Novedosa Función de CETPI (Isoforma de la Proteína

Novedosa Función de CETPI (Isoforma de la Proteína
Transferidora de Ésteres de Colesterol).
Jaime Mas Oliva y Víctor García González
Instituto de Fisiología Celular. UNAM.
I. Introducción
La proteína transferidora de ésteres de colesterol (CETP) es una glucoproteína plasmática
que es secretada principalmente por el hígado y se encuentra asociada en mayor proporción a las
lipoproteínas de alta densidad (HDL) [1]. CETP promueve la transferencia de ésteres de
colesterol y triglicéridos entre lipoproteínas [1,2], principalmente direccionando el flujo de
ésteres de colesterol de las HDL hacía lipoproteínas de baja (LDL) y de muy baja densidad
(VLDL). El cambio en la composición de lipoproteínas mediado por CETP afecta el metabolismo
y regula los niveles plasmáticos de lípidos [2,3]. En este sentido, extensos estudios en
polimorfismos de CETP y deficiencias genéticas indican una relación directa entre su actividad,
el colesterol asociado a las partículas HDL y enfermedad cardiovascular [4,5].
Estudios de mutagénesis sitio específica han mostrado que el dominio localizado en el Cterminal (E465-S476) estructurado como una α-hélice anfipática, corresponde con una región clave
en la transferencia de lípidos (Figura 1) [6-8]. Durante la caracterización estructural de este
dominio, se encontró que la disrupción del puente salino H 466-D470 a través de la mutación D470N
origina la perdida de la estructura nativa, debido en parte al cambio del grupo hidroxilo cargado
negativamente en la cadena lateral del ácido aspártico-470 por la amina presente en la asparagina
(Figura 1) [6]. La resolución de la estructura tridimensional ha proporcionado una base sólida
para la propuesta de que CETP opera a través de un mecanismo acarreador en la transferencia de
lípidos [9], sin embargo estudios de nuestro laboratorio sugieren que el proceso de transferencia
puede estar directamente relacionado con la formación de un sistema micelar lípidico, en donde
la conservación de la estructura α-hélice en esta región debe ser crítica para este proceso [10]. El
conocimiento acumulado en relación con la estructura y función del C-terminal de CETP ha
permitido desarrollar en el laboratorio un trabajo de aplicación tecnológica para la determinación
de los niveles plasmáticos de CETP como dato auxiliar en la clínica [11].
Estudios recientes de nuestro laboratorio han demostrado que este dominio conteniendo la
mutación D470N presenta la formación de estructura secundaria-β cuando se mantiene fuera de un
ambiente lipídico, caracterización realizada a través de técnicas de espectroscopía y fluorescencia
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[12]. Los resultados obtenidos muestran que el cambio conformacional de la α-hélice hacia una
cadena-β induce la formación de fibrillas de tipo amiloide. Este tipo de estructuras causan efectos
citotóxicos similares a los inducidos por el péptido β-amiloide, como la formación de especies
reactivas de oxígenos y cambios en el balance de proteínas de la maquinaria celular de
endocitosis [12,13]. Nuestros experimentos han permitido proponer que un delicado balance entre
la estructura secundaria altamente dinámica del C-terminal de CETP, parámetros fisicoquímicos
como la carga neta y el ambiente lipídico pueden definir el tipo de estructura secundaria
adquirida. Alteraciones en este equilibrio podrían favorecer cambios en la estructura secundaria
nativa, lo cual modificaría la capacidad de transferencia de lípidos.
El sitio crítico para la unión y transferencia de lípidos está directamente conectado al Cterminal de CETP, sin embargo en nuestro grupo de trabajo se reportó el hallazgo de una forma
alterna de CETP. Denominada CETPI, el ARNm de esta isoforma fue localizado solamente en el
intestino delgado, una característica de esta variante es la pérdida del exón 16 y que 54 bases
contenidas en el intrón 15 formen parte del nuevo ARNm, lo cual implica la sustitución de la
estructura α-hélice del C-terminal por una estructura rica en prolinas, con una alta probabilidad
de mantener un estado desordenado [14]. Considerando que la actividad transferidora de lípidos
neutros se abate al modificar la estructura α-hélice del C-terminal de CETP, resulta importante
describir cual puede ser la función de CETPI, ya que también fue encontrada en plasma [14]. De
tal manera que el proyecto está centrado en el estudio de la función de esta nueva isoforma de
CETP.
Un primer acercamiento al estudio de CETPI ha sido la búsqueda de proteínas que pueden
tener homología a nivel de estructura primaria y terciaria. Específicamente una proteína de unión
a lipopolisacáridos (LPS) ha sido ampliamente caracterizada de modular el efecto biológico de
los LPS y participar en la respuesta inmune innata ante la infección por bacterias Gram-negativas.
La proteína bactericida/incrementadora de permeabilidad (BPI) se encuentra en los gránulos
lisosomales de neutrófilos polimorfonucleares, presenta la propiedad de unir y neutralizar el
efecto tóxico de los LPS de la membrana externa de las Gram-negativas [15,16]. De forma
interesante BPI comparte una alta similitud a nivel de estructura tridimensional con CETP, sin
embargo presentan una homología muy baja en la secuencia primaria.
Considerando la convergencia estructural entre las dos proteínas, la cual se extiende a
más de 400 residuos, CETP comparte los más importantes elementos estructurales con BPI,
incluyendo el plegamiento global, la simetría y la arquitectura del dominio +NH3; sin embargo,
presentan diferentes patrones de unión a moléculas de lípidos [17]. La principal diferencia entre
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las dos proteínas radica en que BPI es más corta en los últimos 20aa del C-terminal, por lo que no
presenta la región -hélice de unión a lípidos de CETP, de manera que la diferencia en la función
de ambas proteínas debe estar directamente relacionada con esta región (Figura 2). Estudios con
proteínas quiméricas conteniendo diferentes regiones del N y C-terminal de CETP con partes
homologas de BPI también sugieren esta propiedad [18].
Debido a que CETPI no tiene la secuencia crítica requerida para la transferencia de lípidos
y en cambio puede presentar una región desordenada, muy probablemente la actividad de
transferencia de lípidos neutros es residual. Considerando las propiedades de unión a
lipopolisacáridos descritas en la proteína BPI, sin la presencia de la región α-hélice en su dominio
C-terminal y la alta similitud a nivel de estructura tridimensional con CETP, hemos planteado
que la isoforma CETPI puede presentar la propiedad de unión a LPS, con la capacidad de ser una
estructura con potencial bacteriostático o bactericida. Posiblemente a través de la evolución
CETPI perdió la capacidad de transferir lípidos; sin embargo, conserva otra función que aún no
se ha descrito y que en nuestras manos podría estar la respuesta.
II. Resultados
Considerando que solamente en intestino delgado fue detectada la expresión de CETPI,
durante esta etapa de nuestra investigación se usó como modelo experimental la línea celular
FHs74Int (ATCC) proveniente de intestino delgado, así como células Caco-2 procedentes de
colon (ATCC). En una primer serie de experimentos se comprobó la expresión de CETPI en
lisados de las células FHs74Int, identificando una banda cercana a 67 kDa; sin embargo, también
se encontró otra muy cercana a 68 kDa con menor intensidad (Figura 3A), probablemente
asociada con la forma no madura de la proteína. En el extremo N-terminal se encuentra un
péptido señal de 17 residuos que es clave para su exportación al medio extracelular.
Cuando células FHs74Int después de 10 días de incubación y con una confluencia del
90% se expusieron a concentraciones graduales de lipopolisacáridos (LPS) durante 12h, se
encontró un aumento en la expresión de CETPI en los lisados celulares a partir de la
concentración más baja (0.1ng/ml). Esta respuesta se mantuvo hasta la concentración de
1000ng/ml. De forma interesante, también se identificó la banda de 67 kDa en muestras
recuperadas del medio extracelular de células tratadas de intestino delgado (Figura 3A).
El hígado y el tejido adiposo son las principales fuentes de síntesis de CETP, aunque
también se ha reportado su expresión en intestino delgado [19]. En la evaluación de la expresión
de CETP en células FHs74Int se encontró un patrón de expresión diferente al de CETPI, ya que
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en condiciones basales sin tratamiento con LPS no se encontró la expresión de CETP. Se registró
la señal de esta proteína hasta concentraciones de 100ng/ml de LPS. En muestras recuperadas del
medio extracelular no se detectó la banda correspondiente a CETP en ninguna de las condiciones
evaluadas (Figura 3B). Sí bien, la principal función de CETP esta relacionada con la transferencia
de lípidos entre lipoproteínas, en un trabajo reciente se ha reportado que la proteína purificada
CETP también tiene la capacidad de unir LPS, aunque su constante de afinidad es tres órdenes de
magnitud mayor que la de proteínas especializadas como BPI [20]. Esta referencia concuerda con
nuestro resultado, ya que mientras CETPI está presente desde la concentración más baja usada de
LPS (0.1ng/ml), en cambio la expresión de CETP fue detectada a partir del tratamiento con
100ng/ml de LPS. No está reportado si en un contexto fisiológico como en casos de infecciones
sistémicas por bacterias Gram-negativas, CETP puede participar en la respuesta inmune a través
de la unión a LPS. Empleando células que forman parte de la respuesta inmune innata como
macrófagos y células de microglia también se detectó la presencia de CETPI, así como en células
procedentes de colon (Caco2) (Figura 4). Considerando la expresión con respecto al control de
carga β-actina, la señal fue más alta en células de colon.
Así mismo, se ha evaluado la expresión de CETP en cultivos de células Caco2. Bajo
condiciones basales no se detecto síntesis de CETP, aún bajo el estímulo con LPS. De manera
que se decidió usar otros sistemas de lípidos como vesículas de fosfatidilcolina+colesterol, el
extracto polar de lípidos de bacterias Gram-negativas, y una mezcla del extracto polar de lípidos
bacterianos+LPS. En todas las condiciones evaluadas no se identificó la banda característica de
CETP (Figura 5). Actualmente nos encontramos en la identificación de CETPI en estas mismas
condiciones experimentales y estamos desarrollando de manera paralela la estrategia para la
sobre-expresión y purificación de CETPI.
La diferencia en la expresión de CETP y CETPI en células de intestino delgado tratadas
con LPS sugiere una función diferente para estas proteínas, por lo que CETPI debe estar
realizando otra función adicional a la transferencia de lípidos. Aunque hacen falta un mayor
número de experimentos que confirmen nuestros resultados, estos son indicativos de la posible
función bacteriostática y/o bactericida de CETPI asociada con la unión a este tipo de lípidos en la
membrana externa de bacterias Gram-negativas.
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IV. Figuras
Figura 1. Estructura tridimensional de CETP. A) CETP está compuesta por cuatro dominios: un
barril en cada lado de la proteína (presentados en verde y amarillo), una hoja-β central conectora
entre los dos barriles (en rojo) y una extensión C-terminal (rectángulo azul). Estructura obtenida
del Protein Data Bank; código de acceso: 2obd. B) Representación estructural del dominio Cterminal de CETP, mostrando la estructura secundaria de los últimos 24 aa, la cual está integrada
por tres motivos: cadena β (G453-G462), una región poco estructurada (G462-P464) y la α-hélice
anfipática (E465-S476), estructura clave en la transferencia de lípidos.
A
B
C-terminal (24aa)
GFLLLQMDFGFPEHLLVDFLQSLS
453
465
476
puente salino
Hélice X
EHLLVDFLQSLS
Hélice Z (Mutación D470N)
EHLLVNFLQSLS
466
470
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Figura 2. Alineamiento de las proteínas BPI y CETP, realizado a través del servidor: Interactive
Structure based Sequences Alignment Program (STRAP). Las estructuras se obtuvieron del
Protein Data Bank; código de acceso: 2obd para CETP y 1bp1 para BPI. En color azul está
representada la estructura de CETP y en verde la de BPI.
Región C-terminal
exclusiva de CETP
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Figura 3. Efecto del tratamiento con LPS’s sobre la expresión de CETP y CETPI en el modelo
celular de intestino delgado (células FHs74Int). A) Niveles de expresión de CETPI después de
12h de tratamiento utilizando concentraciones crecientes de LPS. B) Inmunotransferencia para la
identificación de CETP. En los últimos tres carriles de cada gel se cargaron muestras del medio
extracelular. La proteína β-actina fue usada como control de carga.
A
LPS (ng/ml)
Extracelular
LPS (ng/ml)
0 0.1 1 10 102 103 0 10 103
67 kDa
CETPI
53
β-actina
B
43
LPS (ng/ml)
Extracelular
LPS (ng/ml)
0 0.1 1 10 102 103 0 10 103
CETP
66 kDa
β-actina
43
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Figura 4. Detección de CETPI en lisados de células de colon (Caco2), macrófagos (RAW) y
microglia (EOC). A) Membrana utilizada en la imunotransferencia teñida con rojo Ponceau.
B) β-actina como control de carga.
A
kDa
B
Caco2 RAW EOC
Caco2 RAW EOC
100
75
67 kDa
CETPI
50
β-actina
43 kDa
8
Figura 5. Expresión de CETP y CETPI bajo tratamiento con diferentes tipos de moléculas
lipídicas utilizando células FHs74Int. A) La expresión de CETP no fue identificada bajo el
tratamiento con las diferentes mezclas lipídicas empleadas. Se utilizaron sistemas micelares
compuestos de fosfatidilcolina (PC) y colesterol (Col), así como del extracto polar de lípidos de
E. coli (Bacter), lipopolisacáridos (LPS) y mezclas de LPS con el extracto de E. coli (carriles A y
B). B) Expresión de CETPI bajo el mismo tratamiento. La β-actina se usó como control de carga.
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II. Referencias
[1]
Tall AR. (1993) Plasma cholesteryl ester transfer protein. J Lipid Res 34:1255-1274.
[2]
Barter PJ, Brewer HB Jr, Chapman MJ, Hennekens CH, Rader DJ, Tall AR (2003)
Cholesteryl ester transfer protein: a novel target for raising HDL and inhibiting
atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 23:160-167.
[3]
Morton RE (1990) Interaction of lipid transfer protein with plasma lipoproteins and cell
membranes. Experientia 46:552-560.
[4]
Tall AR. (1995) Plasma cholesteryl ester transfer protein and high-density lipoproteins:
new insights from molecular genetic studies. J Intern Med 237:5-12.
[5]
Klerkx AH, El Harchaoui K, van der Steeg WA, Boekholdt SM, Stroes ES, Kastelein JJ,
Kuivenhoven JA. (2006) Cholesteryl ester transfer protein (CETP) inhibition beyond
raising high-density lipoprotein cholesterol levels: pathways by which modulation of
CETP activity may alter atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol:706-715.
[6]
Bolaños-García VM, Soriano-García M, Mas-Oliva J. (1998) Stability of the C-terminal
peptide of CETP mediated through an (i, i + 4) array. Biochim Biophys Acta, 1384:7-15.
[7]
Wang S, Wang X, Deng L, Rassart E, Milne RS, Tall AR. (1993) Point mutagenesis of
carboxyl-terminal amino acids of cholesteryl ester transfer protein. J Biol Chem 66:19551959.
[8]
Wang S, Kussie P, Deng L, Tall A (1995) Defective binding of neutral lipids by a
carboxyl-terminal deletion mutant of cholesteryl ester transfer protein. Evidence for a
carboxyl-terminal cholesteryl ester binding site essential for neutral lipid transfer activity.
J Biol Chem 270:612-618.
[9]
Qiu X, Mistry A, Ammirati M.J, Chrunyk BA, Clark RW, Cong Y, Culp JS, Danley DE,
Freeman TB, Geoghegan KF, Griffor MC, Hawrylik SJ, Hayward CM, Hensley P, Hoth
LR, Karam GA, Lira ME, Lloyd DB, McGrath KM, Stutzman-Engwall KJ, Subashi AK,
Subashi TA, Thompson JF, Wang IK, Zhao H, Seddon AP (2007) Crystal structure of
cholesteryl ester transfer protein reveals a long tunnel and four bound lipid molecules.
Nat. Struct. Mol. Biol 14:106-113.
[10]
García-González V, and Mas-Oliva J (2009). Structural Arrangement that Supports Lipid
Transfer in the cholesteryl- ester transfer protein (CETP). USA-México Workshop in
Biological Chemistry: Multidisciplinary Approaches to Protein Folding. Mexico, D.F, March
25-27.
10
[11]
Certificado de Patente en la Comunidad Europea 00986050.3. Certificado de Patente en
México No. 9911575. Sistema para Cuantificar la Proteína Transferidora de Estrés de
Colesterol en Muestras Biológicas y Sintéticas
[12]
García-González V and
Mas-Oliva J (2010). Amyloidogenic Properties of the C-
terminus Domain of the Cholesteryl-Ester Transfer Protein (CETP). Int. J. Mol. Sci. (en
revision)
[13]
Manzano-León N, Delgado-Coello B, Guaderrama-Díaz M, Mas-Oliva J (2006) Betaadaptin: key molecule for microglial scavenger receptor function under oxidative stress.
Biochem Biophys Res Commun 351(3):588-594
[14]
Alonso AL, Zentella-Dehesa A, Mas-Oliva J (2003). Characterization of a naturally
occurring new version of the cholesterol ester transfer protein (CETP) from small
intestine. Mol Cell Biochem 245:173-182.
[15]
Schumann RR, Leong SR, Flaggs GW, Gray PW, Wright SD, Mathison JC, Tobias PS,
Ulevitch RJ (1990) Structure and function of lipopolysaccharide binding protein. Science
249:1429-1431.
[16]
Elsbach P, Weiss J (1995) Prospects for use of recombinant BPI in the treatment of gramnegative bacterial infections. Infect Agents Dis 4(2):102-109.
[17]
Bruce C, Beamer LJ, Tall AR (1998) The implications of the structure of the
bactericidal/permeability-increasing protein on the lipid-transfer function of the
cholesteryl ester transfer protein. Curr Opin Struct Biol 8:426-434.
[18]
Lloyd DB, Bonnette P, Thompson JF (2006) Protein fusions of BPI with CETP retain
functions inherent to each. Biochemistry 45:12954-12959.
[19]
Tall A (1995) Plasma lipid transfer proteins. Annu Rev Biochem 64:235-257.
[20]
Clark RW, Cunningham D, Cong Y, Subashi TA, Tkalcevic GT, Lloyd DB, Boyd JG,
Chrunyk BA, Karam GA, Qiu X, Wang IK, Francone OL (2009) Assessment of
cholesteryl ester transfer protein inhibitors for interaction with proteins involved in the
immune response to infection. J Lipid Res 51:967-974.
11