asserachrom® vwf:cb - Annar Diagnóstica Import

4/ COMPOSICIÓN DEL KIT
ASSERACHROM® VWF:CB
Enzimoinmunoensayo para la determinación
de la capacidad de unión del factor von Willebrand al colágeno
–3
–3
–3
–3
–1
–3
–3
–1
–1
(REF 00239)
•
•
• Contenido del kit de 96 tests:
x 2 tiras de Reactivo 1 (Coated Strip)
viales de Reactivo 2 (Anti-VWF-Peroxidase)
viales de Reactivo 3 (TMB)
viales de Reactivo 4 (Dilution Buffer)
vial de Reactivo 5 (Washing Solution)
viales de Reactivo 6 (VWF:CB Calibrator)
viales de Reactivo 7 (VWF:CB Control)
soporte de tiras
tapa de placa
•
•
•
•
Español 6
Noviembre 2009
•
1/ UTILIZACIÓN DEL KIT
Valoración de la capacidad de unión del factor von Willebrand al colágeno
(VWF:CB) por el método ELISA.
2/ INFORMACIÓN SOBRE EL FACTOR VON WILLEBRAND
•
Enfermedad de Willebrand
La enfermedad de Willebrand es la anomalía constitucional más
frecuente de la hemostasis. Desde el punto de vista clínico, se
caracteriza principalmente por hemorragias mucosas y cutáneas (7).
Se diferencian tres grandes tipos de enfermedad de Willebrand (1, 7):
– el tipo 1 corresponde a un déficit cuantitativo de VWF; clásicamente se
consideraba el tipo más frecuente (70 a 80 % de los casos de
enfermedad de Willebrand); sin embargo, este punto es discutido en la
actualidad;
– el tipo 2 agrupa las anomalías cualitativas del VWF; en general, la
anomalía está relacionada con la estructura multimérica;
– el tipo 3 se caracteriza por la ausencia casi completa de VWF en el
plasma y en los compartimentos celulares.
Principales tipos de enfermedad de Willebrand (6, 7)
Test
Tipo 1
Tipo 2A Tipo 2B Tipo 2M Tipo 2N
Tipo 3
VWF:Ag
↓
No↓
No↓
No↓
N
No detectable
VWF:RCo*
↓
↓↓
↓ o ↓↓
↓↓
N
No detectable
VWF:RCo/
VWF:Ag
N
Disminuido
No
No
N
/
VWF:CB
↓
VWF:CB/
VWF:Ag
HMWM**
N
N
↓↓
disminuido disminuido
↓↓
Disminuido Disminuido
No
No↓
N
No detectable
N
N
/
N
No detectables
No
Ausentes ausentes disminuido
* VWF:RCo: actividad cofactor de la ristocetina del factor von Willebrand
** Multímeros de alto peso molecular
N Normal
•
•
Además, los déficits en VWF pueden estar asociados a diversos estados
clínicos (mieloma, linfoma, lupus eritematoso diseminado,
hipotiroidismo...). En estos casos se habla de enfermedad de Willebrand
adquirida (2).
Capacidad de unión del VWF al colágeno
Sólo los multímeros de VWF de alto peso molecular funcionales se
pueden unir al colágeno (3). Un valor disminuido de VWF:CB indica un
defecto cuantitativo o cualitativo de dichos multímeros. El cálculo de la
relación [VWF:CB]/[VWF:Ag] es importante para distinguir entre los tipos
2 de la enfermedad de Willebrand, los subtipos en los que existe una
pérdida de multímeros de alto peso molecular (HMWM) (4). Esta
valoración permite diferenciar entre el tipo 2A (relación
[VWF:CB]/[VWF:Ag] muy disminuida) y el tipo 2M (relación
[VWF:CB]/[VWF:Ag] normal o ligeramente disminuida).
Algunos reactivos de este kit contienen productos de origen humano y/o animal. Cuando se
ha utilizado plasma humano en la preparación de estos reactivos, se excluye previamente la
presencia del antígeno HBs, de los anticuerpos anti-HCV, anti-HIV 1 y anti-HIV 2 con los
correspondientes análisis. En el suero de cada placenta utilizada se realizan los mismos
análisis. Sin embargo, ningún test puede garantizar de manera absoluta la ausencia de
agentes infecciosos. Por eso, estos reactivos de origen biológico han de ser manipulados
con las precauciones habituales, ya que se trata de productos potencialmente infecciosos.
5/ PRECAUCIONES
El estuche intacto se debe conservar a 2-8 °C. Estos reactivos se destinan
exclusivamente a un uso in vitro y deben ser manipulados por personal de
laboratorio. Utilizar únicamente reactivos de un mismo kit o de un mismo
lote. Los residuos se eliminarán con arreglo a la reglamentación local
vigente.
6/ OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LA MUESTRA
La obtención de la muestra debe ajustarse a las recomendaciones para los
exámenes de hemostasis.
• Obtención de sangre sobre solución de citrato trisódico 0,109 M: 1 vol.
de citrato por 9 vol. de sangre.
• Centrifugación: 15 minutos a 2000-2500 g.
• Conservación del plasma: 4 horas a 20 ± 5 °C
1 mes a –20 °C.
7/ CONSERVACIÓN Y PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Conservados a 2-8 °C en su embalaje original, los reactivos son estables
hasta la fecha de caducidad indicada en el estuche.
• Reactivo 1
Antes de abrir el embalaje, mantener el Reactivo 1 a temperatura
ambiente (18-25 °C) durante 30 minutos; tras este periodo, las tiras están
listas para usar. Comenzar la valoración (ver apartado 9.4.)
inmediatamente después de sacar las tiras de su embalaje.
• Reactivo 2
Reconstituir cada vial con 8 ml de Reactivo 4 (R4). Dejar que la solución
se estabilice durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C). A
continuación, homogeneizar antes de usar con un agitador tipo Vortex.
Debido a las características del Reactivo 4, el Reactivo 2 es irritante tras
su reconstitución.
Estabilidad tras la reconstitución: 4 horas a 20 ± 5 °C.
• Reactivo 3
Mantener el Reactivo 3 a temperatura ambiente (18-25 °C) durante
30 minutos. A continuación, utilizar inmediatamente.
PRECAUCIONES: EVITAR CUALQUIER CONTACTO CON UN ELEMENTO METÁLICO O
CON AGENTES OXIDANTES.
•
3/ PRINCIPIO DEL TEST
Un soporte de plástico recubierto de colágeno humano (Reactivo 1) fija el
factor von Willebrand existente en el plasma a probar, por medio de los
multímeros de alto peso molecular. El VWF fijado se revela con
anticuerpos de conejo anti-VWF humano marcados con peroxidasa
(Reactivo 2) que se fijan sobre los determinantes antigénicos libres. La
cantidad de peroxidasa unida se mide por su actividad sobre el sustrato
TMB (Reactivo 3). Tras detener la reacción con un ácido fuerte, la
intensidad de la coloración está en función de la concentración inicial de
VWF capaz de unirse al colágeno (VWF:CB) presente en el medio.
Reactivo 1: tira de 16 pocillos, recubierta de colágeno humano
placentario de tipo III.
Reactivo 2: inmunoglobulinas de conejo anti-VWF humano marcadas
con peroxidasa, liofilizadas.
Reactivo 3: vial de 8 ml de tetrametilbenzidina (TMB < 1 %), listo para
usar.
Reactivo 4: vial de 50 ml de tampón fosfato, listo para usar.
Reactivo 5: vial de 50 ml de solución de lavado, concentrado 20 veces
Reactivo 6: plasma humano liofilizado que contiene tras su
reconstitución una cantidad conocida de VWF:CB (ver la hoja incluida en
el kit). Esta cantidad se determina respecto a un estándar secundario del
Estándar Internacional 02/150 establecido en 2003.
Reactivo 7: plasma humano liofilizado que contiene tras su
reconstitución una cantidad conocida de VWF:CB (ver la hoja incluida en
el kit). Esta cantidad se determina respecto a un estándar secundario del
Estándar Internacional 02/150 establecido en 2003.
•
Reactivo 4
Mantener el Reactivo 4 (R4) a temperatura ambiente (18-25 °C) durante
30 minutos antes de su utilización.
Estabilidad tras la apertura: 15 días a 2-8 °C en ausencia de cualquier
contaminación.
•
Reactivos 6 y 7
Reconstituir cada vial de Reactivos 6 (R6) y 7 (R7) con exactamente 0,5
ml de agua destilada. Mantener la solución durante 30 minutos a
temperatura ambiente (18-25 °C) para que se estabilice y, a
continuación, homogeneizar antes de usar con un agitador tipo Vortex.
Estabilidad tras la reconstitución: 4 horas a 20 ± 5 °C.
8/ REACTIVO Y MATERIAL AUXILIARES
•
•
•
•
Ácido sulfúrico 1 M (el ácido sulfúrico concentrado es aproximadamente
18 M).
Material de lavado.
Lector de placas a 450 nm.
Equipamiento habitual en los laboratorios de análisis clínicos
(centrifugadora, agitador tipo Vortex, cronómetro, pipetas multicanales,
agua destilada…).
9/ PROCEDIMIENTO
9.1. Calibración
La calibración se efectúa en tubos de plástico con el Reactivo 6.
Preparar la solución inicial t diluyendo el Reactivo 6 a 1/51 en
Reactivo 4 (20 µl de Reactivo 6 + 1 ml de Reactivo 4). Esta solución
constituye el punto más alto de la calibración y su valor se indica en
la hoja incluida en el kit. A partir de esta solución inicial, preparar la
siguiente curva de calibración con Reactivo 4.
Dilución de los diferentes
puntos de la calibración
Reactivo 6 (µl)
t
Reactivo 4 (µl)
1000
A título de ejemplo, 86 plasmas humanos que se consideran normales se
han analizado con el kit Asserachrom® VWF:CB. Los resultados obtenidos
son los siguientes:
[VWF:CB] (%)* relación [VWF:CB]/[VWF:Ag]*
Población total (n = 86) 103 (64 - 155)**
1,01 (0,82 - 1,18)**
Grupo O (n = 53)
96 (62 - 138)
1,00 (0,80 - 1,15)
Grupos no O (n = 33)
127 (86 - 160)
1,01 (0,87 - 1,20)
t/8
t/16
500
500
500
500
En los sujetos del grupo O se observan niveles más bajos de VWF:CB, tal
y como se describe en la literatura (5).
500
500
500
500
12/ CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
Dispensar en el pocillo:
Muestra
200 µl
Tapar los pocillos y mantener 1 hora a
temperatura ambiente (18-25 °C).
Lavar 5 veces con Reactivo 5, y añadir inmediatamente:
FIJACIÓN DEL
INMUNOCONJUGADO
11/ VALORES NORMALES
t/4
9.2. Plasmas a probar
Los plasmas se diluyen en tubos de plástico a 1/51 en Reactivo 4
(20 µl de plasma + 1 ml de Reactivo 4) y, si es necesario, a 1/2 en
Reactivo 4 de esta dilución a 1/51. Para esta segunda dilución, el valor
leído en la curva de calibración se multiplicará por 2.
9.3. Control
El control de calidad se realiza con el Reactivo 7. Este reactivo se
analiza a 2 diluciones realizadas en tubos de plástico: una dilución a
1/51 en Reactivo 4 y una dilución a 1/2 en Reactivo 4 de esta dilución
a 1/51. Para esta segunda dilución, el valor leído en la curva de
calibración se multiplicará por 2.
9.4. Valoración
Inmediatamente después de sacar las tiras de su embalaje, distribuir
por duplicado:
– las diluciones estándares así como los controles y plasmas diluidos
a analizar (en la hora siguiente a su preparación)
– el Reactivo 4 (blanco reactivo).
Todos estos pipeteos sobre la placa deben efectuarse en menos de 10
minutos.
FIJACIÓN DEL
ANTÍGENO
En papel bilogarítmico, representar en abscisas el valor de VWF:CB (%) de
los diferentes puntos de la calibración y en ordenadas el valor de la
absorbancia correspondiente. Trazar la curva de calibración (modo no
lineal). Si el calibrador y los plasmas se han diluido de forma idéntica, el
valor de VWF:CB en las muestras analizadas se lee directamente en la
curva de calibración.
Calcular la relación [VWF:CB]/[VWF:Ag]. El resultado debe interpretarse
en función del estado clínico y biológico del paciente.
Comprobar que el resultado obtenido para el Reactivo 7 se sitúa en el
intervalo indicado en la hoja incluida en el kit. Si no es el caso, asegurarse
del buen funcionamiento de todo el sistema: condiciones operativas,
reactivos, calibración, plasmas a analizar, etc. Si es necesario, repetir las
muestras.
t/2
20
Solución inicial
o su dilución (µl)
10/ RESULTADOS
Reactivo 2
200 µl
Tapar los pocillos y mantener 1 hora a
temperatura ambiente (18-25 °C).
Lavar 5 veces con Reactivo 5, y añadir inmediatamente
activando un cronómetro:
200 µl
TMB (Reactivo 3)
Esperar exactamente 5 minutos a 18-25 °C para
cada muestra, y a continuación añadir:
PRECAUCIONES: El Reactivo 4 contiene la mezcla 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona / 2metil-2H-isotiazol-3-ona (3:1). A la concentración a la que se presenta (< 0,06 %), esta
mezcla se clasifica como irritante.
R43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.
S26: En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y
acúdase a un médico.
S28: En caso de contacto con la piel, lávense inmediata y abundantemente con agua y
jabón.
S36/37/39: Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.
COLORACIÓN
Reactivo 5
Diluir a 1/20 en agua destilada. Para dos tiras, utilizar 15 ml de Reactivo 5
y completar hasta 300 ml con agua destilada.
Estabilidad tras la dilución: 15 días a 2-8 °C en ausencia de cualquier
contaminación.
Si el Reactivo 5 presenta cristales, disolverlos manteniendo el vial
15 minutos a 37 °C.
Comentarios
– En cada lavado, llenar los pocillos con Reactivo 5 hasta el borde y
después
vaciarlos
completamente;
debe
respetarse
escrupulosamente el número de lavados.
– No dejar nunca los pocillos vacíos, si es necesario llenarlos con
Reactivo 5.
– No poner las tiras bajo una luz intensa.
– La temperatura influye en la intensidad de la coloración obtenida. La
técnica se ha optimizado para una temperatura de 22 ± 2 °C.
H2SO4 1 M
50 µl
Tras distribuir el ácido en todos los pocillos, agitar la placa.
15 minutos a 1 hora tras detener la reacción, medir
la absorbancia a 450 nm (ajustar el 0 con el blanco reactivo).
* Mediana
** 95 % de la población incluida presenta un valor de VWF:CB o una relación
VWF:CB/VWF:Ag situada dentro del intervalo establecido.
•
•
Límite de detección - Intervalo de medición
Con el protocolo indicado, el límite de detección es de 1 % de VWF:CB.
El intervalo de medición se extiende de 1 a 140 % de VWF:CB. No
obstante, para un lote dado, el límite superior del intervalo de medición
corresponderá al valor indicado en la hoja para el Reactivo 6.
Reproducibilidad
Los resultados de los estudios de reproducibilidad se indican en la
siguiente tabla:
Reproducibilidad intra-serie Reproducibilidad inter-series
Muestra
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
_ n
X (%)
SD (%)
CV (%)
21
44,5
1,7
3,9
21
75,3
3,5
4,6
10
41,9
2,3
5,4
10
76,2
2,1
2,8
BIBLIOGRAFÍA
1. SADLER J.E.:
“A revised classification of von Willebrand disease”. Thromb.
Haemostasis, 71, 4, 520-525, 1994.
2. VEYRADIER A., JENKINS C.S.P., FRESSINAUD E., MEYER D.:
“Acquired von Willebrand syndrome: from pathophysiology to
management”. Thromb. Haemostasis, 84, 175-182, 2000.
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“von Willebrand factor collagen-binding (activity) assay in the diagnosis
of von Willebrand disease: A 15-year journey”. Sem. Thromb. Haemost.,
28, 2, 191-202, 2002.
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“Molecular genetics of type 2 von Willebrand disease”. Int. J. Hematol.,
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6. FRESSINAUD E., MEYER D.:
“Von Willebrand disease: biological diagnosis” dans “Textbook of
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7. FRESSINAUD E., MEYER D.:
“La maladie de Willebrand : du diagnostic au traitement”. Revue du
praticien, 55, 20, 2209-18, 2005.
Los cambios significativos son indicados por las líneas punteadas en el margen.
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