Estudio microbiológico de muestras de hortalizas comercializadas
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Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 13 Estudio microbiológico de muestras de hortalizas comercializadas en mercados públicos de San Salvador. Coralia de los Ángeles González Departamento de Bioquímica y Contaminación Ambiental, Facultad de Química y Farmacia, Universidad de El Salvador, El Salvador, Centro América. Resumen El consumo de hortalizas crudas expone a la población salvadoreña a infecciones gastrointestinales causadas por enterobacterias, virus y geoparásitos. Objetivo. Evaluar la contaminación fecal en muestras de hortalizas frescas originarias de huertas de El Salvador, de Quezaltenango (Guatemala) y comercializadas en siete mercados públicos de San Salvador. Metodología. Estudio bacteriológico y parasitológico de 262 muestras de hortalizas frescas para identificar enterobacterias en medios de cultivo selectivo, y huevos y quistes de parásitos intestinales mediante el método de concentración por centrifugación. Resultados. Se aislaron las siguientes enterobacterias: Escherichia coli en muestras de cilantro (67%), rábano (56%), apio (22%), lechuga (22%), y Salmonella sp. en el 10% de rábanos y lechugas, respectivamente. Así mismo, se identificaron huevos de Ascaris lumbricoides y quistes de Endolimax nana y de Giardia intestinalis. Las muestras de pepino y zanahoria fueron las únicas hortalizas que no presentaron contaminación por bacterias ni parásitos. Conclusión. Los resultados indican alta contaminación fecal de muestras de hortalizas por E. coli y Salmonella sp., y por huevos y quistes de parásitos intestinales, lo que puede relacionarse con deficientes prácticas agrícolas y de higiene en el cultivo, recolección, transportación y comercialización de las hortalizas investigadas, cuyo consumo representan un riesgo para la salud. Palabras clave: hortalizas frescas - estudio microbiológico – enterobacterias - contaminación fecal – Eschericha coli - El SalvadorAutor, correo: [email protected] Introducción La enfermedad diarreica aguda causada por agentes bacterianos, virus y parasitarios, constituye un problema de salud en los países en desarrollo, especialmente durante la estación de lluvia. Las hortalizas, alimentos consumidos crudos en ensaladas y encurtidos son usualmente un vehículo de transmisión de agentes bacterianos y parasitarios, como ha sido reportado en varios países de América Latina (1-5). En el país no se ha evaluado Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 14 adecuadamente la contaminación fecal de las hortalizas, pero existe evidencia de que pueden ser agentes importantes de transmisión de enfermedades intestinales (5). Desde el punto de vista de la salud pública, la búsqueda y el control higiénico de las hortalizas puede ayudar a localizar su origen, reducir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas gastrointestinales, así como también los costos económicos en materia de salud de la población. Varios estudios han demostrado que la implementación de buenas prácticas agrícolas, promovidas para mejorar el cultivo, la producción y comercialización de las hortalizas puede garantizar su calidad e inocuidad (6-10). En 1971, en El Salvador se reportó un primer estudio exploratorio, que mostró alta contaminación fecal en muestras de verduras comercializadas en el Mercado Central de San Salvador, reportando Escherichia coli en 20% de repollos y en 4.7% de lechugas examinadas y, además, contaminación por huevos de Ascaris lumbricoides, Toxocara sp., uncinaria y larvas de Strongyloides estercoralis en las muestras de lechuga. Las hortalizas provenían de cultivos irrigados con agua del río Acelhuate, altamente contaminado que circunda San Salvador (5). El presente trabajo tuvo por objetivo investigar la contaminación por enterobacterias y parásitos intestinales de hortalizas originarias de varias huertas del país, de Quezaltenango, Guatemala, y comercializadas en siete mercados de la Zona Metropolitana de San Salvador. Materiales y métodos El examen microbiológico fue realizado en muestras de apio, cilantro, cebolla, lechuga, rábano, repollo, tomate, pepino y zanahoria, comercializadas en los siguientes mercados de la Zona Metropolitana de San Salvador: La Tiendona, Modelo, Mercado Central, San Miguelito, San Antonio Abad, Zacamil y San Jacinto. A las vendedoras se les realizó una encuesta para conocer la procedencia, almacenamiento e higiene de las hortalizas, y se visitaron los principales lugares de producción de las mismas: Las Pilas, Chalatenango, Distrito de Riego del Valle de Zapotitán, Volcán de San Salvador, Lempa Acahuapa y Quezaltenango(Guatemala) para verificar si los agricultores cumplían con las buenas prácticas agrícolas recomendadas por la SAG/OIRSA para el cultivo de hortalizas (10). Examen bacteriológico. En el laboratorio se analizaron 162 muestras de hortalizas recolectadas en el período de julio a septiembre de 2006 (estación de lluvia) y de enero a febrero de 2007 (estación seca). Las muestras fueron tomadas en forma aséptica, en bolsas plásticas previamente rotuladas, y trasladadas al laboratorio en hieleras desinfectadas. El Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 15 análisis se inició con la preparación de tres diluciones: a) una dilución de 10-1 de 25 gramos de la muestra de hortalizas más 225 ml de agua peptonada en un frasco estéril, y agitación por 5 minutos en un aparato Stomacher a 260 RPM; b) una dilución de 10-2, de una muestra de 10 ml de la dilución anterior tomada con pipeta despuntada estéril, más 90 ml de diluyente; c) una dilución de 10-3 preparada con 10 ml de la dilución anterior más 90 ml de diluyente. Prueba para bacterias coliformes totales, fecales y Escherichia coli. De cada una de las diluciones se inoculó un mililitro a cada uno de tres tubos con caldo Fluorocult LMX y se incubaron a 35oC durante 24 a 48 horas. Los tubos que presentaron coloración azul verdoso, indicaron prueba positiva para coliformes totales. Posteriormente se examinaron los tubos bajo luz ultravioleta en un cuarto oscuro, utilizando lámparas fluorescentes. La producción de un pigmento fluorescente indica prueba positiva para Escherichia coli, la cual se confirmó al agregar dos gotas de reactivo de Kovack,el aparecimiento de un anillo de coloración roja indica prueba positiva. Para determinar coliformes fecales, se tomaron dos asadas de los tubos que presentaron fluorescencia y se sembraron en tubos con caldo EC en una Campana Durham y se incubaron en baño de agua a 44.5oC por 24 horas. La presencia de turbidez y gas dentro de la campana del tubo indica presencia de coliformes fecales. Prueba para determinar la presencia de Salmonella sp. Se pesaron 25 gramos de muestra en 225 ml de caldo lactosado y se centrifugo en un Stomacher a 230 RPM durante 5 minutos y luego se incubaron por 24 horas a 36° C ; de esta dilución 10-1 se tomó un ml y se inoculó en un tubo con caldo de Tetrationato de Sodio, y 0.1 ml a otro tubo con Caldo Rappaport Vassilidius, y se incubaron a 35oC y 42oC por 48 horas. Se tomó una asada del crecimiento y se sembró en agar Salmonella-Shigella y agar Rambac, se incubaron a 35oC durante 24 horas. Se seleccionaron las colonias incoloras o rosadas, traslúcidas o ligeramente opacas con punto negro en el Agar SS y Rambac, para realizar las pruebas bioquímicas de confirmación. Determinación de parásitos. La detección de huevos de helmintos y quistes de protozoarios fue realizada por el método de centrifugación y por el examen microscópico (objetivo 40X) de dos asadas del sedimento de la muestra de hortaliza de la dilución 10-1, más una gota de Lugol preparada entre porta-objeto y cubre-objeto. Resultados El examen microbiológico de 162 muestras de las siguientes hortalizas: apio, cilantro, cebolla, lechuga, rábano, repollo y tomate, mostró alta contaminación fecal enterobacterias E. coli , Salmonella sp. y por huevos de Ascaris lumbricoides, por las quistes de Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 16 Giardia intestinalis y de Endolimax nana (Cuadro 1, cuadro 2 y cuadro 2a ). Todas las hortalizas comercializadas en siete mercados públicos de la Zona Metropolitana de San Salvador - La Tiendona, Mercado Modelo, Mercado Central, San Miguelito, San Antonio Abad, Zacamil y San Jacinto provenían de huertas ubicadas en Las Pilas (Chalatenango), Valle de Zapotitán, Volcán de San Salvador, Lempa Acahuapa, y Quezaltenango (Guatemala). Se reportó contaminación en menor frecuencia por Entamoeba coli, Entamoeba histolytica y huevos de Taenia sp. Cuadro 1. Contaminación fecal de muestras de hortalizas y su procedencia Todas las muestras de hortalizas examinadas mostraron contaminación fecal tanto en la época lluviosa como en la época seca, sin embargo su frecuencia expresada en porcentajes no fue significativa. La alta contaminación fecal por E. coli fue detectada en 67% de las muestras de cilantro, siendo la hortaliza más contaminada, procedente de las huertas del Volcán de San Salvador y de Quezaltenango (Guatemala). Se observó, además, contaminación de rábano (56%), apio (22%) y lechuga (22%). La presencia de la E. coli, si bien forma parte de la flora normal del intestino humano desde la infancia, por su elevada frecuencia en la leche y otros alimentos es aceptada como indicador de contaminación fecal. En cambio, se encontró baja contaminación por Salmonella sp. en el 10% de rábanos y lechugas respectivamente, procedentes de las huertas de Las Pilas (Chalatenango), del Volcán de San Salvador y de Quezaltenango (Guatemala), pero no se identificaron en esta oportunidad las posibles especies de salmonela implicadas. Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 Las formas parasitarias 17 encontradas con mayor frecuencia fueron los huevos de A. lumbricoides y quistes de G. intestinalis y, con menor frecuencia quistes de Entamoeba coli, Entamoeba histolytica y huevos de Taenia sp. En la época seca, el cilantro y el tomate presentaron 42% de contaminación por A. lumbricoides en muestras procedentes de los mercados San Antonio Abad, Central, La Tiendona, Modelo, Zacamil y San Jacinto; así como en un 33% en apio y lechuga procedentes de los mercados Modelo, Zacamil y San Jacinto y en un 22% en rábano y cebolla del mercado Central y de San Jacinto. Asimismo, se detectó contaminación por el protozoario Entamoeba coli en el apio (33%), rábano (11%) y tomate (44%) procedentes de los mercados Modelo, La Tiendona, San Miguelito y Zacamil. El protozoario Giardia intestinalis fue reportado en el 100% de las muestras de apio y cilantro y en un 67% de la muestras de lechuga, cebolla y rábano procedentes de los mercados de San Miguelito, Modelo, Zacamil, San Antonio Abad, Central, San Jacinto y en un 22%de tomate y repollo procedentes del mercado Central La lechuga originaria de Quezaltenango, Guatemala mostró también elevada frecuencia de las enterobacterias Escherichia coli y Salmonella sp. y de los parásitos A. lumbricoides, y G. intestinalis (cuadro 2). Discusión El presente estudio muestra un alto nivel de contaminación de las hortalizas comercializadas en siete mercados de la Zona Metropolitana de San Salvador, originarias de huertas irrigadas por ríos y afluentes presuntamente contaminados por materias fecales de origen humano. Las hortalizas contaminadas provenían de cinco huertas ubicadas en el país y de una huerta de Guatemala: Las Pilas (Chalatenango), Distrito de Riego del Valle de Zapotitán, Volcán de San Salvador, Lempa Acahuapa, y Quezaltenango(Guatemala). Fue sorprendente detectar la alta contaminación de las siguientes hortalizas: apio, cilantro, cebolla lechuga, rábano, repollo, y tomate, por microorganismos patógenos agentes de enfermedades intestinales endémicas. La enterobacteria E. coli, por ejemplo, si bien forma parte de la flora normal en el intestino humano, incluye también cepas patógenas causantes de diarrea aguda y crónica en adultos y lactantes, diarrea del viajero e infecciones del aparato urinario, y en casos severos, disentería similar a la causada por la Shigella dysenteriae. La elevada frecuencia de E. coli en el agua, la leche y otros alimentos se acepta como indicador de contaminación fecal. Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 18 El aislamiento de Salmonella spp. reportada en menor proporción en rábano originario de Las Pilas, Chalatenango y en lechuga importada de Guatemala, indica la necesidad de identificar en estudios futuros las especies y serotipos que causan la enfermedad clínica catalogada como fiebre entérica, septicemias y enterocolitis. Es importante identificar la especie Salmonella typhi por ser agente causal de la Fiebre tifoidea, y también otras especies o serotipos como Salmonella choleraesuis, Salmonella paratyphi A y Salmonella paratyphi B por ser especialmente infecciosas para el hombre, así como para aves, cerdos, roedores, bovinos, mascotas - tortugas y loros -, que constituyen reservorios de la infección humana. Su caracterización es compleja, pues demanda estudios epidemiológicos con técnicas de hibridación DNA. En relación a los parásitos intestinales, los huevos de A. lumbricoides se identificaron frecuentemente en el apio, cilantro, lechuga y rábano, hortalizas originarias de huertos de El Salvador y Guatemala. Además, se identificaron con menor frecuencia, huevos de Taenia sp., que si fueran huevos de Taenia solium significaría un alto riesgo para los humanos y el cerdo de contraer la cisticercosis. Por otra parte, se descubrió elevada frecuencia de contaminación de las hortalizas por G. intestinalis, conocida también como Giardia lamblia o G. duodenalis, protozoario causante de irritación e inflamación a nivel del duodeno y yeyuno, con expulsión de heces grasosas y fétidas, cólicos abdominales y flatulencia. La giardiasis actualmente es catalogada como una zoonosis, pues existen especies del parásito que infectan perros, gatos, monos, roedores, caballos, osos, ardillas y peces, razón por la cual es necesaria su tipificación molecular a fin de determinar la especie y el origen de la infección. Los quistes de G. intestinales pueden sobrevivir en el agua hasta por 3 meses. Desde el punto de vista epidemiológico, es importante tener presente que las hortalizas son alimentos para consumo interno y para la exportación, razón por la cual su producción, cosecha, almacenamiento, distribución y comercialización deben someterse a programas de producción conocidos como Buenas Prácticas Agrícolas, para asegurar su calidad y reducir al mínimo su contaminación. Por su alto contenido de ácido ascórbico, carotenos y fibra dietética, las hortalizas son ampliamente recomendadas en la dieta alimentaria diaria. Entre los factores implicados en la contaminación fecal de las hortalizas, se identificaron los siguientes: a) carencia de un Manual de Buenas Prácticas Agrícolas, que asegure la calidad sanitaria del cultivo, colecta, transporte y comercialización de las hortalizas en las huertas investigadas; b) coexistencia de la vivienda y de animales domésticos dentro de las áreas de cultivo; c) Irrigación de las plantaciones con agua de ríos potencialmente contaminados y Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 19 ubicados en los Distritos de riego del valle de Zapotitán, (La Libertad), Atiocoyo y Nueva Concepción ( Chalatenango), Jayaque y San Antonio del Monte( Sonsonate), Lempa Acahuapa (San Vicente) y Chimaltenango en Guatemala; d) falta de higiene en la manipulación de las hortalizas por los transportistas, vendedores y compradores y la exposición de las mismas al aire libre en los vehículos de transporte y en mercados; y e) almacenamiento de las hortalizas en lugares expuestos a insectos (moscas y cucarachas), que participan el la transmisión mecánica de los microorganismos patógenos mencionados. Por otra parte, se investigó en el laboratorio el efecto inhibitorio de soluciones desinfectantes en el crecimiento de E. coli, para lo cual las hortalizas fueron lavadas con una solución de jabón, pesando 5 gramos de detergente en 95 ml de agua, se lavaron con agua potable y luego sumergidas por 15 minutos en una solución de Hipoclorito de Sodio de 169 ppm, siguiendo la recomendación del producto comercial, lo que redujo substancialmente la presencia de bacterias por debajo del límite máximo permitido para el consumo. Resultado similar fue obtenido usando una concentración de orégano al 10% p/v en agua destilada por 15 minutos. En relación con la contaminación de hortalizas por Salmonella sp., resultados inhibitorios han sido logrados por otros investigadores, usando ácido acético (vinagre) al 4% (4). El resultado de nuestro estudio muestra la relación directa entre la contaminación fecal de hortalizas comercializadas en siete mercados públicos de la Zona Metropolitana de San Salvador, su origen de huertas cultivadas en el país y en Guatemala y el elevado riesgo de contraer enfermedades causadas por enterobacterias y parásitos intestinales. El problema de la contaminación de hortalizas a nivel de país es aún desconocido, razón por la cual es recomendable realizar estudios más amplios orientados a precisar la magnitud del problema. Sin embargo, ante la necesidad inmediata de introducir acciones de control, orientadas al desarrollo de huertas saludables y comercialización higiénica de las hortalizas en el país, se sugieren las siguientes acciones de control: 1) adecuada disposición de las excretas, mediante el uso de letrina de hoyo o fosas sépticas, con lavado de agua y zonas de absorción; 2) asegurar la disponibilidad de agua potable y mecanismos de filtración del agua en ríos contaminados usados para la irrigación; 3) mejoramiento de las condiciones de vida e higiene de la población involucrada (educación – promoción), a fin de lograr la adecuada producción, transporte y comercialización de las hortalizas; y 4) desarrollar campañas educativas sobre higiene de las hortalizas y su apropiada comercialización, mediante el uso de cajas de cartón protegidas con papel plástico transparente - a semejanza de la práctica adoptada por los Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 20 mercados privados - con el objetivo de evitar su inadecuada manipulación por vendedores y compradores. Indudablemente, este proceso de control sanitario requiere la cooperación de los Ministerios de Salud, Agricultura, Medio Ambiente y Educación, puesto que la elevada contaminación actual de los ríos demanda acciones de saneamiento de manera integral. Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 21 Cuadro 2. Resultados del estudio microbiológico de hortalizas procedentes de diferentes mercados de El Salvador y Guatemala. Mercado Hortaliza Procedencia Microorganismos identificados ______________________________________________________________________ Ascaris Giardia E. coli Salmonella sp. lumbricoides La Tiendona Rábano Las Pilas/Chal. Volcán de S.S. + + + INTERIOR DEL PAIS. Tomate Las Pilas/Chal. Volcán de S.S. + Valle Zapotitan. Repollo Las Pilas/Chal. Volcán de S.S. + Cilanto Volcan de San Salv. + + Lechuga Guatemala + + + + Apio Guatemala + + Cebolla Guatemala + Modelo Rábano Volcan de San Salv. + + Tomate Guatemala + Repollo Guatemala + Cilanto Volcan de San Salv. + + Lechuga Guatemala + + Apio volcan de San Salv, Guatemala + + Cebolla Central Rábano volcan de San Salv, Guatemala + + Tomate Lempa Acahuapa + Repollo Lempa Acahuapa + Cilanto volcan de San Salv, Guatemala + + Lechuga Guatemala, Chimaltenango + + Apio volcan de San Salv, Guatemala + + Cebolla Guatemala - Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 22 Cuadro 2. Resultados de estudio microscópico de hortalizas de diferentes mercados de El Salvador y Guatemala Mercado Hortaliza Procedencia Microorganismos identificados __________________________________________________________________________________________ Ascaris lumbricoides San Miguelito Rábano Tomate Repollo Cilanto Lechuga Apio Cebolla San Antonio Rábano Tomate Repollo Cilanto Lechuga Apio Cebolla Zacamil Rábano Tomate Repollo Cilanto Lechuga Apio Cebolla San Jacinto Rábano Tomate Repollo Cilanto Lechuga Apio Cebolla Guatemala Guatemala Las Pilas Volcan de San Salv. Guatemala Guatemala Guatemala Volcan de San Salv. valle zapotitan Las Pilas Volcan de San Salv. Guatemala Volcan de San Salv. Guatemala Guatemala Guatemala Las Pilas Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Volcan de San Salv. Guatemala Las Pilas Volcan de San Salv. Guatemala Volcan de San Salv. Guatemala + Hortalizas contaminadas --Hortalizas no cotaminadas + + + + + + + + + + + + + - Giardia intestinalis + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - E. coli + + + + - Salmonella sp. - Minerva Revista en línea CIC-UES Enero-Julio 2014 Vol. 4 23 Patrocinio Este proyecto, con registro de aprobación 03.06, fue financiado por el Consejo de Investigaciones Científicas de la Universidad de El Salvador (CIC-UES). Referencias 1. Monge L, Chinchilla M, Reyes L. Presencia de parásitos y bacterias intestinales en hortalizas que se consumen crudas en Costa Rica. 1955. 2. Muñoz V, et al. Alta contaminación de enteroparásitos en hortalizas comercializadas en los mercados de la ciudad de La Paz, Bolivia. Revista biofarbo 2008. 3. Gregorio P, et al. Detección de parásitos intestinales en el agua y alimentos de Trujillo, Perú. Rev Perú med exp salud pública 2008. Consultada en http://www.scielo.org.v 4. Franjola T, Gutiérrez J. 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