Teórica Filogenia-Metagenómica 2015

Filogenia Microbiana
Genómica ambiental- Metagenómica
Revisión estructura celular procariota
Referencias:
-The Legacy of Carl Woese and Wolfang Zillig: from phylogeny to landmark discoveries.
S. Albers et al. Nature Rev. Microbiol. 11, 713-719 (2013)
-Metagenomics: Application of genomics to uncultured microorganisms.
Jo Handelsman. MMBR 68 (4): 669-685 (2004)
-Metagenomic Analysis: Past and Future Trends.
Simon, C. and Daniel R. AEM 77(4): 1153-1161 (2011)
Filogenia:
Historia evolutiva de un grupo de organismos
Inferida indirectamente por comparación de secuencias nucleotídicas
Genes empleados en análisis filogenéticos
-
Universalmente distribuidos en los grupos en estudio
-
Funcionalmente homólogos
-
Poseen regiones de secuencias conservadas (alineamiento de
secuencias)
Small subunit rRNAs (SSU rRNA), genes codificantes de ARNr 16S
(procariotas) y 18S (eucariotas)
Otros genes: ATPasas, componentes aparato de traducción (factor de
elongación Tu), RecA, Hsp60, t-RNA sintetasas.
Carl Woese (1977) usa por primera vez SSU rRNA como herramienta
filogenética y propone el Arbol Filogenético Universal con 3 Dominios:
Bacteria, Archaea, Eukarya.
PROCARIOTAS
(Adapted from Woese et al. PNAS 87: 4576-4579, 1990)
EUCARIOTAS
Estructura primaria y secundaria del ARNr de E. coli. El ARN 16S de las arqueas
posee un plegamiento similar pero presenta numerosas diferencias en la secuencia nt.
Aplicación de los SSU rRNAs. Identificación de microorganismos.
El análisis de SSU rRNAs permitió el desarrollo de herramientas que se utilizan
en ecología microbiana y medicina.
Complementa técnicas fenotípicas y genotípicas usadas para la Taxonomía
bacteriana.
Signature sequences en los ARNrs:
Son oligonucleótidos cortos únicos a ciertos grupos de microorganismos.
Se conocen para los 3 dominios de la vida y para microorganismos específicos.
Sirven para el diseño de sondas o probes filogenéticos usados en la técnica FISH
y para el diseño de cebadores en PCR
Ribotipificación (huellas moleculares) :
Se basa en el análisis del perfil de restricción de los genes codificantes de rRNA
16S.
Extracción del ADNg del microorganismo, digestión con enzimas de restricción
(ERs), electroforesis de fragmentos de ADNg, hibridación con sondas de SSU
rRNA.
Da un patrón de bandas característico para cada microorganismo que
depende de la secuencia de nt del rRNA (presencia/ausencia sitio de
reconocimiento de las ER usadas). Se compara el perfil obtenido con patrones de
restricción de rRNA de microorganimos conocidos.
Usado en diagnóstico clínico y análisis de alimentos.
Técnicas basadas en la amplificación de rRNA por PCR
Secuenciación de los genes SSU rRNAS y Filogenia
Ecología microbiana
Estudia la biodiversidad y actividades existentes en las comunidades
microbianas (poblaciones de microorganismos que interaccionan en la
naturaleza)
El estudio de biodiversidad requiere identificación y cuantificación de
microorganismos directamente en su habitat.
Métodos de análisis de comunidades microbianas
1. Dependientes de cultivo. Enriquecimiento y aislamiento de los
microorganismos. Ej. Columna de Winogradsky (TP1). Ecosistema
microbiano artificial que permite el enriquecimiento y aislamiento de
distintos grupos fisiológicos.
2. Independientes de cultivo. No requiere el aislamiento de los
microorganismos. Estos son detectados mediante el análisis de sus genes
directamente de las muestras ambientales.
Análisis de comunidades microbianas
independiente de cultivo
Métodos de tinción generales
Permiten cuantificar microoganismos en muestras naturales. No dan información sobre la
fisiología o filogenia de la células.
Cuantificación de células totales. DAPI (4, 6 diamido 2 phenylindole), naranja de acridina.,
SYBR Green I . Son colorantes fluorescentes que se unen al ADN. No son específicos. No
distinguen células vivas o muertas.
Tinción de células viables. Se basan en la
integridad de la membrana celular.
Ej. LIVE/DEAD. El verde penetra en todas las
células; el rojo (ioduro de propidio) penetra
sólo en las células que poseen la membrana
rota (células muertas).
Tinciones genéticas:
Probes filogenéticos y FISH (fluorescence sin situ hybridization)
Identificación y cuantificación de microorganismos. Muy específico.
Se usan probes muy específicos complementarios a SSU rRNAs marcados con un
fluoróforo. Penetran en las células e hibridizan con los ribosomas. Observación en
microscopio de fluorescencia.
Análisis de muestras ambientales o células en cultivo.
Aplicación en ecología microbiana, diagnóstico clínico, microbiología de alimentos.
FISH
A, C. Tinción de células totales (DAPI).
B, D. Probes específicos para Acidithiobacillus ferrooxidans (B) y Acidiphillium spp (D).
Muestras tomadas del Rio Tinto, España.
DGGE
Permite separar genes de igual tamaño y
diferente composición de bases (diferente Tm)
en geles desnaturalizantes con gradiente de
urea o formamida.
Metagenómica
(Genómica Ambiental)
Estudio molecular de
comunidades microbianas
- Diversidad filogenética
- Diversidad metabólica
- Expresión génica
- Análisis funcional
- Reconstrucción total o parcial
de los genomas de
microorganiamos no cultivados
Método de PCR para analizar comunidades microbianas
(SSU rRNAs y genes metabólicos)
Más de 200 metagenomas secuenciados de diferentes ambientes:
- Tierra
- Océanos
- Intestino humano
- Ambientes extremos
- Aplicación en investigaciones médicas y forenses
- 2009. Projecto Metagenoma Humano.
Mapear comunidades microbianas asociadas con el intestino humano, boca, piel.
Metatranscriptómica
Provee información sobre capacidades metabólicas y funcionales de una
comunidad microbiana.
Secuenciación directa de ADNc usando nuevas tecnologías de secuenciación
(next -generation sequencing technologies )
Ej. Pirosecuenciación
Metaproteómica
Caracterización en gran escala del conjunto de proteínas de la microbiota
ambiental en un determinado momento.
Su finalidad es determinar el potencial catalítico de una comunidad microbiana.
Electroforesis 2D y espectrometría de masas.
Es un área emergente.
Estructura general de la célula procariota
Micrografía electrónica
de transmisión (MET)
de una bacteria.
Comparación de la envoltura celular en bacterias Gram + y Gram
negativas
Envoltura celular de
bacterias y arqueas
a. Arquea
b. Bacteria Gram +
c. Bacteria Gram -
S. Capa S
CM. Membrana citopl.
CW. Pared celular
OM. Membrana externa
PG. Péptidoglicano
(mureína)
Lípidos de las Membranas celulares de bacterias y arqueas
Los fosfolípidos en bacterias son
ésteres de glicerol y ácidos grasos.
a. Fosfatidiletanolamina
b. Fosfatidilglicerol
Las cadenas hidrofóbicas de fosfolípidos arqueanos son alcoholes isoprenoides,
forman uniones éter con el glicerol (a-b-c). Forman bicapas o monocapas lipídicas
(d). Membranas más estables en condiciones ambientales extremas