873 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS INTESTINALES DE Triatoma
barberi (USINGER, 1939), MANTENIDAS EN CONDICIONES DE LABORATORIO
César Espino de la Fuente-Muñoz1, Eric Dumonteil2, Marco Antonio Becerril-Flores1. 1Área Académica de
Medicina, Instituto de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Ex Hacienda de la
Concepción s/n, Carretera Pachuca Actopan, San Agustín Tlaxiaca, Hidalgo, C.P. 42160, México. 2Laboratorio de
Parasitología, Centro de Investigaciones Regionales Dr. Hideyo Noguchi, Universidad Autónoma de Yucatán, Av.
Itzaes #490 x 59, Mérida, Yucatán. C.P. 97000, México. [email protected]; [email protected];
[email protected]
RESUMEN. Con la finalidad de conocer el tipo de microorganismos que colonizan el intestino de triatominos, se realizó el
aislamiento e identificación de bacterias intestinales de Triatoma barberi, insecto vector de la Enfermedad de Chagas que se
distribuye en varios estados del centro del País, incluyendo el Estado de Hidalgo. De 15 individuos de triatominos se lograron
aislar tres diferentes colonias bacterianas y se identificaron mediante PCR y análisis de secuencias con el programa en línea
BLAST: Staphylococcus warneri (Staphyloccaceae) con 100% de máxima identidad en BLAST, Brevundimonas bullata
(Caulobacteraceae) con 99% de máxima identidad y Enterococcus feacalis (Entorococcaceae) con 99% de máxima identidad.
Dos bacterias presentaron actividad hemolítica. Los resultados señalan que existen bacterias que forman parte de la microbiota y
que podrían favorecer la degradación de la hemoglobina para beneficio del insecto y posiblemente a Trypanosoma cruzi.
Palabras clave: Tritominos, microbiota, Enfermedad de Chagas.
Isolation and identification of intestinal bacteria of Triatoma barberi (usinger, 1939), reared
in laboratory conditions
ABSTRACT. In order to know the type of microorganisms that colonize the gut of triatomines, we isolated and identified
intestinal bacteria of Triatoma barberi, insect vector of Chagas disease which is distributed in several Mexican states, including
Hidalgo state. Of 15 individuals of triatomine we isolated three different bacterial colonies which were identified by PCR and
sequence analysis with the online program BLAST: Staphylococcus warneri (Staphyloccaceae) 100% maximum identity in
BLAST, Brevundimonas bullata (Caulobacteraceae) with 99% of maximum identity and Enterococcus feacalis (Entorococcaceae)
99% maximum identity. Two bacteria showed hemolytic activity. The results indicate that there are bacteria that are part of the
microbiota which could promote hemoglobin degradation to benefit the insect and possibly Trypanosoma cruzi.
Key words: Triatomine, microbiota, Chagas disease.
Introducción
Los triatominos son insectos pertenecientes al orden Hemiptera, suborden Heteroptera,
Familia Reduviidae y subfamilia Triatominae. Todos los miembros de esta subfamilia son
hematófagos, característica que se considera reciente en términos evolutivos y que esta
relacionada con la transmisión de T. cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas (Tartarotti
et al., 2006).
En México, un vector importante de la Enfermedad de Chagas, es Triatoma barberi, que
se distribuye en 12 estados: Colima, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacán,
Morelos, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Tlaxcala, Veracruz y el Distrito Federal. Su importancia
como vector radica en su amplia distribución dentro del territorio nacional, por su domiciliaridad,
sus hábitos alimenticios, pues de acuerdo con las observaciones en laboratorio, prefiere la sangre
de mamíferos y su defecación la efectúa al momento de alimentarse y se ha demostrado ser uno
de los mejores transmisores del parásito (Martínez-Ibarra et al., 2005; Salazar-Schetino et al.,
2005; Becerril, et al., 2010).
Se sabe que muchos insectos necesitan un aporte de nutrientes extra para favorecer su
desarrollo, ya que su dieta es muy restringida (Beard et al., 2002). En el caso de los Triatominos
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se ha observado que el aporte de nutrientes que no se encuentran en la sangre puede ser
proporcionado por el metabolismo de bacterias simbiontes que se presentan a lo largo de su
sistema digestivo, principalmente en su intestino medio (Beard et al, 1998; Beard et al, 2002;
Azambuja et al., 2005a; Douglas, 2007; Sánchez-Contreras y Vlisidou, 2008). Aunado a esto se
sugiere que son muchos los factores que intervienen en el establecimiento de Trypanosoma cruzi
dentro de la chinche (Azambuja et al., 2005b) por lo que estas bacterias simbiontes aparte de
proporcionar nutrientes esenciales al insecto, pueden tener influencia sobre la transformación y el
comportamiento y desarrollo de las poblaciones de T. cruzi dentro del vector (Azambuja et al.,
2004). Con el fin de conocer el tipo de bacterias simbiontes de los triatominos y su relación con
la colonización de T. cruzi se aislaron e identificaron microorganismos presentes en T. barberi.
Materiales y Método
Los insectos que se emplearon en este trabajo, fueron obtenidos de una colonia de T.
barberi, del Laboratorio de Investigación Anexo al Laboratorio de Histología del Instituto de
Ciencias de la Salud, de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. La colonia se ha
mantenido en condiciones de laboratorio por 18 generaciones, con una humedad relativa de 66%,
a una temperatura de 28°C y las chinches han sido alimentadas sobre ratones una vez por semana.
La colonia fue establecida a partir de insectos colectados en la Comunidad
“E Ah
”
el Estado de Hidalgo, como lo reporta Becerril-Flores et al., (2007).
Se utilizaron un total de 15 insectos de quinto estadio, bajo condiciones de esterilidad, los
insectos se lavaron repetidas veces con agua destilada y alcohol al 70% para eliminar las
bacterias presentes en su superficie, se extrajo el intestino medio del insecto y fue macerado y
lavado con solución salina estéril al 0.85%. El macerado fue sembrado por extensión en placa en
Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI) y se incubó a 28 °C durante 48 horas. De los cultivos
puros obtenidos en Agar BHI, se observaron características morfológicas y se realizaron pruebas
las siguientes bioquímicas para apoyar su identificación: TSI, MIO, Hierro de Kligler, Bilis
Esculina, TSI, Rojo Violeta, Citrato, McConkey, EMB, LIA, Blood Agar y prueba de catalasa.
Para realizar la identificación de las bacterias se hizo una extracción de DNA en la que se
tomaron de 2 a 3 colonias de los cultivos axénicos, agregandose400µl de buffer de extracción
(Tris-HCl 5M, NaCl 5M, EDTA 0.5 M, SDS 10%) y se dejó incubar a 23 °C durante 1 hora.
Posteriormente se centrifugó por 1 minuto a 10,000 rpm y al sobrenadante se le agregó 300µl de
isopropanol. La solución se incubó a 23°C durante 2 minutos y se centrifugó por 5 minutos a
10,000 rpm. El pellet obtenido se secó y se resuspendió en 60 µl de buffer T.E.
A partir de la suspensión en T.E. Se amplificaron fragmentos de la subunidad 16S
ribosomal empleando los prime 8F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
926
(5’CCGNCNATTNNTTTNAGTTT-3’). C
ó
PC contenía 1µl de DNA, 5 µl MgCl2
50 mM, 4 µl de buffer para PCR 10X (Tris-HCl 1M y KCl 1M), 1 µl de dNTP´s 4 mM, 1 µl de
cada uno de los primers 10 pmol y 2 µl de Taq DNA polimerasa para un volumen final de 40 µl.
LA PCR consistió en 35 ciclos de 95° C durante 30 segundos, 50° C por 30 segundos, 72° C por
30 segundos y por último una extensión final de 72° C durante 10 minutos. Los productos de
PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.
El DNA amplificado se purificó empleando el kit comercial Wizard Genomic de PROMEGA.
Los fragmentos amplificados fueron secuenciados por la Unidad de Servicios Genómicos, en el
Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad del CINVESTAV unidad Irapuato y se
analizaron con el Programa BLAST para determinar la especie de las bacterias aisladas.
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Resultados
A partir del intestino medio de la chinches, se obtuvieron tres cultivos puros de bacterias
en medio BHI. Con base en la tinción de Gram se determinó que dos de los cultivos presentaban
forma de cocos Gram positivos y un cultivo bacilos largos Gram negativos. Las bacterias Gram
positivas pertenecen a la Clase Bacilli dentro del Phyllum Firmicutes, mientras que la bacteria
Gram negativa pertenece a la clase Alpha Proteobacteria dentro del Phyllum Proteobacteria. Las
características de las colonias obtenidas se presentan en el cuadro 1.
A partir de la secuenciación de los fragmentos de la subunidad 16S ribosomal y con base
en el análisis realizado en el programa BLAST, se identificaron las especies de las colonias
aisladas que corresponden a Staphylococcus warneri cepa AW 25 785pb (GenBank
NR_025922.1), Enterococcus feacalis cepa JCM 5803 802pb (GenBank NR_040789.1) y
Brevundimonas bullata cepa IAM 13153 731pb (GenBank NR_025831.1) (Fig. 1).
Cuadro 1. Bacterias aisladas del intestino de Triatoma barberi, identificadas por pruebas microbiológicas y por PCR
Máx.
Identidad
(BLAST)
Clase
Staphylococcus
warneri
100%
Bacilli
Staphylococcaceae
Brevundimonas
bullata
99%
Alpha
Proteobacteria
Caulobacteraceae
Enterococcus
feacalis
99%
Bacilli
Enterococcaceae
Cepa
Familia
Colonias
Colonias
blancas, forma
circular,
elevación
convexa,
margen entero
Colonias
cafés, forma
circular,
elevación
umbonada,
margen
ondulado.
Colonias
transparentes,
puntiforme,
planas,
margen
entero.
Tinción
Gram
Hemolisi
s
Estafilococos
Gram +
Positiva
Bacilos Gram
-
Negativa
Cocos Gram +
Positva
Cabe señalar que durante el procesamiento de los microorganismos para su identificación
por pruebas bioquímicas, se pudo observar que Staphylococcus warneri fue la única bacteria
aislada que presenta motilidad evidente en Agar MIO y a pesar de no tener reacción positiva para
las pruebas Hierro de Kligler y Bilis Escualina presentan un crecimiento favorable en dichos
medios de cultivo. La reacción positiva en Agar Bilis Escualina para Enterococcus faecalis
muestra que hidroliza la escualina confirmando su clasificación dentro del género Enterococcus,
además, esta bacteria fue la única que tuvo reacción positiva en el Agar LIA. En el caso de
Brevundimonas bullata fue negativa para todas las pruebas bioquímicas que se realizaron. Por
otro lado se observó que Staphylococcus warneri y Enterococcus faecalis presentan actividad
hemolítica en agar sangre.
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Figura 1. Fragmentos amplificados de la sub unidad 16S ribosomal de las bacterias aisladas
de T. barberi.
Discusión
Las bacterias que se aislaron en este trabajo ya han sido reportadas para otras especies de
insectos incluso dentro del género Triatoma, sin embargo para Triatoma barberi es el primer
registro que se tiene de la microbiota intestinal. Varias especies del género Staphylococcus han
sido encontradas en Triatoma infestans y Rhodnius prolixus (Hypsa y Dale, 1997). En el caso de
Enterococcus feacalis se ha encontrado principalmente en tres especies de vectores de la
enfermedad de Chagas: Pastrongylus megistus, Rhodnius prolixus y Triatoma infestans
(Figueiredo et al., 1995). Al parecer este sería el primer registro en donde se mencione a
Brevundimonas bullata como parte de la microbiota intestinal en triatominos, aunque miembros
de este género ya han sido descritos anteriormente en otros insectos hematófagos como en el caso
del mosquito Anopheles stephensi (Dinparast Djadid, 2011).
Una característica importante que se pudo observar en S. warneri y en E. feacalis fue la
presencia de hemólisis en Agar sangre. Esto resulta interesante ya que la fuente principal de
alimentación de los triatominos es la sangre, y muchos nutrientes para la chinche así como la
degradación de la sangre del insecto son realizadas por algunos microorganismos, por lo que
resultan indispensables. Lo anterior se ha observado con el simbionte Rhodococcus rhodnii en
Rhodnius prolixus (Beard et al., 1998; Beard et al., 2002). Además, las bacterias simbiontes y
comensales presentes en el intestino del vector facilitan la digestión y la defensa de la superficie
intestinal frente a patógenos oportunistas, como algunos parásitos y otros microorganismos
(Dillon y Dillon, 2004) y algunas bacterias como Serratia marscecens juegan un papel
importante en la dinámica poblacional de T. cruzi (Azambuja et al., 2004).
Compartimos la opinión de Vallejo et al. (2009) de que las bacterias identificadas en
cultivos de laboratorio, no necesariamente reflejan la frecuencia de especies microbianas de la
chinche en condiciones naturales, pero de igual forma proporcionan una estimación de la
microbiota presente.
Literatura Citada
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