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CATEDRA DE BIOQUIMICA
LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL
Tecnología Médica
Elaborada por:
Prof. Barbara Butendieck A.
Prof. Claudia Castillo K.
2014
Introducción Normas generales de protección, prevención y comportamiento: Por todos los riesgos indicados, es necesario (y obligatorio) llevar delantal para protegerse de los productos químicos. Como protección personal se puede utilizar, cuando sea necesario, guantes y máscara. Todas las damas y caballeros que tienen el pelo largo, deben recogerlo en forma completa en un moño con un collet, pinche o traba. En el laboratorio no se debe fumar, comer ni beber, para evitar el peligro de un envenenamiento o contagio por contacto accidental con algún producto tóxico o agente patógeno. El material de vidrio debe ser manipulado con precaución para evitar roturas. Se recomienda fijarse en el nombre de las disoluciones y productos antes de utilizarlos. Si se utilizan pipetas de vidrio o plástico, hay que pipetear con el dedo índice, nunca con el pulgar. No se debe pipetear directamente del frasco de agua destilada o de las disoluciones que se comparten con otros grupos: debe pipetearse de la disolución transvasada previamente a un vaso precipitado. Hay que manejar con precaución las sustancias peligrosas: ácidos, álcalis, disolventes orgánicos y productos tóxicos. Estos productos no deben pipetearse nunca con la boca, sino con ayuda de una propipeta. Seguridad en el laboratorio Deben tener presente las reglas generales de seguridad. Se debe estar consciente que los reactivos utilizados en el laboratorio son potencialmente tóxicos, irritantes o inflamables. Sin embargo estas sustancias son peligrosas solo cuando no se manipulan correctamente. La guía y el cuaderno de laboratorio Es muy importante hacer un diagrama de flujo antes de iniciar la sesión. Los procedimientos, detalles, observaciones y resultados se deben registrar en la guía o cuaderno de laboratorio mientras el experimento se está llevando a cabo. Breve pauta para preparar el Informe de Laboratorio. Portada Logo institucional, facultad, escuela; nombre del laboratorio, integrantes del grupo, asignatura, docentes, fecha de entrega. Introducción Breve resumen de conceptos y/o importancia del tema. La información debe tener relevancia para el práctico y no debe ser una copia de un libro, de la guía o de internet. Procurar que no exceda de una plana. Objetivo Aquí se debe incluir cual es el objetivo del práctico, porque, para qué? Parte experimental Materiales y métodos Se describen los reactivos, materiales y equipo que se utilizan, así como la metodología empleada Se debe redactar en tercera persona. Resultados y discusión Se describen los resultados obtenidos, se indican los cálculos, tablas, gráficas o figuras, así como una explicación con fundamentos científicos del porqué se obtuvieron esos resultados. Los resultados experimentales se resumen en forma de tabla o de gráfica. Las tablas y gráficas deben nombrarse ordenadamente en el texto (Tabla 1, Tabla 2, etc.) y deben tener un título. En algunos casos, además, puede ser interesante dar detalles adicionales en forma de una leyenda colocada debajo del título. Las unidades en que se expresan los resultados deben indicarse en la parte superior de cada columna (y nunca en cada línea de cifras). Estas unidades deben elegirse de manera que presenten un número limitado de cifras (por ejemplo, una concentración de 0.0072 mol/L se escribe más fácilmente 7.2 mmol/L o 72 x 10-­‐4 mol/L). En general, los valores obtenidos se presentan en forma de gráfica y no de tabla. Para trazar una gráfica se representan los valores de la variable independiente (parámetro conocido) en el eje de abscisas (eje x) y los de la variable dependiente (parámetro desconocido) en el eje de ordenadas (eje y). Cuestionario En caso de existir cuestionario, incluirlo en el informe. Bibliografía Reportar las fuentes utilizadas con el formato estándar: Para libros: Autor(s), año de publicación, título, editorial y páginas consultadas, en el caso de internet señalar la dirección completa, fecha de revisión de lapágina. Para el caso de revistas científicas: Autor(es), año, nombre del artículo, nombre de la revista, volumen, número, páginas. (Norma APA) Los Informes se escribirán a mano en un cuadernillo de matemáticas y se entregarán en el laboratorio siguiente, al inicio de éste. La entrega del informe fuera de plazo devengará automáticamente en un 1 en la calificación. Considere en el informe la redacción y la ortografía. Se descontarán decimas de nota por estos errores. OJO
Antes del inicio del laboratorio se realizarán pruebas de entrada al laboratorio. Las preguntas saldrán de la guía de laboratorio, del práctico que se realizará ese día LABORATORIO 2: INTRODUCCIÓN
I.
SOLUCIONES Y TAMPONES
SOLUCIONES
Una solución es una mezcla homogénea de dos o más componentes. El componente que está en
mayor proporción se llama solvente y el o los componentes que están en menor proporción se
llaman solutos. En soluciones líquidas, el solvente es líquido en tanto que los solutos pueden ser
sólidos, líquidos o gases. La mayoría de las soluciones usadas en bioquímica son soluciones
acuosas (solvente agua).
Para caracterizar una solución no basta indicar sus componentes, sino que también la proporción
en que estos están presentes en la solución, es decir, la concentración de cada uno de los solutos
en la solución.
UNIDADES DE CONCENTRACIÓN
Las más usadas en la práctica son de dos tipos:
-. Unidades de concentración referidas a volumen: Indican cantidad de soluto disuelto por unidad
de volumen de solución.
Ej.: la molaridad, la normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc.
-.Unidades de concentración referidas a peso: indican cantidad de soluto disuelto por unidad de
peso de solución o de solvente.
Ej.: % p/p, molalidad.
1.-Molaridad (M): número de moles de soluto por litro de solución. Para preparar una solución de
molaridad dada es necesario conocer el peso molecular (PM) del soluto.
Se usan las relaciones:
Peso soluto (g) = número de moles de soluto
PM (g/mol)
N° moles de soluto = M
Volumen solución (l)
Ej.: Una solución 1 M (1 molar) de NaCl contiene 1 mol (58,8g) de NaCl por litro. Un mol de NaCl
23
corresponde a un valor igual al número de Avogadro de moléculas, que es 6,023 x 10 .
La concentración de iones en solución también se indica en unidades molares, en este caso el
ión es la molécula.
Ejemplos: Consideremos la solución 1 M de NaCl. Los enlaces iónicos de la red cristalina de
cloruro de sodio se rompen al disolverse la sal.
+
NaCl -------------! Na + Cl
+
-
Por cada mol de NaCl sólido se forma 1 mol de Na y un mol de Cl . Luego:
+
Concentración de Na = 1M
Concentración de cloruro = 1 M
Para las moléculas más complejas como MgCl2
MgCl2 -------------! Mg
+2
+ 2 Cl
-
Una solución de cloruro de magnesio 1M contiene:
+2
Concentración de Mg
=1M
Concentración de cloruro = 2 M
Las concentraciones de soluciones diluidas se suele expresar en unidades que son
submúltiplos de M:
Milimolaridad (mM): número de milimoles de soluto por litro de solución.
La milimolaridad y los otros submúltiplos se definen en forma análoga:
-3
-3
Milimolaridad (mM): 1 mmol = 10 moles, luego 1mM = 10 M
-6
-6
Micromolaridad (µM) 1µmol = 10 moles, luego 1µM = 10 M
-9
-9
Nanomolaridad (nM) 1 nmol = 10 moles, luego 1nM = 10 M
2. Normalidad (N): Número de pesos equivalentes (PE) de soluto por litro de solución. Solamente
para algunos compuestos se define un PE, y este siempre tiene relación con la reactividad del
compuesto.
En general : PE = PM
N
Ácidos y bases: n = N° de protones que puede ceder (el ácido) o captar (la base) por
molécula. Compuestos que sufren reacciones redox: n= N° de electrones captados (agente
oxidante) o cedidos (agente reductor) por molécula.
3. Peso de soluto/volumen de solución en g/l, mg/l: Esta es la forma más sencilla de indicar la
concentración de una solución, es la forma más usual, aparte de la molaridad.
4. Porcentaje peso/volumen (% p/v): Peso de soluto en gramos por 100 ml de solución (g%). Se
habla de porcentaje ya que 100 ml de una solución acuosa relativamente diluida pesan
aproximadamente 100g. para soluciones muy diluidas se usa el submúltiplo mg% = peso del soluto
en mg por 100 ml de solución.
5. Porcentaje peso/ peso (%p/p): Peso en gramos de soluto por 100 gramos de solución. La
concentración de la mayoría de los ácidos comerciales viene dada en %p/p. Aquí la proporción de
soluto puede ser mayor que la proporción del solvente. Ej.: H2SO4 96%. Para poder transformar
%p/p a concentración molar o normal es necesario conocer la densidad (d) de la solución.
Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial del 28%, densidad 1,15 (kg/l).
Primero calculamos cuánto pesa 1 litro de la solución.
1 l x 1,15 (kg/l) = 1,15 kg = 1150 g
Ahora calculamos el peso de HCL puro contenido en este litro:
100 g de solución contienen 28 g, por lo tanto 1150 g de solución contienen 1150g
x 0,28 = 322g
Finalmente, calculamos a cuántos moles corresponde este peso de HCl:
(g/mol)
PM del HCl = 36,5
322 (g)
= 8,82 moles
36,5 (g/mol)
Hemos calculado que 1 litro del ácido comercial contiene 8,82 moles de HCl, es decir, su
concentración es 8,82 M.
6. Molalidad (m): Número de moles de soluto por 1000 gramos de solvente. Esta unidad de
concentración se usa solamente para ciertos cálculos físico-químicos. Expresar la concentración en
estas unidades presenta la ventaja de que se hace independiente de la temperatura. Al contrario,
una concentración expresada en unidades referidas a volumen, como la molaridad, varía con la
temperatura, ya que ésta afecta el volumen. Para soluciones acuosas diluidas m es prácticamente
igual a M.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
Para preparar una solución de un soluto dado se puede usar el soluto puro (
generalmente sólido) o una solución concentrada de él en el mismo solvente ( solución stock). Este
último caso constituye una dilución.
Para diluciones rige la relación:
V1 x C1 = V2 x C2
V1 = volumen de la solución concentrada
C1 = concentración de la solución concentrada
V2 = volumen de la solución diluida
C2 =concentración de la solución diluida
C1 y C2 pueden ser unidades de concentración de cualquier sistema referido a volumen.
Ejemplo: En un matraz aforado de 100 ml se colocaron 10 ml de una solución 2M de cloruro de
sodio y se aforó con agua. ¿Cuál será la concentración de la solución resultante?
Nuestro sentido común nos dice que la respuesta será 0,2 M, ya que la solución se diluyó 10
veces. El cálculo según la relación dada sería:
C2 = V1 x C1 = 10 ml x 2M = 0,2 M
V2
100 ml
PROBLEMAS SOLUCIONES
1.- a) ¿Cuántos g de NaOH sólido se requieren para preparar 500 ml de una solución 0,04 M?
b) Exprese la concentración de la solución preparada en a) en términos de N, g/l, (% p/v).
2.- ¿Cuántos mililitros (ml) de H2SO4 3M se requieren para preparar 500 ml de una solución de
H2SO4 de concentración?
a) 0,05 M b) 0,002 N
3.- Describa la preparación de 3 litros de HCl 0,25 M, utilizando una solución comercial
concentrada de HCl ( 32% p/p, d= 1,16 kg/l).
4.- 50 ml de H3PO4 85% p/p, d= 1,71 g/ml se diluyeron a 200 ml con agua. Calcule la normalidad de
la solución.
5. a) ¿Cuántos ml de NaCl 0,5 M se necesitan para preparar 2 litros de NaCl 2 mM?
b) ¿Cuántos ml de KCl 0,3 M se necesitan para preparar 2 litros de solución 50 mM?
6.- Ud. dispone de varias soluciones concentradas: NaCl 2M; KCl 0,5 mM; MgCl2 100 mM y CaCl2
1,3 M. A partir de esto, describa la preparación de 2 l de una solución que contenga NaCl 120 mM,
KCl 35 µM, MgCl2 0,03mM y Na2SO4 0,06 M.
-
7.- Respecto de la solución preparada en 6, calcule la concentración para el anión Cl y para el
+
catión Na .
pH Y TAMPONES
ACIDOS Y BASES
Según la definición de Bronstedt:
ÁCIDO:
es un compuesto que tiende a ceder protones al medio.
BASE:
es un compuesto que tiende a captar protones del medio.
En medio acuoso, la reacción correspondiente de un ácido HA será:
+
HA + H2O "--! H3O + A
–
u obviando la participación del agua:
+
HA "--! H + A
-
(1)
Considerando esta reacción en el sentido inverso, la especie a- puede captar protones. A- es la
base conjugada de HA.
Similarmente para una base B:
B
-
+
+ H "-! BH
+
(2)
+
BH es el ácido conjugado B.
Ejemplos de bases según Bronstedt son los compuestos orgánicos básicos, que deben su
basicidad al grupo funcional amino.
FUERZA DE ACIDOS Y BASES
Un ácido o una base fuerte es el que está completamente disociado en solución.
En cambio, un ácido débil está solamente parcialmente disociado y la base parcialmente
protonada.
Ácidos fuertes son: HCl, HNO3, HClO4, H2SO4 (ambos protones), H3PO4 (solamente el
primer protón que se disocia). Bases fuertes son: NaOH, KOH, etc. Ácidos y bases débiles:
prácticamente todos los ácidos y bases orgánicos pertenecen a este grupo.
Ácidos y bases débiles
Consideremos a modo de ejemplo el ácido acético, HOAc.
Fórmula estructural: CH3- COOH
Este ácido débil posee un solo protón ácido. En solución acuosa coexisten en equilibrio moléculas
de la especie protonada con moléculas del anión acetato (OAc) y protones. La relación entre la
concentración de las especies nombradas a una temperatura determinada está dada por la
constante de equilibrio de la reacción de disociación, llamada constante de acidez, Ka:
HOAC "----! OAc
-
+H
+
(3)
+
Ka = [OAc] [H ]
[HOAc]
Ka de HOAc (25 °C): 1,78 x 10
-5
Se suele expresar la acidez a través del pKa en vez de usar Ka:
pKa = - log Ka
pKa de HOAC (25 °C)=4,75
Se cumple:
que a mayor Ka ========# menor pKa =====# mayor acidez
Con el fin de comprender mejor el significado de la constante de acidez,
calcularemos la concentración de las especies presentes en una solución 0,1 M de HOAc.
Según la ecuación 3
+
[H ] = [OAc] = x
[HOAc] = 0,1 –x
El valor numérico de Ka indica que HOAC estará poco disociado, luego podemos aproximar:
[HOAc] = 0,1
reemplazando en la expresión de Ka
2
Ka = x = 1,78 x 10
-5
0,1
-3
x = 1,33 x 10 M
Es decir, en nuestra solución:
= 0,1 M
[HOAc]
+
[OAc]
= [H ] = 1,33 mM
Comprobamos que la aproximación hecha fue correcta.
-3
El pH de la solución es igual a pH = - log (1,33 x 10 ) = 2,88
Para una base débil B se puede definir la constante de basicidad Kb
+
Kb = [BH ]
+
[B] [H ]
Sin embargo, lo usual es caracterizar las bases débiles a través de la constante de acidez de su
+
ácido conjugado BH (invirtiendo la reacción 2). Para un par ácido/base conjugada se cumple:
Ka x Kb = Kw y
+
-
Kw = [H ] x [OH ] = 10
-14
(25 °C)
Kw = constante de disociación del agua
ECUACIÓN DE HENDERSON-HASSELBACH
En forma análoga a lo visto para HOAC, para un ácido débil HA:
-
+
Ka = [A ] [H ]
[HA]
+
Despejando [H ] y aplicando log se obtiene
-
pH = pKa + log [A ]
Ecuación de Henderson-Hasselbach
[HA]
Esta ecuación establece la relación entre pH y la proporción entre la especie protonada y
desprotonada. Se usa para calcular el pH de la mezcla de un ácido débil con un ácido fuerte o una
base fuerte de un ácido débil con su sal, mezclas tampón, etc..
SOLUCIONES TAMPON
Cuando se titula una solución de HOAc con una solución de una base fuerte
(NaOH), midiendo el pH después de cada adición se obtiene el siguiente gráfico, llamado curva de
titulación:
pH
zona tamponante
punto de equivalencia
ml NaOH
Se aprecia que en un rango de pH alrededor de 4,75 (pKa) el pH varía muy poco
durante la adición de base, se trata de la zona tamponante del par HOAc/OAc . (Definiremos este
concepto más adelante).
Las reacciones involucradas son:
1. NaOH
+
2. OH + H
3. HOAc
+
-
Na + OH
H 2O
+
OAc + H
La suma de las dos primeras reacciones hace disminuir la concentración de protones en la
solución. Sin embargo, la tercera reacción simultáneamente repone parte de los protones
neutralizados. El equilibrio de disociación de HOAc se desplaza hacia la formación de acetato.
Para:
-
pH = pKa ocurre que [HOAc] = [OAc ] (Verifique esta aseveración)
A medida que la concentración de la especie protonada HOAc en la solución se
hace pequeña, el pH comienza a aumentar más fuertemente, hasta que la solución pierde su
característica de tampón.
Al titular una solución básica que contiene el anión acetato con un ácido fuerte se observa el
mismo fenómeno. Estaríamos recorriendo nuestra curva de derecha a izquierda.
Solución tampón (solución amortiguadora o buffer): Es una solución cuyo pH se mantiene
prácticamente constante cuando se le agregan pequeñas cantidades de ácido o base. Las
soluciones tampón son sistemas formados por un ácido débil y su base conjugada o por una base
débil con su ácido conjugado.
Zona tamponante de un sistema tampón: Es el intervalo de pH en el cual el sistema posee
propiedades de tampón, depende del valor del pKa de la especie protonada. Un tampón es "bueno"
aproximadamente 1 unidad de pH alrededor del pKa.
Los valores de pKa para algunos tampones de uso común en bioquímica están contenidos en la
tabla 1. También se usan mezclas de dos diferentes sistemas tampón, ejemplos: Tampón
tris/fosfato, trietanolamina/dietanolamina.
Capacidad de una solución tampón: La capacidad de una solución tampón indica la cantidad de
ácido o de base que es capaz de absorber sin cambiar fuertemente su pH y depende de:
- pH : es máxima para pH = pKa
- concentración: a mayor concentración, mayor capacidad tamponante.
Concentración de una solución tampón: Es la suma de las concentraciones de la especie
protonada y de la especie deprotonada.
Compuesto
Acido fosfórico (pka1)
Glicina
Acido cítrico (pKa1)
Acido fórmico
Acido acético
Acido cítrico (pKa2)
Acido cítrico (pKa3)
MES (ácido conjugado)
Imidazol (ácido conjugado)
Acido fosfórico (pKa2)
HEPES (ácido conjugado)
Trietanolamina (ácido conjugado)
TRIS (ácido conjugado)
Acido fosfórico (pKa3)
pKa (20ºC)
1,96
2,45
3,10
3,75
4,75
4,75
5,40
6,15
7,00
7,21
7,55
7,77
8,08
12,30
Selección de un tampón:
Las variables a considerar son en primer lugar:
a) El pH al cual deseamos trabajar
b) La capacidad que necesitamos
Otros aspectos importantes pueden ser:
c) Solubilidad de los compuestos
Ejemplo: Una desventaja de los buffer de fosfato es la baja solubilidad de sus sales.
d) Variación del pH con la temperatura:
Ejemplo: Una desventaja de los tampones de Tris es que su pH varía notoriamente con la
temperatura.
e) Volatilidad: Algunos sistemas tampón presentan la ventaja de ser volátiles.
Ejemplo: Acetato de amonio, bicarbonato de amonio.
f) Transparencia a la luz U.V.: Cuando se desea detectar un compuesto por absorciometría, es
necesario usar un buffer que sea suficientemente transparente a la longitud de onda de la
determinación.
g) Interacciones entre el sistema tampón y las sustancias en estudio.
Ejemplo: influencia de un sistema tampón sobre la actividad de determinada enzima.
Cálculos relacionados con la preparación de tampones:
Ejemplo: Se desea preparar un litro de buffer acetato 0,1 M de pH = 4,60 a partir de ácido acético
2 M y acetato de sodio.
La ecuación de Henderson-Hasselbach permite calcular la razón de las concentraciones de
HOAc y OAc necesaria para que el pH de la solución sea igual a 4,60:
-
pH = pKa + log [OAc ] ; reemplazando el pKa de HOAc y el pH:
[HOAc]
-
4,60 = 4,75 + log [OAc ]
[HOAc]
-
-
log [OAc ] = -0,15
[HOAc]
[OAc ] = 0,708
[HOAc]
-
Por otra parte: [HOAc] + [OAc ] = 0,1 (todas las concentraciones en M)
-
[HOAc] = 0,1 - [OAc ]
-
Reemplazando: [OAc ]
= 0,708
0,1 - [OAc ]
-
-
[OAc ] = 0,0708 - 0,708 [OAc ]
-
[OAc ] = 0,0708 = 0,0415 M
1,708
[HOAc] = 0,1 - 0,0415 = 0,0585 M
Se desea preparar un volumen igual a un litro, luego se necesitan 0,0415 moles
sodio.
NaOAc : PM = 82
de acetato de
0,0415 moles = 3,4 g
HOAc: se aplica la relación de las diluciones
V1 = 1 (l) x 0,0585 M = 0,0293(l)
2M
Preparación de la solución: en un matraz aforado de 1 litro se colocan 3,4 g de acetato de sodio
más 29,3 ml de HOAc 2 M y se afora con agua.
PROBLEMAS TAMPONES
+
-
1. ¿Cuáles son a) H , b) OH ; c) pH; de una solución de un ácido fuerte HX de concentración 5
mM?
-3
-12
Resp.: a) 5 x 10 M
c) 2,30
b) 2 x 10 M
+
-7
2. a) La concentración de iones H de una muestra de orina es 2 x 10 M. ¿Cuál es su pH?
b) El pH de una muestra de suero es 7,4 ¿Cuál es la concentración de iones hidrógeno?
-8
Resp.: a) 6,7
b) 4 x 10 M
+
-
3. ¿Cuántos iones de a) H y b) OH están presentes en 250 ml de una solución de pH = 4?
19
13
Resp.: a) 1,51 x 10
b) 1,51 x 10
4. ¿Cuántos milílitros de HCl 0,05 N se requieren para neutralizar exactamente 20 g de NaOH?
Resp.: 10000 ml = 10 litros
5. ¿Cuántos g de NaOH sólido se necesitan para preparar?:
a) 250 ml de una solución 0,08 M y
b) 500 ml de una solución de NaOH a pH 9,7?
Resp.: a) 0,8 g
b) 1,00 mg
6. El pH de una solución 0,02 M de ácido débil HA es 4. a) ¿cuál es el grado de ionización de HA
en la solución? b) ¿cuál es el Ka?
-7
Resp.: a) 0,5%
b) 5,03 x 10
-6
7. El Ka de un ácido HA es 1,6 x 10 a) ¿Cuáles son pH y grado de ionización del ácido en una
-3
solución 10 M? b) Calcular el pKa
Resp.: a) 4,40; 4%
b) 5,80
8. ¿Cuál es la concentración de ácido acético y acetato en un tampón acetato de concentración
-5
0,1 M y pH 6,0? El Ka para el ácido acético es 1,78 x 10
Resp.: 94,7 mM; 5,3 mM ( [OAc ] y [HOAc] respectiv.)
9. Calcule el pH de las soluciones obtenidas al mezclar 10 ml de NaOH 0.01 M, con 90 ml de: a)
H2O b) NaCl 0,1 M c) una solución que contiene 0,05 M HOAc y 0,05 M NaOAc. ¿Cuál será el
valor inicial del pH de la solución? Discuta los resultados.
Resp.: a) 11
b) 11
c) 4,77
10.¿Cuál es el pH de una solución que contiene acetato potásico 0,3 M y ácido acético 0,15 M?
(pKa ácido acético = 4,75)
Resp.: 5,05
11. ¿Cuál es el pH de una solución que contiene NH4Cl 0,1 M y NH3 0,2 M. pKb NH3 = 4,6.
Resp.: pH 9,7
-3
-3
12. Se preparó un "buffer" disolviendo en agua 5 x 10 moles de ácido fórmico y 7 x 10 moles de
-4
formiato de sodio en un volúmen final de 1 l. El Ka del ácido fórmico es 1,8 x 10 .
a) calcular el pH de la solución resultante
b) si esta solución se diluyera 10 veces ¿cuál sería el pH final?
Resp.: a) 3,89
b) 3,89
13. Calcular el pH de una solución formada cuando a 200 ml de ácido acético 0,5 M se le añaden
100 ml de NaOH 0,1 M. pKa ácido acético = 4,75
Resp.: 3,8
14. Los tampones Tris/HCl se pueden obtener agregando HCl a una solución de Tris.
Tris = Tris (hidroximetil)aminometano Fórmula estructural: (CH3OH)3 CNH2 PM: 121,1 Acido
+
conjugado: Tris H , pKa = 8,1. Calcule la cantidad en gramos de Tris y el volúmen de HCl 1 M
que se requiere para preparar 1 l de un buffer Tris/HCl 0,2 M, pH 7,5
Resp.: 24,2 g; 160 ml
15. Una solución amortiguadora contiene ácido acético 0,1 M y acetato de sodio 0,1 M. Calcular el
pH después de la adición de 10 ml de HCl 0,1 N a 90 ml del amortiguador.
Resp.: 4,65
16. Describir la preparación de 2 litros de tampón fosfato 0,15 M, pH 6,9 partiendo de:
a) solución 2 M de H3PO4 y solución 1 M de KOH
b) soluciones 1 M de KH2PO4 y Na2HPO4
c) KH2PO4 sólido y K2HPO4 sólido
Resp.: a) 150 ml H3PO4 2 M
b) 200 ml KH2PO4
c) 27,2 g KH2PO4
400 ml KOH 1 M
100 ml Na2HPO4
17,4 g K2HPO4
+
+
+
17. La piridina es una base orgánica que reacciona con los H para formar Pyr-H Para Pyr-H :
pKa = 5,36. Se desea preparar un tampón de piridina/HCl de pH 5,5 titulando 50 ml de piridina
0,1 M con HCl 0,1 M.
¿Cuánto HCl se gastará? ¿Cuál será la concentración del tampón?
Resp.: 21 ml; 0,070 M
OBSERVACION:
Grado de ionización de un ácido es la fracción de la concentración total
que se encuentra disociada, se suele expresar como porcentaje.
Laboratorio 2: Parte Experimental. Determinación del pH y preparación de soluciones amortiguadoras y diluciones Objetivo: Aprender el uso correcto del pH metro y preparar soluciones con diferentes valores de
pH.
Materiales y métodos Materiales Potenciómetro, pipetas Pasteur, matraz aforado 100 ml, vasos precipitados de 250 ml, piseta con
agua, agitador magnético, espátula. Muestras para determinar pH: leche, jugo, bebidas, etc.
Reactivos Solución estándar pH 4, pH 7; Solución de NaOH 10M, HCl concentrado, ácido acético, acetato de
sodio, EDTA
Métodos Uso del pH metro y medición del pH 1.- El electrodo del pHmetro siempre debe estar sumergido en una solución de KCl o agua
destilada. Enjuagar el electrodo con agua destilada y secar.
2.- Ajustar el pHmetro primero a pH 7, después a 4 con soluciones reguladoras comerciales.
3.- Entre cada pH enjuagar con agua destilada.
4.- Determinar el pH de varias muestras como leche, jugos, refrescos, etc,
Preparación de diferentes soluciones 1.-­‐ Preparar 100 mL de una solución amortiguadora de acetato de sodio 50 mM, pH 5.
Para realizar esto, primero debe calcular cuántos gramos de acetato de sodio se necesitan,
disolverlos en menos de 100 ml de agua destilada (por ejemplo 70mL) y ajustar el pH a 5 con ácido
acético. Usar la formula M= (n/V) = (m PM)/V (M= molaridad, m=masa en gr, P.M.= peso molecular
y V= volumen en litros) para hacerlos cálculos.
2.- Preparar 100 ml de EDTA 0,5 M pH 8 Calcular cuántos gramos de EDTA necesitas, poner en 60 ml, comenzar a disolver con agitador
magnético y tratar de ajustar el pH cercano a 8 (el EDTA comenzará a disolverse) y adicionar poco
a poco más agua. Ajustar a pH 8 y aforar a 100 ml.
Preparación de diluciones 1.- A partir de la solución 2, prepare una dilución. Prepare 100 ml de una solución de EDTA
0,1 M.
Calcular cuántos ml de la solución 2 se van a necesitar. Medirlos con una pipeta y trasvasar a un
matraz aforado de 100 ml. Aforar con agua destilada a 100 ml.
Cálculos aquí: Cuestionario 1. ¿Por qué el pH del potenciómetro se ajusta primero a pH 7 y no a 4 o 10?
2. ¿Por qué el electrodo se debe mantener en una solución de KCl saturado? En caso de no
contar en el laboratorio con KCl, ¿Que otros compuestos pueden usarse?
3. Si quisiera preparar un buffer fosfato de potasio pH 11, ¿qué sales seleccionaría?
4. ¿El buffer de acetato de sodio que se preparó está a un pH que se puede considerar
adecuado para servir como solución amortiguadora? .Explique su respuesta.
5. En la preparación del acetato de sodio, cual es el ácido y cual la base conjugada.
Bibliografía 1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth
edition. Cambridge University Press.
2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice. 1st edition.
Waveland Press, Inc. USA.
3. Douglas A. Skoog and Donald M. West.1971.Principles of Instrumental Analysis. Holt, Rinehart
and Winston, Inc.
4. Rodney F. Boyer.1986. Modern Experimental Biochemistry. The Benjamin/Cummings Publishing
Company, Inc.
5. Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory Manual.
Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press
Laboratorio 3 y 4 : Espectrofotometría: Absorciometria
Montaje de una Técnica Fotocolorimetrica
PRINCIPIOS DE ABSORCIOMETRIA DE UV/VISIBLE
La absorciometría aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber radiación
electromagnética. Los diferentes tipos de radiación electromagnética, como ser rayos X, luz
ultravioleta (UV), luz visible, luz infrarroja, ondas de radio, etc., se propagan a velocidad común
pero difieren en longitud de onda y frecuencia. Se cumple que:
c=λxυ
c = velocidad de la luz en el vacío
λ = longitud de onda
υ = frecuencia
El ojo humano detecta la radiación del rango de longitudes de onda de 400 a 800 nm,
-9
llamada luz visible (1 nm = 10 m). La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm)
posee la energía necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de
menor energía a otro de mayor energía de ciertos compuestos, llamados cromóforos. Las
sustancias coloreadas absorben luz visible, su color corresponde a la radiación no absorbida. La
luz solar es blanca, ya que contiene radiación de todo el espectro visible, aparte de otras
radiaciones.
LEY DE LAMBERT-BEER
La ley de Beer-Lambert (o Lambert-Beer) es la ley fundamental de la absorciometría, ya
que relaciona la absorción de la luz con la concentración de soluciones. Consideremos un haz de
luz monocromática (luz de una sola longitud de onda) que atraviesa una solución de un compuesto
contenido en un recipiente de vidrio. El siguiente esquema ilustra la situación:
cubeta
solución
de
concentración c
I0
I
luz incidente
luz transmitida
l
Io
I
l
c
= intensidad del haz incidente
= intensidad del haz transmitido
= camino óptico (ancho interior de la cubeta medido en cm).
= concentración
Si el compuesto absorbe a la longitud de onda dada, I es menor que Io. Cuanto mayor es el
número de moléculas de este cromóforo encontradas por el haz de luz en su camino, menor será la
intensidad de la luz transmitida. Dicho número de moléculas depende de la distancia recorrida a
través de la solución (camino óptico) y de la concentración. La relación entre estos parámetros está
dada por la ley de Lambert-Beer:
I = Io x 10
- ε lc
(1)
La forma de esta ley usada en la práctica es más sencilla y se obtiene de la siguiente
manera: Reordenando y aplicando logaritmos:
log I = - ε l c
Io
Se define como absorbancia (A) de una solución:
Luego:
A = log Io
----I
A=ε•l•c
(2)
(3)
ley de Beer-Lambert (forma lineal)
Por convención se usa el siguiente sistema de unidades:
l = camino óptico en cm
c = concentración en M
ε = coeficiente de extinción molar, en cm-1 x M-1
Sinónimos de absorbancia: densidad óptica, extinción.
El coeficiente de extinción molar: es una característica propia del cromóforo a una longitud
de onda dada y representa la probabilidad de que el cromóforo absorba la radiación. Para explicar
el significado se suele señalar que ε es igual al valor numérico de la absorbancia que tendría una
solución 1 M del cromóforo si el camino óptico es igual a 1 cm. Es importante recalcar el carácter
hipotético de esta afirmación, ya que normalmente no es posible preparar soluciones de
concentración 1 M de los cromóforos (si el PM es alto, 1 M es una concentración extremadamente
alta), y por otra parte el órden de magnitud de los coeficientes de extinción molar importantes
corresponde a valores muy superiores al intervalo de absorbancias medibles en la práctica. Los
-1
-1
coeficientes de extinción pueden tomar valores hasta 100.000 cm M , aproximadamente.
Para compuestos de peso molecular desconocido se usa en vez del coeficiente de
extinción molar la absorbancia de una solución de concentración estándar expresada en % P/V,
0,1%
medida en una cubeta de camino óptico dado como referencia. Ejm.: para proteínas se usa A
(l
= 1 cm), y para proteínas típicas a 280 nm tiene valores cercanos a 1.
Por otra parte, se define como transmitancia (T) de una solución:
T=I
(4)
Io
Es decir, la transmitancia es la fracción de la intensidad incidente transmitida por la
solución. T se puede expresar como porcentaje (%T).
%T = I x 100
Io
Aplicando logaritmos a (4) y reemplazando con (2) se obtiene:
A = - log T
(5)
Ejm: Si %T = 50, entonces T = 0,50 y A = 0,301
La ley de Lambert-Beer indica que para un cromóforo a una longitud de onda dada la
absorbancia aumenta en forma lineal con la concentración (con l = cte), mientras que la
transmitancia disminuye en forma exponencial. (Fig. 1 y 2).
A
A=εlc
T
T = 10
-ε l c
pendiente = ε x l
c
c
Fig. 1
Fig. 2
El gráfico de la absorbancia de un cromóforo en solución en función de la longitud de onda
se denomina espectro de absorción. Un espectro de absorción se obtiene variando la longitud de
onda para l y c constantes, y por lo tanto representa la variación de A con la longitud de onda
(según (3)).
A continuación se muestra como ejemplo el espectro de absorción de riboflavina (en
fosfato de sodio, a pH 7,0).
A
260
longitud de onda (λ)
340
420
500 nm
El espectro de absorción de UV/visible es característico para un cromóforo determinado,
por lo tanto se puede usar para su identificación. Las características espectroscópicas se pueden
resumir, indicando la posición de los máximos de las bandas de absorción (λ máx) con los
correspondientes coeficientes de extinción. Por ejemplo, para riboflavina a pH 7,0:
λ máx (nm)
266
373
445
-1
-1
ε (M cm )
31.800
10.400
12.500
La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su única banda en la región del visible a
445 nm, corresponde a absorción de luz azul.
CALCULOS EN ABSORCIOMETRIA
De la ley de Lambert-Beer se puede deducir:
a) Para diluciones, si la absorbancia se mide a una misma longitud de onda, en la misma cubeta:
A1
A2
b)
V2
V1
En un espectro:
A1
A2
ε1
ε2
La aditividad de la absorbancia:
La absorbancia de una solución a cierta longitud de onda es igual a la suma de las
absorbancias de todos los cromóforos que contiene.
AT = A1 + A2 + A3 + ...
INSTRUMENTOS DE MEDIDA
Los componentes básicos de todos los instrumentos que se usan en absorciometría de
UV/visible son:
- Fuente de luz
- Dispositivo que permite seleccionar la longitud de onda
- Compartimento de muestra
- Detector
- Dispositivo que permite la lectura directamente o inscriptor
Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos:
a)
Fotómetros de filtro: La selección de la longitud de onda se realiza mediante filtros
intercambiables.
b)
Espectrofotómetros: Poseen un monocromador, son más sofisticados que los fotómetros de
filtro.
Por otra parte se distinguen instrumentos que operan en el rango visible solamente y otros
que abarcan el UV y el visible (tienen 2 fuentes de luz). Además existen instrumentos de 1
solo haz y de doble haz.
El siguiente esquema muestra el trayecto de la luz en un espectrofotómetro que opera con
luz visible:
I0
lámpara de
Tungsteno
Monocromador
I
0.532
Cubeta en
portacubetas
Fototubo
Pantalla
de lectura
1. FUENTE DE LUZ:
No existe una fuente de luz que proporcione radiación de todo el rango espectral UV/visible de
suficiente intensidad, por consiguiente se usan fuentes diferentes: Fuente de luz visible: lámpara de
tungsteno. Sirve para 340-850 nm aproximadamente. Fuente de luz UV: lámparas de H2 o D2.
Sirven para 200-375 nm aproximadamente.
2. SELECCION DE LA LONGITUD DE ONDA:
2.1. Filtros
No proporcionan luz realmente monocromática sino que permiten el paso de un cierto rango
de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda de máxima transmitancia del filtro.
2.2. Monocromadores
Poseen un elemento dispersor, que puede ser un prisma o una red de difracción. El elemento
dispersor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un sistema de espejos permite
dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada hacia la ranura de salida:
493 nm
492 nm
491 nm
490 nm
489 nm
488 nm
487 nm
486 nm
ranura
491 nm
490 nm
489 nm
luz monocromática
Monocromador
Al cerrar más la ranura aumentará la monocromaticidad de la luz, pero siempre pasará un
cierto rango de longitudes de onda. La monocromaticidad de esta luz se mide a través del "ancho
de banda" del espectrofotómetro (típicamente es de 1 a 10 nm). En la práctica se considera que un
espectrofotómetro opera con luz prácticamente monocromática.
Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua, condición
necesaria para obtener espectros de absorción. Con un fotómetro de filtro no es posible obtener
espectros de absorción.
3. COMPARTIMENTO DE MUESTRAS:
Allí se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra y de referencia. Las cubetas
son de vidrio o plástico (para el visible) o cuarzo (para el UV).
4. DETECTOR:
Los detectores son de tipo fotoeléctrico: al incidir luz producen corriente eléctrica, de
intensidad proporcional a la intensidad de la luz. Los detectores más usuales son los fototubos y
los tubos fotomultiplicadores o fotomultiplicadores.
5. LECTURA O REGISTRO:
La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia. Si el
instrumento informa la transmitancia se calcula A usando la ecuación (5). La absorbancia
normalmente se mide con 3 cifras después de la coma. El rango fotométrico de los
espectrofotómetros normalmente es desde A = 0,000 hasta A = 2,000 ó 3,000, dependiendo del
modelo.
APLICACION DE LA ABSORCIOMETRIA EN EL ANALISIS CUANTITATIVO
1. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE UN CROMOFORO PURO
Midiendo la absorbancia de la solución problema en un espectrofotómetro y conociendo el
correspondiente coeficiente de extinción molar se puede calcular la concentración. Normalmente se
usa la longitud de onda del máximo de una banda, cuyo valor se encuentra en la literatura.
Un método alternativo es construir una curva de calibración de A en función de c, que será
una recta si se cumple la ley de Lambert-Beer (ver fig.1). Interpolando en la recta con la
absorbancia de la solución problema se puede determinar su concentración. Una ventaja del
método con curva de calibración es que permite usar también un fotómetro de filtro. La pendiente
de la curva de calibración se ha llamado factor de calibración, k. Luego:
A=k•c
(6)
Si se ha usado un espectrofotómetro de buena calidad: k = ε x 1 Si el número de muestras es
alto, será más práctico determinar k, desde el gráfico y usar la ecuación (6) que interpolar.
2. DETERMINACIONES A TRAVES DE UNA ENSAYO O "TEST"
Muchos compuestos que no pueden ser determinados directamente (midiendo su propia
absorbancia), se pueden determinar por absorciometría usando un ensayo o "test". En el ensayo
se agrega uno o varios reactivos cromogénicos que interaccionan o reaccionan específicamente
con el compuesto a determinar, generándose un compuesto o complejo que absorbe. Normalmente
en los test se genera un color (absorbancia de luz visible), por lo que se denominan ensayos
colorimétricos.
Casos en los cuales se realiza un test:
1.
El compuesto no absorbe en todo el UV/visible:
Ejemplo: Determinaciones de azúcares, determinación de fosfato.
2.
El compuesto absorbe en una región espectral (generalmente UV), pero no se puede efectuar
la determinación directa porque la muestra o "solución problema" es una mezcla que contiene
otros compuestos que absorben en la misma región que el compuesto a determinar o/y la
absorbancia es demasiado baja
Ejemplo: Determinación de proteínas. En este caso además es indispensable un test, si se
analiza una muestra con varias proteínas, de coeficientes de extinción desconocidos.
El test se realiza en paralelo con la muestra problema, con una o varias soluciones del
compuesto a determinar, de concentración conocida (soluciones patrón o estándar) y con el
solvente (blanco del test). Posteriormente se miden las absorbancias "contra" el blanco, es decir,
en instrumentos de 1 solo haz, se calibra A = 0 con el blanco en el haz.
Alternativamente se pueden medir contra agua, y restar la absorbancia del blanco de todas las
absorbancias. Esta A será proporcional a la concentración del compuesto que se va a determinar
dentro de cierto rango de concentraciones, específico para cada test. Si se usó solamente una
solución, se calcula la concentración por proporción directa:
C (problema) = A (problema)
C (estándar)
A (estándar)
Si se usaron varias soluciones estándar se construye la curva de calibración del test. Para
determinar la concentración del compuesto en la muestra problema se puede interpolar en la recta
o usar el factor de calibración, como se explicó anteriormente. Es necesario destacar que para un
test k no es igual a un producto ε x 1.
Al usar un test, debe tomar en cuenta la posible presencia en la muestra de compuestos
que interfieran con el test, señalados normalmente en la literatura, junto al método.
BIBLIOGRAFIA (Espectrofotometría)
1.
2.
3.
4.
H.Willard, L.Merrit, J.Dean "Instrumental Methods of Analysis".
G.Ewing "Instrumental Methods of Chemical Analysis".
D. Freifelder, "Physical Biochemisty".
S.B.Brown, Ed. "An Introduction to Spectroscopy for Biochemists".
Parte Experimental:
En el presente práctico se estudiará la validez de la ley de Lambert Beer para soluciones acuosas
de permanganato de potasio. Este compuesto presenta en el espectro visible una banda de
-1
-1
absorción ancha, provista de hombros, cuyo máximo está a 525nm (ε = 2.500M cm ).
Para la determinación fotocolorimétrica de sustancias que no absorben en la región del visible, se
usa una reacción específica que lleva a la formación de un producto (o productos) coloreado. En
estos casos es indispensable construir una curva de calibración para la determinación. Ejemplos
típicos son las determinaciones de proteínas (método de Biuret, Método de Bradford, etc).
Materiales:
Solución de permanganato de potasio 0.1M
Matraces aforados de 100 y 10 ml
Vasos precipitados 50 ml
Pipetas.
Procedimiento:
1.- Prepare 100ml de una solución de KMnO4 que tenga absorbancia cercana a 1 a 525 nm. No es
necesario efectuar una dilución rigurosamente cuantitativa. Esta solución se usará como muestra
problema
2.- Trace el espectro de absorción de la solución problema en el rango espectral 400-600 nm
Efectuar las lecturas a intervalos de 10, 5, 2 o 1 nm, determinando la posición de los máximos con
mayor exactitud posible. Grafique los valores en papel milimetrado.
3.- Prepare 7 soluciones estándar cuya absorbancia en el máximo cubra en el rango entre 0 y 1.4
Utilice para ello una solución prediluida de permanganato 1mM. Mida la absorbancia de las
soluciones en el máximo y a dos longitudes de onda situados en los flancos.
En forma previa al práctico:
Efectúe los cálculos necesarios para 1 y 3 y prepare una tabla de la siguiente forma:
Tabla 1
Solución
ml KMnO4
1mM
Nº
1
2
3
4
5
6
7
Contenido del informe adicional:
Concentración
A (medida)
525nm
___nm
_____nm
Espectro de absorción del KMnO4
• Cálculo de la concentración de la solución problema
• Tabla Nº 1
• Curvas de calibración: Gráfico de A en función de C para cada longitud de onda ( en el
mismo gráfico)
• Determinación de la concentración de la solución problema usando la curva de calibración
más adecuada.
Laboratorio 5y 6: Reconocimiento de Hidratos de Carbono
“Métodos cualitativos para la identificación de carbohidratos” (Monosacáridos, Disacáridos y
Polisacáridos)
1. Objetivos: Identificar por métodos colorimétricos cualitativos los principales monosacáridos,
disacáridos y polisacáridos.
2. Introducción
Los carbohidratos están distribuidos ampliamente en vegetales y animales en los cuales tiene
participación estructural, funcional y metabólica. Los carbohidratos se clasifican dependiendo del
número de átomos de carbono que posee y la función aldehídica o cetonia, estas a su vez le
confiere la base para la mayoría de las reacciones usadas para su identificación y cuantificación.
Cuando el carbohidrato está formado por una sola molécula de carbohidrato, se denomina
monosacárido, por dos, disacárido y por más de dos, polisacárido.
Los disacáridos son azucares formados por la unión de dos monosacáridos mediante el enlace
glucosídico. Si este enlace se efectúa entre dos carbonos anoméricos, el disacárido no tendrá el
potencial aldehído o cetona libre, por lo tanto no dan positivas aquellas pruebas que involucren la
participación de estos grupos, recibiendo el nombre de azúcar no reductor, la sacarosa y la
trealosa son ejemplos de los disacáridos no reductores (ver anexos). Todos los disacáridos que
posean un carbono anomérico libre, darán positivas estas reacciones, llamándose azucares
reductores, debido a que promueven la reducción del reactivo usado y ellos mismos se oxidan.
Aunque la mayoría de los disacáridos carecen de importancia para el hombre, con algunas
excepciones como la sacarosa, su estudio se debe a que disacáridos como la maltosa y la
celubiosa, se originan como producto de la hidrólisis de polisacáridos, la maltosa, por ejemplo, es
el producto de la hidrólisis del glucógeno y el almidón. Los polisacáridos, si son abundantes y
representan para el hombre la principal fuente de energía metabólica de fácil aprovechamiento, el
almidón, constituido por solo moléculas de glucosa es sin lugar a dudas la base alimenticia del
globo terrestre, especialmente en la población de bajos recursos.
En el anexo, se muestran las estructuras de los principales mono, di y polisacáridos.
3. Material y Metódos
A.- Prueba de Molish
Es una reacción general para carbohidratos que contienen más de 5 átomos de carbono, la
reacción se muestra en la siguiente figura:
Fig. 1: Reacción de Molish
B.- Prueba de Barfoed:
Es una reacción para identificar monosacáridos, aunque algunos disacáridos (los reductores) dan
positiva la reacción, pero con mas tiempo de calentamiento, ya que así se hidroliza el disacárido. El
fundamento radica en la reducción del acetato cúprico a oxido cuproso.
C.- Prueba de Bial o de Orcinol-HCl
Es una prueba específica para pentosas la cual se muestra en la figura 2. La positividad se
reconoce por la formación de una coloración verde botella brillante.
Fig. 2: Reacción de Bial
D.- Prueba de Seliwanoff:
Es específica para cetosas que contengan 5 o más átomos de carbono, pero se usa casi
exclusivamente para identificar fructosa. La reacción se presenta en la figura 3.
Fig. 3: Reacción de Seliwanoff
E.- Prueba de Lugol:
Es una prueba que se usa para identificar almidón. El color azul, se debe, posiblemente a la
formación de un complejo: Ioduro de almidón.
G.- Prueba de Benedict:
Es una prueba específica para las sustancias reductoras con grupos carbonilos libres.
Fig. 4 Reacción de la prueba de Benedict cualitativo
H.- Prueba Fenilhidrazina
Es una prueba para distinguir asas (y oligosacáridos). Los carbohidratos que solo se diferencian en
sus átomos de carbono 1 y/o 2 darán la misma osazona, como es el caso de la glucosa y la
fructosa, que son isomeros de función. La figura 5 muestra la reacción.
Fig. 5 Reacción de la prueba de Fenilhidrazina
Procedimiento: Materiales Tubos de ensayo, mechero, pinzas de madera
Prueba
de Molish
de Barfoed
de Bial
de Seliwanoff
de Lugol
de Benedict
Fenilhidrazina
Procedimiento: En un tubo de ensayo colocar:
Sustancia problema
Reactivo de molish:
MEZCLAR
Agregar H2SO4 concentrado
Dejar caer lentamente por las paredes del tubo el ácido. La
aparición de un anillo violeta-rojizo en el sitio de contacto de los
dos líquidos indica que la muestra contiene carbohidratos.
Sustancia problema
Reactivo de Barfoed:
Mezclar y calentar en baño de agua hirviente, contando los minutos
y sacra del baño cada tubo inmediatamente después que haya
aparecido el precipitado rojo ladrillo de Cu2O. Anotar el tiempo que
corresponda a cada carbohidrato.
La aparición de un precipitado rojo antes de los 6 minutos indica la
presencia de un monosacárido. La aparición de un escaso
precipitado rojo, entre los 9 y 12 minutos indica la presencia de
LACTOSA o MALTOSA.
Sustancia problema
Reactivo de Bial:
MEZCLAR
Llevar a baño maría hirviente durante 3 minutos. La aparición de un
color verde botella, brillante y totalmente transparente indica la
presencia de una PENTOSA. Algunos azucares dan con el Bial una
coloración verde, pero ésta es opaca.
Sustancia problema
Reactivo de Seliwanoff:
Llevar a baño maría hirviente durante 10 minutos. La formación de
un color rojo cereza indica la presencia de FRUCTOSA.
Sustancia problema
Reactivo de Lugol:
Mezclar y observar. La aparición de una coloración azul indica la
presencia del ALMIDON y una coloración roja indica el
GLUCOGENO o Eritrodextrina. Si el color no cambia, el
carbohidrato es un monosacárido o un disacárido.
Sustancia problema
Reactivo de Benedict cualitativo:
MEZCLAR
Llevar a baño maría hirviente por 5 minutos. La aparición de un
precipitado verde, amarillo o rojo indica la presencia de un
AZUCAR REDUCTOR.
Sustancia problema
Reactivo de Fenilhidrazina:
MEZCLAR BIEN
Coloque los tubos en agua de baño María hirviendo durante 10
minutos. Al final del periodo de calentamiento, enfríe los tubos en
chorro de agua.
DEJAR EN REPOSO POR 5 MINUTOS
Examinar al microscopio la forma característica de los cristales de
osazona colocando con mucho cuidado una gota en el portaobjeto.
Cubrir con la laminilla cubreobjeto evitando dañar los cristales con
movimientos bruscos o exceso de muestra.
Volumen
1 ml
2 gotas
0.50 ml
1 ml
2.5 ml
1 ml
1.5 ml
1 ml
2 ml
2 ml
1 gota
0.5 ml
2 ml
2 ml
5 ml
Marcha analítica para monosacáridos, disacáridos y polisacáridos
INFORME RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS
1. Complete el siguiente cuadro con la información deseada. En la casilla “Nº Muestra”, coloque el
numero de cada tubo de las muestras problemas que se le entrego. Use los signos (+) o (-), para
reportar la positividad o negatividad de la reacción. Sobre la base de los resultados de sus
pruebas, Ud. puede identificar la muestra problema.
N° Muestra
1
2
Molish
Barfoed
Bial
Seliwanoff
Lugol
Benedict
ANEXO
1.- REPRESENTACIÓN DE FISCHER DE MONOSACÁRIDOS
Representación de Fischer de los monosacáridos más frecuentes en la naturaleza:
2.- REPRESENTACIÓN DE HAWORTH
Representación en estructuras de Haworth:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
3.- DISACÁRIDOS MAS IMPORTANTES Y ESTRUCTURAS DEL PIRANO Y FURANO.
Disacáridos más importantes:
•
•
•
4.- ANÓMEROS DE LA GLUCOSA Y REPRESENTACIÓN EN SILLA
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Laboratorio 7
Propiedades de las proteínas
Objetivo: Observar las propiedades de las proteínas y cuantificar proteínas con un método
colorimétrico.
PROPIEDADES
Especificidad
Las propiedades de las proteínas dependen de la estructura tridimensional en el medio acuoso, es
decir, de los aminoácidos que se disponen en su superficie, que son los que constituyen el centro
activo; también de los aminoácidos que se disponen hacia el interior, ya que son los que dan
rigidez y forma a la proteína. Cada proteína tiene una conformación según su estructura primaria.
Así, un pequeño cambio en la secuencia de aminoácidos provoca cambios en la estructura
primaria, secundaria, terciaria, y por tanto pérdida de la actividad biológica.
Solubilidad
Las proteínas globulares son solubles en agua, debido a que sus radicales polares o hidrófilos se
sitúan hacia el exterior, formando puentes de hidrógeno con el agua, constituyendo una capa de
solvatación. Esta solubilidad varía dependiendo del tamaño, de la forma, de la disposición de los
radicales y del pH.
Desnaturalización
Pérdida de la estructura tridimensional o conformación, y por tanto también de la actividad
biológica. Se produce al variar la temperatura, presión, pH, electronegatividad, etc. Esto provoca la
rotura de los puentes de hidrógeno que mantienen las estructuras secundaria y terciaria, y las
proteínas se convierten en fibras insolubles en agua. Si las condiciones son suaves, el proceso es
reversible, y si el cambio es más drástico, es irreversible.
Material y Métodos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Tubos de ensayo
Pipetas grad. 5 ml
Mecheros
Baño María
Acido acético
Ac. Nítrico conc.
Solución de NaOH 40%
Solución de NaOH 20%
Solución de sulfato cúprico 1%
Solución de acetato de plomo 5%
Albúmina de bovino
Clara de huevo
I. Coagulación de proteínas: Las proteínas, debido al gran tamaño de sus moléculas, forman con el
agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con formación de coágulos al ser
calentadas a temperaturas superiores a los 70° C o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos,
alcohol, etc.
La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su denaturación por los
agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan por la destrucción de su
estructura terciaria y cuaternaria.
Procedimiento:
1.- colocar en un tubo de ensayo algo de clara de huevo ( 3ml aprox.)
2.- añadir 3 ml de acido acético y calentar el tubo a la llama del mechero o en baño maría.
II. Reacciones coloreadas
a) Reacción xantoproteíca: Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color
amarillo, cuando las proteínas son tratadas con acido nítrico concentrado. La prueba da resultado
positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente
en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color
anaranjado oscuro.
Procedimiento
1.- poner en el tubo de ensayo 3 ml de solución de albúmina de bovino
2.- Añadir 1 ml de HNO3 concentrado
3.- Calentar a 100° C en baño maría
4.- Enfriar en agua fría
5.- Añadir gota a gota solución de NaOH al 40%.
b) Reacción del Biuret: La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que
se debe a la presencia del enlace peptídico que se destruye al liberarse los aminoácidos.
Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia
compleja denominada biuret, de formula:
NH2 – CO – N – CO – NH2
Que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida, da una coloración violeta
característica.
Procedimiento
1.- Poner en un tubo de ensayo 3 ml de albúmina de bovino
2.- Añadir 2 ml de solución de NaOH al 20%
3.- A continuación, 5 gotas de solución de CuSO4 al 1%.
4.- Debe aparecer una coloración violeta-rosácea característica.
c) Reacción de los aminoácidos azufrados: Se pone de manifiesto por la formación de un
precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación mediante un
álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo,
forma el sulfuro de plomo.
Procedimiento
1.- Colocar 3 ml de albúmina de bovino en tubo de ensayo.
2.- Añadir 2 ml de NaOH al 20%
3.- Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%
4.- Calentar el tubo hasta ebullición
5.- Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo,
utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que nos sirve para identificar proteínas que tienen en
su composición aminoácidos con azufre.
Laboratorio 8
Cuantificación de Proteínas
INTRODUCCION:
Se han descrito muchos métodos diferentes para la determinación cuantitativa de
proteínas. Estos métodos difieren entre sí en sensibilidad, existencia de interferencias, exactitud y
sencillez. La selección del método adecuado se realiza considerando las características de las
muestras que se desean analizar, que pueden ser extractos de tejidos animales o vegetales,
líquidos biológicos de interés en bioquímica clínica (suero, orina), muestras obtenidas en el curso
de la purificación de una proteína, fracciones de una columna cromatográfica, muestras de una
proteína pura, etc.
En general los métodos utilizados para la determinación cuantitativa de proteínas consisten
en la determinación absorciométrica directa o en ensayos de tipo colorimétrico, turbidimétrico o
fluorométrico.
Absorciometría de proteínas
La mayoría de las proteínas presentan un máximo de absorbancia a 280 nm
aproximadamente, debido principalmente a la presencia de residuos de triptófano y tirosina, y en
menor proporción fenilalanina. Los residuos de histidina, cisteína y cistina también presentan
bandas de absorbancia en el ultravioleta cercano, pero se encuentran a menores longitudes de
onda y son de menor intensidad. La posición exacta del máximo de absorbancia, así como el
coeficiente de extinción molar de una proteína depende de su composición aminoacídica. Por
consiguiente, solamente para soluciones de una proteína pura, conocida, cuyo coeficiente de
extinción se ha determinado previamente, se puede calcular la concentración a partir de su
absorbancia.
Se han efectuado estimaciones de la concentración total de proteínas en mezcla a partir de
la absorbancia a 280 nm (A 280) o usando la razón A 280/A 260 (método de Warburg), que permite
corregir el error debido a la contaminación por ácidos nucleicos los cuales presentan un máximo
de absorbancia a 260 nm. Las proteínas también absorben fuertemente a longitudes de onda
menores a 240 nm, debido principalmente a la contribución de los residuos de aminoácidos
aromáticos, así como de los enlaces peptídicos (bajo los 220 nm). La literatura describe métodos
para efectuar estimaciones de concentración utilizando la absorbancia en esta región. Sin
embargo, todas estas estimaciones pueden llevar a un error considerable debido a la presencia de
contaminantes o a una composición aminoacídica atípica.
Ensayos colorimétricos
Los ensayos más usados son los de Biuret, de Bradford, de Lowry y el ensayo usando
ácido bicinconínico. El ensayo de Biuret se utilizará en el presente práctico. El ensayo de Lowry es
de sensibilidad algo menor al de Bradford (0,025 - 0,5 mg/ml), es más confiable, pero es más
complicado.
Cuantificacion de proteínas por el método de Biuret
El reactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino), reacciona con compuestos que
contienen dos o más enlaces peptídicos dando una coloración violeta. El color desarrollado se
++
debe a un complejo de coordinación entre el Cu y cuatro átomos de nitrógeno que provienen de
dos cadenas peptídicas. El método de Biuret sirve para la determinación de concentraciones entre
1 y 10 mg/ml.
Los dipéptidos y los aminoácidos (excepto serina y treonina) no dan esta reacción.
Interferencias: Péptidos, Tris, sacarosa y pigmentos biliares también generan el color, sales de
amonio y sacarosa afectan el color.
PARTE EXPERIMENTAL
1.
ENSAYO DE BIURET
MATERIALES
Reactivo de Biuret: Preparación:
Colocar 1.5 g de sulfato de cobre (CuSO4 X 5 H2O) y 6 g de tartrato de sodio y potasio (NaKC4H4O6
x 4 H2O) en un vaso de 1000 ml. Agregar alrededor de 500 ml de agua destilada y agitar hasta
disolución. Agregar lentamente y agitando constantemente, 300 ml de hidróxido de sodio 2.5 N.
Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. Agregar 1.0 g de ioduro de potasio y
agitar hasta que esté totalmente disuelto. Diluir a 1000 ml y guardar en frasco de polietileno. Este
reactivo es estable indefinidamente. (Se entregará preparado).
-
Espectrofotómetro.
-
Solución patrón de albúmina 10 mg/ml
PROCEDIMIENTO
CURVA DE CALIBRACION
Atención: realice el ensayo de la muestra en forma paralela a la curva de calibración.
Disponga de seis tubos y coloque en ellos volúmenes de solución estándar que contengan 2;
4; 6; 8 y 10 mg de albúmina. El sexto tubo úselo como blanco, coloque 1 ml de agua destilada
en vez de albúmina.
Complete a 1 ml con agua destilada (De esta forma Ud. ha preparado soluciones de albúmina
de la concentración correspondiente al rango del test).
Agregue 4 ml del reactivo de Biuret
Deje desarrollar color durante 30', luego mida A a 540 nm contra el blanco. (En forma previa
la práctico, prepare una tabla que indique para cada tubo: volumen de agua, volumen de
solución estándar, mg/ml (proteínas), A.
DETERMINACION DE PROTEINAS EN UNA MUESTRA
-
En un tubo coloque 1 ml de la muestra a determinar. Si es necesario, use la muestra
prediluída.
Agregue 4 ml del reactivo de Biuret.
Deje desarrollar color durante 30' y mida A a 540 nm.
INFORME
Contenido (aparte de lo habitual):
Tablas de valores
Curva de calibración: gráfico de absorbancia en función de concentración.
Calculo de la concentración de la muestra, considerando prediluciones.
BIBLIOGRAFIA
$ Methods in Enzymology Vol. 3 pág. 447
$ Bradford, M.M., Analytical Biochemistry 72, 248 - 254 (1976).
Laboratorio 9: “Reconocimiento de Enzimas” y “Efecto temperatura y pH
sobre la actividad enzimática”
1. Objetivos: Poner de manifiesto la presencia de la enzima CATALASA en tejidos animales y
vegetales. Comprobar la acción de la temperatura sobre la actividad de las enzimas y comprobar la
acción hidrolítica de la AMILASA.
Comprbar el efecto que tiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y temperatura
2. Introducción
Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica. Todas las reacciones químicas del
metabolismo celular se realizan gracias a la acción de catalizadores o enzimas. La sustancia sobre
la que actúa una enzima se denomina substrato. Pasteur descubrió que la fermentación del azúcar
mediante levaduras, con su conversión en alcohol etílico y anhídrido carbónico es catalizada por
fermentos o enzimas. En 1897 Buchner logró extraer de las células de levadura las enzimas que
catalizan la fermentación alcohólica. Sumner en 1926, aisló en forma cristalina la enzima ureasa, a
partir de extractos obtenidos de Cannavalia enzyformis (Fabaceae) la que hidroliza la urea según la
siguiente reacción:
UREASA
(NH2)2 CO + H2O
CO2 + 2 NH3
En 1930, Northrop aisló en forma cristalina las enzimas digestivas: pepsina, tripsina y
quimotripsina. En la actualidad se conocen más de 2000 enzimas que han sido aisladas en forma
cristalina.
En términos generales los catalizadores se caracterizan por las siguientes propiedades:
1º Son eficaces en pequeñas cantidades. Tienen un número de recambio alto, que varía entre 100
y 36 millones (anhidrasa carbónica). El número de recambio o actividad molar, se define como la
cantidad de substrato transformado en la unidad de tiempo por una cantidad dada de enzima, por
6
ej. la catalasa hidroliza 5,6 x 10 moléculas de H2 O2 por molécula de enzima por minuto, por lo que
6
su número de recambio es 5,6 x 10 .
2º No se alteran durante las reacciones en que participan.
3º Aceleran el proceso para la obtención del equilibrio de una reacción reversible.
4º Muestran especificidad. La acción de la enzima es extremadamente selectiva sobre un substrato
específico.
Las enzimas tienen pesos moleculares que oscilan entre 12.000 y un millón. Algunas enzimas son
proteínas conjugadas; ya que poseen un grupo no proteico o prostético, por Ej. un azúcar glucoproteínas, un lípido -lipoproteínas, un ácido nucleico -nucleoproteínas. Una enzima completa
se denomina holoenzima, y está formada por una parte proteica (apoenzima) y un cofactor no
proteico (coenzima).
HOLOENZIMA = APOENZIMA + COENZIMA
Entre los cofactores que requieren las enzimas para su funcionamiento están las coenzimas:
NADPH+H (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido), NAD (nicotinamida adenina
dinucleotido), FAD (flavina adenina dinucleótido), piridoxal, biotina, tiamina, ácido tetra hidrofólico,
cobalamina, etc. Así mismo, muchas enzimas requieren activadores metálicos, y he de allí la
importancia de los minerales para el buen funcionamiento y crecimiento de las plantas.
Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metabólicos a
velocidades compatibles con la vida, contribuyendo además a su regulación. Debido a su
naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y pH,
factores que pueden alterar la estructura molecular de la enzima, provocando su desnaturalización.
En general una reacción química aumenta su velocidad de reacción al aumentar la temperatura,
pero en el caso de las reacciones catalizadas por enzimas, este efecto se observa sólo entre 0 y
40 ºC, ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces
débiles, principalmente puentes de hidrógeno y la pérdida de su conformación nativa.
Debido también a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos ionizables, los que
derivan de los radicales de sus aminoácidos constituyentes. Las alteraciones del pH pueden
cambiar el grado de ionización de los grupos químicos involucrados en el sitio activo de la enzima,
afectando su actividad catalítica.
Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad máxima a un valor de pH
denominado pH óptimo. Por tal motivo la actividad enzimática se mide en presencia de tampones o
amortiguadores de pH.
La amilasa salival es una enzima que rompe específicamente los enlaces glicosídicos α 1-4 de los
polisacáridos. La hidrólisis del almidón por amilasa salival da como producto una mezcla de
maltosa, maltotriosa (dextrinas) y glucosa. El almidón es un polisacárido formado por 2 tipos de
cadena: amilasa (lineal), que presenta sólo enlaces α 1-4 y amilopectina (ramificada), con enlaces
α 1-4 y α 1-6 El almidón se reconoce químicamente por el color azul intenso que desarrolla en
presencia de yodo, por lo que la hidrólisis enzimática del almidón se puede determinar por la
pérdida del color azul de una mezcla de reacción.
3. MATERIAL Y METODOS
Gradilla
Pipetas
Soluciones de Fehling A y B
Trocitos de hígado y tomate
Tubos de ensayo
Agua oxigenada
Baño María
Preparación enzimática: Lavado bucal con
agua destilada, filtrado y mantenido en hielo.
Tampón fosfato 0.1 M, pH 7.0, pH 5.0, pH
6.0 y pH 8.0
solución de Cloruro de sodio 0.03 M
solución de almidón 1% p/v
Solución de Lugol
Almidón
Papel Filtro
Embudo
Soporte Universal y de embudo
1.- Reconocimiento de la Catalasa
La Catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales. La
función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma
una molécula toxica que es el peróxido de hidrogeno o agua oxigenada. (H2 O2).
La enzima descompone el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno, por lo que se soluciona el
problema.
La reacción de la Catalasa sobre el H2 O2, es la siguiente:
2 H2 O2
Catalasa
2 H2 O
+
O2
REACCION: La existencia de la catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua
oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias
patógenas son anaerobias mueren con el desprendimiento de oxigeno que se produce cuando la
catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada.
En esta primera experiencia vamos a demostrar su existencia:
1. Colocar en tubo de ensayo unos trocitos de hígado
2. Añadir 5 ml de agua oxigenada
3. Se observará un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxigeno.
Nota: Se debe repetir esta experiencia con diferentes tejidos animales y vegetales. Puede ser
interesante ir observando la mayor o menor actividad, según el tejido con el que se realice la
experiencia.
2.- Desnaturalización de la catalasa.
Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental de las proteínas, que es la
DESNATURALIZACION.
Ya que la catalasa químicamente es un proteína, podemos desnaturalizarla al someterla a altas
temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perderá también la función y como consecuencia su
función catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua oxigenada y no se observará ningún
tipo de reacción cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos.
1.
2.
3.
4.
5.
colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hígado.
Añadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos.
Después de este tiempo, retirar el agua sobrenadante.
Añadir 5 ml de agua oxigenada.
Observar el resultado.
3.- Hidrólisis del Almidón.
Mediante esta experiencia, vamos a ver la actividad de otra enzima, la AMILASA o ptialina,
presente en la saliva.
Esta enzima actúa sobre el polisacárido Almidón, hidrolizando el enlace o-glicosídico, por lo que el
almidón se terminara por transformar en unidades de glucosa.
Es importante que recuerden las reacciones características de glúcidos para comprender esta
experiencia.
Procedimiento:
1. Poner en una gradilla 4 tubos de ensayo numerados del 1 al 4.
2. Añadir a cada tubo 5 ml de una solución diluida de almidón
3. A los tubos 3 y 4 añadir una pequeña cantidad de saliva.
%
En el tubo 1 hacer reacción de Fehling.
Reacción de Fehling:
- Tomar la muestra que se quiera analizar (normalmente una cantidad de 3 ml.)
1. Añadir 1 ml. de Fehling A y 1 ml. de Fehling B. El líquido del tubo de ensayo adquirirá un
fuerte color azul.
2. Calentar el tubo al baño María o directamente en un mechero de Laboratorio.
3. La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo.
4. La reacción será negativa si la muestra queda azul, o cambia a un tono azul-verdoso.
Fundamento: Se basa en el carácter reductor de los monosacáridos y de la mayoría de los
disacáridos (excepto la sacarosa). Si el glúcido que se investiga es reductor, se oxidará dando
lugar a la reducción del sulfato de cobre (II), de color azul, a óxido de cobre (I), de color rojoanaranjado.
%
En el tubo 2 realicen la reacción de Lugol
Reacción del Lugol:
Este método se usa para identificar polisacáridos. El almidón en contacto con unas gotas de
Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico.
1. Poner en un tubo de ensayo unos 3 ml del glúcido a investigar.
2. Añadir unas gotas de Lugol.
3. Si la disolución del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta, la reacción es positiva.
Fundamento: La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se
introduce entre las espiras de la molécula de almidón. No es por tanto, una verdadera reacción
química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta
molécula, apareciendo la coloración azul violeta.
Los resultados son los esperados para un polisacárido como el almidón
Los tubos 3 y 4 contienen el almidón, al que se le ha añadido saliva. Colocar los tubos precipitados
al baño maría, controlando la temperatura del agua que no hierva, ya que lo que intentamos es que
la enzima de la saliva actué a 37 ºC. Mantener por 15 minutos.
Después de este tiempo realizar las siguientes reacciones:
•
•
En el tubo 3 realice la reacción de Fehling
En el tubo 4 realizar la prueba de Lugol
El resultado positivo obtenido en el tubo 3 nos indica que la amilasa de la saliva ha hidrolizado el
almidón transformándolo en glucosa, por eso la reacción de de Fehling es ahora positiva.
De forma similar, se puede interpretar el resultado del tubo 4, ahora nos da la reacción de
polisacáridos negativa, ya que el almidón se ha hidrolizado.
PROCEDIMIENTO pH y temperatura
A.- Efecto de la Temperatura sobre la hidrólisis enzimática del almidón.
Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de la preparación enzimática, 1 ml de la
solución de cloruro de sodio, 1 ml de la solución tampón fosfato pH 7.0 y 2 ml de solución de
almidón. Mezcle suavemente sin agitar e incube durante 15 minutos en las siguientes condiciones:
tubo 1 a 0ºC (sobre hielo), el tubo 2 a 37ºC en un baño termorregulado, el tubo 3 a 100ºC (baño
maría) y el tubo 4 a temperatura ambiente. Incluya un quinto tubo sin cloruro de sodio en la mezcla
de Reacción a temperatura ambiente. Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol, mezcle y
observe. Anote y discuta sus resultados.
Tubo
Solución
Almidón
Tampón
fosfato pH 7.0
Sol. cloruro de
sodio
Preparación
enzimática
Temperatura
incubación
Lugol
(gotas)
1
2
3
4
5
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1ml
-
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
0ºC
37ºC
100ºC
TA
TA
1
1
1
1
1
B.- Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival.
Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de preparación enzimática, 1 ml de solución
de cloruro de sodio y 2 ml de solución de almidón. Posteriormente adicione 1 ml de tampón fosfato
pH 5.0 al tubo 1, 1 ml buffer pH 6.0 al tubo 2 , 1 ml buffer pH 7.0 al tubo 3 y 1 ml buffer pH 8.0 al
tubo 4. Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Al cabo de ese tiempo
agregue una gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados.
Tubo
Solución
Almidón
Tampón
fosfato
Sol. cloruro de
sodio
Preparación
enzimática
Temperatura
incubación
Lugol
(gotas)
1
2
3
4
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
1 ml pH 5.0
1 ml pH 6.0
1 ml pH 7.0
1ml pH 8.0
1 ml
1 ml
1 ml
1ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
TA
TA
TA
TA
1
1
1
1
Laboratorio 10: FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA POR LEVADURAS
(Sacharomyces cereviceae)
Fundamento:
La glucosa es un carbohidrato fermentable por las levaduras. La fermentación alcohólica es un
proceso anaeróbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias. Estos
microorganismos transforman la glucosa en alcohol etílico y dióxido de carbono. La fermentación
alcohólica, comienza después de que la glucosa entra en la célula. La glucosa se degrada hasta
ácido pirúvico, en el proceso denominado glucólisis. Este ácido pirúvico se convierte luego en CO2
y etanol. Los seres humanos han aprovechado este proceso para hacer pan, cerveza, y vino. En
estos tres productos se emplea el mismo microorganismo que es la levadura común o
Saccharomyces cerevisae.
Reactivos:
Solución de glucosa (1 g en 100 ml)
Reactivo de Benedict.
Levadura de panadero seca activa.
Procedimiento
1.- En un vaso de precipitado de 25 ml. agregar 10 ml de la solución de glucosa y añadir 0.3 g (la
punta de una espátula) de levadura. Agitar hasta que la mezcla sea homogénea. Incube a 37
grados.
Realizar la prueba de Benedict a esa mezcla a:
los 30 min.,
y a la hora y media de incubación.
2.- Para verificar que la solución de glucosa es un azúcar reductor, realice una prueba de Benedict
a la solución de glucosa.
3.- Para verificar que la levadura no contiene ningún azúcar reductor, realizar un blanco de
reacción (control) de la siguiente manera:
Mezcle 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura con 10 ml de agua destilada.
Efectúe una prueba de Benedict tomando 0.5 ml de esta solución de levadura.
Nota: La prueba de Benedict se efectúa de la siguiente manera:
1.- Pipetear 0.5 ml. de la solución problema en un tubo de ensayo
2.- Añadir 1 ml. de Reactivo de Benedict.
3.- Calentar en baño de agua hirviente durante 3 min.
Si la muestra cambió de color azul a rojo ladrillo, hay presencia de azúcares reductores.
Laboratorio 11: “Determinación de Glicemia”
1. Objetivo: Determinar la concentración de glucosa sanguínea (Glicemia) en una muestra de
Sangre.
2. Introducción:
La glucosa es el principal monosacárido del organismo y constituye un metabolito que
aporta energía vital para las funciones celulares. El catabolismo de la glucosa se realiza durante la
glicólisis. Su determinación en sangre es útil para el diagnóstico y monitoreo de trastornos en el
metabolismo de los hidratos de carbono, como la Diabetes Mellitus, hipoglicemias, tumores de los
islotes pancreáticos y otras patologías.
3. MATERIAL Y METODOS:
- Gluco tester
- Lancetas
- Tiras reactivas para determinación Glucosa en sangre
- Algodón (tórulas)
- Alcohol 70%
- Guantes desechables
Actividades :
Determinación de glicemia. Se utilizará un instrumento para la determinación enzimática de la
concentración de glucosa en una muestra de Sangre
Discuta los resultados obtenidos y realice un informe, pudiendo considerar el anexo proporcionado
a continuación:
ANEXO: METABOLISMO GLUCIDICO
La glicemia normalmente se encuentra en el rango de 70 – 110 mg/dL. Normalmente una
glicemia en ayunas superior a 126 mg/dl es francamente sospechosa de diabetes Mellitus. Pueden
encontrarse hiperglicemias severas (400 mg/dl).
r
La principal causa de hiperglicemia es la Diabetes Mellitus, una enfermedad endocrina
altamente prevalente en nuestro país, afectando a una 5% de la población. Sin embargo pueden
existir otras causas de hiperglicemia.
Otras causas de Hiperglicemia: Hipofisiarias, suprarrenales, tiroideas, infección aguda,
encefalopatía, tóxicos, infarto miocardio, pancreatitis aguda, diabetes gestacional.
Causas de Hipoglicemia: Esfuerzos musculares agotadores, hiperinsulismo,
tratamiento
insulínico, insuficiencia suprarrenal, hipotiroidismo, afecciones hepáticas, trastornos de la nutrición
y digestivos, afecciones nerviosas, alcoholismo agudo.
Cualquier alteración metabólica relacionada con la glicemia puede asociarse a la alteración de
otros analitos como: hemoglobina glicosilada, insulina, glucagón, péptido C, glucosuria
(concentración de glucosa en orina), proteinuria, albuminuria, etc.
INSULINA: Hormona producida por el páncreas que es esencial para la utilización de la glucosa
por la célula. Esta hormona se encuentra en concentraciones normales en el plasma entre 2 –5
µU/mL. En condiciones patológicas como la obesidad y en los diabéticos obesos adultos, la
insulinemia basal suele ser alta y luego de la administración de glucosa su aumento es tardío y
alcanza cifras superiores a lo normal (250 µU/mL o más). En la diabetes juvenil se observa una
disminución de insulina en ayunas, pero sobre todo una falta de respuesta de secreción de
insulina frente a la ingesta de glucosa.
PEPTIDO C: La insulina es una proteína que se secreta como una pro-hormona. En el plasma
sufre una hidrólisis que conduce a la hormona activa más un péptido denominado PÉPTIDO C, el
cual tiene una vida media biológica superior a la de la insulina. La determinación de este péptido es
útil para determinar la actividad secretora de las células beta del páncreas, aún en los enfermos
tratados con insulina es un índice indirecto de la secreción de insulina endógena residual del
paciente diabético.
Valores ayuno:
Post-prandial:
2,10 ng/mL
4,2 ng/mL
HEMOGLOBINA GLICOSILADA HbA1c: Los prolongados estados de hiperglicemia que presentan
los pacientes diabéticos, conducen a la glicación no-enzimática de las proteínas. Una proteína
susceptible a glicarse es la hemoglobina, cuya vida media es de 120 días, por lo tanto, la glicación
de la hemoglobina indica que el paciente no ha tenido un buen control de su glicemia durante los
120 días previos a la evaluación de este parámetro. En otras palabras es una forma indirecta de
evaluar la glicemia promedio de los 2 a 3 meses previos Valores referencia: 6.2% a 8.2%
PROTEINURIA: Los pacientes diabéticos suelen presentar durante el curso de su patología, la
denominada Nefropatía diabética, que es un tipo de insuficiencia renal. La proteinuria o
concentración de proteínas en la orina es un buen indicador de la función del riñón. Normalmente
la excreción de proteínas por la orina puede alcanzar unos 200 mg/24 horas o 20 mg/dL. Las
proteínas que en condiciones normales aparecen en la orina son: la proteína de Tamm-Horsfall
(40-70 mg) y la albúmina (10-20 mg). Rangos superiores a 20 mg/dl requieren exploración
adicional y cifras superiores a 250 mg/24 requieren exploración uronefrológica. . Sobre 1000-2000
mg/24 hay que sospechar de insuficiencia renal avanzada.
MICROALBUMINURIA: La microalbuminuria se define como pequeñas cantidades de albúmina
que son excretadas en la orina, por sobre los niveles considerados normales. Estos valores
pueden ocurrir entre 30 a 300 mg/24hr., cifras superiores son consideradas como
macroalbuminuria y se asocian a insuficiencia renal severa. La nefropatía en la diabetes insulino
dependiente puede ser reconocida en sus fases iniciales a través de la pesquisa de la
microalbuminuria. Además de la diabetes Mellitus, la Hipertensión Arterial es otra condición que
puede conducir a microalbuminuria.
La microalbuminuria es considerada como un marcador precoz de daño renal.
Valores normales: hasta 10 mg/L
NOTA
Emia: sufijo con el cual se denomina la concentración de un determinado analito en el suero o
plasma
Uria : sufijo con el cual se denomina la concentración de un determinado analito en la
orina.
Procedimiento:
Se entregará con anticipación el protocolo del Kit a utilizar para este procedimiento.
Laboratorio 12: “Determinación de Colesterol y TG”
1. Objetivos: Determinar colesterol en una muestra de sangre
2. Introducción:
El Perfil lipídico consta de la determinación de Colesterol Total, triglicéridos y colesterolHDL. Adicionalmente, con estos parámetros se puede calcular el colesterol de LDL.
El Colesterol es una molécula de naturaleza esteroidal con un grupo hidroxilo secundario en la
posición C3. Se sintetiza principalmente en el hígado y se absorbe aquel que proviene de la dieta.
Se estima que aproximadamente tres cuartos de colesterol se forman por neo síntesis y una cuarta
parte proviene de la dieta.
Los triglicéridos son ésteres de glicerol, un alcohol trivalente con tres ácidos grasos de cadena
larga. Una parte de ellos se ingiere por la dieta y se transporta a través de los quilomicrones
(triglicéridos exógenos). El hígado además sintetiza triglicéridos, los cuales son transportados a
través de la VLDL (triglicéridos endógenos).
El colesterol de HDL o lipoproteínas de alta densidad representa el transporte de colesterol desde
los tejidos periféricos hacia el hígado, para su posterior excreción por la vía biliar. Este proceso de
denomina, transporte reverso de colesterol, una ruta esencialmente antiaterogénica. Valores
elevados de HDL protegen contra las cardiopatías coronarias, mientras que valores disminuidos de
HDL, especialmente en combinación con triglicéridos elevados se asocian a un elevado riesgo
cardiovascular.
El colesterol de LDL o lipoproteína de baja densidad es proveniente del catabolismo de las
VLDL (lipoproteína de muy baja densidad) y constituye una fuente de aporte de colesterol para
ciertos requerimientos celulares como son: la síntesis de membranas, síntesis de hormonas
esteroidales, síntesis de ácidos biliares y síntesis de vitamina D.
La determinación del perfil lipídico sirve para el screening del riesgo aterogénico de un
determinado paciente.
3. MATERIAL Y METODOS:
- Kit Para medición de Colesterol y TG
- Muestra de Suero
- Guantes desechables
4. Procedimiento:
Se les entregará el Protocolo del Kit a utilizar con anticipación.