1.1. La preservación de alimentos mediante la utilización de
Anuncio
Introducción 1.1. La preservación de alimentos mediante la utilización de productos naturales. Los consumidores actuales demandan cada vez más, alimentos sin sustancias conservantes o antimicrobianas sintetizadas químicamente y asocian alimentos sanos y seguros con alimentos frescos o mínimamente procesados. Esto ha llevado a la búsqueda de nuevas formas de preservación y al análisis de sus efectos sobre la estabilidad microbiológica de los alimentos (Buchanan & Phillips, 1990; Leistner 1992; 1995). La estabilidad microbiológica y por lo tanto la inocuidad de la mayoría de los alimentos procesados (tradicionales y nuevos), está basada en la combinación de diversos factores (composición química bruta, pH, actividad de agua, temperatura de conservación, tratamiento tecnológico, etc). Estos factores controlan el desarrollo microbiano previniéndolo, retardándolo y/o incluso inactivando a los microorganismos (Leistner, 1995). La tecnología de manipulación de factores implica exponer a los microorganismos a un ambiente adverso y de esta manera inhibir su crecimiento al interferir, mediante la combinación de los factores, con su homeostasis (Gould, 1988). La homeostasis es la tendencia de los microorganismos a estabilizar su ambiente interno en respuesta a factores externos. Si el equilibrio interno es modificado por los factores de preservación (actividad de agua, pH, temperatura, aditivos) utilizados en la formulación del alimento, entonces los microorganismos dejarán de multiplicarse o reducirán su velocidad de reproducción, canalizando su energía a reestablecer el equilibrio, cuando esto no ocurre puede producirse la muerte del microorganismo. Los diversos factores de preservación tienen diferentes mecanismos de acción sobre los microorganismos (Leistner, 1995). Uno de los más útilizados para prolongar la vida útil de los alimentos (lapso de aptitud) es el agregado de sustancias que retardan o inhiben la proliferación microbiana. El conocimiento de la influencia de las sustancias utilizadas así como los efectos de la combinación de las mismas, puede permitir el desarrollo de procesos mínimos pero más efectivos para asegurar la estabilidad microbiológica de los alimentos. Ohlsson (1994) señala que los hábitos alimenticios de los consumidores de esta década están cambiando e identifica aspectos como dieta y salud, conveniencia, seguridad e ingredientes naturales como nuevas tendencias en el mercado de alimentos procesados. En muchos países se está consolidando el desarrollo y consumo de alimentos más “naturales”, 2 Introducción minimamente procesado, libres de aditivos o al menos con cantidades reducidas de éstos (Giese, 1994), por lo que existe un peligro potencial en la seguridad de los alimentos al reducir parte de los factores utilizados habitualmente para su preservación (Russel & Gould, 1991). Giese (1994) y Davidson (1996) mencionan que la seguridad de los alimentos mejora significativamente con la incorporación de compuestos antimicrobianos, ya que estas sustancias se añaden a los alimentos para prevenir la descomposición de los mismos, por la actividad metabólica microbiana. Davidson (1996) define a los antimicrobianos como compuestos químicos presentes o añadidos en los alimentos, que retardan el crecimiento microbiano o inactivan a los microorganismos y por lo tanto, detienen el deterioro de la calidad y brindan seguridad al alimento en el cual se encuentran. El aspecto más importante de la pérdida de la calidad de los alimentos es el asociado con el deterioro microbiano y en particular con la presencia y/o desarrollo de microorganismos patógenos. Esto ha llevado a investigar el uso y modo de acción de conservadores disponibles a fin de emplearlos de manera eficiente y a estudiar su aplicación al combinarlos con otras formas tradicionales y noveles de preservación. Los principales antimicrobianos utilizados en alimentos actúan principalmente inhibiendo y/o disminuyendo el crecimiento de los microorganismos, aunque algunos pueden también desactivarlos (Russell & Gould, 1991; Gould, 1996). Las sustancias empleadas como conservadores se usan esencialmente para prevenir el deterioro de los alimentos durante su almacenamiento y distribución, asegurando de esta manera, la inocuidad del producto durante el lapso de aptitud establecido. Por lo tanto, el principal objetivo de ataque de estas sustancias serán aquellos microorganismos que puedan desarrollarse y deteriorar los alimentos. Además, dichas sustancias, se convertirían en un impedimento para el crecimiento de los microorganismos patógenos y productores de toxinas (Gould & Russell, 1991; Davidson, 1996). Numerosos investigadores concuerdan con el hecho de que la evaluación de aditivos para alimentos debe basarse en un balance entre riesgos y beneficios. Por lo tanto, es fundamental que para cada aditivo, dichos riesgos y beneficios, estén identificados y definidos adecuadamente. Particularmente, en el futuro, serán aptos como aditivos aquellos que tengan o cumplan con varias funciones en los alimentos a los cuales se incorporan (Davidson & Branen, 1993). La búsqueda de nuevos compuestos químicos que puedan ayudar a la conservación de alimentos se ha visto restringida por ciertos aspectos, 3 Introducción principalmente económicos. En estos términos, desarrollar un nuevo compuesto y lograr que éste sea aprobado tiene un costo significativamente elevado, sin contar además, el tiempo considerablemente extenso que demanda el proceso de aprobación. Para asegurar que el aditivo desarrollado no tiene ningún efecto negativo sobre la salud, se deben realizar una serie de pruebas que incluyen: genotoxicidad, fertilidad, teratogenicidad, toxicidad subcrónica, y toxicidad crónica, incluyendo carcinogénesis. Una prueba con resultado positivo descalifica al compuesto para que éste pueda ser utilizado en los alimentos (Lück & Jager 1997). Estos obstáculos han conducido a la búsqueda de nuevos conservadores por otras vías. Una de las alternativas, es examinar compuestos que en la actualidad son utilizados en la industria de alimentos con distintos propósitos, los cuales poseen comprobado potencial como antimicrobianos, están aprobados y son seguros en los niveles utilizados. Dentro de estos compuestos se encuentran los llamados antimicrobianos naturales (o productos naturales) presentes en plantas (Nychas, 1995, Davidson, 1996). 1.2. Compuestos con actividad antimicrobiana presentes en plantas La búsqueda de nuevas alternativas para extender el lapso de aptitud de muchos productos alimenticios ha reorientado la investigación hacia los productos naturales. Dentro de éstos existe un gran interés en el uso de los llamados antimicrobianos naturales como posibles susbtitutos de los tradicionalmente utilizados (Nychas, 1995) y existen varios reportes en la bibliografía acerca de la actividad antimicrobiana de especies, hierbas y plantas o sus extractos (Hitokoto et al., 1980; Shelef, 1983; Jay & Rivers, 1984; Karapinar, 1985; Thompson, 1986; Graham & Graham, 1987; Beuchat & Golden, 1989). Las “defensas químicas” cuya función principal es proteger a la planta contra los herbívoros o las enfermedades son agrupadas bajo el término metabolitos secundarios. En la tabla 1 se pueden observar algunos ejemplos de compuestos con actividad antimicrobiana producidos por plantas y descriptos por Duke (1985). Si bien se ha estimado que las plantas sintetizan cientos de miles de diferentes compuestos metabólicos secundarios y que todos los días son reportados otros nuevos, se los ha agrupado en cinco clases de acuerdo a la estructura química o según la forma en que la planta los produce. Los grupos más comunes son: 4 Introducción • Alcaloides: compuestos cíclicos que contienen nitrógeno. Están distribuidos extensamente entre muchas familias de plantas superiores, donde a menudo son producidos en las raíces (figura 1a). Su actividad en animales es diversa, pero muchos intervienen como neurotransmisores. Numerosos alcaloides son adictivos (Kutchan, 1995). • Glucósidos cianogenéticos: Son substancias orgánicas, tambien conocidas como heterósidos cianogenéticos, principios activos de diferentes familias botánicas (Rosaceae, Linaceae, Fabaceae, Euphorbiaceae, etc.). Químicamente, corresponden a estructuras heterosídicas: su genina, que biogenéticamente deriva de aminoácidos como fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina y valina, suele ser un aldehído o una cetona, generalmente el benzaldehído o la acetona, unidos al ácido cianhídrico en forma de hidroxinitrilo. La molécula de azúcar reductor se fija por la función hidroxílica para formar el heterósido. Ciertas plantas y animales tienen enzimas que hidrolizan y separan el azúcar liberando el cianuro, éste actúa directamente sobre las mitocondrias inhibiendo la producción de energía. • Glucosinolatos: Comprenden un pequeño grupo de compuestos también llamados heterósidos sulfocianogenéticos o heterósidos azufrados, son glucósidos que contienen tanto N2 como azufre y se biosintetizan a partir de diversos aminoácidos, lo que da lugar a diferentes estructuras químicas (figura 1c). Su distribución es limitada, se encuentran principalmente en la familia de las crucíferas (Brassicaceae), a las que proporcionan el olor y sabor característico. • Compuestos fenólicos: Definidos químicamente como anillos bencénicos con uno o más grupos hidroxilo, existen más de veinticinco mil estructuras llamadas fenólicas, muchas de las cuales son usados frecuentemente como conservantes por su acción antioxidante. En las plantas previenen la oxidación de las membranas y otros tipos de daños oxidativos. Como defensas, son de sabor desagradable, tóxicos e inhiben la digestión (figura 1b). Los colores azules y rojos de la mayoría de las flores son proporcionados por flavonoides, los robles y el té son ricos en polímeros fenólicos llamados taninos, el olor de la gaulteria es debido a un ácido fenólico (metilsalicilato). Ha sido demostrado que estos compuestos tienen efecto antimicrobiano (Toda et al., 1989) sobre un amplia gama de microorganismos, al parecer por su capacidad de acomplejar proteínas extracelulares y de la pared celular bacteriana. 5 Introducción • Terpenos: Es el segundo grupo más importante de compuestos secundarios. Son muy diversos en estructura y actividad, aunque todos surgen del isopreno. La mayoría son volátiles e imparten el olor típico a coníferas, mentas y muchas otras especies herbáceas y arbustivas. Los triterpenoides, un subgrupo, incluyen muchos compuestos extremadamente amargos, como la curcibitacina de las calabazas y pepinos. Tabla 1: Principales tipos de compuestos antimicrobianos provenientes de plantas Nombre vulgar Nombre científico Compuesto Clase Actividada Aceite de oliva Ajo Olea europaea Allium sativum Hexanal Allicina , ajoeno Cáscara sagrada Rhamnus prusiana Taninos General General Virus, bacterias, hongos Bacteria, Candida S. aureus Helmintos General Bacterias, virus E. coli, Sporothrix, Staphylococcus, Trichophyton S. aureus S. aureus, M. tuberculosis Plasmodium spp. General Cebolla Allium cepa Allicina Aldehído Sulfóxido Polifenoles Antraquinonas Sulfoxido Chamomilla Matricaria chamomilla Ácido antémico Ácido fenólico Clavo Eucaliptus Syzygium aromaticum Eucalyptus globulus Eugenol Taninos Terpeno Polifenoles Ginseng Panax notoginseng Henna Lawsonia inermes Liquoriza Saponinas Ácido gálico Ácido fenólico Glycyrrhiza glabra Glabrol Alcohol fenólico Quinina Te verde Cinchona sp. Camellia sinensis .Quinina Catequinas Tomillos Thymus vulgaris Ácido cafeico, timol, taninos Valeriana Valeriana officinalis Aceite esencial Alkaloide Flavonoides Terpenos, alcoholes fenólico, polifenoles Terpenos Toxicidad relativab ¿? ¿? 1.0 ¿? 2.3 1.7 1.5 2.7 1.5 2.0 2.0 2.0 Virus, bacterias, hongos 2.5 General 2.7 Cowan, 1999. “General” hace referencia a actividad sobre una multiplicidad de microorganismos: bacterias, hongos y protozoarios. b- 0 altamente seguro, 3 altamente tóxico”. a- El potencial y más extendido uso de muchos de estos antimicrobianos naturales parece promisorio dada la demanda de los consumidores. Sin embargo, el reto es aislar, purificar, estabilizar e incorporar estos compuestos a los alimentos sin afectar adversamente la calidad sensorial y las características de seguridad de los productos (Beuchat y Golden, 1989). Además, la bioactividad de estos compuestos puede variar dependiendo de la especie o hierba, tipo de microorganismo presente y alimento involucrado (Giese, 1994). La actividad antimicrobiana de las especies y plantas se atribuye generalmente a compuestos fenólicos presentes en los extractos o aceites esenciales de las mismas (Nychas, 1995; Shelef, 1983) y se reconoce que factores como contenido de grasa, poteínas, sales, el pH y la temperatura afectan la bioactividad de los compuestos fenólicos (Nychas, 1995; Tassou & Nychas, 1994). Entre los productos naturales más estudiados se 6 Introducción encuentran los presentes en plantas, hierbas y especias y dentro de éstos los AEs de plantas aromáticas. a) Coniina Alcaloide piperidinico Conium maculatum b) c) Ácido cafeico Ácido fenólico Coffea canephora Estructura básica de los glucosinolatos Morfina Alcaloide isoquinolico Papaver somniferum Atropina Alcaloide tropano Hyoscyamus níger Atropa belladona Hipericina Quinonas Hypericum perforatum Apigenina Flavones Matricaria chamomilla Glucobrasicina Desulfoglucosinolatos Brassica olerucea Figura 1: Estructura química de algunos compuestos con actividad antimicrobiana: a) Compuestos del grupo de los alcaloides, b) diferentes compuestos del grupo de los flavonoides y c) compuestos del grupo de los glucosinolatos 7 Introducción 1.3. Composición de los AEs Químicamente los AEs consisten en gran medida en mezclas de compuestos sencillos llamados terpenos. La palabra terpeno deriva del nombre alemán de la esencia de trementina: terpentin. Existe una gran diversidad de AEs como las plantas que los producen; en la tabla 2 se muestran algunas de los más conocidos, el lugar de origen de la planta y el método de extracción más frecuente (Hili et al., 1997). Se han llegado a identificar en un AE hasta 300 componentes. Las plantas producen mayor cantidad de terpenoides que los animales y los microbios. La producción, acumulación, emisión y/o secreción de grandes cantidades de ellos depende de la presencia de estructuras anatómicas altamente especializadas (Croteau et al., 2000). Katayama y Nagai (1960) reconocieron a los compuestos activos de algunos aceites esenciales como eugenol, carvacrol, timol y vainillina. Se ha reportado que algunos de estos compuestos fenólicos tienen un amplio espectro de efectividad contra los microorganismos, como el timol extraído del tomillo y del orégano, el aldehido cinámico extraído de la canela y el eugenol extraído del clavo de olor. Tabla 2: Fuentes botánicas y geográficas de los AEs Aceite Especie Parte de la planta País de origen Método de extracción Anis Basil Bergamota Cardamomo Cilantro Geranio Jazmín Lavanda Pasto limón Mejorana Patchouli Menta Sándalo Tagettes Árbol de te Illicium verum Ocimun basilicum Citrus bergamia Elettaria cardamomum Couianrum sativum Pelargonium graveolens Jasminiun oficinales Lavendula hybrida Cymbopogon citratus Thymus mastichina Pogostemon patchouli Mentha piperita Santalum album Tagettes glandulífera Malaleuca tenifolia Fruto Hierba Cáscara Fruto Fruto Hierba Flores Flores Hierba Hierba Hojas Hierba Madera Hierba Hojas China India Costa de Ivory Guatemala Rusia Egipto Marruecos Francia Nepal España EUA India India Nepal Australia Arrastre de vapor Arrastre de vapor Prensado Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Extracción con solvente Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Hili et al., 1997 En la figura 2a se observa el hemiterpeno isopreno que contiene cinco carbones (una unidad de isopreno C5H8), es un gas emitido en la atmósfera por muchas especies de plantas, donde juega un importante papel en la química del ozono. En el caso de los monoterpenos, éstos se subdividen a su vez en tres grupos: acíclicos, monocíclicos y bicíclicos. Un ejemplo de monoterpenos acílicos es el 8 Introducción hidrocarburo mirceno que se encuentra en las esencias de las verbenáceas. El timol es el caso de un compuesto cíclico fenólico y su isómero el carvacrol son los componentes principales de los tomillos y los oréganos.Otros ejemplos de monoterpenos cíclicos son el terpineol presente en el cedrón y el mentol (figura 2b) que es característico de algunas mentas (Zygadlo et al., 1994, 1995a; IPGRI, 1996). Los terpenos bicíclicos se pueden dividir a su vez en tres clases, según el tamaño del segundo anillo, siendo el primero siempre de seis carbonos. La α-tujona es el caso de 6 + 3, los pinenos presentes en las esencia de trementina tienen la conformación 6 + 4, mientras que el alcanfor se caracteriza por un anillo de 6 + 5 (figura 2c). Isopreno (monoterpeno) a) ß-mirceno Timol citronelol Carvacrol α-terpineol Mentol b) c) tujona Pineno Alcanfor Figura 2: Estructuras químicas de diferentes terpenos de acuerdo al número de carbonos y a su conformación espacial. a) unidad isopreno y el monoterpeno citronelol, b) monoterpenos acíclicos y cíclicos. c) terpenos bicíclicos. 9 Introducción 1.4. Las micotoxinas: Hongos productores, y su incidencia en alimentos. Las micotoxinas son un grupo de sustancias con estructuras químicas muy diversas, formadas durante el metabolismo de hongos toxicogénicos. La biosíntesis de estos compuestos ocurre fundamentalmente cuando el desarrollo del micelio se ha detenido durante la fase estacionaria de crecimiento, y existe limitación de algunos nutrientes, en presencia de un exceso de fuentes carbonadas disponibles (Sorenson, 1993). Estas toxinas son clasificadas como metabolitos secundarios, debido a que carecen en su mayoría de funciones conocidas para la fisiología del hongo que las produce. Actualmente se cree que estos compuestos podrían tener diferentes funciones en la supervivencia de los hongos que les dio origen, inhibiendo el crecimiento de otros microorganismos, participando como agentes que favorecen la simbiosis con plantas, o actuando como hormonas sexuales o factores inductores de diferenciación (Demain & Fang, 2000). Recientemente se han identificado relaciones genéticas entre la esporulación y la producción de micotoxinas (Calvo et al., 2002; Shim & Woloshuk, 2001). Algunos metabolitos secundarios, incluyendo los antibióticos, estimulan la formación de esporas, las protegen en el medio ambiente y pueden favorecer o inhibir su germinación (Demain & Fang, 2000). Esta observación hace pensar en la posible relación beneficiosa para el hongo, entre la esporulación y el metabolismo secundario. Este último podría favorecer la diseminación y supervivencia del micelio, proporcionando un mecanismo mediante el cual se reprima la germinación de esporas, cuando no existen condiciones ambientales favorables para su desarrollo. Aproximadamente cuatrocientas micotoxinas han sido aisladas y caracterizadas químicamente hasta el presente, producidas fundamentalmente por especies de cuatro géneros fúngicos: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, y Alternaria (Etzel, 2002). A pesar de esto, no todas las especies incluídas dentro de estos géneros tienen la capacidad para sintetizarlas y, por otro lado, dentro de un género y especie fúngica productora de micotoxinas, puede haber cepas que presenten diferente capacidad toxicogénica (Magnoli et al., 1998; Magnoli et al., 1999). Estos hongos filamentosos son clasificados como ambientales, y algunos de ellos pueden comportarse como endofitos, e infectar tempranamente a los cereales durante su cultivo en el campo. Debido a su diversidad química, las micotoxinas pueden disolverse en las fases lipídicas (fundamentalmente) o acuosas de los alimentos, y difundir al interior de ellos (Hussein & Brasel, 2001; Pitt, 2000). En consecuencia, estas toxinas pueden ser encontradas principalmente en cereales, 10 Introducción semillas, frutas, y alimentos elaborados en base a estas materias primas; aún cuando en ellos no se encuentren elementos fúngicos. El maíz (Zea mays L.) es uno de los cereales que durante su cultivo puede ser afectado por un grupo considerable de enfermedades producidas por hongos, virus o bacterias, presentándose cada año con diferente severidad, dependiendo de las condiciones ambientales y del cultivar considerado (León, 1984). Si se tienen en cuenta solamente las enfermedades producidas por hongos, el vuelco por podredumbres de la raíz, tallo, y espiga; pueden afectar la calidad del grano por la acumulación de micotoxinas (aflatoxinas, fumonisinas, tricotecenos, zearalenona, etc). Los principales hongos responsables de estas afecciones son: Diplodia maydis, D. macrospora, Fusarium avenaceum, F. verticillioides, Gibberella spp., Phytium aphanidermatum, y Macrophomina phaseolina (United States Department of Agriculture, 1980). Además, las podredumbres del almacenamiento pueden desarrollarse en la espiga o en el maíz poscosecha, y fundamentalmente son producidas por especies de Aspergillus niger, A. flavus, A. parasiticus, y A. ochraceus; y por algunas especies de Penicillium, las que se presentan solas o en combinación con otras especies, principalmente del género Fusarium spp. La infección por estos hongos se puede producir en el campo durante las últimas etapas del cultivo, o durante el almacenamiento (León, 1984; Resnik et al., 1995; United States Department of Agriculture, 1980). Una vez recolectado y acondicionado, el grano de maíz puede ser utilizado con diferentes fines. Una parte de la producción se destina a satisfacer la demanda del mercado internacional, y el remanente se consume en el mercado interno. Durante los últimos años, nuestro país presentó una tendencia a adquirir el perfil de exportador, debido al notable crecimiento de la producción, y del escaso incremento del consumo interno, generándose una disponibilidad de mayores saldos exportables. En la última década Argentina exportó prácticamente el 50% del volumen total del maíz producido (García & Della Valle, 2003). Según datos proporcionados por el Instituto Nacional de Estadística y Censos, la producción total de cereales en nuestro país creció en los últimos años un 57,5%; con respecto a datos de la campaña 1995-1996, cosechándose en el 2001 un total de 34.852.000 toneladas, y constituyendo el maíz un 45% del total de cereales producidos (INDEC, 2004). El incremento en la producción de cereales en Argentina se evidencia, además, al analizar la participación de nuestro país en el mercado mundial de cereales, pasando de un 2% a 11 Introducción comienzos de la década del noventa, a un 12,3% del total comercializado mundialmente durante la campaña 1997-1998. Por otra parte, el maíz destinado al mercado interno puede ser utilizado para los diferentes tipos de molienda, como simiente, para el consumo humano o animal, todos bajo la forma de grano; y para la constitución de reservas forrajeras, es decir silaje (García & Della Valle, 2003). La población o el consumidor es cada día más exigente respecto de la calidad de los alimentos elaborados, y en el orden internacional los países importadores interponen nuevas barreras al ingreso de mercaderías, reduciendo los índices de tolerancia de sustancias que contaminan el grano y los subproductos de su industrialización, tales como las micotoxinas, insectos y agroquímicos. Las concentraciones de toxinas fúngicas en los cereales están íntimamente relacionadas con las fluctuaciones de precios en los mercados interno y externo. La especulación sobre la cotización de cereales, y del maíz en particular, está normalmente asociada a largos tiempos de almacenamiento de los mismos, utilizando generalmente infraestructura inadecuada. En consecuencia, el maíz puede sufrir infecciones adicionales con hongos ambientales micotoxicogénicos, aumentando de manera importante sus niveles de micotoxinas, con respecto a las concentraciones existentes inmediatamente después de la cosecha (Munkvold, 2003). En Argentina existe escasa reglamentación actualizada sobre los límites máximos permitidos de micotoxinas en alimentos para el consumo humano o de animales. Actualmente algunas disposiciones internacionales regulan estrictamente los niveles permitidos de estos contaminantes, afectando directamente el comercio internacional y, por lo tanto, a productores y proveedores (Jukes, 2004; Resnik et al., 1995). Desde el punto de vista toxicológico, la infecciones del maíz por Aspergillus spp. y Fusarium spp., adquieren la mayor importancia en la salud humana y animal (Peraica et al., 1999). 1.5. Los géneros Aspergillus y Fusarium: Micotoxinas sintetizadas por estos hongos. El género Aspergillus fue descripto por primera vez hace aproximadamente 300 años. Es extremadamente común en productos almacenados en regiones tropicales y subtropicales, principalmente granos, nueces y especias; como agente que participa en su descomposición (Hocking, 1997). 12 Introducción Aspergillus flavus está ampliamente distribuido en la naturaleza, puede sintetizar aflatoxina B1 (AFB1) (figura 3a), aflatoxina B2 (AFB2), y ácido ciclopiazónico; pero solamente una proporción de 30-40% de las cepas aisladas, son toxicogénicas (Abarca et al., 2000). A. parasiticus sintetiza AFB1, AFB2, aflatoxina G1 (AFG1) y aflatoxina G2 (AFG2). Su distribución a nivel mundial está más limitada, aunque el porcentaje de aislamientos de A. parasiticus aflatoxicogénicos es muy elevado (Hocking, 1997). De acuerdo a Nelson et al. (1983), el género Fusarium se agrupa en 12 secciones. Las especies toxicogénicas más comunmente encontradas en alimentos están incluídas en las secciones Liseola (F. verticillioides, F. proliferatum, F. nygamai y F. subglutinans), Sporotrichiella (F. sporotrichioides y F. poae), Gibbosum (F. equiseti), y Discolor (F. graminearum y F. culmorum) (Bullerman, 1997). Gibberella fujikuroi (Sawada) es el teleomorfo de muchas de las especies de anamorfos conidiales en el género Fusarium sección Liseola, incluyendo F. verticillioides (Sacc.) Niremberg (ex F. moniliforme Sheldon), F. subglutinans (Wollenweber y Reinking) Nelson, Toussoun y Marasas; y F. proliferatum (Matsushima) Niremberg (Nelson et al., 1983). Según el concepto de especies biológicas, F. verticillioides y F. proliferatum pertenecen a las poblaciones de apareamiento A y D, respectivamente. Aunque F. verticillioides y F. proliferatum son los principales productores de fumonisinas, existen especies dentro de Liseola u otras secciones que también pueden sintetizarlas, pero en menor grado. Hasta la actualidad se han descripto por lo menos 14 fumonisinas, las que han sido clasificadas en grupos A, B, C, P y H (JECFA, 2001), siendo la fumonisina B1 (FB1) (figura 3b) la más importante por su incidencia en alimentos, y por los efectos tóxicos producidos en animales y humanos. a) b) Figura 3: Estructuras químicas de AFB1 (a) y de FB1 (b). 13 Introducción Teniendo en cuenta las diferentes infecciones fúngicas que puede sufrir el maíz durante su cultivo y almacenamiento, la coinfección por Aspergillus spp. y Fusarium spp. y, consecuentemente, la existencia simultánea de AFB1 y FB1, puede ser una situación común en el maíz destinado al consumo humano y animal. 1.6. Las micotoxicosis. Las micotoxinas presentan un amplio rango de toxicidad, relacionado principalmente con la actividad que tienen estos compuestos por sí mismos, la vía de administración, el tiempo de exposición, el sexo, la cepa y la edad de la especie animal afectada (Hengstler et al., 1999). Cuando estas toxinas ingresan al organismo de los animales y humanos se inducen micotoxicosis agudas, subcrónicas, o crónicas; según la dosis y el tiempo de exposición a estos compuestos. Las primeras se producen cuando altas dosis de micotoxinas ingresan al organismo en un lapso de unas pocas horas, pudiendo causar la muerte del individuo. En la actualidad raramente se registran casos de micotoxicosis agudas en humanos por el consumo de alimentos contaminados con niveles altos de micotoxinas, encontrándose casos fundamentalmente en algunos países en desarrollo. Por el contrario, frecuentemente se observan síntomas de intoxicación aguda luego de la administración terapéutica de alcaloides del ergot (Etzel, 2002). Los otros tipos de intoxicación, en los que ingresan al organismo cantidades menores de toxinas durante unos pocos meses (subcrónicas) o por varios meses o años (crónicas), representan el mayor problema para la salud humana y animal en el mundo. Es posible que las micotoxinas presentes en los alimentos, sean responsables de más muertes humanas que los microorganismos transmitidos a través de estos (Pitt, 2000). Entre los primeros datos de intoxicación humana por micotoxinas se encuentran los brotes agudos de ergotismo causados por alcaloides ergóticos del hongo Claviceps purpurea, que alcanzaron proporciones de epidemia, conocida como “el fuego de San Antonio”, mutilando y causando la muerte a miles de personas en Europa, durante la Edad Media. Las víctimas estaban expuestas a la dietilamida del ácido lisérgico (LSD), sustancia alucinógena que se producía durante el horneado del pan elaborado con trigo contaminado por el cornezuelo del centeno (Peraica et al., 1999). La acción letal de algunos de estos metabolitos secundarios hizo que sean utilizados con fines de bioterrorismo. Uno de los primeros usos de las micotoxinas como armas biológicas se registró en el siglo VI aC, 14 Introducción donde los Asirios envenenaban a sus enemigos con centeno contaminado con ergot (Etzel, 2002). En lo que respecta a salud y producción animal, el interés general por las micotoxinas aumentó en 1960, cuando se declaró en animales de granja en Inglaterra una micotoxicosis aguda transmitida por el pienso, denominada enfermedad X de los pavos, comprobándose posteriormente que era causada por las aflatoxinas (Peraica et al., 1999). Conjuntamente con el consumo de tabaco, la dieta es probablemente uno de los factores más importantes en la etiología del cáncer humano (Ferguson, 2002), siendo vehículo de una amplia variedad de carcinógenos químicos genotóxicos o epigenéticos. Estos carcinógenos químicos pueden tener acción directa, ejerciendo el efecto tóxico sin sufrir previamente biotransformaciones, o comportarse como pro-carcinógenos, los cuales son bioactivados en el organismo mediante reacciones "detoxificantes". En el caso de procarcinógenos que ingresan por vía oral, la bioactivación ocurre fundamentalmente en hígado, siendo éste el principal órgano blanco de acción (deBethizy & Hayes, 2001). El cáncer, segunda causa de muerte en la actualidad en los países desarrollados, es un grupo de enfermedades de origen multigénico y multifactorial; resultado de dos procesos sucesivos: el aumento descontrolado de la proliferación de un grupo de células que da lugar a un tumor o neoplasia; y la posterior adquisición de capacidad invasiva, que les permite la diseminación en el organismo y la formación de metástasis (Lodish et al., 2001). 1.7. Mecanismos de acción tóxica de fumonisina B1 en humanos y animales. Las fumonisinas, descriptas por primera vez en 1988 (Bezuidenhout et al., 1988), son un grupo de al menos 14 amino-polialcoholes formados esencialmente por una cadena alifática de 20 carbonos con dos cadenas laterales hidrofílicas unidas mediante enlaces tipo éster. En maíz, la biosíntesis ocurre luego de la infección del grano por cepas toxicogénicas, principalmente en la fase tardía de madurez en el campo, cuando los granos todavía tienen altas actividades de agua. Con menor importancia, las fumonisinas pueden encontrarse en otros alimentos como sorgo, espárragos y arroz. Si existen condiciones desfavorables de almacenamiento, luego de la cosecha pueden incrementarse considerablemente los niveles de estas micotoxinas (JECFA, 2001). Las fumonisinas están ampliamente distribuidas en la naturaleza, siendo la FB1 considerada como la más 15 Introducción abundante y la más tóxica de las fumonisinas (Thiel et al., 1992). Las concentraciones de esta toxina en maíz pueden variar desde unas pocas ppb, hasta niveles alrededor de 160 ppm (Chu & Li, 1994; Shephard et al., 1996). La estabilidad de FB1 durante el procesamiento de los alimentos es afectada por varios factores, incluyendo la humedad del producto, la concentración y localización de la toxina, la presencia de aditivos, y el tipo de matriz del alimento (Jackson & Bullerman, 1999). Las fumonisinas son muy estables al calor, ocurriendo destrucción significativa de estas toxinas cuando se alcanzan temperaturas superiores a 150 °C, aunque la eficiencia del proceso disminuye a medida que se utilizan mayores tiempos de calentamiento (JECFA, 2001). Los estudios realizados hasta el presente sugieren que FB1 no es genotóxica, pero tiene una importante acción promotora de cáncer hepático, según se ha demostrado por la inducción de focos γ-glutamil transpeptidasa y GST positivos en hígado de ratas (Voss et al., 2002). En 1993 la Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer ha clasificado a las fumonisinas como compuestos probablemente carcinogénicos para humanos (Grupo 2B) (IARC, 1993b). En ratas y en otros animales utilizados en investigación, cuando FB1 ingresa por vía oral, aproximadamente un 4% de la dosis administrada es absorbida en intestino. Luego se distribuye a la mayoría de los tejidos desapareciendo rápidamente del plasma, y eliminándose del organismo de acuerdo a un modelo bi o tricompartamental (MartinezLarranaga et al., 1999). La proporción del gasto cardíaco que recibe cada órgano tiene una importancia fundamental cuando se pretende entender por qué hígado y riñón son los principales blancos de acción de FB1. Estos dos órganos retienen la mayoría de la toxina absorbida (Martinez-Larranaga et al., 1999), siendo en algunos casos más importante la retención en hígado, y en otras situaciones se acumula principalmente en riñón. No existen evidencias, tanto en estudios in vitro como in vivo, de que FB1 sea metabolizada. La micotoxina absorbida es posteriormente excretada por bilis. Cuando llega a intestino es hidrolizada posiblemente por enzimas microbianas, perdiendo uno o ambos ácidos tricarboxílicos laterales; encontrándose en materia fecal la toxina y los productos de la hidrólisis. Mientras que no existen evidencias de que FB1 sea metabolizada por el complejo citocromos p, algunos estudios in vivo e in vitro han demostrado que esta micotoxina puede modificar la actividad de este complejo enzimático (Spotti et al., 2000). 16 Introducción Para explicar los efectos tóxicos de FB1 en animales se han propuesto varios mecanismos, dos de los cuales cuentan con mayor respaldo de evidencia experimental, y es posible que estén estrechamente relacionados. En uno de ellos, la FB1 produce la inhibición de la ceramida sintetasa, una enzima clave en el metabolismo de los esfingolípidos. En el otro mecanismo, una variación en las proporciones de ácidos grasos y fosfolípidos celulares induciría cambios en la síntesis de eicosanoides, prostaglandinas, leucotrienos y otros derivados oxigenados. La disrupción del metabolismo de esfingolípidos produce desbalances en el contenido de fosfoglicerolípidos, ácidos grasos y colesterol. Según estas hipótesis FB1 causa directa o indirectamente, un espectro amplio de cambios en el metabolismo lipídico y en las vías bioquímicas de las células. Ambas situaciones tienen como consecuencia alteraciones en la señalización mediada por lípidos, y en reacciones metabólicas importantes para el crecimiento, diferenciación y muerte celular. (Mobio et al., 2000; Pinelli et al., 1999). Fumonisina B1 posee similitud estructural con algunos sustratos de ceramida sintetasa, produciendo inhibición competitiva de la enzima. La esfinganina (Sa), una base esfingoide formada durante la síntesis de novo de esfingolípidos, y la esfingosina (So) producida durante el reciclaje fisiológico de esfingolípidos celulares; son los sustratos naturales de la enzima ceramida sintetasa (JECFA, 2001). Tanto en estudios in vivo como in vitro, se observó que la inhibición de esta actividad enzimática por acción de FB1 tiene como consecuencia un incremento rápido de las concentraciones intracelulares de Sa y, en menor grado, de So (IPCS, 2000). Este aumento en los niveles de Sa produce una inversión en la relación Sa/So intracelular, que puede ser detectada en sangre periférica y orina, debido a que Sa puede difundir libremente a través de la membrana plasmática. En este sentido, se ha estado evaluando la posibilidad de utilizar la relación Sa/So presente en diferentes muestras biológicas como biomarcador de exposición a fumonisinas (Qiu & Liu, 2001). La respuesta a la exposición a FB1 depende del tipo celular afectado, persistiendo por más tiempo el desbalance lipídico en hepatocitos y en células renales (IPCS, 2000). Wang et al. (1999) realizaron un aporte muy importante para la micotoxicología de las fumonisinas. En un modelo experimental en ratas observaron que, luego de inducirse el desbalance de lípidos celulares con una dosis de FB1, niveles diez veces inferiores fueron suficientes para sostener este efecto en el tiempo. En otras palabras, los efectos tóxicos que 17 Introducción puede tener un alimento que contiene bajas concentraciones de FB1, pueden ser subestimados si quienes los consumen han estado previamente expuestos a mayores cantidades de esta micotoxina. Aunque existen áreas geográficas donde la exposición humana a fumonisinas es muy elevada, no hay constancia confirmada de una toxicidad aguda por estas toxinas en seres humanos (JECFA, 2001), y no se ha podido determinar su dosis letal en animales de experimentación. Las fumonisinas han sido descubiertas por los efectos crónicos inducidos en animales de granja. Las primeras publicaciones referidas a FB1 fueron realizadas por investigadores sudafricanos en 1988, que aislaron y caracterizaron la toxina a partir de F. verticillioides MRC 826 (Bezuidenhout et al., 1988; Gelderblom et al., 1988). Durante los años siguientes se pudo confirmar que estas micotoxinas eran las responsables de la leucoencefalomalacia equina (Marasas et al., 1988), que ya había sido descripta por Butler en 1902, y del Síndrome de edema pulmonar que produjo la muerte de miles de cerdos en EE.UU. en 1989. Además, en modelos experimentales en animales, la intoxicación con FB1 indujo alteraciones en los parámetros nutricionales de cerdos y de ratas (Casado et al., 2001; Dilkin et al., 2003). Sydenham et al. (1990) observaron una relación directa entre la exposición a altos niveles de FB1 y una mayor incidencia de cáncer de esófago en la población de Transkei, Sudáfrica. Observaciones similares fueron realizadas por Chu y Li (1994) en China, y por Doko y Visconti (1994) en Italia. Los resultados epidemiológicos en los últimos años parecen reforzar este concepto, pero en la actualidad no se conoce exactamente de qué manera FB1 participa en la instalación de los procesos neoplásicos. 1.8. Bioactividad de compuestos de origen vegetal sobre la toxicogénesis de algunas cepas fúngicas. Más de 1340 plantas son conocidas por ser fuente potencial de compuestos antimicrobianos, pero pocas han sido estudiadas científicamente (Wilkins & Board, 1989). Algunos autores han examinado los efectos de los compuestos aislados de AEs de plantas aromáticas sobre cultivos fúngicos para encontrar fungicidas naturales. Un número importante de los constituyentes de estos AEs ha demostrado tener capacidad inhibitoria sobre el desarrollo de las cepas fúngicas (Chao & Young, 2000). Aparentemente existiría una relación directa entre la estructura química del componente más abundante en el AE y 18 Introducción sus efectos antifúngicos. Generalmente la capacidad inhibitoria del AE podría ser atribuída a la presencia de un núcleo aromático, conteniendo un grupo polar funcional (Farag et al., 1989). Alrededor de 30.000 compuestos aislados de AEs de plantas aromáticas contienen grupos fenólicos y éstos compuestos son los más utilizados por la industria de los alimentos (Meeker & Linke, 1988). De los AEs mencionados anteriormente, un número significativo de publicaciones ha documentado la actividad antimicrobiana del AE de pasto limón, palo rosa, canela, clavo de olor y orégano sobre diferentes especies microbianas. Mishra & Dubey (1994) informaron que el AE de pasto limón (Cimbopogon citratus) actuó como un fungistático efectivo sobre 47 cepas de hongos filamentosos, además estos autores describen que los efectos de este AE sobre Aspergillus flavus son, en algunos casos superiores a fungicidas de síntesis comerciales como el Agrosan, oxicloruro cúprico etc. También en A. flavus, se demostró el efecto inhibitorio sobre el crecimiento y la producción de aflatoxinas de los AE de clavo (Syzygium aromaticum) y la canela (Cinnamomum zeylanicum) (Bullerman et al., 1977; Montes-Belmont & Carvajal, 1998; Sinha et al., 1993). La actividad inhibitoria del AE de orégano (Origanum vulgare) sobre el crecimiento de A. flavus, A. ochraceus y A. niger ha sido evaluada previamente por Paster et al (1995) demostrando resultados significativo sobre el crecimiento y la toxicogénesis. Soliman & Badea (2002) reportaron la actividad antifúncia y antitoxicogénica del AE de tomillo (40% de timol) sobre A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus y F. verticillioides. En general varios autores concuerdan en que las concentraciones utilizadas para detener el desarrollo fúngico en un sustrato como las semillas almacenadas, son relativamente altas y que deberían desarrollarse experimentos con el objetivo de encontrar la dosis óptima para las especies fúngicas que contaminan una especie de cereal en particular. También existe coincidencia en que los componentes minoritarios de los AEs juegan un rol importante en la bioactividad sobre los microorganismos y sobre la estabilidad de los AEs. 19
