Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

Los conceptos modernos de producción animal y de aumento del comercio internacional exigen el
desarrollo de medios de diagnóstico, de vigilancia, así como capacidad global y harmonización
diagnóstica para potenciar la producción y la salud de los animales y para contribuir a la unión de
tecnologías de detección de agentes patógenos como base de la iniciativa mundial “un mundo, una
salud”.
El desarrollo global de infraestructuras de transporte mejoradas ha contribuido al aumento de los
desplazamientos internacionales de personas y mercancías. Y por consiguiente, ha aumentado el
riesgo de transferencia de agentes patógenos entre países, e incluso entre continentes. Como
respuesta al cambio climático global, ciertas enfermedades endémicas de algunas zonas, como la
lengua azul o la peste porcina Africana, están mostrando una tendencia a desplazarse o
propagarse a otras zonas geográficas, fuera de su territorio habitual. Por último, la constante
intensificación de la producción animal requiere aplicar cambios a las medidas preventivas, al
diagnóstico y al control de las enfermedades de los animales.
Con el fin de que se acepten en todo el mundo, los métodos diagnósticos modernos deben
validarse y ser sensibles, específicos, rápidos, fáciles de utilizar y rentables y, además, estar
automatizados para facilitar la evaluación de grandes cantidades de muestras.
La erradicación de la peste bovina es un ejemplo destacable de la aplicación de las nuevas
tecnologías al control y a la erradicación de enfermedades, en que la prueba de la neutralización
vírica se sustituyó por un enzimoinmunoanálisis bien validado que se utilizó en el programa de
erradicación a nivel mundial.
El objetivo de este capítulo es proporcionar información general básica al personal no
especializado. Se han dedicado dos números de la Revista Científica y Técnica de la OIE a la
biotecnología y al diagnóstico de enfermedades animales, que pueden consultarse en la página
web de la OIE. A continuación se indican los temas tratados, brevemente revisados en este
capítulo.
A.
Detección de ácidos nucleicos
1.
2.
3
4.
5.
6.
7.
8.
Extracción de ácido nucleico
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR en tiempo real
Amplificación isotérmica
Detección de ácidos nucleicos sin amplificación de ADN
Diagnóstico mediante la técnica de los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de
restricción y enfoques relacionados basados en ADN
Secuenciación de genoma
Diagnóstico mediante sondas de ADN y tecnología de micromatrices de ADN
Metagenómica
B.
Detección de proteínas
B1. Detección de antígenos
1.
2.
3.
Enzimoinmunoanálisis de captura de antígeno (AgELISA)
Inmunoanálisis cuantitativos (radioinmunoanálisis y enzimoinmunoanálisis cuantitativo)
Prueba de inmunofluorescencia
4.
5
Inmunohistoquímica
Immunocromatografía (dispositivos de flujo lateral)
B2. Detección de anticuerpos
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Aglutinación
Prueba de inhibición de la hemaglutinación
Prueba de inmunodifusión en gel de agar
Prueba de fijación del complemento
ELISA indirecto (iELISA)
ELISA de competición (cELISA)
ELISA de bloqueo (bELISA)
Inmunoelectrotransferencia
Detección de anticuerpos fluorescentes
B3. Tecnologías en desarrollo para la detección de proteínas
B4. Proteómica
B5. Producción de antígenos mediante tecnología de ADN recombinante
C.
Implicaciones de las nuevas tecnologías
Para que la gestión de las enfermedades infecciosas, y en concreto de las transfronterizas, resulte eficiente es
necesaria una identificación rápida, sensible, específica y confirmativa del agente patógeno. Las técnicas
convencionales, como el aislamiento del agente patógeno (el método de referencia para el diagnóstico) no solo
son laboriosas en el caso de los agentes patógenos más exigentes y difíciles de cultivar in vitro, sino que también
pueden suponer un riesgo para los técnicos de diagnóstico si el microorganismo es zoonótico. Dado que estas
limitaciones a menudo requieren laboratorios de un alto nivel de seguridad (como por ejemplo, de tipo BSL3), se
ha observado que la amplificación de ácidos nucleicos tiene ventajas. En concreto, las tecnologías basadas en la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han revolucionado los diagnósticos de las enfermedades infecciosas.
Las infraestructuras de amplificación del ADN son sensibles, específicas, rápidas y robustas, puesto que utilizan
varios moldes de ácido nucleico no infeccioso como material de partida. Estas infraestructuras son también
rentables y se prestan a la automatización, de modo que son ideales para obtener un alto rendimiento.
Un paso importante en el procedimiento diagnóstico molecular es la extracción de mezclas “limpias” de ácido
nucleico que actúen como molde para las reacciones. Aunque es relativamente fácil extraer ADN de cultivos
bacterianos o de sangre, técnicamente es más complicado preparar material adecuado de muestras de campo,
como heces, órganos internos o material de abortos. Si el material a analizar no ha sido purificado de agentes
contaminantes en la muestra clínica, la prueba quedará comprometida y puede dar resultados falsos. Por otra
parte, tener que procesar grandes cantidades de muestras aumenta el riesgo de contaminación, lo cual comporta
falsos positivos. Los pasos de manipulación durante la extracción de ácidos nucleicos son críticos debido a la
contaminación cruzada de las muestras, que comporta falsos positivos. Por ello, la extracción de ácidos
nucleicos debe llevarse a cabo mediante procedimientos de trabajo estrictos, en una sala aislada, independiente
de otras fases del proceso de la PCR (como la preparación de la mezcla madre, la adición de muestras extraídas
a la mezcla madre o la amplificación). Normalmente se insertan varios controles negativos (como agua tratada
con DEPC [dietilpirocarbonato]) entre muestras determinadas de los grupos de muestras analizadas, con el fin de
detectar una posible contaminación cruzada.
Existen varios tipos de muestras que se sabe que inhiben la reacción de la PCR, lo cual comporta falsos
negativos. Incluir un control interno en la prueba es importante para el control de calidad de la extracción de
ácidos nucleicos, con el fin de demostrar la ausencia de inhibidores de la PCR. Estos controles internos pueden
ser un gen de mantenimiento, un gen endógeno, un gen constante expresado por la célula basal, como el de la
gliceraldehído-3-fosfatasa (GPDH3) o el de la βactina, o bien un ácido nucleico exógeno que no esté presente de
forma natural en la preparación pero que se añada en el paso de extracción (Belák & Thorén, 2001). Existen
varios métodos especializados para tipos concretos de muestras y tejidos, la mayoría de los cuales se
comercializa hoy en día, como sistemas manuales o automatizados para estaciones de trabajo robóticas. El
desarrollo y la accesibilidad de las infraestructuras de extracción robóticas no solo minimiza el riesgo de
contaminación, sino que también permite el procesado de grandes cantidades de muestras en condiciones de
reacción constante y muy poca manipulación por parte del operario. En consecuencia, estas infraestructuras han
contribuido a establecer pruebas diagnósticas de alto rendimiento y robustas, que acortan el tiempo necesario de
procesado por muestra, pasando a durar de horas a minutos (Belák et al., 2009). Están diseñadas para mejorar
la fiabilidad de la extracción de ácidos nucleicos de distintas muestras, pero sigue tratándose de un campo
exigente.
Como alternativa a la extracción de ácidos nucleicos, los biotecnólogos se están centrando cada vez más en las
polimerasas que son resistentes a los inhibidores de la PCR, y hoy en día se dispone de varias en el mercado
para la amplificación directa de ácidos nucleicos de muestras patológicas sin necesidad de realizar ningún paso
de extracción. En estas pruebas cada vez se utiliza más un control interno para demostrar que la muestra no
contiene inhibidores de la PCR.
La PCR explota los mecanismos de replicación natural del ADN y da lugar a la producción in-vitro de grandes
cantidades de una secuencia de ADN deseada a partir de una mezcla compleja de secuencias heterógenas
(Saiki et al., 1988). La PCR permite amplificar una región concreta de entre 50 y varios miles de pares de bases
dando miles de millones de copias. La especificidad de la región amplificada puede ser diana de cebadores
(moléculas sintéticas cortas de ADN complementario de ambas cadenas y situadas a ambos lados de las
secuencias diana) específicos, que se hibrida al molde monocatenario y se extiende con la ADN polimerasa.
La amplificación de ADN en protocolos de PCR se lleva a cabo utilizando una sucesión de pasos de incubación
cíclicos a distintas temperaturas. En primer lugar, se desnaturaliza el ADN por calor para separar las dos hebras
complementarias y obtener un molde monocatenario. A continuación, se hibridan cebadores específicos al molde
monocatenario a baja temperatura y se extienden con la ADN polimerasa a una temperatura intermedia. Una vez
la polimerasa ha sintetizado una nueva hebra de ADN, el producto se separa del molde calentando a una mayor
temperatura. Estos pasos, denominados ciclos, se repiten 20-40 veces, lo cual da lugar a la amplificación de las
secuencias diana del ADN. La clave para la amplificación geométrica de las secuencias diana de ADN mediante
la PCR es la selección de cebadores pareados que, una vez extendidos, crearán otros puntos recíprocos de
hibridación del cebador para la extensión del cebador en los siguientes ciclos. Para detectar ARN (como por
ejemplo, virus de ARN), en primer lugar debe crearse una copia de ADNc del ARN utilizando una transcriptasa
inversa (RT). A continuación, el ADNc actúa como molde para la amplificación mediante la PCR. Esta técnica se
denomina PCR con transcripción inversa (RT-PCR).
La identidad del producto de la PCR se define por su tamaño característico, y/o se confirma utilizando sondas de
ADN (véase más adelante), o digestos de restricción, que se pueden utilizar para proporcionar polimorfismos en
la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) (véase el apartado A.5). Desde la aparición de técnicas
automáticas de secuenciación, sin lugar a dudas es más frecuente realizar la identificación mediante la
secuenciación directa del producto de la PCR. Así, por ejemplo, se utiliza la secuenciación en la tipificación de la
virulencia de un virus de la influenza aviar tipo A, en el cual se encuentran motivos estructurales asociados a la
virulencia en el punto de división del gen de la hemaglutinina que son indicadores fiables de alta patogenicidad
en los pollos. La sensibilidad de una PCR puede potenciarse por el uso de un segundo conjunto de cebadores
para amplificar un subfragmento a partir del producto de la PCR de la primera reacción. Esta técnica suele
denominarse PCR anidada y se ha utilizado para detectar bajos niveles de agentes patógenos en la muestra. No
obstante, la utilización de la PCR anidada puede aumentar el nivel de contaminación ambiental durante la
segunda amplificación (subfragmento), aumentando así el riesgo de falsos positivos.
La PCR es un procedimiento muy sensible de detección de agentes infecciosos en tejidos de hospedadores y en
vectores, incluso cuando solo están infectadas un bajo número de células hospedadoras. La PCR permite
acceder a una secuencia génica que se haya integrado en el ADN de las células hospedadoras infectadas y
ampliarla. También permite acceder a secuencias génicas víricas no integradas y ampliarlas. Es evidente que la
PCR debe ser una de las pruebas que se realicen en las vacuna para determinar si presentan contaminación. No
obstante, no diferencia entre microorganismos viables y no viables, ni identifica fragmentos incompletos de ADN
genómico, y esto puede complicar la interpretación de los resultados y afectar a la aplicabilidad de la PCR en
este ámbito.
La PCR puede resultar muy útil en el diagnóstico de infecciones crónicas y persistentes, como la diarrea viral
bovina (DVB), la leucosis bovina enzoótica o el virus de la artritis/encefalitis caprina. Estas enfermedades
presentan graves problemas de diagnóstico y prevención, puesto que los animales infectados son una potencial
fuente constante de transmisión.
Para ampliar esta utilidad en el diagnóstico y en la identificación de agentes patógenos del ámbito de la
veterinaria, a lo largo de los últimos años se han aplicado muchas modificaciones a la PCR. Así, la PCR en la
que se utilizan cebadores muy conservados está diseñada para la identificación de clases de agentes patógenos.
Utilizando cebadores de PCR que son complementarios de estas regiones de secuencias conservadas, en la
muestra puede detectarse la presencia de cualquier bacteria de una clase determinada. Es importante destacar
que un resultado positivo en la PCR debe caracterizarse a continuación mediante hibridación con sondas
específicas de la especie, análisis mediante RFLP o secuenciación. De igual modo, puede diseñarse una PCR
consenso para utilizar cebadores degenerados que tengan por diana regiones de secuencias o motivos
conservados de un grupo de agentes patógenos emparentados. La utilización de cebadores degenerados (es
decir, una mezcla de cebadores similares con bases distintas en algunas posiciones) ha dado lugar a la
identificación de muchos virus previamente no reconocidos en distintas especies animales. Por otra parte, se ha
diseñado una PCR múltiple, en la que se pueden utilizar dos o más pares de cebadores dirigidos a secuencias
particulares específicas del agente patógeno dentro de una reacción única, lo cual permite la detección
simultánea de múltiples agentes patógenos. La PCR múltiple tiene la ventaja de poseer un alto grado de
sensibilidad y de especificidad. No obstante, ha habido informes de que dicho multiplexado puede reducir la
sensibilidad en comparación con las reacciones únicas, debido a competición. Si en la prueba es importante
disponer de una buena sensibilidad, esta condición debe tenerse en cuenta durante el procedimiento de
validación (desarrollo y optimización de la prueba).
Las PCR clásicas para el diagnóstico de agentes patógenos, tanto bacterianos como víricos, hoy en día se están
sustituyendo en gran medida por pruebas de PCR en tiempo real. En las PCR en tiempo real se intercalan
tinciones o una sonda o cebador específicos de especie (marcados con tinción fluorescente). La señal
fluorescente medida es proporcional al número de fragmentos de ADN producidos. Así, durante la PCR en
tiempo real, puede realizarse un seguimiento de la acumulación de productos de la PCR en cada ciclo
consecutivo, en función de los cambios observados en el grado de fluorescencia. En otras palabras, la prueba
puede utilizarse para la cuantificación absoluta o relativa del contenido en ADN o ARN en una muestra dada.
Contrariamente a lo que ocurre en la PCR convencional, la PCR en tiempo real requiere menos manipulación, es
más rápida, tiene un formato de tubo cerrado (menor riesgo de contaminación cruzada), es muy sensible y
específica, conservado así una eficiencia cualitativa, y proporciona información cuantitativa. En muchos casos, la
PCR en tiempo real ha demostrado ser más sensible que otros métodos de referencia previos. El desarrollo de
máquinas y pruebas de PCR en tiempo real portátiles genera la expectativa de que estas técnicas puedan
utilizarse para el diagnóstico rápido (en menos de 2 horas) de brotes de enfermedad en el campo.
Cuando se utiliza PCR para el diagnóstico, se precisa un gran nivel de precaución para evitar la contaminación
de las muestras, puesto que la exquisita sensibilidad de la técnica puede conllevar fácilmente la aparición de
falsos positivos. En estudios multicéntricos se ha observado que muestras positivas se detectan como positivas
invariablemente en todos los laboratorios, pero que a menudo se obtienen falsos positivos en muestras que se
sabe que son negativas, lo cual indica la continua presencia de problemas de contaminación (Schweiger et al.,
1997). Ahora se dispone de una nueva generación de estaciones de trabajo robóticas en las que pueden
ejecutarse reacciones de PCR con solo un tubo abierto y en cualquier momento. Esto reduce en gran medida el
riesgo de contaminación. También es importante controlar los posibles resultados “negativos” causados por la
presencia de inhibidores de la PCR en la mezcla de reacción. Puede utilizarse un molde, independiente del ADN
diana, que se sepa que produce un producto de PCR (lo imite) con cebadores específicos, a modo de control
para los inhibidores de la PCR, y que permita reconocer si un resultado es un falso negativo (Belák et al., 2009).
Si se aplican estas precauciones, la PCR se convierte en una opción realista para los responsables de llevar a
cabo el diagnóstico.
Hasta hace poco, la generación de la señal en una prueba de PCR en tiempo real se ha limitado a ciertas
sustancias químicas, como algunas tinciones (SYBR Green y Eva Green), sondas de hidrólisis, balizas
moleculares, transferencia de energía con sonda de cebador (PriProET), cebadores escorpión, sondas de
hibridación dual y unión a nucleótidos marcados con tinción (Belák et al., 2009). Se ha desarrollado un marcaje
alternativo utilizando marcadores que confieren una alta multiplicidad a la prueba. La PCR con cebadores
marcados con moléculas de masa conocida es una mejora de la PCR en tiempo real, en la que los cebadores se
marcan con marcadores de pesos moleculares conocidos pero distintos. Tras la amplificación de los fragmentos
de ADN diana, los marcadores se desprenden mediante luz UV, y a continuación se miden mediante
espectrometría de masas. Este enfoque permite el multiplexado de conjuntos de fragmentos de ADN diana
mucho mayores (y, por tanto, de múltiples enfermedades), puesto que la prueba no se limita al número de
tinciones existentes. La aplicación de la PCR con cebadores marcados con moléculas de masa conocida ya se
ha utilizado en el diagnóstico diferencial de enfermedades sindrómicas (síndromes respiratorio, hemorrágico, por
agentes patógenos entéricos, de meningitis/encefalitis) y en la detección de nuevos clados de agentes patógenos
(Lipkin, 2010). En una modificación de este método se utiliza desorción-ionización por láser asistida por matriz
(MALDI), que mide directamente los pesos moleculares de los productos de la PCR y los compara con datos
conocidos (Lipkin, 2010).
Se ha logrado otra mejora de la tecnología de secuenciación al pasar de una detección fotométrica a una
química de la reacción de la PCR en tiempo real (Neidringhaus et al., 2011). La tecnología se denomina
secuenciación de torrente iónico (secuenciación mediada por pH, secuenciación por silicio o secuenciación por
semiconductor) y se basa en la detección de la liberación de iones de hidrógeno cuando se añade un nucleótido
a una hebra de ADN mediante la polimerasa. Los iones de hidrógeno cambiarán el pH de la solución, lo cual
puede detectarse mediante un sensor de ión (micropehachímetro). Este sistema se basa en una matriz de alta
densidad de micropocillos creados mecánicamente para llevar a cabo una gran cantidad de procesos
bioquímicos simultáneamente. Ya se han desarrollado plataformas de secuenciación de cuarta generación, como
las tecnologías de secuenciación mediante nanoporo, los métodos de extensión de larga lectura y los métodos
basados en la grabación directa en video de bases nucleicas, a modo de métodos demostrativos preliminares
(Neidringhaus et al., 2011). Todavía no se ha evaluado el impacto que han tenido en la comunidad científica.
Las tecnologías de amplificación isotérmica ofrecen la ventaja de omitir el termociclado, lo cual posibilita la
amplificación de ADN a temperatura constante. Estas tecnologías consisten en la amplificación basada en la
secuencia del ácido nucleico (NASBA), la amplificación mediada por transcripción (TMA), la amplificación
mediada por señal en la tecnología del ARN (SMART), la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA), la
amplificación por círculo rodante (RCA), la amplificación isotérmica mediada por asa (LAMP), la amplificación
isotérmica por desplazamiento múltiple (IMDA), la amplificación dependiente de helicasa (HDA), la amplificación
circular dependiente de helicasa (cHDA), la amplificación isotérmica con un solo cebador (SPIA) y la
amplificación basada en la invasión de la hebra (SIBA) (Gill & Ghaemi, 2008). El método más utilizado es la
LAMP, que hace uso de cuatro cebadores formando un ADN en forma de tallo-lazo mediante la síntesis de ADN
con cebador propio y mediante una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de la hebra. El resultado
del proceso de amplificación es la producción de asas en los extremos de las hebras complementarias, que se
extienden continuamente. El proceso de amplificación se refleja por la aparición de turbidez en la mezcla de
reacción o por la aparición de una señal fluorescente si se utilizan tinciones fluorescentes (Gill & Ghaemi, 2008).
Se ha desarrollado un nuevo enfoque para la detección de ADN diana utilizando la dispersión de Raman de
superficie aumentada (SERS) (Harpster et al., 2009). Este método se basa en capturar una sonda conjugada a
tiol y una sonda informadora marcada con azul de metileno, que se une al ADN complementario (diana). Una
etiqueta de Raman posiciona el azul de metileno en una nanopartícula de oro, a una distancia óptima para
potenciar la SERS. La producción de una señal mesurable específica de captura del espectro de Raman tiene
lugar por la estimulación de resonancia de plasmón de superficie potenciada, mediante la excitación por láser. La
sensibilidad analítica del método es de nivel nanomolar. La señal también se puede medir mediante disipación en
microbalanza de cristal de cuarzo (un método que se basa en la inducción de un efecto piezoeléctrico), que
permite realizar una interpretación cuantitativa de los resultados. En una modificación de este método se utilizan
nanopartículas paramagnéticas como portadoras de la sonda de captura. Una vez el ADN diana se ha unido a
las sondas de captura e informadoras, los complejos son atraídos magnéticamente a una posición concreta,
donde se mide la señal “concentrada”. Este método también permite una evaluación cuantitativa de los
resultados.
Las pruebas serológicas que se utilizan con frecuencia para identificar microorganismos pueden no diferenciar
entre cepas de agentes patógenos estrechamente emparentados, tanto si estos son virus como bacterias,
hongos o parásitos. Los procedimientos basados en el ADN pueden ofrecer un mayor grado de discriminación,
que a menudo es necesario. Un punto de partida adecuado pueden ser los análisis de los polimorfismos en la
longitud de los fragmentos de restricción (RFLP).
El enfoque del RFLP se basa en el hecho de que los genomas de agentes patógenos incluso estrechamente
emparentados presentan variaciones en las secuencias. Así, por ejemplo, el orden lineal de nucleótidos
adyacentes que incluya la secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción específica en un genoma
puede estar ausente en el genoma de otra cepa estrechamente emparentada.
En la práctica, el RFLP consiste en aislar el agente patógeno, extraer ADN o ARN (con la posterior transcripción
inversa a ADNc), y a continuación digerir el ácido nucleico con una o varias enzimas de restricción. Estas
enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen y escinden ADN bicatenario por secuencias de
nucleótidos específicas denominadas puntos de restricción. Después, cada fragmento de ADN digerido se
separa mediante electroforesis en gel y se visualiza mediante tinción con bromuro de etidio. Lo ideal es que cada
cepa manifieste un patrón propio, o huella de ADN. Al principio pueden proponerse muchas enzimas de
restricción distintas, de modo que pueden llevarse a cabo análisis de muchas huellas genéticas a partir de
digestiones con varias enzimas de restricciones determinadas; una combinación de los mejores resultados
permitirá una exhaustiva diferenciación entre cepas (Loza-Rubio et al., 1999).
Para el estudio de agentes patógenos es más útil una modificación de la técnica clásica de la RFLP, por la cual
se incorpora la PCR como paso preliminar. Se utiliza PCR para amplificar una región específica del genoma
(cuya secuencia ya se sabe que varía en función del agente patógeno), que a continuación sirve de ADN molde
para la técnica del RFLP. Esta combinación (PCR-RFLP) ofrece una sensibilidad y comparabilidad mucho
mayores para la identificación de agentes patógenos y es especialmente útil cuando el animal infectado presenta
una carga de agente patógeno baja, o bien un agente patógeno difícil de aislar en cultivo. Así pues, permite
determinar la presencia de cepas o tipos concretos en un brote de enfermedad, y debería posibilitar la
trazabilidad epidemiológica de cepas dentro de un país o entre países. La incorporación de electroforesis en gel
de campo pulsante (PFGE) facilita la separación de grandes (hasta de varias megabases) fragmentos de ADN y
puede ser una útil ayuda en el análisis por RFLP básico. Estas tecnologías se utilizan mucho en el programa
oficial de detección y discriminación de agentes patógenos transmitidos por los alimentos (Escherichia
coliO157:H7, Salmonella, Shigella, Listeria o Campylobacter) del Center for Disease Control, del Department of
Health and Human Services de EE.UU. (http://www.cdc.gov/pulsenet/).
Los RFLP tienen un claro valor para los estudios epidemiológicos, pero si se desea una interpretación más crítica
de los datos del RFLP es necesario crear bases de datos para determinar si los perfiles de RFLP son
clínicamente significativos y si están relacionados con factores como la virulencia o el conjunto de hospedadores.
En la práctica, para clasificar una cepa es habitual no basarse en un único punto de restricción sino utilizar
puntos de varios lugares del genoma. Un dilema constante para los técnicos de diagnóstico veterinario es la
evaluación de cualquier diferencia molecular que se detecte entre distintas cepas de un mismo agente patógeno,
puesto que la pérdida o adquisición de punto(s) de la endonucleasa de restricción pueden no estar relacionadas
con diferencias en la capacidad del agente patógeno de causar enfermedad, es decir, una diferencia en el RFLP
puede no ser funcionalmente significativa, excepto como rasgo diferenciador.
Se lleva a cabo una amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD) utilizando cebadores aleatorios
octámeros o dodecámeros que amplificarán o no un segmento de ADN en función de la complementariedad de
este con la secuencia de dichos cebadores. Si se produce una mutación en el ADN molde en el punto que
previamente era complementario con el cebador, no se generará un producto de la PCR, de modo que los
segmentos de ADN amplificados crearán un patrón distinto en el gel. Se pueden secuenciar marcadores RAPD
que definan cepas individuales, y a continuación utilizarse como región amplificada de secuencia confirmada
(SCAR). Así pues, la conversión de un marcador polimórfico anónimo en una SCAR significa que puede llevarse
a cabo una PCR simple para identificar de forma más sencilla un genoma específico (Lewin et al., 2002).
Aunque el RFLP y la PCR-RFLP son mucho menos potentes que las tecnologías modernas de secuenciación,
son baratos, fáciles de ejecutar y lo suficientemente descriptivos para los estudios epidemiológicos de brotes y
para la identificación de cepas determinadas de agentes patógenos. La investigación de motivos mediante
RFLP/PCR-RFLP es una útil herramienta para identificar el origen de una infección (sobre todo cuando se ha
producido transmisión animal a hombre) y/o para diferenciar entre cepas naturales y vacunales de agentes
patógenos determinados.
Las técnicas mediante las cuales puede detectarse y caracterizarse ADN de un agente patógeno siguen
mejorando y evolucionando. Actualmente, lo último en procedimientos discriminatorios es la secuenciación del
genoma. Desde 1977, el método Sanger (Sanger et al., 1977) ha sido el enfoque dominante y el método de
referencia para la secuenciación de ADN.
La secuenciación convencional de ADN se basa en la secuenciación por ciclos de fragmentos diana de ADN con
didesoxinucleótidos marcados, que tienen la propiedad de detener la elongación en su lugar de unión. Cada
didesoxinucleótido se marca con una tinción distinta, lo cual permite diferenciar entre didesoxinucleótidos
distintos. Dado que cada didesoxinucleótido compite con los nucleótidos “normales” por sus puntos de unión
complementaria, el resultado de esta amplificación por PCR será una mezcla de fragmentos de ADN de distintas
longitudes, cada uno de los cuales termina con un didesoxinucleótido definido (identificable por su color). A
continuación, la mezcla de PCR se analiza mediante electroforesis capilar, que separa los fragmentos en función
de su longitud y lee el color de cada fragmento. Después, se aplica un programa informático analítico para
convertir las señales de color en una composición de nucleótidos.
El desarrollo de tecnologías de micromatriz, así como las mejoras en la manipulación del ADN, han contribuido
de manera importante al desarrollo de protocolos de secuenciación directa capaz de detectar agentes patógenos
desconocidos. Esta tecnología permite secuenciar grandes fragmentos de ADN, de modo que posibilita la
comparación de secuencias con las de bases de datos, disponibles solo localmente o de dominio público.
La secuenciación de una parte bien caracterizada del genoma está desempeñando un importante papel en la
caracterización de agentes patógenos y en estudios epidemiológicos. La secuenciación de productos
amplificados mediante PCR utilizando cebadores degenerados que acceden a un gen común a los virus de la
misma familia se ha convertido en una importante herramienta de diagnóstico, sobre todo para la identificación
de miembros de la familia previamente no reconocidos. La secuenciación de productos en una región definida del
genoma se utiliza en estudios epidemiológicos para evaluar la similitud genética con otros agentes patógenos de
la misma especie (subtipo), para determinar las propiedades filogenéticas o para determinar el origen de un
brote/infección. Además, analizando y comparando distintos motivos de la secuencia, esta tecnología ofrece la
posibilidad de predecir la tendencia de un agente patógeno a mutar dando lugar a más cepas patógenas, lo cual
permite, hasta cierto punto, predecir cómo será la propagación de un brote o una infección (Horimoto&Kawaoka,
1995).
Las tecnologías de última generación, como la PCR en la que se utilizan cebadores marcados con moléculas de
masas altas conocidas y la secuenciación de alto rendimiento (Belák et al., 2009; Lipkin, 2010) permiten realizar
diagnósticos mucho mejores que con la secuenciación dirigida convencional. La PCR en la que se utilizan
cebadores marcados con moléculas de masas conocidas se ha utilizado con éxito para la detección simultánea y
la diferenciación de enfermedades sindrómicas, como enfermedades respiratorias, diarreas, encefalitis/meningitis
y fiebres hemorrágicas (Lipkin, 2010). Además, la secuenciación de alto rendimiento aplicada a plataformas de
multiplexado es capaz de generar secuenciación aleatoria del genoma completo, lo cual supone poner detectar y
comparar al mismo tiempo el agente patógeno en distintas regiones del genoma.
El lanzamiento comercial de la primera pirosecuenciación paralela, la plataforma secuenciadora de ADN 454, en
el año 2005, supuso el inicio de la nueva era del análisis genómico de alto rendimiento, ahora denominado
secuenciación de nueva generación (NGS). Esto permite secuenciar un gran genoma en poco tiempo, lo cual
facilita el estudio del material genético extraído directamente de muestras ambientales, o metagenómica. Estas
nuevas tecnologías han permitido identificar rápidamente un agente patógeno desconocido (agentes patógenos
emergentes) o difícil de cultivar in vitro, así como identificar una variante presente en pequeñas cantidades en
una mezcla (Kunin et al., 2008).
La secuenciación de alto rendimiento supone un gran desafío para las soluciones bioinformáticas necesarias
para analizar las enormes cantidades de datos generados, con el fin de dar respuesta a cuestiones biológicas
concretas, como posibles amplificaciones de grandes cantidades de agentes patógenos inesperados y sus
interacciones con el genoma de la células hospedadoras (Kunin et al., 2008). El proceso de diferenciación de
estos agentes patógenos, cuando se lleva a cabo utilizando un sistema BLAST convencional, sigue siendo lento
e inadecuado para el uso sistemático. Actualmente se están desarrollando varios enfoques para resolver este
problema, como la preparación de la muestra (retirar el ADN de la célula hospedadora eucariota durante la fase
de extracción), la reducción de los grupos de datos entrados para la evaluación (enviando partes de los
amplicones obtenidos en lugar del genoma completo), el estudio de un grupo reducido de agentes patógenos
(por ejemplo, agentes patógenos animales, solo virus/bacterias, solo un grupo de virus/bacterias, etc.) y la
optimización de la bioinformática (producción de programas informáticos especializados capaces de analizar
grandes cantidades de datos utilizando algoritmos integrados). Cada uno de estos enfoques tiene ventajas e
inconvenientes, pero parece ser que la cuidadosa preparación de la muestra y la optimización de la
bioinformática son las mejores soluciones.
La aplicación de sondas convencionales de ADN y el análisis mediante micromatrices son procesos distintos
pero estrechamente relacionados. Lo fundamental en ambos procesos es la unión (hibridación) del ADN, de una
muestra sospechosa de contener un agente patógeno (el ADN “desconocido”), con ADN altamente caracterizado
extraído con antelación de un agente patógeno de interés (el ADN “conocido”).
Al utilizar sondas convencionales de ADN, el ADN (o ARN) desconocido – la diana- se inmoviliza en una
superficie sólida, por ejemplo, una membrana. El ADN conocido, en forma de sonda marcándolo o añadiéndole
moléculas de algún modo, está en fase líquida y se aplica al ADN diana.
Además, en el uso de sondas convencionales de ADN, la diana pueden ser ácidos nucleicos extraídos de
material clínico o de cultivos celulares, que (a) se añaden a membranas (una transferencia puntual o
transferencia por ranuras), o (b) se transfieren a una membrana tras una electroforesis en gel, lo cual es menos
conveniente en un contexto de diagnóstico. La cantidad de agente patógeno en una muestra clínica podría ser
demasiado baja como para ser detectada. En consecuencia, el ácido nucleico podría amplificarse mediante PCR
o RT-PCR, aplicando el producto de la PCR a una membrana. Para visualizar una sonda unida a esta diana, la
sonda puede marcarse con un núclido radiactivo o, lo que es más frecuente y seguro, “marcarse” de forma no
radiactiva. Así, por ejemplo, puede incorporarse biotina o psoralen-biotina a la sonda, y la sonda a continuación
debe detectarse añadiendo estreptavidina unida a una enzima para que se genere color o luz
(quimioluminiscencia).
En el diagnóstico con micromatrices, la diana es el ADN conocido (grandes oligonucleótidos o ADN
complementario), inmovilizado en un porta de vidrio, y el ADN desconocido está en fase líquida y marcado para
que sirva de sonda.
En la utilización de sondas de micromatriz, la sonda se crea a partir del ácido nucleico de la muestra problema.
El ácido nucleico se extrae de una muestra y se lleva a cabo una PCR o una RT-PCR utilizando cebadores de
oligonucleótidos aleatorios. De esta forma, se amplifica parte del total de ácidos nucleicos de la muestra – tanto
del hospedador como del agente patógeno. Estos productos de la PCR, representativos de todo el ácido nucleico
de la muestra, se marcan con una tinción fluorescente y se aplican al micromatriz. En condiciones óptimas, solo
el ADN del agente patógeno se unirá al ADN del porta de vidrio. Si el objetivo es detectar un agente patógeno
concreto o un grupo de agentes patógenos emparentados, pueden utilizarse oligonucleótidos específicos del
agente patógeno para amplificarlos dentro de la muestra, con el fin de producir una sonda.
Las micromatrices se denominan así porque pueden estar formadas por varios miles de ADN conocidos distintos,
y cada ADN se deposita sobre portas de vidrio en forma de puntos formando la matriz. Cada punto mide solo
unos 10 μm de diámetro. Para crear las matrices pueden utilizarse ADN complementarios aparte de los genes
seleccionados de los agentes patógenos (Belák et al., 2009). No obstante, si deben estudiarse grandes
cantidades de agentes patógenos, sería logísticamente más fácil utilizar oligonucleótidos grandes.
Pueden diseñarse micromatrices para la detección de agentes patógenos para varios niveles de diferenciación.
En el caso de los ADN diana oligonucleotídicos, inicialmente pueden designarse oligonucleótidos capaces de
detectar y diferenciar agentes patógenos a nivel de género. Puede escogerse un número de oligonucleótidos, tal
vez de unos 10, con un alto grado de conservación de la secuencia (oligonucleótidos consenso) dentro de un
género determinado, de tal modo que una sonda creada a partir de una muestra de campo que contenga un
miembro de ese género probablemente se hibridaría con al menos algunos de los oligonucleótidos, mientras que
no se hibridaría (o se hibridaría en menor medida) con los que correspondieran a géneros relacionados, por
ejemplo para diferenciar cepas de Apthovirus (virus de la fiebre aftosa [VFA]) de cepas de Enterovirus de la
familia Picornaviridae. A continuación, pueden escogerse otros grupos de oligonucleótidos, que se depositarán
sobre el mismo porta de matriz, capaces de caracterizar un agente patógeno con mayor especificidad, por
ejemplo para diferenciar los siete tipos de VFA, y posiblemente incluso para afinar más y llegar a nivel de
subtipo.
En el uso de sondas de ADN convencionales, la detección de un agente patógeno resulta limitada por el número
de sondas utilizadas, mientras que la única limitación en el análisis mediante micromatrices es la cantidad de
ADN diana que contenga la matriz. Si una micromatriz tiene 1000 oligonucleótidos distintos, para lograr la misma
potencia de resolución mediante el uso de sondas convencionales se precisarían 1000 sondas y 1000 reacciones
de sonda independientes. La gran ventaja del análisis mediante micromatriz al buscar agentes patógenos es que
pueden buscarse cientos de agentes patógenos al mismo tiempo aplicando sondas en un solo porta de
micromatriz. Es evidente que el análisis de micromatrices tiene un gran potencial en la investigación de
enfermedades de etiología desconocida o enfermedades en las que pudiera haber más de un agente patógeno
implicado, y cuando se requiere subtipificación. Para potenciar la sensibilidad de la detección de agentes
patógenos, pueden utilizarse micromatrices junto con amplificaciones por PCR. Estas PCR se suelen diseñar
para amplificar uno o más genes conservados, o múltiples secuencias, como en el caso de la PCR en la que se
utilizan cebadores muy conservados, la PCR consenso y la PCR múltiple. Cuando se deba identificar un agente
patógeno concreto, será menos justificable la utilización de una micromatriz, puesto que la producción e
hibridación en portas es relativamente cara. En lugar de ello, para estos casos más sencillos, será más adecuado
utilizar una PCR específica de agente patógeno/subtipo, seguida de una secuenciación o RFLP para la
confirmación.
Actualmente, la mayoría de nuevas tecnologías, como la PCR con cebadores marcados con moléculas de masa
conocida, la SERS, la secuenciación de alto rendimiento, etc. son compatibles con ciertos formatos de
micromatriz. Esto permite un alto multiplexado de las pruebas en una sola ejecución, lo cual permite generar
grandes cantidades de datos a partir de una sola muestra. Se utilizan programas informáticos adecuados a
efectos de control/garantía de calidad internos en las micromatrices, así como para el registro de datos
relacionados con el estado de una muestra determinada.
Si los avances del pasado en biotecnología son indicativos del futuro, lo esperable es que el equipo y los
reactivos de las micromatrices sean cada vez menos caros, lo cual permitiría una mayor aplicación de esta
tecnología al diagnóstico de enfermedades de los animales. Ello ayudará en la investigación de virus hasta ahora
desconocidos o la caracterización de cepas bacterianas en cuanto a virulencia, sensibilidad a antimicrobianos u
otros marcadores importantes. Uno de los principales desafíos afrontados al utilizar enfoques basados en
matrices es la manipulación y el análisis de las grandes cantidades de datos que se generan.
La metagenómica se define como un estudio, independiente de cultivo, del conjunto de poblaciones microbianas
(microbioma) que contiene una muestra, analizando el contenido de la secuencia de nucleótidos de la muestra
(Bexfield&Kellam, 2011). La tecnología se basa en la amplificación y secuenciación de todo el contenido en ADN
y/o ARN de una muestra determinada seguido de un exhaustivo filtrado de los datos obtenidos utilizando
soluciones informáticas específicas. La metagenómica es una potente herramienta para la detección aleatoria de
agentes patógenos existentes o emergentes. Existen varias consideraciones relacionadas con esta tecnología,
como la proporción entre el número de secuencias diana y el número de secuencias amplificadas totales
(lecturas del 0,00135% en caso de detectar arenavirus) (Palacios et al.,2008), la selección de la muestra
(cantidad de agentes patógenos en la muestra diana), la adquisición de datos sobre el consumo de tiempo y el
tiempo necesario para el análisis de los datos. Actualmente, las dos principales limitaciones son las siguientes: i)
dado que el método se basa en hallar similitudes con agentes patógenos conocidos, todavía no existe solución
para la definición de secuencias sin par, y ii) las soluciones informáticas que puedan facilitar la interpretación de
los resultados. Para minimizar estos inconvenientes, actualmente se tienen en cuenta tres soluciones: aumentar
la carga de agentes patógenos (muestras problema con alta probabilidad de multiplicación del agente patógeno),
reducir la cantidad de datos resultantes reduciendo el número de agentes patógenos buscados y/o excluyendo
secuencias de referencia del hospedador del análisis de datos, y optimizar la bioinformática para conseguir
aplicaciones “relacionadas con la profesión”.
No está claro cuál es el límite entre las que podrían denominarse “pruebas biológicas clásicas” y los “métodos
basados en la biotecnología”, y ambas expresiones se utilizan para detectar proteínas específicas de agentes
patógenos, o respuestas de anticuerpos contra dichas proteínas. La mayoría de los métodos se basan en
interacciones inmunitarias entre antígenos y anticuerpos. También es difícil diferenciar claramente entre lo que
es una prueba de detección de anticuerpos y lo que es una prueba de detección de antígeno, ya que la mayoría
de estas pruebas pueden utilizarse tanto para detectar antígeno como anticuerpos, en función de si se busca uno
u otro. Por tanto, en este apartado, la clasificación de los métodos de detección de antígeno y anticuerpos está
condicionada, y para cada método se ofrece una calificación. A efectos de integridad, en este apartado se ofrece
una breve descripción de inmunoanálisis convencionales, como la aglutinación o la fijación del complemento, así
como de los últimos avances en biotecnología, como las distintas plataformas ELISA.
El enzimoinmunoanálisis de captura de antígeno (agELISA) facilita la detección de antígeno de agentes
patógenos presentes en un animal antes de que aparezcan los signos clínicos o cuando estos ya se observan. El
AgELISA suele seguir un formato de prueba en sándwich utilizando anticuerpos de captura y de detección (o
bien MAb específicos o bien anticuerpos policlonales). En primer lugar, el MAb específico o policlonal captura el
antígeno de la muestra unido a un soporte de fase sólida y su presencia se detecta mediante el uso de un
segundo MAb o un anticuerpo policlonal, que puede marcarse de forma radiactiva o, lo que es más frecuente,
enzimática. Si el anticuerpo de detección no se marca, se utiliza un conjugado anti-especie (que reaccione frente
al anticuerpo de detección). El anticuerpo de captura selecciona el antígeno diana de otra proteína de
competición presente en suspensiones de la muestra y asegura que sea semi-concentrada para aumentar la
probabilidad de detección. Las características deseadas en un MAb de captura son que se una fuertemente al
agente patógeno, que reconozca un epítopo conservado muy específico en el agente patógeno buscado, y que
pueda unirse a una placa de ELISA sin perder reactividad. Además, a menudo se utiliza un segundo MAb que
reconoce un epítopo distinto del reconocido por el MAb de captura unido a la placa de ELISA, como parte del
sistema indicador. No obstante, puede ser difícil identificar MAb con una exhaustiva reactividad intra-tipo, de
modo que para aumentar la probabilidad de reacción contra todas las variantes antigénicas tal vez sean
preferibles antisueros policlonales.
Se han desarrollado AgELISA para la detección de Anaplasma (Trueblood et al., 1991), del virus de la diarrea
viral bovina (Mignon et al., 1991), del virus de la peste bovina y del virus de la peste de los pequeños rumiantes
(Libeau et al., 1994). Ahora son importantes métodos de captura de antígeno relacionados en los que se utilizan
perlas inmunomagnéticas, muy aceptados para la detección de ciertas infecciones bacterianas, como las
causadas por Listeria, Salmonella o Escherichia coli. El principio de esta tecnología se basa en la separación
inmunomagnérica, es decir, la que se consigue utilizando pequeñas partículas super-paramagnéticas o perlas
recubiertas con anticuerpos contra antígenos de superficie de las células. Tras la extracción magnética de la
muestra problema utilizando un segundo anticuerpo en formato sándwich pueden detectarse tanto bacterias
intactas como sus determinantes antigénicos solubles. Como unión libre de superficie sólida, las pruebas de
captura de antígeno en las que se utilizan perlas inmunomagnéticas permiten potenciar la cinética de una
reacción antígeno-anticuerpo. Como resultado, se reducen tanto la unión inespecífica como el periodo de
incubación.
El ELISA cuantitativo (qELISA) no se utiliza específicamente para la detección de enfermedades. No obstante, se
utiliza mucho para medir la concentración de proteínas específicas (tiroxina, esteroides) u otras proteínas o
haptenos en el organismo o líquidos corporales. Así, estos métodos a menudo se utilizan para el diagnóstico de
trastornos hormonales, principalmente en la reproducción animal. El principio es muy similar al ELISA de
competición (cELISA). Las placas se recubren de anticuerpos contra la sustancia que va a medirse. La sustancia
de competición se marca con un marcador (un isótopo en un radioinmunoanálisis, y una enzima o biotina en un
enzimoinmunoanálisis) y se titula a una concentración que saturará los anticuerpos de recubrimiento. Se añade
un grupo de estándares de concentración conocida a los pocillos de la placa de ELISA. A medida que aumenta la
concentración del estándar, el competidor marcado se va desplazando en los pocillos adecuados, dando lugar a
una disminución de la coloración al final de la reacción. En base a esta correlación, se dibuja una curva estándar,
que muestre la pérdida de coloración (porcentaje de desplazamiento) en función de la concentración conocida.
Una vez se ha dibujado la curva estándar, se mide el porcentaje de desplazamiento causado por la muestra
desconocida y se lee la concentración de la sustancia buscada utilizando la curva estándar.
Se utiliza la prueba de la inmunofluorescencia (FAT) para detectar agentes patógenos en tejidos o líquidos del
animal, utilizando anticuerpos específicos contra el antígeno buscado. Los anticuerpos se marcan con tinción
fluorescente (la más utilizada es el isotiocianato de fluoresceína [ITCF]). Una vez la muestra está preparada,
según un procedimiento de laboratorio predefinido, se añaden a la misma anticuerpos marcados, la muestra se
incuba en condiciones definidas, se lava para eliminar los anticuerpos no unidos y se examina con microscopio
de fluorescencia. Aparece fluorescencia visible en los puntos de unión de los anticuerpos específicos. Este
método se utiliza con frecuencia para la detección del virus de la rabia en encéfalos de animales muertos y el
virus de la peste porcina clásica en tejidos de cerdos sospechosos. Dado que es un método basado en la unión
directa del anticuerpo marcado al antígeno (agente patógeno) presente en la muestra, normalmente se denomina
inmunofluorescencia directa.
Como complemento del aislamiento de los microorganismos causales a partir de tejidos, la inmunohistoquímica
se ha convertido en una herramienta estándar para la identificación de agentes patógenos, y también para la
confirmación de los resultados obtenidos utilizando tecnología diagnóstica punta (como la PCR con cebadores
marcados con moléculas de masa conocida). La detección in situ de antígenos en tejidos fijados ofrece varias
ventajas respecto a otras técnicas de diagnóstico. Estas ventajas son las siguientes: (i) comodidad de envío de la
muestra; (ii) manejo seguro de agentes patógenos potencialmente zoonóticos; (iii) estudios retrospectivos de
muestras guardadas; (iv) rapidez, y (v) la detección de microorganismos inviables (Haines & Clark, 1991).
También se utiliza inmunohistoquímica para la detección de proteína anómala de prión (PrP Sc) en tejido
encefálico para confirmar el prurigo lumbar, la EEB u otras encefalopatías espongiformes transmisibles, y se ha
demostrado que es más sensible que el examen histopatológico estándar (Thorgeirsdottir et al., 2002). A medida
que aumenta la cantidad de MAb contra antígenos determinados, aumenta la utilización de la
inmunohistoquímica para la identificación de microorganismos y de otros marcadores específicos de
enfermedades autoinmunes y neoplasias. Dado que la fijación en formalina permite desnaturalizar los epítopos
antigénicos (es decir, la estructura tridimensional reconocida por los MAb) el paso limitante en la aplicación de la
inmunohistoquímica es identificar una combinación adecuada de MAb/antígeno que se una en tejidos fijados en
formalina. Esto puede conseguirse utilizando cortes congelados o bien técnicas de recuperación de antígeno
(como la digestión por enzima proteolítica o el tratamiento en microondas) antes de la inmunotinción.
La inmunocromatografía constituye un método cómodo de detección de antígenos en unos minutos sin
necesidad de aparatos especiales. La muestra se aplica a un extremo de un filtro en el que se inmoviliza
anticuerpo y se aplican microperlas (como por ejemplo, de oro coloidal) conjugadas a anticuerpo. El antígeno de
la muestra forma un inmunocomplejo con el anticuerpo marcado con el oro coloidal. Este complejo se desplaza
junto con la muestra líquida, y establece contacto con el anticuerpo inmovilizado en la membrana, donde forma
un inmunocomplejo con el anticuerpo inmovilizado generando un producto coloreado que puede visualizarse a
simple vista.
La aglutinación es un método en el que se utiliza la propiedad de los anticuerpos específicos de unirse a varios
microorganismos patógenos formando una sola agrupación, obteniéndose así grandes complejos, que precipitan
fácilmente. La precipitación puede ser visible macroscópicamente o microscópicamente. En laboratorios de
veterinaria todavía se utilizan mucho distintas aplicaciones técnicas de este principio, sobre todo para la
detección de anticuerpos específicos contra la brucelosis y la leptospirosis (véanse los capítulos específicos de
este Manual sobre cada enfermedad). Este método se puede utilizar para la detección tanto de anticuerpos,
cuando se utiliza un antígeno conocido, como de antígeno, cuando se utilizan sueros bien definidos.
El método de inhibición de la hemaglutinación se basa en la propiedad de algunos agentes patógenos
(principalmente virus) de aglutinar eritrocitos inespecíficamente. En presencia de anticuerpos específicos, esta
actividad del virus se puede “bloquear” y dejará de aglutinar los eritrocitos. La prueba se utiliza para la detección
cualitativa y cuantitativa tanto de antígenos como de anticuerpos. Se ha utilizado mucho para la detección de
anticuerpos específicos de serotipo contra la influenza aviar, la peste de los pequeños rumiantes (PPR) y otras
enfermedades. Esta prueba también se puede utilizar para detectar antígenos (detectar la presencia de un virus
de la influenza aviar en el líquido alantoideo tras intentar aislarlo) (Mulder & Brans, 1952).
La prueba de la inmunodifusión en gel de agar se basa en la propiedad de las proteínas de difundir
aleatoriamente en un agar de determinada concentración. Se colocan anticuerpos y antígeno en pocillos a una
distancia definida. Tras la incubación, en el punto del gel de agar en que los anticuerpos y el antígeno se
encuentran y se unen, se forman líneas de precipitación, visibles bajo un haz de luz oblicua intensa sobre un
fondo negro. La prueba se utiliza más para la detección de anticuerpos contra la influenza aviar (anticuerpos
matriz), la anemia infecciosa equina (prueba de Coggins) y la leucosis bovina enzoótica. En ciertas
circunstancias, la prueba se puede utilizar para la detección de antígeno (para llevar a cabo un seguimiento del
éxito del aislamiento del virus de la influenza aviar en líquido alantoideo).
El complemento es un sistema termolábil de más de 25 proteínas presentes en la sangre que se activan
secuencialmente mediante complejos de antígeno/anticuerpo para ayudar a eliminar agentes patógenos. La
prueba de la fijación del complemento (CF) se basa en la propiedad de algunos anticuerpos de utilizar el
complemento como mediador. La prueba se basa en dos reacciones independientes, cada una de las cuales
requiere el complemento como mediador: (i) la reacción “principal”, en la que el suero problema (inactivado por
calor para destruir el complemento) se incuba con una fuente externa (normalmente de conejo o de cobaya) de
complemento y con el antígeno; y (ii) la reacción “ayudante” (indicadora), en la que se incuban anticuerpos antieritrocito (“hemolisina”) con eritrocitos de oveja lavados a una concentración predefinida. Si el suero problema da
positivo (específico del antígeno buscado) en la reacción principal, se habrá utilizado complemento y, por tanto,
el total de la mezcla carecerá de complemento activo. Si la reacción es negativa, no se habrá gastado
complemento y la mezcla contendrá complemento activo. Tras un periodo de incubación adecuado, se añade un
volumen definido de la mezcla de la reacción “principal” a la mezcla de la reacción “ayudante”. En caso de
reacción positiva (sin complemento activo en la mezcla “principal”), los eritrocitos de la reacción “ayudante” no se
hemolizarán y formarán un botón redondo bien definido en el fondo del tubo (o en los pocillos, en el caso de las
pruebas en que se utiliza un formato de microplaca). El sobrenadante de estos tubos (o pocillos) será
transparente. En el caso de una reacción negativa (cuando el complemento de la mezcla “principal” está activo),
los eritrocitos de la reacción “ayudante” se hemolizarán. En este caso, no habrá formación del botón en el fondo
del tubo (o pocillo, en las pruebas donde se utiliza un formato de microplaca). El sobrenadante de estos tubos (o
pocillos) será rojizo y turbio. La CF puede utilizarse para la determinación cualitativa y semicuantitativa de
anticuerpos específicos. Todavía se utiliza mucho para la detección de anticuerpos contra la brucelosis en
ganado bovino, ovino y caprino, la fiebre Q, la pleuroneumonía contagiosa bovina (PNCB) y otras enfermedades.
En un iELISA, el antígeno buscado (entero o purificado) se une a la fase sólida en una placa de ELISA. Se
añaden muestras de suero a una dilución adecuada. Si hay anticuerpos específicos contra el antígeno de
recubrimiento, se unirán a dicho antígeno. Las placas de ELISA se lavan para eliminar todo posible anticuerpo no
unido. A continuación, se añaden antisueros anti-inmunoglobulina conjugados a una enzima (normalmente una
peroxidasa), específicos de la inmunoglobulina de la especie animal estudiada. Si en la primera fase ha habido
anticuerpos específicos contra el antígeno de recubrimiento, las anti-inmunoglobulinas conjugadas se unirán a
ellos y no se eliminarán durante el segundo paso de lavado. A continuación se añade el tampón de sustrato. En
los casos positivos (presencia de anticuerpos específicos) el color del tampón de sustrato cambiará. Se mide la
aparición de color a una longitud de onda definida utilizando un espectrofotómetro, que será proporcional al nivel
de anticuerpos presente en la muestra.
El cELISA es un inmunoanálisis que puede utilizarse para detectar o cuantificar anticuerpo o antígeno mediante
un método de competición. El cELISA para la detección de anticuerpos específicos ha sustituido en gran medida
el iELISA para la detección a gran escala y la serovigilancia. El cELISA ofrece importantes ventajas respecto al
iELISA, puesto que permite analizar muestras de varias especies sin necesidad de conjugados específicos de
especie marcados con enzimas para cada especie analizada. Muchos antígenos son extremadamente difíciles o
lentos de purificar. Cuando se utilizan en una prueba indirecta, pueden producir valores de fondo altos como
consecuencia de una unión inespecífica. Sin embargo, pueden utilizarse antígenos relativamente crudos en el
cELISA siempre que el “anticuerpo de detección” tenga la especificidad deseada. El principio de una prueba de
competición para la detección de anticuerpos es la competición entre el suero problema y el anticuerpo de
detección. Se detecta unión específica del anticuerpo de detección utilizando un conjugado anti-especie
adecuado. Cuando se obtiene un color inferior al esperado, significará que se ha producido unión de anticuerpos
presentes en el suero problema al antígeno, lo cual, por tanto, impide la unión del anticuerpo de detección
específico.
El funcionamiento básico del bELISA es similar al descrito para el AgELISA (párrafo B2.1). Anticuerpos
específicos contra el antígeno buscado se unen a la fase sólida de la placa de ELISA. El antígeno, antes de ser
añadido a la placa recubierta de anticuerpo, se incuba con las muestras. Si las muestras contienen anticuerpos
contra ese antígeno, se unirán (bloquearán) al antígeno durante su incubación. Cuando se añada a los pocillos,
el antígeno bloqueado será incapaz de unirse a los anticuerpos de recubrimiento. Como consecuencia, cuando
se añada anticuerpo de detección a los pocillos, este no será capaz de reconocer ningún antígeno unido (no
aparecerá color). Por el contrario, si la muestra corresponde a un caso negativo, se producirá unión y, por tanto,
aparecerá color.
La inmunoelectrotransferencia combina la alta resolución de la electroforesis en gel con la especificidad de la
detección inmunoquímica y constituye un método de identificación de proteínas inmunodominantes reconocidas
por anticuerpos de animales infectados o anticuerpos monoclonales (MAb) dirigidos contra el agente buscado. El
procedimiento de la inmunoelectrotransferencia puede dividirse en varios pasos: (i) Preparación de la muestra,
(ii) Resolución del antígeno mediante electroforesis en gel, (iii) Transferencia de los polipéptidos separados a un
soporte de membrana (membrana de nitrocelulosa, polivinilidenodifluoruro [PVDF]), (iv) Bloqueo de puntos de
unión inespecíficos en la membrana, (v) Incubación con anticuerpo de detección, y (vi) Detección de anticuerpos
unidos.
La elección del anticuerpo de detección resulta crucial. Los sueros policlonales están formados por varios
anticuerpos que reflejan el repertorio completo de la respuesta inmunitaria contra un antígeno complejo
determinado. Por tanto, detectarán varios polipéptidos bien diferenciados dando un “perfil” característico de
reactividad. Los MAb se unen solo a un epítopo; por tanto, son útiles para identificar polipéptidos muy
específicos. Tras la incubación con el anticuerpo de detección, todo anticuerpo unido a bandas proteicas
específicas se puede visualizar mediante antisueros anti-especie marcados con enzimas y un
sustrato/cromógeno adecuado.
La inmunoelectrotransferencia se lleva a cabo principalmente en laboratorios de diagnóstico para identificar y/o
caracterizar agentes infecciosos en base a la especificidad de antígeno o utilizando antígenos conocidos para
detectar una respuesta serológica específica. Los falsos positivos y falsos negativos de otras pruebas
diagnósticas a menudo se resuelven mediante inmunoelectrotransferencia (Molina Caballero et al., 1993). Como
ejemplo de la detección de antígenos, se ha utilizado la inmunoelectrotransferencia a gran escala como principal
método de detección de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y del prurigo lumbar; asimismo, se ha
utilizado en millones de muestras de tronco encefálico en Europa y otros lugares para la detección de proteína de
prión (Schaller et al., 1999). Hoy en día ha sido sustituida en gran medida por métodos basados en el AgELISA o
en dispositivos de flujo lateral, pero sigue siendo una importante prueba confirmativa y esencial para determinar
si una cepa causante de encefalopatía espongiforme transmisible es responsable de encefalopatías
espongiformes bovinas típicas o atípicas, o bien de prurigo lumbar. La inmunoelectrotransferencia a menudo
también se utiliza para determinar la especificidad de MAb determinados. También pueden transferirse
polipéptidos purificados determinados (o proteínas recombinantes expresadas) a membranas de nitrocelulosa o
de PVDF mediante inmunoelectrotransferencia para examinar la reactividad de sueros problema frente a
proteínas determinadas. Este característico perfil de reactividad puede utilizarse para ayudar a diferenciar entre
animales que han sido vacunados o infectados, como ocurre con la inmunoelectrotransferencia unida a enzima
(EITB), una inmunoelectrotransferencia para la fiebre aftosa que se utiliza mucho en Sudamérica (Bergmann et
al., 1993). El factor que más afecta al éxito de una técnica de inmunoelectrotransferencia es el tipo de epítopos
reconocidos por los anticuerpos. La mayoría de técnicas en gel de alta resolución incluyen algún tipo de
desnaturalización del antígeno. Esto destruye determinantes conformacionales y permite solo la detección de
epítopos lineales o no conformacionales. La mayoría de antisueros policlonales contienen anticuerpos contra
epítopos tanto lineales como conformacionales, pero los MAb van dirigidos a epítopos únicos; así pues, si tienen
por objetivo epítopos conformacionales, no reaccionarán con proteína desnaturalizada.
La modificación de este método puede utilizarse para la detección de anticuerpos. Básicamente, la modificación
se halla en la utilización de anticuerpos secundarios, específicos contra los anticuerpos de la especie estudiada.
Así, por ejemplo, si en un perro se desea comprobar si presenta anticuerpos específicos contra leishmania, se
fija antígeno de leishmania en un porta, se incuba con el suero del perro estudiado, se lava para eliminar los
anticuerpos no unidos y se incuba de nuevo con anticuerpos anti-perro marcados (anticuerpos generados
mediante inmunización de distintas especies animales con inmunoglobulinas de un perro). Aparece fluorescencia
solo si el animal estudiado tiene anticuerpos específicos contra el antígeno buscado.
Las siguientes tecnologías de detección de proteínas están en fase de desarrollo
i)
Pueden utilizarse plataformas ELISA múltiple para crear “pruebas de grupos de enfermedades”
(VDVB, rinotraqueítis bovina infecciosa [RBI], virus parainfluenza tipo 3 [PI3] y virus sincitial
respiratorio [VSR]). La prueba se basa en el mismo principio que el ELISA convencional, adaptado a
un microformato.
ii)
Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) utilizada
como fuente de generación de señal. El marcado del conjugado y el antígeno se lleva a cabo
utilizando dos tinciones fluoróforas. Este principio se ha probado para los formatos de competición y
sándwich.
iii)
“ELISA potenciométrico” basado en la producción de una señal eléctrica, en lugar de una señal de
color, que requiere muy poca preparación de la muestra y que da resultados en 2-15 minutos.
iv)
Una prueba SERS (utilizando oro coloidal como ligando) para la detección de ADN/ARN y proteínas
en reacciones inmunitarias utilizando efecto piezoeléctrico, así como amplificación de la señal
utilizando captura magnética.
v)
Prueba de detección de múltiples proteínas basada en la generación de señal utilizando efecto
piezoeléctrico y la modulación de la oscilación causada por la unión a un analito específico. Esta
prueba se ha desarrollado para obtener un resultado rápido (60 segundos), capacidad de
multiplexado, medidas cualitativas y cuantitativas y ausencia de necesidad de reactivos y/o
incubaciones. El dispositivo es del tamaño de un teléfono móvil, y puede utilizarse una trasmisión de
los resultados sin cables integrada para agilizar el análisis de los datos. El principio de funcionamiento
se ha demostrado científicamente y se están llevando a cabo estudios preliminares sobre su
aplicabilidad al diagnóstico de la influenza aviar.
vi)
Pruebas de unión por proximidad (PLA) para la detección de antígenos
Las PLA son una modificación de la inmunohistoquímica convencional. Se basan en la aplicación de
dos anticuerpos dirigidos contra distintos epítopos de una sola proteína, detectada mediante
anticuerpos secundarios marcados con hebras cortas de ADN conocido. Tras la unión de los
anticuerpos secundarios, sus hebras de ADN se amplifican, y a su vez las sondas detectoras
complementarias (marcadas con tinciones fluorescentes), y a continuación se unen a su secuencia
complementaria en las hebras amplificadas. Esto da lugar a una amplificación múltiple de la señal y
permite la detección de cantidades muy bajas de las proteínas buscadas presentes en la muestra. La
técnica se utiliza como herramienta para la detección rápida de múltiples proteínas o proteomas.
vii)
Análisis mediante MALDI-TOF para bacteriología determinativa
En la espectrometría de masas MALDI-TOF se utiliza una matriz absorbente de la radiación
ultravioleta mezclada con un polímero en un disolvente adecuado. La mezcla muestra/matriz se
deposita sobre una punta de sonda de muestra. En condiciones de vacío, se retira el disolvente,
dejando que las moléculas de polímero co-cristalizadas se dispersen homogéneamente dentro de las
moléculas de matriz. Se determinan las masas molares utilizando un haz de luz láser pulsada con la
frecuencia adecuada. Esta técnica se está utilizando cada vez más en laboratorios de microbiología
para la detección y la diferenciación de agentes patógenos víricos, bacterianos y fúngicos.
El proteoma es el complemento total de las proteínas expresadas en una célula, un tejido o un organismo, y la
proteómica es el estudio de las proteínas, incluidos su nivel de expresión, la modificación post-traslacional y la
interacción con otras proteínas, a gran escala. Dado que no todas las proteínas se expresan en todo momento,
sino que dependen de factores fisiológicos y ambientales, la proteómica puede proporcionar una excelente visión
general de los procesos de la enfermedad a nivel proteico. Dado que la aplicación de la proteómica al
descubrimiento de nuevos fármacos promete enormes beneficios económicos, empresas de todo el mundo han
invertido rápidamente recursos en este nuevo campo de investigación.
Muchos de los métodos que se utilizan en la proteómica, como la electroforesis en gel bidimensional (2DGE) y la
espectrometría de masas (MS), se establecieron hace muchos años. No obstante, avances recientes en las
técnicas de la MS, junto con la secuenciación del genoma completo y el desarrollo de potentes plataformas
bioinformáticas y robóticas, han revolucionado la identificación de proteínas. El principio general de la proteómica
es la separación de proteínas, normalmente mediante 2DGE sobre geles de poliacrilamida; a continuación, se
extraen puntos de proteína, se digieren con tripsina, y los péptidos resultantes se analizan mediante MS.
Después, las masas de estos péptidos se comparan con las masas predichas de péptidos calculadas mediante
análisis informáticos de las bases de datos del genoma, dando lugar a la identificación de genes. También puede
utilizarse la MS para deducir la secuencia de aminoácidos de péptidos y para caracterizar modificaciones posttraslacionales, como la glucosilación o la fosforilación. La 2DGE tiene algunos inconvenientes, sobre todo para la
separación de proteínas hidrofóbicas, de modo que para ciertas aplicaciones se están utilizando otras técnicas
de separación basadas en la cromatografía líquida. Sin embargo, la 2DGE es el método de elección para crear
mapas cuantitativos de expresión de proteínas, y permite analizar muchos miles de proteínas en un corto espacio
de tiempo.
Se pueden medir directamente alteraciones en el genoma de tejidos o líquidos corporales, como el suero, la
orina o líquido cefalorraquídeo, de modo que pueden detectarse con exactitud alteraciones que tengan lugar en
un estado de enfermedad. Además de servir para identificar moléculas que pueden ser la diana de nuevos
tratamientos, este enfoque es muy útil para el diagnóstico de enfermedades en fases tempranas. Hasta ahora,
las aplicaciones clínicas de la proteómica mejor establecidas se encuentran en la identificación de marcadores
para el diagnóstico temprano de cánceres, como cánceres de vejiga, en la orina. No obstante, también se está
llevando a cabo un considerable trabajo de investigación en otros campos, como las cardiopatías, la enfermedad
e Alzheimer y la diabetes insulinodependiente.
La utilización de la proteómica para el diagnóstico de enfermedades infecciosas está en sus inicios, pero está
demostrada su gran importancia. Así, por ejemplo, el diagnóstico definitivo del virus de la hepatitis B crónica
(VHB) sigue basándose en la biopsia hepática, pero el análisis proteómico de muestras de suero indica que la
expresión de al menos siete proteínas séricas está considerablemente alterada en los pacientes con VHB
crónica. De forma similar, el diagnóstico diferencial ante-mortem de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ)
puede facilitarse mediante la proteómica, puesto que datos preliminares indican que siete proteínas del líquido
cefalorraquídeo (LCR) se expresan de modo distinto en pacientes con la ECJ variante que en pacientes con la
ECJ esporádica (Choe et al., 2002).
Una de las aplicaciones extremadamente útiles de la proteómica al diagnóstico de enfermedades infecciosas es
la identificación de nuevos antígenos para el diagnóstico analizando sueros de animales infectados y no
infectados contra proteomas inmunotransferidos, mapeados mediante 2DGE de agentes infecciosos.
En el ámbito de la veterinaria, ahora se están aplicando proyectos de investigación basados en la proteómica,
que sin lugar a dudas producirán nuevas herramientas de diagnóstico para el futuro. Se están obteniendo mapas
de proteoma de varios agentes patógenos de importancia en la veterinaria, como bacterias (Mujer et al., 2002),
protozoos (Rout & Field, 2001) o nematodos (Yatsuda et al., 2003).
Los avances en biología y genética molecular de los años 1970 iniciaron el desarrollo de la tecnología del ADN
recombinante. Desde entonces, el impacto de esta tecnología es tal que desempeña un importante papel en la
investigación científica, así como en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades. La tecnología del ADN
recombinante simplemente consiste en la transferencia de genes de un organismo a otro: literalmente, es la
recombinación de ADN de distintos orígenes. Los objetivos de la tecnología del ADN recombinante son identificar
genes, aislar genes, modificar genes y re-expresar genes en otros huéspedes u organismos. Estos pasos
permiten a los científicos y a los veterinarios identificar nuevos genes y las proteínas que codifican, corregir
defectos genéticos endógenos y crear grandes cantidades de productos génicos específicos, como hormonas,
antígenos para ser utilizados en vacunas, y otras proteínas producidas por agentes biológicos de interés. En las
pruebas de diagnóstico mediante el uso de proteína recombinante es especialmente importante el grado de
especificidad alcanzable.
Los antígenos ideales tal vez sean las proteínas en estado natural, puesto que proporcionan epítopos
estructurales de superficie específicos de secuencia. Muchas de las actuales pruebas de diagnóstico requieren
antígenos de detección que tienen que producirse continuamente a partir de un cultivo celular u obtenerse de un
animal infectado. Estas preparaciones de antígeno son caras y a menudo tienen un periodo de validez corto, y
cada nuevo lote de antígeno requiere estandarización. Casi nunca se dispone de proteínas naturales totalmente
puras, y a menudo se generan anticuerpos contra polipéptidos contaminantes que pueden comportar la aparición
de falsos positivos. La tecnología del ADN recombinante produce antígenos que ofrecen muchas ventajas
respecto a los antígenos aislados de otras fuentes biológicas. Estas ventajas son una gran pureza y una gran
actividad específica y, dado que la proteína se sintetiza en células cultivadas en laboratorio genéticamente
modificadas, cada preparación del producto proteico es idéntica a la preparación previa, lo cual garantiza una
constancia entre lotes. Cuando se utilizan antígenos recombinantes con el formato de cELISA, puede no ser
necesaria la purificación del antígeno recombinante a partir del lisado, puesto que la especificidad del cELISA
depende principalmente del MAb que se haya utilizado.
A continuación se expone un resumen del procedimiento a seguir para la producción de un antígeno mediante
tecnología de ADN recombinante. La identificación de un antígeno de potencial diagnóstico o importancia
científica se logra mediante el estudio de la respuesta de anticuerpos del hospedador frente a las proteínas del
microorganismo en cuestión. Los antígenos inmunodominantes, que se definen como proteínas del
microorganismo contra el cual el hospedador responde con el máximo título posible de anticuerpos, son
especialmente interesantes, puesto que probablemente constituirán un estímulo importante de la inmunidad
celular y humoral contra el agente patógeno de interés. Se utilizan con gran frecuencia estudios de
reconocimiento del antígeno para identificar antígenos inmunodominantes biológicamente relevantes para su uso
en la generación de MAb, así como en el desarrollo de vacunas. Una vez se ha identificado una proteína de
interés, se genera el gen que codifica la proteína utilizando ARN mensajero (ARNm) del microorganismo a modo
de molde para crear ADNc. Este método de clonación del gen que codifica la proteína de interés requiere un
conocimiento previo de la secuencia génica, directamente a partir del microorganismo de interés, o bien
mediante el uso de secuencias génicas de especies estrechamente emparentadas. Cuando no se dispone de
datos sobre la secuencia génica, un método alternativo consiste en generar genotecas recombinantes de ADN
genómico del microorganismo o de ADNc sintetizado a partir de ARNm. Pueden clonarse fragmentos de las
genotecas recombinantes obteniendo así un sistema de expresión de proteína, que puede ser procariota o
eucariota, y comprobar si la genoteca expresa la proteína.
Existe una amplia gama de sistemas de expresión. Puede expresarse proteína en bacterias, normalmente E. coli,
levaduras, células de insectos utilizando baculovirus, o en células eucariotas mediante infección con vectores
víricos adecuados o mediante transinfección permanente. Las diferencias en la glucosilación cuando se prepara
en cultivos celulares bacterianos, de insectos o de mamíferos pueden modificar la estructura proteica y su
reactividad con el anticuerpo. Tal vez se tenga que extraer antígeno de la célula, aunque también puede
secretarse. A menudo se precisa purificación, aunque no siempre. En la producción de antígenos para su uso en
pruebas de diagnóstico se está tendiendo al desarrollo de antígenos peptídicos sintéticos. Esto permite analizar
antígenos como reactivos de diagnóstico en base a la secuencia génica, de modo que se hace innecesario
expresar la proteína entera, lo cual acorta el proceso.
Ya se han determinado las secuencias genómicas de muchos agentes patógenos. Un gen responsable de un
antígeno o inmunogen se puede clonar fácilmente con tecnología PCR y caracterizarse por secuencia de
nucleótidos (Rappuoli & Covacci, 2003). En pocas palabras, el ADN amplificado se puede clonar en un vector
plásmido bacteriano y expresarse como antígeno recombinante. El gen clonado se puede diseñar de tal forma
que la proteína recombinante se una a su terminación N o C con una etiqueta de detección que pueda utilizarse
para su purificación mediante cromatografía de afinidad. Existen muchas etiquetas, pero las más conocidas son
la polihisdina (6-8 residuos), la glutation S-transferasa (GST) o el péptido Flag, formado por 8 residuos de
aminoácido. A continuación, puede determinarse la antigenicidad de los productos génicos. La detección
sistemática del gen antigénico in silico, a partir de datos de la secuencia del genoma, acelera el desarrollo de kits
de diagnóstico y de vacunas (Tortorella et al., 2000).
Existen varias tendencias en las tecnologías de diagnóstico que influirán en la forma en que se enfoque el
diagnóstico de enfermedades en el futuro, afectando al entorno del laboratorio, al análisis de datos y al control de
las enfermedades:
i)
El desarrollo global de tecnologías basadas en chips ha conllevado una importante tendencia a la
miniaturización del formato analítico tanto en pruebas moleculares como de detección de proteínas. Los
formatos analíticos tienen tamaños de entre varios milímetros y varios centímetros.
ii)
Incluso miniaturizadas, pueden desarrollarse plataformas de multiplexado capaces de detectar desde unos
pocos hasta miles de agentes patógenos en una sola muestra.
iii)
La miniaturización del formato analítico va acompañada de una miniaturización similar en el equipo de
laboratorio, lo cual permite realizar análisis in situ. Esta tendencia está dando lugar al uso en el campo de
equipo sofisticado que antes solo se utilizaba en el laboratorio, lo cual facilita un diagnóstico rápido y precoz
de enfermedades infecciosas, así como la rápida intervención de las autoridades competentes en cada
caso.
iv)
El desarrollo de fuentes alternativas de generación/amplificación de señal, sustituyendo la medición de luz
por la de masa, por el efecto piezoeléctrico o por la concentración del ligando comportarán el desarrollo de
una plataforma totalmente nueva de tecnologías.
vi)
Aunque el desarrollo de nuevas tecnologías a menudo puede suponer una mejora de la capacidad, ¡nunca
debe olvidarse la importancia de la prueba confirmativa y el papel que desempeña en el diagnóstico!
viii) Dado que las plataformas de diagnóstico están cambiando continuamente, del modo que se ha descrito
anteriormente, resultan afectados varios componentes de la cadena de control de las enfermedades. Será
necesario desarrollar tecnologías de comunicación y sistemas de información para obtener, guardar y
analizar sistemáticamente los grandes conjuntos de datos producidos por las nuevas tecnologías en un
periodo de tiempo relativamente corto. Es probable que aumente la tendencia a la entrada de resultados en
tiempo real mediante teléfonos móviles o Internet, lo cual precisará un importante desarrollo de sistemas de
información y de manejo de datos.
ix)
Una infraestructura y preparación adecuadas deberán ser parte indispensable de la actualización
tecnológica. Esto incluirá formación a distancia en el uso de pruebas en el campo (obtención y preparación
de muestras, análisis, interpretación de los resultados, procesado de las muestras para ser enviadas a
Laboratorios de Referencia y notificación a las autoridades correspondientes).
x)
Deberá realizarse una adaptación de los planes nacionales de emergencia para la gestión simultánea de
varias enfermedades, así como la gestión de enfermedades nuevas e inesperadas.
BELÁK S. & THORÉN P. (2001). Molecular diagnosis of animal diseases: some experiences over the past decade.
Expert. Rev. Mol. Diagn.,1 (4), 434–443.
BELÁK S., THORÉN P., LEBLANC N. & VILJOEN G (2009). Advances in viral disease diagnostic and molecular
epidemiological techniques. Expert Rev. Mol. Diagn.,9(4), 367–381.
BEXFIELD N. & KELLAM P. (2011): Metagenomics and the molecular identification of novel viruses. Vet. J., 190,
191–198.
CHOE L.H., GREEN A., KNIGHT R.S., THOMPSON E.J. & LEE K.H. (2002). Apolipoprotein E and other cerebrospinal
fluid proteins differentiate ante mortem variant Creutzfeldt-Jakob disease from ante mortem sporadic CreutzfeldtJakob disease. Electrophoresis, 23, 2242–2246.
GILL P. & GHAEMI A. (2008). Nucleic acid isothermal amplification technologies – a review.Nucleosides,
Nucleotides & Nucleic Acids,27, 224–243.
HAINES D.M. & CLARK E.G. (1991). Enzyme immunohistochemical staining of formalin-fixed tissues for diagnosis in
veterinary pathology. Can. Vet. J., 32, 295–302.
HARPSTER M.H., ZHANG H., SANKARA-W ARRIER A.K., RAY B.H., W ARD T.R., KOLLMAR J.P., CARRON K.T., MECHAM
J.O., CORCORAN R.C., W ILSON W.C. & JOHNSON P.A. (2009). SERS detection of indirect viral DNA capture using
colloidal gold and methylene blue as a Raman label. Biosensors & Bioelectronics,25, 674–681.
KUNIN V., COPELAND A., LAPIDUS A., MAVROMATIS K. & HUGENHOLTZ P. (2008). A bioinformatician’s guide to
metagenomics. Microbiol. Mol. Biol. Rev.,72(4), 557–578.
LEWIN S., SCHONIAN G., EL TAI N., OSKAM L., BASTIEN P. & PRESBER W. (2002). Strain typing in Leishmaniadonovani
by using sequence-confirmed amplified region analysis. Int. J. Parasitol., 32, 1267–1276.
LIBEAU G., DIALLO A., COLAS F. & GUERRE L. (1994). Rapid differential diagnosis of rinderpest and pestes des petits
ruminants using an immunocapture ELISA. Vet. Rec., 134, 300–304.
LIPKIN W.I. (2010). Microbe hunting.Microbiol.Molec. Biol. Rev.,74 (3), 363–377.
LOZA-RUBIO E., AGUILAR-SETIÉN A., BAHLOUL CH., BROCHIER B., PASTORET P.P. & TORDO N. (1999). Discrimination
between epidemiological cycles of rabies in Mexico. Arch. Med. Res., 30, 144–149.
MIGNON B., DUBUISSON J., BARANOWSKI E., KOROMYSLOV I., ERNST E., BOULANGER D., W AXWEILER S. & PASTORET P.P.
(1991). A monoclonal ELISA for bovine viral diarrhoea pestivirus antigen detection in persistently infected cattle.
J. Virol. Methods, 35, 177–188.
MOLINA CABALLERO J.M., ANGUIANO A., FERRER O., SERRANO E. & UCEDA A. (1993). Use of an enzyme-linked
immunosorbent assay for serodiagnosis of clinical paratuberculosis in goats. Study by western blotting of falsepositive reactions. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 12, 629–638.
MUJER V.C., W AGNER M.A., ESCHENBRENNER M., HORN T., KRAYCER J.A., REDKAR R., HAGIOUS S., ELZER P. &
DELVECCHIO V.G. (2002). Global analysis of Brucellamelitensis proteomes. Ann. NY Acad. Sci., 969, 97–101.
MULDER J. & BRANS L.M.(1952). Studies on the antigenic behaviour of egg- and egg-mouse-egg-lines of strains of
influenza virus, with the aid of the haemagglutination-inhibition test. Antonie Van Leeuwenhoek,18(2),139–152.
PALACIOS G., DRUCE J., DU L., TRAN T., BIRCH C., BRIESE T., CONLAN S., QUAN P.L., HUI J., MARSHALL J., SIMONS J.F.,
EGHOLM M., PADDOCK C.D., SHIEH W.J., GOLDSMITH C.S., ZAKI S.R., CATTON M.& LIPKIN W.I. (2008): A New
Arenavirus in a Cluster of Fatal Transplant-Associated Diseases. New Engl. J.Med., 358-10, 991–998.
ROUT M.P. & FIELD M.C. (2001). Isolation and characterization of subnuclear compartments from
Trypanosomabrucei. Identification of a major repetitive nuclear lamina component. J. Biol. Chem., 276, 38261–
38271.
SAIKI R., GEFLAND D., STOFFEL S., SCHANF S., HIGUCHI R., HORN G., MULLIS K. & ERLICH H. (1988). Primer-directed
enzymatic amplification of DNA with thermostableDNA polymerase. Science, 293, 487–491.
SANGER F., NICKLEN S. & COULSON A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl Acad.
Sci. USA,74(12), 5463–5467.
SCHALLER O., FATZER R., STACK M., CLARK J., COOLEY W., BIFFIGER K., EGLI S., DOHERR M., VANDEVELDE M., HEIM D.,
OESCH B. & MOSER M. (1999). Validation of a western immunoblotting procedure for bovine PrPSc detection and
its use as a rapid surveillance method for the diagnosis of bovine spongiform encepahlopathy (BSE).
ActaNeuropathol. (Berl.), 98, 437–443.
SCHWEIGER B., PAULI G., ZEICHHARDT H. & KUCHERER C. (1997). A multicentre quality assessment study to monitor
the performance of HIV-1 PCR. J. Virol. Methods, 67, 45–55.
THORGEIRSDOTTIR S., GEORGSSON G., REYNISSON E., SIGURDARSON S. & PALSDOTTIRA. (2002). Search for healthy
carriers of scrapie: an assessment of subclinical infection in an Icelandic scrapie flock by three diagnostic
methods and correlation with PRP genotypes. Arch. Virol., 147, 709–722.
TORTORELLA D., GEWURZ B.E., FURMAN M.H., SCHUST D.J. & PLOEGH H.L. (2000). Viral subversion of the immune
system. Ann. Rev. Immunol., 18, 861–926.
TRUEBLOOD E.S., MCGUIRE T.C. & PALMER G.H (1991). Detection of anaplasmamarginalerickettsemia prior to onset
of clinical signs by using an antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol., 29, 1542–
1544.
YATSUDA A.P., KRIJGSVELD J., CORNELISSEN A.W., HECK A.J. & DE VRIES E. (2003) comprehensive analysis of the
secreted proteins of the parasite Haemonchuscontortus reveals extensive sequence variation and differential
immune recognition. J. Biol. Chem., 278, 16941–16951.
*
* *