IV a y b Replicacion y Reparacion del DNA

IV. Replicación
Una de las principales interrogantes de la mente humana es
como es posible la continuación de la vida?.
Y uno de los mecanismos mas importantes de toda célula es la
Replicación del DNA.
Este mecanismo responde a la pregunta:
a. Modelos de Replicación del DNA.
“Cuando una célula se divide, de donde viene el DNA extra”?
Que es la “replicación del DNA”?
Es el proceso que puede duplicar el DNA de una célula.
El paso siguiente es la duplicación celular !
Tres etapas fundamentales de la replicación:
Es un fenómeno extremadamente complicado en el que participan
gran cantidad de enzimas.
Durante el proceso debe asegurarse que las células hijas sean
idénticas a la célula madre y que estas no sean defectuosas.
I Iniciación
II Elongación
III Terminación
I Iniciación:
Reconocimiento del sitio de origen.
Separar y estabilizar cadenas parentales (Helicasa).
Iniciar síntesis del DNA en horquilla de replicación por complejo
proteico llamado Primosoma.
II Elongación:
Formación del complejo de síntesis de cadenas hijas o Replisoma
(complejo activo DNA polimerasa III)
III Terminación:
Unión o reacción de terminación de la síntesis al final del replicón.
Bloqueo (tus-Prot) inhibiendo helicasa, Metilación (Hemimetilacion)
Finalmente, los cromosomas deben ser separados uno de otro para que
pasen independientemente a cada una de las células hijas.
La replicación tiene las siguientes características:
1) Ocurre en el citoplasma en procariotas y en el núcleo en
eucariotas.
2) Es semiconservativa, es decir que conserva una cadena del DNA
Replicón es la unidad del DNA que posee los elementos de control para la
replicación (inicio y terminación). Cada replicón se activa tan sólo una vez
en cada ciclo celular (*virus).
Los replicones son numerosos en eucariotas, mientras que el genoma
viral o el genoma bacteriano pueden ser considerados como replicones
únicos.
original.
Las características comunes de estos sitios de origen de la replicación:
3) Bidireccional y simultanea.
4) Necesita cebadores de RNA.
• Secuencias repetidas cortas.
• Sitios de reconocimiento para proteínas multiméricas de iniciación.
• Sitios flanqueados por secuencias ricas en TA.
5) La adición de nucleótidos sólo ocurre en dirección 5’-3’.
La replicación tiene tres tipos de origen (secuencias iniciadoras):
6) Ocurre sólo una vez por ciclo celular.
7) Se replica el genoma completo.
• oriC (E. coli).
• SV40 (simian virus 40).
• ARS (secuencias de replicación autónomas) en levadura.
1
I. Iniciación
• oriC: región de 240 pb con la capacidad de replicación independiente y
controlada. Contiene una serie de secuencias repetidas (9-pb y 13-pb) que son
características de cualquier secuencia de origen de la síntesis. Estas secuencias
proporcionan un sitio de anclaje para las proteínas que inician la replicación.
Existe también una secuencia rica en AT adyacente a oriC que aparentemente
facilita el desenrollamiento del dúplex para exponer los templetes (cadenas base)
sencillos a ser copiados.
oriC: E. coli
Hay tres tipos de DNA Polimerasa Dependiente de DNA que se han
aislado y purificado a partir de E. coli :
1) DNA Polimerasa I: llena huecos y participa en la reparación del
DNA.
2) DNA Polimerasa II: realiza el control de calidad, es decir que se
asegura que los nucleótidos sean los correspondientes, llena
huecos y facilita la síntesis en cadenas dañadas (perpetuando las
mutaciones).
3) DNA Polimerasa III: es la enzima funcional en las cuñas de
replicación en las que sintetiza el DNA nuevo.
• SV40: región de 65 pb que contiene 3 segmentos necesarios para que se inicie la
replicación. Muchas proteínas y plásmidos de mamíferos contienen estas regiones
especificas.
En mamíferos son: α, β, γ, δ, ε
Replicación en Procariotas y Eucariotas
La replicación tiene los siguientes problemas o limitantes:
1) Las DNA polimerasas no pueden desenrollar el dúplex de DNA.
2) Las cadenas en el dúplex son antiparalelas y las DNA
polimerasas solo pueden añadir nucleotidos en dirección 5’- 3’.
3) Requieren de la presencia de un “cebador” de DNA o RNA para
adicionar nucleótidos. Es decir dependen de la preexistencia de un
fragmento patrón para iniciar el copiado de las cadenas parentales.
II. Elongación.
Una de las cadenas es replicada discontinuamente: Fragmentos Okazaki
Formación del complejo de síntesis de cadenas hijas o Replisoma.
Una de las cadenas es replicada discontinuamente: Fragmentos Okazaki
(Cadena retrasada)
III
<15 nucleótidos
(Cadena líder)
II
La replicación es bidireccional y ocurre simultáneamente en ambas cadenas, por
lo que la horquilla o burbuja de iniciación se va haciendo más larga conforme
avanza la replicación al sintetizar nuevo DNA.
Cada extremo de la horquilla representa una cuña creciente (growing fork) donde
ambas cadenas se sintetizan, no obstante una cadena es sintetizada de forma
continua a partir de un solo cebador de RNA. La cadena que va en dirección 5’ –
3’ crece en la misma dirección en la que crece la horquilla y por ello se le
denomina la cadena líder.
fragmentos resultantes RNA-DNA
(1000-2000 nucleótidos)
La síntesis de la otra
cadena se complica
mucho ya que la dirección
global de su crecimiento
debe ser en dirección
contraria a la que trabaja
la DNA polimerasa.
Este requerimiento
incompatible con las
funciones de la enzima
que polimeriza el DNA es
solucionado mediante un
proceso que involucra un
copiado discontinuo de la
cadena retrasada
mediante el uso de
muchos cebadores de
RNA.
2
DNA polimerasa III: Síntesis de la cadena líder y la cadena retrasada.
DNA polimerasa III es
una proteína bastante
grande (>600 kDa) y
altamente compleja,
formada por 10
polipéptidos diferentes.
Posee una estructura de
dímero asimétrico y
contiene dos copias de la
mayoría de las
subunidades y dos sitios
catalíticos para la adición
de nucleótidos.
La DNA polimerasa III procesa hasta 500,000 nucleótidos sin desprenderse,
actividad indispensable para el crecimiento de la cadena líder.
La habilidad de la DNA polimerasa para comportarse como un centro
procesador se lo da la subunidad β que forma una estructura cerrada
alrededor de la doble hélice y posteriormente asociarse y anclar el centro
activo al final del cebador.
Velocidad: 500-1000 nucleótidos por segundo
El “núcleo” o interior del complejo esta formado por las subunidades α, ε, θ contiene
los sitios activos para la adición de nucleótidos.
Las subunidades restantes tienen como función convertir la parte activa en un centro
procesador (processive enzyme). Sin éstas subunidades la enzima es mas bien
distributiva, es decir, se desprende después de sintetizar entre 10 y 50 nucleótidos.
Portador de
Abrazadera:
Carga-abrazadera
De las 6 subunidades restantes, 5 (γ,δ,δ’,χ,ψ) conforman el llamado complejo γ, que
controla la transferencia de la subunidad β al sustrato (DNA-cebador), mientras que
la subunidad τ dimeriza el complejo activo al interior de la polimerasa.
Síntesis cadena
LIDER
γ, δ, δ',χ, ψ
(complejo γ)
Síntesis cadena
RETRASADA
Abrazadera:
β
Portador de Abrazadera:
γ, δ, δ',χ, ψ
abrazadera
(complejo γ)
Abrazadera:
β
Centros catalíticos:
α, ε, θ
Centros catalíticos:
Centro catalítico
α, ε, θ
τ mantiene el
complejo
dimerizado
Estabilizador del Dímero:
τ
Video Replicación del DNA
(DNARepOverview.mov)
O bien:
http://www.mcb.harvard.edu/Losick/images/TromboneFINALd.swf
Líder
Retrasada
Replisoma asímetrico
ó modelo de trombón
3
Iniciación o Reconocimiento del sitio de origen.
oriC
dnaA-Prot inicia la replicación en E. coli
(ssb-Prot)
(dnaB-Prot)
o RNA Polimerasa (dnaG-Prot)
dnaA-Prot se ancla, en
presencia de ATP, en las
4 regiones de repetición
corta (9 pb) de ori C
formando un complejo
que contiene de 10 a 20
subunidades.
Zonas ricas en
fáciles de separar.
*****Péptido de terminación: tus-Prot
TER son sitios específicos de terminación de la síntesis en los que se ancla
tus-Prot. Esta proteína previene que la helicasa desdoble el dúplex de DNA
interrumpiendo la cuña de replicación.
A-T,
III. Terminación
III. Terminación
III. Terminación
REPLICACIÓN DE LOS TELÓMEROS
Las moléculas ADN doble hélice lineal tienen problemas para replicar sus
extremos, ya que las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que ir
añadiendo nucleótidos. Uno de los extremos de cada hélice (el extremo 5') se
puede copiar sin problemas debido a que viene cebado desde atrás, sin
embargo, el extremo contrario (extremo 3') no podría replicarse ya que no
puede ser cebado desde atrás. Como consecuencia quedaría un corto
segmento al final sin copiarse y se iría acortando el ADN por ese extremo en
cada ronda de replicación.
4
Video Replicación de Telomeros
(Telomeros.MOV)
La manera de solventar este problema consiste en disponer de
secuencias repetidas en los extremos, los telómeros eucarióticos
contienen una secuencia corta rica en Guanina repetida cientos de
veces (por ejemplo la secuencia 5' TTGGGG 3' en el ciliado
Tetrahymena).
Además, los telómeros poseen extremos 3' monocatenarios que
pueden autoaparearse y suministrar un extremo 3' para replicar los
extremos cromosómicos.
Reparación del DNA
Cambios en la secuencia de DNA pueden ser inducidos por:
IV. Replicación
• Efectos ambientales tales como la radiación, químicos mutagénicos y descomposición térmica de
los nucleósidos.
• Errores de lectura de la polimerasa al momento de la replicación del DNA.
Si estos errores no fueran corregidos, al menos en su mayor parte, las células somáticas
acumularían tantas alteraciones en su secuencia que no podrían realizar sus funciones. Asimismo
las células germinales portarían demasiadas diferencias y por tanto la progenie no podría formarse o
llegaría un momento en que no seria viable.
Mecanismo de reparación de la molécula que transfiere los caracteres hereditarios de generación en
generación es indispensable para la vida.
No obstante, y en el contexto evolutivo, salta a la vista que los errores o cambios en las secuencias
no son removidos en su totalidad.
b. Mecanismos de Reparación del DNA.
Si existiera un mecanismo perfecto en el que ninguna alteración o cambio pudiera ser transferido a
la siguiente generación, todos los organismos serían prácticamente idénticos. Si bien la reproducción
sexual introduce variación en el acervo genético de las poblaciones, si la secuencia de ambos
progenitores fuera idéntica, la recombinación durante la meiosis y por tanto los gametos formados de
esta manera portaría exactamente la misma información.
Los cambios aparecen, el sistema de reparación intracelular trata de corregir los daños, los cambios
no corregidos pasan a la siguiente generación, si estos daños no permiten el correcto
funcionamiento el organismo no pasa las “pruebas de selección natural” y los nuevos cambios
desaparecen del acervo genético. Si los cambios no alteran la sobrevivencia del organismo, este
podrá reproducirse y los cambios se acumularán en su progenie y en la progenie de su progenie.
Las bases enzimáticas por las que se corrige una secuencia de bases no están
plenamente conocidas en E. coli.
Se sabe que la DNA polimerasa introduce o “se equivoca” en una base cada
10,000 adiciones. Dado que el tamaño de los genes en esta bacteria es de 1000
pb, esto quiere decir que uno de cada 10 genes podría tener una mutación o bien
una tasa de 0.1 mutación por gen por generación. Sin embargo la tasa de
mutación experimentalmente medida es mucho menor (0.00001 o 0.000001).
El descubrimiento de la función de lectura de prueba descubierta inicialmente en
la DNA polimerasa I y posteriormente en la III.
Una cadena sintética de poli-dA fue usada como cebador y además contenia una
base mal apareada en el extremo 3’. Al introducir DNA polimerasa I aislada de E.
coli la base modificada era removida mediante actividad 3’-5’ exonucleásica.
La mayor parte de las polimerasas descritas en bacterias poseen la actividad
exonucleásica, sin embargo solo las DNA polimerasas d y e de los eucariotas
poseen dicha actividad. El que la actividad sea compartida por varios tipos de
polimerasas refleja la importancia de la actividad de lectura de prueba para evitar
daño genético excesivo, manteniendo la fidelidad del copiado.
5
Tipo de Lesión en la cadena de DNA
Ejemplo - Causa
Base faltante (Gap)
Remoción térmica de purinas por ácidos o calor
(10,000 purinas por dia por célula): A, G
Remoción de bases alteradas por las DNA
glucosilasas.
Base alterada
Radiación Iónica
etilmetano)
Base incorrecta
Mutaciones en la subunidad exonucleásica 3’-5’
Protuberancias por deleción o inserción
Agentes intercalantes (acridinas) introducen o
remueven nucleotidos durante la replicación o
recombinación.
Pirimidinas ligadas o asociadas
Dímeros ciclobutílicos, principalmente de Timina
causados por radiación UV.
Rupturas de cadena
Radiación Iónica o químicos que rompen los
enlaces fosfodiester (bleomicina)
Ligamiento cruzado de cadena
Ligamiento covalente de dos cadenas por
agentes bifuncionales alquilantes (mitomicina).
Fragmentos 3’ deoxiribosa
Disrupción de la estructura de la deoxiribosa por
radicales libres haciendo que se rompa la
cadena.
o
alquilación
(sulfato
de
RecA complex
Por su parte la DNA polimerasa III corrige conforme va avanzando la síntesis,
retardandola momentáneamente hasta reemplazar la base dañada.
Repair systems correct damage to DNA
• Repair systems recognize DNA sequences that do not conform to standard base pairs.
• Excision systems remove one strand of DNA at the site of damage and then replace it.
• Recombination-repair systems use recombination to replace the double-stranded region that has
been damaged.
• All these systems are prone to introducing errors during the repair process.
• Photoreactivation is a nonmutagenic repair system that acts specifically on pyrimidine dimers.
• Structural distortions may provide a physical impediment to replication or transcription.
Introduction of covalent links between bases on one strand of DNA or between bases on
opposite strands inhibits replication and transcription.
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Excision repair systems in E. coli
Repair systems
• Some enzymes directly reverse specific sorts of
damage to DNA.
• There are pathways for base excision repair,
nucleotide excision repair, and mismatch repair,
all of which function by removing and replacing
material.
• The Uvr system makes incisions — 12 bases apart on
both sides of damaged DNA, removes the DNA between
them, and resynthesizes new DNA.
The uvr system of excision repair includes three genes,
uvrA,B,C, that code for the components of a repair
endonuclease.
• There are systems that function by using
recombination to retrieve an undamaged copy
that is used to replace a damaged duplex
sequence.
• The nonhomologous end-joining pathway
rejoins broken doublestranded ends.
• Several different DNA polymerases may be
involved in resynthesizing stretches
of
replacement DNA.
Base flipping is used by methylases and glycosylases
The methylase flips the target cytosine
completely out of the helix, it enters a
cavity in the enzyme where it is
modified. Then it is returned to its
normal position in the helix.
When mismatch errors occur during replication in E.
coli, it is possible to distinguish the original strand of
DNA.
Immediately after replication of methylated DNA, only
the original parental strand carries the methyl groups.
In the period while the newly synthesized strand
awaits the introduction of methyl groups, the two
strands can be distinguished.
Mismatches can be repaired preferentially for >1 kb
around a GATC site.
The result is that the newly synthesized strand is
corrected to the sequence of the parental strand.
E. coli dam- mutants show an increased rate of
spontaneous mutation.
The direct involvement
of RecA protein in
recombination-repair
is only one of its
activities.
This extraordinary
protein also has
another, quite distinct
function.
RecA causes to trigger
a complex series of
phenotypic changes
called the SOS
response, which
involves the expression
of many genes whose
products include repair
functions.
7
Fin
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