predictivo de este ensayo adaptado para mejorar la sensibilidad de la
técnica en las TRA, tanto en IAH (Duran et al., 2002) como en ICSI (Evenson et al., 2002).
-ISNT (In SituNick Translation)
Fue implantada por Bianchiy colaboradores en 1993 (Bianchi et al.,
1993).Consiste en la incorporación de nucleótidos de desoxiuridina trifosfato (dUTP)
marcados con un biotina o digoxigenina a las roturas de cadena sencilla,usando como
molde la cadena complementaria de ADNmediante la acción exonucleasa (5’-3’) y
polimerasa de la ADN polimerasa I. Identifica la cantidad de ADN dañado cuantificando
la intensidad de señal producida (Gorczyca et al., 1993). Los resultados se analizan con
un microscopio de fluorescencia o citometría de flujo. Esta tecnología tiene la misma
base y los mismos inconvenientes que el ensayo TUNEL aunque la incorporación de
nucleótidos en este caso es mayor.
2. Técnicas que miden la susceptibilidad diferencial del ADN para ser desnaturalizado
al exponerlo a distintos tratamientos:
-SCSA (SpermChromatin Structure Assay)
El ensayo de la estructura de la cromatina espermática se introdujo en 1980 por
el grupo de Evenson para analizar la cromatina espermática en mamíferos (Evenson et
al, 1980). La tecnología se fundamenta en el incremento de susceptibilidad a la
desnaturalizaciónin situ de la cromatina que se produce como consecuencia delas
roturas en el ADN.
Se deja actuar una solución ácida o una temperatura elevada sobre las cabezas
de los espermatozoidespara así desnaturalizar su ADN y posteriormente se tiñe. Mide la
susceptibilidad a desnaturalizarse, se desnaturalizará el ADN que presente roturas,
mientras que el que está intacto no se descondensa.La tinción se realiza con naranja de
acridina (NA), fluorocromo que puede intercalarse entre las dos cadenas de ADN y que
tiene la cualidad de ser metacromático, capaz de teñir de un color distinto al propio
colorante. Emite fluorescencia verde o roja a distinta longitud de onda y esta dependerá
de si el ADN esta en forma de doble cadena o de cadena sencilla, intacto o fragmentado,
respectivamente. Si este fluorocromo se incorpora a ADN de cadena sencilla lo hace
formando agregados y emite color rojo-anaranjado y si lo que emite es color verde se
27
INTRODUCCIÓN
ha incorporado a cadenas dobles de ADN en forma de monómero. Se analizan 5000
espermatozoides utilizando un citómetro de flujo que calcula el cociente entre
fluorescencia roja y la fluorescencia total (fluorescencia verde+fluorescencia roja)
(Evensonet al., 1980). Lo que mide es laratio de cadena simple y cadena doble en cada
espermatozoide, la relaciónentre espermatozoides con el ADN fragmentadoeintacto,
respectivamente. Un mayor grado de desnaturalización indica un ADN con estructura
más frágil, es decir una proporción de cadena sencilla mayor que la proporción de
cadena doble.El porcentaje de fragmentación de ADN (%DFI: ADNFragmentation Index)
que proporciona esta técnica indica la proporción de espermatozoides que tiene el ADN
desnaturalizado en un porcentaje medio-alto. Como resultado de esta técnica también
obtenemos otro parámetro, el HDS (Hight DNA stability), que indica el porcentaje de
espermatozoides inmaduros.A la hora de aplicar esta técnica a la práctica clínica y como
resultado de numerosas investigaciones se estableció el punto de corte en 30 que
corresponde a un porcentaje de fragmentación (30%) por encima del cual el individuo
vería comprometida su fertilidad (Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000). Índices
superiores al 30% están relacionados además con abortos en el primer
trimestre.Actualmente las muestras se clasifican en calidad excelente, con %DFI menor o
igual al 15%, buena calidad si el %DFI se encuentra entre 15 y 30% y por último calidad
pobre si el índice supera al 30% (Evenson and Wixon, 2006a).
-Ensayo COMETA(comet assay) oSCGE (Single Cell Gel Electrophoresis)
Se introdujo por primera vez en 1984 por Ostling y Johanson (Ostling and
Johanson, 1984). Se basa en el mismo principio que la electroforesis de ADN desnudo,en
que las moléculas de ADN tienen distinta capacidad para moverse a través de un gel al
ser sometidas a un campo eléctrico dependiendo de su tamaño.
La técnica consiste, básicamente, en incluir la muestra de espermatozoides
dentro de un microgel de agarosa sobre un portaobjetos. Se desnaturaliza y a
continuación se somete a una solución de lisis con un agente reductor de grupos
sulfidrilo, por ejemplo el ditiotreitol (DTT). La cromatina se descondensa al romperse
lospuentesdisulfuro existentes en las protaminas de los espermatozoides por la acción
del DTT. Después,el microgel es sometido a una electroforesis y tras eso se realiza una
28
INTRODUCCIÓN
tinción sobre el mismo con un fluorocromo del tipo DAPI (4,6 diamino-2-phenylindole),
IP (Ioduro de Propidio) o SYBR-Green. Al someter al ADN descondensado
de un
espermatozoide a la acción de un campo eléctrico se mueve desde el polo negativo al
positivo. Los múltiples fragmentos de ADN de los núcleos de los espermatozoides
fragmentados se van desplazando formando una imagen que recuerda a la cola de un
cometa (de ahí su nombre), de mayor tamaño a medida que el grado de fragmentación
es mayor. Por el contrario, los núcleos de los espermatozoides que no presenten roturas
no generan colas o las que generan son muy discretas (Fig. 9). La cantidad de daño o el
porcentaje de fragmentación se cuantifican midiendo la longitud y densidad de la cola
del cometa (Singh et al., 1988). Los resultados se analizan con un microscopio de
fluorescencia y pueden ser interpretados o bien por un observador experimentado o
bien utilizando un software de análisis de imágenes específico. Esta técnica debido a su
compleja metodología se utiliza fundamentalmente en investigación.
Sise realiza la desnaturalización en condiciones neutras de pH se evidencian las
roturas de cadena doble, pero si lo hacemos en condiciones alcalinastambién podremos
visualizarroturasde cadena sencilla y la existencia de puntos lábiles alcalinos,ya quelos
ambientes con pH altos ayudan a desnaturalizar el ADN. Existe una variante de esta
técnica, el ensayo cometa bidimensional, que combina los dos tipos de
desnaturalización; en primer lugar se utilizan condiciones neutras y posteriormente
condiciones alcalinas evidenciando así tanto las roturas de cadena sencilla como de
cadena doble.
29
INTRODUCCIÓN
Figura 9.- Ensayo COMETA.Arriba: Núcleo espermático con ADN íntegro. Abajo: Núcleo espermático con
ADN fragmentado, se observa el desplazamiento de los fragmentos de ADN al ser sometidos al campo
eléctrico. (Cortés-Gutiérrez et al., 2007)
- Test SCD (Sperm Chromatin Dispersion test)
Fue introducido por Fernández y colaboradores en 2003 (Fernández et al.,
2003).Existe una versión comercial y se conoce comoel kit Halosperm® (Fernández et al.,
2005).Se basa en que al romper los puentes disulfuro que forman las protaminas, y
utilizar una solución de lisis que extraiga las proteínas, los bucles de ADN se relajan y
forman halos alrededor del núcleo.Los espermatozoides con ADN fragmentado ven
impedida la relajación de los bucles y muestran halos muy reducidos o inexistentes,
contrariamente a lo observado en espermatozoides sin fragmentación.
Técnicamente,los espermatozoides se fijan con un gel de agarosa de bajo punto
de fusión en un portaobjetos pretratado. Se somete a las preparaciones a una solución
ácida que induce la desnaturalizacióndel ADN en losespermatozoides. Tras ese
tratamiento inicial y por el efecto de una solución de lisis se desproteiniza la preparación
eliminando la mayor parte de las proteínas nucleares. Las preparaciones se lavancon una
solución tamponada, se deshidratan y se dejan secar al aire. Como último pasose tiñen
las preparaciones conel kit Diff-Quik o concolorante deWrighten el caso de ir a utilizar
microscopía de campo claro, o con fluorocromos específicos tipo DAPI si se recurre a un
microscopio de fluorescencia. En las cabezas de los espermatozoides cuyoADN no está
30
INTRODUCCIÓN
fragmentado se producen halos, de distinta magnitud, como consecuencia de la
dispersión de los bucles de ADN (Fig. 10). Por el contrario, en aquellos espermatozoides
en los que no se producen halos o estos son muy pequeños se considera quepresentan
el ADN fragmentado (Fernández et al., 2003;Fernández et al., 2005). Los resultados se
analizan con un microscopio de campo claro o uno de fluorescencia (según el tipo de
tinción utilizada) y pueden ser interpretados o bien por un observador experimentado o
bien utilizando un software de análisis de imágenes específico que valorará la presencia
o ausencia de halos y la magnitud de los mismos.
Figura 10.- Test SCD.Núcleos espermáticos procesados con SCDt teñidos con DAPI (arriba) y con Wright
(abajo): (a) halo grande, (b) halo mediano, (c) halo pequeño, (d) sin halo y (e) núcleo sin halo y degradado.
(Fernández et al., 2005)
Esta tecnología tiene la misma base que el ensayo cometa con la diferencia de
que en este caso no se necesita realizar una electroforesis, lo que facilita notablemente
su realización, sin perder por ello capacidad predictiva ya que los resultados obtenidos
mediante esta técnica se correlacionan con los obtenidos utilizando otras metodologías
como el SCSA o el TUNEL (Chohan et al., 2006). Este proceso no requiere de aparataje
específico diferente al que se utiliza de rutina en un laboratorio de andrología, ya que
31
INTRODUCCIÓN
con un microscopio de campo claro, que forma parte de la dotación indispensable de
cualquiera de estos laboratorios, sería suficiente.
-DBD-FISH (DNA Breakage Detection-Fluorescence in Situ Hybridization)
Fue introducida por Fernández en 1998 (Fernández et al., 1998). El método
radica en la exposición del ADN de los espermatozoides a soluciones alcalinas que son
capaces de desnaturalizar la molécula tanto en lugares sensibles como en extremos
3´OH que han quedado libres por una rotura de cadena doble o sencilla.
Las células, que están sobre un portaobjetos e incluidas en una delgada capa de
agarosa se incuban en una solución alcalina capaz de realizar una desnaturalización
suave de la molécula de ADN. Una vez detenida la desnaturalización se incuba la
preparación en una solución de lisis para extraer las proteínas y dejar la molécula de
ADN en forma de cadena sencilla. Esta hebra sencilla de ADN, obtenida a partir del
punto de rotura, se hibrida con una sonda específica de ADN marcada con un
fluorocromo como, por ejemplo, el DAPI (Fig. 11). Al aumentar el porcentaje de
fragmentación, mayor número de roturas y mayor proporción de ADN de cadena
sencilla, mayor intensidad tendrá el marcaje en el ADN en el núcleo de la cabeza de ese
espermatozoide en concreto. Los resultados son analizados e interpretados, como en el
caso anterior, con un microscopio de fluorescencia y por un observador experimentado.
La intensidad de la señal puede ser cuantificada con un programa de análisis de
imágenes, a mayor intensidad en la señal mayor será el porcentaje de roturas. Esta
técnica se utiliza fundamentalmente en el campo de la investigación y permitir analizar
cada célula en secuencias específicas de ADN (Cortés-Gutiérrez et al., 2007).
32
INTRODUCCIÓN
Figura 11.- DBD–FISH combinado con SCD.a: Espermatozoides teñidos con DAPI con ADN íntegro: 1,2,5 y 6
y con ADN fragmentado: 3 y 4.b: Espermatozoides procesados con DBD-FISH con ADN fragmentado (3 y
4). (Cortés-Gutiérrez et al., 2007)
3. Otras técnicas:En este apartado se englobarían otros métodos alternativos quese
utilizan menos porque son menos fiables, debido que son poco reproducibles y son muy
susceptibles a la subjetividad del observador.
-NA (naranja de Acridina)
Introducida por Tejada en 1984 (Tejada et al., 1984).Los espermatozoides se
tiñen con este colorante metacromático, el ADN fragmentado emite fluorescencia
naranja y el no fragmentado verde, según el mismo principio utilizado en la técnica
SCSA. Se analizan mediante microscopía de fluorescencia,y es difícil de evaluar porque
existen muchos colores intermedios y los resultados no son muy reproducibles (Evenson
and Wixon, 2006a).
-AT (azul de Toluina)
Descrita por Andreetta en 1995 (Andreetta et al., 1995).Los espermatozoides se
colorean con este colorante básico que tiene cualidades metacromáticas igual que la NA.
Tiñe de violeta azulado intenso al unirse a cromatina rica en histonas o de azul más
pálido al unirse a cromatina rica en protaminas. Se basa en que los espermatozoides
más inmaduros presentarán más roturas y eso es lo que realmente evalúa, el grado de
maduración según la condensación del ADN del núcleo. Se puede evaluar mediante
33
INTRODUCCIÓN
microscopia de campo claro o con citometría de flujo (Erenpreisa et al., 2003). Al igual
que en el caso de la NAlos resultados son poco reproducibles.
-CMA-3 (CMA3)
Se trata de un fluorocromo específico que presenta afinidad preferencial a unirse
a regiones ricas en pares GCy compite con las protaminas por los mismos lugares en el
ADN. Los espermatozoides que muestran coloración intensa presentan niveles bajos de
protaminación. Se ha relacionado la fragmentación del ADN espermático con
espermatozoides deficientes en protaminas.Al igual que en el caso anterior evalúa la
maduración, el nivel de empaquetamiento de la cromatina nuclear(Manicardi et al.,
1995). La valoración de los resultados se realiza mediante microscopía de fluorescencia.
Realmente detecta espermatozoides morfológicamente normales que pueden presentar
anomalías en la compactación de la cromatina. Una de sus mayores limitaciones es la
subjetividad del observador a la hora de delimitar clases de espermatozoides.
7.3. SIGNIFICADO CLÍNICO DE LA FRAGMENTACIÓN DELADN ESPERMÁTICO
Hasta la actualidad se han utilizado los parámetros clásicos del seminograma
para predecir la fertilidad del varón, pero últimamente el análisis de la integridad del
ADN espermático está cogiendo más protagonismo por la información adicional que
puede proporcionar sobre la evaluación y el diagnóstico de la fecundidad masculina,
(Saleh et al., 2002a). Se han publicado numerosos trabajos intentando relacionar la
fragmentación del ADN espermático con los distintos parámetros convencionales del
seminograma con resultados, sin embargo, muy contradictorios. Así, algunos estudios
indican
que
niveles
elevados
relacionadospositivamente
con
de
daño
alteraciones
en
el
seminales
ADN
de
espermático
todo
tipo
están
(como
concentración, motilidad, aspectos morfología del espermatozoide, etc.) (Tomlinson et
al., 2001; Sheikh et al., 2008; Tandara et al., 2013), mientras en otras ocasiones,
contrariamente a lo anterior, se establecen relaciones negativas entre el porcentaje de
fragmentación y parámetros básicos del seminograma (Kidd et al., 2001; Johnson et al.,
2015, Benchaib et al., 2007). Incluso se han intentado establecer valores umbrales de
fragmentación por debajo de los cuales el éxito de cualquiera de las TRA estaría
34
INTRODUCCIÓN
seriamente comprometido, sin haberse logrado un consenso tampoco en ese aspecto
(Evenson et al., 1999, Spanòet al., 2000;Evenson and Wixon, 2006a, Collins et al., 2008).
En cuanto a su repercusión sobre el resultado de las TRA, numerosos autores
relacionan niveles altos de fragmentación espermática con peores resultados en tasas
de embarazo tras IA (Duran et al. 2002;Bungum et al.,2004; Zini, 2011). Sin embargo, en
el caso de la FIV convencional, al contrario que lo que sucede en la IA, los resultados son
polémicos, encontrándose desde relaciones significativas con distintos parámetros,
como la tasa de fecundación (Hostet al.,2000) o la tasa de embarazo(Tarozzi et al.,2009),
hasta la no concordancia(Bungum et al., 2004). Si nos centramos en estudios realizados
en pacientes sometidas a ICSI, al igual que en FIV, los resultados son también
controvertidos. De este modo, hay autores que no encuentran relación entre la
fragmentación del ADN espermático y los resultados del ciclo, tanto en tasas de
fecundación como de embarazo(Zini, 2011), mientras, contrariamente, otros
investigadores sí que encuentran asociación entre la fragmentación y los resultados de
ICSI(Micinski et al.,2009), así como con los resultados de pérdida gestacional
(Bhattacharya, 2008).
Con todas estas controversias, parece sensato profundizar en el análisis dela
fragmentación en los varones que se van a someter a TRA, y eso adquiere especial
importancia sobre todo en los casos de ICSI, en los que es el biólogo el que elige el
espermatozoide, basándose únicamente en criterios morfológicos. De momento el
estudio de la fragmentación del ADN espermático no está instaurada como técnica
rutinaria en los laboratorios y todavía no se ha llegado a un consenso sobre si su
incorporación al estudio seminal convencional permitiría ayudar a diferenciar los
varones fértiles de los infértiles. A pesar de que se ha investigado mucho actualmente
sigue siendo un tema muy controvertido. Hay autores que defienden la incorporaciónde
esta técnica a la rutina de pruebas que se deben realizar al varón (Lewis, 2015), mientras
que otros abogan por lo contrario al no existir suficiente evidencia científica de su
implicación (Drobnis and Johnson, 2015).
35
INTRODUCCIÓN
8. TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA
Una vez completado el estudio de la pareja estéril y examinando la totalidad de
las pruebas realizadas a ambos miembros se decide hacia qué técnica de reproducción
asistida se les va a dirigir.
Las tres técnicas fundamentales de reproducción asistida son la inseminación
artificial (IA), la fecundación in vitroconvencional (FIV) y la inyección intracitoplasmática
de espermatozoides, en inglésIntracytoplasmic Sperm Injection(ICSI).La inseminación
artificial consiste en la introducción de una selección de los espermatozoides que tengan
mejor calidad en el interior de la cavidad uterina de la mujer. La muestra seminal puede
provenir del marido, hablamos entonces de inseminación artificial homóloga o
conyugal(IAH o IAC)oproceder de un donante (IAD). En la fecundación in vitro
convencional los ovocitos se incuban en un medio de cultivo que contiene
espermatozoides previamente preparados, uno de los cuales fecundará cada ovocito in
vitro. El ICSI consiste en introducir mediante un sistema de micromanipulación un
espermatozoide dentro de cada uno de los ovocitos maduros.
Cuando se utiliza,de manera rutinaria, cualquiera de estas técnicas de
reproducción asistida, especialmente el ICSI, en los laboratorios de FIV se eluden
muchos mecanismos de selección natural y esto tiene como consecuencia que
aumenten las posibilidades de que el material genético de los espermatozoides (que el
biólogo ha elegido)que fecunden a los ovocitos contenga alteraciones.
Por todas las circunstancias referidas consideramos que puede resultar de gran
interés, no solo científico sino también de aplicación a la práctica clínica, seguir
profundizando en el conocimiento de los factores que inciden y pueden mejorar los
resultados de los tratamientos de reproducción asistida, un área de enorme relevancia
sociosanitaria.
36
OBJETIVOS
OBJETIVOS
El presente trabajo tiene como objetivo general la evaluación del impacto del
factor masculino sobre los resultados clínicos tras los tratamientos de reproducción
asistida, utilizando como técnica de inseminación la inyección intracitoplasmática de
espermatozoides (ICSI).
Para ello se pretenden llevar a cabo los siguientes objetivos específicos:
1.- Analizar las características y parámetros seminales de los varones de la serie.
2.-
Establecer las posibles relaciones entre la fragmentación del ADN espermático y los
parámetros clásicos del seminograma.
3.-
Evaluar las consecuencias que tiene el procesamiento espermático mediante la
técnica de swim-up sobre la fragmentación de la muestra seminal.
4.-
Evaluar los resultados de los ciclos de fecundación in vitro mediante la técnica de
inyección intracitoplasmática de espermatozoides en relación con las características
de las parejas, los parámetros seminales y la fragmentación del ADN espermático.
-
39
MATERIAL Y MÉTODOS
MATERIAL Y MÉTODOS
1. POBLACIÓN DE ESTUDIO
La población estudiada está compuesta poruna serie de41 parejas de pacientes
que acudieron a la consulta de Fecundación In Vitro de la Unidad de Reproducción
Humana del HOSPITAL 12 DE OCTUBRE de Madrid en un periodo que abarca desde 20
de Octubre del 2008 hasta 2 de febrero del 2010. Todas estas parejas fueron
sometidas durante este periodo a uno o a varios ciclos de fecundación in vitro, la
mayoría de ellas con transferencia de embriones en fresco y en algunos casos con un
ciclo posterior de transferencia de embriones congelados procedentes de esos ciclos
previos de fecundación in vitro.
Ninguna de las parejas estudiadas teníahijos anteriores ni con estas ni con otras
parejas y todas acudieron a la consulta tras un periodo de esterilidad igual o superior a
un año.
Los varones que forman parte del estudio tienen una edad comprendida entre
los 25 y los 51 años, con una edad media de 38,51 ± 0,94 años.La edad de las mujeres
osciló entre los 21 y los 40 años, con una edad media de 34,46 ± 0,71 años. A todos los
sujetos, tanto hombres como mujeres se les realizó una serología de hepatitis B y C y
VIH y, en el caso de los varones, también un seminograma previode estudio antes de
empezar el ciclo.
Todas las parejas firmaron un consentimiento informado elaborado en la
Unidad de reproducción Humana siguiendo las directrices de la SEF y reconocido por la
Unidad de calidad y Comité de historias clínicas del Hospital 12 de Octubre. Los datos
de este trabajo se han tratado siempre de manera confidencial y en ningún caso se ha
hecho referencia a la filiación de los mismos, respetando así losrequisitos
contemplados en la legislación de la Agencia Española de Protección de Datos.
2. SEMINOGRAMA
El análisis seminal se realizó siguiendo las recomendaciones de la OMSvigentes
en el momento de la recogida de los datos(OMS, 1999).Actualmente, los valores de
referencia han sufrido algunas variaciones debido a la revisión realizada recientemente
43
MATERIAL Y MÉTODOS
(OMS, 2010).La muestra se obtuvo por masturbación tras un periodo de abstinencia
sexual de 2 días como mínimo y 5 días como máximo, intentando mantener las
máximas condiciones de asepsia posibles. El eyaculado, que tiene que ser completo, se
recogió en un recipiente estéril y con un tiempo máximo de traslado al laboratorio de
entre 30 minutos y 1 hora, evitando en lo posible las fluctuaciones de temperatura.
Cada una de las muestras se registró, etiquetándola con el nombre y número de
historia de ambos miembros de la pareja. Se completan los datos sobre la recogida con
información que facilitaron los varones sobre los días de abstinencia, el lugar y la hora
exacta a la que se hasido obtenido y también se incorpora a la hoja de recogida
cualquier otro dato que facilite el paciente, como la aparición de fiebre en los últimos
días, la ingesta de cualquier tipo de fármaco, situaciones de estrés, etc.; así como
cualquier incidencia que haya tenido durante el proceso de recogida y/o traslado al
laboratorio.
Una vez que la muestra llega al laboratorio se conserva en una incubadora a
37°C para su licuefacción, después de lo cual comienza el procesamiento.El eyaculado
se empieza a procesar, más o menos, entre los 25 o 30 minutos después su obtención
y 1 hora como máximo para prevenir la deshidratación y los cambios de temperatura
que afectan a la calidad espermática.
El estudio de la muestra se dividió en dos etapas, y los parámetros principales
recogidos en ellas se resumen en la Tabla 1.
44
MATERIAL Y MÉTODOS
Parámetro
Licuefacción
Aspecto
Valores de referencia
Alteraciones
Total a los 60 min.
*
Homogéneo
*
Rojizo-marrón*
Color: gris-opalescente
Amarillento*
Opacidad disminuida*
Hipospermia
Volumen
≥ 2,0ml
Aspermia
(ausencia de eyaculado)
Viscosidad
pH
Concentración
espermática
Número total de
espermatozoides
Motilidad
Morfología
Caída por gravedad en
gota o filamentos <2 cm
Hiperviscosidad seminal
≥ 7,2
*
Oligozoospermia**
≥ 20 x 106/ml
Azoospermia
(ausencia de espermatozoides)
≥ 40 x 106/eyaculado
Oligozoospermia**
≥ 50% (a + b)***
Astenozoospermia
o ≥ 25% (a)
≥ 15% formas normales
Teratozoospermia
Tabla 1.- Valores de referencia (OMS, 1999)
* No existe denominación consensuada para las alteraciones.
** Suficiente con que uno de los dos parámetros esté alterado.
*** a: motilidad progresiva rápida, b: motilidad progresiva lenta o perezosa.
Pormenorizando los parámetros recogidos:
Análisis macroscópico: Este apartado comprende la observación de las siguientes
características de la muestra seminal:
▪ Licuefacción: Para evaluar una muestra de semen esta debe estar licuada. La
licuefacción es un fenómeno espontáneo que se produce gracias a una sustancia
liberada en el eyaculado denominada fibrinolisina.Aunque la licuefacción completa
ocurre normalmente alrededor de los 15 minutos post-eyaculación a temperatura
45
MATERIAL Y MÉTODOS
ambiente, una muestra normal puede tardar hasta 60 minutos en licuarse. Si pasado
ese periodo no se ha producido tiene que quedar registrado. En algunos casos
aparecen cuerpos gelatinosos que no se licuan, lo que parece carecer de importancia o
significado clínico y no dificultan el análisis. En algunas ocasiones este fenómeno de
licuefacción no ocurre de manera natural, de modo que transcurrido el tiempo
máximo (60 minutos), si la muestra no se ha licuado completamente, en nuestro caso
hemos procedido a diluir el eyaculado en una solución salina tamponada (Dulbecco´s
Phosphate Buffered Saline, Gibco®, Life Technologies, Paisley, UK) en proporción
1:1ymezclar repetidamente con una pipeta de calibre ancho hasta conseguir la
licuefacción completa. Existen otros métodos, como la adición de bromelina (1g/L), o
el paso deleyaculado por una aguja de calibre 18 o 19 (0.84 mm o 0.69 mm de calibre
interno, respectivamente)unida a una jeringa,se desaconsejan porque puede producir
daño a los espermatozoides.Cualquier procedimiento adicional utilizado deberá ser
registrado.
▪ Aspecto: Una muestra normal debe ser homogénea y de color gris opalescente.
Puede parecer menos opaca cuando la concentración de espermatozoides es muy
baja, o tener una tonalidad rojizo-marrón que indicaría la presencia de hematíes, o
amarillenta como consecuencia del consumo de vitamina B o en el caso de pacientes
con ictericia. (Tabla 1).
▪ Volumen: Se calcula utilizando el peso total del recipiente con la muestra y
restándole el peso del recipiente vacío. La medida se registraen ml utilizando un
decimal. Para que un volumen se considere normal debe ser igual o superior a 2,0 ml
(Tabla 1).
▪ Viscosidad:Para evaluar este parámetro, también llamado “consistencia”,se aspirala
muestra con una pipeta de plástico ancha ( ̴1.5 mm de diámetro) y el contenido de la
pipeta se deja caer por gravedad. Se considera viscosidad normal la caída en gota o
produciendo filamentos menores de 2 cm de longitud. Si los filamentos superan los 2
cm de largo se considera una viscosidad aumentada(Tabla 1)indicando posiblemente
algún tipo de disfunción prostática y pudiendo interferir en la valoración de otros
46
MATERIAL Y MÉTODOS
parámetros como la concentración o la motilidad.
Los métodos para reducir la
viscosidad son los mismos que los descritos para facilitar la licuefacción.
▪ pH: Debe ser medido antes de transcurrir una hora de la eyaculaci6n y se realiza
utilizandotiras de papel específicas para medir pH que tengan un rango de entre 6.0 y
10.0. Se homogeniza bien la muestra con una pipeta, se pone una gota encima del
papel pH y esperamos 30 segundos a que el papel se impregne y cambie de color.
Pasado ese tiempo se comparael tono obtenido con la tabla de colores de referencia
para saber con qué pH se corresponde.El pH debe ser superior a 7,2(Tabla 1 ). Los
valores inferiores a 7,0en muestras azoospérmicas pueden indicar una obstrucción de
las vías eyaculatorias o la ausencia bilateral congénita de los vasos deferentes.
Análisis microcópico:
▪ Motilidad espermática: Se depositan 10 µl de la muestra , muy bien homogeneizada,
en un portaobjetos limpio y atemperado y se cubre con un cubreobjetos de
22 x 22
mm para obtener una profundidad ̴ 20 µm. Esperar aproximadamente un minuto para
que la muestra se estabilice. La motilidad se evaluó utilizando un microscopio Nikon
Eclipse E200 con contraste de fases y un objetivo 40x. Se evalúan por lo menos 5
campos aleatorios para clasificar 200 espermatozoides. La OMS establece cuatro
categorías de espermatozoides (a, b, c y d) según su movilidad.Se cuantifican en cada
campo los espermatozoides progresivos y con movimiento rápido (trayectoria
rectilínea y velocidad mayor o igual a 25 µm/seg o velocidad mayor o igual a 5 veces la
longitud de la cabeza por segundo) que se clasifican como clase a, los progresivos lentos o
perezosos(velocidad menor de 25 µm/seg) que se incluyen en la clase b, los no
progresivos (velocidad < 5 µm/seg) catalogados como clase c, y por último los de la
clase d que corresponden a los espermatozoides inmóviles (Tabla 2). La movilidad se
registra expresando los porcentajes de espermatozoides de la muestra que se incluyen
en cada una de las cuatro categorías de movilidad espermática.
47
MATERIAL Y MÉTODOS
Categoría OMS Tipo de movilidad
Velocidad
a
Progresiva rápida
≥ 25 µm/s (≥ 5 veces la longitud de la cabeza)
b
Progresiva lenta
5 - 24 µm/s
c
No progresiva
d
Inmóviles
< 5 µm/s (< 1 vez la longitud de la cabeza)
-
Tabla 2.- Categorías de motilidad espermática (a 37°C) según la OMS (1999)
Una vez cuantificados 200 espermatozoides en una primera preparación se repite el
proceso, es decir, se prepara un nuevo portaobjetos de la misma muestra seminal y se
vuelven a valorar otros 200 espermatozoides. La movilidad se registra expresando los
porcentajes de espermatozoides de la muestra que se incluyen en cada una de las
cuatro categorías. Se considera que una muestra tiene una motilidad normal si la suma
de espermatozoides con motilidad “a + b” esigual o superior al 50%, o bien si el
porcentaje de espermatozoides que tienen motilidad “a” es igual o superior al 25%.
Por debajo de esos valores se considera que existe astenozoospermia (Tabla 2).
▪ Concentración espermática: Para el cuantificar el número de espermatozoides se
utilizó la cámara de contaje de Makler® (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel) (Fig
12).Es una cámara específica de recuento de espermatozoides compuesta de dos
partes, una base de metal donde se sitúa la muestra y una cubierta de cristal que actúa
de cubreobjetos. En el centro hay una rejilla de 1mm2, subdividida en 100 cuadrados,
cada uno de 0,1 x 0,1 mm. Se deposita en la cámara 5 μl de muestra previamente
homogeneizada y se contabiliza en un microscopio con contraste de fasesNikon Eclipse
E200con un objetivo 20x o 40x, contabilizando únicamente los espermatozoides
intactos. El número de espermatozoides (n) cuya cabeza esté dentro del área comprendida
en 10 cuadros equivale al número de millones
(nx106)de espermatozoides por
mililitro.Este recuento se realizó 3 veces para poder establecer una media. Para
aumentar la fiabilidad del análisis este proceso se puede duplicar cargando de nuevo la
cámara con otros 5 μl de la misma muestra y repitiendo el contaje. El número total de
espermatozoides en todo el eyaculado es el producto de la concentración espermática
y el volumen de la muestra. Se refleja en el informe tanto la concentración de
48
MATERIAL Y MÉTODOS
espermatozoides por mililitro como el número total de espermatozoides contenidos
en la muestra. El límite inferior que marca la OMSpara semen normales de 20x106
espermatozoides/ml y 40x106 espermatozoides/eyaculado. Por debajo de estos niveles
se consideraque existeoligozoospermia. En los casos de muestras oligozoospérmicas, se
cuentan los espermatozoides que se localizan en toda la superficie de la cuadrícula (en los 100
cuadros), y el número obtenido multiplicado por 105 representaría la concentración de
espermatozoides por mililitro. Si no se encuentra ningún espermatozoide en toda la
cámara hay que centrifugar el total del eyaculado (15 minutos a 800g) para examinar
al microscopio el sedimento completo en una preparación con cubreobjetos utilizando
contraste de fases y el objetivo 40x.
Figura 12..- Cámara Makler (izda) y rejilla vista al microscopio (izda)
▪ Morfología: Este parámetro se evalúa examinando extensiones de las muestras en un
microscopio Nikon Eclipse E200 con un objetivo 40x. Para preparar las extensiones se
deposita una gota de 10 µl de la muestra previamente homogeneizadaen el final del
portaobjetos limpio y libre de grasa para que el material se adhiera al cristal. Con la
ayuda de otro portaobjetos dispuesto con un ángulo de 45° sobre el anterior se estira
la gota a lo largo de toda la superficie en un tiempo aproximado de 1 segundo (hay que
arrastrar la gota con el portaobjetos “de arrastre” por delante tirando de ella, no hay
que empujar la gota presionando sobre ella).Si partimos de muestrascon baja
concentración de espermatozoides es aconsejable concentrar la muestra mediante
centrifugación(se tiene que registrar ya que pude afectar a la morfología). Una vez
realizadas dos extensiones por muestra se dejan secar al aire y posteriormente se
49
MATERIAL Y MÉTODOS
tiñen para poder ser estudiadas.Existen diversos tipos de tinciones aplicables a los
espermatozoides como la tinción de Papanicolau, la tinción de Shorr o la tinción DiffQuik. Esta última es la tinción, cuyo protocolo se detalla a continuación, elegida en
nuestro laboratorio.
Tinción Diff-Quik (Allegiance Healthcare Corp, McGraw Park, IL, USA):
El protocolo seguido, siguiendo las instrucciones del proveedor, ha sido el siguiente:
-Inmersión de la preparación durante 15 segundos en solución fijadora, consistente en
colorante verde rápido (Fast Green FCF) (0,002 g/l de sal disódica de la familia de los
triarilmetanos) disuelto en metanol. Sacar y dejar escurrir
la preparación
verticalmente sobre un papel absorbente.
- Inmersión de 10 segundos en la Solución de tinción I: Eosina Y (1,22 g/l) en una
solución tamponada con fostato (pH 6,6) y 0,1% (p/v) de azida sódica como
conservante. Sacar el porta.
-Introducir el porta durante 5 segundos en la Solución de tinción II: Colorante de
tiazina (1,1 g/l) en solución tamponada con fosfato (pH 6,6).
-Sacar y eliminar el exceso de colorante lavando con agua corriente del grifo 10 o 15
veces, escurrir en vertical sobre un papel absorbente y dejar secar al aire.
Las preparaciones pueden examinarse directamente sin necesidad de montaje
si no se van a almacenar. Las preparaciones también se pueden montar, utilizando
medio de montaje permanente,para su almacenamiento durante largos periodos de
tiempo.
Uno de los problemas más comunes que se encuentran a la hora de valorar la
morfología es la falta de objetividad y las variaciones en la interpretación que dan
lugar a malos resultados. Se recomienda clasificar a los espermatozoides de una
manera simple en normales/anormales y de manera opcional introducir en la
clasificaciónlos tiposde anomalías (Fig 13).
Un espermatozoide normal, según el manual de la OMS (1999) consta de
cabeza, cuello, pieza media y flagelo o cola, y está perfectamente definido en aspecto y
medidas de todas sus partes. En la tabla 3 se resumen los parámetros morfológicos de
normalidad ya detallados en la introducción. Cualquier desviación de sus
50
MATERIAL Y MÉTODOS
características determina que el espermatozoide sea considerado como anormal. Los
tipos de anomalías más importantes en la cabeza, serían defectos de tamaño, de
forma, presencia de vacuolas, acrosomas de tamaño alterado, etc. o distintas
combinaciones de todas las anomalías anteriores. Dentro de las anomalías del cuello y
de la pieza media encontramos inserciones asimétricas, alteraciones de tamaño, de
contorno, de forma o combinaciones de estos defectos. Las anomalías del flagelo son
muy variadas, pueden ser de tamaño, de forma como colas enrolladas sobre si mismas,
anguladas o rotas, de espesor irregular y cualquier combinación entre ellas. Existe otra
anomalía que consiste en la presencia de un exceso de citoplasma residual, grandes
acúmulos de citoplasma teñidos de manera desigual, sobrepasando más de la mitad de
la longitud de la cabeza, se encuentran generalmente asociadas a piezas medias
defectuosas. En la Fig. 13 se representan los principales tipos de anomalías
encontradas en los espermatozoides humanos.
Forma
Longitud
Anchura
Partes
Región acrosómica: más clara,
Cabeza
- Ovalada
- Contorno regular y liso
4 - 5 µm
3,5 - 4,5 µm
bien definida, 40-70% del
volumen de la cabeza.
Núcleo
Pieza
media
- Delgada
- Si gota citoplasmática
volumen ≤ 1/2 cabeza
1,5
< 1 µm
cabezas
-
- Uniforme
Cola
- Más estrecha que pieza
media
45 µm
-
- Desenrollada
Tabla 3.- Principales parámetros morfológicos de un espermatozoide normal.
51
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 13.- Principales tipos de anomalías morfológicas espermáticas
Una vez teñida y analizada la morfología hay que determinar el porcentaje de
espermatozoides morfológicamente normales de la muestra, sin que sea necesario
especificar el tipo de anomalía ni el porcentaje que corresponde a cada una de ellas. Se
analizan todos los espermatozoides de las áreas seleccionadas con óptica de campo
claro,con el objetivo de 40x, hasta completar un número mínimo de 200 células
evaluadas. Se cuantifica el número de espermatozoides normales, reflejándose
finalmente el porcentaje de espermatozoides normales que se expresa como número
entero. Sólo se contabilizan los espermatozoides que están intactos, aquellos en los
que se vea la morfología claramente, los que no estén pegados, ni superpuestos a
otros, ni situados en el borde. Las preparaciones que estén muy sucias hay que volver
a lavarlas para eliminar todos los restos de material que dificultan el análisis.
Para evaluar la morfología espermática, como ya hemos anticipado,
normalmente es suficiente con determinar el porcentaje de espermatozoides
morfológicamente normales. No es necesario cuantificar por separado los distintos
tipos de anomalías que aparecen en la cabeza, la pieza media y en la cola. El número
mínimo de espermatozoides morfológicamente normales que tiene que tener una
muestra es del 15%, en el caso de que la muestra no alcance este número mínimo
hablamos de teratozoospermia.
52
MATERIAL Y MÉTODOS
3. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS (SWIM-UP)
Toda muestra que vaya a ser usada en cualquiera de las TRA debe ser
procesada. Este procesamiento se suele denominar capacitación espermática con la
oposición de algunos autores que defienden que ese nombre debe corresponder
exclusivamente al conjunto de cambios que se producen en el espermatozoide, dentro
del tracto reproductor femenino, mediante los cuales adquiere la capacidad
fecundante. La técnica consiste en eliminar el plasma seminal que contiene
componentes que afectan negativamente al comportamiento de la muestra en el caso
de que esta se vaya a utilizar TRA. Mediante las distintas técnicas de preparación de las
muestras también conseguimos aislar y concentrar un alto porcentaje de los
espermatozoides con mejor movilidad y morfológicamente normales así como eliminar
suciedad, espermatozoides inmóviles y otros tipos de células.
Existen varias técnicas de preparación espermática, basadas en migración,
centrifugación o lavado, y en cada laboratorio se decide cual de ellas elegir, según el
tipo de muestra y la técnica en la que se va a utilizar, según sus propios protocolos y su
experiencia. Una de las más utilizadas es la técnica de los gradientes de densidad
discontinuos, basadaen la separación de las células según su capacidad para vencer la
resistencia que ofrecen las distintas capas de densidades diferentes. Se suelen utilizar
columnas de dos o tres densidades diferentes. Como producto final y tras un proceso
de centrifugación se obtiene una solución con espermatozoides móviles sin la
presencia del resto de componentes y otros tipos celulares que están presentes en el
semen en fresco. Otra de las técnicas más comúnmente utilizada en todos los
laboratorios de fecundación in vitro es la técnica de swim-up y este es el
procedimiento de preparación espermática que se ha elegido en el laboratoriopara
procesar todas las muestras de este estudio. Esta técnica se basa en la capacidad de
los espermatozoides con buena movilidad para nadar hacia el medio de cultivo. El
swim-up estándar es un procedimientode realización sencilla que permite una buena
recuperación de espermatozoides móviles. La secuencia de pasos a seguir queda
relatada a continuación:
53
MATERIAL Y MÉTODOS
- En un tubo de fondo redondo mezclar la muestra con medio de cultivo G-GAMETE™
suplementado con HSA(Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden)en proporción 1:1.
- Centrifugar a 300-500g durante 10 minutos.
- Descartar el sobrenadante decantándolo.
- Añadir al pellet que ha quedado en el fondo del tubo 0.5 mlde medio de cultivo
suavemente (el volumen de medio que se añade es variable según la calidad de la
muestra), dejando que se vaya deslizando lentamente por las paredes para no remover
el sedimento.
- Introducir en la incubadora a 37°C y con el porcentaje de CO2 específico para el tipo
de medios utilizados, el tubo inclinado en un ángulo de 45° durante 45-60 minutos.
- Rescatar el sobrenadante (hacia donde se habrán desplazado los espermatozoides
con mejor movilidad) y pasarlo a un tubo limpio. El volumen de sobrenadante que hay
que recuperar dependerá de la cantidad de medio que añadimos en un principio pero
siempre rescataremos menos cantidad de la añadida para así evitar mezclar las dos
fases y llevarnos parte del pellet al apurar demasiado.
- Homogeneizar el medio recuperado y calcular el número de espermatozoides móviles
que se han recuperado, denominado REM (Recuento de espermatozoides móviles).
Habitualmente, se establecen tres grupos de pacientes según su REM, el
primero incluye a los pacientes en los que hemos recuperado menos de 1 x 10 6
espermatozoides móviles/ml, el segundo contiene a aquellos en los que el REM está
comprendido entre 1 y 5 x 106 y en el último están los varones en los que se recuperan
más de 5 x 106 espermatozoides móviles.
Una vez concluido el proceso pasar 100 µl del semen preparado a otro tubo y
ajustar la concentración a 5-10x106espermatozoides/ml para posteriormente analizar
la fragmentación. El resto del preparado se utiliza para realizar la microinyección
espermática de los ovocitos recuperados de la pareja.
Todo el proceso anterior se debe realizar en la campana de flujo laminar y
condiciones de máxima esterilidad.
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MATERIAL Y MÉTODOS
4. TEST SCD (Sperm Chromatin Dispersión)
La fragmentación del ADN espermático se analiza utilizando el Kit Halosperm®
(Halotech Dna, SL; Madrid, Spain). Es un kit de utilización muy sencilla, barata y rápida
que permite estudiar la fragmentación del ADN de los espermatozoides. El
funcionamiento de este kit está basado en el test SCD (Fernández et al., 2003;
Fernández et al., 2005).
La técnica se realizó según las instrucciones del fabricante:
- Colocar la solución de lisis (LS) a temperatura ambiente (22°C).
- Diluir la muestra de semen en medio de cultivo hasta alcanzar una concentración de
5-10 millones por mililitro.
- Situar el eppendorf con agarosa (ACS) en un flotador y mantenerlo en un baño de
agua a 90°-100°C durante 5 minutos hasta que la agarosa se disuelva (también se
puede fundir en el microondas).
- Trasladar el eppendorf con la agarosa, insertado en el flotador, a un baño de agua con
una temperatura controlada de 37°C y mantenerlo ahí durante 5 minutos hasta que la
temperatura sea uniforme.
- Añadir 25 µl de la muestra de semen al eppendorf que contiene la agarosa y mezclar
bien. Extraer de la mezcla (SCS) 20 µl y colocarlo en el portaobjetos pretratado con
agarosa tapándolo con un cubreobjetos de 22 x 22 mm.
- Mantener el portaobjetos en posición horizontal durante todo el proceso.
- Poner el portaobjetos sobre una superficie de metal fría (̴4°C). Meter la superficie de
metal con el portaobjetos encima en el frigorífico y mantener durante 5 minutos para
que la agarosa solidifique.
- Preparar la solución de desnaturalización (AD): Añadir 80 µl de la solución de
desnaturalización (HCl) a 10 µl de agua destilada, mezclar bien y volcar a una cámara
de incubación.
- Eliminar el cubreobjetos deslizándolo suavemente. De ahora en adelante hay que
mantener el portaobjetos lo más horizontal posible.
- Sumergir inmediatamente el portaobjetos en la solución de desnaturalización en
posición horizontal y mantener ahí durante 7 minutos a temperatura ambiente.
55
MATERIAL Y MÉTODOS
- Después, cambiar el portaobjetos a otra cámara de incubación que contenga 10 ml
de solución de lisis, previamente atemperada, e incubar durante 25 minutos.
- Sacar el portaobjetos y sumergirlo en una nueva cámara de incubación que contenga
abundante agua destilada durante 5 minutos para eliminar los restos de solución de
lisis.
- Deshidratar la preparación en baños crecientes de etanol: Cambiar el portaobjetos a
una cámara de incubación que contenga etanol al 70% durante 2 minutos, a
continuación pasarlo a otra cámara con etanol al 90% otros 2 minutos y, por último, a
una cámara con etanol absolutodurante otros 2 minutos.
- Dejar secar al aire a temperatura ambiente y teñir.
5. TINCIÓN
Para teñir los portaobjetos tratados se utilizó la tinción Diff-Quik(Allegiance
Healthcare Corp, McGraw Park, IL, USA), que ya ha sido descrita en el apartado 3.1 de
Material y Métodos.
6. EVALUACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN
Las preparaciones se analizaron, con un microscopio Nikon Eclipse E200, con
objetivo de 100X, hasta completar el número necesario (500) de células evaluadas.Tras
someter a los espermatozoides a este tratamiento se detectanhalos alrededor de la
estructura nuclear central en las cabezas de las células que no presentan
fragmentación o en las que muestren una fragmentación escasa, formados por bucles
de ADN que se han originado al romper los enlaces disulfuro, eliminar las proteínas
celulares y relajar así la molécula de ADN. En los espermatozoides que presenten
fragmentación no se observará este halo o bien este será mínimo ya que la existencia
de numerosas roturas impide la dispersión de la molécula de ADN y la formación de
esos largos bucles.
Como consecuencia del tratamiento de fragmentación del ADN y de la tinción al
observar al microscopio encontramos espermatozoides que presentan el flagelointacto
56
MATERIAL Y MÉTODOS
y alrededor de la estructura de sus cabezas halos de distinto tamaño. Según la
existencia y el tamaño de los espermatozoides se clasifican en:
1- Espermatozoides sin fragmentación del ADN. Dentro de este grupo se diferencian:
- Espermatozoides que presentan un halo grande: aquellos cuyo halo es de tamaño
similar o superior al diámetro menor de su cabeza.
- Espermatozoides con un halo de tamaño medio: en el caso en que tengan un halo
comprendido entre el diámetro menor de su cabeza y 1/3 del mismo.
2- Espermatozoides con el ADN fragmentado.Entre ellos podemos encontrar:
- Espermatozoides que muestran un halo pequeño: en los que este es igual o inferior
a 1/3 del diámetro menor de su cabeza.
- Espermatozoides sin halo.
- Espermatozoides degradados.
Pueden aparecer también en la muestra espermatozoides que presentan una
cabeza teñida débil e irregularmente e incluso otro tipo de células que no son
espermatozoides.
Se analizaron un mínimo de 500 espermatozoides evitando clasificar los
espermatozoides localizados en el borde de la preparación (Fernández et al., 2005). Se
calcula finalmente el número de espermatozoides que presentan el ADN fragmentado,
que corresponde a la suma de las células con halo pequeño, sin halo y las degradadas,
y se expresa en forma de porcentaje.
En este estudio se recogieron en cada paciente dos datos diferentes, por un
lado el correspondiente a la fragmentación del ADN de los espermatozoides
procedentes de la muestra de semen en fresco (fragmentación basal)y por otro lado el
que corresponde a la fragmentación del ADN de la misma muestra conlos
espermatozoides recuperados una vez realizado el swim-up(fragmentación post swimup). El procesamiento de los dos tipos de muestras diferentes en cada paciente se
realizó simultáneamente justo antes de llevar a cabo el proceso de inyección
intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (también denominada microinyección
espermática).
57
MATERIAL Y MÉTODOS
7. RECUPERACIÓN Y PREPARACIÓN DE LOS OVOCITOS
Las estimulaciones ováricas se realizaron utilizando FSH-r (Gonal-F®; Merck
Serono S.A., Madrid, España o Puregon®; MSD, España), LH-r (Luveris®; Merck Serono
S.A., Madrid, España); FSH-r y LH-r combinadas (Pergoveris®; Merck Serono S.A.,
Madrid, España) o HMG up (Menopur®; Ferring, S.A.U., Madrid, España). Las pacientes
se estimularon según sus características utilizando protocolos de estimulación cortos
con antagonistas GnRH o largos con agonistas GnRH. En los protocolos largos con
agonistas se realizó una supresión hipofisaria con Nafarelina intranasal (Synarel®;
Pfizer S.A., Madrid, España) o triptorelina subcutánea (Decapectyl® diario 0,1; Ipsen,
Barcelona, España) desde la fase lútea del ciclo previo. En los protocolos de
estimulación con antagonistas de la GnRH, se utilizó cetrorelix subcutáneo (Cetrotide®;
Merck Serono S.A., Madrid, España) o ganerelix (Orgalutran®;MSD, España). Las
gonadotropinas fueron suministradas en el 2º o 3er día del ciclo, cuando la
concentración de estradiol en sangre era menor de 50 pg/ml y la ecografía vaginal no
mostraba ningún folículo de tamaño superior a 10 mm de diámetro. Cuando la FSH y la
LH se suministraron de manera combinada las concentraciones fueron variables según
se tratara de pacientes calificadas de normorespondedoras (FSH 150-225 UI y LH 0-150
UI) o de bajas respondedoras (FSH 300-450 UI y LH 75-150 UI) y los tratamientos
tuvieron una duración similar. En el caso de protocolos cortos en mujeres estimuladas
con una sola gonadotropina (FSH), las normorespondedoras comenzaron con una dosis
de 150-225 UI que seaumentó a 300-450 UI en las bajas respondedoras y se
mantuvieron durante 10 u 11 días. La introducción del antagonista se realizó con
protocolo flexible cuando un folículo superaba los 14 mm o el E 2 era mayor de 400-500
pg/ml, con una valoración individualizada de cada caso. En los ciclos largos con
agonistas se inició el tratamiento entre el día 17-22 del ciclo previo (ciclo natural o con
anticonceptivo), se realizó un control de frenaje tras la menstruación y otro después
de 10 días de tratamiento para confirmar la supresión hipofisaria. En el momento de
inicio de las gonadotropinas se redujo la dosis de análogos a la mitad.
En resumen, el protocolo de estimulación fue individualizado y se adaptó a los
datos de reserva ovárica de cada mujer con el fin deoptimizar la respuesta ovárica. Se
58
MATERIAL Y MÉTODOS
siguieron pautas de estimulaciónespecíficas para mujeres con perfil de normo, bajo e
hiperrespuestacombinando diferentes dosis y tipos de gonadotropinas tanto en ciclo
con antagonistas GnRH como en ciclo largo con análogos.
El criterio para la administración de la hCG (Ovitrelle®; Merck Serono S.A.,
Madrid, España), común a todos los ciclos, fue la presencia de 3 o más folículos con un
diámetro mayor o igual a 18 mm. La recuperación ovocitaria se realizó a las 35 o 36
horas de la administración de la hCG. El día de la punción folicular (día 0) el
procedimiento de extracción se realizó mediante una aspiración transvaginal guiada
por una ecografía vaginal en un quirófano reservado únicamente para este uso. Los
líquidos foliculares se procesaron en el laboratorio contiguo.Los ovocitos se extrajeron
del líquido folicular utilizando para su localización una lupa binocular(Nikon SMZ 800)
situada dentro de una cabina de flujolaminar bajo estrictas condiciones de esterilidad y
se procesaron para su posterior utilización en la técnica de ICSI. Estos ovocitos
obtenidos se depositaron y se limpiaron en primer lugar en una placa de lavado para
eliminar los restos de líquido folicular.La placa de lavado esta compuesta por gotas
deG-GAMETE™ suplementado con HSA(Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden)
cubierto con OVOIL™ (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden) Una vez limpios se
pusieron en una placa de cultivoseparando y situandocada uno en una gotadiferente.
En nuestro caso la placa se preparó con medio G-IVF™ PLUS suplementado con HSA
(Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden) equilibrado, cubierto con OVOIL™ (Vitrolife
Sweden AB Göteborg, Sweden) que protege las gotas en las que están los ovocitos
yretrasa la perdida de temperatura y el cambio del pH. La placa de cultivo con los
ovocitos se mantuvo en la incubadora a 37°C, 6% de CO2y 95% de
humedad,condiciones que pueden variar según el tipo de mediosutilizados, hasta el
momento de prepararlos para la microinyección, entre 2 y 3 horas después de su
obtención. Se fabrica una placa de decumulación compuesta por microgotas de una
solución que contiene hialuronidasa HYASE™ -10X (Vitrolife Sweden AB Göteborg,
Sweden), enzima que se utiliza para degradar las células del cúmulo cuyo efecto,
combinado con la acción mecánica que resulta de pasar el cúmulo por un capilar de
59
MATERIAL Y MÉTODOS
diámetro pequeño, consigue que el ovocito se deshaga de todas las células de su
alrededor y quede liberado.
8. INYECCIÓN INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZOIDES (ICSI)
Una vez que todos los ovocitos de la paciente están decumulados se realiza
elproceso deICSI. La placa destinada a la microinyección está compuesta por
microgotas de un medio específico que contiene PVP (polivinilpirrolidona) para la
inmovilización de los espermatozoides antes de la microinyección ICSI™ (Vitrolife
Sweden AB Göteborg, Sweden), se trata de un medio muy viscoso que ralentiza el
movimiento de los espermatozoides y así se facilita su manipulación, y por gotas de
medio G-GAMETE™ suplementado con HSA(Vitrolife Sweden AB Göteborg,
Sweden)cubierto con OVOIL™ (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden), dentro de las
que se realiza la microinyección propiamente dicha. Se prepara el microscopio(Nikon
Eclipse Ti-U), comprobando el buen funcionamiento tanto de la óptica como de los
sistemas de microinyección, atemperándolo y situando las micropipetas, en nuestro
caso ICSI y Holding micropipets (Origio a/sMåløv, Denmark). A continuación se
comienzacon la inmovilización de los espermatozoides. Se coloca una pequeña
cantidad del semen capacitado en una gota de PVPy en el microscopio de
microinyección se extraende esa gota uno a uno, aspirándolos por la cola con la pipeta
de microinyección, eligiendo aquellos espermatozoides que
parezcan de mejor
calidad, los que tengan mejor morfología y mejor movilidad. Los espermatozoides
elegidos se pasan individualmente a una gota limpia de PVP. Cada espermatozoide
seleccionado se inmoviliza ejerciendo presión con la micropipeta situada encima del
flagelo contra la placa de microinyección y dejándolos preparados en esa nueva gota.
Al inmovilizar los espermatozoides se consigue la desestabilización y la
permeabilización de la membrana plasmática y se facilita así la descondensación
nuclear. Se repiteesta operación hasta que tengamos un número suficiente de
espermatozoides (siempre se seleccionan espermatozoides en exceso por si alguno se
daña o se pierde durante el proceso) para asegurar microinyectar con un
espermatozoide cada uno de los ovocitos obtenidos de cada paciente. Una vez
60
MATERIAL Y MÉTODOS
inmovilizados los espermatozoides se distribuyen los ovocitos en las gotas del medio
en el que se va ha realizar la microinyección, un ovocito por gota. Se dispone el ovocito
de manera que el corpúsculo polar (CP) quede situado en las posiciones 12 o 6
siguiendo el esquema de las agujas del reloj para evitar dañar la placa meiótica al
introducir la pipeta. La pipeta de sujeción (holding) se desplaza hasta que quede
pegada a la zona pelúcida (ZP) del ovocito y se fija ejerciendo una ligera aspiración.
Una vez comprobado que el ovocito está bien sujeto se aproxima el espermatozoide
que está dentro de la pipeta de microinyección lo más cerca posible de la punta y se
presiona sobre la zona pelúcida del ovocito hasta penetrar en el interior del citoplasma
atravesando tanto la ZP como la membrana. Antes de introducir el espermatozoide
hay que asegurarse de que realmente se está en el interior del ovocito aspirando si es
necesario parte del citoplasma y comprobando que realmente las membranas se han
roto. A continuación se deposita suavemente el espermatozoide intentando no
arrastrarlo hacia fuera al sacar la micropipeta y dejar la menor cantidad posible de PVP
dentro del citoplasma ya que es tóxico para el ovocito (Fig. 14).
Figura 14.- Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)
Se microinyectan uno por uno, cada ovocito con un espermatozoide, anotando
cualquier característica destacable del ovocito o cualquier incidencia ocurrida durante
61
MATERIAL Y MÉTODOS
el proceso. Una vez que se han microinyectados todos los ovocitos de una paciente se
trasladana una placa de cultivo nueva, formada por microgotas de un nuevo medio de
cultivo, en nuestro caso G-1™ PLUS suplementado con HSA (Vitrolife Sweden AB
Göteborg, Sweden) y equilibradocubierto con OVOIL™ (Vitrolife Sweden AB Göteborg,
Sweden),y se separa cada ovocito en una gota para poder seguir su evolución
individualmente. La placa debe mantenerseen la incubadora a 37°C, 6% de CO2y 95%
de humedad hasta la valoración de la fecundación.
9. EVALUACIÓN DE LOS EMBRIONES
La evaluación de la fecundación se realiza al día siguiente (día+1) en un
intervalo que va desde las 16 a las 19 horas post-microinyección. La visualización en
este estadio, estadio de zigoto, permite desechar aquellos ovocitos que no hayan
fecundado o aquellos que presentan una fecundación anómala. Los zigotos que
presenten signos claros de una fecundación correcta, es decir en los que se visualicen
claramente 2 pronúcleos (PN) y 2corpúsculos polares (CP) se pasan a una nueva placa
de cultivo. La evaluación y clasificación de los embriones en los distintos estadios
evolutivos se ha realizado siguiendo los criterios que estableceLa Asociación para el
Estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR 2007). La valoración de distintos
parámetros que se analizan en el caso de los zigotos no influye en la catalogación final,
únicamente se tendrá en cuenta para establecer diferencias a la hora de elegir entre
embriones que luego tengan la misma calidad el día de la transferencia que es cuando
realmente hay que dar una clasificación definitiva. ASEBIR establece como criterios
favorables en día +1 la presencia de halo citoplasmático y la división temprana (la
aparición de un preembrión con dos blastómeras iguales que no presenten
multinucleación y sin fragmentación entre 25 y 27 horas post-microinyección) y como
aspectos desfavorables la presencia de un sólo precursor nucleolar, que los pronúcleos
estén separados y que tengan tamaño desigual. Una vez analizados los zigotos y
preembriones y registradas las características morfológicas de cada uno de ellos se
mantienen en la incubadora hasta la siguiente valoración.
62
MATERIAL Y MÉTODOS
La evaluación en día +2 debe realizarse en un intervalo de observación que
debe estar entre las 44 y las 47 horas post-inseminación.
Los embriones en día +2 se clasifican en cuatrocategorías (Fig. 15):
- embriones de grado 1 o calidad A: son los de mejor calidad y por tanto los que tienen
mayores probabilidades de implantación. Para poder estar incluidos en esta categoría
los embriones deben tener 4 células iguales o de tamaño semejante sin vacuolas ni
multinucleación, si presentan fragmentación esta no puede superar del 10% del
volumen total del embrión y la zona pelúcida tiene que ser normal.
- embriones de grado 2 o calidad B: son aquellos que siguen siendo de buena calidad
pero tienen una capacidad de implantación inferior a los de grado 1. Pertenecen a esta
categoría todos los embriones que presenten de 2 a 5 células (mejor calidad los de 5
células que los de 2) iguales o semejantes, sin multinucleación ni vacuolas, cuya zona
pelúcida sea normal y que muestren una fragmentación comprendida entre el 11% y el
25%. También se incluyen en esta categoría los embriones, que aún teniendo 4 células,
no se puedan incluir en la categoría 1 por presentar una fragmentación superior al
10%.
- embriones de grado 3 o calidad C: son embriones de calidad intermedia y con
potencial de implantación por debajo de los de las categorías anteriores. Los
embriones de esta categoría tienen que tener 2, 4 o 5 células (si presentan un
porcentaje de fragmentación de entre el 26 y el 35%) o bien 3 o 6 (mejor 6 células que
3); si aparecen fragmentos, su proporción no debe superar el 35%, ni ser de tipo IV. Las
células no deben presentar multinucleación. Siempre que en el embrión aparezcan
células distintas, vacuolas escasas o que la zona pelúcida sea anormal lo
encuadraremos en esta categoría.
- embriones de grado 4 o calidad D: son los de peor calidad y por lo tanto poseen una
capacidad implantatoria baja. Corresponden a esta categoría los embriones que tienen
1 o más de 6 células, o bien 3 células semejantes y todos aquellos que
independientemente del número de células que presenten tengan vacuolas
abundantes, una fragmentación superior al 35% o del tipo IV, multinucleación o anillo
acitoplasmático.
63
MATERIAL Y MÉTODOS
Los embriones de día +3 también se clasifican en cuatro categorías(Fig. 15):
- embriones de grado 1 o calidad A: pertenecen a esta categoría los embriones que
presentan 7 u 8 células (siempre que provengan de un embrión de 4 células en día +2).
Tienen que tener como máximo un 10% de fragmentación celular, sus células tienen
que ser iguales o semejantes y sin multinucleación ni vacuolización y la zona pelúcida
debe ser normal.
- embriones de grado 2 o calidad B: en este grupo están los embriones que tienen 7
células o más (si han evolucionado a partir de un embrión de 2 o 5 células en día +2) y
aquellos que poseen 9 células o más (si tenían 4 células en día +2). Estos embriones
tienen entre un 11 y un 25% de fragmentación, las células como en el grupo anterior
también tienen que ser iguales o semejantes, no deben tener ninguna célula
multinucleada, ni vacuolas y su zona pelúcida tiene que ser normal.
- embriones de grado 3 o calidad C: se incluyen en esta clase aquellos que están
formados por 7 células o más (derivados de embriones de 2, 4 o 5 células en día +2), 6
células (formados a partir de embriones de 2 células o de 4 en día +2), 8 o más células
(resultado de embriones con 6 células en día +2) y 6 células o más (originados a partir
de embriones de 3 células en día +2). En este grupo la fragmentación oscila entre el 26
y el 35%. Incluiremos en esta categoría a los que presenten desigualdad en el tamaño
de sus células, vacuolas escasas y su zona pelúcida sea anormal.
-embriones de grado 4 o calidad D: formado por embriones que en día + 2 ya tenían 6
células (independientemente de las células que tengan en día +3), embriones con 5
células o menos (independientemente del número de células que tuvieran en día + 2) y
embriones que sólo hayan aumentado 1 célula en el paso de día +2 a +3. Pertenecen a
esta clase todos los embriones que tengan una fragmentación superior al 35% o esta
sea de tipo IV, presenten multinucleación, vacuolas abundantes o anillo
acitoplasmático.
64
MATERIAL Y MÉTODOS
Calidad asignada
si transf. D+2
Nº cels D+3
Calidad asignada
si transf. D+3
B
3 cel
4 cel
5 cel
6 cel
7 cel
8 cel
D
D
D
C
B
B
% frag D+2 o D+3
A..........< 10%
B........... 11-25%
C........... 26-35%
D..........> 35%
D...........tipo IV
4 cel
5 cel
6 cel
7 cel
8 cel
9 cel
Cualquier valor
D
D
C
C
C
C
D
Vacuolas
A.........no
B.........no
C.........escasas
D........abundantes
A
5 cel
6 cel
7 cel
8 cel
9 cel
10 cel
D
C
A
A
B
B
5 cel
B
6 cel
7 cel
8 cel
9 cel
10 cel
D
B
B
B
B
6 cel
C
7 cel
8 cel
9 cel
10 cel
11 cel
D
C
C
C
C
>6 cel
D
Cualquier valor
D
Nº cels D+2
2 cel
3 cel
4 cel
2 pequeñas 1 grande
C
3 iguales
D
Modificar asignación a la baja si:
Multinucleación
A.........no
B.........no
C.........no
D........Cualquier multinucleación
Semejanza (2 ; 4 ; 8 ; 16)
A.......iguales o semejante
C..... diferentes
ZP
A.....normal
B.....eclosion
C.....anormal
Anillo acitoplasmático D+3
D
Asignar la letra mas baja
Figura 15.- Esquema de gradación de la calidad embrionaria (ASEBIR, 2007)
Es imprescindible hacer evaluaciones seriadas de la evolución de los
preembriones para poder clasificarlos correctamente y esto implica mantenerlos
durante cierto tiempo fuera de la incubadora. Hay que minimizar al máximo el tiempo
de observación e intentar retornarlos lo antes posible a las condiciones óptimas de
cultivo para disminuir lo máximo posible los efectos nocivos que puedan afectar a su
evolución.
10. TRANSFERENCIA EMBRIONARIA
Una vez analizados y clasificados todos los embriones de la paciente se decide
el número de embriones a transferir y el resto se crioconservan.
La elección del número de embriones a transferir es un asunto complejo,
decidido por el ginecólogo y consensuado con la pareja. Siempre se transfieren los
embriones de mejor calidad pero el número va a depender de muchos factores como
la edad de la paciente, si ha tenido transferencias anteriores, el número y la calidad de
los embriones transferidos en otras ocasiones, la calidad y el número de los embriones
que tenemos para transferir, la presencia de alguna patología o enfermedad, etc. Una
vez decidido el número de embriones a transferir hay que eligir los que tienen mejor
65
MATERIAL Y MÉTODOS
calidad para separarlos del resto y pasarlos a una placa de transferencia, en nuestro
caso, con medio G-2™ PLUS suplementado con HSA (Vitrolife Sweden AB Göteborg,
Sweden) cubierto con OVOIL™ (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden), y se mantiene
en la incubadora hasta el momento de cargarlos en el catéter de transferencia.
La transferencia embrionaria se realiza, como en el caso de la punción folicular,
en el quirófano contiguo al laboratorio. Se sacan los embriones de la incubadora, se
lavan en medio G-2™ PLUS suplementado con HSA (Vitrolife Sweden AB Göteborg,
Sweden) limpio y se cargan en un catéter de transferencia previamente lavado con el
mismo medio en un volumen de medio muy pequeño. Los catéteres que utilizamos son
de dos tipos, GYNETICS Emtrac A o GYNETICS Emtract Set (GYNETICS®, Gynetics
Medical Products N.V., Lommel, Belgium). La transferencia se realiza, una vez limpio el
cervix y eliminado el moco, introduciendo el catéter con los embriones a través del
cuello y depositándolos cuidadosamente en el útero guiándose por una ecografía
abdominal. Una vez realizada la transferencia se comprueba en el laboratorio que no
ha quedado ningún embrión retenido en el catéter, en caso contrario se lavan los
embriones en medio limpio y se carga un nuevo catéter para repetir el proceso, hasta
estar seguros de que todos los embriones están dentro de la cavidad uterina.
La fase lútea se mantiene suministrando a las pacientes óvulos de progesterona
(Utrogestan®; Seid S.A., Barcelona, España) (Progeffik®; Effik, Madrid, España) por vía
vaginal a una dosis de 400 mg cada 12 h comenzando su administración el día de la
punción folicular y manteniéndola hasta la menstruación, si no se produce gestación, o
durante las 12 primeras semanas de embarazo. Los embarazos se diagnosticaron por
un aumento de la concentración de ß-hCG en orina a los 14 días post-transferencia,
que posteriormente se confirmará en sangre y por la presencia de saco gestacional
intrauterino con latido positivo verificado por ecografía vaginal.
11. CRIOPRESERVACIÓN EMBRIONARIA
Los embriones viables que no se han transferido se conservan para poder
utilizarlos en futuros intentos, en caso de no lograr un embarazo con la transferencia
de embriones “en fresco”. Para conservar los embriones es necesario criopreservarlos
66
MATERIAL Y MÉTODOS
y almacenarlos a temperaturas muy bajas utilizando equipos especiales. Los embriones
que se van a criopreservar se tienen que describir exhaustivamente en la hoja de
congelación, detallando de la manera más precisa posible todas sus características
morfológicas (número de células, porcentaje de fragmentación, presencia de vacuolas,
multinucleación, aspecto de ZP, etc.). La criopreservación se realizó siguiendo en
protocolo lento, utilizando el kit comercial (FREEZE-KIT 1™, Vitrolife Sweden AB
Göteborg, Sweden) que consta de tres soluciones. Preparamos una placa de cuatro
pocillos Nunclon™ Delta (NUNC®, Roskilde, DenmarK), en el pocillo número uno
ponemos 0,7 ml de la solución de congelación 1, en el dos 0,7 ml de la solución
número 2 y en el tres 0,7 ml de la 3, los pasos se realizaron siguiendo las indicaciones
del fabricante:
- La solución 1 (Cryo-PBS) está compuesta por: CryoPBS + 25mg/ml HSA + penicilina G.
Cuando introducimos los embriones que vamos a criopreservar en esta solución hay
que observar y registrar todos los datos relativos a su morfología. Los embriones
deben permanecer en esta solución entre 2 y 5 minutos.
- La solución 2 o Embryo freezing solution 1 (EFS-1) está compuesta por: CryoPBS + 1.5
M 1,2 Propanediol. Las células de los embriones al entrar en contacto con esta solución
se retraen al expulsar agua para intentar equilibrar las altas concentraciones de solutos
extracelulares del medio y posteriormente se hinchan cuando el crioprotector penetra
en el interior de las células. En esta solución tienen que estar un tiempo no inferior a
10 minutos y no superior a 20 minutos.
- La solución 3 o Embryo freezing solution 2 (EFS-2) está compuesta por: CryoPBS + 1.5
M 1,2-Propanediol + 0.1 MSucrose. Es la solución final y una vez que se pasan los
embriones a esta solución se cargan directamente sin tener que permanecer nada más
que el tiempo necesario para introducirlos dentro de la pajuela de congelación que es
el receptáculo en el que se mantendrán mientras permanezcan criopreservados.
Para cargar la pajuela es necesario aspirar primero un poco de medio de
congelación (EFS-2) a continuación introducir aire para hacer una burbuja,
seguidamente entran los embriones sumergidos en una pequeña cantidad de medio,
para aislarlos se vuelve a hacer otra burbuja de aire, continuamos con una mínima
67
MATERIAL Y MÉTODOS
cantidad de medio (donde se realizará el seeding durante el proceso de congelación) y
se termina con aire hasta llenarla por completo. Los embriones quedan en un volumen
pequeño de medio y flanqueados por dos burbujas de aire, una a cada lado, que los
aíslan y evitan la posibilidad de que puedan desplazarse por la pajuela.
Una vez cargada cada pajuela se sella por los dos extremos utilizando una
selladora eléctrica que combina presión y calor. De esta manera el extremo por el que
están los embriones queda herméticamente cerrado para evitar la pérdida de material
y las posibles contaminaciones en el banco de embriones. El extremo opuesto que
también tiene que quedar selladolleva un identificador de color en el que aparecen los
datos de la paciente (Nombre, número de historia, número de embriones que contiene
la pajuela, etc.).
Una vez preparadas todas las pajuelas (cargadas con los embriones y selladas),
para criopreservarlas se utilizan congeladores programables que controlan
rigurosamente el descenso de la temperatura mediante un programa informático. Los
embriones se sitúan en una cámara dentro del congelador a la que van entrando
pulsos de vapores de nitrógeno líquido (N2) desde un depósito a demanda del
programa de congelación y así, va descendiendo la temperatura de los embriones
según las indicaciones del programa hasta su completa crioconservación. Una vez que
ha finalizado el programa de congelación los embriones se sumergen en N2, a -196°C,
dentro de los bancos de embriones, donde se conservan hasta su posterior utilización.
Los sistemas de almacenamiento de embriones constan de varios compartimentos
para facilitar la localización de los embriones. Un banco de embriones contiene un
número variable de recipientes que están numerados llamados canister y dentro de
ellos hay otros receptáculos más pequeños, los gobelets, de colores diferentes donde
se almacenan las pajuelas, cada una con su identificador de color y los datos de la
paciente. De esta manera cada pajuela tendrá un código formado por colores y
números que sólo tendrá ella (Ubicación de cada embrión: nº del banco, nº/color del
canister, color del gobelet y color de la pajuela).
Si no se ha tenido éxito con la transferencia de embriones en fresco y la pareja
posee embriones criopreservados estos se utilizan para una nueva transferencia. Se
68
MATERIAL Y MÉTODOS
prepara el endometrio de la paciente con un tratamiento hormonal con estrógenos
hasta confirmar ecográficamente un endometrio de más de 7 mm de aspecto
proliferativo, o con el simple seguimiento ecográfico del ciclo natural . Una vez
confirmada la proliferación endometrial adecuada se continúa con gestágemos durante 2
o 3 días antes de la fecha prevista para la transferencia y así asegurar un endometrio
secretor.
Para poder realizar la transferencia es necesario retornar a los embriones a las
condiciones fisiológicas, es decir a las que tenían antes de su crioconservación. La
descriopreservación se realizó siguiendo también el protocolo lento, utilizando el kit
comercial complementario al de criopreservación (THAW-KIT 1™, Vitrolife Sweden AB
Göteborg, Sweden). Preparamos una placa de cuatro pocillos Nunclon™ Delta (NUNC®,
Roskilde, DenmarK), en cada ponemos 0,7 ml de cada una de las cuatro soluciones y se
siguieron los pasos y los tiempos recomendados por el fabricante según el siguiente
esquema:
-Una vez localizada, extraer la pajuela del nitrógeno líquido, manteniéndola a
temperatura ambiente durante 30 segundos e introducir en un baño a 30°C durante
otros 45 segundos.
-La solución 1 o Embryo thawing solution 1 (ETS-1) está compuesta por:CryoPBS + 1.0
M 1,2-Propanediol+ 0.2 MSucrose. Sumergir y mantener los embriones entre 1 y 5
minutos en esta solución.
-La solución 2 o Embryo thawing solution 2 (ETS-2) está compuesta por:CryoPBS + 0.5
M 1,2-Propanediol+ 0.2 MSucrose. Introducir los embriones durante un tiempo de
entre 2 y 5 minutos.
-La solución 3 o Embryo thawing solution 3 (ETS3) está compuesta por:CryoPBS+ 0.2
MSucrose. Los embriones deben permanecer en este medio entre 5 y 10 minutos.
-La solución 4 (Cryo-PBS) está compuesta por:CryoPBS + 25mg/ml HSA + penicilina G. El
tiempo que permanezcan dentro de esta solución tiene que ser entre 5 y 10 minutos.
-Los
embriones
que
tengan
un
porcentaje
de
células
intactas
pot-
congelación/descongelación ≥ al 50% se podrán transferir si la transferencia se hace el
mismo día de la descongelación. El resto de embriones, los que tengan más porcentaje
69
MATERIAL Y MÉTODOS
dañado, se descartarán. Si la transferencia está programada para el día siguiente se
dejaran en una placa de cultivo y se evaluarán al día siguiente para transferir
únicamente los embriones que hayan evolucionado y se hayan dividido, el resto se
desechará.
La técnica de criotransferencia es idéntica, tanto a nivel del laboratorio como a
nivel del ginecólogo en el quirófano, a la utilizada para transferir embriones en fresco.
De igual modo, también son idénticos el tratamiento y las recomendaciones
posteriores.
12. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para la realización de los análisis estadísticos se ha utilizado el programa
informático SPSS (IBM SPSS Statistics for Windows, Version 22.0. Armonk, NY). Se
usaron tests paramétricos o no paramétricos según las variables analizadas siguieran o
no una distribución normal,
para lo cual se aplicó previamente la prueba de
Kolmogorov-Smirnov.
La asociación entre variables se llevó a cabo mediante la prueba de Chi
cuadrado (χ2) (con la corrección de Yates cuando fue necesario) o el test exacto de
Fisher. Para la comparación de medias se utilizó la t de Student, la U de Mann-Witney,
test de comparación de proporciones (Prueba Z) o Análisis de Varianza (ANOVA). Las
curvas ROC se determinaron para calcular la utilidad diagnóstica de la fragmentación
en el ADN espermático. Para la correlación entre variables se utilizó el test de
correlación lineal (r) de Pearson. Para el análisis de los factores que afectaban al éxito
de embarazo se realizó un test de regresión logística multivariante. En todos los casos,
los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando el valor P fue
menor de 0,05 (P<0,05).
70
RESULTADOS
RESULTADOS
1. ANÁLISIS DESCRIPTIVO
La población estudiada está formada por 41 parejas que fueron sometidas a un
ciclo de Fecundación in Vitro utilizando la técnica de inyección intracitoplasmática de
espermatozoides (ICSI).
Analizando las indicaciones clínicas por las que estas parejas se sometieron a un
tratamiento de ICSI encontramos que el 34,15% corresponde a causas femeninas, el
17,07% a causas masculinas y el 48,78% a causas mixtas.
1.1. ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE LOS VARONES
El 65,85% de las parejas se sometieron al ciclo de ICSI por indicación
únicamente masculina o por indicación mixta. En la Tabla 4 se muestra un resumen de
las características de los varones, indicándose los valores medios de los parámetros
más importantes del seminograma.En todos los casos en los que en la indicación
estuvo presente el factor masculino se debió a alteraciones en uno o más de un
parámetro del seminograma básico realizado antes de decidir el tipo de tratamiento
que se debía ofertar a esa pareja en particular.
La edad media de los varones estudiados fue de 38,51 ± 0,94 [24,5-51,4] años.
Al analizar los antecedentes urológicos de estos pacientes se encontró un
porcentaje de pacientes con varicocele del 9,76%.
En cuanto a los hábitos tóxicos se analizó el consumo de tabaco y se obtuvo un
porcentaje de fumadores del 46,34%.
Las muestras utilizadas en el estudio fueron analizadas el mismo día en el que
se iban a utilizar. Se realizó un seminograma a los 41 pacientes analizados, el 19,51%de
ellospresenta todos los valores de los parámetros del seminograma dentro de la
normalidad, catalogándose como muestras normozoospérmicas.
El 80,49%restante presentó uno o varios de estos parámetros alterados. Dentro
de este grupo el 18,92% corresponde a alteraciones únicas. De estas muestras que
presentan un único parámetro alterado, más de la mitad, el 57,14%, presenta
alteraciones la motilidad espermática (astenozoospermia), el 28,57% corresponde a
73
RESULTADOS
una alteración en la morfología (teratozoospermia) y el 14,29 restante no alcanza la
concentración de espermatozoides necesaria para llegar a la normalidad
(oligozoospermia). El resto de las muestras alteradas tenían valores alterados en dos o
más parámetros del seminograma.
El volumen medio de eyaculado fue de 2,67± 0,14 [0,5-4,5] ml. La
concentración media de espermatozoides en la muestra fue de 51,1± 6,3 [4,6 143]x106 espermatozoides/ml. El porcentaje medio de motilidad progresiva (a+b)fue
del 31,83 ± 1,9 [10 - 50] %. La media ponderada del porcentaje de espermatozoides
con morfología normalfue de 13,82 ± 1,60 [2 - 45] % de espermatozoides.
Todas las muestras analizadas fueron procesadas mediante la técnica de
preparación espermática denominada swim-up. A partir de esta se recuperan los
espermatozoides de mejor calidad que serán los que se empleen para la TRA, en este
estudio fue en todos los casos ICSI. La media de espermatozoides recuperados tras
swim-up fue de 6,1± 1,2 [0,5-38] x106espermatozoides/ml.
El porcentaje medio de fragmentación basal de estas muestras, es decir, el
calculado antes de su preparación, pre swim-up, fuede 31,83 ± 2,97 [5,50-95,20] % de
espermatozoides
fragmentados.
Seanalizaron
también
los
porcentajes
de
fragmentación de ADN espermático en cada una de estas muestras después de ser
procesadas, es decir, post swim-up. La media de fragmentación de las muestras una
vez preparadas fue de 10,03 ± 1,83 [0,10-8,90] % de espermatozoides fragmentados.
74
RESULTADOS
Variables
Media ± ST
Rango
38,51 ± 0,94
25-51
51,1± 6,3
4,6 - 143
2,67 ± 0,14
0,5 - 4,5
6,1 ± 1,2
0,5 - 38
Motilidad progresiva (%)
31,83 ± 1,91
10 - 50
Formas normales (%)
13,82 ± 1,60
2 - 45
Fragmentación basal (%)
31,83 ± 2,97
5,5 - 95,2
Fragmentación tras swim-up (%)
10,03 ± 1,83
0,1 - 8,9
Edad
Concentración de espermatozoides (x 106/ml)
Volumen medio eyaculado (ml)
REM(x 106/ml)
Variables
Porcentaje
Antecedentes urológicos (%)
9,76
Consumo de tabaco (%)
46,34
Pacientes normozoospérmicos (%)
19,51
Tabla 4.- Análisis descriptivo de las características biológicas y seminales de los varones de la serie.
1.2. ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE LAS MUJERES Y DEL CICLO ICSI
Las mujeres estudiadas tenían una edad media de 34,38 ± 0,71 [20,9 – 39,9]
años.La mayoría de las pacientes, el 53,66%, se sometían por primera vez a un ciclo de
Fecundación In Vitro. Para el 24,39% este era su segundo ciclo, era el tercero para el
17,07% y para el 4,88% restante era la cuarta vez que lo intentaban.
La media de folículos mayores de 16 mm, que son los que teóricamente son
susceptibles de punción, de nuestras pacientes es de 9,12 ± 0,82 [0-28] folículos.
La media de valores máximos de estradiol sérico, E2 o 17β-estradiol, alcanzados
al final de la estimulación ovárica en nuestras pacientes fue de 2809,54 ± 151,33 [9424638] pg/ml.
Se puncionan un total de 472 folículos; la media de folículos puncionados es de
11,51 ± 0,559 [7-21] folículos/paciente.
75
RESULTADOS
De los 472 folículos puncionados se obtienen 355 ovocitos en total, lo que
equivale al 75,21% de los folículos puncionados. Se obtuvo una media de 8,66 ± 0,41
[4-16] ovocitos/paciente.
Los ovocitos obtenidos estaban en distintos estadios madurativos. Para poder
realizarICSI es necesario que el ovocito que se vaya a utilizar esté en un estadio
madurativo concreto, en metafase de la segunda división meiótica, metafase II (MII)
teniendo que descartar todo el resto de gametos femeninos que se encuentren en
cualquier otra fase de división. De los 355 ovocitos obtenidos, 276 ovocitos, es decir el
77,75%, tenían el grado madurativo correcto. La media por paciente es de 6,73 ± 0,36
[3-12] ovocitos MII.
Se dividió la población femenina en dos grupos, mujeres de buen o de mal
pronósticopara el análisis de los resultados del ciclo ICSI. El grupo de mujeres de buen
pronóstico (mujeres con reserva ovárica normal o riesgo de hiperrespuesta) está
formado por aquellas pacientes que tenían una edad menor de 38 años, un recuento
de folículos antrales de más de 7, una FSH basal < 10 mUI/ml. o que no habían tenido
resultados desfavorables en ciclos previos. El grupo de mujeres de mal pronóstico lo
constituyen aquellas que no cumplían dichos criterios.No se siguieron de forma
estricta los criterios de Bolonia puesto que el estudio se hizo antes de la aparición de
dicho consenso y porque se incluyen también pacientes potencialmente bajas
respondedoras que logran una respuesta folicular adecuada con un protocolo de
estimulación específico para bajas respondedoras. Este segundo grupo fue estimulado
con dosis altas de gonadotropinas (FSH y acción LH) en protocolo con antagonistas
GnRH. De nuestra serie, 23 mujeres (56%) fueron incluidas en esta categoría de peor
pronóstico y, las restantes 18, en la de bueno.
1.3. ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE RESULTADOS DEL CICLO ICSI
Para valorar el resultado de los ciclos, son utilizaron los siguientes indicadores:
tasa de fecundación, calidad embrionaria, tasa de implantación y tasa de gestación.
Se define tasa de fecundación como elcociente entre el número de zigotos
obtenidos y el número de ovocitos MII inseminados o microinyectados expresado en
76
RESULTADOS
tanto por ciento.Se define tasa de implantación como elcociente entre el número de
sacos gestacionales y el número de embriones transferidos. La variable calidad
embrionaria se refiere a las características morfológicas de los embriones que
determinan su potencial implantatorio, como se explicó en el apartado Material y
métodos.La tasa de embarazo o de gestación utilizada en este estudio, corresponde a
la tasa de gestación por transferencia que se define como elcociente entre el número
de embarazos clínicos y el número de transferencias realizadas.
En este estudio se utilizó en el 100% de los casos elICSI como TRA. Por lo tanto
se microinyectaron 276 ovocitos MII, que habían extruido el corpúsculo polar y por lo
tanto habían alcanzando el estadio correcto de maduración.
Los embriones correctamente fecundados son aquellos que presentan 2
pronúcleos en el interior del citoplasma, uno de origen materno y otro paterno y dos
corpúsculos polares localizados en el espacio perivitelino. Cuando la TRA que se utiliza
esel ICSI, la presencia de 2PN y 2 CP tiene que observarse en un rango estricto de
tiempo que va desde las 16 a las 19 horas postICSI. La tasa media de fecundación fue
del 57,24%, es decir, 158 de esos 276 ovocitos, con una tasa media de fecundación por
mujer de 57,44 ± 4,38 de MII microinyectados presentaban los signos de fecundación
correcta 2PN y 2 CP.
Encontramos fallo total de fecundación en el 7,32% de las pacientes analizadas.
El 96,2% de los ovocitos fecundados evoluciona correctamente, el otro 3,8%
que no lo hacey, por lo tanto, se desecha. Se analiza por lo tanto la evolución de 152
embriones que se desarrollan y evolucionan correctamente hasta el momento en que
se decide su destino, transferencia o criopreservación.
Los embriones obtenidos se clasificaron siguiendo los criterios de ASEBIR en
cuatro categorías (G1, G2, G3 y G4) de menor a mayor calidad y potencial
implantatorio. Los embriones analizados en este estudio se distribuyen en las
categorías anteriores de la siguiente manera: 9 embriones de grado 1 (5,92%), 57
embriones de grado 2 (37,5%), 59 embriones de grado 3 (38,82%) y 27 embriones de
grado 4 (17,76%). Agrupando los embriones en 2 categorías principales, “embriones
77
RESULTADOS
buenos” (G1+G2) y “embriones no buenos” (G3+G4); tendemos 66 embriones (43,42%)
y 86 embriones (56,58%) respectivamente.
El destino de estos embriones puede variar entre la transferencia a 2 o 3 días
después de la punción o bien la criopreservación de los mismos.
A todas las pacientes del estudio que tenían embriones(92,68%) se les ha
realizado una transferencia, en día+2 o +3 tomando como día 0 el día de la punción
folicular; el otro 7,32% corresponde a las pacientes en las que se ha producido un fallo
de fecundación y por lo tanto no hemos obtenido ningún embrión. Se han transferido
un total de 87 embriones (57,24%) en 38 transferencias. Se transfirieron 9 embriones
de grado 1 (10,34%), 43 embriones de grado 2 (49,43%), 22 embriones de grado 3
(25,29%) y 13 embriones de grado 4 (14,94%). Agrupándolos en dos categorías
principales tenemos 52 embriones G1 + G2 (59,77%) y 35 embriones G3 + G4 (40,23%).
De esas transferencias el 10,53% corresponde a transferencias de 1 único embrión, al
ser el único embrión que teníamos no se trata de transferencias electivas. En la
mayoría de los casos (50%) se transfirieron 2 embriones, en este grupo el 89,47%
corresponde a una transferencia electiva porque contábamos en con más de 2
embriones y pudimos elegir los 2 mejores para transferir, en el 10,53% restante la
transferencia se realizó de los únicos 2 embriones de los que disponíamos. El 39,47%
de las transferencias fueron de 3 embriones, de ellas el 66,66% fueron no electivas y
en el resto (33´33%) se pudo elegir entre más de 3 embriones los mejores para
transferir.
Del total de transferencias, el 57,89% eran transferencias electivas, pudimos
elegir los mejores embriones porque contábamos con más embriones de los que se
decidió transferir para elegir. Los 65 embriones que no se transfirieron (42,76%) se
criopreservaron para poder ser utilizados en criotransferencias en el caso de no
obtener embarazo.
Se consiguió embarazo clínico en 12 de las 38 transferencias embrionarias
realizadas (31,58%), únicamente 1 paciente tuvo un embarazo bioquímico (2,63%). De
los embarazos obtenidos el 75% son gestaciones únicas, el 25% corresponde a
gestaciones gemelares y el porcentaje de embarazos triples es del 0%. La tasa de
78
RESULTADOS
abortos fue del 8,33%, sólo uno embarazo único finalizó en aborto. Se transfieren en
total 87 embriones, 4 de ellos se transfirieron en 4 transferencias no electivas de un
embrión único. Se realizaron 19 transferencias de 2 embriones transfiriendo un total
de 38 embriones. El resto, 45 embriones se transfirieron en 15 transferencias de 3
embriones cada una (triples). La tasa de implantación total es del 17,4%, la tasa de
implantación media por paciente fue de 19,30 ± 5,17. De las mujeres a las que se
realiza una transferencia de un único embrión se embaraza el 25%, el 42,10% de las
pacientes a las que se transfieren 2 embriones y el 20% de las mujeres con
transferencia de tres embriones. El 11,11% de los embarazos únicos provienen de una
transferencia única, el 66,66% de una transferencia doble y el 22,22% de una triple. De
los embarazos gemelares, el 66,66% es consecuencia de una transferencia doble y el
33,33% de una triple.
No se transfirieron el 42,76% de los embriones, debido a un excedente de los
mismos,se contaba con más embriones de los que se decidió transferir; en ningún caso
se anuló la transferencia teniendo embriones disponibles. Todos los embriones que no
se transfirieron en el ciclo se criopreservaron. El 53,66% de las pacientes de este
estudio criopreservaron embriones.El 18,60% de ellos se dañó durante el proceso de
congelación/descongelación y se desechó, como consecuencia del total de embriones
descriopreservados se recuperaron 35 embriones viables que se pudieron transferir;
únicamente en 2 mujeres no se pudo realizar la criotransferencia porque ningún
embrión era viable al final del proceso de descriopreservación. La tasa de
supervivencia embrionaria post criopreservación fue del 81,40%. Se realizaron 16
criotransferencias con resultado de 2 gestaciones clínicas (12,5%), una única y otra
gemelar y una gestación bioquímica (6,25%). La tasa de implantación de estos
embriones fue del 8,57%. El 36,36% de las pacientes que criopreservaron siguen
manteniendo 1 o varios embriones que han quedado almacenados en nuestro banco,
forman un total de 22 embriones que pertenecen a 8 pacientes; de esas mujeres el
75% consiguió un embarazo en la transferencia de embriones que llegó a término. El
resumen de todos estos resultados se muestra en la tabla 5.
79
RESULTADOS
Variables
Media ± ST
Rango
Edad
34,46 ± 0,71
20,9-39,9
Ovocitos recuperados/paciente
8,66 ± 0,41
4-16
Ovocitos MII/paciente
6,73 ± 0,36
3 - 12
Embriones obtenidos/paciente
3,71 ± 0,32
0-8
Tasa media de fecundación
57,44 ± 4,38
0 - 100
Tasa media de implantación
19,30 ± 5,17
0 - 100
Variables
Valor
Embriones G1 + G2/embriones totales (%)
43,42
Tasa de gestación/transferencia (%)
31,58
Tabla 5.- Análisis descriptivo del ciclo de ICSI
2. ANÁLISIS DE LOS PARÁMETROS DEL SEMINOGRAMA Y CARACTERÍSTICAS
BIOLÓGICAS DE LOS VARONES
2.1. NORMOZOOSPERMIA
Los pacientes se dividieron en dos grupos según su edad, un primer grupo lo
formaron los pacientes más jóvenes, con edades inferiores a 40 años y el otro grupo
los varones con 40 años o más. Al comparar los pacientes que son
normozoospérmicos, sin alteraciones de los parámetros seminales, y los que no lo son
no se observan diferencias significativas entre los dos grupos de edad. Sin embargo, al
analizar la posible repercusión del hábito de fumar sobre la calidad de la muestra
espermática se encuentran diferencias significativas entre los varones fumadores y no
fumadores. Los pacientes que fuman tienen alguno de los parámetros del
seminograma alterado en un porcentaje significativamente mayor que aquellos que no
lo hacen (P= 0,03) (Tabla 6).
80
RESULTADOS
≥ 40 años
< 40 años
Normo
N
N
Sí
1
7
No
13
20
Total
14
27
P
0,15
No fumador
Fumador
N
N
7
1
15
18
22
19
P
0,03
Tabla 6.- Varones normozoospérmicos en relación con la edad y el consumo de tabaco
2.2. ALTERACIONES EN LOS PARÁMETROS DEL SEMINOGRAMA (oligozoospermia,
astenozoospermia y teratozoospermia)
En este apartado se han realizado las comparaciones de las principales
alteraciones de
los parámetros del seminograma (Volumen y concentración
espermática, movilidad progresiva y morfología espermática) estableciendo los grupos
de pacientes de la serie analizada con oligozoospermia, astenozoospermia y
teratozoospermia, respectivamente, en relación con la edad y consumo de tabaco.
Al estudiar la relación entre la edad de los pacientes masculinos
conoligozoospermia y sin ella no existieron diferencias significativas para ninguno de
los dos grupos de edad, mayores y menores de 40 años.Del mismo modo, al realizar
esta comparación con los datos referentes alconsumo de tabaco,entre los pacientes
oligozoospérmicosy los que tienen muestras con una concentración normal de
espermatozoides nose encuentran diferenciasestadísticamente significativas(Tabla 7).
≥ 40 años
< 40 años
Oligo
N
N
Sí
3
10
No
11
17
Total
14
27
P
0,30
No fumador
Fumador
N
N
8
5
14
14
22
19
P
0,49
Tabla 7.- Varones oligozoospérmicos en relación con la edad y el consumo de tabaco
81
RESULTADOS
Si se hace referencia a aquellas alteraciones que afectan a la motilidad
espermática (astenozoospermia) y se comparan los dos grupos de edad, no se
encuentran diferencias significativas en este grupo de pacientes en relación con dicho
parámetro.
Si se realiza una comparación similar acerca de la relación del hábito de fumar y
la existencia o no de alteraciones en la motilidad espermática, se observan diferencias
significativas entre el grupo de fumadores y el de no fumadores (Tabla 8).
≥ 40 años
< 40 años
Asteno
N
N
Sí
12
21
No
2
6
14
27
Total
P
0,54
No fumador
Fumador
N
N
15
18
7
1
22
19
P
0,03
Tabla 8.- Varones astenozoospérmicos en relación con la edad y el consumo de tabaco
Finalmente, al comparar las alteraciones de la morfología espermática que
establece la categoría de varones teratozoospérmicos en relación con la población de
hombres menores de 40 años y la de los varones de 40 años o más, no encontramos
diferencias significativas entre los pacientes de los dos grupos de edad.Del mismo
modo, los hombres fumadores y no fumadores se distribuyen de manera similar en los
dos grupos, el grupo de teratozoospérmicos y el grupo de los que no lo son, no
existiendo diferencias significativas entre ellos(Tabla 9).
82
RESULTADOS
≥ 40 años
< 40 años
Terato
N
N
Sí
9
18
No
5
9
14
27
Total
P
0,87
No fumador
Fumador
N
N
14
13
8
6
22
19
P
0,74
Tabla 9.- Varones teratozoospérmicos en relación con la edad y el consumo de tabaco
2.3. RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES MÓVILES (REM)
Después de realizar el swim-upse calculó el REM dividiendo la población de
hombres en tres grupos distintos según el REM obtenido, el primero incluye a los
pacientes en los que se recupera menos de 1x106 espermatozoides móviles, el
segundo contiene a aquellos en los que el REM está comprendido entre 1 y 5x106
espermatozoides móviles recuperados y en el último están los varones en los que se
recuperan más de 5x106 espermatozoides móviles. Al analizar los datos obtenidos (Fig.
16)en relación con los dos grupos de edad establecidos no se encuentrandiferencias
significativas en el número de espermatozoides móviles recuperados. En relación al
valor medio de REM las diferencias que se encuentran entre los dos grupos no son
estadísticamente significativas. En relación con el consumo o no de tabaco las
diferencias de REM igualmente no fueron significativas (Tabla 10).
≥ 40 años
< 40 años
REM (x 106)
N
N
<1
1
4
1-5
7
16
>5
6
7
Media ± SE
7,7 ± 0,59
5,3 ± 0,44
Rango
0,75 - 38
0,5 - 30
Total
14
27
No fumador Fumador
P
0,49
0,35
N
N
4
1
13
10
5
8
5,5 ± 0,49
6,8 ± 0,52
0,5 - 38
0,5 - 30
22
19
P
0,26
0,6
Tabla 10.- REM y sus valores medios en relación con la edad y el consumo de tabaco.
83
RESULTADOS
Figura 16.- Gráfica de dispersión de REM respeco a edad y consumo de tabaco.
2.4. CORRELACIONES ENTRE LOS PARÁMETROS SEMINALES.
Se realizaron las comparaciones cruzadas para correlacionar entre sí, los
distintos parámetros seminales: volumen del eyaculado y concentración espermática
(que definen a los varones oligozoospérmicos), morfología normal, medida en el
porcentaje de formas espermáticas normales en cada individuo (que marca los límites
de la teratozoospermia), la motilidad progresiva (% clases a+b)y el REM, cuyos
resultados se resumen en la Tabla 11.
Concentración
Volumen eyaculado
Concentración
r=-0,229
P=0,150
Motilidad
progresiva
(% a+b)
r=0,201
P=0,208
r=0,131
P=0,415
Motilidad
progresiva (% a+b)
Morfología
(% f. normales)
Morfología
(% f.
normales)
r=0,303
P=0,054
r=0,015
P=0,928
r=0,305
P=0,048
Recuento
espermatozoides
móviles (REM)
r=0,127
P=0,428
r=0,302
P=0,049
r=0,420
P=0,006
r=0,336
P=0,032
Tabla 11.- Análisis de correlaciones lineales entre distintos parámetros seminales.
84
RESULTADOS
Se encontró una correlación lineal positiva estadísticamente significativa
entrela motilidad progresiva y la morfología espermática (r= 0,305, P= 0,048) y entre
los valores de REM y la concentración espermática (r= 0,302, P= 0,049) y la morfología
espermática (r= 0,336, P= 0,032)y la motilidad progresiva (r=0,420, P=0,006). Las
gráficas representativas se recogen en la Fig. 17.
Figura 17.- Gráficas de dispersión de distintos parámetros seminales entre sí.
85
RESULTADOS
3. FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO Y PARÁMETROS MASCULINOS
3.1. ANÁLISIS DE LA FRAGMENTACIÓN BASAL
Todas las muestras recibidas en el laboratorio el día de la punción folicular se
sometieron a un primer test de fragmentación de ADN antes de ser procesadas,
calculándose el porcentaje de fragmentación basal del ADN espermático que tiene
cada una, lo que puede representarse gráficamente (Fig. 18).Para analizar este
parámetro se dividen a los pacientes en dos grupos según el porcentaje de
espermatozoides fragmentados que presenten en el eyaculado. El punto de corte
utilizado para considerar que una muestra está patológicamente fragmentada es el
30% (Evenson, 1999).A partir de ello se han establecido en este estudio dos grupos de
varones, uno formado por aquellos pacientes que presentaron una fragmentación
basal de espermatozoides menor del 30% (< 30%) ( = 17,8 ± 1,32)y otro que contenía
a los pacientes con un porcentaje de fragmentación igual o mayor al 30% (≥ 30%)
( =46,57 ± 3,58) (Tabla 12).Las diferencias entre ambas medias fueron altamente
significativas(P= 0,003).
Fragmentación basal (%)
Media ± SE
Rango
17,8 ± 1,32
5,5 - 28,8
≥ 30% 46,57 ± 3,58
31,0 - 95,2
<30%
P
0,003
Tabla 12.- Fragmentación basal en dos grupos
86
RESULTADOS
Figura 18.- Representación gráfica de la fragmentación basal, medias (general y en tramos) y umbral
Al analizar si la edad del varón influía en la fragmentación basal del ADN
espermático se encontrarondiferencias estadísticamente muy significativas entre los
dos grupos de edad en los que se dividió a la población masculina de la serie analizada
(Tabla 13, Fig. 19).
Sin embargo, los porcentajes medios de fragmentación calculados en los dos
grupos de edad (28,28 y 38,69), aunque son claramente diferentes, dichas diferencias
no alcanzaron la significación estadística, y al analizar de forma global el porcentaje de
fragmentación basal de cada muestra en comparación con la edad de cada individuo,
no se observó correlación entre ambos parámetros (r = 0,175, P= 0,273).
Se observó también que la mayoría de hombres jóvenes tenían
fragmentaciones basales menores de 30 (18 de 27, 66,67%), mientras que la mayoría
87
RESULTADOS
de hombres mayores tenían fragmentaciones basales patológicas (11 de 14, 78,58%),
con grandes diferencias entre las medias de cada uno de los subgrupos como se
aprecia en al Fig. 20.
Al analizar la relación entre lafragmentación basal y el consumo de tabaco no se
encontraron diferencias significativas, ni tampoco al comparar los porcentajes medios
de fragmentación entre los dos grupos (fumadores y no fumadores) (Tabla 13 y Fig.
19).
≥ 40 años
< 40 años
Frag. basal
N
N
< 30%
3
18
≥ 30%
11
9
Media ± SE 38,69 ± 0,60 28,28 ± 0,45
Rango
7,6 - 71,7
5,5 - 95,2
Total
14
27
P
0,01
0,09
No fumador
Fumador
N
N
9
12
13
7
35,27 ± 0,49 27,86 ± 0,52
5,5 - 95,2
7,3 - 68,7
14
27
Tabla 13.- Relación entre fragmentación basal y la edad y el hábito de fumar.
Figura 19.- Gráfica de dispersión de la fragmentación basal con la edad y el hábito de fumar.
88
P
0,15
0,21
RESULTADOS
Figura 20.- Diagrama de barras de la fragmentación basal por intervalos de edad.
3.1.1.. FRAGMENTACIÓN BASAL Y CALIDAD SEMINAL
-VARONES NORMOZOOSPÉRMICOS
Se analizaron las muestras de pacientes que eran normozoospérmicos y los que
no lo eran con respecto al punto de corte de fragmentación establecido,
evidenciándosediferencias significativas entre ellos. En lo referente al porcentaje
medio de fragmentación basal los resultados obtenidos mostraron medias semejantes
en ambos casos (Tabla 14).
Fragmentación basal
< 30%
≥ 30%
Normo
N
N
Sí
7
1
No
14
19
21
20
Total
P
0,02
Fragmentación basal (%)
Media ± SE
Rango
31,80 ± 1,01 5,5 - 95,2
31,84 ± 0,39 7,3 - 71,7
P
0,99
Tabla 14.- Fragmentación basal y porcentaje medio defragmentación en varones normozoospérmicos
89
RESULTADOS
-VARONES CON ALTERACIONES EN LOS PARÁMETROS DEL SEMINOGRAMA
Tras comparar la fragmentación basal del ADN espermático entre el grupo de
pacientes que tenían una concentración de espermatozoides normal y el grupo de
pacientes oligozooospérmico, no se observaron diferencias significativas entre ellos.Si
cotejamos las medias de fragmentación basal que encontramos en el grupo de
pacientes oligozoospérmicos con la que obtenemos en el grupo de pacientes con una
concentración de espermatozoides normal en el eyaculado, del mismo modo no se
encontraron diferencias significativas entre ellos (Tabla 15).
Fragmentación basal
< 30%
≥ 30%
Oligo
N
N
Sí
6
7
No
15
13
Total
21
20
P
0,65
Fragmentación basal (%)
Media ± SE
Rango
33,01 ± 0,62
14 - 68,7
31,29 ± 0,44 5,5 - 95,2
P
0,57
Tabla 15.- Fragmentación basal y porcentaje medio de fragmentación basal en varones
oligozoospérmicos
De igual manera se comparó la fragmentación basal que tenía el grupo de
pacientes astenozoospérmicos con aquellos pacientes que presentaron movilidad
normal,y la distribución de los pacientes fue muy similar en los dos grupos en relación
con ese parámetro de fragmentación, sin encontrarse diferencias significativas,
circunstancia que se mantuvo en la comparación de los porcentajes medios de
fragmentación basal(Tabla 16).
90
RESULTADOS
Fragmentación basal
< 30%
≥ 30%
Asteno
N
N
Sí
17
16
No
4
4
21
20
Total
P
0,93
Fragmentación basal (%)
Media ± SE
Rango
31,03 ± 0,41 7,3 - 71,7
35,14 ± 0,75 5,5 - 95,2
P
0,71
Tabla 16.- Fragmentación basal y porcentaje medio de fragmentación basal en varones
astenozoospérmicos
El último parámetro referente a la calidad seminal que se analizó en relación
con la fragmentación basal fue la morfología espermática en los varones del estudio.
La mitad de la población teratozoospérmica está incluida en cadagrupo de
fragmentación basal y ocurre algo prácticamente similar paralos varones no
teratozoospérmicos. Del mismo modo, se observaron medias similares de
fragmentación basal entre el grupo de varones teratozoospérmicos y el grupo de
varones que no lo son, sin encontrarse diferencias significativas en ningún caso (Tabla
17).
Fragmentación basal
< 30%
≥ 30%
Terato
N
N
Sí
14
13
No
7
7
21
20
Total
P
0,91
Fragmentación basal (%)
Media ± SE
Rango
31,33 ± 0,45 7,3 - 71,7
32,81 ± 0,59 5,5 - 95,2
P
0,84
Tabla 17.- Fragmentación basal y porcentaje medio de fragmentación basal en varones
teratozoospérmicos
3.1.2.. FRAGMENTACIÓN BASAL Y REM
Para comparar la fragmentación basal con el REM se mantuvieron, de este
último parámetro, los tres grupos anteriormente descritos (< 1 x 10 6, 1 - 5 x 106 y 5 x
91
RESULTADOS
106) (Fig), no encontrándose relación entre ambas variables. Aunque se observaron
diferencias en la fragmentación basal media calculada en los tres grupos de REM,
apreciándose como porcentaje medio de fragmentación va disminuyendo a medida
que aumenta el número de espermatozoides recuperados, las diferencias no llegaron a
ser significativas (Tabla 18).
Fragmentación basal
< 30%
≥ 30%
REM(x 106)
N
N
<1
2
4
1-5
10
10
>5
9
6
21
20
Total
Fragmentación basal (%)
P
Media ± SE
Rango
P
35,28 ± 0,91 18,1 - 55,1
0,53
33,16 ± 0,48
7,1 - 95,2 0,72
28,15 ± 0,62
5,5 - 53,2
Tabla 18.- Fragmentación basal y porcentaje medio de fragmentación basal y REM
3.1.3. FRAGMENTACIÓN BASAL Y CORRELACIÓN CON LOS PARÁMETROS SEMINALES
Se realizó un análisis de la correlación lineal en la población de varones objeto
de este estudio, con la intención de medir el grado de relación entre el porcentaje
basal de ADN fragmentado de cada muestra con los parámetros seminales de esas
mismas muestras: volumen, concentración espermática, morfología y REM, sin
encontrar relaciones estadísticamente significativas con ellos (Tabla 19 y Fig. 21).
%Fragmentación basal ADN espermático
Volumen del eyaculado
Coeficiente de
P
Correlación (r)
-0,051
0,751
Concentración espermática
-0,014
0,928
Motilidad progresiva
-0,037
0,825
Morfología espermática (%Formas normales)
-0,036
0,823
Recuento espermatozoides móviles (REM)
-0,092
0,566
Tabla 19.- Análisis de correlación lineal entre el porcentaje de fragmentación basal y los parámetros
seminales.
92
RESULTADOS
Figura 21.- Gráfica de dispersión de la Fragmentación basal conparámetros seminales.
3.2. ANÁLISIS DE LA FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP
Una vez preparada la muestra espermática mediantela técnica deswim-up, se
hizo un segundo análisis de la fragmentación para evaluar el efecto que tenía la técnica
sobre el daño en el ADN de los espermático y se observó una disminución general en
los porcentajes de fragmentación de este ADN con respecto al primer análisis (Fig.22).
93
RESULTADOS
Figura 22.- Representación gráfica de la fragmentación post swim-up y su media
A pesar de que aparecen diferencias en los porcentajes medios de
fragmentación del ADN espermático post swim-up en los varones menores de 40 años
respecto a los que tienen 40 años o más (Fig. 23), siendo la fragmentación más alta en
estos últimos, las diferencias encontradas no alcanzaron la significación estadística
(Tabla 20), y al analizar globalmente el porcentaje de fragmentación post swim-up de
cada muestra en comparación con la edad de cada individuo, no se observó
correlación lineal estadísticamente significativa entre ambos parámetros (r = -0,045, P=
0,781).
94
RESULTADOS
Fragmentación post swim-up (%)
Edad varón
Media ± SE
Rango
< 40
9,44 ± 0,45
0,1 - 48,9
≥ 40 11,16 ± 0,59
0,1 - 45,1
P
0,36
Tabla 20.- Fragmentación post swim-up media y edad
Como en el caso de la fragmentación basal, los porcentajes medios de
fragmentación no diferían significativamente entre varones fumadores y los no
fumadores (Tabla 21 y Fig. 23).
Fragmentación post swim-up (%)
Media ± SE
Rango
No fumador
10,46 ± 0,49
0,1 - 48,9
Fumador
9,53 ± 0,52
0,4 - 45,1
P
0,80
Tabla 21.- Fragmentación post swim-up media y consumo de tabaco
Figura 23.- Gráficas de dispersión de la fragmentación post swim-up con edad y consumo de tabaco
95
RESULTADOS
3.2.1.. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y CALIDAD SEMINAL
-VARONES NORMOZOOSPÉRMICOS
El porcentaje medio de fragmentación de las muestras una vez procesadas fue
diferente entre el grupo de varones normozoospérmico y el grupo de los que no lo
son, el porcentaje más alto lo encontramos en los pacientes que están diagnosticados
de normozoospermia, a pesar de lo cual las diferencias no son significativas (Tabla 22).
Fragmentación post swim-up (%)
Normo
Media ± SE
Sí 13,58 ± 1,01
No
9,65 ± 0,39
Rango
0,1 - 48,9
0,1 - 45,1
P
0,53
Tabla 22.- Fragmentación post swim-up media y Normozoospermia
-VARONES CON ALTERACIONES EN LOS PARÁMETROS DEL SEMINOGRAMA
Los porcentajes medios de fragmentación en varones con las diferentes
alteraciones en los parámetros seminales y sus comparaciones con las muestras
normales se indican en la Tabla23. Las muestras oligozoospérmicas presentaron un
porcentaje mediode fragmentación post swim-up menor que la del grupo de pacientes
que tenían una concentración de espermatozoides normal (Tabla 23).Lo mismo ocurre
en el caso de analizar la motilidad, la fragmentación post swim-up media entre los
hombres que no son astenozoospérmicos es mayor que la encontrada en los
astenozoospérmicos, a pesar de lo cual las diferencias encontradas no son
significativas. Por último, en relación con las muestras con alteraciones en la
morfología espermática (varones teratozoospérmicos) tampoco se encuentran
diferencias significativas, a pesar de ser más altos los porcentajesde fragmentación
post swim-up en los varones con morfología normal (Tabla 23).
96
RESULTADOS
Fragmentación post swim-up (%)
Oligo
Asteno
Terato
Media ± SE
Rango
Sí
6,41 ± 0,62
0,1 - 30,8
No
11,71 ± 0,44
0,1 - 48,9
Sí
9,32 ±0,41
0,1 - 45,1
No
12,96 ± 0,75
0,1 - 48,9
Sí
9,57 ± 0,45
0,1 - 45,1
No
10,91 ± 0,59
0,1 - 48,9
P
0,18
0,43
0,73
Tabla 23.- Porcentajes medios de Fragmentación post swim-upy alteraciones del seminograma.
3.2.2.. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y REM
Como en los casos anteriores, para comparar el porcentaje medio de
fragmentación después del swim-upsegún el REM hemos dividido la población
masculina en tres grupos según el REM. Aún siendo mayor el porcentaje de
fragmentación en las muestras que tienen los valores de REM más bajos, esto no se
mantiene en los dos grupos de REM superiores a 1x 10 6, no obstante las diferencias no
son significativas (Tabla 24).
Fragmentación post swim-up (%)
REM (x 106)
Media ± SE
Rango
<1
13,54± 0,91
1,3 - 30,8
1-5
8,26± 0,48
0,1 -48,9
> 5 11,81 ± 0,62
0,1 - 45,1
P
0,54
Tabla 24.- Fragmentación post swim-up media y REM
97
RESULTADOS
3.2.3. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y FRAGMENTACIÓN BASAL
La media de la fragmentación post swim-up fue mucho menor que la media de
la fragmentación basal, siendo la diferencia entre ambas altamente significativa (Tabla
25). El análisis de correlación entre ambos tipos de fragmentaciones del ADN
espermático estableció una correlación positiva altamente significativa entre ambos
parámetros (r = 0,463, P= 0,002). Esta relación se muestra en la Fig. 24.
Media ± SE
Fragmentación basal (%)
Rango
31,83 ± 2,97 5,50 - 95,20
Fragmentación post swim-up (%) 10,03 ± 1,83 0,10 - 48,90
P
0,00
Tabla 25.- Fragmentación post swim-up media y fragmentación basal media
Figura 24.- Fragmentación post swim-up media y fragmentación basal media
La fragmentación post swim-up en porcentaje medio fue inferior en las
muestras que tenían una fragmentación basal inferior al 30% que en aquellas que la
tenían igual o superior (Fig. 25). El nivel de fragmentación descendió más en el grupo
de muestras más fragmentadas y las diferencias que se encontraron fueron
estadísticamente significativas (Tabla 26).
98
RESULTADOS
Fragmentación post swim-up (%)
Fragmentación basal
Media ± SE
Rango
< 30%
6,41 ± 0,50
0,1 - 27,2
≥ 30% 13,83 ± 0,51
0,2 - 48,9
P
0,04
Tabla 26.- Fragmentación post swim-up media y fragmentación basal
Figura 25.Representación gráfica de Fragmentación post swim-up y fragmentación basal con
fragmentación basal ordenada. La línea roja marca el límite de los valores de fragmentación basal
patológica (30%)
3.2.4. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y CORRELACIÓN CON LA FRAGMENTACIÓN
BASAL Y LOS PARÁMETROS SEMINALES
Se realizó un análisis de correlación lineal en los pacientes, para profundizar en
el grado de relación entre el porcentaje de fragmentación del ADN espermático tras
someter a las muestras al proceso de preparación, mediante la técnica de swim-up,
con los parámetros seminales de esas mismas muestras: volumen, concentración
espermática, motilidad progresiva, morfología y REM, sin encontrar relaciones
estadísticamente significativas con ellos (Tabla 27 y Fig. 26). Sin embargo, al comparar
los porcentajes de fragmentación post swim-up con los correspondientes porcentajes
encontrados en el semen antes del procesamiento (%fragmentación basal) se encontró
una fuerte correlación positiva, estadísticamente significativa (Tabla 27).
99
RESULTADOS
%Fragmentación post swim-up del ADN espermático
Volumen del eyaculado
Coeficiente de
P
Correlación (r)
-0,159
0,322
Concentración espermática
0,020
0,901
Motilidad progresiva (a+b)
-0,037
0,816
Morfología espermática (%Formas normales)
0,198
0,216
Recuento espermatozoides móviles (REM)
-0,092
0,566
% Fragmentación basal del ADN espermático
0,463
0,002
Tabla 27.- Análisis de correlación lineal entre la fragmentación post swim-up y la fragmentación basal y
los parámetros seminales
Figura 26.-Gráficas de dispersión de fragmentación post swim-up respecto a fragmentación basal y
parámetros seminales
3.3. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN TRAS EL PROCESAMIENTO MEDIANTE SWIMUP
Al comparar los resultados de los dos test de fragmentación, el realizado antes
del procesamiento de la muestra y el posterior después de someter la muestra al
procesamiento por la técnica de swim-up puede observarse cómo afecta esta técnica
al porcentaje de fragmentación. En casi todas las
100
muestras el porcentaje de
RESULTADOS
fragmentación espermática disminuye drásticamente excepto en dos pacientes, el 6 y
el 20 (Fig. 27).
Figura 27.- Representación gráfica de la variación de la fragmentación espermática con la fragmentación
basal ordenada y sin ordenar
101
RESULTADOS
Se analizó la variable variación de la fragmentación calculada como la
diferencia, medida en puntos porcentuales (p.p.), entre el porcentaje de
fragmentación post swim-up y el porcentaje de fragmentación basal. En la Fig.27 se
incluye también la variación porcentual (%): diferencia entre fragmentaciones dividido
entre fragmentación basal.
Si bien se perciben diferencias de casi nueve puntos enla variación de los
porcentajes medios de fragmentación entre los dos grupos de edad de los varones, las
diferenciasencontradas no alcanzaron la significación estadística (Tabla 28 y Fig. 28).
Variación de fragmentación
Edad varón
Media ± SE
Rango
< 40 -18,84 ± 3,0
-58,3 - +6,4
≥ 40 -27,53 ± 4,5
-65,6 - -2,3
P
0,10
Tabla 28.- Variación en los porcentajes de fragmentación y edad
A continuación se analizó de forma global la variación media del porcentaje de
fragmentación separando a los varones en fumadores y no fumadores (Fig. 28). A
pesar de ser más efectivo el swim-up para descartar espermatozoides con el ADN
fragmentado en los no fumadores las diferencias no son estadísticamente significativas
con respecto al otro grupo (Tabla 29).
Variación de fragmentación
Media ± SE
Rango
No fumador -24,81 ± 0,49
-65,6 - +6,4
Fumador -18,33 ± 0,52
-58,3 - +0,8
P
0,21
Tabla 29.- Variación media de fragmentación y consumo de tabaco
102
RESULTADOS
Figura 28.--Gráfica de dispersión de variación de la fragmentacióncon consumo de tabaco y edad
3.3.1.. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y CALIDAD SEMINAL
- VARONES NORMOZOOSPÉRMICOS
Una vez analizado el porcentaje medio en el que ha variado la fragmentación
en relación a si la muestra es o no es normozoospérmica localizamos un descenso
similar aunque ligeramente mayor en el porcentaje de fragmentación en las muestras
que provienen de pacientes no normozoospérmicos. El swim-up parece ligeramente
menos efectivo en la eliminación de espermatozoides con el ADN fragmentado en el
caso de que las muestras sean normales (Tabla 30).
Variación de fragmentación
Normo
Media ± SE
Rango
Sí -18,22 ± 9,6
-46,3 - -5,4
No -22,19 ± 2,7
-65,6 - +6,4
P
0,65
Tabla 30.-Variación media de fragmentación y Normozoospermia
103
RESULTADOS
-VARONES CON ALTERACIONES EN LOS PARÁMETROS DEL SEMINOGRAMA
Las variaciones en los porcentajes medios de fragmentación espermática en
varones con las diferentes alteraciones en los parámetros seminales y sus
comparaciones con las muestras normales se indican en la tabla 31. El descenso medio
en el porcentaje de fragmentación es mayor en las muestras oligozoospérmicas que en
las que no lo son, aunque las diferencias encontradas no son significativas (Tabla 31).
Mediante el swim-up se eliminan más espermatozoides con el ADN fragmentado en
muestras con la concentración inicial de espermatozoides alterada que en las que son
normales para este parámetro.
En relación con las alteraciones en la motilidad espermática, tantolas muestras
que tienen alterada la motilidad (astenozoospermia) como las que no la tienen se
comportan de manera similar; en ambos grupos el porcentaje medio en el que ha
disminuido la fragmentación es semejante, la diferencia no llega al medio punto
(Tabla), de manera que las muestras astenozoospérmicas y las que no lo son se
comportan igual frente a la técnica de swim-up.
Finalmente, al comparar la variación media de la fragmentación entre
individuos
cuya
muestra
tiene
alterada
la
morfología
espermática
(teratozoospérmicos) frente a los que no la presentan alterada, se encuentra con
valores muy similares en ambos casos (Tabla), con lo que el procedimiento del swimup es igualmente efectivo en el caso de utilizarlo para procesar muestras
teratozoospérmicas que para preparar las que no lo son a la hora de eliminar
fragmentación.
104
RESULTADOS
Variación de fragmentación
Oligo
Asteno
Terato
Media ± SE
Rango
P
Sí
-26,60 ± 4,2
-58,3 - -10,8
No
-19,58 ± 3,2
-65,6 - +6,4
Sí
-21,71 ± 2,7
-65,6 - +6,4
No
-22,17 ± 7,0
-51,4 - -0,2
Sí
-21,75 ± 3,0
-65,6 - +0,8
No
-21,91 ± 4,9
-51,4 - +6,4
0,20
0,94
0,98
Tabla 31.- Variación media de fragmentación y alteraciones de los parámetros seminales
3.3.2.. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y REM
Se halló la variación media del DFI en cada uno de los grupos en los que se ha
dividido la población según el REM post swim-up. Mientras la fragmentación
disminuye de manera parecida en los dos grupos de REM inferiores a 5x 10 6 en el caso
de muestras cuyos REM sobrepasan los 5x 106 el porcentaje medio en el que
disminuye la fragmentación es menor (Tabla 32).
Variación de fragmentación
REM (x 106)
Media ± SE
Rango
< 1 -21,74 ± 0,91
-34,6 - -11,7
1 - 5 -24,90 ± 0,48
-65,6 - +6,4
> 5 -16,35 ± 0,62
-45,3 - -0,2
P
0,33
Tabla 32.Tabla .- Variación media de fragmentación y REM
105
RESULTADOS
3.3.3. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y FRAGMENTACIÓN BASAL
Tomando como referencia si la fragmentación basal estaba o no por debajo del
30%, se encontraron diferencias muy significativas en cuanto a la variación media de la
fragmentación en los dos grupos (Tabla 33). En las muestras que tienen
fragmentaciones basales altas, después delswim-upse eliminan por término medio un
mayor número de espermatozoides fragmentados que en el grupo de pacientes con
fragmentaciones basales por debajo del 30% y las ambos parámetros presentan una
correlación lineal positiva estadísticamente significativa (r = 0,791 P= 0, 000) como se
aprecia claramente en la gráfica de dispersión entre ambas variables (Fig).
Variación de fragmentación
Fragmentación basal
Media ± SE
Rango
< 30% -11,39 ± 0,50
-4,3 - +6,4
≥ 30% -32,75 ±0,51
-65,6 - -2,3
P
0,00
Tabla 33.- Variación media de fragmentación y fragmentación basal
3.3.4.VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACION Y CORRELACIONES CON LOS PORCENTAJES
DE FRAGMENTACIÓN BASAL, POST SWIM-UP Y CON LOS PARÁMETROS SEMINALES
Se realizó un análisis de correlación lineal para profundizar en las relaciones entre
la variación de la fragmentación, como consecuencia del swim-up,y los parámetros
seminales (volumen, concentración espermática, motilidad progresiva, morfología),
REMy la fragmentación (basal y post swim-up) de las muestras (Fig. 29).Se encontró
una correlación negativa muy significativa entre las variación de la fragmentación del
ADN espermático de los varones, y los correspondientes porcentajes de fragmentación
basal, a mayor fragmentación basal corresponde menor variación, es decir, una
variación más negativa, una diminución mayor (Tabla 34). Esta relación lineal se
aprecia claramente en la gráfica de dispersión entre ambas variables (Fig. 29)
106
RESULTADOS
Variación de la fragmentación post swim-up
Volumen del eyaculado
Coeficiente de
P
Correlación (r)
0,054
0,737
Concentración espermática
-0,031
0,847
Motilidad progresiva (a+b)
0,015
0,926
Morfología espermática (%Formas normales)
0,050
0,758
Recuento espermatozoides móviles (REM)
0,168
0,294
% Fragmentación basal del ADN espermático
-0,791
0,000
% Fragmentación post swim-up del ADN espermático
0,049
0,760
Tabla 34.- Análisis de correlación lineal entre la variación de la fragmentación yla fragmentación basal,
post swim-up y parámetros seminales.
Figura 29.- Gráficas de dispersión de variación de la fragmentación respecto aparámetros seminales,
fragmentación basal, fragmentación post swim-up
107
RESULTADOS
4. RESULTADO DE LOS TRATAMIENTOS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA (TRA)
MEDIANTE ICSI
El resultado o éxito clínico de los tratamientos de reproducción asistida (TRA)
mediante la técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) se
midenmediante unos parámetros indicadores que son la tasa de fecundación, la
calidad embrionaria, la tasa de implantación y la gestación.
La tasa de fecundación media de las 41 pacientes analizadas fue 57,44 ± 4,38 y
la tasa de implantación media de las 38 pacientes a las que se realizó transferencia
embrionaria (las otras 3 pacientes correspondían a fallos de fecundación), 19,30 ±
5,17. El 63% de las 41 pacientes obtuvieron embriones de buena calidad. El 31,58% de
las 38 pacientes a las que se realizó transferencia, se embarazaron.
Estos resultados fueron analizados en relación con la edad de ambos miembros
de la pareja (Fig. 30 y Fig. 31), los parámetros seminales, la fragmentación del ADN
espermáticoy en relación con las características de las mujeres del estudio.
La edad del varón se relacionó con la tasa de fecundación y no lo hizo con la de
implantación, aunque para ambas variables se observa una tasa más elevada para
aquellos varones de menor edad (Tabla 35). Las correlaciones lineales entre la edad de
los varones y ambos parámetros, no fueron estadísticamente significativas (r= -0,248,
P= 0,118 y r= -0,146, P= 0,382, respectivamente). Sin embargo, para ambas
correlaciones se observó la misma tendencia de valores negativos, de manera que
tasas mayores de ambos parámetros se encontraron en los pacientes más jóvenes.
Tasa de fecundación
Edad
N
Media ± SE
Rango
< 40 años 27 62,64 ± 5,77
0 - 100
≥ 40 años 14 47,39 ± 5,68 0 - 85,71
Total
Tasa de implantación
P
N
0,049
41
Media ± SE
Rango
25 24,00 ± 6,60 0 - 100
13
10,25 ±7,90
0 - 100
38
Tabla 35.- Edad del varón en relación con tasa de fecundación y tasa de implantación
108
P
0,193
RESULTADOS
Tampoco se encontró relación entre la edad del varón distribuidos en grupos de
edad (< 40 años y ≥ 40 años) y embriones de buena calidad (G1+G2), y con embarazo
(Tabla 36). Aun así se observó que el porcentaje de parejas con embriones de buena
calidad era algo superior para el grupo de varones jóvenes (20 de 27, 74,1%) que para
el de varones mayores de 40 (9 de 14, 64,3%) y la tasa de embarazo muy superior (40%
y 15,4%, repectivamente) (Tabla 36 y Fig 30).
Embriones (G1 + G2)
Sí
No
Edad varón
N
N
< 40 años
20
7
≥ 40 años
9
5
Total
29
12
P
0,77
Gestación
Sí
No
N
N
10
15
2
11
12
26
P
0,23
Tabla 36.- Edad del varón en relación con embriones de buena calidad y gestación
Figura 30.- Diagramas de barras de embriones G1 + G2 y embarazo por intervalos de edad del varón
109
RESULTADOS
Figura 31.- Gráficas de dispersión de resultado del ciclo de ICSI en función de la edad del varón
En cuanto a la edad de la mujer, se establecieron dos rangos (≤ 35 años y > 35
años). Nose encontró relación, estadísticamente significativa, entre la edad de las
mujeres y la tasa de fecundación ni tampoco con la de implantación (Tabla 37 y Fig.
32), aunque en este segundo caso, la tasa media de implantación disminuye a la mitad
en el grupo de mujeres mayores de 35 años y los tres fallos de fecundación
corresponden a mujeres mayores de 35 años. Las correlaciones lineales entre edad y
ambos parámetros no fueron significativas (r= -0,048, P= 0,766 y r= -0,175, P= 0,294),
respectivamente. Tal como ocurre con las edades de los varones, en ambas
correlaciones se observó la misma tendencia de valores negativos de coeficientes de
correlación, de forma que las mayores tasas de ambos parámetros se encontraron en
las mujeres más jóvenes.
110
RESULTADOS
Tasa de fecundación
Edad
N
Media ± SE
Rango
≤ 35 años 21
62,18±6,05
14,29 - 100
> 35 años 20 52,45± 6,30
Total
Tasa de implantación
P
0 - 100
0,27
41
N
Media ± SE
Rango
21 24,60±7,59 0 - 100
17 12,74±6,63 0 - 100
P
0,25
38
Tabla 37.- Edad de la mujer en relación con tasa de fecundación y tasa de implantación
Del mismo modo, no se encontró relación entre la edad de la edad de la mujer con
la existencia de embriones de buena calidad (G1+G2) (χ2= 0,01,P= 0,92), ni con
embarazo (χ2= 0,92, P= 0,48) (Tabla 38 y Fig. 32). No se observaron tampoco
diferencias en los porcentaje de parejas con embriones de buena calidad en ambos
grupos de mujeres, la tasa de embarazo de las mujeres jóvenes fue superior a la
encontrada en el grupo de mujeres mayores (38,1% y 23, 53%, respectivamente)
(Tabla 38 y Fig 33).
Embriones (G1 + G2)
Sí
No
Edad mujer
N
N
≤ 35 años
15
6
> 35 años
14
6
Total
29
12
P
0,92
Gestación
Sí
No
N
N
8
13
4
13
12
26
P
0,48
Tabla 38.- Edad de la mujer en relación con embriones de buena calidad y gestación
111
RESULTADOS
Figura 32.- Gráficas de dispersión de resultado del ciclo de ICSI en función de la edad de la mujer
Figura 33.- Diagrama de barras de embriones G1 + G2 y embarazo por intervalos de edad de la mujer
4.1. RESULTADOS DE LOS TRA MEDIANTE ICSI Y PARÁMETROS SEMINALES
Se realizó un análisis de la relación los resultados de los tratamientos de
reproducción asistida mediante la ICSI y los distintos tipos de semen (Normo, oligo,
112
RESULTADOS
asteno y teratozoospérmico) y el REM, no encontrado diferencias en ninguno de estos
parámetros respecto a la presencia de embriones de buena calidad (G1+G2) (Tabla 39).
Presencia/ausencia de embriones de buena calidad (G1 + G2)
χ²
P
Semen Normal
1,83
0,30
Semen Oligozoospérmico
1,77
0,27
Semen Astenozoospérmico
1,35
0,40
Semen Teratozoospérmico
2,30
0,16
Recuento Espermatozoide Móviles (REM)
0,23
0,89
Tabla 39.- Relación entre los tipos de varones (normozoospérmicos, oligozoospérmicos,
astenozoospérmicos y teratozoospérmicos) y el REM contrastados con la existencia o no de embriones
de buena calidad (G1 + G2)
Sin embargo la comparación entre los distintos tipos de varones y el REM respecto
a la gestación se encontraron diferencias significativas en la consecución de embarazo
en relación con el semen normal y con el semen de morfología alterada (Tabla 40).
113
RESULTADOS
EmbarazoSí Embarazo No
Normo
Oligo
Asteno
Terato
REM (x 106)
N
N
Sí
5
3
No
7
23
Sí
5
7
No
7
19
Sí
10
20
No
2
5
Sí
4
21
No
8
7
<1
1
5
1-5
8
12
>5
3
9
Total
12
26
χ²
P
4,48 0,03
0,83 0,36
0,20 0,65
8,21 0,04
3,78 0,15
Tabla 40.- Relación entre los tipos de varones (normozoospérmicos, oligozoospérmicos,
astenozoospérmicos y teratozoospérmicos) y el REM en relación con la gestación
Las correlaciones lineales para medir el grado de relación entre los distintos
parámetros cuantitativos seminales, volumen del eyaculado (Fig. 34), concentración
espermática (Fig. 35), motilidad progresiva (Fig. 36), morfología (Fig. 37) y el REM (Fig.
38), y
las tasas de fecundación e implantación, resaltaron la existencia de una
correlación lineal positiva significativa entre el porcentaje de formas normales y la
tasa de implantación (Tabla 41).
114
RESULTADOS
Volumen del eyaculado
Tasa implantación
Coeficiente de
P
Correlación (r)
-0,270
0,294
Tasa de Fecundación
Coeficiente de
P
Correlación (r)
0,038
0,811
Concentración espermática
-0,013
0,939
0,024
0,880
Motilidad progresiva
-0,044
0,247
0,085
0,845
Morfología (% formas normales)
0,396
0,014
-0,030
0,851
REM
-0,140
0,402
0,180
0,761
Tabla 41.- Análisis de correlación lineal entre la tasa de implantación y la tasa de fecundación y los
parámetros seminales.
Figura 34.- Graficas de dispersión de indicadores del resultados del ciclo en función del volumen del
eyaculado.
115
RESULTADOS
Figura 35.- Indicadores del resultado del ciclo en función de la concentración.
Figura 36.- Gráfica de dispersión de Indicadores del resultado del ciclo con motidad progresiva.
116
RESULTADOS
Figura 37.- Gráficas de dispersión deIndicadores del resultado del ciclo en función de la morfología.
Figura 38..-Gráficas de dispersión deIndicadores del resultado del ciclo en función de REM.
117
RESULTADOS
4.2. RESULTADOS DE LOS TRA MEDIANTE ICSI y FRAGMENTACIÓN DEL ADN
ESPERMÁTICO
En este apartado se ha estudiadosi la fragmentación del ADN espermático fue
determinante o afectó en alguna medida a los resultados de los tratamientos de
reproducción asistida mediante la ICSI, que se analizan en este trabajo (Fig. 40).
4.2.1. FRAGMENTACIÓN BASAL Y RESULTADOS DE ICSI
4.2.1.1. FRAGMENTACIÓN BASAL Y TASA DE FECUNDACIÓN
La tasa de fecundación fue ligeramente más elevada en el caso de utilizar
muestras con porcentajes de fragmentación basal igual o superior al 30% en
comparación con las que se encontraron cuando la muestra analizada tenía un
porcentaje menor (Tabla 42).
Tasa de fecundación
Fragmentación basal
Media ± SE
Rango
< 30% 56,38 ± 0,50
0,00 - 88,89
≥ 30% 58,55 ±0,51
0,00 - 100,00
P
0,80
Tabla 42.- Tasa de fecundación media y fragmentación basal
4.2.1.2. FRAGMENTACIÓN BASAL Y EMBRIONES DE BUENA CALIDAD
Contrastando la existencia o no de embriones de buena calidad (G1+G2) entre
los dos grupos de fragmentación basal, no se observaron diferencias significativas
entre los dos grupos distribuyéndose los embriones buenos de manera
similar.Comparando las medias de fragmentación basal entre el grupo de pacientes
que tiene embriones G1+G2 y el grupo que no los tiene, no se encontraron diferencias
significativas entre ambos grupos, aunque se encontraron valores ligeramente
superiores en el grupo que tiene embriones de buena calidad (Tabla 43).
118
RESULTADOS
Fragmentación basal
< 30%
≥ 30%
Embriones G1 + G2
N
N
Sí
14
15
No
7
5
21
20
Total
P
0,55
Media ± SE
Rango
32,41 ± 3,89
5,5 - 95,2
30,44 ± 4,01
10,3 - 55,1
P
0,76
Tabla 43.- Fragmentación basal y Fragmentación basal media en relación con embriones de buena
calidad (G1+G2)
Para analizar si el test de fragmentación basal era una prueba capaz de predecir la
obtención de embriones de buena calidad se recurrió a una curva ROC. El área bajo la
curva (AUC) fue 0,48, con lo que se concluyó que la realización de un análisis de
fragmentación basal no era prueba capaz pronosticar que esa paciente tuviera
embriones de buena calidad (Fig.39).
F. basal
F. post swim-up
Figura 39.- Curva ROC de la fragmentación basal (azul) y fragmentación post swim-up en las
pacientes que tienen embriones de buena calidad (G1 + G2)
119
RESULTADOS
4.2.1.3. FRAGMENTACIÓN BASAL Y TASA DE IMPLANTACIÓN
El estudio de la diferencias de tasas medias de implantación entre los dos
grupos de fragmentación reveló que, a pesar de que la tasa de implantación era más
elevada en el caso de las muestras del grupo de fragmentación basal menor respecto a
la del otro grupo, las diferencias no alcanzaron la significación (Tabla 44)
Tasa de implantación
Fragmentación basal
Media ± SE
Rango P
< 30% 22,50 ±0,51
-
≥ 30% 15,74 ±0,54
-
0,52
Tabla 44.- Tasa media de implantación y fragmentación basal
4.2.1.4. FRAGMENTACIÓN BASAL Y GESTACIÓN
Las pacientes que no consiguieron embarazo estaban equitativamente
distribuidas entre los dos grupo de fragmentación basal establecidos. En lo referente al
número de embarazosaunque fue mayor en el grupo que presenta una fragmentación
basal menor las diferencias fueron pequeñas con el otro grupo (Tabla 45) .
Fragmentación basal
< 30%
≥ 30%
Gestación
N
N
Sí
7
5
No
13
13
20
18
Total
P
0,63
Tabla 45.- Fragmentación basal y gestación
La tasa media de gestación fue como consecuencia ligeramente superior en el
grupo que tenía una fragmentación < 30% .En cambio la media de fragmentación basal
fue superior aunque también en un porcentaje pequeño en el grupo de mujeres que
no se embarazaron (Tabla 46) .
120
RESULTADOS
Fragmentación basal (%)
Gestación
Media ± SE
Rango
Sí 30,42 ±5,01
14,9 - 68,7
No 32,18 ± 3,99
5,5 - 95,2
P
0,79
Tabla 46.- Fragmentación basal media y gestación
Figura 40..- Gráfica de dispersión deindicadores de los resultados del ciclo en función de la
fragmentación basal
Para analizar si el test de fragmentación basal era una prueba capaz de predecir la
obtención de gestación, se recurrió a una curva ROC. El área bajo la curva (AUC) fue
0,46, con lo que se concluyó que la realización de un análisis de fragmentación basal
no era prueba capaz pronosticar que se vaya a producir embarazo (Fig.41).
121
RESULTADOS
F. basal
F. post swim-up
Figura 41.- Curva ROC de la fragmentación basal y post swim-up en las pacientes que consiguen embarazo
4.2.2. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y RESULTADOS DE ICSI
4.2.2.1. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y TASA DE FECUNDACIÓN
Para valorar si la el porcentaje de fragmentación post swim-up afectaba a la
tasa de fecundación obtenida tras la técnica de ICSI se realizó el análisis de correlación
lineal que arrojó resultados no significativos (r = 0,180; P= 0,26) (Fig. 42).
4.2.2.2. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y EMBRIONES DE BUENA CALIDAD
Con objeto de conocer si existía alguna relación entre la fragmentación post
swim-up y la calidad embrionaria hemos calculado la fragmentación media en los dos
grupos, no obteniéndose ningún resultado significativo (Tabla 47).
122
RESULTADOS
Fragmentación post swim-up (%)
Embriones G1 + G2
Media ± SE
Rango
Sí
11,37 ± 0,43
0,1 - 48,9
No
6,78 ± 0,63
0,2 - 20,5
P
0,26
Tabla 47.- Fragmentación post swim-up media y embriones de buena calidad (G1+G2)
Como en el caso de la fragmentación basal también se analizó si el cálculo del
porcentaje de fragmentación después del swim-up era un buen predictor de la
obtención de embriones de buena calidad. El valor de AUC fue de 0,57, a pesar de ser
un valor más elevado que el que se obtuvo al analizar la fragmentación basal, el
resultado demuestra que en este caso tampoco nos encontramos delante de una
prueba con un alto valor de predicción (Fig.39).
4.2.2.3. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y TASA DE IMPLANTACIÓN
Para valorar si el porcentaje de fragmentación post swim-up del ADN
espermático afectaba a la tasa de implantación que se obtenía mediante la técnica de
ICSI se realizó el análisis de correlación linealcon resultados no significativos (r=-0,035;
P= 0,84).
4.2.2.4. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y GESTACIÓN
De la comparación de medias realizada entre el grupo de mujeres que se
embarazaron y el que no, se encontró que, a pesar de ser superior la media de
fragmentación post swim-up en el segundo grupo, las diferencias obtenidas no fueron
significativas (Tabla 48).
123
RESULTADOS
Fragmentación post swim-up (%)
Gestación
Media ± SE
Rango
Sí
8,57 ± 0,63
0,4 - 27,2
11,15 ± 0,46
0,1 - 48,9
No
P
0,55
Tabla 48.- Fragmentación post swim-up media y gestación
Figura 42.- Gráfica de dispersión deindicadores de los resultados ciclo en función de la fragmentación
post swim-up
El AUC (0,49) del estudio de la curva ROC demuestra que el test de
fragmentación post swim-up no es una prueba válida para pronosticar el resultado del
ciclo en cuanto a la obtención de gestación (Fig. 41).
124
RESULTADOS
4.2.3. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y RESULTADOS DE ICSI
4.2.3.1. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y TASA DE FECUNDACIÓN
El análisis de la correlación entre las variaciones de los porcentajes de fragmentación
del ADN espermático en relación con el parámetro que refleja la tasa de fecundación
resultante de la técnica de ICSI en las parejas del estudio dio resultados no significativos (r=-
0,018; P=0,91) (Fig. 43).
4.2.3.2. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y EMBRIONES DE BUENA CALIDAD
Las medias de variaciones de fragmentación, debido al procesamiento
mediante swim-up, fueron similares en los dos grupos de embriones y las diferencias
no fueron significativas (Tabla 49).
Variación de fragmentación
Embriones G1 + G2
Media ± SE
Rango
Sí -21,04 ± 0,43
-65,6 - +6,4
No -23,66 ± 0,64
-45,3 - -0,2
P
0,65
Tabla 49.- Variación de fragmentación media y embriones de buena calidad (G1+G2)
4.2.3.3. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y TASA DE IMPLANTACIÓN
Los parámetros variación de los porcentajes de fragmentación del ADN
espermático y tasa de implantación resultante de la técnica de ICSI en las parejas del
estudio no se encontraban significativamente correlacionados (r = -0,095; P= 0,57).
4.2.3.4. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y GESTACIÓN
Al analizar la variación de la fragmentación del ADN espermático una vez
procesada la muestra no se encontraron diferencias significativas entre el grupo de
mujeres que se embarazaban y el grupo de aquellas que no obtuvieron un embarazo
(Tabla 50).
125
RESULTADOS
Variación de fragmentación
Gestación
Media ± SE
Rango
Sí -21,85 ± 0,64
-58,3 - +6,4
No -21,03 ± 0,46
-65,6 - +0,8
P
0,88
Tabla 50.- Variación de fragmentación media y gestación
Figura 43.- Gráfica de dispersión de indicadores de los resultados ciclo en función de variación de la
fragmentación
Finalmente, para valorar en su conjunto el factor masculino en relación con la
obtención de embarazo, se realizó un test de regresión logística multivariante con
edad, tipos de anomalías seminales, porcentajes de fragmentación basal y post swimup. Los resultados de este análisis evidenciaron que el fracaso en la consecución de
126
RESULTADOS
embarazo se asoció significativamente a varones oligozoospérmicos (P= 0,005) y a
teratozoospérmicos (P= 0,012).
4.3. RESULTADOS DE TRA MEDIANTE ICSI EN MUJERES DE BUEN Y MAL PRONÓSTICO
La población femenina de estudio, como se explicó en el apartado de análisis
descriptivo, se dividió, para el análisis de los resultados del ciclo ICSI, en función de su
edad, el recuento de folículos antrales, la FSHbasal y resultados de ciclos previos.
4.3.1. TASA DE FECUNDACIÓN EN MUJERES DE BUEN Y MAL PRONÓSTICO
La comparación de la tasa de fecundación entre las mujeres de buen y mal
pronóstico no arrojó diferencias significativas entre ambos grupos, aunque la media
fue más elevada para aquellas mujeres clasificadas como de buen pronóstico (Tabla
51).
Tasa de fecundación
Pronóstico de la mujer
N
Media ± SE
Bueno 18
64,09 ± 7,50
Malo 23
52,23 ± 5,03
P
0,182
Tabla 51.- Tasa media de fecundación y pronóstico de la mujer
4.3.2. EMBRIONES DE BUENA CALIDAD EN MUJERES DE BUEN Y MAL PRONÓSTICO
Analizando la obtención de embriones de buena calidad (G1+G2) según las
mujeres sean de buen o mal pronóstico, se observaron valores medios muy similares
en ambos grupos, las diferencias encontradas entre las medias no fueron significativas
(Tabla 52).
127
RESULTADOS
Embriones G1+G2
Pronóstico de la mujer
N
Media ± SE
Bueno 18
1,67 ± 0,40
Malo 23
1,57 ± 0,26
P
0,623
Tabla 52.- embriones de buena calidad (G1+G2) y pronóstico de la mujer
4.3.3. TASA DE IMPLANTACIÓN EN MUJERES DE BUEN Y MAL PRONÓSTICO
Los resultados obtenidos en cuanto a la tasa de implantación, reflejan valores
medios con diferencias de hasta 12 puntos entre las 17 mujeres de buen (una mujer de
las 18 totales con fallo de fecundación) y las 21 de mal pronóstico (dos mujeres con
fallo de fecundación), con mayor tasa de implantación para el grupo de mujeres
clasificadas como de buen pronóstico, no siendo esta diferencia estadísticamente
significativa (Tabla 53).
Tasa de implantación
Pronóstico de la mujer
N
Media ± SE
Bueno 17
27,45 ± 8,91
Malo 21
15,74 ± 5,73
P
0,175
Tabla 53.- Tasa media de implantación y pronóstico de la mujer
4.3.4. GESTACIÓN EN MUJERES DE BUEN Y MAL PRONÓSTICO
La tasa de gestación por transferencia (sólo 38 transferencias porque hubo 3
fallos de fecundación), fue superior para el grupo de mujeres clasificadas como de
buen pronóstico (7 gestantes de 17 de buen pronóstico, tasa de 41,2%) que para el
otro grupo (5 gestantes de 21 de mal pronóstico, tasa de 23,8%). Además, la mayoría
de las gestaciones corresponden a las mujeres de buen pronóstico (7 de buen
pronóstico de 12 gestaciones, 58,3% de las gestaciones) y, entre las mujeres que no
gestaron, hay más de las pertenecientes al grupo de mal pronóstico (16 de mal
128
RESULTADOS
pronóstico de 26 no gestantes, 61,5% de los fallos de gestación). A pesar de las
diferencias, no se obtuvo significación estadística entre ambas variables (Tabla 54).
Pronóstico
Bueno
Malo
Gestación
N
N
Sí
7
5
No
10
16
17
21
Total
P
0,63
Tabla 54.- Mujeres de buen y mal pronóstico en relación con la gestación
Finalmente, para profundizar en los factores femeninos que pudieran afectar al
éxito de embarazo, se realizó un test de regresión logística multivariante con los
parámetros femeninos como número de ovocitos obtenidos, número de embriones de
buena calidad, número de embriones transferidos y edad materna, encontrando que el
éxito de embarazo se asoció significativamente a la edad materna (P= 0,05) y muy
significativamente al número de embriones (P= 0,002).
129
DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
1. PARÁMETROS SEMINALES Y CARACTERÍSTICAS DE LOS VARONES
Algunos aspectos cuantitativos y cualitativos de la muestra de semen
denominados parámetros seminales, se han utilizado de forma rutinaria para evaluar
la fertilidad y se han considerado un indicador de la misma(Eskenazi et al., 2003). Los
parámetros analizados en un seminograma rutinario son el volumen del eyaculado, la
concentración espermática de la muestra, la motilidad y morfología de los
espermatozoides que definen la calidad seminal. Otro indicador habitual de la calidad
espermática es el recuento de espermatozoides móviles (REM).
Al estudiar las correlaciones en comparaciones cruzadas entre los parámetros
del seminograma en los varones de nuestra serie se encontró que el REM se
correlacionaba lineal y positivamente tanto con la concentración espermática como
con la motilidad progresiva (% de espermatozoides con motilidad a+b), con la
morfología (medida en % de formas normales) (r= 0,420, P=0,06 y r= 0,336, P= 0,032,
respectivamente) (Tabla 11). Algo esperable teniendo en cuenta que, generalmente,
cuanto más elevada sea la concentración inicial de espermatozoides, mayor número se
recuperará y que existen determinadas alteraciones morfológicas que dificultan la
motilidad del espermatozoide disminuyendo el número de ellos recuperados. Se
estableció también una correlación positiva entre motilidad progresiva y morfología
espermática (r= 0,305, P= 0,048) (Tabla 11), probablemente debido a que existen
ciertas anomalías morfológicas que compromenten el desplazamiento de los
espermatozoides.
Independientemente de la posible influencia de los factores analizados, existe
una tendencia global al deterioro de la calidad seminal en el tiempo, para cada franja
de edad. Un estudio sobre más de 26000 hombres realizado en Francia a lo largo de 17
años determinó la existencia de una disminución continua significativa en la
concentración espermática de alrededor del 1,9% al año así como una disminución
significativa no cuantificable en el porcentaje de formas normales y una ligera
disminución de la motilidad pero sin una tendencia clara (Rolland et al., 2013).
133
DISCUSIÓN
1.1. PARÁMETROS SEMINALES Y EDAD
Numerosos estudios han analizado el efecto de la edad sobre el deterioro de
los parámetros seminales. La cuestión de la edad avanzada es un tema que va
adquiriendo más importancia a medida que las parejas van retrasando el momento de
tener descendencia, debido al aumento de la esperanza de vida, a los avances en el
campo de la reproducción asistida y a un conjunto de cambios sociológicos (Sartorius
and Nieschlag, 2010).
Está comprobado que la fertilidad femenina se reduce en las mujeres a partir
de los 35 años, a pesar de estar mucho menos investigado, también hay evidencias que
sugieren que el aumento de la edad del varón está asociado a una disminución en la
fertilidad con independencia de la edad materna (Aitken, 2014). La Rochebrochard, en
dos análisis sobre 6188 parejas europeas y 1938 hombres con parejas estériles,
respectivamente, establece los 40 años como la edad paterna a partir de la cual se
observa mayor riesgo de infertilidad (La Rochebrochard and Thonneau, 2003; La
Rochebrochard et al., 2006).
La primera parte de este estudio analizó si la calidad seminal del grupo total de
pacientes se veía afectada por la edad. Analizando los datos de nuestro trabajo no
observamos que la edad influya en el hecho de presentar un seminograma normal o
no (Tabla 6). Estos datos no coinciden con otros investigadores, cuyos estudios revelan
que a medida que la edad aumenta la calidad seminal disminuye (Eskenazi et al., 2003;
Kuhnertet al., 2004). Sin embargo, hay que considerar que el rango de edad de la
población estudiada osciló entre 24,5 y 51,4 años,con una media de 38,51 ± 0,94, y el
efecto deletéreo de la edad en el varón si bien es progresivo es más manifiesto a partir
de la cuarta década.
Al analizar por separado los parámetros más importantes del seminograma
como la concentración, la motilidad y la morfología también encontramos que son
variables independientes de la edad (Tablas 7, 8 y 9). Los datos que hemos obtenido
coinciden con algunos estudios realizados por otros grupos que tampoco encuentran
asociación entre la edad y la concentración, concluyendo que en concreto el conteo de
espermatozoides no disminuye al aumentar la edad del sexo masculino (Kidd et al.,
134
DISCUSIÓN
2001;Johnson et al., 2015). Incluso hay autores que hablan de un aumento en la
concentración espermática asociada al incremento de edad en hombres infértiles que,
sin embargo, no se produce en hombres fértiles (Brahem et al., 2011). En el estudio del
grupo de Johnson se ha detectado que este sorprendente aumento que se produce de
la concentración está asociado en muchos casos a una disminución en el volumen de la
muestra. Lo que se estaría produciendo es un aumento en el número de
espermatozoides por mililitro más que un incremento real del número de
espermatozoides totales en el eyaculado (Johnson et al., 2015).Nosotros, sin embargo,
no encontramos que la edad afecte negativamente a la concentración pero tampoco
que el volumen de eyaculado disminuya con la edad de nuestros pacientes. Todos los
pacientes hipospérmicos de nuestro estudio tenían una edad inferior a la edad media
de la muestra (38,51 años).
A pesar de que la concentración parece ser para algunos autores la variable
menos afectada por la edad (Kiddet al., 2011; Johnson et al., 2015), muchos estudios
encuentran una correlación negativa con otros parámetros del seminograma,
observando descensos asociados con la edad en parámetros tan importantes como
motilidad y morfología (Kidd et al., 2001; Johnson et al., 2015). A pesar de eso, y
basándonos en los datos obtenidos, nosotros no podemos establecer correlación
alguna, coincidiendo con otros autores que tampoco encuentran evidencias de que la
edad afecte a ninguno de estos dos parámetros (Nijs et al., 2011; Brahem et al., 2011).
En un metanálisis publicado por Li y colaboradores en el 2001 en el que se incluían 57
estudios y casi 30000 pacientes de 26 países encontraron que la edad no afectaba de
manera consistente ni a la concentración de espermatozoides ni a la morfología de los
mismos (Li et al., 2011).
Lógicamente, al no encontrar relación entre la edad y los parámetros seminales
en nuestros pacientes, tampoco observamos relación alguna con el resultado del REM.
En este caso, los resultados están dentro de lo esperado ya que el REM es una
consecuencia de la calidad de la muestra (Tabla 10).
Los resultados de los estudios sobre el efecto de la edad en los parámetros
seminales son heterogéneos y controvertidos. Hay autores que señalan que la mayoría
135
DISCUSIÓN
de estos estudios están realizados en pacientes que provienen de las consultas de
andrología o de las consultas de fertilidad (Kidd et al., 2001) lo que supondría un sesgo
importante que distorsionaría los resultados. Es difícil separar el efecto de la edad de
otros posibles contaminantes ambientales u otros disruptores endocrinos, patología
asociada y estilos de vida que podrían afectar negativamente a los parámetros
seminales. Estos factores externos pueden generar confusión y su efecto quedar
enmascarado, atribuyendo, en determinados casos, el descenso de la calidad
espermática únicamente al aumento de la edad. A esto hay que añadir el hecho de
que, en muchos casos, no se han tenido en cuenta aspectos importantes como
periodos de abstinencia sexual excesivamente elevados (Levitaset al., 2007), además
de que es raro encontrar estudios que incluyan a pacientes mayores de 60 años
(Brahem et al., 2011).
1.2. PARÁMETROS SEMINALES Y TABAQUISMO
Existen varios agentes externos que pueden afectar negativamente a la
espermatogénesis y como consecuencia influyen en la calidad seminal, y uno de los
más estudiados es el tabaco. El tabaquismo se ha identificado desde hace tiempo
como factor asociado con una disminución de los valores de los parámetros básicos del
seminograma que determinan el estudio de la infertilidad masculina como son la
concentración, motilidad y morfología de los espermatozoides.
La mayoría de las publicaciones coinciden en que el tabaco afecta
negativamente a los parámetros seminales aunque la afectación es más o menos
severa según el estudio en concreto (Liet al., 2011; Taha et al., 2012; Al‑Turki, 2015).
Sin embargo, hay autores que no encuentran relación entre el tabaquismo y la calidad
del semen a no ser que su efecto se combine con el consumo de alcohol (Martini et al.,
2004; Pasqualottoet al., 2005), o ni siquiera en esos casos (de Jong et al., 2014).
El 46,34% de los varones que componen la población de estudio son
fumadores. En nuestroestudio encontramos que los pacientes que fumaban tenían
alteración en alguno de los parámetros del seminograma en un porcentaje
significativamente mayor que aquellos que no eran fumadores (P = 0,03) (Tabla 6), de
136
DISCUSIÓN
modo que existe una relación inversa entre el consumo de tabaco y la
normozoospermia (normalidad en los parámetros del seminograma), es decir, el
consumo de tabaco influye negativamente en la normozoospermia. Al analizar por
separado los distintos parámetros seminales, las diferencias encontradas en la
concentración y en la morfología con respecto al consumo de tabaco, no son
significativas. Ambas son, por separado, variables independientes del consumo de
tabaco (Tablas 7 y 9).
En el caso de la concentración, nuestros resultados coinciden con otros
estudios en los que encuentran que el consumo de tabaco no tiene efectos
significativos sobre estos dos parámetros (Pasqualottoet al., 2005; de Jong et al.,
2014). No ocurre lo mismo con otros autores que observan un descenso significativo
en la concentración de espermatozoides en los varones fumadores con respecto a los
no fumadores (Caserta et al., 2013).
Si analizamos la morfología espermática y también coincidiendo con los datos
publicados por los grupos de Caserta y Pasqualotto, encontramos que el porcentaje de
espermatozoides con morfología normal se redujo en los fumadores pero no lo hizo de
manera clínicamente relevante(Caserta et al., 2013; Pasqualotto et al., 2005).
La motilidad, en cambio, disminuyó en el grupo de fumadores de nuestra
población de un modo significativo (P= 0,03) (Tabla 8). Nuestros resultados coinciden
con grandes series como la del grupo deCaserta, con 296 pacientes (Caserta et al.,
2013), observándose una relación positivaentre la astenozoospermia y el consumo de
tabaco. La elevada concentración de óxido nítrico o de malondialdehido u otros
agentes
peróxidos
ha
sido
descrita
en
varones
fumadores,
incluso
con
normozooospermia, y se postula como uno de los mecanismos por los que se podría
afectar la motilidad espermática (Ghaffari and Rostami, 2012).Otros grupos no
encontraron correlación del tabaquismo con la movilidad al estudiar varones infértiles
(Künzle et al., 2003;de Jong et al., 2014) o población de fertilidad probada (de Jong et
al., 2014).
Por otra parte, en nuestra muestra,no se aprecia dependencia entre la
alteración en la motilidad y la intensidad del consumo. Dentro del grupo de los
137
DISCUSIÓN
fumadores no se observa dependencia entre el daño producido en la motilidad y el
número de cigarrillos consumidos(dato no mostrado). En este aspecto, un estudio
realizado por Pasqualotto y cols. concluyen que no hay diferencias entre los distintos
grupos de fumadores en función de la intensidad de consumo, y los parámetros
seminales (Pasqualottoet al., 2005). No es descartable que la información aportada por
los pacientes en relación a la intensidad de consumo de tabaco, sea inexacta.
Por otro lado, analizando la posible relación entre consumo de tabaco y el REM
encontramos que esteparámetro eraindependiente de la condición o no de fumador.
Sin embargo, como explicábamos anteriormente, sí hallamos asociación entre el
consumo de tabaco y la motilidad. Estos hechospueden deberse a que, a pesar de que
el REM está muy asociado a la motilidad espermática, tanto la concentración como la
morfología también intervienen en su resultado. El efecto del tabaco sobre la
motilidad podría verse compensado por los otros dos parámetros, que en nuestra
población no se ven perjudicados.
Según la OMS el consumo de tabaco mata a más de 5 millones de personas al
año y es responsable de la muerte de 1 de cada 10 adultos. A esto hay que unir los
elevados gastos de salud pública relacionados con el tratamiento de enfermedades
causadas por el tabaco. Además, a pesar de que se continúa investigando, parece
probable que el consumo de tabaco afecte a los parámetros seminales,y sí se ha
detectado que determinados componentes del tabaco atraviesan la barrera
hematotesticular (Vine et al., 1993), pero se desconocen los mecanismos
fisiopatológicos por los que el tabaco afecta a la calidad seminal. Hay trabajos que
evalúan el efecto que tiene en los fumadores el dejar de fumar y encuentran que
pasados 3 meses algunos parámetros seminales mejoran en los exfumadores (Santoset
al., 2011). Por otra parte el efecto nocivo del tabaco puede manifestarse a otros
niveles que determinan la capacidad fecundante o la calidad del material genético del
espermatozoide que no son detectables en el estudio básico seminal.
138
DISCUSIÓN
2. FRAGMENTACIÓN BASAL DEL ADN ESPERMÁTICO
En los últimos años, se ha unido al estudio de las variables clásicas del
seminograma, la posibilidad del análisisde la fragmentación del ADN espermático. La
integridad del material genético, tanto del gameto femenino como masculino, es
esencial para el correcto desarrollo del embrión. El daño en el ADN de los
espermatozoides se puede producir, como ya se ha relatado, por numerosos factores.
Entre los más comunes encontramos deficiencias en el empaquetamiento de la
cromatina espermática, mal funcionamiento del proceso apoptótico previo a la
eyaculación y la acción de las ROS.
El test SCD ha sido la técnica de estudio elegida en este trabajo para evaluar la
fragmentación del ADN espermático. Esta técnica es sencilla, reproducible, económica
y que, además, no necesita invertir en aparataje muy costoso como ocurre con otras
disponibles en el mercado. Se trata, por tanto, de una técnica fácilmente incorporable
a los laboratorios de fecundación in vitro ypuede constituir una herramienta valiosa.
Otros métodospara medir la fragmentación, como SCSA y TUNEL,proporcionan
resultados similares (Chohan et al., 2006; Ribas-Maynou et al., 2013) pero requieren
equipos costosos y, SCSA, también capacitación especializada.
El establecimiento de un punto de corte para la interpretación del test de
fragmentación basalha sido objeto de debate desde que se popularizó el estudio de la
fragmentación espermática.Se ha utilizado como punto de corte para nuestro estudio
el valor umbral de fragmentación que estableció Evenson (30%) por debajo del cual se
reducían mucho las probabilidades de conseguir un embarazo (Evenson et al., 2002;
Bungum et al., 2008).Ese punto de corte ha sido bastante discutido y hasta el
momento no se ha conseguido precisar el valor exacto por encima del cual no se
consiga embarazo. El nivel de corte para los valores de fragmentación del DNA
propuesto por Evenson establece que la probabilidad de la fertilización in vivo es
cercana a 0 si la proporción de espermatozoides con daño excede el 30%.
Utilizando este mismo punto de corte, hemos obtenido dos subgrupos con el
mismo número de individuos (21 y 20, respectivamente), y el valor medio de
fragmentación basal del grupo de pacientes que no alcanzaron el umbral del 30% de
139
DISCUSIÓN
fragmentación de su ADN espermático fue de 18% mientras que la del otro subgrupo
fue de 47% (29 puntos superior) y las diferencias entre ambos fueron altamente
significativas (P= 0,003) (Tabla 12).El umbral del 30% se describe como el efecto “punta
del iceberg”, esto es, el daño en el ADN identificado en el 30% de los espermatozoides
indica una anormalidad en la población entera que causa infertilidad in vivo (Evenson
et al. 2002).Los resultados del análisis de fragmentación basal mostraron que el 50%
de nuestra población presentaba valores de fragmentación del ADN espermático
patológicos (≥ 30%).
2.1. FRAGMENTACIÓN BASAL Y PARÁMETROS SEMINALES
Los datos obtenidos en nuestro estudio muestran que los varones que han
tenido los parámetros seminales convencionales de concentración, motilidad y
morfología dentro de los valores normales (normozoospérmicos) en relación con los
que no lo eran (no normozoospérmicos) se distribuyeron de modo diferente entre los
dos grupos de fragmentación basal, con un sesgo a encontrarse más pacientes
normozoospérmicos en el grupo de fragmentación basal <30% que en el otro,
evidenciándose diferencias significativas en la distribución, aunque presentaron
porcentajes medios de fragmentación similares (P= 0,02) (Tabla 14).Basándonos en
estos datos, parece que el resultado de un seminograma básico, por sí sólo, no predice
los valores mediosde fragmentación. No podría garantizarnos menores tasas de
fragmentación en el caso de pacientes normozoospérmicos, ni prever que los varones
no normozoospérmicos van a presentan mayor daño espermático. Estas circunstancias
son coincidentes con lo encontrado en otros trabajos previos, en los que, hombres con
muestras de semen normales pueden tener un nivel elevado de fragmentación basal,
mientras que otros con una calidad espermática inferior pueden tener niveles mínimos
de daño en el ADN(Brahem et al., 2011) o que no observan relación entre el daño en el
ADN espermático y los parámetros seminales (concentración, motilidad y morfología)
(Zini et al., 2005).
Del mismo modo, los pacientes oligozoospérmicos de nuestro estudio
presentan una tasa media de fragmentación basal sólo ligeramente más elevada que
140
DISCUSIÓN
los que tienen una concentración espermática normal y algo similar en sentido
contrario ocurriría para pacientes astenozoospérmicos y teratozoospérmicos, y en
todos los casos sin tratarse de diferencias significativas (Tablas 15, 16 y 17). Lo que
indicaría que los parámetros seminales y la fragmentación del ADN espermático son
variables independientes (Brahem et al., 2011). Sin embargo, otros estudios previos
señalan que los pacientes normozoospérmicos presentan un porcentaje menor de
espermatozoides con el ADN dañado que varones que no lo son, en concreto,
oligozoospérmicos o teratozoospérmicos (Tomlinson et al., 2001).
Por otro lado, cuando se correlacionaron los parámetros seminales, por
separado, las alteraciones seminales ya sea de concentración, de motilidad o de
morfología, eran independientes de la fragmentación del ADN de los espermatozoides
(Tablas 15, 16 y 17).También en esto coincidimos con otros trabajos en los que no
existió relación entre la fragmentación basal y parámetros clásicos analizados por
separado, como la morfología (Irvineet al, 2000) o la concentración (Sheikh et al.,
2008; Tandara et al., 2013). Otros, por el contrario, encuentran una fuerte correlación
entre motilidad y fragmentación (Palermo et al., 2014).
El estudio de la posible relación entre el REM y el daño basal en el ADN
espermático encontramos una tendencia entre ellos, cuanto mayor es el número de
espermatozoides recuperados menor es el porcentaje de fragmentación basal de la
muestra, a pesar de lo cual no se demuestra que las variables sean estadísticamente
dependientes. El estudio revela diferencias de hasta 8 puntos porcentuales de
fragmentación basal media entre los subgrupos de mayor y menor REM (Tabla 18).
El análisis de correlación evidenció que tampoco existe relación lineal entre la
fragmentación del ADN espermático y ninguna de las variables de calidad seminal
analizadas (Tabla 19).
Los numerosos y variados resultados que hemos encontrado publicados son, en
muchos casos, contradictorios y ponen de manifiestoque los análisis convencionales de
las muestras seminales no siempre son predictivos de los niveles de daño en el ADN
espermático (Lewis, 2007), lo cual coincidiría con lo encontrado por nosotros en el
análisis de la fragmentación basal y los parámetros de calidad del seminograma. Esta
141
DISCUSIÓN
disparidad en la bibliografía puede tener su origen en varios factores que limitan el
estudio. Por un lado, la heterogeneidad que existe en una población de
espermatozoides dificulta mucho el examen de las posibles interacciones entre los
parámetros seminales (Tomlinson et al., 2001). Además, se ha comprobado que los
niveles de fragmentación pueden fluctuar en el tiempo y encontrarse valores
diferentes en muestras del mismo individuo obtenidas en diferentes días (Lewis, 2007).
Por otro lado,la mayoría de estos estudios están realizados en varones incluidos en
consultas de andrología o de fertilidad (Kidd et al., 2001), lo que podría sesgar la
muestra. En cualquier caso, no se ha llegado a determinar que la fragmentación del
ADN espermático esté relacionada con los parámetros seminales, lo que justificaría el
análisis de ambos durante una evaluación integral de la infertilidad masculina (Evgeni,
2014).
En los últimos años, se ha intentado profundizar en la repercusión que tiene la
integridad de la cromatina en la fertilidad del varón para intentar incorporarla a los
parámetros tradicionales de las pruebas seminales. Lamentablemente, ningún
parámetro, por sí sólo, parececapaz, hoy por hoy, de predecir la infertilidad masculina.
Se sigue investigando para intentar encontrar la prueba o el conjunto de ellas que nos
permitan, por fin, determinar con rigor absoluto si un varón es fértil o no lo es.
2.2. FRAGMENTACIÓN BASAL Y EDAD
La edad de los varones es una de las variables de nuestro estudio que más
afecta a los niveles de fragmentación del ADN espermático (P= 0,01) (Tabla 13). A
pesar de que los riesgos potenciales que implica la edad avanzada de la mujer sobre
los resultados reproductivos están perfectamente descritos (Smith et al., 1996;
Berkowitz et al., 1990; Breart, 1997) , no existe la misma cantidad de bibliografía
referente a la edad del hombre. La edad puede afectar, además de a la calidad del
semen, también a la integridad del ADN de los espermatozoides.
Como ya hemos visto al comienzo de esta discusión, en nuestra población, los
parámetros seminales son independientes de la edad, pero no ocurre lo mismo si lo
que analizamos es la fragmentación basal del ADN espermático.Nuestros resultados
142
DISCUSIÓN
evidencian que la proporción de espermatozoides con el ADN fragmentado fue, de
media,10 puntos porcentualessuperior en pacientes con edades superiores a los 40
años que en los pacientes más jóvenes(Tabla 13), aunque no llegue a ser una
correlación lineal la relación existente entre ambos parámetros. La mayoría de los
autores llegan a la misma conclusión y encuentran una relación positiva entre la edad y
el daño en el ADN espermático (Sánchez Toledo et al., 2013, Johnson et al., 2015),
aunque otros las consideran variables independientes tanto en varones fértiles como
en infértiles (Nijs et al., 2011; Khalili, et al., 2006; Brahem et al., 2011).
El aumento en el porcentaje de fragmentación basal del ADN que hemos
observado en nuestro trabajo, coincide con los resultados que cabría esperar, ya que
se sabe que con la edad se producen cambios en todo el sistema reproductor
masculino, producción de hormonas reproductivas, función sexual, morfología
testicular, parámetros seminales, integridad del ADN, fertilidad, etc.(Sartorius et al.,
2010; Sharma et al., 2015). Muchos autores han especulado sobre que las asociaciones
de estos parámetros no son únicamente consecuencias directas del envejecimiento
sino también de los efectos acumulativos que tiene la exposición a tóxicos y
contaminantes (Kidd et al., 2001).
A pesar de que numerosos autores han estudiado cómo afecta la edad
avanzada del varón a la integridad del ADN de los espermatozoides, los resultados aún
no son concluyentes. Hay estudios que sugieren que la fragmentación del ADN debe
ser un análisis de rutina para varones de edad avanzada, a los que se debe avisar de los
riesgos potenciales que su edad implica (Das et al., 2013; Johnson, et al., 2015). Es
preciso considerar que además del posible aumento del porcentaje de
espermatozoides con el ADN dañado, la influencia negativa de la edad puede
determinar un incremento de alteraciones genéticas en la descendencia como, por
ejemplo, en la tasa de aneuploidías (Sartorius et al., 2010).
Se desconoce exactamente el impacto del incremento de la edad paterna en la
integridad del ADN espermático y, aunque se trata de un elemento muy presente en la
investigación de la fertilidad masculina, se necesitan más estudios al respecto. Para
evitar sesgos muestrales, se debería ampliar el muestreo, evitando ceñirse a pacientes
143
DISCUSIÓN
que provengan de las consultas de esterilidad o de andrología, aumentando el tamaño
de las muestras e incluyendo en ella pacientes de edades avanzadas.
A la vista de nuestros resultados y coincidiendo los resultados obtenidos por la
mayor parte de los investigadores, sería conveniente proponer a los pacientes de edad
avanzada, independientemente de que tengan los parámetros seminales normales o
no, la realización de una prueba de fragmentación como complemento al
seminograma y como parte de la evaluación de la pareja. Si bien la edad límite del
varón para la solicitud de esta prueba no está claramente establecida, su realización se
considera en protocolos de estudio de fallo de implantación, incluso ante
seminogramas normales. En los programas de ovodonación, en los que la edad media
de las parejas es más avanzada y especialmente ante un ciclo fallido, muchos centros
recomiendan el estudio de la fragmentación del ADN para descartar la interferencia de
un factor masculino a menudo inadvertido.
2.3. FRAGMENTACIÓN BASAL Y TABAQUISMO
Al análisis del efecto del tabaco sobre los parámetros clásicos del seminograma
se ha añadido el estudio de cómo puede verseafectada la fragmentación del ADN. Para
la mayoría de los estudios, el tabaco tiene un efecto perjudicial tanto en los
parámetros seminales clásicos, como se ha relatado antes, como en la integridad del
ADN del espermatozoide (Tabla 13). Se han descrito efectos perjudiciales sobre la
motilidad del esperma, la fragmentación del ADN y se han correlacionado
directamente con la cantidad de cigarrillos y la duración del hábito, incluso en hombres
fértiles (Taha et al., 2012). Otros estudios, a pesar de encontrar diferencias en el nivel
de fragmentación entre fumadores y no fumadores, no aprecian relación con el nivel
de consumo (Caserta et al., 2013).
Aunque todavía se desconocen los mecanismos exactos mediante los cuales los
componentes del humo del tabaco afectan a la espermatogénesis, se conoce que
produce alteraciones en la producción de hormonas en los testículos, aumenta la
concentración de radicales libres en el testículo yaumenta el estrés oxidativo en el
tracto reproductivo masculino. Este estrés oxidativo se podría traducir, a su vez, en la
144
DISCUSIÓN
inducción de altos niveles de daño oxidativo del ADN en los espermatozoides (Aitken,
2014). La nicotina y otros agentes oxidantes pueden producir un aumento de
la fragmentación del ADN contenido en la cabeza del espermatozoide y una mayor
muerte celular perjudicando así la calidad de los gametos masculinos, que puede
también tener un impacto negativo en los resultados de las TRA. Se han desarrollado
estudios para intentar comprender de qué manera concreta el tabaco altera a la
cromatina del espermatozoide. Hay autores que encuentran una alteración en la
relación de histonas y protaminas en un número mayor de espermatozoides en el caso
de varones fumadores, lo que podría, en parte, explicar el efecto nocivo del tabaco
sobre los parámetros seminales y la fragmentación del ADN espermático Simon et
al.,2011; Hamad et al., 2014).Algunos autores encuentran más fragmentación en
fumadores que en no fumadores pero sin diferencias suficientes como para hablar de
correlación entre estas variables (Saleh et al., 2202b). Otros autores no han detectado
que el tabaco tenga ningún efecto, no encuentran diferencias ni entre fumadores y no
fumadores, ni tampoco entre los que fuman más o menos; llegando a encontrar
incluso tasas mayores de fragmentación en los varones no fumadores (Sergerie et al.,
2000). Los resultados obtenidos en este trabajo coinciden con los encontrados por
Sergerie, detectando que los pacientes que fuman tienen fragmentaciones basales
inferiores en relación a las que se aprecian en los no fumadores, no siendo estas
diferencias estadísticamente significativas.
A pesar de que determinar cómo afecta el tabaco a la calidad seminal, en
general, y conocer los mecanismos exactos implicados, está todavía en vías de
investigación, todos los datos sugieren que los componentes tóxicos del tabaco son
perjudiciales y se traducen en una reducción de los niveles hormonales y de los
parámetros seminales, más o menos importantes y acusadas. Se desconoce
igualmente si al dejar de fumar se recupera o no la calidad seminal, ni cuánto tiempo
es necesario para recuperarla, ni tampoco el efecto que tiene el humo sobre la calidad
seminal en el caso de los fumadores pasivos.
Aunque las sucesivas campañas han disminuido la incidencia del consumo,
sigue siendo necesario asesorar a todos los pacientes que acuden a las unidades de
145
DISCUSIÓN
reproducción asistida sobre la necesidad de evitar la exposición al tabaco antes de que
se vayan a someter a un tratamiento de fertilidad, lo que indudablemente mejorará su
estado de salud general, probablemente se traducirá en una mejoría de su calidad
seminal y contribuirá aumentar sus posibilidades de tener descendencia (Al‑Turki,
2015).
3. FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICOTRAS EL PROCESAMIENTO MEDIANTE
SWIM-UP
Las técnicas de procesamiento son imprescindibles para poder utilizar las
muestras seminales en las TRA. Estas técnicas eliminan el plasma seminal, los
espermatozoides inmóviles y otras células presentes en la muestra, como los
leucocitos, permitiendo aislar la fracción que contiene los espermatozoides con mejor
movilidad y morfología.
En los TRA, en general, habría varias causas por lasque el nivel de
fragmentación en el momento de la fecundación debería ser, por lo general, mucho
más alto que el detectado en el momento de la eyaculación. Las manipulaciones que
implica el procesamiento de las muestras podrían afectar negativamente a la calidad
de las mismas. Se ha descrito un deterioro de la integridad de la cromatina nuclear
como consecuencia de los procesos de centrifugación que, por otra parte, son
indispensables para realizar cualquiera de las técnicas de procesamiento. La
centrifugación, unido a la coexistencia, durante su procesamiento, de espermatozoides
con el ADN intacto con espermatozoides inmaduros provocaría un aumento en los
niveles de ROS producidos por estos últimos que afectarían negativamente al resto
alterando la integridad de la cromatina e induciendo fragmentación en el ADN
espermático (Ollero et al., 2001). Se ha observado también una dinámica de
fragmentación asociada al tiempo además de un incremento progresivo en la intensidad del daño que sufre el espermatozoide cuando se incuba a 37°C durante un
período prolongado (Nabi et al., 2014).
Puesto que la preparación y manipulación de la muestra es imprescindible para
su posterior utilización en cualquiera de las TRA, es fundamental reducir al máximo el
146
DISCUSIÓN
tiempo de procesamiento de las muestras de semen para minimizar la interacción
entre los espermatozoides con ADN dañado y no dañado y dado que el tiempo
repercute negativamente en la fragmentación (Caballero et al., 2008). En concreto, el
tiempo de incubación a 37°C debe mantenerse por debajo de las 2 horas (Nabi et al.,
2014).
Teniendo en cuenta que los niveles de fragmentación de una muestra pueden
variar desde el momento de su evaluación hasta el momento de su utilización en la
técnica de TRA, coincidimos con otros autores que proponen el estudio del daño en el
ADN espermático justo en el momento en el que se vaya a realizar la TRA, no antes,
para así conocer los valores reales del daño que tiene la muestra en el momento más
cercano posible a la fecundación. Si se realizase siempre en ese momento, se
conseguiría unificar los resultados entre diferentes laboratorios a la vez que aportar
datos más precisos para analizar el impacto negativo de la fragmentación del ADN
espermático (Núñez-Calonge et al., 2012).
Todas las muestras de este estudio han sido utilizadas en un plazo inferior a 60
minutos desde su procesamiento, intervalo en el cual se realizó el nuevo test de
fragmentación, determinándose el porcentaje de espermatozoides con el ADN
fragmentado, que es el parámetro que hemos denominado fragmentación post swimup.
Todas las muestras analizadas en este estudio fueron sometidas a la técnica
swim-up de procesamiento espermático.Según los resultados de este estudio, la
técnica de swim-up provoca, además de lo indicado al comienzo de este apartado, una
reducción en los porcentajes de fragmentación de las muestras comparándolos con los
que encontramos en las mismas muestras antes de su preparación (fragmentación
basal). Esto indicaría que la técnica de procesamiento produce un aumento de la
calidad de la muestra en cuanto a la fragmentación del ADN, aun cuando la técnica se
estableció en su origen para aumentar la calidad de las muestras en parámetros
relativos a la movilidad y la morfología espermática, está concebida para seleccionar
una muestra enriquecida en espermatozoides con movilidad progresiva mayor y
mejores porcentajes de morfología normal (Mortimer, 1994).
147
DISCUSIÓN
Numerosos autores coinciden en que es el procesamiento de la muestra en sí lo
que disminuye la fragmentación y no depende de la técnica elegida para realizarlo. Hay
autores que han comparado las dos técnicas más utilizadas, el swim-up y los gradientes
de densidad. Algunos de ellos se decantan por una de las dos técnicas encontrando un
porcentaje significativamente mayor de espermatozoides con la cromatina intacta tras
procesar la muestra mediante swim-up con respecto a hacerlo utilizando gradientes de
densidad (Zini et al., 2000). Otros autores no encuentran diferencias en los resultados
que obtienen y observan que ambas técnicas producen una reducción significativa en
los niveles de fragmentación (Jackson et al., 2010;Jayaraman et al., 2012). Este último
grupo incluso analiza una combinación de las dos técnicas y, comparando los tres
métodos, comprueban que cualquiera de ellos consigue un enriquecimiento de
espermatozoides con la cromatina intacta (Jayaraman et al., 2012). A pesar de ciertas
publicaciones discrepantes, la mayoría de los autores coinciden en la mejoría
observada en cuanto al porcentaje de fragmentación tras el procesamiento de la
muestra, tal como ocurre en nuestro caso.
No se ha encontrado bibliografía relevante referente a la magnitud de la
variación de la fragmentación tras el procesamiento de la muestra.
3.1. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y FRAGMENTACIÓN BASAL
La disminución observada, en nuestros pacientes, en el daño de la cromatina de
los espermatozoides post swim-up se produce tanto en las muestras de varones que
tienen un porcentaje de fragmentación no patológico (<30%) (reducción de 11 puntos
porcentuales) como en aquellas en las que es patológico (≥30%) (reducciónde 47
puntos porcentuales). Estos resultados muestran queel swim-up mejora el porcentaje
de espermatozoides con el ADN intacto, en general, para cualquier valor de
fragmentación inicial de la muestra (Fig. 25). La mayor parte de las publicaciones
coinciden con nuestros datos y relatan una disminución en la fragmentación más o
menos elevada como consecuencia del procesamiento de la muestra (Tomlinson et al.,
2001; Bungum et al., 2008; Wang et al., 2014). Los resultados obtenidos forman parte
de lo esperado ya que las técnicas de preparación espermática tienen como objetivo
148
DISCUSIÓN
eliminar, además del plasma seminal, otros tipos celulares y componentes presentes
en la muestra en fresco así como los espermatozoides que tienen peor motilidad y los
inmóviles. Este tipo de espermatozoides suele presentar el ADN más fragmentado (de
Lamirande and Gagnon, 1995) con lo cual es lógico que al eliminarlos se obtenga una
muestra con mayor concentración de espermatozoides con el ADN intacto que es la
que se va a utilizar para la TRA elegida.
El valor medio de fragmentación post swim-upde nuestra poblaciónfue 10,03 ±
1,83 [0,10 - 8,90] % de espermatozoides fragmentados, es decir,
22 puntos
porcentuales menor que el valor medio de la fragmentación basal(31,83 ± 2,97 [5,50 95,20] % de espermatozoides fragmentados), unas diferencias muy significativas (P=
0,00)que suponen una reducción de más de 2/3, de manera que el 90% de los
pacientes tuvieronvalores de fragmentación post swim-up inferiores al 30%, mientras
que en el caso de la fragmentación basal, sólo el 50% se encontraba por debajo de
dicho umbral (Fig. 24). Nuestros resultados demuestran que el procesamiento de las
muestras mejora la calidad espermática de las mismas no sólo a nivel de la movilidad y
morfología, que era el resultado esperado, sino también a nivel de la fragmentación
del ADN espermático(Tabla 25).
El porcentaje medio de fragmentación post swim-up (6,41 ± 0,50) fue
significativamente inferior en las muestras que partían de una fragmentación basal
inferior al 30% que en aquellas que la tenían igual o superior (13,83 ± 0,51),
circunstancia que cabría esperar al partirse de muestras menos y más fragmentadas
respectivamente (P= 0,04) (Tabla 26). Los análisis de correlación entre ambos tipos de
fragmentaciones del ADN espermático estableció fuerte correlación positiva entre
ambos parámetros (r= 0,463, P= 0,02) (Tabla 27).Analizando lavariación de la
fragmentación respecto a la basal se encontró quela magnitud de la variación que
experimenta la fragmentación en los varones cuya fragmentación basal era menor de
30% (11,4 p.p.), es significativamente inferior a la de aquellos cuya fragmentación
basal era mayor o igual a 30% (32,8 p.p.) (P= 0,00)(Tabla 33). Esto significaría que el
nivel de fragmentación descendió significativamente más en el grupo de muestras más
fragmentadas basalmente.El análisis de correlación estableció una correlación positiva
149
DISCUSIÓN
altamente significativa entre los valores de variación de fragmentación y sus
resrespectivos porcentajes de fragmentación basal para cada paciente (P= 0,000)
(Tabla 34 y Fig. 29). Sin embargo, se observa en la Tabla 34, que no se estableció
correlación significativa de la variación, en disminución de la fragmentación, con su
resultado final, es decir con la fragmentación post swim-up.
Tomando en su conjunto todos estos hechos, puede decirse que el
procesamiento de la muestra seminal es más efectivo en mejorar la calidad
espermática, no sólo para seleccionar motilidad y morfología, sino también disminuir
el porcentaje de espermatozoides con fragmentación de su ADN. Esta disminución es
más acusada en aquellos pacientes que presentaron mayores porcentajes de
fragmentación basal, de manera que, finalmente, el procesamiento acerca en sus
niveles de fragmentación a ambos tipos de pacientes, aquellos que partían de
porcentajes de fragmentación basal no patológicos (< 30%) y aquellos pacientes que
eran patológicos para ese parámetro (≥ 30%). Esto podría ser debido a que, cuantos
más espermatozoides con el ADN dañado tenga la muestra, más posibilidades hay de
que la técnica los elimine.
Al mismo
tiempo, revisando los datosemanados de laFigura 27, se
observandescensos en la fragmentación de hasta 66 puntos porcentuales en el mejor
de los casos (muestra 23, Fig. 27). Únicamente en dos individuos la fragmentación
aumentó, siendo en ambos un incremento poco importante (muestras 6 y 20, Fig. 27),
y existe un tercer caso en el que la mejora es mínima (muestra 9, Fig. 27).
En la muestra para la que el swim-up tiene peor impacto(muestra 20, Fig. 27),
se produce un aumento de 6,5 p.p., pasando de tener un valor de fragmentación
considerado no patológico (21% > 30%) antes del procesamiento a encontrarse entre
las muestras de peor valor tras el procesamiento (27%). En el otro caso, el aumento no
llega a un 1 p.p. pero a pesar de que presentaba un valor basal bastante favorable
(16%), y el cambio es mínimo, el valor post swim-up (17%) se encuentra por encima de
la media. La muestra en la que la disminución es menor, tan sólo 0,2 p.p. pasa de un
valor de fragmentación basal muy favorable (10,3%) a un valor de fragmentación post
swim-up ligeramente por encima de la media (10,1%). Esos tres casos pertenecían al
150
DISCUSIÓN
subgrupo de fragmentaciones basales menores del 30%, mientras en el otro grupo
había numerosos pacientes que, partiendo de valores muy elevados de fragmentación
basal (>30%), estos se reducen, tras el procesamiento, hasta niveles que se encuentran
por debajo del valor medio de fragmentación postswim-up. Todos estos datos también
corroborarían lo referido acerca de que el procesamiento afecta más acusadamente,
disminuyendo los niveles de fragmentación, a las muestras más fragmentadas
basalmente.
3.2. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN, EDAD Y TABACO
Una vez comprobada la relación entre la fragmentación post swim-up y la
fragmentación basal y analizado también el efecto positivo que la variación de la
fragmentación, producida por el procesamiento, tiene sobre la fragmentación basal de
la muestra (Fig. 25),se ha analizado el alcance de estos parámetros en relación con
otras características de los varones de la serie.
Se encontraron ligeras diferencias en los porcentajes medios de fragmentación
del ADN espermático post swim-up en los varones menores de 40 años respecto a los
que tienen 40 años o más, siendo la fragmentación más alta en estos, pero sin
significación estadística (Tabla20). Al analizar globalmente los porcentajes de
fragmentación post swim-up de cada paciente, en relación con su edad, no existió
correlación lineal estadísticamente significativa entre ambos parámetros (r = -0,045, P
= 0,781).
Sin embargo, en relación con la variación de la fragmentación, en el subgrupo
de varones con edad < 40 años, la variación en el porcentaje de fragmentación del ADN
espermático producida por el swim-up, es muy inferior a la observada en el subgrupo
de edad ≥ 40 años (casi 10 puntos menos). Los valores de partida de porcentajes de
fragmentación de los varones jóvenes eran significativamente mejores (28,28 ± 0,45
frente a 38,69 ± 0,60 en los mayores de 40 años; P=0,01) (Tabla 28)).
Analizando la variación de la fragmentación en relación con la condición de
fumador, apesar de ser más efectivo el swim-up para descartar espermatozoides con el
151
DISCUSIÓN
ADN fragmentado en los no fumadores las diferencias no son estadísticamente
significativas con respecto al otro grupo (Tabla 29.
3.3. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y CARACTERÍSTICAS SEMINALES
En relación a la condición de normozoospermia, se establece un descenso en
los porcentajes de fragmentación que parecerían indicar que la técnica de swim-up es
ligeramente menos efectiva en la eliminación de espermatozoides con el ADN
fragmentado en el caso de que las muestras sean normales respecto a las que no lo
son. Pero hay que tener en cuenta que en las muestras normales, se partía de una
fragmentación basal ligeramente menor, aunque no puede descartarse un efecto
correlacionado a lo que ocurre con respecto a la fragmentación basal (Tabla 30).
Del mismo modo, las variaciones en los porcentajes medios de fragmentación
espermática en varones con las diferentes alteraciones en los parámetros seminales en
comparación con las muestras normales, no arrojaron diferencias significativas para
ninguna de las alteraciones seminales (Tabla 31). De esto se puede concluir que el
procedimiento del swim-up es igualmente efectivo, a la hora de eliminar
fragmentación del ADN, en el caso de utilizarlo para procesar muestras alteradas que
las que no lo son.
En referencia al REM, la variación de la fragmentación fue más acusada para los
los dos grupos con menor recuento de espermatozoide móviles, mientras que
disminuyó para el grupo de REM>5, no alcanzando las diferencias entre grupos
significación estadística(Tabla 32). Hay que tener en cuenta que para el grupo con
mayor REM se partía de una media de fragmentación basal por debajo del 30%, y no
era el caso para los otros dos grupos de pacientes, con niveles menores de REM, en los
que se partía de porcentajes medios de fragmentación basal por encima del 30%. Esta
tendencia a encontrar mayor recuperación de semen normal cuanto peor era la
calidad de partida, concuerda con lo encontrado entre los subgrupos de fragmentación
basal y post swim-up.
152
DISCUSIÓN
4. FACTOR MASCULINO EN LOS RESULTADOS DE LOS CICLOS DE ICSI
Los parámetros utilizados en nuestro estudio para valorar el resultado de los
ciclos, son: tasa de fecundación, calidad embrionaria, tasa de implantación y gestación.
Según los resultados de la bibliografía, la relación entre fragmentación y éxito
en TRA va a depender de la técnica reproductiva utilizada. Se estableceuna relación
negativa entre el elevado porcentaje de fragmentación y el embarazo natural o en
elconseguido mediante inseminación artificial (IA) (Duran et al., 2002) que no se
mantiene cuando se trata de pacientes sometidas a fecundación in vitro (FIV)o a ICSI
(Larson-Cook et al., 2003).De manera que cuanto más selectiva para el factor
masculino es la técnica, menor es el efecto perjudicial de una elevada fragmentación.
En nuestra serie, todas las pacientes fueron sometidas a la técnica de inyección
intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), procedimiento en que cada
espermatozoide es seleccionado individualmente.
4.1. RESULTADOS DEL CICLO ICSI Y EDAD DEL VARÓN
Varios estudios determinan que la implantación, la calidad de los embriones y
el éxito de la gestación son independientes de la edad del varón (Bellver et al., 2008) o
que no existen diferencias en cuanto a los resultados del ciclo en función de la edad
(Gallardo et al., 1996). Nuestros resultados están en consonancia con estos autores, en
cuanto a la independencia estadística de la implantación, la calidad embrionaria y la
gestación respecto a la edad de los varones, aunque sí detectamos diferencias, no
estadísticamente significativas, para los tres parámetros entre ambos grupos de edad,
a favor del grupo de varones más jóvenes. La tasa media de fecundación, sin embargo,
sí es significativamente mayor para varones menores de 40 años, con diferencias de 15
puntos entre ambos grupos de edad (P= 0,049) (Tabla 35). Se observó una tendencia
similarpara la tasa de implantación, con casi 14 puntos de diferencia entre los varones
de mayor y menor edad, aunque sin significaciónestadística (Tabla 35).Tampoco se
encontraron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a calidad
embrionaria y gestación en relación con los dos grupos de edad del varón, pero los
153
DISCUSIÓN
datos también evidencian tendencias en el mismo sentido. El porcentaje de ciclos en
los que se obtienen embriones G1 y G2 es casi 10 puntos mayor en el grupo de varones
de menor edad (74,1% frente a 64,3%) y el porcentaje de gestaciones obtenidas es
mucho mayor, 49 puntos, en el grupo de los varones más jóvenes (Tabla 36 y Fig. 30).
4.2. RESULTADOS DEL CICLO ICSI Y CARACTERÍSTICAS SEMINALES
No se encontró correlación estadísticamente significativa entre la tasa de
fecundación y las variables de la muestra seminal analizadas, volumen, concentración,
motilidad, morfología y el REM (Tabla 41). Los resultados de nuestro estudio indican
que la calidad embrionaria es independiente de la existencia de cualquier alteración en
el seminograma y del REM (Tabla 39). La tasa de implantación presenta correlación
lineal positiva estadísticamente significativa con el porcentaje de formas normales (P=
0,014), no existe significación estadística en la correlación con las otras variables,
volumen, concentración, motilidad y REM (Tabla 41). La tasa de gestación y la
condición de normozoospermia, se comportan como variables positivamente
dependientes (P= 0,03). El 16% de las parejas con muestras teratozoospérmicas, se
embarazan, frente al 53% en aquellas con muestras consideradas morfológicamente
normales, siendo esta diferencia estadísticamente significativa. Las diferencias
encontradas entre la existencia o no de oligozoospermia y astenozoospermia, en
cuanto a gestación, no son estadísticamente significativas, lo mismo sucede con las
diferencias entre los tres grupos de REM. La alteración en la morfología es la única que
afecta negativamente, de forma significativa, tanto a la tasa de implantación como a la
de gestación (P= 0,04) (Tabla 40).
Estas deducciones van en la misma línea que otras investigaciones que indican
que los varones con menor porcentaje de gametos morfológicamenteanormales
tienen menor probabilidad de producir embarazo natural (Menkveldet al., 2001) o
cuando sus parejas son tratadas con inseminación (Van Waartet al., 2001) o
fecundación in vitro (Krugeret al., 1988). Algunos investigaciones, por el contrario,
concluyen que los resultados del embarazo son independientes de los parámetros
seminales (Larson-Cook et al., 2003).
154
DISCUSIÓN
4.3. RESULTADOS DEL CICLO ICSI Y FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO
Se analizó si la fragmentación basal de las muestras seminales afectaba a los
resultados del ciclo. Según los resultados obtenidos, no encontramos ninguna relación
entre los valores de fragmentación basal y ninguno de los parámetros con los que
evaluamos el resultado del ciclo de ICSI. Muestras con valores de fragmentación basal
superiores al 30% son capaces de conseguir tasas de fertilización (Tabla 42), calidades
embrionarias (Tabla 43), tasas de embarazo clínico (Tabla 45) y de implantación (Tabla
44) semejantes a las muestras que con niveles de fragmentación inferiores.
Este fenómeno ya había sido descrito en la literatura, donde se describe que la
fragmentación de ADN basal no se correlaciona con los resultados del ciclo de ICSI
(Anifandis et al., 2014; Palermo et al., 2014; Wang et al., 2014; Zhang et al., 2014; Zhao
et al., 2014; Sánchez Toledo et al., 2013; Yilmaz, et al., 2010; Vélez de la Calle et al.,
2008; Zini et al., 2005). Sin embargo, en determinados casos, sí que se ha establecido
una correlación negativa entre la fragmentación basal, la tasa de fecundación, la
calidad del embrión y la tasa de gestación también en ciclos de ICSI (Simon et al.,
2011).
Las tasas de fragmentación superiores al 30% han sido relacionadas incluso con
el riesgo de aborto, indicando que un porcentaje de espermatozoides con ADN
fragmentado superior al 30 % reduce o en algunos casos elimina la posibilidad de
conseguir en embarazo a término (Evenson and Wixon, 2008). En nuestro estudio, no
es posible extraer conclusiones relativas al aborto puesto que sólo uno de los
embarazos no llegó a término.
Una vez comprobado el efecto positivo que tiene el procesamiento
espermático mediante la técnica de swim-up sobre los niveles de fragmentación de las
muestras, se analizó la posible relación entre los nuevos valores de fragmentación post
swim-up y los resultados del ciclo. Nuestros resultados muestran que el porcentaje de
fragmentación post swim-up es independiente de los resultados que obtenemos en el
ciclo de ICSI. Valores más bajos de fragmentación post swim-up no se traducen en
mejores tasas de fecundación (r= 0,180, P= 0,26), mejor calidad embrionaria (Tabla
47), mejores tasas de implantación (r= 0,035, P= 0,84) o en relación con la consecución
155
DISCUSIÓN
de embarazo (Tabla 48). Esta ausencia de relación coincide con lo que encuentran
otros autores (Larson et al., 2000; Bungum et al., 2007). Otras investigaciones, por el
contrario, concluyen que sí es posible predecir resultados, como la calidad del embrión
y la tasa de embarazo a partir de los valores de fragmentación post swim-up (Gosálvez
et al., 2013; Avendaño et al., 2010; Zhang et al., 2008).
Una
primera
justificación
a
la independencia
encontrada entre
la
fragmentación basal y los resultados del ciclo, podría serla elevada disminución (hasta
66 p.p., con una media de 22 p.p) en el porcentaje de fragmentacióntras el
procesamiento de las muestrasque se ha expuesto previamente, provoca que los
valores finales sean similares entre sí, lo que anula la importancia de los valores
basales.A estas dos explicaciones, habría que añadir que, la mayoría de las muestras, a
pesar de tener valores más o menos elevados de fragmentación basal ven reducidos
los niveles de daño a niveles mucho más bajos al analizar la muestra una vez
procesada, lo que explicaría que no se encuentre relación entre el porcentaje de
fragmentación basal y los resultados de ICSI. En resumen, la similitud de los valores
finales entre sí y el bajo valor de estos, constituyen las posibles causas que justificarían
que el nivel de fragmentación basaltenga poco valor pronóstico en términos de
fecundación, calidad embrionaria, implantación y embarazo.
La fragmentación post swim-up indica el porcentaje real de espermatozoides
con el ADN fragmentado presente en la muestra que se va a utilizar para la TRA.
Parece más sensato utilizar este valor para predecir el éxito en las técnicas de
reproducción asistida. Sin embargo, al analizar el parámetro fragmentación post swimup tampoco encontramos relación ni con la tasa de fecundación, ni con la calidad
embrionaria, ni con las tasas implantación y gestación.
El procesamiento elimina un porcentaje elevado de los espermatozoides con el
ADN fragmentado, no la totalidad de ellos. El tipo y la magnitud de deterioro que
presenta el ADN espermático, además de variar entre individuos, también lo hace
entre espermatozoides de una misma muestra.En la técnica ICSI, se selecciona el mejor
espermatozoide en términos de morfología y motilidad pero se desconoce el estado de
su ADN. Será más probable haber escogido un espermatozoide con el ADN íntegro en
156
DISCUSIÓN
una muestra que contenga un porcentaje más elevado de ellos. El estudio de la
fragmentación post swim-up, determinó que los valores no varían mucho entre las
diferentes muestras, con lo que tendríamosprobabilidades similares en todas ellas de
escoger un espermatozoide con el ADN dañado/integro. De ahí que no se encuentre
relación entre los valores de fragmentación post swim-up y los parámetros indicadores
de éxito del ciclo.
El genoma nuclear humano está compuesto por ADN no codificante y ADN
codificante. La parte codificante la constituyen los exones y corresponde tan sólo al
1,5% del total.Esta gran diferencia entre la cantidad de ADN codificante y no
codificante provoca, por sí sola, que la mayor parte de la roturas sucedan en las
secuencias no codificantes, lo que podría ser mejor tolerado y reparado(Gosálvez
Berenguer et al., 2008).
Aunque tanto en nuestro estudio como en otras investigaciones, no se infiere
relación entre la fragmentación del ADN espermático y el éxito de las TRA, existen
diferentes métodos que permiten mejorarla. Algunas causas inductoras de
fragmentación basal en el ADN espermático, como el daño producido por los radicales
libres, puede disminuirse contratamientos y dietas ricas en nutrientes con propiedades
antioxidantes (Wright et al., 2014). La reducción del periodo de abstinencia puede
mejorar también los valores de fragmentación basal (Gosálvez et al., 2011). Se han
desarrollado también procedimientos de laboratorio, como las columnas MACS
(magnetic activated cell sorting), capaces de eliminar de la muestra procesada
espermatozoides apoptóticos (Gil et al., 2013). Otra posible alternativa, en casos de
varones con porcentajes de fragmentación basal elevada, es la utilización de
espermatozoides de testículo, que tienen un grado de fragmentación menor debido a
que parte del daño se origina por oxidación una vez que han salido del testículo
(González-Marín et al., 2012).
Además del estudio de la fragmentación, otras técnicas han suscitado,en las
últimas décadas, gran interés para estudiar la calidad espermática entre los
profesionales de la reproducción asistida. Por ejemplo, estudio de meiosis que permite
descartar anomalías en la meiosis espermática, estudio de aneuploidías (FISH y CGH157
DISCUSIÓN
array), microscopía electrónica de barrido para identificar anomalías morfológicas
indetectables con microscopía óptica convencional. Hasta la fecha ningún método ha
resultado mejor que otro para el estudio del factor masculino.
Finalmente, para valorar en su conjunto el factor masculino en relación con la
obtención de embarazo, se realizó un test de regresión logística multivariante con
edad, tipos de anomalías seminales, porcentajes de fragmentación basal y post swimup. Los resultados de este análisis evidenciaron que el fracaso en la consecución de
embarazo se asoció significativamente a varones oligozoospérmicos (P= 0,005), lo que
confirma los resultados obtenidos de χ². También se asoció significativamente el
embarazo a varones teratozoospérmicos (P= 0,012), de forma contraria a lo que
ocurría en el análisis univariado.
5. FACTOR FEMENINO EN LOS RESULTADOS DE CICLOS DE ICSI
Aunque en este estudio no se encontró una diferencia estadísticamente
significativa de las tasa de fecundación e implantación entre los dos grupos de edad de
las mujeres establecidos, la tasa de fecundación disminuye a la mitad en el grupo de
mayor edad y las tres mujeres con fallo de fecundación pertenecen también a este
grupo de mujeres > 35 años (Tabla 37).Lo mismo sucedió con respecto a la existencia
de embriones de buena calidad y el embarazo (Tabla 38). Tal como ocurre con las
edades de los varones, en ambas variables se observó la misma tendencia de valores
negativos de coeficientes de correlación, de forma que tanto el porcentaje de mujeres
con embriones de buena calidad como el de mujeres gestantes, se encontraron en las
pacientes más jóvenes. En el análisis de regresión logística multivariante realizado
(entre la consecución de embarazo y el número de ovocitos, el número de embriones
G1+G2, el número de embriones transferidos y la edad de la mujer), sí encontramos
asociación significativa entre la edad de la mujer y tanto el éxito de embarazo comoel
número de embriones G1+G2. Del mismo modo, varios autores encuentran mejores
valores de calidad embrionaria y tasa de embarazo en mujeres más jóvenes sometidas
a ciclos de ICSI respecto a las de mayor edad (Ménézo and Barak, 2000; Brucker et al.,
2014). En contra de la creencia general, está comprobado que las TRA, en general, no
158
DISCUSIÓN
compensan totalmente el efecto negativo de la edad de la mujer sobre la fertilidad
(Leridon, 2004).El factor ovocitario ha de ser tenido en cuenta a la hora de valorar
estos resultados del ciclo de FIV. No sólo porque, como veremos, tiene la capacidad de
reparar el DNA espermático, sino porque los primeros días de vida embrionaria
dependen fundamentalmente del ovocito que aportará todos los orgánulos necesarios
para su supervivencia y desarrollo. Hasta el 4º o 5º día no se activa el material genético
paterno y empieza a tener mayor relevancia el factor masculino.
El ovocito presenta una capacidad de reparación del daño en el ADN del
espermatozoide,una vez que este ha entrado en su citoplasma, que influye en la
fertilidad de la pareja y que depende de tres factores: la cuantía de daño, el tipo de
daño y la calidad del ovocito.Hay autores que aseguran que la tasa de fecundación va a
depender más de la calidad del ovocito que de la calidad del espermatozoide
(Meseguer et al., 2011).
Parece que los ovocitos de buena calidad conseguirían neutralizar el impacto
negativo de la fragmentación del ADN sobre la probabilidad de obtener un
embarazo.Uno de los factores decisivosa la hora de relacionar la fragmentación del
ADN espermático con los resultados del ciclo de reproducción asistida, es la diferencia
que puede existir entre la población de mujeres en cuanto a su capacidad para reparar
estas roturas del ADN.
Para intentar minimizar el error o la confusión que puede introducir en este
estudio las diferencias que existen entre las condiciones de las pacientes hemos
dividido la población en dos grupos, mujeres de buen o de mal pronóstico. El grupo de
mujeres de buen pronóstico está formado por aquellas pacientes que tenían una edad
menor de 38 años, un recuento de folículos antrales de más de 7, una FSH basa < 10
mUI/ml. o que habían tenido resultados desfavorables en ciclos previos. El grupo de
mujeres de mal pronóstico lo constituyen aquellas que no cumplían dichos criterios.No
se siguieron de forma estricta los criterios de Bolonia (Ferraretti et al., 2011)puesto
que el estudio se hizo antes de la aparición de dicho consenso y porque se incluyen
también pacientes potencialmente bajas respondedoras. Este segundo grupo fue
estimulado con dosis altas de gonadotropinas (FSH y acción LH ) en protocolo con
159
DISCUSIÓN
antagonistas GnRH. De nuestra muestra, 23 (56%) fueron incluidas en esta categoría
de peor pronóstico.
Los resultados obtenidos determinan que tanto la tasa de fecundación, como la
calidad embrionaria, la tasa de implantación o el embarazo, son más elevadas en el
grupo de mujeres con buen pronóstico, no siendo las diferencias entre ambos grupos
estadísticamente significativas para ninguna de las cuatro variables (Tablas 51-54).
Estas diferencias son más acusadas en la tasa de implantación, donde las mujeres de
buen pronóstico, tuvieron casi 12 p.p. más de tasa de implantación que las de mal
pronóstico.
El tamaño muestral de nuestro estudio no permite hacer un análisis
estratificado en función de la fragmentación de los resultados del ciclo en los dos
grupos de mujeres.
Dado que el factor más determinante de la calidad ovocitaria es la edad, es
posibles que la capacidad de reparación de los ovocitos disminuya de forma
significativa con la edad materna. Se han obtenido resultados mejores en pacientes
que han utilizado ovocitos de donantes, que son mujeres jóvenes con ovocitos de
mejor calidad que teóricamente repararían mejor (Meseguer et al., 2011).
160
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
1.La evaluación de los parámetros clásicos del seminograma no permite predecir el grado
de integridad del ADN espermático, siendo este un factor importanteparadeterminar
la calidad del material genético masculino. Por lo tanto, es recomendable incluir el
estudio de fragmentación del ADN espermático, como complemento al seminograma,
en el diagnóstico de la infertilidad del varón.
2. La técnica swim-up de procesamiento de muestras seminales, además de recuperar los
espermatozoides con mejor movilidad y morfología, enriquece la muestra en
espermatozoides con el ADN íntegro, disminuyendo drásticamente los porcentajes de
fragmentación del ADN espermático. La evaluación de la fragmentación, por tanto,
debería realizarse después del procesamiento de las muestras.
3. La disminución de los niveles de fragmentación del ADN espermático tras el swim-up,
es proporcionalmente mayor cuanto mayor sea el porcentaje de fragmentación basal
del individuo, unificando en gran medida los valores finales de fragmentación entre las
diferentes muestras.
4. En la valoración de los ciclos de ICSI en relación con las características del varón y los
parámetros seminales, se ha encontrado que la edad y la condición de
normozoospermia se relacionan con los resultados de este tratamiento.
5. Los bajos niveles de fragmentación del ADN espermático tras el procesamiento
mediante swim-up, junto con la gran capacidad de reparación del ADN que posee el
ovocito, hacen que la fragmentación del ADN espermático sea un factor independiente
del éxito de los tratamientos de reproducción asistida mediante ICSI.
163
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ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
ADN: Ácido desoxirribonucleico, deoxyribonucleic acid (DNA)
NA: Naranja de acridina, acridine orange (AO)
ARN: Ácido ribonucleico, ribonucleic acid (RNA)
ADNm: Ácido desoxirribonucleico mitocondrial
ARNt: Ácido ribonucleico transferente
ASEBIR:Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción
ATP: Adenosín trifosfato, trifosfato de adenosina,adenosine triphosphate
AUC: Área bajo la curva, area under the curve
cm: Centímetro
CMA3: Cromomicina A3
CP: Corpúsculo Polar
DAPI: 4’,6-diaminofenil-2-indol
DBD-FISH: Detección de roturas de ADN mediante hibridación in situ fluorescente; DNA
breakage detection-fluorescence in situ hybridization
DFI: Índice de fragmentación del ADN, DNA fragmentation index
DNasa: Desoxirribonucleasa
DTT: Ditiotreitol
dUTP: Dexouridina trifosfato, trifosfato de desoxiuridina, deoxyuridine triphosphate
D 0: Día de la punción folicular
D+1: Día siguiente a la punción folicular la fecundación
D+2: Segundo día tras la punción folicular la fecundación
E2: 17β extradiol
EMM: Edad media de maternidad
FIV: Fecundación in Vitro
FSH: Hormona folículo estimulante, follicle-Stimulating hormone
g: Gramo
GC: Guanina-citosina
GnRH: Hormona liberadora de gonadotropina, gonadotropin-releasing hormone
h: Hora
hCG: Gonadotropina coriónica humana, human corionic gonadotropin
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ABREVIATURAS
HCl: Ácido clorhídrico
hMG: Gonadotropina menopáusica humana, human menopausal gonadotropin
HSA: Albúmina sérica humana, human serum albumin
IA: Inseminación artificial
IAH: Inseminación artificial homóloga
IC: Intervalo de confianza
IAD:Inseminación artificial con semen de donante.
ICSI: Inyección intracitoplasmática de espermatozoides, intracytoplasmic sperm
injection (microinyección espermática)
INE: Instituto Nacional de Estadística
ISNT: marcaje por traslado de mella; in situ nick translation
IUI: inseminación intrauterina; intrauterine insemination
kb: Kilobase
LH: Hormona luteinizante, luteinizing hormone
m: Metro
MAR: Región de anclaje a la matriz, matrix attachment region
MI: Metafase I de la primera división meiótica
MII: Metafase II de la primera división meiótica
mg: Miligramo
min: Minuto
ml: Mililitro
mm: Milímetro
ng: Nanogramo
N2: Nitógeno
°C: Grado centígrado
-OH: Radical hidroxilo
OMS: Organización mundial de la salud, world health organization (WHO)
P: p-valor estadístico
pb: Pares de bases
PBS: Tampón fosfato salino, phosphate buffered saline
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ABREVIATURAS
PI: Profase de la primera división meiótica, profase I
PN: Pronúcleo
p.p.: Punto porcentual
PVP: Polivinilpirrolidona, polyvinylpyrrolidone
REM: Recuento de espermatozoides móviles
ROC: Característica operativa del receptor; receiver operating characteristic
ROS: Especies reactivas de oxígeno, reactive oxygen species
SCD: Dispersión de la cromatina espermática; sperm chromatin dispersion test (SCDt)
SCGE: Single Cell Gel Electrophoresis
SCSA: Ensayo de la estructura de la cromatina espermática; sperm chromatin structure
assay
SDF: Fragmentación del ADN espermático, sperm DNA fragmentation
SEF: Sociedad Española de Fertilidad
SPSS: Programa estadístico, Statistical package for the social sciences
TdT: Desoxinucleotidil transferasa terminal; terminal deoxynucleotidyl transferase
TNP: Proteína de transición, transition protein
TOP2B: Topoisomerasa IIβ
TRA: Técnicas de reproducción asistida
TUNEL: Marcaje del extremo libre por dUTP mediado por la desoxinucleotidil
transferasa terminal, terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick-end
labeling
UI: Unidades internacionales
VG: Vesícula germinal
ZP: Zona pelúcida
β-hCG: Subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana
μg: Microgramo
μl: Microlitro
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