Estudio molecular del oncogen BCR/ABL t(9:22) en pacientes

Universidad Simón Bolívar
Decanato de Estudios de Postgrado
Coordinación de Biología
Estudio molecular del oncogen BCR/ABL t(9:22) en
pacientes venezolanos con Leucemia Mieloide Crónica.
Tesis Doctoral presentada a la Universidad Simón Bolívar por
Fanny Carreño
Como requisito parcial para optar al título de
Doctora en Ciencias Biológicas
Realizado bajo la Tutoría de:
Dr. René Utrera
Sartenejas, Enero 2008
DEDICATORIA
Siento un inmenso placer al elogiar con esta tesis
a las dos personas que engendraron en mí
la curiosidad y la pasión
por el mundo desgarrador y fascinante de
la LEUCEMIA
A mi hijo Alejandro Antonio
A mi maestro José Luís López
ii
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mis más sinceros agradecimientos al Dr. René Utrera por brindarme la
oportunidad de desarrollar este proyecto tan ambicioso, el cual, sin lugar a dudas, ha permitido nuestro
crecimiento personal y entera satisfacción al aportar un humilde granito de arena en la búsqueda de una
mejora en la calidad de vida de las personas que sufren estos tipos de aflicciones.
Al Dr. José Luís López a quien admiro y respeto infinitamente. Él es la persona que con su
paciencia, cariño, buen humor y amor por su trabajo me enseñó que cuando se cree y ama lo que se
está haciendo no importan las adversidades y el reconocimiento porque siempre te queda la
satisfacción de que estas ayudando a mejorar la vida de un enfermo.
A la Dra. Osiris Da Costa, por su invaluable ayuda en la obtención de las muestras, las
interminables revisiones y discusión de historias clínicas, su apoyo en la revisión del manuscrito y su
amistad desinteresada. Osiris mil gracias.
A la Dra. Leonor Cárdenas, por abrirme siempre las puertas de su consulta en la busca de
muestras e historias clínicas, así como todo su apoyo profesional y personal en la culminación de este
proyecto.
A las Lic. Aramilena Prado y Patricia Rodríguez quienes me brindaron todo su apoyo en la
realización de la técnica citometría de flujo y en la revisión y discusión de los resultados referentes a
este tema. Chicas, siempre les estaré en deuda.
Al Dr. Ivan Galindo, por permitirme realizar en su laboratorio la técnica de RT-PCR en
Tiempo Real y por todo su apoyo y colaboración durante los experimentos.
Al Dr. Juan Carlos Martinez, por su infinita paciencia en los interminables momentos de
consultas sobre los experimentos de RT-PCR en Tiempo Real. Mil gracias Juan.
A los Dres. Pedro Sánchez, Ana Monzón y Elsa Tovar por todas las facilidades que me dieron
durante la estandarización del panel de las translocaciones.
A mi esposo Carlos Méndez, por toda su ayuda en la realización de la estadística de este
trabajo. Carlos, sin temor a dudas, haz sido mi horizonte en la culminación de este trabajo, sin ti este
logro no hubiera sido posible. Gracias por cruzar hacia mi camino y empezar a caminar junto a mi,
gracias por tanto amor a nuestros hijos y sobre todo gracias por seguir allí con tu infinita paciencia y
sabiduría. Te amo.
A la Dra. Susana Blanco, porque en el momento más difícil de mí doctorado sólo tú me
enseñaste la puerta que conduciría a mi objetivo final. Siempre estaré cuando me necesites susi (ve susi
ve).
A la Dra. Margarita Rodríguez, por todos sus consejos oportunos y por ser esa madre que todos
los estudiantes necesitamos en los momentos más difíciles.
A la Dra. Antonieta Porco, por sus valiosos consejos en las discusiones de laboratorio y por su
apoyo moral en los momentos de duda.
Al Dr. Emilio Herrera, trabajar contigo ha sido una experiencia de vida para mí. Tú mano
amiga recogió los despojos, los pego con sonrisas, cafés y canciones, pero también con trabajo,
perseverancia y confianza en mí y en mi trabajo. Profe, muchas gracias, su confianza y cariño me
permitieron levantarme y culminar hoy este camino. Siempre te estaré en deuda.
Al Dr. Guillermo Barreto (mi coordinador), por estar siempre allí para escuchar mis dudas, mis
quejas, mis sin sabores, pero sobre todo para darme opciones de salida. Guille mil gracias.
A la Dra. Martha Bravo, por comenzar conmigo este camino y por mantenerme atada a una
silla durante las horas interminables de discusión de papers. Los caminos que iniciamos con amigos
son más llevaderos en los momentos más tortuosos, pero son esos mismos caminos los que a veces y
sin un por qué separan nuestros destinos. Espero que tu sendero esté siempre lleno de dicha y amor.
iii
A mis inolvidables amigas Noelis, María José y Yumelis, me siento muy afortunada de que ni
el tiempo, ni la distancia, ni las dificultades hayan podido agrietar las paredes de nuestra amistad.
Gracias por estar siempre allí. Las quiero.
A mis panas del asco: Pedro, Ariana, Giselle, Cristinita. Gracias por aguantar a esta Cumanesa
en todos sus momentos.
A los compañeros y profesores amigos del laboratorio de genética de poblaciones: Rosita,
Angela, Tatiana, Bladimir, Maribet, Victor, Nicida, Prof. Jazmin, Prof. Marisol. Gracias por compartir
conmigo esos momentos de trabajo extra.
A la Doctora Yajidy El Abed, por haber recorrido este camino conmigo y compartir los
interminables trasnochos y fines de semana en la Univ. Amiga, gracias por todas tus palabras de aliento
y apoyo cuando más lo necesité.
A mis amiguis de celular: Rafa (monster), Gladinex, Anita, Loly, Adriana, Jaki, deisy,
Juancito.
A mis amiguis del laboratorio: Estluz, Leomig, Andreina, Roybel, Luisa, Patricia, Pedro,
Mayela, Vanessa, Yurianny, Fifí, Carolina, María José, Orbelis.
A las super chicas de la coordinación Judiht y Marisol, quienes además de cumplir su trabajo a
cabalidad están siempre pendientes de que sus chicos estén al día y terminen lo más pronto posible su
camino académico. Gracias Judiht por guiarme siempre.
A la coordinadora Prof. Solange Issa, por todo su gran apoyo y colaboración durante la
entrega del manuscrito. Gracias profe.
A mis dos angeles guardianes: Joa y Maggi, ustedes son el mejor regalos que me dieron mis
padres. Gracias por perseverar conmigo en este camino. Las amo.
A mis padres, Antonio y Alida, quienes me enseñaron que el regalo más valioso que tenemos
para dar es la humildad. Los amo.
A mi hijo Rodrigo, regalo especial de dios que llegó en su justo momento. A dios gracias.
A la Señora Margarita Vallejo, por su paciencia y colaboración durante el escrito de este
manuscrito y por enseñarme que no importa cuanto trabajo tengas, la familia siempre esta primero.
A mis cuñis Hector, Enrique, Sandy, Norelis, por su solidaridad.
A mis amigos Nora, Oliver, Sergio, Israel, Priscila y cheo. Gracias por todo el amor y cuidado
hacia mi y mis hijos. Nora, eres una hermana más.
A mis tías, tíos y primas lindas que nunca me desampararon, Enrique, Lilia, Zuleima,
Hortensia, Marisol, Carelin, Elianny, Hayarit, Francys, Vanesa, Daniela, Osmari.
A mi hija putativa Liz, que dios te bendiga.
Al FONACIT por financiar este proyecto (código G2001000784) y por darme la beca que
permitió mi residencia en Caracas y permanencia en el postgrado.
A todos GRACIAS
iv
RESUMEN
Estudio molecular del encogen BCR/ABL en pacientes venezolanos con leucemia
mieloide crónica.
La leucemia mieloide crónica (LMC) es una patología clínica común, caracterizada por la expansión
clonal de células mieloides progenitoras. Esta es causada por la translocación recíproca y no aleatoria
t(9;22)(q34;q11), que origina el gen de fusión BCR-ABL en el cromosoma 22 (conocido como
cromosoma Filadelfia, Ph+), el cual codifica para una proteína quimérica funcionalmente activa que es
capaz de ejercer un efecto transformante en todas las células que la producen. Este trabajo reporta el
estudio molecular por RT-PCR de la translocación BCR-ABL en 297 pacientes venezolanos
diagnosticados clínicamente con LMC. Los análisis estadísticos de estos datos demuestran que dicha
translocación se presenta con una frecuencia de 67.3% (200/297), la cual no corresponde con lo
reportado en estudios previos (95%). De los 200 pacientes positivos para BCR/ABL, las variantes
estuvieron distribuidas de la siguiente manera: b2a2 (43.5%), b3a2 (39.5%), e1a2 (3.5%), mientras que
de sus co-expresiones se encontró que: b2a2/b3a2 (12.5%) y b2a2/e1a2 (1%). Los datos obtenidos de
las variantes con mayor frecuencia (b2a2 y b3a2) concuerdan con los resultados reportados en otros
países. Las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 fueron clonadas y secuenciadas, pudiéndose identificar en
algunos pacientes, el punto de fusión que identifica a cada una de ellas. En las secuencias realizadas
sobre la variante b2a2 fueron detectadas 2 mutaciones puntuales silentes: a) (T/C) en la posición 402
de 3 pacientes y b) (T/C) en la posición 434 de 1 paciente, ambas en la región abl del híbrido
BCR/ABL, mientras que las secuencias realizadas para las variantes b3a2 y e1a2, evidenciaron el
punto de fusión reportado, no detectándose mutaciones en la porción del gen abl. El cálculo de la
frecuencia para las variantes reportadas evidenció que ninguna de ellas estuvo relacionada con la edad
o el sexo, aunque se observó una mayor probabilidad de detección de la enfermedad en etapa adulta,
principalmente a partir de los 40 años. La estandarización de un panel de translocaciones asociadas con
diversos tipos de leucemia permitió la identificación de éstas en 40 pacientes que dieron negativos para
la quimera BCR/ABL, 2 fueron positivos para CBFβ/MYH11, 5 positivos para AML1/ETO, 6
positivos para E2A/PBX1, 3 positivos para SIL/TAL, 11 positivos para TEL/AML y 9
positivos para PML/RARα. Análisis por citometría de flujo permitió hacer la clasificación de 10
pacientes LMC en fase inicial (3 FC) y crisis blástica (7 CB), a estos últimos se les logró identificar su
linaje y fueron clasificados en LMCCB mieloide (4) y en LMCCB linfoide (3). El estudio de los tres
factores que pueden originar la resistencia al tratamiento con Imatinib demostró que en las tres fases de
la enfermedad la resistencia a Imatinib fue causada por un aumento en los niveles de expresión de
BCR/ABL y no por la presencia de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de esta
quimera o por un aumento en los niveles de expresión del gen Lyn, el cual ha sido abundantemente
implicado en la resistencia a Imatinib. Estos datos demuestran que BCR/ABL ejerce directamente un
efecto transformante en las células que lo expresan en pacientes con una resistencia primaria, tal como
ha sido reportado. Este trabajo confirma que la detección molecular de la LMC es la vía más rápida,
confiable y efectiva en el diagnóstico temprano de la LMC, el cual colabora con el tratamiento y
supervivencia de los pacientes que sufren esta patología. Así mismo, se demuestra la importancia de
los paneles de diagnóstico y la gran ayuda que ofrece la citometria de flujo en la clasificación de la
LMC y otras leucemias. La evolución de estos estudios, contribuirán a la obtención de un mayor
conocimiento del comportamiento de la LMC en la población venezolana y a un mejor tratamiento en
base a las diferentes terapias que hoy en día son aplicadas en nuestro país.
Palabras claves: LMC, BCR/ABL, Lyn.
v
ÍNDICE GENERAL
Introducción
Clínica de la Leucemia Mieloide Crónica (LMC)
Factores genéticos y no genéticos (ambientales) relacionados a la LMC
Citogenética de la LMC
Caracterización de los genes translocados en la LMC
Vías de señalización celular que se ven afectadas en pacientes LMC
Adhesión celular alterada
Activación constitutiva de la señalización mitogénica
Reducción de la apoptosis celular
Degradación de proteínas inhibidoras de ABL por proteosomas
Tratamiento de la LMC
Tratamiento de la LMC con Imatinib
Resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes con LMC
Sobre-expresión de la quimera BCR/ABL
Modificación en la expresión de genes por BCR/ABL
Expresión del gen Lyn
Mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera BCR/ABL
Otras modalidades de tratamiento para la LMC
Técnicas empleadas para el diagnóstico y clasificación de las leucemias
Citogenética
Citometría de flujo
Señales de dispersión
Señales de Fluorescencia
PCR en tiempo real
Justificación e importancia del tema tratado
Objetivos
General
Específicos
1
2
4
5
7
11
12
13
15
17
18
20
22
23
23
25
27
28
29
30
31
32
32
34
39
42
42
Metodología
Diagnóstico molecular de BCR/ABL
Obtención de las muestras
Extracción de ARNtotal
Obtención de células mononucleares (Gradiente de Ficoll)
Extracción de ARN total. Protocolo A
Extracción de ARN total. Protocolo B
Determinación de la concentración y calidad del ARNt
Transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa
Transcripción reversa (RT)
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Clonación de las variantes de BCR/ABL
Preparación de células competentes
Ligación
Transformación
Extracción y Purificación del ADN plasmídico (Mini-prep)
Digestión del ADN plasmídico con enzimas de restricción (endonucleasas)
Secuenciación manual y automática de los productos de BCR/ABL
vi
45
45
45
45
45
46
47
47
47
47
50
50
51
52
53
53
54
Purificación de los productos de PCR (protocolos A y B)
Secuenciación manual
Reacción de secuenciación para los productos de la PCR
Reacción de secuenciación para los plásmidos
Corrida electroforética de las reacciones de secuenciación manual, en geles de
poliacrilamida al 6%.
Tinción con plata para los geles de secuencia
Secuenciación automática
Análisis estadístico en el diagnóstico molecular
Detección de otras translocaciónes que inducen leucemia: panel de diagnóstico
Obtención de la muestra
RT-PCR convencional:
Citometría de Flujo
Determinación de la LMC mediante citometría de flujo usando paneles de anticuerpos
monoclonales específicos.
Obtención de la muestra
Procesamiento de las muestras en el citómetro de flujo y su correspondiente análisis.
Análisis de los resultados
Factores implicados en la resistencia al tratamiento de la LMC con imatinib
Modificación de la expresión génica por bcr/abl
Obtención de la muestra
Selección de genes a ser estudiados
Tratamiento del ARNtotal con ADNasa
Aislamiento de ARNmensajeros
RT-PCR convencional
RT-PCR en Tiempo Real
Análisis de los datos
Cuantificación relativa sin curva estandar
Análisis estadístico
Detección de mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera
BCR/ABL.
Obtención de la muestra
RT-PCR
Purificación de los productos de la PCR
Secuenciación automática
54
55
55
56
Resultados
80
80
80
80
82
Diagnóstico molecular de BCR/ABL
Extracción de ARN total.
Extracción de ARN total. Protocolo A
Extracción de ARN total. Protocolo B
Determinación de la translocaciòn BCR/ABL por transcripción inversa a partir de ARNt
y su posterior amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
Clonación de productos de PCR con variantes de BCR/ABL
Secuenciación de las muestras clonadas o productos de PCR de las diferentes variantes
de BCR/ABL
Secuenciación manual
Secuenciación automática
Variante b2a2
Variante b3a2
Variante e1a2
Análisis estadístico de los resultados obtenidos en el diagnóstico molecular de BCR/ABL
vii
56
57
57
58
59
59
60
62
62
64
64
65
70
70
71
71
72
72
73
74
74
74
75
76
76
76
78
79
83
85
87
88
91
91
94
96
98
Frecuencia de la quimera BCR/ABL en pacientes LMC Venezolanos
Frecuencia de la variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2
en pacientes LMC venezolanos.
Comparación de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2 y b2a2/b3a2
entre pacientes LMC venezolanos y otros países latinoamericanos.
Comparación de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2 y b2a2/b3a2
entre pacientes LMC venezolanos con respecto a la edad y el sexo.
Detección de otras translocaciónes que inducen leucemia: panel de diagnóstico
Citometría de Flujo
Caso LMC
Caso LMC en crisis blástica (CB) linfoide
Caso LMC en crisis blástica (CB) mieloide
Factores implicados en la resistencia al tratamiento de la LMC con imatinib
Modificación de la expresión génica por BCR/ABL
Selección de los pacientes a ser evaluados
Estandarización de las condiciones de amplificación por PCR
Eliminación de ADNg en las muestras de ARNt usadas en la síntesis de ADNc
Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR convencional para los
genes GAPDH, Lyn y AKAP12
Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR en Tiempo Real para
los genes GAPDH, Lyn y AKAP12
Evaluación por PCR en Tiempo Real del gen Lyn en pacientes Venezolanos con LMC
Estadística de la RTQPCR
Detección de mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera
BCR/ABL
Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR para el punto de
fusión y el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL
Secuenciación automática del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL de
los pacientes con LMC
99
99
101
103
106
110
111
113
115
119
119
119
121
121
122
122
124
128
132
132
134
Discusión
Conclusiones
Lista de Referencias
Anexos
141
Anexo A
205
Anexo B
206
Anexo C
207
Anexo D
209
173
176
204
Anexo E
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig.
Título
Pág.
1
Esquema representativo del proceso de Hematopoyesis.
2
2
Esquema representativo de la translocación recíproca y no aletoria
entre los cromosomas 9 y 22 que originan el cromosoma Filadelfia
que participa en la aparición y evolución de la LMC.
6
3
Esquema representativo de los diferentes dominios estructurales
presentes en las proteínas (A) BCR, (B) ABL y el híbrido (C) BCR/ABL.
8
4
Esquema representativo de la estructura de los genes abl y bcr en sus
respectivos cromosomas y las diferentes isoformas quiméricas que se
pueden forman a partir de la fusión de ambos.
10
5
Esquema representativo del complejo de adhesión focal.
14
6
Esquema de las diferentes vías de señalización celular que pueden ser
afectadas por la expresión del híbrido BCR/ABL.
15
7
Esquema de algunas vías de señalización celular que pueden ser afectadas
por la expresión del híbrido BCR/ABL.
17
8
Representación de las tres primeras modalidades terapéuticas usadas
para el tratamiento de la LMC.
19
9
Presentación farmacéutica del inhibidor Glivec, modo de acción y su
estructura química.
22
10
Identificación de genes que pueden ser usados para distinguir
pacientes LLA sensibles y resistentes al tratamiento con Imatinib.
24
11
Identificación de los diferentes tipos de células inmaduras que
se pueden encontrar en un frotis sanguíneo de paciente con LMC.
30
12
Ilustración representativa de un estudio citogenético con células de
un paciente LMC.
31
13
Ilustración representativa del funcionamiento del citómetro de flujo.
33
ix
14
Ilustración representativa del modo de acción de los tres sistemas
de detección de la amplificación por RTQ-PCR.
36
15
Ilustración representativa del sistema Light Cycler para amplificación
por RTQ-PCR.
37
16
Esquema ilustrativo de la posición de los cebadores en los genes bcr
y abl (Panel A) y en las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 (Panel B).
49
17
Secuencias de las variantes b2a2 (Panel A), b3a2 (Panel B) y
e1a2 (Panel C) correspondientes a las diferentes translocaciones
del híbrido BCR/ABL.
50
18
Dot plot de la serie blanca en condiciones de normalidad.
65
19
Esquema de los posibles casos que se pueden presentar a la hora del
análisis de resultados en los Dot plot de fluoresecencia Ag-Ag o mixto.
66
20
Dot plot de fluorescencia mixto.
67
21
Dot plot de fluorescencia mixto representativo de la separación en
cuadrante de las poblaciones celulares y valoración en porcentajes
de la intensidad de expresión del Ag analizado.
68
22
Dot plot de fluorescencia Ag-Ag representativo de la separación
en cuadrante (líneas verdes) del enfrentamiento de dos antígenos
y la valoración de sus expresiones en porcentajes.
69
23
Secuencia del híbrido BCR/ABL identificando el punto de fusión
y el dominio tirosina quinasa.
78
24
Extracción de ARNt.
81
25
Extracción de ARNt con Trizol.
83
26
Amplificación por RT-PCR de las diversas variantes de BCR-ABL.
85
27
Determinación de colonias positivas conteniendo el fragmento clonado
86
28
Determinación de los clones positivos.
87
29
Secuencia manual del paciente 112 (b2a2).
89
30
Alineación de las secuencias manuales de los pacientes LMC 20, 54
112, 130, 139 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL
90
x
(Variante b2a2, número de acceso: AJ131467).
31
Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC 20,
54, 93, 112, 130, A9 y A6 y la secuencia reportada para la translocación
BCR/ABL (Variante b2a2, número de acceso: AJ131467).
93
32
Secuencias de los pacientes LMC 93 y A9 con el punto de fusión
de la quimera BCR/ABL, variante b2a2.
93
33
Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC
A15, 16, 17, 18 y 19 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL
(Variante b3a2, número de acceso: AJ131466).
95
34
Secuencias de los pacientes LMC A15 y A19con el punto de
fusión de la quimera BCR/ABL, variante b3a2.
96
35
Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC
A7 y A14 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL
(Variante e1a2, número de acceso: AF113911).
97
36
Secuencias de los pacientes LMC A7 y A14 con el punto de fusión de
quimera BCR/ABL, variante e1a2.
98
Análisis de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2, e1a2,
b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2 de los pacientes LMC venezolanos con
respecto a la edad y el sexo.
105
Distribución por grupos de edades de los pacientes BCR/ABL y
distribución de la población general Venezolana.
105
Estandarización por RT-PCR de siete translocaciones vinculadas
Con el origen y evolución de otros tipos de leucemia
107
Dot-plot de la población celular (por tamaño y granulosidad)
de los tes casos de LMC analizados.
111
41
Dot-plot de la población celular de un paciente con LMC analizado
112
42
Dot-plot de la población celular de un paciente representativo de
los tres casos de LMC en crisis blástica analizados
114
Dot-plot de la población celular de un paciente representativo de
los tres casos de LMC en crisis blástica analizados
116
Ensayos de amplificación por PCR convencional en muestras previamente
tratadas con ADNasa.
121
37
38
39
40
43
44
xi
45
Estandarización de la amplificación por PCR convencional de los genes
GAPDH, Lyn y AKAP12.
122
46
Gráficas de amplificación, curva de fusión y corrida en agarosa
1.5% de los productos de amplificación de los genes GAPDH,
AKAP12 y Lyn en personas normales y pacientes con LMC.
123
47
Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes
con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 1.
126
48
Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes
con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 2.
126
49
Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes
con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 3.
127
50
Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes
con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp.4.
127
51
Gráfica de la expresión relativa del gen Lyn en controles (N, puntos
blancos) y pacientes LMC en las diferentes fases clínicas de enfermedad.
130
52
Gráfica de la expresión relativa aleatorizada de los gen GAPDH
y Lyn en las diferentes fases clínicas de la LMC.
131
53
Estandarización del protocolo de PCR empleado para la amplificación
del punto de fusión de la quimera BCR/ABL en pacientes con LMC
133
54
Estandarización del protocolo de PCR empleado para la amplificación
del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL en pacientes con LMC
133
55
Alineación de la secuencias automáticas de los pacientes F1, F2, F3, F5, F6,
F10, F11, F12, F13, F14, F25, F16, F17, F18, F19 y la secuencia reportada
para el dominio de BCR/ABL (número de acceso: NM005157)
138
56
Mutaciones puntuales encontradas en el dominio tirosina quinasa (SH1) de
la quimera BCR/ABL asociadas con la resistencia clínica a Imatinib.
166
xii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla
Título
Pág.
I
Mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa del a quimera
BCR/ABL que han sido asociadas con la resistencia al tratamiento
con Glivec en pacientes con LMC y LLA.
28
II
Secuencia de cebadores empleados en la amplificación de las diferentes
variantes de la translocación BCR/ABL y del control interno BCR en
pacientes LMC.
48
III
Translocaciones seleccionadas para la producción de paneles de
diagnóstico de Leucemias.
61
IV
Paneles de anticuerpos monoclonales usados en el diagnóstico de
enfermedades hematoncológicas.
63
V
Genes seleccionados para los estudios de expresión génica en pacientes
positivos para la translocación BCR/ABL.
71
VI
Secuencia de cebadores usados para la amplificación de la quimera
BCR/ABL y el dominio tirosina quinasa en pacientes con LMC
77
VII
Cuadro resumen de los 200/297 pacientes LMC positivos para
la translocación BCR/ABL y sus respectivas variantes obtenidas.
84
VIII
Cálculo de la frecuencia de BCR/ABL en pacientes Venezolanos con
LMC y su comparación con la frecuencia esperada de 95% de
positivos para BCR/ABL, reportado en otros países.
99
IX
Frecuencia de las diferentes variantes BCR/ABL encontradas en
los pacientes LMC venezolanos y su comparación con un modelo
de distribución uniforme.
X
Frecuencia de las variantes b2a2 y b3a2 encontradas en
los pacientes LMC venezolanos y su comparación con un modelo
de distribución uniforme.
101
XI
Valores de p obtenidos de la comparación entre las frecuencias de
las variantes (b2a2, b3a2, b2a2/b3a2) encontradas en Venezuela
103
xiii
100
y en otros países latinoamericanos.
XII
Resumen de los resultados obtenidos en la RT-PCR realizada
a 40 pacientes de los 96 que dieron negativos para la quimera BCR/ABL
109
XIII
Pacientes LMC positivos incluidos en el estudio de expresión génica
mediante la técnica de PCR en Tiempo Real.
120
XIV
Valores obtenidos a partir de la amplificación por PCR en Tiempo
Real de los genes GAPDH y Lyn.
129
XV
Resumen de los resultados obtenidos en el estudio de los factores
que afectan la respuesta al tratamiento con Imatinib
139
XVI
Compuestos inhibidores de proteínas tirosina quinasa y su espectro
de acción
171
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
LMC = Leucemia mieloide crónica
LMA = Leucemia mieloide Aguda
LLA = Leucemia linfocítica aguda
SP = Sangre periférica
MO = Médula ósea
c-abl = Designación para el gen abl
bcr = Designación para el gen bcr
ABL = Designación para la proteína ABL
BCR = Designación para la proteína BCR
BCR/ABL = Designación para la proteína quimérica
Ph+ = Cromosoma filadelfia
SH1 = Dominio 1 de homología con la familia Src
SH2 = Dominio 2 de homología con la familia Src
SH3 = Dominio 3 de homología con la familia Src
ADN = Ácido desoxirribonucleico
ARNm = Ácido ribonucleico mensajero
ARNt = Ácido ribonucleico total
DEPC = Dietilpirocarbonato
b2a2 = Variante de BCR/ABL
b3a2 = Variante de BCR/ABL
e1a2 = Variante de BCR/ABL
HLA = Sistema de leucocitos antígenos humano
CDs = antígenos celulares
IFNα = Interferon alfa
STI751, Glivec = Fármaco usado contra la LMC
FC = Fase crónica de la LMC
xv
FA = Fase acelerada de la LMC
CB = Fase de crisis blástica de la LMC
K562 = Línea celular creada a partir pacientes LMC que expresa BCR/ABL.
RTQ-PCR = Racción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa
Lyn= Designación para el gen Lyn.
LYN = Designación que se le da a la proteína codificada a partir de gen Lyn.
GAPDH = gliceraldehil pirubato deshidrogenasa
Fish = Técnica de inmunofluorescencia con sondas marcadas para ver cromosomas en
metafase.
CMF = Técnica de Citometría de flujo
FSC = distribución de la serie blanca en el gráfico de dispersión de acuerdo al tamaño celular
SSC = Distribución de la serie blanca en el gráfico de dispersión de acuerdo a su complejidad
o granulocidad.
Ag = Anticuerpo Monoclonal.
CD 10, 20, 33, 34, ….etc.= Nombre para designar a los diferentes antígenos celulares.
xvi
INTRODUCCIÓN
Algunas alteraciones cromosómicas y genéticas en las células progenitoras
hematopoyéticas inmaduras, sean mieloides (que dan origen a eritrocitos, monocitos,
plaquetas, megacariocitos, promielocitos, etc) o linfoides (que dan origen a linfocitos B, T y
células suicidas naturales), han sido involucradas en la producción de proteínas quiméricas
funcionales que dan origen a las leucemias (Ver figura 1) (Faderl y Col. 1999; López. 2002;
Melo y Col. 2003).
De acuerdo al tipo de célula progenitora que se altera, las leucemias han sido
clasificadas en dos grandes grupos: (1) las leucemias mieloblásticas, en las cuales la
alteración que se produce involucra a las células progenitoras de origen mieloide, y (2) las
leucemias linfoblásticas, en las cuales la alteración envuelve a células progenitoras de origen
linfoide. Adicionalmente, las leucemias han sido clasificadas en crónicas y agudas de
acuerdo a la madurez del tipo celular comprometido y a la agresividad clínica con la cual se
desarrollan. (Bennett y Col. 1976; Bennett y Col. 1996; Goldsby y Col. 2000).
Por otra parte, las leucemias crónicas, en las que se incluyen a la leucemia mieloide
crónica (LMC) y a la leucemia linfocítica crónica (LLC), se caracterizan fundamentalmente
por la presencia de células sanguíneas en diferentes períodos de maduración y por ser
consideradas menos agresivas en su inicio, aún cuando el paciente tiene menos probabilidad
de sobrevivir en etapas avanzadas. Por su parte, las leucemias agudas, en las que se incluyen
la leucemia mieloide aguda (LMA) y la leucemia linfoblástica aguda (LLA), están
caracterizadas por un alto número de células inmaduras y por presentar cuadros agresivos en
los inicios de la enfermedad, sin embargo, a diferencia de las leucemias crónicas, el paciente
puede sobrevivir posterior a un tratamiento adecuado (Bennett y Col. 1976; Bennett y Col.
1996; Goldsby y Col. 2000).
Una de las leucemias que más ha sido estudiada en la actualidad es la leucemia
mieloide crónica (LMC), la cual ha marcado pauta para el estudio y comprensión de los otros
tipos de leucemias. Esta enfermedad involucra a todas las células de origen mieloide y
1
algunas de las células de origen linfoide. Adicionalmente, estudios vinculados con la LMC
la reportan como la más frecuente en adultos (15 -20%), con una incidencia de 1 - 2 casos
por cada 100.000 personas por año. Por otra parte, la edad promedio en la cual se manifiesta
esta enfermedad ha sido estimada cercana a los 45 años, con un intervalo comprendido entre
los 25 y 70 años (70 %). Aunque la LMC es considerada como una leucemia que se
manifiesta fundamentalmente en adultos, también ha sido reportada en niños (10%) (Faderl y
Col. 1999; http://seer.cancer.gov/statfacts/).
Figura 1. Esquema representativo del proceso de Hematopoyesis. Los círculos y flechas rojos identifican las
células progenitoras mieloides y linfoides que dan origen a las diferentes células sanguíneas. La figura interna
muestra los distintos componentes de la médula ósea entre los que se encuentran las células troncales
hematopoyéticas y del estroma, las células de soporte del estroma, adipocitos y osteoblastos. Tomado de
http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/stem/specific/specific02.htm.
Clínica de la Leucemia Mieloide Crónica (LMC).
La LMC se define clínicamente como una expansión clonal de células progenitoras
hematopoyéticas principalmente del linaje mieloide donde se incluyen: granulocitos del tipo
2
promielocito, mielocito y metamielocito presentes tanto en la médula ósea (MO) como en la
sangre periférica (SP). La gran cantidad de granulocitos presentes durante la LMC se debe a
las alteraciones que ocurren en el proceso de diferenciación de estas células, impidiendo su
desarrollo hacia glóbulos blancos maduros y provocando su acumulación y aumento
desmesurado con respecto a las células normales (Golde y Gulate, 1994; Bennett y Col.
1996; Amarante-Mendes y Col. 1998; Deininger y Col. 2000; Kosugi y Col. 2000).
Desde el punto de vista de su evolución clínica, la LMC se puede clasificar en tres
fases:
.- Fase crónica inicial. Tiene un período variable de duración (aproximadamente de 3
a 5 años). En esta fase se pueden observar cantidades similares de células maduras e
inmaduras, tanto en MO como en SP. Adicionalmente, es posible encontrar en los pacientes
que padecen de LMC un elevado recuento de leucocitos, esplenomegalia (crecimiento del
bazo), baja actividad de la fosfatasa alcalina de los neutrófilos, anemia y un
hipermetabolismo con la consecuente pérdida de peso, fatiga, fiebre y niveles elevados de
ácido úrico.
.- Fase acelerada. Puede durar algunos meses y se caracteriza tanto por un aumento en
el número de blastos en MO y SP (≥ 10%), como el de los basófilos y eosinófilos (≥ 20%). A
su vez es posible encontrar leucocitosis (cuando el valor absoluto de leucocitos es mayor de
11.000), visceromegalia (crecimiento de las vísceras) progresiva, anemia progresiva,
trombocitosis (presencia de un alto número de plaquetas en la sangre), mielofibrosis
(acumulación de fibras y células sanguíneas anómalas dentro de la médula ósea), dolor en los
huesos, fiebre y un aumento en la resistencia al tratamiento.
.- Fase terminal o de crisis blástica. Está asociada a signos y síntomas de leucemia
aguda o enfermedad extramedular, las cuales se caracterizan por un aumento excesivo de
células blásticas mieloides o linfoide en MO y SP (≥ 20%) y pancitopenia (disminución de
todas las poblaciones celulares de la sangre). En esta última etapa, el paciente tiene menos
probabilidad de sobrevivir, pues se hace completamente resistente al tratamiento, y el
período de vida pudiera verse limitado a unos pocos meses. Mas aún, existen algunos casos
en los que se puede llegar a una fase refractaria final en la cual el paciente no responde a
3
ningún tipo de tratamiento (Kantarjian y Col. 1993; Golde y Gulate, 1994; Beedassy y Col.
2000; Di Bacco y Col.. 2000).
Factores genéticos y no genéticos (ambientales) relacionados a la LMC.
Factores genéticos:
Hasta ahora no se ha encontrado ningún factor genético o predisposición que induzca
LMC. Por ejemplo, estudios en pacientes gemelos afectados con LMC no reportan un mayor
riesgo de desarrollar esta enfermedad por parte del hermano que no se ha visto afectado.
Sigue siendo un misterio el por qué sólo uno de dos gemelos idénticos es capaz de
desarrollar LMC, siendo su genética idéntica y el ambiente al que son expuestos
prácticamente el mismo (John y Col. 1973).
Actualmente, la única asociación descrita de un factor genético con la aparición de la
LMC deriva de los trabajos realizados con el sistema de histocompatibilidad (HLA). Se ha
demostrado que la respuesta inmune mediada por linfocitos T, vía expresión de diferentes
alelos HLA, juega un rol muy importante en la inmunosobrevivencia contra la LMC. En tal
sentido, Cortes y col. (1998) demostraron que ciertas moléculas de HLA clase I y II son
capaces de asociarse con BCR/ABL e inducir una respuesta inmune tipo CD8+ linfocito T
citotóxico contra esta proteína quimérica. Por su parte, Yasukawa y colaboradores (2000)
realizando un estudio sobre los diferentes alelos reportados para HLA y las variantes b2a2 y
b3a2 presentes en la LMC, encontraron que existía una asociación en la expresión de algunos
tipos de alelos HLA y las variantes expresadas en pacientes LMC en comparación con
personas normales. Estos resultados suponen una ventaja de no padecer la enfermedad en
aquellas personas que expresan los alelos que son capaces de presentar a la quimera ante el
sistema inmune para que sea degradada. En contraparte a los trabajos anteriores, Mundehada
y colaboradores (2004) no consiguieron ninguna asociación específica entre las diferentes
variantes de las quimeras presentes en la LMC y los alelos HLA reportados anteriormente.
Aunque los hallazgos obtenidos en este tema no han producido resultados contundentes, han
abierto una puerta en la búsqueda de diferentes tipos de moléculas que pudieran inducir una
predisposición a la LMC.
4
Factores no genéticos (ambientales):
Existen muchos factores no genéticos que han sido relacionados con el origen y
evolución de la LMC. Por ejemplo, las exposiciones por largo tiempo a altas energías de
radiación (tal como ocurrió en Japón durante la segunda guerra mundial), algunas drogas
(quimioterapia), algunos inmunosupresores y las radiaciones usadas en el tratamiento de
otros tipos de canceres u otras enfermedades, pueden incrementar el riesgo de aparición de
LMC entre un 20 – 30%. Otros factores asociados a la aparición de la LMC que han sido
estudiados incluye: los campos electromagnéticos de frecuencias extremadamente baja,
pesticidas, bencenos, formaldehídos, infecciones virales (por ejemplo el virus HTLV-1, que
causa la leucemia/linfoma de células T del adulto) y errores en la recombinación que ocurren
a lo largo de la vida, entre otros (Sompayrac 1999).
La propensión a la leucemia también puede verse incrementada luego de largos
períodos de endogamia en una población. Adicionalmente, una hipótesis similar ha planteado
que las personas que no han sido expuestas durante su juventud a los agentes infecciosos
comunes, pueden tener mayor propensión a sufrir de leucemias. Los agentes infecciosos
serían nuevos en su sistema causando una inmunorespuesta fuerte e inadecuada (Robien y
Ulrich. 2003).
Citogenética de la LMC:
Aunque la LMC se conoce hace más de 150 años, la alteración cromosómica que la
produce no fue descubierta sino hasta 1960 (Nowell y Hungerford). A partir de este
momento fue conocida como la enfermedad del cromosoma Ph+ (o cromosoma Filadelfia en
honor a la ciudad donde fue descubierta por primera vez), debido a que la principal
característica que presentaban los pacientes que la padecían era la presencia de un
cromosoma 22 de menor tamaño en su cariotipo, con respecto al cromosoma 22 de personas
normales. Años más tarde, fue incluida dentro del subgrupo LMC debido a que el 95% de los
pacientes que presentaban esta patología clínica también presentaban un cromosoma 22 con
las mismas características que las reportadas por Nowell y Hungerford y a partir de este
momento se convirtió en el distintivo de identificación de la LMC (Faderl y Kantarjian.
2000; Goldman y Melo. 2003).
5
A principios de los años 70 el estudio detallado del cromosoma Ph+ permitió
descubrir que su origen es producto de la translocación de la porción distal del cromosoma
22 dentro de otro cromosoma, usualmente el cromosoma 9 (Rowley, 1973). Citado por
Goldman y Melo. 2003). En 1982 De Klein y colaboradores, demostraron que el oncogen abl
estaba involucrado en la translocación generada desde el cromosoma 9 al cromosoma 22,
indicando que la translocación era recíproca y no aleatoria entre los brazos largos de ambos
cromosomas. Esto sugirió, por primera vez, un rol determinante del gen abl en la aparición y
evolución de la LMC. Para el año de 1984 Prakash y Yunis, mapearon la secuencia de los
puntos de corte en los cromosomas 22 y 9 en las sub-bandas 22q11.21 y 9q34.1,
respectivamente. A partir de ese momento la translocación fue también denotada como
t(9;22)(q34;11). Más aún, estos investigadores también reportaron que aunque la posición
del corte en el cromosoma 9 era poco variable, en el cromosoma 22 si existía un alto grado
de variabilidad en el punto de corte, el cual estaba agrupado en un área que fue llamada bcr
("binding cluster region"). En 1985 Shtivelman y colaboradores se refirieron a esta región
como un gen al que se le denominó bcr, además reportaron que en la translocación el
oncogen abl era transferido al cromosoma 22 (Ver figura 2).
Figura 2. Esquema representativo de la translocación recíproca y no aleatoria entre los cromosomas 9 y
22 que originan el cromosoma Filadelfia que participa en la aparición y evolución de la LMC. Las bandas
de color rojo y amarillo representan la región de ambos cromosomas involucrados en el punto de fusión.
Tomado de http://www.popularmechanics.com/science/health_medicine/1281066.html.
6
Caracterización de los genes translocados en la LMC:
Posterior al descubrimiento de la translocación t(9;22)(q34;11) y a la identificación
de los genes involucrados en ella, la atención se centró principalmente en la caracterización
detallada de los genes abl y bcr, la proteína híbrida (bcr/abl) que se produce en la
translocación y las funciones celulares en las que se ven envueltos (Melo 1996; Kantarjian y
Col. 2000).
El gen abl humano es el homólogo del oncogen v-abl del virus de la leucemia murina
de Abelson. El ARNm que se transcribe a partir de este gen comprende 11 exones
(denominados a1- a11), los cuales codifican para una proteína de 145-KDa conformada por
1.097 aminoácidos. Entre las propiedades que caracterizan a la proteína ABL se incluye una
actividad enzimática del tipo tirosina quinasa no receptora, que se expresa en todos los
tejidos y que está presente en las dos isoformas originadas por un corte y empalme
alternativo (“splicing”) del primer exón del ARNm del gen. Adicionalmente, la proteína
ABL contiene diversos dominios estructurales: a) tres dominios de homología Src: SH1, SH2
y tirosina quinasa SH3, los cuales están ubicados en el extremo N-terminal, b) un dominio
central rico en prolina que permite la interacción con dominios SH3 de otras proteínas y por
último c) un dominio ubicado en el extremo C-terminal que contiene señales de localización
nuclear, unión al ADN, exportación hacia el citoplasma y de unión a F-actina y G-actina,
(ver figura 3). Basado en su estructura proteica, la proteína ABL puede ser ubicada tanto en
el citoplasma como en el núcleo y ha sido implicada en la regulación de procesos celulares
tan importantes como: la diferenciación celular, el ciclo celular, la adhesión celular y
respuesta a estrés. En condiciones normales, la actividad enzimática de la proteína ABL es
fuertemente regulada por la unión intramolecular de la porción inicial de la región Nterminal (comprendida por el exon 1 [1b o 1a] y la primera parte del exon 2 [a2]) al dominio
SH1, (Kipreos y Wang, 1990; Sawyers y Col. 1994; Lewis y Col.. 1998; Faderl, y Col.
1999; Van Etten, 1999; Yuan y Col. 1999; Pluk y Col. 2002 ; Goldman, y Melo. 2003.
7
Figura 3. Esquema representativo de los diferentes dominios estructurales presentes en las proteínas (A)
BCR, (B) ABL y (C) el híbrido BCR/ABL. Las nomenclaturas p160, p145 y p210 representan otra forma en
la que son llamadas estas proteínas. N y C indican los extremos N-terminal y C-terminal de cada proteína
respectivamente. Los bloques de distintos colores representan los diferentes dominios estructurales para cada
proteína. En el dominio serina/treonina de BCR se señala la ubicación del residuo de tirosina 177. El esquema
del híbrido BCR/ABL muestra las regiones de la proteína que corresponden a BCR y ABL, así como el punto
de fusión más común. Tomado de Expert Reviews in Molecular Medicine © 2003 Cambridge University Press.
Por su parte, el gen bcr transcribe un ARNm que abarca 25 exones (también
denominados e1 – e25) los cuales codifican para una proteína de 160-KDa conformada por
1.271 aminoácidos. El producto proteico de este gen es expresado en todos los tejidos y, al
igual que ABL, presenta diferentes dominios estructurales: a) en el extremo N-terminal se
encuentra un dominio hélice vuelta hélice involucrado en la formación de homodímeros u
homotetrámeros (oligomerización), además de un dominio de unión a SH2, b) en la porción
central se encuentra un dominio con actividad enzimática serina-treonina quinasa (cuyos
únicos sustratos identificados han sido BAP-1 y el mismo BCR) y adicionalmente un
dominio con homología a los factores de intercambio de GTP por GDP, Rho, Rho GEF y por
último c) en el extremo C-terminal un dominio que facilita la unión de lípidos dependientes
de Calcio (CalB) y un dominio con homología a la proteína activadora de la GTPasa Rac
(Rac-GAP), la cual es una pequeña GTPasa de la super familia Ras que regula la
8
polimerización de actina y la actividad de una NADPH oxidasa en células fagocíticas (ver
figura 3) (Deininger y Col. 2000).
La localización celular de BCR ha sido precisada específicamente en el citoplasma y
dentro de sus funciones mas importantes destaca su participación en las vías de transducción
de señalización celular, lo cual quedó evidenciado cuando se demostró que BCR fosforilada
en su residuo de tirosina 177 es capaz de unirse a la proteína adaptadora Grb2 (proteína que
participa en la activación de la vía de señalización de Ras). Otras investigaciones han
demostrado que la proteína BCR también posee la capacidad de asociarse con el ADN y con
la proteína XPB, a través de su estructura aminoacídica, lo cual le permite jugar un rol
crucial durante el proceso de reparación del ADN, iniciación general de la transcripción y
regulación del ciclo celular (Laurent y Col. 2001; Duncan y Col. 2003).
Además de las características estructurales específicas de la proteína BCR cabe
destacar que tanto el gen como la proteína deben su nombre a la presencia de regiones
conocidas como "binding cluster region" (bcr), las cuales han sido reportadas como regiones
sensibles a ruptura. Hasta ahora, se conocen tres regiones dentro del gen bcr que presentan
estas características, las cuales han sido ubicadas de mayor a menor dependiendo de la
frecuencia con que ocurre el corte. Estas son: la región bcr mayor (M-bcr), la región bcr
menor (m-bcr) y la región bcr micro (µ-bcr) (ver figura 4) (Wetzler y Col. 1995; Maru y
Col. 1999; Takeda y Col. 1999; Laurent y Col. 2001).
De la fusión de los genes abl y bcr en t(9;22)(q34;q11), y su posterior transcripción y
traducción, se originan dos proteínas híbridas denominadas BCR/ABL y ABL/BCR. La
proteína quimérica BCR/ABL es funcionalmente activa y ha sido demostrado que ejerce un
efecto importante en la transformación de las células presentes en los pacientes con LMC.
Sin embargo, aún cuando el híbrido ABL/BCR es transcripcionalmente activo, hasta los
momentos, no se ha determinado su participación en algún rol funcional que lo vincule al
origen y evolución de la enfermedad, a pesar de todos los estudios que se han realizado en la
región codificante de esta proteína (Mes-Masson y Col. 1986).
9
Figura 4. Esquema representativo de la estructura de los genes abl y bcr en sus respectivos cromosomas y
algunas de las isoformas quiméricas que se pueden formar a partir de la fusión de ambos. Las flechas
rojas indican los diferentes puntos de ruptura para ambos genes. Tomado de The New England Journal of
Medicine, 2003.
El gen híbrido bcr/abl involucra generalmente al exon 2 (a2) del gen abl y los
exones, 1 (e1), 12 (b2) 13 (b3) y 19 (e19) del gen bcr. La variabilidad en el punto de corte
del gen bcr ha permitido detectar varias isoformas BCR/ABL o variantes en los pacientes
con LMC. Una de estas isoformas es producida como consecuencia de la ruptura en la región
menor de corte del gen bcr (m-bcr), la cual involucra el exón 1 e induce la expresión de un
ARNm de 7.5 kb que codifica para una proteína de 190 KD. Esta primera variante proteica,
denominada p190BCR/ABL o e1a2, está presente en el 70% de los casos de LLA de adulto y en
un 20% de los casos LMC (Hermans y Col. 1987). La segunda isoforma es producida como
resultado de una ruptura en la región mayor de corte de bcr (M-bcr) que involucra los exones
12 y 13, conduciendo a la producción de un ARNm de 8.5Kb que codifica para una proteína
de 210 KD. Esta isoforma denominada p210BCR/ABL, es la más común en los casos de LMC
(95%), la cual a su vez se subdivide en dos variantes: b2a2 y b3a2, denominadas así por
Melo y Col. (1995). La tercera y última isoforma del híbrido BCR/ABL es la menos común y
se produce como resultado de una ruptura en la región micro de corte de bcr (µ-bcr) que
involucra al exon 19, codificando una proteína de 230 KD. Esta isoforma denominada
p230BCR/ABL o e19a2, fue primero identificada en pacientes con un tipo de leucemia conocida
10
como leucemia neutrofílica crónica (LNC) y que ha sido reportada en pocos casos de LMC
(ver figura 4) (Melo y Col.1993; Melo, 1996; Wilson y Col. 1997; Briz y Col. 1997;
Kantarjian, y Col. 2000; Quackenbush y Col. l. 2000; Duncan, y Col. 2003).
Cabe destacar que además de las isoformas más comunes descritas anteriormente,
también han sido identificadas otras variantes de BCR/ABL reportadas con una frecuencia de
aparición mucho menor. Estas variantes han sido denominadas: e1/a3, b2a3, b3a3, e2/a1a,
e6/a2, e8/a2 y e13/a2. (Melo y Col. 1994; Melo, 1996; Melo, y Col. 1996; Pane y Col. 1996;
Ravandi y Col. 1999; Laurent y Col. 2001).
Vías de señalización celular que se ven afectadas en pacientes con LMC.
La quimera BCR/ABL conserva la actividad enzimática tipo tirosina-quinasa de la
proteína ABL pero de una manera desregulada (la proteína está activada constitutivamente).
Dada su funcionalidad, el híbrido BCR/ABL ha sido vinculado de manera crucial en las vías
de señalización que participan en el crecimiento, diferenciación y apoptosis celular. Por lo
tanto, basado en la importancia vital que tiene la actividad tirosina-quinasa de la proteína ABL
(mantenida en la quimera) y sumado a la nueva capacidad de interactuar con múltiples
dominios de otras proteínas, gracias a las nuevas conformaciones adquiridas por su unión con
BCR, se ha hecho necesario tratar de entender los mecanismos mediante los cuales esta células
transformadas conducen a una condición de malignidad. (Melo 1996; Deininger y Col.2000;
Kantarjian y Col. 2000).
Uno de los eventos que desencadena el efecto transformante de la fusión BCR/ABL
incluye la inducción de la proliferación de estas células de una manera independiente de los
factores de crecimiento hematopoyéticos (eritropoyetina, trombopoyetina, interleuquina 3 o 6,
factores estimulantes de colonias granulocito-macrófago y factor de células troncales), quienes
cumplen este rol en condiciones normales. Este hecho, desencadena una serie de cambios
intracelulares que traen como consecuencia la expansión del clon maligno con respecto a las
células que no producen la proteína quimérica (Cline 1994; Faderl y Col. 1999).
11
Basados en diversas investigaciones referidas a las diferentes vías de señalización
celular que pueden ser afectadas por la proteína híbrida BCR/ABL (Verfallie y Col. 1997;
Deininger y Col. 2000; Melo y Col. 2003), las cuales participan no sólo al inicio sino durante
la progresión de la LMC, han sido propuestos 4 mecanismos principales para incidir en la
transformación maligna de las células de pacientes con LMC:
1) Adhesión celular alterada, de los clones transformados con las células del estroma
de la médula ósea (MO) y de la matriz extracelular.
2) Activación constitutiva de la señalización mitogénica.
3) Reducción de la apoptosis celular.
4) Degradación de proteínas inhibitorias de ABL mediada por proteosomas.
1. Adhesión celular alterada:
En el microambiente del estroma de la médula ósea ocurren procesos de adhesión y
mantenimiento de las células progenitoras de la sangre. Estos procesos son regulados por
receptores y agonistas de supervivencia y proliferación a través de una estimulación directa
sobre estas células, lo cual facilita la adquisición de una buena fijación, comunicación y
control de la diferenciación (Di Bacco y Col. 2000). En efecto, el proceso de adhesión celular
es llevado a cabo por un grupo de proteínas receptoras de la superficie celular conocidas como
integrinas. Estas proteínas son glicoproteínas compuestas de dos sub-unidades α y β (α4β1 y
α5β1), donde la cadena α determina la especificidad por el ligando y la cadena β participa en
la activación de la vía de transducción de señal, posterior a la unión del ligando. Esta vía de
señalización se inicia cuando las integrinas son activadas por su ligando e inducen el
reclutamiento tanto de proteínas del citoesqueleto (tales como tensina, paxillina, talina y
vinculina) como de proteínas con
actividad tirosina-quinasa (Fax y c-ABL) y proteínas
adaptadoras (GRB2 y CRKL), las cuales forman el complejo de adhesión focal (Clark y
Brugge, 1995; Schwartz y Col. 1995; Lewis, y Col. 1996).
Varios estudios han demostrado que las células progenitoras presentes en los pacientes
con LMC, exhiben una disminución en su capacidad para adherirse a las células del estroma
12
de la MO y a la matriz extracelular. En tal sentido, Zhao y Col. (1997) demostraron que las
células en pacientes con LMC expresaban una isoforma de las integrinas (β1B) que las hacía
incapaz de mantener la adhesión celular y que esa isoforma no ha sido detectada en las células
de personas normales. Por otro lado, Salgia y Col. (1995) y Gotoh y Col (1997) observaron
que en las células transfectadas con BCR/ABL las proteínas tensinas, paxillinas, talinas,
vinculinas y FAK se encontraban constitutivamente fosforiladas. Todos estos hallazgos
permitieron llegar a la conclusión de que algunos cambios en la estructura de las integrinas y
de otras proteínas pertenecientes a su cascada de señalización, alteraban su función y
originaban como consecuencia modificaciones en el proceso de transducción de señal desde
afuera hacia adentro de las células, lo que se traduce en una desregulación del proceso que
controla la fijación y proliferación de estas células, permitiendo entonces la liberación e
infiltración de células progenitoras al torrente sanguíneo y linfático (Ver figura 5) (Gordon y
Col. 1987; Verfaillie y Col. 1997; Deininger y Col. 2000).
2. Activación constitutiva de la señalización mitogénica:
Aunque las funciones de la proteína c-ABL no han sido completamente entendidas, es
bien conocido el rol que ella juega en la regulación del ciclo celular. En efecto, en condiciones
normales la proteína c-ABL se encuentra presente en el núcleo, gracias al dominio de
localización nuclear presente en su estructura proteica. Una vez en el núcleo, esta proteína es
capaz de regular la proliferación celular gracias a su dominio SH2 y a su actividad tirosinaquinasa, que le permiten asociarse con una gran cantidad de las proteínas que conforman la
maquinaria del ciclo celular induciendo un bloqueo en su progresión (Ray y Col. 1994; Sirard
y Col. 1994).
13
Figura 5. Esquema representativo del complejo de adhesión focal. Las integrinas están ubicadas en la
membrana celular mientras que el grupo de proteínas citoplasmáticas que se aglomeran a su alrededor
conforman el complejo de adhesión focal. La asociación de las integrinas con las proteínas de la matriz
extracelular permite su fijación al sitio de interés. Tomado de The New England Journal of Medicine, 2003.
Cortez y Col. (1997) demostraron que células 32D (células precursoras mieloides), que
expresan la proteína quimérica BCR/ABL mantienen una activación constitutiva del ciclo
14
celular inducido por los factores de crecimiento. La habilidad que adquieren estas células
transformadas para continuar con el crecimiento celular, sugiere que BCR/ABL mantiene
activados todos los componentes de la maquinaria del ciclo celular que participan en la
transición de la fase G1 a S. Adicionalmente, ha sido demostrado que la actividad de las
quinasas dependientes de ciclina incluyendo Cdk2, Cdk3, Cdk4 y Cdk6 es elevada en las
células que expresan BCR/ABL, incluso se ha encontrado que la presencia de BCR/ABL
inhibe el efecto de agentes genotóxicos que pueden bloquear o producir aberraciones en el
ciclo celular. Por otra parte, la proteína BCR/ABL es también capaz de interactuar en el
citoplasma, vía proteínas adaptadoras (GRB2, CBL, SHC Y CRKL), con la vía de
señalización que envuelve a la proteína Ras. Aunque los eventos de señalización “aguas
abajo” de Ras no han sido completamente caracterizados, es bien conocido su rol crucial en la
vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), principalmente la vía de JAK
quinasa. Otras de las vías implicadas en los procesos proliferativos inducidos por BCR/ABL
son: la de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y aquellas donde participan los factores de
transcripción de activadores y transductores de señal (STAT) y MYC. (Ver figura 6) (Sawyers
y Col. 1992; Puil y Col. 1994; Pelicci y Col. 1995; Cahill y Col. 1996; Zou y Col. 1997;
Deininger y Col. 2000; Melo y Col. 2003; Goldman y Melo. 2003; Andreu y Col. 2005).
15
Figura 6. Esquema de las diferentes vías de señalización celular que pueden ser afectadas por la
expresión del híbrido BCR/ABL. En la parte superior se muestra la proteína BCR/ABL con los diferentes
dominios estructurales que permiten su unión a una gran cantidad de transductores de señales tales como
GRB2, CBL, SHC y CRKL. Las vías señaladas con flechas corresponden a las MAPs quinasas, JAK-STAT,
PI3-quinasa y FAK. Tomado de New England Journal of Medicine, 2003.
3. Reducción de la apoptosis celular:
La hematopoyesis normalmente involucra mecanismos de proliferación, diferenciación
y apoptosis, siendo estos procesos a su vez regulados por la concentración y composición de
citoquinas. La apoptosis en particular, ha sido descrita como un programa de suicidio celular
genéticamente controlado, el cual puede ser activado tanto por la desregulación de un oncogen
detectado por la célula, como a través de los estímulos de estrés o de agentes externos que
pudieran estar presentes en el ambiente celular, dañando la estructura del ADN. Las vías de
señalización involucradas en el desencadenamiento de la apoptosis incluyen a las tirosinas
quinasas, las cuales pueden ser activadas de una manera independiente de sus receptores
celulares e inducir, vía Raf-1, la activación de Akt quien, a su vez, es capaz de activar
proteínas que participan directamente en la vía apoptótica, tales como Bad, Bcl-xl y Bcl-2
(Nieborowska-Skorska y Col. 1999; Deininger y Col. 2000).
La inhibición de la apoptosis en pacientes con LMC ha sido ampliamente reportada,
más aún, algunos estudios han divulgado que la proteína BCR/ABL no solo es capaz de unirse
a muchas moléculas transductoras de señal, sino que además puede interactuar con otras
proteínas ubicadas en los diferentes escalones de las cascadas de señalización de las vías antes
señaladas, ejerciendo de esta manera su efecto transformante. En tal sentido, Ahmed y Col.
(1998) reportaron la participación directa de BCR/ABL en la vía de señalización de STAT, la
cual está involucrada en mecanismos de funcionalidad antiapoptóticos. En efecto, la quimera
BCR/ABL es capaz de activar a STAT, favoreciendo su entrada al núcleo y de esta manera
activando la transcripción de genes involucrados en la supresión de la apoptosis tales como cmyc, ciclina D1 y p21(waf). Otros mecanismos implicados en la inhibición de esta vía, han
sido vinculados a través de: a) la proteína quinasa (PKC), b) la vía de la interleuquina 3
(asociación física con su receptor) con activación de Jak2, c) desregulación de la expresión de
bcl-2 y aumento en la expresión de bcl-xl y d) el bloqueo directo de la liberación de citocromo
c desde la membrana interna de la mitocondria, siendo este último mecanismo el que impide la
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activación de las diferentes caspasas y en consecuencia el reconocimiento y excisión
(“cleavage”) de las proteínas que desencadenan la cascada de degradación nuclear y celular
(Ver figura 7) (Bedi y Col. 1994; Puil y Col. 1994; Chapman y Col 1995; Wilson-Rawls y Col
1996; Amarante-Mendes y Col 1998; Dubrez y Col 1998; Carlett-Falcone y Col 1999;
Jamieson y Col 1999; Di Bacco y Col 2000).
Figura 7. Esquema de algunas vías de señalización celular que pueden ser afectadas por la expresión del
híbrido BCR/ABL. Las vías involucradas en la apoptosis son resaltadas con flechas rojas. En la parte superior
se muestra la proteína BCR/ABL unida a los diferentes transductores de señales celulares. Las dos vías
principales de la apoptosis involucran a PI3-quinasa y a Ras, quienes coinciden en la cascada de AKT hasta
llegar a las proteínas de la mitocondria BCLXL y BCL2. Tomado de New England Journal of Medicine, 2.003.
4. Degradación de las proteínas inhibitorias de ABL mediada por proteosomas:
El cuarto y último mecanismo postulado en la transformación de las células de
pacientes con LMC es la degradación de proteínas que inhiben a ABL, vía proteosomaubiquitina. El sistema proteosoma-ubiquitina es el mayor sistema no lisosomal que permite
una rápida degradación y procesamiento de proteínas. Los principales sustratos de esta vía son
las proteínas regulatorias y los factores de transcripción. Diversos investigadores han
demostrado que el complejo proteosoma-ubiquitina es abundantemente expresado en las
células leucémicas y que además dicha expresión aumenta mucho más en el proceso de
transformación maligna de las células mononucleares. Dai y Col. (1998) demostraron que la
quimera BCR/ABL es capaz de inducir la degradación de las proteínas inhibitorias de ABL,
17
Abi-1 y Abi-2 en células Ph+, vía proteosomas. Este hecho, fue el primer indicio de que
muchas otras vías de señalización, además de las ya descritas, pueden ser afectadas por BCRABL en su efecto transformante (Shinohara y Col. 1996; Hershko, 1997; Zhang, y Col. 1999).
Tratamiento de la LMC.
El compendio de los descubrimientos hechos en la última década sobre la LMC, tanto
a nivel clínico como a nivel molecular, ha permitido evolucionar en modo progresivo y
eficiente en el tratamiento de las personas afectadas con esta patología (Wu 2003).
A principio de los años 50, los pacientes con LMC eran tratados solo con radioterapia
y compuestos químicos como, la ciclofosfamida, metrotexato, clorambucil y tiotepa entre
otros. Para 1957 se incluye el uso de busulfán en el tratamiento con quimioterapia, el cual fue
reforzado luego con la inclusión de la hidroxiurea (1964). Un año después se logró iniciar el
transplante de médula ósea alogénico, lo que amplió el espectro de tratamientos a usar,
aumentando el porcentaje de supervivencia de los pacientes que padecían de la enfermedad.
No obstante, fue en 1990 cuando Donnall Thomas (premio Nobel) logra el perfeccionamiento
del transplante de médula ósea antólogo, el cual aumentó aún más las posibilidades de
supervivencia. Más recientemente, también se logró la inclusión del interferón α (IFNα) en el
tratamiento con quimioterapia (ver figura 8).
Actualmente, todas estas modalidades terapéuticas se siguen empleando en el
tratamiento de la LMC, ya sean solas o en combinación, dependiendo de cada caso. Sin
embargo, estos tipos de tratamientos son muy tóxicos, comprometen las células sanas del
paciente y aunque pueden erradicar completamente la enfermedad no eliminan completamente
la posibilidad de que el paciente vuelva a recaer. En este sentido, es importante destacar que el
uso del interferón α (IFNα) marcó pauta en el tratamiento de la LMC debido su mediano nivel
de toxicidad con respecto a los métodos terapéuticos mencionados en párrafos anteriores.
Adicionalmente, su uso trajo nuevas esperanzas de cura y supervivencia para los pacientes
afectados, ya que en muchos casos se logró obtener no sólo una remisión clínico-
18
hematológica, sino que también algunos enfermos lograron alcanzar una conversión
citogenética (Ph-) de intensidad y duración variable (Rozman y Carreras 1995).
A
B
C
Figura 8. Representación de las tres primeras modalidades terapéuticas usadas para el tratamiento de la
LMC. A) Radioterapia para la eliminación de tumores. B) Quimioterapia con interferón α. C) Transplante de
Médula ósea (MO) alogénico, el número 1, en esta última gráfica, indica la recolección de la MO a partir de los
huesos de la cadera, el número 2 indica los componentes de la MO que son importantes para el transplante y el
número 3 indica el proceso de repoblación del receptor con la MO del donante. Tomado de:
http://www.cancerinfo.es/index.php?textoid=21&orden=12, http://www.brachiterapia.it/ita/ ht ml/carci.htm,
http://www.besthealth.com/besthealth/surgery/spanish/pages/100112.html,
http://www.Germe
sonline.com/catalog/41/594/115019/sell_arbutin.html, http://www.innovacionesleucemia.com/article 2.asp.
El IFNα es una glicoproteína producida por el organismo en respuesta a enfermedades
malignas. Este, junto con los INFβ, θ y τ conforman el grupo de los interferones tipo I, cuya
nomenclatura ha sido designada de acuerdo a la secuencia de los genes que los codifican. En
humanos hay al menos 18 genes no alélicos de IFNα, cuatro de los cuales son pseudogenes y
19
al menos 6 son genes no alélicos del IFNw. Con respecto a sus receptores, se sabe que en la
mayoría de las células los receptores de IFN existen en una densidad de 103 a 104 / célula. En
relación al mecanismo de acción del IFNα, se ha demostrado que tras la unión con su receptor,
el complejo IFN-receptor se interna en el citoplasma celular y una vez allí, da lugar a la
activación de enzimas ligadas al receptor (tirosinas quinasas - tyk 2, JAK1 y JAK2), las cuales
son capaces de fosforilar a las proteínas STAT 1a, STAT 1b y STAT 2, las cuales se unen
luego para formar el complejo ISGF3-a (ge factor-3 estimulado por IFN). Este complejo se
une entonces con la proteína citoplasmática p48 formando un complejo de cuatro moléculas
llamado ISGF3-g que se une en el núcleo a distintas regiones ISRE (IFN stimulated response
element), dando lugar a la transcripción de ISGs (IFN stimulated genes). Por último, como
resultado del proceso de traducción, se sintetizan numerosas proteínas con función protectora,
habiéndose descubierto hasta el momento más de 30, muchas de las cuales tienen un papel
esencial en la inhibición de la replicación. Una de estas enzimas es la proteína quinasa elF-2α, cuya forma activa fosforila forma parte del complejo iniciador de la traducción protéica. Tal
fosforilación bloquea entonces la construcción ulterior de la sub-unidad, deteniendo así la
síntesis proteica (la enzima es capaz de bloquear la síntesis proteica en células afectadas y no
en células sanas) (Fish y Col. 1999; Faderl y Kantarjian 2000; Faderl, 2004).
Desafortunadamente, con el paso del tiempo, el uso de IFNα en pacientes con LMC
trajo como consecuencia la aparición de pacientes resistentes a este tratamiento, mejor
conocidos como pacientes refractarios. Este hecho, estimuló la búsqueda de nuevos
tratamientos para los pacientes LMC, los cuales estuvieron enfocados principalmente (gracias
a los avances en los estudios moleculares de la quimera) a atacar la estructura y función de la
actividad tirosina-quinasa presente en BCR/ABL, la cual es causante de la enfermedad.
Tratamiento de la LMC con Imatinib.
Entre los años de 1995 y 1996, Druker y Col. reportaron la identificación del fármaco
STI571 derivado del 2-fenilamino pirimidina (formalmente conocido como CGP57148B,
ahora mencionado también como Imatinib mesylate; Gleevec® o Glivec® de Novartis), el cual
fue usado, en su primera fase de ensayo, en aquellos pacientes LMC resistentes al tratamiento
20
con INFα. Cincuenta y tres de 54 pacientes mostraron una respuesta hematológica completa
con 300mg de la droga, mientras que el 31% de estos pacientes mostró una respuesta
citogenética, con un 13% de respuesta completa. En vista de la fantástica respuesta al fármaco
se decidió luego ampliar el tratamiento a pacientes con LMC en crisis blástica mieloide o
linfoide y en pacientes con LLA Ph+, observándose un 11% de respuesta hematológica
completa en pacientes con crisis blástica mieloide y un 15% en los casos con enfermedad
linfoide (Schindler y Col. 2000; Wu 2003; Deininger y Col. 2005).
Imatinib es un compuesto químico que debido a su estructura es capaz de unirse
específicamente al sitio de unión del ATP en la quimera BCR/ABL. Adicionalmente, este
compuesto puede inhibir reversiblemente a c-ABL, PDGF-Rα- y β, proteína c-Kit y a la
proteína de fusión TEL-PDGF-R. La estructura cristalina del complejo Imatinib-quimera
reveló que Imatinib se inserta fuertemente en el dominio catalítico de la quimera BCR/ABL y
su grupo piridinil entra por debajo de la α-hélice en el lóbulo N-terminal de la quinasa. De
esta manera, el compuesto es enroscado al grupo amino secundario y queda fuertemente
unido a la región de activación del loop. Esta región, controla la actividad catalítica de muchas
quinasas por ser el interruptor entre los estados de activación e inactivación dependientes de
fosforilación. En quinasas altamente activas el loop es estabilizado en una conformación
abierta por fosforilación en sus residuos de serina, treonina y tirosina y en esta conformación,
la cadena β formada, proporciona la plataforma para la unión del sustrato (ver figura 9)
(Schindler y Col. 2000; Topaly y Col. 2001).
La selección de este inhibidor, entre muchos otros, para el tratamiento de la LMC
estuvo basada en dos hechos fundamentales: a) usado a concentraciones micromolares fue
capaz de provocar la remisión hematológica y citogenética completa de una gran cantidad de
pacientes, principalmente aquellos que se encontraban en la fase crónica (FC) de la
enfermedad y b) presentó un efecto tóxico muy bajo en el organismo en comparación con el
INFα, la radioterapia y la quimioterapia (Druker y Col. 2001; Sawyers y Col. 2002).
21
En la actualidad, aunque el Imatinib sigue siendo el medicamento más usado en el
tratamiento de la LMC, estudios recientes han reportado que pacientes con LMC en fase
acelerada, en crisis blástica o pacientes con LMA Ph+, pueden desarrollar resistencia contra
este fármaco. Este hecho ha traído como consecuencia la recaída de estos pacientes e incluso
su muerte (Gorre y Col. 2001; Shah y Col. 2002; Dai y Col. 2004; Yoshida y Melo 2004; Gu y
Col. 2005; Wolf y Col 2005).
Figura 9. Presentación farmacéutica del inhibidor Imatinib, modo de acción y su estructura química. A)
Presentación en capsulas de 400 mg del fármaco. B) a. Inhibición competitiva con el ATP por el dominio
22
tirosina quinasa de BCR/ABL. b. Estructura química del 2-fenilamino pirimidina. Tomado de
http://www.chem.uoa.gr/chemicals/chem_imatinib.htm; www.leucemie-espoir.org/spip/article2.html.
Resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes con LMC.
Dada la gran trascendencia que ha tenido el medicamento Imatinib en la recuperación
completa, sobrevivencia y calidad de vida de los pacientes con LMC, muchos investigadores
se han centrado en la búsqueda de la (s) causa (s) que origina (n) la resistencia a este
tratamiento.
Partiendo del hecho de que la alteración inicial de la supervivencia y la
regulación del ciclo celular inducida por BCR/ABL puede promover aberraciones
cromosomales y mutaciones adicionales, que amplifiquen la transformación mediada por
BCR/ABL, los investigadores han propuesto varios mecanismos que pudieran estar influyendo
en la resistencia a Imatinib. Estos son:
1) Sobre-expresión exacerbada de la quimera BCR/ABL.
2) Cambios en la expresión de genes involucrados en las diferentes vías de señalización
celular.
3). Presencia de mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera
BCR/ABL.
1. Sobre-expresión de la quimera BCR/ABL.
En el caso de la sobre-expresión de la quimera BCR/ABL, estudios in vitro con líneas
celulares resistentes al tratamiento con Imatinib mostraron amplificación en la expresión de la
quimera BCR/ABL en asociación con la sobre-expresión de la proteína (Mahon y Col 2000).
Por su parte, Gorre y Col. (2001) a través de estudios bioquímicos y análisis moleculares,
encontraron que en todos los pacientes analizados la resistencia a la droga estuvo asociada a la
reactivación de la transducción de señal de BCR/ABL y que en 6 de 11 pacientes la resistencia
estuvo asociada con la amplificación progresiva de la quimera BCR/ABL. Por otro lado,
Olavarria y Col. (2001), realizando en pacientes con enfermedad mínima residual
cuantificaciones de la quimera BCR/ABL por RT-PCR en Tiempo Real, también reportaron
que pacientes que sufrieron recaída presentaron altos niveles de la quimera. Así mismo,
Weisberg y Griffin (2000), usando las líneas celulares Ba/F3 y K562 y Keeshan y Col. (2001),
23
usando la línea celular 32D, evidenciaron que células con altos niveles de expresión de la
quimera fueron más resistentes al tratamiento en comparación con las que presentaron bajos
niveles de expresión. Los investigadores llegaron a la conclusión de que la sobre-expresión de
BCR/ABL en pacientes con LMC es el paso inicial en el reestablecimiento de la transducción
de señal que conduce a la resistencia del tratamiento con Imatinib (Le Coutre y Col. 2000;
Goldman y Melo 2001; Hochhaus y Col. 2001; Barnes y Col. 2005).
2. Modificación en la expresión de genes por BCR/ABL.
Con respecto a los cambios en la expresión de genes involucrados en las diferentes vías
de transducción de señal de la quimera BCB/ABL asociados a la resistencia del tratamiento
con Imatinib, ha sido sugerido que en etapas posteriores de la evolución de la LMC puede
ocurrir la sobre-expresión o sobre activación de quinasas que trabajan “aguas abajo” en las
cascadas de señalización activadas por BCR/ABL. En este sentido, los trabajos de Hofmann y
Col. (2002), usando análisis de expresión de genes por microarreglos, reportaron que el
mecanismo de resistencia al tratamiento con Imatinib es debido a la expresión de genes que
participan en las cascadas de señalización tomadas por la quimera para inducir su efecto
transformante. Ellos también analizaron pacientes con LMC y LLA con diferentes rangos de
respuesta al Imatinib y encontraron variaciones en la expresión de una gran cantidad de genes
para cada tipo de muestra (ver figura 10).
24
Figura 10. Identificación de genes que pueden ser usados para distinguir pacientes con LLA sensibles y
resistentes al tratamiento con Imatinib. Las muestras son listadas horizontalmente y los 95 genes son listados
verticalmente. S1-10 pacientes sensibles a Imatinib antes del tratamiento. R1-7 pacientes con resistencia
primaria antes del tratamiento. T1-8 casos resistentes en presencia de Imatinib. La intensidad de colores indica
los niveles de confianza de la expresión de los datos. Tomado de Hofmann y Col. 2002.
Por su parte, Salesse y Verfaillie (2003) usando técnicas de hibridización sustractiva,
“differential display”, y RTQ-PCR, demostraron que uno de los efectos transformantes de
BCR/ABL es inducir la disminución o aumento de la expresión de diversas moléculas que
participan en el control de la proliferación, diferenciación, bloqueo de la apoptosis y control de
la adhesión celular. Estas y otras investigaciones generaron un gran impacto en el estudio de la
resistencia al tratamiento que conllevó a la identificación de un inmenso número de genes
25
cuya expresión era alterada por la quimera BCR/ABL, utilizando principalmente técnicas
como los microarreglos y PCR en Tiempo Real y en el uso tanto de líneas celulares
establecidas (que expresan BCR/ABL) o células de pacientes con LMC. Es de interés
mencionar que en todos los casos analizados, la resistencia al tratamiento con Imatinib estuvo
relacionada principalmente con una recaída o con la evolución de la LMC a una fase acelerada
o de crisis blástica (Kaneta y Col. 2003; Dvorak y Col. 2003; Ohmine y Col. 2003; Hakansson
y Col. 2004; Radich y Col. 2006).
Todos estos hallazgos evidencian los diferentes mecanismos propuestos para ser
usados por la quimera BCR/ABL para inducir la resistencia al fármaco Imatinib, los cuales
han sido observados de forma única (Dai y Col. (2004) o en combinación (Gorre y Col.
(2001), dependiendo del tipo de mecanismo. Estos hechos muestran el carácter redundante de
las alteraciones celulares producidas por la quimera BCR/ABL.
Expresión del gen Lyn.
Uno de los genes que más ha llamado la atención en los estudios de modificación de la
expresión génica mediada por BCR/ABL es el gen Lyn, debido a que ha sido reportado en
diversos trabajos que su expresión se ve significativamente alterada en pacientes con LMC
que se encuentran en etapas avanzadas de la enfermedad y que presentan resistencia al
tratamiento con Imatinib (Baran y Col. 2003; Luciano y Col. 2003; Yu y Col. 2003; Dai y Col.
2004; Rodriguez y Col. 2004; Contri y Col. 2005; Jing y Col. 2005). Así mismo, el
descubrimiento de que la proteína LYN puede ser directamente activada por la quimera
BCR/ABL en ausencia de factores de crecimiento, ha aumentado mucho más la curiosidad con
respecto al papel que esta proteína puede cumplir en el efecto transformante de BCR/ABL en
pacientes con LMC (Torigoe y Col. 1992).
Estudios con líneas celulares con una alta resistencia al Imatinib, obtenidas a partir de
pacientes con LMC, demostraron que en estas células el crecimiento y la supervivencia no
estuvo mediado por una sobre-expresión de BCR/ABL (en este caso más bien se observó
disminución de su expresión) o por la presencia de mutaciones puntuales sino por la sobreexpresión y activación de las proteínas tirosina quinasa LYN y HCK, las cuales no fueron
26
inhibidas por Imatinib (Nimmanapalli y Col. 2001; Donato, y Col. 2003). Esta modificación
de la expresión y activación de LYN también ha sido reportada en estudios con las líneas
celulares K562 y LAMA84, también resistentes al tratamiento con Imatinib. En este caso, el
aumento de expresión y activación de LYN estuvo asociado a un aumento en la expresión de
la proteína anti-apoptótica Bcl-2, lo que induciría a pensar en un papel de LYN en la vía de la
apoptosis (Dai y Col. 2004).
Estudios citogenéticos y moleculares han revelado que el gen Lyn está ubicado en el
cromosoma 8 y transcribe un ARNm de 3.2Kb, el cual codifica para una proteína de 58.5 KDa
con actividad tipo tirosina-quinasa igual que c-ABL (Yamanashi y Col. 1987). A proteína
LYN presenta dos isoformas, p53 y p56, las cuales se forman como resultado de un “splicing”
alternativo del ARNm. La actividad catalítica de LYN es altamente regulada por fosforilación
en su residuo de tirosina en la posición 508 (Shangary y Col. 2003).
LYN ha sido involucrada en varias funciones celulares entre la cuales podemos
mencionar: su participación junto con FYN en una vía sinergística que regula la degranulación
de las células troncales (Parravicini y Col. 2002). También ha sido demostrada la participación
de LYN en los mecanismos de respuesta al estrés celular, por su unión directa a p53 a través
de su dominio SH3. Esta unión, al igual que ocurre con c-ABL, permite formar un complejo
estable que estimula la transcripción de genes en respuesta a daños en el ADN. Es bien
conocido que la activación final de p53 induce apoptosis celular y detiene el crecimiento
celular. Estos estudios también demuestran que LYN puede inducir la acumulación nuclear de
p53 ubiquitinizado, para inhibir su exportación al citoplasma celular (Ren y Col. 2000). Más
recientemente, LYN ha sido considerada como un componente importante en la transducción
de señal mediada por citoquinas en una gran variedad de tipos celulares y también se ha
reportado su rol clave en el crecimiento y la apoptosis de células hematopoyéticas (Donato, et
al. 2003). Evidencias obtenidas a partir de modelos murino y humano, sugieren que LYN es
un blanco importante “aguas abajo” de la señalización de BCR/ABL, más aún, ha sido
evidenciada la activación de LYN en células positivas para BCR/ABL obtenidas a partir de
pacientes con LMC en crisis blastica y en células leucémicas HL-60 transfectadas con
BCR/ABL. En conjunto, estos hallazgos han originado la posibilidad de que la activación de
27
LYN puede estar implicada en la función antiapoptótica de BCR/ABL, incluyendo aquellos
casos en los que la expresión de BCR/ABL es disminuida por cualquier otro factor (Dai y Col.
2004).
3. Mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera BCR/ABL.
Por último, con respecto a las mutaciones puntuales asociadas a la resistencia del
tratamiento con Imatinib, Gorre y Col (2001) también encontraron en su estudio que algunos
pacientes en crisis blástica, tanto linfoide como mieloide, presentaron la mutación puntual
Thr315Ile (C944T) relacionada con el puente de hidrógeno que une a la droga con la porción
ABL de la quimera. A partir de este descubrimiento se ha generado recientemente una amplia
lista de mutaciones puntuales que han sido encontradas en el dominio tirosina-quinasa de los
pacientes resistentes al Imatinib (Ver Tabla I). Es importante resaltar que la mayoría de estas
mutaciones han sido reportadas en pacientes con etapas avanzadas de la LMC o en pacientes
con LLA Ph+. Estos hallazgos permitieron inferir que la presencia de estas mutaciones causa
la pérdida de especificidad del Imatinib por el dominio tirosina-quinasa de BCR/ABL, no
permitiendo su inhibición. Para contrarrestar este efecto varias industrias farmacéuticas están
creando nuevos compuestos, que solos o en combinación con el Imatinib, puedan controlar el
efecto transformante de BCR/ABL. Los candidatos más resaltantes son: inhibidores farnesiltransferasa (SCH66336), inhibidor adafostin (NSC680410), inhibidor tirosina-quinasa de la
clase de las pidopirimidinas (PD166326), inhibidor del ciclo celular conocido como
flavopiridol (NSC649890) en combinación con inhibidores de las vías de señalización de
supervivencia como el bortezomib y los conocidos como los inhibidores de tirosina quinasa de
segunda generación Nilotinib (ANM107) y Desatinib, quienes presentan una potencia de
acción mayor (por un factor de 20 -50) con respecto a imatinib (Hoover y Col. 2002; RocheLestienne y Col. 2002; Branford y Col. 2003; Melo y Col. 2003; Dai y Col. 2004; Wolff y
Col. 2005; Kantarjian, y Col. 2006; Talpaz y Col. 2006 ; Guilhot y Col. 2007).
Tabla I. Mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL que han sido asociadas
con la resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes con LMC y LLA. (Tomado de Melo y Col. 2003).
28
Por otro lado, es interesante mencionar que varios de los investigadores antes
mencionados consideran que la fase inicial de una recaída en LMC, o el inicio de la resistencia
al tratamiento con Imatinib, involucra primero una sobre-expresión de BCR/ABL en aquellas
células que no fueron eliminadas por el tratamiento, las cuales posteriormente podrían adquirir
y acumular mutaciones puntuales que luego, cuando se inicia la recaída o resistencia, serían
capaces de ejercer el efecto inhibitorio de una manera independiente de la quimera (Barnes y
Col. 2005).
Otras modalidades de tratamiento para la LMC.
Es importante mencionar que actualmente están siendo desarrollados otros sistemas
para el tratamiento de pacientes con LMC. Entre estos podemos mencionar el uso de
oligonucleótidos antisentido (AS), ARN de interferencia (ARNi), ribozimas (ARN catalítico),
DNAzimas y fragmentos de BCR. Los tres primeros son capaces de unirse directamente sobre
29
el ARN, el cuarto sobre el ADN para poder ejercer su efecto y el último lo hace directamente
sobre la molécula BCR-ABL. No obstante, aún cuando estos sistemas son eficientes no han
logrado erradicar completamente la enfermedad debido a que no se ha podido obtener un alto
grado de especificidad en ninguno de los sistemas, tal como es el caso de los oligos antisentido
y las ribozimas (Buchdunger y Col. 1996; James y Gibson 1998; Galderisi y Col. 1999;
Kasper y Col. 1999; Clark. 2000).
Por último, debemos resaltar que el seguimiento del tratamiento de los pacientes que
padecen LMC dio un giro de 180 grados gracias al uso de técnicas, como la PCR en Tiempo
Real, la cual permite la cuantificación continua de la quimera BCR/ABL en pacientes que ya
han sido diagnosticados BCR/ABL positivos. Este hecho ha traído grandes avances en la
disminución de un gran número de pacientes en fase de crisis blástica, así como un monitoreo
más específico de los pacientes que se encuentran en fase crónica y fase acelerada (Kreuzer y
Col. 1999; Neumann y Col. 2003; Müller y Col. 2007).
Técnicas empleadas para el diagnóstico y clasificación de las leucemias.
En la actualidad, el diagnóstico y clasificación de las leucemias contempla una serie
de parámetros clínicos, bioquímicos y moleculares que permiten discernir, en el menor
tiempo posible y de una forma muy certera, el tipo de leucemia que padece una persona
favoreciendo así el tratamiento que se le debe aplicar. Estos estudios comprenden el
diagnóstico clínico de acuerdo a una sintomatología clínica específica, los estudios
morfológicos de las células del paciente (ver figura 11), siguiendo el acuerdo FAB (grupo de
cooperación Británico-Americano-Francés), los estudios citogenéticos, los estudios
inmunológicos y los estudios moleculares, siendo estos últimos los que han permitido
alcanzar una clasificación más precisa (Kersey 1997; Chomel y Col. 2000; Avisati y Col.
2001).
30
Figura 11. Identificación del los diferentes tipos de células inmaduras que pueden encontrarse en un
frotis sanguíneo de paciente con LMC. Las flechas rojas identifican los eritroblastos, metamielocitos, blastos
y mielocitos. Las células inmaduras corresponden a las de gran tamaño, con muchas granulaciones en su
interior y con una coloración púrpura. Tomado de www.leucemie-espoir.org/spip/article2.html.
Citogenética
Los estudios citogenéticos involucran principalmente la identificación de alteraciones
a nivel cromosómico. Estos incluyen: tamaño, número, presencia de translocaciones,
deleciones, inversiones, etc. La citogenética abarca una serie de técnicas de tinción y
fluorescencia que permiten ampliar el rango de diagnóstico, estas incluyen los cariotipos,
tinción de bandas G y más actualmente la técnica de hibridización in situ con fluorescencia
(FISH). El FISH permite la identificación de zonas específicas del ADN, incluso a nivel de
un solo gen. La técnica incluye la producción de sondas sintéticas que luego son conjugadas
a compuestos fluorescentes. Esta sonda es capaz luego de hibridar con secuencias diana en el
ADN de interés y emitir una fluorescencia específica que permite la identificación de los
genes en estudio (ver figura 12). Cabe destacar, que aún cuando estos estudios proporcionan
una información muy valiosa sobre las alteraciones cromosómicas, no cuentan con la
sensibilidad necesaria que permita el uso de poca cantidad de muestra, así como el gran
esfuerzo de laboratorio que hace falta para lograr buenos resultados (Faderl y Col. 1999; Di
bacco y Col. 2000; Melo 2003).
31
A
B
Figura 12. Ilustración representativa de un estudio citogenético con células de un paciente con LMC. A)
Cariotipo realizado con células en metafase de un paciente con LMC. Las flechas rojas indican la formación del
cromosoma Filadelfia en el par 22 y la formación de un cromosoma con mayor tamaño en el par 9. B)
identificación por FISH de la translocación BCR/ABL y de los genes abl y bcr en células en metafase de un
paciente con LMC. Tomado de www.leucemie-espoir.org/spip/article2.html.
Citometria de flujo
Por su parte, los estudios inmunológicos contemplan la identificación de proteínas
receptoras de membrana, citoplasmáticas y nucleares específicas (antígenos), las cuales son
detectadas con el uso de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos
específicos.
La citometría de flujo (CMF), es una técnica de análisis celular multiparamétrico
cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células)
alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada
célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la
célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en
señales electrónicas que posteriormente son digitalizadas para permitir la medida simultánea
de varios parámetros en una misma célula. (www.citometriadeflujo.com). Estos parámetros
son:
•
Parámetros relacionados con las características intrínsecas de la célula, como su
tamaño y la complejidad o granularidad de su núcleo y citoplasma.
32
•
Parámetros relacionados con características antigénicas de cada célula (conocido
como inmunofenotipo).
Las señales producidas por la interacción de las células con el haz de luz son de dos
tipos:
1. Señales de dispersión.
La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un
cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las
características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamentalmente: el
tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado
complejidad. En los Citómetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersión:
a.- La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la
dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al
tamaño de la partícula que produce la dispersión.
b.- La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la
complejidad de la estructura interna de la partícula.
2. Señales de Fluorescencia.
Un fluorocromo es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud
de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o
excitación es el intervalo sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es
el intervalo sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la
luz de excitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía
se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es
decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de
absorción y emisión se denomina “Stokes shift”. Los citómetros de flujo permiten detectar
señales de fluorescencia procedentes de los complejos Antígeno/Anticuerpo, marcados con un
fluorocromo, situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual
33
a la proporción de componentes fluorescentes de la partícula (Ver figura 13)
(www.citometriadeflujo.com).
A
B
C
Figura 13. Ilustración representativa del funcionamiento del citómetro de flujo. A) Cámara a través de la
cual se hace pasar la suspensión a estudiar, las células pasan una a una a través del dispositivo para poder ser
leídas por el láser. B) Señales de dispersión que permiten la identificación del tamaño y la granulosidad de cada
célula. C) Detección de la fluorescencia emitida por los anticuerpos monoclonales conjugados a fluorocromos.
Tomado de http://www.citometriadeflujo.com/HTML/fundamentos%20frame.htm
Actualmente, la CMF es una técnica que se aplica en la rutina diaria de muchos
laboratorios clínicos y de investigación y es capaz de proporcionar resultados de forma rápida
que pueden ser aplicables al diagnóstico. Gracias a su gran especificidad el citómetro puede
distinguir entre varias poblaciones celulares diferentes, y detectar una población celular en una
muestra en la que predominan otras poblaciones celulares.
Aún con toda su versatilidad, los estudios inmunológicos presentan ciertas limitantes
puesto que no pueden identificar las fases tempranas de algunas leucemias (tal como la LMC
en fase crónica y acelerada), pero su uso es indispensable en los diferentes centros de
34
diagnóstico porque permite identificar el tipo de linaje (mieloide o linfoide) en los casos de
LMC en fase de crisis blastica, lo cual ayuda a decidir el tratamiento más adecuado (Goldsby
y Col. 2000).
PCR en Tiempo Real.
En contraparte con las técnicas anteriores, los estudios moleculares, tales como RTPCR (“reverse transcription – polymerase chain reaction”) y más recientemente RT-PCR
Cuantitativa en Tiempo Real (RTQ-PCR), han marcado pauta en los estudios de diagnóstico
y seguimiento de la evolución de las leucemias. Estas técnicas pueden identificar en muy
corto tiempo no solo el tipo específico de leucemia que presenta el paciente, sino sus
variantes e incluso la respuesta que el paciente presenta ante un tratamiento dado o un
transplante de médula ósea. Las técnicas de RT-PCR y RTQ-PCR involucran la producción
de un ADN complementario a partir de un ARN mensajero molde proveniente de cada
paciente y su posterior amplificación empleando cebadores específicos para la identificación
de la alteración cromosomal distintiva de cada tipo de leucemia. Estas técnicas presentan una
mayor sensibilidad con respecto a las antes mencionadas gracias a que son capaces de
detectar una célula maligna entre 100.000 células normales y sólo necesitan una mínima
cantidad de muestra del paciente para dar resultados muy fidedignos (Deininger y Col.
2000; Goldman y Col. 2004).
En el caso particular de la RTQ-PCR, el producto obtenido puede ser visualizado y
cuantificado en el mismo momento en el que se está produciendo, todo esto a partir de la
presencia de un reportero fluorescente que se une o intercala en el ADNc obtenido de cada
muestra de paciente y emite una señal que aumenta de manera proporcional directa a la
cantidad de producto de PCR formado. Esta PCR combina el principio de fluorescencia con
una alta sensibilidad analítica y precisión, ofreciendo un rango de detección dinámico de 6 o
más órdenes de magnitud (Heid y Col. 1996).
En el mercado existe una gran variedad de sistemas de reporteros fluorescentes, entre
los que resaltan:
1. El sistema de detección por SYBR Green.
35
2. El sistema de detección por hibridización de sondas.
3. El sistema de detección por TaqMan.
1. El sistema de detección por “SYBR Green” consiste en la capacidad que tiene este
colorante para intercalarse en el surco menor de la molécula de ADN de doble cadena. Este
compuesto es agregado en la mezcla de reacción de PCR y su detección en el proceso de
amplificación es evidente solo cuando se han formado las cadenas dobles de ADN. La
desventaja de esta técnica de detección es que el “SYBR Green” es un agente fluorescente
que no es secuencia específico, es decir, que tanto las amplificaciones inespecíficas como los
dímeros de cebadores no pueden distinguirse del amplicón específico en estudio
(http://www.rapidcycler.com/lightcycler_u/lectures/quantification_on_lc.htm).
2. Por su parte, el sistema de detección por hibridización de sondas si permite la
detección de la amplificación de productos específicos. En él, dos sondas son producidas de
tal manera que puedan hibridizar una al lado de la otra en la cadena de ADN diana. La sonda
ubicada hacia el extremo 3` es marcada con fluoresceína, la cual actúa como un donador de
fluorescencia por transferencia de energía de resonancia (FRET), mientras que la sonda del
extremo 5` es marcada con un colorante aceptor. Cuando la reacción de amplificación se
inicia, la señal FRET es vista sólo cuando la taq polimerasa elimina ambas sondas de la
cadena de ADN que sirve como molde, liberando así la molécula fluorescente.
(http://www.rapidcycler.com/lightcycler_u/lectures/quantification_on_lc.htm)
3. Por último, el sistema de detección por sonda “TaqMan” consiste en la producción
de una sonda que, al igual que en el sistema 2, es capaz de hibridizar con una secuencia diana
en el ADN, pero en este caso la misma sonda lleva unida a ella la molécula de fluoresceína y
un “Quenching” que inhibe que la fluoresceína se active y emita fluorescencia. Cuando la
taq polimerasa, en su proceso de amplificación, hidroliza la sonda y elimina la inhibición que
ejerce el “Quenching” sobre la fluoresceína entonces ésta puede fluorescer (ver figura 14)
(http://www.rapidcycler.com/lightcycler_u/lectures/quantification_on_lc.htm).
36
Figura 14. Ilustración representativa del modo de acción de los tres sistemas de detección de la
amplificación por RTQ-PCR. 1) Sistema de detección con el colorante “SYBR Green”, representado en color
verde. 2) Sistema de detección con sondas de hibridización. La fluoresceína es identificada con el color verde
mientras que el colorante aceptor está representado en rojo. C) Sistema de detección con sondas TaqMan. La
fluoresceína es identificada con el color verde mientras que el “Quencher” está representado en rojo. Tomado
de http://www.rapidcycler.com/lightcycler_u/lectures/quantification_on_lc.htm.
Existen diferentes equipos diseñados para el proceso de RTQ-PCR, pero todos siguen
un mismo fundamento. El sistema del LightCycler es uno de los más usados en los estudios
de cuantificación de quimeras que causan leucemias, enfermedad residual y estudios de
expresión génica, ya que permite el análisis de una gran cantidad de muestras en un tiempo
muy corto. Este sistema trabaja con pequeños capilares de vidrio que admiten el cargado de
muy poco material de reacción (20 μl), lo cual reduce el costo de los reactivos y permite partir
de
muy
poca
cantidad
del
material
(http://www.idahotechnology.com/rapid/images/schematic.gif).
37
genético
a
estudiar
A
B
Figura 15. Ilustración representativa del sistema Light Cycler para amplificación por RTQ-PCR. A)
Equipo de LightCycler exponiendo el sistema de carrusel. B) Configuración interna del equipo mostrando cada
una de las cámaras y dispositivos. Tomado de http://www.idahotechnology.com/rapid/images/schematic.gif
La RTQ-PCR es una de las técnicas más usadas en el estudio de la expresión génica en
enfermedades como la leucemia. Esta permite hacer no sólo una cuantificación absoluta de la
muestra sino que también se pueden realizar análisis de expresión relativa con la inclusión de
un gen “housekeeping” (por ejemplo GAPDH), el cual sirve como marco de referencia en la
medición de la expresión de un gen en estudio (Towatari y Col. 1991; Sill y Col. 1995;
Canitrot y Col. 1999; Takeda y Col. 1999).
Con base en lo expuesto en párrafos anteriores, en el presente trabajo de investigación
se enfocaron los dos aspectos más resaltantes en el estudio de la LMC. El primero, en el que se
investigó todo lo relacionado con el diagnóstico molecular de esta patología y el segundo, en
el que se investigaron los tres mecanismos principales que han sido propuestos para adquirir
resistencia contra el tratamiento con Imatinib. Este trabajo es pionero en el reporte de una
estadística detallada de la frecuencia con que se presenta la LMC y sus variantes en los
principales centros de referencia del país, lo cual, a su vez, permitió hacer una extrapolación
38
de la situación a nivel nacional y con respecto a otros países. La estadística obtenida, también
permitió evidenciar la relación que pudiera tener la LMC con la edad y el sexo de los
pacientes venezolanos que la padecen.
Por último, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran la importancia que
tiene en nuestro país el esfuerzo combinado de grupos de trabajo multidisciplinarios,
constituidos por médicos especialistas en enfermedades hematoncológicas (como la LMC) e
investigadores en el área de la biología moleculares (Biólogos, Bioanalistas, etc), así como la
combinación de técnicas en la formación del engranaje perfecto de visión, experimentación y
discusión que conforman la maquinaria que trabaja en pro de una mayor y mejor comprensión
del comportamiento de estas patologías tanto en nuestra población como en el resto del
mundo.
39
JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DEL TEMA TRATADO
En general, las leucemias son patologías clínicas que afectan tanto a niños como a
adultos (principalmente a adultos) sin distinción de raza o género y se encuentran ampliamente
distribuidas a nivel mundial. En sus inicios, el diagnóstico de la leucemia era sinónimo de
muerte inminente, sin embargo con el paso de los años se han desarrollado diversos tipos de
tratamientos como la quimioterapia, radioterapia, transplante de médula ósea y otras como la
terapia génica, los cuales han permitido en algunos casos la erradicación completa de la
enfermedad y en otros han logrado al menos alargar mucho más el periodo de vida del
paciente con buena calidad de vida. (http://seer.cancer.gov/statfacts/).
Actualmente se cuenta con una clasificación bien detallada de todos los tipos de
leucemias (sus variantes y sus pronósticos) que han sido encontrados en diversos países. Sin
embargo, este conocimiento sólo ha sido útil para indicarnos cuan grave y complicadas son
estas alteraciones y de lo difícil que se hace conseguir una completa erradicación de las
mismas. (Goldsby y Col. 2000; Duncan, y Col. 2003; Melo y Col .2003)
Una de las leucemias que más ha llamado la atención en la comunidad mundial es la
leucemia mieloide crónica o LMC, debido a que esta alteración es una de las más frecuentes
entre los pacientes que visitan los diferentes centros de diagnóstico a nivel mundial. Por si esto
fuera poco, la LMC es inducida por una translocación que ocasionalmente es encontrada en
leucemias como la LLA y tiene efectos de mal pronóstico tanto en niños como en adultos
(Deininger y Col. 2003).
En países desarrollados como Estados Unidos, aproximadamente 4.500 nuevos casos
de LMC son diagnosticados cada año (Mow et al. 2002). En los países europeos las
estadísticas para LMC y otros tipos de leucemias son muy similares, razón por la cual en la
actualidad se están realizando diversos estudios para determinar la frecuencia y prevalencia de
estas en las diferentes poblaciones así como su tratamiento.
39
En el caso particular de Venezuela, el diagnóstico molecular de la LMC se realizaba
inicialmente en un solo centro de referencia a nivel nacional (Banco Municipal de Sangre,
BMS), el cual está a cargo del Doctor José Luís López. Más recientemente, se han
desarrollado otros dos centros de diagnóstico, pero éstos son privados, no son considerados
centros de referencia nacional y el costo por del diagnóstico molecular es elevado.
Aunque en el centro de referencia BMS no se disponen de datos estadísticos que
permitan hacer un estimado de la frecuencia con la que se presentan los casos de LMC, se sabe
(Dr. José Luís López, comunicación personal) que aproximadamente un promedio de 600
pacientes anuales llegan a este centro y que un buen porcentaje de ellos son diagnosticados
como LMC. Si a este número se le adicionan los casos atendidos por los centros privados y el
considerable número de personas del interior del país con bajos recursos económicos y escasa
posibilidad de traslado a estos centros, se podría obtener un valor estadístico de frecuencia de
la enfermedad en Venezuela cercanos a los reportados por otros países en relación con su
número total de habitantes.
En vista de las observaciones anteriores, las leucemias han sido catalogadas como un
problema importante de salud pública a nivel nacional. Este hecho ha traído como
consecuencia la unión de varios investigadores y médicos especialistas del área para tratar de
buscar soluciones concretas que permitan controlar la situación. El proyecto de grupo
FONACIT G-2001000784 involucra dos centros clínicos (Banco Municipal de Sangre, (BMS)
y el Hospital Dr. Miguel Pérez Carreño (HPC)) y dos centros de investigación (Universidad
Simón Bolívar (USB) y el Instituto de Estudios avanzados (IDEA)). Este proyecto, tiene su
centro piloto en la USB y su objetivo fundamental fue la estandarización y puesta en
funcionamiento de diversas técnicas moleculares para ser empleadas en el diagnóstico de la
LMC y otros tipos de leucemias. Este diagnóstico se hace en forma gratuita y permite realizar
el diagnóstico inicial y el seguimiento de pacientes en tratamiento con Imatinib o posterior a
un transplante alogénico de médula ósea. Adicionalmente incluye la preparación de personal
capacitado para trabajar en esta área, así como la capacitación de nuevos centros a nivel
nacional, de tal manera que el país pueda contar con varios centros de referencias de
diagnóstico y seguimiento de las leucemias.
40
Con base en la importancia vital que tiene este tipo de investigación para la salud de
nuestra nación, la realización de esta tesis Doctoral es considerada una pieza fundamental en
el inicio, desarrollo y consolidación de este nuevo centro de referencia nacional, pues ésta
pretende establecer la estandarización de las principales técnicas moleculares de diagnóstico
de la LMC y realizar el diagnóstico molecular de un número significativo de pacientes que
permita hacer por primera vez la detección de la frecuencia de esta patología en nuestro país.
Posteriormente, con el fin de establecer el estatus de nuestros pacientes en cuanto a la
respuesta al tratamiento que actualmente se está empleando para atacar la LMC y los posibles
factores moleculares que pudieran estar influyendo en el desarrollo de resistencia contra este
tratamiento, también se pretende realizar estudios de análisis de secuencias, estudio expresión
génica, detección de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de la proteína
quimérica y persistencia en la expresión del distintivo molecular de esta enfermedad.
Adicionalmente, se implementará el uso de paneles de diagnóstico no sólo para la LMC sino
para otras leucemias cuya frecuencia de aparición sea cercana a la de la LMC. Esta tesis
servirá como prototipo en la realización de nuevos trabajos de investigación relacionados con
el diagnóstico y tratamiento de otros tipos de leucemia, tales como la LMA, LLC, LLA y
linfomas.
41
OBJETIVOS
Objetivo General:
Estudio molecular de la translocación BCR/ABL en pacientes Venezolanos con
leucemia mieloide crónica LMC.
Objetivos específicos:
1.- Determinación de la presencia de la translocación BCR/ABL, vinculada al subtipo
de leucemia mieloide crónica (LMC), en pacientes leucémicos y controles mediante las
técnicas de extracción de ARN, RT-PCR y Northern Blot.
2.- Clonamiento de los diferentes productos de la fusión BCR/ABL encontrados en los
pacientes leucémicos.
3.- Secuenciación de los diferentes productos de interés de la fusión BCR/ABL
encontrados en los pacientes leucémicos y comparación de los mismos con los
reportados en la bibliografía.
4.- Elaboración de sondas de ADNc enriquecidas a partir de pacientes LMC y
controles para monitorear, mediante la técnica de “screening” diferencial con librería
de ADNc, cambios de expresión génica en genes claves relacionados con el desarrollo,
evolución y resistencia al tratamiento de la patología LMC.
5.- Elaboración de arreglos de membrana de ADNc humanos específicos, basados en
los reportes internacionales, para ser hibridizados con sondas de ADNc de pacientes
con LMC y controles que permitan identificar genes involucrados en el desarrollo,
evolución y resistencia al tratamiento de la LMC.
42
6.- Determinación de la frecuencia de la translocación BCR/ABL en pacientes LMC
Venezolanos.
Nota importante:
Es imprescindible aclarar que en este trabajo fue necesario modificar tanto de la última
actividad planteada en el objetivo 1 (Northern Blot), como de los objetivos 4 y 5 de la tesis.
Todas las modificaciones estuvieron fundamentadas en el hecho de que aún cuando
este trabajo estuvo financiado por un proyecto de grupo aprobado por el FONACIT, la entrega
de los recursos financieros sufrió retardos, lo cual alteró el cumplimento de algunos de sus
objetivos. Adicional a esto, estuvo el dramático hecho de que todos los pedidos de reactivos y
principalmente de equipos necesarios para su realización fueron detenidos o retardados por el
problema del paro petrolero que hubo en el país. Con respecto a la realización del Northern
Blot, el empleo de está técnica no fue necesario debido a que obtuvimos muy buenos
resultados con la RT-PCR en la identificación de la translocación y sus variantes y a que las
secuenciaciones manuales y automáticas permitieron obtener resultados completamente
satisfactorios.
Con respecto a los objetivos 4 y 5, que involucran el uso de técnicas para estudios de
expresión génica relacionados con el desarrollo, evolución y resistencia al tratamiento de la
LMC, fue necesario introducir cambios en las técnicas propuestas, incorporando el uso de la
técnica de RTQ-PCR debido a que los equipos y reactivos necesarios para el logro de estos
objetivos llegaron hace tan solo 10 meses a Venezuela. En todo caso, el cambio resultó
favorable debido a que la RTQ-PCR es una técnica más actual y con mayor sensibilidad en
este tipo de estudios.
Por otro lado, también se decidió incluir un estudio de mutaciones puntuales en el
dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL en los pacientes analizados con el fin de
completar, en conjunto con el Dr. José Luís López, el estudio de los tres posibles mecanismos
43
que podrían ser responsables de la resistencia al tratamiento con Imatinibib observada en
pacientes venezolanos con LMC.
Adicionalmente, se debe mencionar que también se decidióincluir en este estudio la
técnica de citometría de flujo en el diagnóstico de algunos casos de LMC ya que es una
técnica ampliamente usada para el diagnóstico inicial de este y otros tipos de leucemias, lo que
permitió hacer un análisis comparativo con las técnicas moleculares durante el estudio.
Por último, este estudio se incluyó como un objetivo adicional de gran utilidad, la
creación de un panel diagnóstico en donde además de la detección de BCR/ABL para el
diagnóstico de LMC o LLA, también se incluyeron otros tipos de translocaciones vinculadas a
otras leucemias. Este aporte permite mejorar las expectativas de la comunidad que sufre de
este tipo de problemas, y permite a su vez facilitar el trabajo de los médicos a través un
diagnóstico más completo.
44
METODOLOGÍA
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA QUIMERA BCR/ABL
Obtención de las muestras:
En el presente estudio se evaluaron 297 muestras de pacientes con diagnóstico de
leucemia referidos por el Banco Municipal de Sangre de Caracas y Hospital Miguel Pérez
Carreño, con edades comprendidas entre 0 meses y 90 años, abarcando ambos géneros. La
selección de los pacientes sospechosos de LMC, a ser confirmados mediante ensayos
moleculares en el Laboratorio de Genética Molecular Humana de la Universidad Simón
Bolívar, se hizo sobre la base de estudios clínicos, morfológicos y citoquímicos . Se
procesaron muestras a partir de aspirados de médula ósea (MO) por punción directa y sangre
periférica (SP). También se tomaron muestras de personas que no presentaron ninguna
manifestación clínica de LMC, con el fin de usarlos como controles negativos durante los
ensayos. Todas las muestras fueron almacenadas en tubos con K3EDTA, mantenidas a
temperatura ambiente y procesadas el mismo día en que fueron recolectadas. Todas las
muestras fueron tomadas bajo previo consentimiento informado (Anexo E).
Extracción de ARN total.
Obtención de células mononucleares (Gradiente de Ficoll).
Por cada 3 ml de muestra se agregaron 3 ml de Ficoll y se centrifugó por 30 min. a
1.500 rpm. De las tres fases formadas, se tomó la capa intermedia que contenía las células
blancas mononucleares y se colocó en un tubo eppendorf estéril. Posteriormente, las muestras
se centrifugaron por 3 min. a 3.000 rpm. y el sedimento producido fue usado para la
extracción del ARN total (ARNt).
Extracción de ARN total. Protocolo A. (Modificado de Chomczynski & Sacchi. 1986).
El pellet obtenido por gradiente de Ficoll se homogeneizó con 1 ml de solución
desnaturalizante (citrato de sodio 0.75 M, sarkosyl al 10%, 250g de guanidina isotiocianato, y
45
antes de su uso se le agregó 0.35 ml de 2-mercaptoetanol) y se dejó reposar por 5 min. a
temperatura ambiente. Luego se procedió a agregar secuencialmente al homogenato 0,1 ml de
acetato de sodio 2M a pH 4, 1 ml de fenol saturado en agua y 0,2 ml de cloroformo-alcohol
isoamílico (49:1) (se mezcló suavemente). La suspensión se agitó vigorosamente por 10 seg. y
se incubó en hielo por 15 min. Las muestras se centrifugaron a 11.000 rpm por 20 min. a 4°C
y se tomó la fase acuosa. Esta fase se transfirió a un tubo nuevo, estéril y libre de ARNasa y se
mezcló por inversión con 1 ml de isopropanol, posteriormente se colocó a -20°C por 1 hora.
Los tubos fueron luego centrifugados a 11.000 rpm. a 4°C por 20 min. y el pellet fue
resuspendido en 0,3 ml de solución desnaturalizante. Por último, se hizo una reprecipitación
con 1 volumen de isopropanol y se colocó a -20°C por 1 hora, se centrifugó a 11.000 rpm por
10 min. y luego el pellet fue resuspendido en 0,3 ml de etanol frió al 75% con agua tratada
con DEPC, se agitó suavemente para permitir el lavado del pellet y se centrifugó a 7.500 rpm.
por 5 min. Posteriormente se descartó el sobrenadante y el ARNt (pellet) se dejó secar
invirtiendo el eppendorf en un papel absorbente nuevo por aproximadamente 30 min. El ARN
obtenido se resuspendió en 40 μl de H2O tratada con DEPC mezclando suavemente y fue
almacenado a -80 °C hasta su uso.
Extracción de ARN total. Protocolo B. (kit con Trizol).
El pellet obtenido por gradiente de Ficoll se homogeneizó con 1 ml de Trizol®Reagent
(Invitrogen), la mezcla se pasó a través de una jeringa de 5 ml (8-10 veces) y se incubó a
temperatura ambiente por 5 min. Posteriormente se le agregó 200 μl de cloroformo, se mezcló
por inversión y se dejó reposar 5 min. a temperatura ambiente. Luego, se centrifugó a 14.000
rpm. a 4 ºC por 15 min., y se tomó la fase acuosa a la cual se le añadió igual volumen de
isopropanol, para la precipitación se mezcló por inversión y se dejó reposar por 15 min. a 4 ºC.
Por último, se centrifugó a 14.000 rpm por 15 min. a 4 ºC, descartándose el sobrenadante. El
pellet de ARNt obtenido fue lavado con 1 ml de etanol al 75% frío, se centrifugó durante 5
min. a 7.500 rpm a 4 ºC y posteriormente el pellet se secó por inversión del eppendorf sobre
papel absorbente durante unos 20 min. El ARNt se resuspendió en 40 μl de agua libre de
ARNasa.
46
Determinación de la concentración y calidad del ARNt.
La concentración del ARNt fue determinada por cuantificación espectrofotométrica
(260/280) y su calidad fue visualizada en un gel de agarosa al 1% (MOPS 1X y formaldehído
37%) como lo describe Ausubel y col. (1995). La corrida electroforética se llevó a cabo en una
cámara horizontal libre de ARNasa “Easy CastTM” a un voltaje de 100 V. Los geles fueron
fotografiados empleando el sistema Gel Doc 2000TM Gel Documentation System, PC, 220-240
V, CCIR y el software del equipo Quantity One 4.2.1 de BIO RAD.
Transcripción Inversa – Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR).
Transcripción inversa (RT).
La síntesis de ADN complementario (ADNc) se realizó en un volumen final de 30 μl,
preparada en dos etapas. En la primera parte se preparó una mezcla que contuvo: 5 μl de la
muestra de ARNt (0.5-1 μg), 1 μl de oligo RP (“Random Primer”) (100 ng/μl), 4 μl de Buffer
5X, 11 μl de agua tratada con DEPC. Posteriormente se incubó a 68 ºC por 3 min. y se dejó 5
min. a temperatura ambiente. En la segunda etapa se agregó a la primera mezcla: 0,5 μl
ARNasin Inhibitor (Promega), 1 μl de dNTP`s 10 mM, 2 μl de MgCl2 25 mM, 4,5 μl de agua
tratada con DEPC y 1 μl de la enzima M-MVL transcriptasa inversa (Invitrogen). El tubo se
incubó a 37 ºC por 1 hora para permitir la acción de la enzima y luego se desnaturalizó a 95 ºC
por 2 min. El ADNc obtenido se almacenó a -20 ºC hasta su uso en los posteriores análisis.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Para una reacción de PCR de 20 μl se mezclaron: 6.3 μl de agua Millipore, 2 μl de
dNTP`s (2 mM), 2 μl de buffer 10X, 1.5 μl del cebador sentido B2B (10 pmol/ μl), 1.5 μl del
cebador antisentido CA3- (10 pmol/ μl), 1.6 μl de MgCl2 25 mM, 0.1 μl de taq polimerasa y 5
μl del ADNc. La PCR se realizó en dos tipos de termocicladores, el Rapid Cycler de Idaho
Technology (RC) y el MiniCycler de JM research (MC). Los programas empleados en cada
uno de los termocicladores fueron: (RC) un ciclo de 94 ºC 3 min., 35 ciclos de: 94 ºC 10 seg.,
55 ºC 10 seg., 72 ºC 30 seg., un ciclo de 72 ºC 3 min. (MC) un ciclo de 94 ºC 5 min., 35 ciclos
de: 94 ºC 1 min., 55 ºC 1 min., 72 ºC 50 seg., un ciclo de 72 ºC 10 min. y 4 ºC 5 min. Los
cebadores y tamaños esperados para cada variante están detallados en la Tabla II.
47
Tabla II. Secuencia de cebadores empleados en la amplificación de las diferentes variantes de la translocación
BCR/ABL y del control interno BCR en pacientes con LMC. Los tamaños esperados para cada producto, así
como la temperatura de “annealing” fueron tomados de Cross y Col. 1994.
Tipo de estudio
Variantes
Secuencia de Cebadores
Tamaño
del Producto
Temperatura
de Annealing
Translocación
BCR/ABL
b2a2
b3a2
e1a2
B2B:
CA3-:
TGTTGACTGGCGTGATGTAGTTGCTTGG
B2B:
CA3-:
TGTTGACTGGCGTGATGTAGTTGCTTGG
BCR-C:
CA3-:
TGTTGACTGGCGTGATGTAGTTGCTTGG
ACAGAATTCGCTGACCATCAATAAG
ACAGAATTCGCTGACCATCAATAAG
ACCGCATGTTCCGGGACAAAAG
310 pb
385 pb
55°C
481 pb
Control interno
BCR
Gen
bcr
B2B:
C5e-:
ACAGAATTCGCTGACCATCAATAAG
808 pb
55°C
ATAGGATCCTTTGCAACCGGGTCTGAA
La figura 16 (Panel A) ilustra la localización donde están alineados los cebadores
usados en este trabajo sobre los genes bcr y abl y sobre las secuencias hibridas producidas una
vez ocurrida la translocación, figura 16 (Panel B). Adicionalmente se ilustran los diferentes
puntos de corte, correspondientes a las variantes p210 (b2a2 y b3a2) y p190 (e1a2), así como
los tamaños esperados para cada una. Por su parte, en la figura 17 es posible apreciar con
mucho mas detalle las secuencias de las tres variantes reportadas (b2a2 b3a2 y e1a2),
resaltándose la posición de los cebadores usados para su detección por PCR, los puntos de
corte reportados para cada una de las variantes, y las secuencias de ambos genes cercanas al
punto de unión de la translocación involucrada, respectivamente.
48
Figura 16. Esquema ilustrativo de la posición de los cebadores en los genes bcr y abl (Panel A) y en las
variantes b2a2, b3a2 y e1a2 (Panel B). La barra de color amarillo representa al gen bcr y la barra roja
representa al gen abl. Las flechas amarillas indican la zona de unión de los diferentes cebadores en bcr y las
flechas rojas indican la región donde se unen los cebadores en abl, la dirección de cada una de las flechas indican
los cebadores. BCR-C, B2B, C5e, y CA3 son los nombres que reciben los diferentes cebadores sentidos y
antisentidos. Los números con la línea blanca indican los tamaños esperados con cada juego de cebador para cada
variante. Tomado de http://www.compgene.com/bcrabl.htm
A. b2a2
1
81
161
241
321
401
481
561
641
721
801
881
gcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcc
cagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagt
ggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgacc
aactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagaagcccttcagcggccagtagc
atctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaa
atgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaag
ctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaa
ctacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgc
tgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatac
gaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacac
cctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgca
acaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagt
B. b3a2
1
81
161
241
gcgaacaagggcagcaaagctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcc
cagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagt
ggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgacc
aactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctcta
49
321
401
481
561
641
721
801
881
961
tgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctg
actttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgac
cccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccg
ggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactaca
tcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagc
agcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagg
gagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctgg
ccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaag
cccactgtctatggtgtgtcccctaactacgacaagt
C. e1a2
1
81
161
241
321
401
481
561
641
721
801
881
961
gtaccagccctaccagagcatctacgtcgggggcatgatggaaggggagggcaagggcccgctcctgcgcagccagagca
cctctgagcaggagaagcgccttacctggccccgcaggtcctactccccccggagttttgaggattgcggaggcggctat
accccggactgcagctccaatgagaacctcacctccagcgaggaggacttctcctctggccagtccagccgcgtgtcccc
aagccccaccacctaccgcatgttccgggacaaaagccgctctccctcgcagaactcgcaacagtccttcgacagcagca
gtccccccacgccgcagtgccataagcggcaccggcactgcccggttgtcgtgtccgaggccaccatcgtgggcgtccgc
aagaccgggcagatctggcccaacgatggcgagggcgccttccatggagacgcagaagcccttcagcggccagtagcatc
tgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatg
accccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctc
cgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtccaagcaactac
atcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgag
cagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaag
ggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctg
gccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaa
Figura 17. Secuencias de las variantes b2a2 (Panel A), b3a2 (Panel B) y e1a2 (Panel C) correspondientes a
los diferentes puntos de corte del híbrido BCR/ABL. En violeta y amarillo se señalan las secuencias donde se
unen los cebadores. En verde se señalan las secuencias correspondientes a las regiones del gen bcr y en azul se
señalan las secuencias correspondientes a las regiones del gen abl involucradas en la amplificación por PCR.
Una vez obtenidos los productos amplificados por PCR, estos fueron analizados en
geles de agarosa al 1,5% utilizando como buffer de corrida TAE 1X (Tris Base 2M, Ácido
Acético Glacial 5,71%, EDTA 0,05 M pH 8). La corrida electroforética se llevó a cabo en una
cámara horizontal “Easy CastTM” con un voltaje de 100 V y tiempo de corrida de 15 min. La
visualización de las bandas se hizo empleando un transiluminador de luz ultravioleta DyNA
Light Dual Intensity UV Transiluminator. Los geles fueron fotografiados en un equipo Gel
Doc 2000TM “Gel Documentation System”, PC, 220-240 V y analizados por el uso del
software Quantity One 4.2.1 de Biorad.
Clonación de las variantes de BCR/ABL
Una vez detectadas como positivas, mediante RT-PCR, para algunas de las variantes
(p210: b2a2/b3a2 y p190: e1a2) reportadas para BCR/ABL, 10 muestras (13, 20, 54, 69, 88, 89,
108, 112, 130 y 139) de pacientes venezolanos con LMC fueron clonadas (ver Anexo A) con
el propósito de facilitar ensayos posteriores y preservar estas muestras como controles
positivos en el laboratorio. Entre los ensayos posteriores destacó el obtener las secuencias
respectivas y realizar los análisis para confirmar tanto los puntos de fusión de las diferentes
50
variantes analizadas con respecto a las secuencias reportadas en la literatura, como la aparición
de mutaciones no reportadas en los híbridos analizados.
Preparación de células competentes.
Una colonia de células DH5α fue inoculada en 5 ml de caldo LB (Luria-Bertani. Por
cada litro: Bacto triptona 20 gr/Extracto de Bacto Levadura 5 gr/ NaCl 8.58 gr) e incubada
durante 12-14 horas a 37 ºC con agitación constante. Posteriormente 2 ml del caldo crecido
fueron usados para inocular 50 ml de medio (LB) e incubado a 37 ºC con agitación constante
hasta alcanzar una densidad óptica de 0,3 a 550 nm (~ 5 X 107 células/ml), aproximadamente
2-3 horas de incubación. El cultivo celular fue separado en dos tubos Corex estériles, enfriado
en hielo por 10 min. y centrifugado durante 15 min. a 750-1000 g. a 4 ºC.
El pellet fue resuspendido en 1/3 del volumen del buffer de transformación CCMB 80
frío (CaCl2.2H2O 80 mM, MnCl2.4H2O 20 mM MgCl2.6H2O 10 mM, acetato de potasio 1M,
pH 7 1%, Glicerol 10%) por 20 min. y reposado en hielo. La suspensión se centrifugó por 10
min. a 750-1000 g a 4 ºC. El pellet obtenido se resuspendió nuevamente en 1:12 del buffer
CCMB 80 y posteriormente alicuotado en volúmenes de 200 μl. Las células
fueron
almacenadas a -70ºC hasta su uso.
Ligación.
Los productos de la PCR fueron ligados al vector pGEM-T Easy, Promega. Este vector
es preparado cortándolo con la enzima de restricción EcoRV y posteriormente agregada una
timina al extremo 3’ de ambos extremos del vector. Estos extremos del vector mejoran
significativamente su ligación a un producto de la PCR, ya que por una parte evita la recircularización del vector y lo más importante permite exponer una terminación compatible
con los extremos de los productos de la PCR, en los cuales usualmente las polimerasas
termoestables, usadas de rutina, agregan una base nucleotídica de más en el extremo 3’
(usualmente adenina) de todos los fragmentos que se encuentran en forma “romo/blunt”, lo
cual es independiente del templado que se está amplificando (Anexo B).
51
La ligación del producto BCR/ABL al plásmido se realizó usando 5 µl del Buffer
“Rapid Ligation” 2X, 0,5 µl del vector pGEM-T Easy (50 ng), 3,5 µl del producto de PCR y 1
µl T4 DNA ligasa. La mezcla de reacción obtenida (10 μl) fue agitada cuidadosamente se dejó
a temperatura ambiente 1 hora y luego se dejó a 4 ºC toda la noche y hasta el momento de su
uso.
Transformación.
Para la reacción de transformación de los productos BCR/ABL ligados al vector
pGEM-T Easy, se tomaron 200 μl de células DH5α competentes (preparadas previamente) a
las cuales se les agregó 4 μl de la reacción de ligación. Se dejaron en hielo durante 30 min., se
provocó un choque térmico a 42 ºC por 2 min., posteriormente se agregó 1 ml del caldo LB y
se incubó durante 1 hora a 37 ºC. La mezcla de transformación fue luego centrifugada por 5
min. a 5.000 rpm y el pellet fue resuspendido cuidadosamente en 200 μl de caldo LB +
ampicilina (100 µg/ml). En paralelo con la transformación de los plásmidos contentivos de las
secuencias clonadas, también se hizo la transformación del plásmido pBS/SK, el cual fue
usado como control positivo de transformación bacteriana.
Cuatro placas fueron sembradas de la siguiente manera: a) LB agar y 100 μl de DH5α
(control bacterias), b) LB agar, Ampicilina (Amp.), IPTG (isopropil-β-D-tiogalaptopiranoside)
y X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranoside) y 100 μl de DH5α transfectadas
con PBS/SK (control de transformación), c) una tercera placa preparada igual a la segunda
pero donde sólo se sembraron 100 μl de DH5α competentes (control del inserto) y d) una
última placa preparada igual que la segunda pero sembrada con 100 μl de los productos de la
ligación.
A
B
C
D
Control bacterial
Control de
Control de Cel
Transformación con
sin transformar
Transformación
Competentes.
DH5α+ p-GEM+PCR
52
Las placas se incubaron a 37 ºC por aproximadamente 15 horas y se seleccionaron sólo
las colonias blancas para el posterior análisis de confirmación del clonaje mediante minipreparaciones (Miniprep). Las colonias blancas se sembraron por separado en tubos con 2 ml
de suspensión LB y ampicilina y se dejaron en incubación toda la noche a 37 ºC con agitación
constante.
Extracción y purificación del ADN plasmídico (Mini-prep).
Para una reacción típica de miniprep se tomaron 1,5 ml del medio crecido con las
colonias recombinantes, se centrífugó por 1 min. a 12.000 rpm y al pellet se le agregaron 100
μl de la sol I (resuspensión) de mini-prep (50 mM de glucosa, 25 mM de Tris-HCL pH 8, 10
mM de EDTA pH 8). Se agitó el tubo suavemente con los dedos hasta lograr su completa
resuspensión. A esta suspensión se le colocaron luego 200 μl de sol. II (lísis) de mini-prep (0.2
N de NaOH y 1% de SDS), la cual se agitó suavemente hasta lograr la ruptura de las células
(formación de una solución muy densa), y posteriormente se le agregó 150 μl de sol III
(neutralización) de mini-prep (5 M de acetato de potasio y ácido acético glacial), con
agitación suave nuevamente. A la mezcla obtenida se le agregaron 450 μl de fenol, se agitó
por inversión, se centrifugó durante 5 min. a 12.000 rpm y la fase acuosa obtenida fue
transferida a un tubo eppendorf nuevo donde se le añadieron 900 μl (2 ½ vol) de etanol
absoluto (99.8 %) . Esta fase se dejó precipitar por 1 hora a -20 ºC, se centrifugó por 20 min. a
12.000 rpm, el pellet se lavó con 1 ml etanol al 70 %, se centrifugó 10 min. a 12.000 rpm y se
dejó secar a 37 ºC hasta permitir descartar el etanol. El pellet obtenido se resuspendió luego en
30 μl de H2O millipore, se le agregó 1 μl de ARNasa por 1 h a 37ºC con agitación frecuente y
se almacenó a 4 ºC. Dos microlitros del producto de la mini-prep fueron corridos en un gel de
agarosa al 0.8% a 80 V.
Digestión del ADN plasmídico con enzimas de restricción (endonucleasas).
53
Para evaluar la presencia del inserto BCR/ABL dentro del plásmido purificado a partir
de los clones seleccionados, se realizó un análisis de restricción. Usualmente, la reacción de
digestión contenida en 10 μl estuvo compuesta de: 2 μl del ADN plasmídico purificado, 1 μl
de la enzima de restricción Eco RI, 1 μl de Buffer 10X de la enzima y 6 μl de H2O Millipore
estéril. Esta reacción se incubó luego a 37 ºC por 2 horas y se colocó en hielo. Los productos
de la digestión fueron corridos en un gel de agarosa al 1,5 % junto con un marcador de peso
molecular y el plásmido purificado sin digerir.
Secuenciación manual y automática de los productos BCR/ABL.
Para las reacciones de secuenciación manual y automática se emplearon tanto
productos de PCR directos como clones con los insertos correspondientes.
Purificación de los productos de la PCR.
Los productos de la PCR de cada paciente, fueron corridos en geles de agarosa al 1,5%
y las bandas correspondientes a las variantes BCR/ABL fueron cortadas y colocadas en
eppendorf de 1,5 ml identificados. Se emplearon dos métodos de purificación:
Método A: Purificación por esferas de vidrio BioRad (Willis, E., et al 1990).
A cada tubo con el trozo de gel se le agregaron 500 μl de buffer de unión (NaClO4 6M, Tris
HCL pH 8 50mM, EDTA 10 mM), se incubó a 37 °C hasta que el gel se disolvió
completamente. Luego se le agregaron 4 μl de solución de esferas de vidrio al tubo, se agitó
durante 30 min., se centrifugó a 14.000 rpm por 5 min y el pellet fue lavado 3 veces con 100
μl de buffer de unión y centrifugado nuevamente a 14.000 rpm por 5 min. El pellet obtenido
fue lavado entonces 5 veces con la solución de lavado (Tris HCl pH 7,5 20 mM, EDTA 2 mM,
NaCl 0.4 M, etanol 50%) y centrifugado a 14.000 rpm por 5 min. El sedimento
fue
resuspendido en 20 μl de agua Millipore, incubado previamente a 37 °C por 5 min.,
centrifugado a 14.000 rpm. por 2 min. y el sobrenadante obtenido (conteniendo el ADN) fue
centrifugado por última vez para eliminar los restos de las esferas de vidrio. Cinco microlitros
del producto purificado fueron cuantificados y corridos en un gel de agarosa 1.5% para
verificar su cantidad y calidad.
54
Método B: Purificación usando el “kit Wizard® PCR preps DNA purification system” de
Promega.
Con este método se purificaron los productos de dos formas, a partir de bandas y directamente
del producto (ver especificaciones para cada caso). Para la obtención del ADN purificado se
emplearon mini-columnas especiales (como especificado en el protocolo del kit) y los
productos fueron eluidos en 40 μl de agua millipore. La pureza y calidad del producto fue
verificada por cuantificación espectrofotométrica y por visualización directa en gel de agarosa
al 1.5%. Los productos purificados por ambos métodos fueron empleados tanto en la
secuenciación manual como en la automática.
Secuenciación manual.
Reacción de secuenciación para los productos de la PCR.
Las muestras de los pacientes analizadas mediante secuenciación manual de productos
de la PCR fueron las siguientes: 13, 20, 54, 108, 112, 139, 92 y 93. Para la reacción de
secuenciación se empleó el “kit SILVER SEQUENCETM DNA Sequencing Reagents” de
Promega. Con el valor de la concentración de cada producto purificado, obtenido
espectrofotométricamente, se realizaron los cálculos de la cantidad en nanogramos (ng) a usar
en cada reacción. Para ello se utilizó la siguiente fórmula de conversión:
ng = 120 fmol x 6.6x10-4 x pb del producto
Donde 120 fmol equivale a 16 ng de un producto de 200 bp, 6,6x10-4 es el factor de
conversión y bp corresponde a los pares de bases que tiene el producto a estudiar.
Por cada muestra se prepararon cuatro tubos diferentes identificados con las letras A,
C, G, T y a cada uno se le agregó 2 μl de la mezcla de d/ddNTP respectivo y se almacenaron
en hielo hasta su uso. Aparte, se prepararon 16 μl de una mezcla que contenía 5 μl de Buffer
5X de secuenciación, 1 μl del cebador antisentido Ca3 (4,5 pmol/μl), la cantidad
correspondiente de muestra de acuerdo a los ng calculados previamente y agua Millipore. A
esta mezcla se le colocó luego 1 μl de Taq Polimerasa grado secuenciación, se agitó
55
suavemente y se tomaron 4 μl que fueron agregados a cada uno de los tubos almacenados en
hielo. Los tubos fueron incubados en un termociclador pre-calentado a 95 ºC y se corrió un
programa de temperatura que incluía: 95 ºC por 2 min, luego 60 ciclos a 95 ºC por 30 seg, 42
ºC por 30 seg y 70 ºC por 1 min. Al terminar la corrida se le añadieron a cada tubo 3 μl de
solución para detener la reacción. Finalmente, los tubos fueron almacenados a -20 ºC hasta ser
analizados en geles de poliacrilamida al 6%.
Reacción de secuenciación para los plásmidos.
En el caso de los plásmidos se partió de la recomendación de que se deben usar entre
2-4 μg (1-2 pmol) de un plásmido cuyos bp estén en el rango entre 3000 y 5000. Las mezclas
de reacción se prepararon igual que las de secuenciación de productos de la PCR. El cebador
sentido B2B también fue usado en estas reacciones.
Corrida electroforética de las reacciones de secuenciación manual, en geles de
poliacrilamida al 6%.
La corrida electroforética, de los diferentes productos secuenciados, se realizó en geles
de acrilamida al 6%. La acrilamida al 40% se preparó disolviendo 38.96 g de acrilamida +
1.04 g de bisacrilamida (manteniendo una relación 37.5:1) para un volumen final de 100 ml.
La solución fue filtrada al vacío usando un filtro millipore de 0.2 μm de diámetros y
almacenada a 4 °C. Por su parte, la solución de acrilamida al 6% se preparó tomando 6ml de la
solución concentrada al 40% de acrilamida/bisacrilamida, 4 ml del buffer TBE 10X, 16.8 gr de
Urea (7M concentración final) y agua bidestilada hasta completar 40 ml. Al momento de
preparar los geles se produjo su polimerización agregando 80 µl de APS 20% y de 48 µl de
TEMED. El aparato empleado para la preparación y corrida de los geles fue el sistema de
electroforesis vertical para geles de secuencia (C.B.F Scientific Cat # EGT-100).
Los dos vidrios entre los que se dejó polimerizar el gel fueron tratados bajo
condiciones especiales. Uno de ellos fue tratado con solución repelente (Pennzoil) y el otro
con solución adherente (Silane, etanol absoluto), en modo de facilitar la separación de los
vidrios sin la ruptura del gel. Al vidrio adherente se le colocaron los separadores de 0.4 mm
56
de grosor y para la formación de los bolsillos se usó un peine de bolsillos cuadrados del
mismo grosor.
El buffer de corrida fue preparado al momento de realizar la corrida. A partir de un
buffer TBE 10X se prepararon 1.000 ml a concentración 1X con agua bidestilada. Los
productos de cada reacción de secuencia fueron calentados a 70 °C por 2 min. para garantizar
su completa desnaturalización y luego fueron colocados en hielo durante 5 min. Previo al
cargado de las muestras en el gel, se realizó una pre-corrida a 1.000 V durante 30 min. Las
muestras fueron corridas usando primero 2.000 V durante 2 min. (para facilitar que las
muestras entraran en el gel) y luego a 1.000 V durante 4 o 7 horas para corridas de secuencias
de productos de PCR directamente o secuencias de insertos clonados en plásmidos,
respectivamente. La fuente de poder empleada en estos experimentos fue la E-C Apparatus
Corporation (EC.4000P-120).
Tinción con plata para los geles de secuencia.
Una vez finalizada la corrida electroforética, los geles fueron sumergidos en ácido
acético glacial al 10 % durante 30 min. con agitación constante para fijar el ADN en el gel.
Para la tinción con plata el vidrio fue lavado con agua destilada para eliminar los restos del
fijador y luego fue sumergido en la solución de tinción (1 gr de nitrato de plata, 1.5 ml de
formaldehído 37% y 1.000 ml de agua bidestilada) por 30 min con agitación constante. Diez
minutos antes de finalizar la tinción con plata se preparó la solución de revelado (30 gr de
carbonato de sodio, 1.5 ml de formaldehído 37%, 200 μl de tiosulfato de sodio (10 mg/ml) y
1.000 ml de agua bidestilada bien fría). Luego de este tiempo el gel fue lavado 2 veces (para
eliminar los excesos de la tinción de plata) con agua destilada por 2 min cada vez.
Posteriormente, el gel fue transferido a otra bandeja la cual contenía la solución de revelado.
Se agitó constantemente hasta que aparecieron las primeras bandas. Luego la solución de
revelado fue descartada y se agregó nueva solución de revelado. Se continuó agitando hasta
que aparecieron todas las bandas y luego se le añadió ácido acético al 10 % para detener el
proceso de revelado. El gel fue secado y envuelto en papel plástico tipo “envoplast”,
escaneado y almacenado para su posterior análisis.
57
Secuenciación automática.
Las siguientes muestras de los pacientes: 13, 20, 54, 92, 93, 108, 110, 112, 130, 139,
174, 12434, 11973, 13536, A6, A9, A15, A16, A17, A18 y A19 fueron enviadas para análisis
por secuenciación automática. Las cantidades y concentraciones de productos y cebadores
sentido y antisentido (CA3-, B2B y BCR-C) fueron preparadas de acuerdo a lo establecido por
cada centro de secuenciación automática a los que fueron enviados (CEESAN (Venezuela) y
MACROGEN (Corea)). Las secuencias obtenidas fueron comparadas con las secuencias
reportadas en la base de datos del “Gene Bank” y alineadas con respecto a las diferentes
variantes usando el software presente en la página web http://bio.lundberg.gu.se/.
Análisis estadísticos de los datos obtenidos en el diagnóstico molecular.
Con los resultados de los 200 pacientes estudiados, que dieron positivos
molecularmente para la translocación BCR/ABL, se realizaron los cálculos para la
determinación de la frecuencia. Al valor obtenido se le realizó una prueba de bondad de ajuste
(Chi Cuadrado/χ) comparada con las frecuencias reportadas en la literatura. Adicionalmente,
se calculó la frecuencia de cada una de las variantes y se determinó si existía predominancia
de alguna de ellas empleando también una prueba de bondad de ajuste, para ello se usó un
modelo nulo donde cada variante era igualmente probable (modelo de distribución uniforme).
La frecuencia de las variantes fue a su vez comparada contra los resultados reportados
en la literatura, usando para ello la prueba de contraste t de “Student” sobre las frecuencias
modificadas por transformación arcoseno (Sokal y Rolf, 1995) y aplicando la corrección de
Bonferronni (1995). Por último, se determinó si existía relación de dichas variantes con el
sexo y la edad de los pacientes estudiados, y para ello se realizó un análisis de covarianza
mediante una regresión logística usando el programa R (R Development Core Team, 2006) en
donde los grupos de variantes separados por sexo covarían con la edad.
58
DETECCIÓN DE OTRAS TRANSLOCACIÓNES QUE INDUCEN
LEUCEMIA: PANEL DE DIAGNÓSTICO.
Dado que se obtuvieron 97 pacientes negativos para BCR/ABL, que evidentemente
mostraron síntomas clínicos de alteraciones hematooncológicas, se decidió incluir en este
trabajo la estandarización y aplicación de un panel diagnóstico que permitió identificar la
presencia de otras translocaciones relacionadas con otros tipos de leucemias. La creación de
este panel permitirá a futuro realizar una detección más rápida y efectiva de la presencia de
una o varias translocaciones que causan leucemias en un mismo paciente, así como el análisis
de un mayor número de muestras. El panel incluyó 7 de las translocaciones más
frecuentemente reportadas para varios tipos leucemias (ver tabla III). Estas son:
MYH11/CBFβ (INV 16)
AML/ETO (8:22)
LMA
MLL/AF4 (4:11)
E2A/PBX-1 (1:19)
LLA
SIL/TAL1 (TAL1D)
TEL/AML (12:21)
PML/RARα (15:17)
LPA
Obtención de la muestra:
Alícuotas de ARNs totales de 40 de los 97 pacientes que dieron negativos para
BCR/ABL fueron usadas en este ensayo. También se usaron muestras de personas no
enfermas (controles), previo consentimiento.
59
RT-PCR convencional:
Para la producción de los diferentes ADNc se siguió el protocolo descrito en la sección
de diagnóstico molecular (RT-PCR). Algunos de los cebadores empleados para amplificar
cada translocación fueron diseñados por el laboratorio de acuerdo a lo reportado en la
bibliografía y otros fueron provistos por el Dr. José Luís López (BMS).
En todos los casos se utilizó una PCR tipo Nested PCR (se hacen dos PCR y en la
segunda se usa el producto de la primera como templado y uno o ambos cebadores cambian)
para poder obtener los diferentes amplificados.
La mezcla de reacción de la PCR 1 de todas las translocaciones contuvo 6.2 μl de agua
ultra pura, 2 μl de dNTP`s 2 mM, 2 μl de buffer M 10X, 1.6 μl de MgCl2 25 mM, 1.5 μl del
cebador sentido 10 pmol/ μl, 1.5 μl del cebador antisentido 10 pmol/ μl, 0.2 μl de taq
polimerasa y 5 μl de ADNc. Las PCRs se realizaron en el MiniCycler de MJ Research. El
programa de temperatura fue el mismo para todas las translocaciones (ver Tabla III). Los
productos de PCR de cada translocación fueron corridos en geles de agarosa al 1.5% y se usó
siempre un marcador de peso molecular de 100 pares de bases para verificar el tamaño de cada
uno.
60
Tabla III. Translocaciones seleccionadas para la producción de paneles de diagnóstico de Leucemias. La
secuencia de los cebadores para las diferentes PCRs, así como los programas de temperturas y los productos
esperados fueron tomados de pallisgaard y Col. 1998.
Translocación
Tipo
Secuencia de
Tamaño
Temperatura
Tipo de
de
Cebadores
Productos
de Annealing
Leucemia
PCR
MYH11/CBFβ
(INV 16)
Nested
MYH11/ CBFβ: PCR 1
1R: TTTGAAGGCTCCCATGATTCTG
2R: AGGTCCCCTTCCAGCTTCTTCT
3R: GAGCTGGATGTTGAGAGTGGAGAT
MYH11/ CBFβ: PCR 2
5A: TGGGCTGTCTGGAGTTTGATG
6A: TGAGCGCCTGCATGTTGAC
4A: TCCTCGTCCAGCTGGTCTTG
AML/ETO
(8:21)
174, 241, 270,
337, 348, 483,
58°C
LMA
58°C
LMA
58°C
LLA
376, 403 pb.
58°C
LLA
183 pb
58°C
LLA
293, 332 pb.
58°C
LLA
393, 338, 427,
58°C
LPA
544, 663 pb.
AML/ETO: PCR1
Nested
821U: GATGGCACTCTGGTCACTGTG
821U1: TCTCCTATCTCGGGTGAAATGTC
353 pb.
AML/ETO: PCR2
821U: TGGCTGGCAATGATGAAAAC
821U1: CGTTGTCGGTGTAAATGAACTG
MLL/AF4
(4:11)
MLL/AF4: PCR1
Nested
7R: CCGCCTCAGCCACCTACTAC
8R: AGCACTCTCTCCAATGGCAATAGT
10A: GAATTTGAGTGAGTTTTTGAAGATGTATC
MLL/AF4: PCR2
9R: GGACCGCCAAGAAAGAAGT
11R: AGCAGATGGAGTCCACAGGATCAG
12A: GTTTTTGGTTTGGGTTACAGAACT
E2A/PBX1
E2A /PBX-1: PCR1
(1:19)
E1: TTCTCGTCCAGCCCTTCTACC
E2: TTTTCCTCTTCTCGCCGTTTCA
P: GCCACGCCTTCCGCTAAC
Nested
E2A /PBX-1: PCR2
317, 204, 318,
272, 159, 273,
317, 186pb.
E1: CTACGACGGGGGTCTCCAC
E2: AGGTTCCGCTCTCGCACTT
P: CATGTTGTCCAGCCGCATCAG
SIL/TAL1
SIL/TAL1: PCR1
Nested
S: CGACCCCAACGTCCCAGAG
T: CGGTCATCCTGGGGCATATTT
SIL/TAL1: PCR1
S: CCCGCTCCTACCCTGCAAAC
T: AGACCGGCCCCTCTGAATAG
TEL/AML
TEL/ AML:PCR1
(12:21)
T: CACTCCGTGGATTTCAAACAGTC
A: AGCCGAGTAGTTTTCATCATTGC
Nested
TEL/ AML:PCR2
T: CTCATCGGGAAGACCTGGCTTAC
A: AGCACGGAGCAGAGGAAGTTG
PML/RARα
(15:17)
PML/ RARα : PCR1
Nested
P1: CAAGAAAGCCAGCCCAGAG
P2: GTGCGCCAGGTGGTAGCTC
R: AAGCCCTTGCAGCCCTCAC
PML/ RARα : PCR2
P1: GCCAGTGTACGCCTTCTCCAT
P2: CAGCGCGACTACGAGGAGAT
R: CCCATAGTGGTAGCCTGAGGAC
464 pb.
61
CITOMETRÍA DE FLUJO
La citometría de flujo se ha convertido en una herramienta clave en los diferentes
laboratorios clínicos debido a que permite, de una manera rápida y eficiente, identificar la
presencia de anomalías en el estado de maduración de las células presentes en una muestra, de
acuerdo a la distribución que estas presentan con respecto a su tamaño y complejidad
(granularidad). Esta técnica está basada en el uso de anticuerpos monoclonales específicos que
reconocen proteínas (antígenos) presentes tanto en la superficie celular, como en el citoplasma
y el núcleo de las células analizadas.
La determinación de las leucemias por citometría de flujo le ofrece al médico la
oportunidad de confirmar el diagnóstico clínico de estas así como su clasificación, lo cual le
permite iniciar un tratamiento inmediato y efectivo (el tratamiento varía dependiendo del tipo
de leucemia que se diagnostica) antes de tener los resultados definitivos que brinda el
diagnóstico molecular. (www.citometriadeflujo.com)
En tal sentido, en este trabajo se decidió incluir la evaluación por citometría de flujo
de algunos casos de LMC. Para ello, se tomaron 10 muestras de pacientes con diagnóstico
clínico de LMC del Banco Municipal de Sangre (BMS) a cargo del Dr. Pedro Sánchez. Este
estudio nos permitió evaluar los alcances, ventajas y desventajas que tiene esta técnica con
respecto al análisis complementario que ofrece el diagnóstico molecular de la LMC.
Determinación de la LMC mediante citometría de flujo usando paneles de anticuerpos
monoclonales específicos.
En el laboratorio de citometría de flujo del BMS fue posible diagnosticar pacientes con
LMC tanto en fases iniciales como en crisis blástica linfoide y mieloide. En efecto, la tabla IV
muestra en detalle el panel de anticuerpos monoclonales usados en este estudio.
62
Tabla IV. Panel de anticuerpos monoclonales usados en el laboratorio de citometría de flujo del BMS para el
diagnóstico de leucemia. Cada grupo de antígenos CD, tanto de superficie celular como citoplasmático, es usado
para identificar una población celular determinada.
Panel de Leucemia
(LLA LMA LMC)
Anticuerpos Monoclonales
Anticuerpos Monoclonales
de Antígenos de superficie Celular
Anti-CD10/CD20/CD19
de Antígenos Citoplasmáticos
MPO/CD79α/cCD3/HLA-DR
(precursores y blastos de células B y T)
(linaje mieloide, linfoideB o T, NK ,LLA linaje T)
Anti-CD15/CD34
IgG1/ IgG2/ IgG3
(células madres, blastos, progenitores linfoides)
(cél. B maduras,)
Anti-DR/CD22
(sup. Cél: B maduras, citopl: pre.B )
Anti-CD13/CD38
(progenit. Tempr. de granulocitos, monocitos )
Anti-CD11c/CD117
(células mieloides inmaduras, monocitos, macrófagos,
granulocito, cél. NK, B, T)
Anti-CD4/CD8
(Cél. T, monocitos, macrófagos, granulocitos )
Anti-CD14/CD45
(Cél. Hematop., monocit., macrófagos granulocitos)
Anti-CD3/CD7
(Cél. Pluripotentes, NK y T)
Anti-CD2
(Cél. NK y T)
Anti-CD56
(Cél. NK )
Anti-CD33
(precursores mieloides, monocitos)
TdT/Cµ
(LLA linaje B)
Cada anticuerpo monoclonal usado en los estudios de citometría de flujo estuvo
conjugado a un fluorocromo específico que podía ser FITC (isocianato de fluoresceína),
PerCP (Proteína clorofila peridinina) o PE (ficoeritrina). Estos compuestos son capaces de
emitir fluorescencia cuando son expuestos a la luz de un láser, permitiendo así que una vez
formado el complejo antígeno-anticuerpo-fluorocromo conjugado, este pudiera ser detectado y
analizado por el citómetro.
63
Obtención de la muestra:
Las muestras fueron obtenidas a partir de aspirados de médula ósea (MO) y sangre
periférica (SP). El procesamiento y análisis de las muestras se realizó el mismo día de su
obtención.
Procesamiento de las muestras en el citómetro de flujo y su correspondiente análisis.
Para cada muestra se tomó el número necesario de tubos de polietileno, los cuales
fueron identificados con los códigos que correspondían a cada grupo de anticuerpos
monoclonales específicos para el reconocimiento de antígenos de superficie celular o con los
códigos que correspondían a cada grupo de anticuerpos monoclonales específicos para el
reconocimiento de antígenos citoplasmáticos y controles isotípicos. Posteriormente a cada
tubo se le agregaron 5 μl del anticuerpo respectivo y un volumen de la muestra equivalente a
una concentración de 500.000 ó 1.000.000 de células por cm3, (a cada muestra se le realizó
previamente un conteo hematológico (Coulter Gen-System 2) para determinar el número de
leucocitos que contenía) y fueron incubados en oscuridad por 10 min. Luego se les agregó una
solución de lisis de la casa comercial DAKO (Uti-lyse), esta lisis comprendía dos etapas, la
primera consistía en fijar las células con 100 μl de la sol. A durante 10 min. a temperatura
ambiente y en oscuridad, la segunda consistió en lisar los glóbulos rojos presentes en la
muestra añadiendo 1 ml de la sol. B bajo las mismas condiciones de incubación. Por último,
las muestras fueron centrifugadas a 1.500 rpm por 3 min, lavadas con 1 ml de PBS y
resuspendidas en 0.5 μl de PBS antes de ser pasadas por el citómetro de flujo. Los anticuerpos
monoclonales utilizados para la caracterización inmunofenotípica de las células se citan en la
tabla IV.
Las muestras a las que se les realizó la determinación de los antígenos citoplasmáticos
fueron tratadas con el kit de permeabilización de la casa comercial DAKO intra-stain. Primero
se les agregó 50 μl de la sol. A, para fijar las células, se incubó durante 10 min, se centrifugó
igual que en la primera parte, se lavó con PBS, se agregó 50 μl de la sol. B permeabilizante, se
agregaron los anticuerpos citoplasmáticos necesarios y se incubó la mezcla durante 20 min. a
temperatura ambiente en oscuridad. Posteriormente se lavó con PBS y luego se resuspendió en
64
0,5 ml de PBS para ser pasadas por el citómetro de flujo. Las muestras fueron leídas en un
citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson & Co. San José USA) y los resultados
obtenidos fueron luego analizados usando el sofware Cell Quest.
Análisis de los resultados:
Los resultados fueron reflejados en forma de gráficas dot-plot, donde cada muestra
incluyó un dot-plot de dispersión, que permitió identificar la distribución de la serie blanca de
acuerdo al tamaño (FSC) y granularidad de su núcleo y citoplasma (SSC) (ver Fig. 18). En
este dot-plot de dispersión o “scattergrama” las poblaciones celulares fueron representadas
por agrupaciones homogéneas de puntos donde las células más pequeñas y con menor
granularidad, estuvieron ubicadas en la parte inferior de la gráfica (esta posición también es
sinónimo de inmadurez celular), mientras que las células de mayor tamaño y con mayor
granularidad se ubicaron en la parte superior de la gráfica (esta posición es sinónimo de
madurez celular). Teniendo como patrón de referencia el dot-plot de dispersión de una persona
en condiciones normales se pudieron identificar los diferentes casos que presentaron
alteraciones hematoncológicas.
Figura 18. Dot-plot de dispersión de la serie blanca en condiciones de normalidad. En el eje Y está
representado el tamaño de las células y en el eje X está representada la granularidad. Los linfocitos se ubican en
la parte inferior de la gráfica, los monocitos se ubican en la zona superior intermedia y los granulocitos se
distribuyen en la parte superior derecha de la gráfica. Los dibujos ubicados a los lados de cada población reflejan
la forma de cada grupo.
65
Adicional al dot-plot de dispersión, los resultados también incluyeron varios dot-plot
de fluorescencia, los cuales podían ser de fluorescencia Antígeno-Antígeno (Ag-Ag) o de
fluorescencia mixta (SSC-Ag). Los primeros permitieron medir la intensidad de la expresión
de diferentes antígenos enfrentados dentro de una población determinada y los segundos
permitieron identificar las poblaciones celulares positivas para cada antígeno estudiado (ver
Fig. 19 y 20). La figura 19 muestra el esquema explicativo del análisis de los dot-plot de
fluorescencia Ag-Ag:
A= Células que co-expresan ambos Ag con una alta intensidad.
B= Células que expresan ambos Ag pero con intensidad media para ambos (B) o para
cada uno de ellos (B2-B3).
C= Células que expresan un solo Ag con alta intensidad.
D= Células que expresan un solo Ag con intensidad media.
E= Células que no expresan ninguno de los Ag.
F= Expresión Heterogénea. Células que van desde la no expresión de un Ag, pasando
por células con expresión débil, hasta células que presentan una expresión fuerte.
Por su parte el dot-plot Ag-Ag, en la misma fig. 19, muestra un ejemplo de una
población celular enfrentada a un grupode anticuerpos (CD3 y CD9) donde se puede observar
algunos de los casos explicados en el esquema.
Figura 19. Esquema de los posibles casos que se pueden presentar a la hora del análisis de resultados en los
dot-plot de fluoresecencia Ag-Ag o mixto. El esquema evidencia la intensidad de las diferentes poblaciones
estudiadas. El dot-plot Ag-Ag muestra el reconocimiento de la muestra a los Ac. CD3 y CD9.
66
Por último, la figura 20 muestra un ejemplo representativo de un dot-plot de
fluorescencia mixto que permitió la interpretación de este tipo de gráficos en los resultados
obtenidos. Esta gráfica ubica en el eje Y la característica de dispersión que permite observar
tanto las poblaciones celulares que se forman en la región seleccionada como su grado de
complejidad e inmadurez, es decir, en la parte inferior de la gráfica se ubicaron las
poblaciones menos complejas e inmaduras mientras que en la parte superior se ubicaron las
más complejas y con diferentes grados de madures. En el eje X de la gráfica se ubica un Ac
(anticuerpo) conjugado con un fluorocromo específico que permite identificar de izquierda a
derecha la intensidad de expresión del Ag estudiado (expresión nula, intermedia y alta
respectivamente). En resumen, este gráfico es el que permite hacer una selección (por
agrupación celular y por su ubicación en la gráfica) de las células que expresan un Ag
determinado. Como se puede observar en el ejemplo se formaron 5 poblaciones celulares, tres
en el lado inferior (denotando inmadurez con esta posición) y 2 en el lado superior
(demostrando un grado de inmadurez menor), cuando estas fueron enfrentadas al Ac CD4 se
encontró que la población roja presentó una alta e intensa expresión del Ag CD4, mientras que
las poblaciones verdes, azules y amarillas presentaron una expresión intermedia para este Ag y
por último se observaron las poblaciones violetas quienes presentaron una expresión de nula a
débil del Ag.
Figura 20. Dot-plot de fluorescencia mixto. En el eje Y se ubicó la característica de granularidad y en el eje X
se ubicó la característica de Ag. Cada color identificó una población celular.
67
Además de los diferentes dot-plots, el citómetro también mostró una división en
cuadrantes de cada gráfica obtenida (ver Fig. 21). Dicha división permitió hacer una precisa
separación de las diferentes poblaciones celulares formadas (analizada por el eje Y), por
cuadrante, y además fue capaz de arrojar una valoración en porcentaje de las variaciones en la
intensidad de expresión de los antígenos estudiados. El cuadrante posee un punto medio que
fue siempre colocado de tal manera que las diferentes poblaciones formadas quedaron
incluidas dentro de éste. Cada sección del cuadrante (SI, SD, II y ID) indicó el grado de
positividad o negatividad que mostró cada población para la expresión de un antígeno
estudiado, así tenemos que en el dot-plot mixto que presenta la figura 21, el antígeno
analizado en el eje X mostró una expresión heterogénea de dicho anticuerpo entre las
poblaciones ubicadas hacia la parte inferior de la gráfica y que la población ubicada más a la
derecha (cuadrante ID) presentó una alta intensidad de expresión del antígeno en cuestión.
Figura 21. Dot-plot de fluorescencia mixto representativo de la separación en cuadrante (líneas verdes) de
las poblaciones celulares y valoración en porcentajes de la intensidad de expresión del Ag analizado. SI
corresponde a la porción superior izquierda del cuadrante donde Y es positivo y X es negativo para las variables
estudiadas, SD corresponde a la porción superior derecha del cuadrante donde Y y X son positivos, II
corresponde a la porción inferior izquierda del cuadrante donde Y y X son negativos y ID corresponde a la
porción inferior derecha del cuadrante donde Y es negativo y X es positivo.
Sin embargo, cuando el análisis con cuadrantes se realiza sobre un dot-plot de
fluorescencia Ag-Ag, la expresión y valoración estadística para cada cuadrante cambia. Por lo
tanto, el antígeno ubicado en el eje Y tuvo una expresión con valor estadístico solo cuando su
marcaje estuvo incluido dentro de los cuadrantes SI y SD, pero no así para los cuadrantes II e
68
ID. En el caso del antígeno ubicado en el eje X, este tuvo una expresión con valor estadístico
solo cuando su marcaje estuvo incluido dentro de los cuadrantes SD e ID, más no así para los
cuadrantes SI e II (ver Fig. 22).
Figura 22. Dot-plot de fluorescencia Ag-Ag representativo de la separación en cuadrante (líneas verdes)
del enfrentamiento de dos antígenos y la valoración de sus expresiones en porcentajes. SI corresponde a la
porción superior izquierda del cuadrante donde Y es positivo y X es negativo para las variables estudiadas, SD
corresponde a la porción superior derecha del cuadrante donde Y y X son positivos, II corresponde a la porción
inferior izquierda del cuadrante donde Y y X son negativos, ID corresponde a la porción inferior derecha del
cuadrante donde Y es negativo y X es positivo.
69
FACTORES IMPLICADOS EN LA RESISTENCIA AL TRATAMIENTO
DE LA LMC CON IMATINIB
En vista de que el tratamiento con Imatinib es indispensable para la supervivencia de
los pacientes con LMC y que nuestro país no escapa de los casos de pacientes que se han
hecho resistentes al tratamiento con este fármaco, se decidió investigar como último objetivo
de esta tesis cual de los tres factores reportados en la bibliografía podrían estar provocando la
resistencia en nuestros pacientes. Es importante destacar que, aunque la resistencia al
tratamiento con Imatinib es observada principalmente en pacientes en crisis blástica, en este
trabajo se decidió incluir todas las fases de esta enfermedad debido a que éste es pionero en
nuestro país y se quería investigar si lo reportado en la bibliografía también se cumplía para
los pacientes venezolanos.
Además, es importante mencionar que de los tres factores implicados en el mecanismo
de resistencia a Imatinib, nosotros estudiamos dos de ellos (modificación de la expresión
génica y mutaciones en el dominio TK) en el centro piloto de la USB, mientras que el tercero
(cuantificación de la quimera BCR/ABL por PCR en tiempo Real) ya estaba siendo realizado
por el Dr. José Luís López en el BMS en el inicio de estos experimentos. Los resultados de los
tres factores fueron usados en las comparaciones y discusiones posteriores.
MODIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR BCR/ABL.
Dado que ha sido ampliamente reportada la participación de la quimera BCR/ABL en
la modificación de la expresión de un gran número de genes que participan en diferentes vías
de señalización celular, como mecanismo de resistencia al tratamiento con Imatinib, se quiso
determinar si en pacientes venezolanos positivos para BCR/ABL el mecanismo de resistencia
a imatinib era causado por alteración en la expresión de algunos genes sospechosos de sufrir
tales modificaciones (Hofmann y Col. 2002; Salesse y Verfaillie 2003; Dvorak y Col. 2003;
Dai y Col. 2004; Radich y Col. 2006).
70
Obtención de la muestra:
A tal fin, se seleccionaron 23 pacientes positivos para BCR/ABL, los cuales dieron su
consentimiento para ser usados en el estudio. Ocho de ellos se encontraban en la fase crónica
de la enfermedad, 8 estaban en fase acelerada y 7 presentaban la fase de crisis blástica al
momento de tomar las muestras. Como controles normales se escogieron 11 personas al azar
que fuesen negativos al hacerles la detección molecular de la translocación BCR/ABL.
Selección de genes a ser estudiados:
Para la selección de los genes a ser analizados se hizo una búsqueda exhaustiva en la
bibliografía más reciente, tomando en cuenta: 1) el tipo de estudio realizado (microarreglos,
real-time PCR, etc), 2) importancia de los genes en las diferentes vías de señalización que son
afectadas por la proteína BCR/ABL, 3) la frecuencia con la que aparecían reportados en la
bibliografía (Dai y Col. 2004; Rodriguez y Col. 2004; Contri y Col. 2005; Jing y Col. 2005), y
4) como era afectada su expresión (aumenta o disminuye). Los genes seleccionados a ser
evaluados mediante Real-Time PCR fueron: Lyn y AKAP 12 como genes problema y
GAPDH como gen control. El diseño de los diferentes cebadores se hizo empleando el
programa Primer3. Las secuencias de los diferentes cebadores para cada gen fueron enviadas a
sintetizar a “OPERON molecules for life” (ver Tabla V).
Tabla V. Genes seleccionados para los estudios de expresión génica en pacientes positivos para el oncogen
BCR/ABL (Deininger y Col. 2000).
Temp.
Genes
Secuencia
GAPDH up
CATCAAGAAGGTGGTGAA
GAPDH down
GGGTCTTACTCCTTGGAG
AKAP 12 up
CAGGATGGGGAAGCTGAA
Tamaño “Annealing”
Modificación de
la expresión
243 bp
55 °C
No cambia
264 bp
60 °C
Disminuye
AKAP 12 down GGTATCCACCTTGCGCTT
Aumenta
Lyn up
ACTGCCCAGATGAGCTCT
Lyn down
AAGTGCAACCAGTGATGG
218 bp
71
55 °C
Tratamiento del ARN total con ADNasa:
Las 34 muestras de ARN total fueron tratadas con el kit RQ1 RNase-Free Dnase de
Promega. Para una mezcla típica de reacción de 10 μl se usó 1U de enzima por 1 μg de ARN,
1 μl de buffer RQ1 10X y se completó hasta 10 μl con agua libre de nucleasa. La mezcla fue
incubada durante 20 min. a 37 °C y luego la enzima fue inactivada por una incubación a 75 °C
por 10 min. Posterior a este tratamiento, las muestras fueron tratadas con 1 volumen de
fenol:cloroformo:alcohol isoamil, agitadas por inversión y centrifugadas a 14.000 rpm. por 5
min. Los volúmenes obtenidos fueron entonces mezclados con 2½ volúmenes de isopropanol,
incubados a -20 °C por 1 h, centrifugados a 14.000 rpm por 15 min., lavados 3 veces con
etanol 75%, resuspendidos en 40 μl de agua pura con DEPC y almacenados (en alícuotas de
10 μl) a -80°C. La integridad y cantidad del ARN fue visualizada por la corrida del mismo en
geles de agarosa al 1% y por cuantificación espectrofotométrica. Debido a la gran sensibilidad
del sistema empleado, la integridad del ARN fue indispensable en la obtención de resultados
confiables.
Aislamiento de ARN mensajero:
Para obtener los ARNm a partir de los ARN totales de las diferentes muestras se utilizó
el kit “PolyATract mRNA system” de Promega. Para ello, se empleó el protocolo de extracción
de pequeña escala, donde se colocó de 0.1 a 1 mg de ARNt en un eppendorf estéril y se
completó con agua millipore tratada previamente con DEPC hasta 500 μl. Esta suspensión fue
luego calentada a 65 °C por 10 min. y entonces se le agregó 3 μl del oligo dT Biotinilado, 3 μl
72
de SSC 20X, se mezcló gentilmente y se incubó a temperatura ambiente hasta que la solución
estuvo completamente fría. Mientras se daba el proceso de enfriamiento se prepararon las
soluciones stock de 0.5X (30 μl SSC 20X + 1.170 ml de agua Millipore) y 0.1X de SSC (7 μl
SSC 20X + 1.393 agua millipore). Adicionalmente se hizo el lavado de las partículas
paramagnéticas-streptavidina (SA-PMPs) proporcionadas por el kit, empleando SSC 0.5 X y
capturando las partículas con el porta eppendorf magnético. Las SA-PMPs fueron finalmente
resuspendidas en 100 μl de SSC 0.5 X, quedando así listas para ser usadas en la captura del
ARNm unido al oligo biotinilado.
El proceso de captura se llevó a cabo mezclando la reacción de hibridación (ARNmBiotina) con las SA-PMPs lavadas, se incubó a temperatura ambiente por 10 min y luego se
hizo la captura de los híbridos ARNm-Biot.-SA-PMPs usando el porta eppendorf magnético.
Se realizaron 4 lavados con SSC 0.1X y finalmente el sedimento fue resuspendido en dos
tandas con 100 μl y 150 μl de agua millipore tratada con DEPC respectivamente, lo cual
permitió el desprendimiento del complejo Biot.-SA-PMPs de las moléculas de ARNm.
RT-PCR convencional:
Los ARN mensajeros de las 34 muestras fueron usados para producir varias alícuotas
por duplicado de ADNc. Un duplicado fue usado en las PCR convencionales y el otro fue
almacenado, al igual que el ARNm para ser usado en la técnica de RTQ-PCR en tiempo real.
Se realizaron tres tipos de PCR convencionales, (1) la correspondiente a la
demostración de la pureza de los ARNm, (2) la correspondiente a la verificación de si los
pacientes eran positivos para el oncogen BCR/ABL y por último, (3) la correspondiente a la
verificación de la funcionalidad de los cebadores diseñados para cada gen a usar. En el primer
y segundo caso el programa de temperatura empleado fue el mismo que se utilizó en la sección
de diagnóstico molecular (RT-PCR) usando el MiniCycler de MJ Research. En el tercer caso
se usaron 2 programas de temperatura puesto que no todos los genes amplificaron bajo un
mismo programa. El primer programa, usado para amplificar los genes GAPDH y LYN contó
con un ciclo de 94 ºC 5 min., 35 ciclos de: 94 ºC 30 seg., 55 ºC 30 seg., 72 ºC 30 seg., un ciclo
73
de 72 ºC 10 min. y un ciclo de 4 ºC 5 min. El segundo programa, que permitió amplificar a
AKAP 12 contó con un ciclo de 95 °C 5 min. 35 ciclos de: 94 ºC 30 seg., 60 ºC 30 seg., 72 ºC
30 seg., un ciclo de 72 ºC 10 min. y un ciclo de 4 ºC 5 min., usando el MiniCycler de MJ
Research. Es importante mencionar que la amplificación de GAPDH en ambos programas fue
determinante porque este gen fue usado como gen de referencia. Por último, todos los
programas de temperatura fueron luego adaptados al “light cycler”. Los productos de PCR
obtenidos fueron corridos en geles de agarosa al 1.5% para verificar la presencia de bandas
específicas en la amplificación de cada producto.
RT-PCR en Tiempo Real:
Para preparar la reacción de RT-PCR en Tiempo Real se usó el kit LightCycler® RNA
Master SYBR Green I de Roche. En una reacción típica de 20 μl se utilizó Mn(OAc)2 a una
concentración final de 3.25 mM, cebadores sentido y antisentido a una concentración de 0.3
μM para cada gen, ARNmaster SYBR Green I a 1X de concentración y agua Millipore. Las
pre-mezclas de reacción fueron hechas de acuerdo al gen a amplificar y a la cantidad de
muestra a procesar. El gen control GAPDH siempre fue montado en paralelo con los genes en
estudio, así como el control negativo de la reacción (agua).
Cantidades de 12,8 μl de la premezcla fueron colocadas en capilares especiales, por
separado, luego se colocó la cantidad de agua correspondiente a cada tubo y por último fueron
agregadas cada una de las muestras. Como no se pudo obtener una concentración inicial
exacta de las muestras se colocó siempre la misma cantidad de muestra para cada gen. Los
capilares fueron luego tapados herméticamente y centrifugados al mínimo de velocidad y
tiempo que permitió la mini centrífuga.
Todos los capilares fueron introducidos con mucho cuidado y en estricto orden
ascendente, en un carril empleado para tal fin y éste, a su vez, fue ensamblado en el
termociclador antes de que el equipo fuese cerrado herméticamente. Los programas de
temperatura, tiempos, identificación de cada muestra y almacenamiento de datos, fueron
digitalizados en el computador antes de iniciar cada amplificación. Adicionalmente, se
74
programó el equipo para que al final de las reacciones realizara una curva de temperatura de
fusión para todas las muestras.
Análisis de datos:
Cuantificación relativa sin curva estándar:
La cuantificación relativa se basa en la suposición de que la relación entre la
concentración de dos genes es equivalente a la relación entre la fluorescencia producida por
ellos, y por lo tanto también a la relación entre los puntos de cruce. El punto de cruce para
cada curva fue determinado como el número de ciclos en el cual la segunda derivada de la
curva se hace máxima (se usó el método de la segunda derivada). Esto quiere decir que la
relación entre la concentración del gen y el punto de cruce es inversa, es decir, que a mayor
punto de cruce (o número de ciclos) menor será la expresión del gen.
A partir de las gráficas obtenidas de la PCR en tiempo real para cada gen se obtuvieron
los puntos de cruce de cada una de las muestras. Con estos datos se calculó una relación de la
expresión (Ratio= R) entre el gen problema (Lyn o AKAP12) y el gen GAPDH para cada una
de las muestras (normal y enfermo), lo que permitió normalizar este valor para cada gen:
R = punto de cruce gen problema
punto de cruce gen GAPDH
El R de cada uno de los enfermos fue luego dividido entre la media del R para los normales:
Ri enfermo______
Media de Rnormal
El valor obtenido de esta ecuación reflejó el aumento o disminución de la expresión de un gen
en particular por paciente.
Análisis Estadístico:
75
Con los resultados obtenidos se realizó una comparación múltiple de medias de la
relación entre los genes problemas y el gen GAPDH siguiendo el método de Pfaff (2001).
DETECCIÓN DE MUTACIONES PUNTUALES EN EL DOMINIO TIROSINAQUINASA DE LA QUIMERA BCR/ABL.
La presencia de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa (dominio TK) de
la proteína híbrida BCR/ABL, también ha sido ampliamente reportada en pacientes con LMC
que se han vuelto resistentes al tratamiento con imatinib, principalmente en aquellos que se
encuentran en la fase de crisis blástica de la enfermedad (Hoover, y Col. 2002; Melo y Col.
2003; Wolff, y Col. 2005; Talpaz y Col. 2006).
Con el objetivo de demostrar, si la presencia de estas mutaciones en nuestros pacientes
es lo que pudiera estar causando la resistencia al tratamiento con Imatinib, se procedió a
realizar la identificación de las mismas.
Obtención de la muestra:
Los mismos 23 pacientes positivos para BCR/ABL usados tanto en los estudios de
expresión génica como en la cuantificación de la quimera BCR/ABL fueron usados en esta
sección. De estos pacientes 8 se encontraban en la fase crónica, 8 estaban en fase acelerada y 7
presentaban la fase de crísis blástica. Los controles normales fueron los mismos de la sección
anterior.
RT-PCR:
A partir de las alícuotas de ARNt se construyeron los ADNc a ser empleados en el
proceso de amplificación. Los protocolos de retro-transcripción y PCR fueron los mismos que
76
se emplearon en la sección de diagnóstico molecular. Para estar seguros de que el dominio TK
amplificado en las muestras correspondía a células que expresaban la quimera BCR/ABL y no
al ABL de alguna célula sana que pudieran tener estas, se realizaron 2 PCRs (tipo nested) en
las que se usaron los cebadores B2B, ABL-R6 y ABL-F4 (ver tabla VI). En ambas PCRs se
usó el mismo programa de temperatura, el cual consistió en: un ciclo de 94 ºC 1 min., 35
ciclos de: 94 ºC 1 min., 48 ºC 1 min., 72 ºC 1 min., un ciclo de 72 ºC 10 min
Tabla VI. Secuencia de cebadores usados para la amplificación de la quimera BCR/ABL y del dominioTK en
pacientes con LMC. Los tamaños esperados para cada producto, así como la temperatura de “annealing” fueron
tomados de Branford y Col. 2002.
Tipo de estudio
Translocación
Secuencia de Cebadores
Tamaño
Temperatura
del Producto
de Annealing
1.200 pb
48°C
565 pb
48°C
BCR/ABL+
DTK
B2B:
ACAGAATTCGCTGACCATCAATAAG
ABL-R6: AGAACTTGTTGTAGGCCAG
Dominio tirosina quinasa
(DTK)
ABL-F4: TCCCCCAACTACGACAA
ABL-R6: AGAACTTGTTGTAGGCCAG
En la PCR1 se amplificó un producto de 1.200 pb contentivo del punto de fusión
BCR/ABL y del dominio TK, mientras que en la PCR2, la cual usó como templado 2μl del
producto de la PCR1, se amplificó un producto de 565 pb correspondiente solo al dominio TK
(ver Fig. 23).
gcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtca
ctgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagt
tacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggag
cagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgacc
aactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagaa
gcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgt
tggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgtt
77
gcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaag
ctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggc
caaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctgg
taccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggc
agcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatac
gaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcc
tccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgac
gggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggt
gtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatgaagcacaag
ctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcgtgtggaagaaatacagcctgacg
gtggccgtgaagaccttgaaggaggacaccatggaggtggaagagttcttgaaagaagct
gcagtcatgaaagagatcaaacaccctaacctggtgcagctccttggggtctgcacccgg
gagcccccgttctatatcatcactgagttcatgacctacgggaacctcctggactacctg
agggagtgcaaccggcaggaggtgaacgccgtggtgctgctgtacatggccactcagatc
tcgtcagccatggagtacctggagaagaaaaacttcatccacagagatcttgctgcccga
aactgcctggtaggggagaaccacttggtgaaggtagctgattttggcctgagcaggttg
atgacaggggacacctacacagcccatgctggagccaagttccccatcaaatggactgca
cccgagagcctggcctacaacaagttctccatcaagtccgacgtctgggcatttggagta
ttgctttgggaaattgctacctatggcatgtccccttacccgggaattgacctgtcccag
gtgtatgagctgctagagaaggactaccgcatggagcgcccagaaggctgcccagagaag
gtctatgaactcatgcgagcatgttggcagtggaatccctctgaccggccctcctttgct
gaaatccaccaagcctttgaaacaatgttccaggaatccagtatctcagacgaagtggaa
Figura 23. Secuencia del híbrido BCR/ABL identificando el punto de fusión y el dominio tirosina –
quinasa. En violeta, amarillo y verde se señalan las secuencias donde se unen los cebadores. La línea vertical
muestra el punto de fusión BCR/ABL. El fondo azul claro corresponde a la zona amplificada en la PCR 1
(BCR/ABL+DTK: 1.200 pb). El mismo fondo pero con las letras color naranja corresponde a la zona amplificada
en la PCR 2 (DTK: 565 pb). La zona con fondo gris identifica el bolsillo de unión al ATP del dominio TK. La
zona con fondo azul oscuro identifica el loop catalítico del dominio TK. La zona subrayada en negro corresponde
al loop de activación del dominio TK.
La figura 23 muestra los diferentes juegos de cebadores usados en esta sección que
permitieron amplificar el dominio TK del híbrido (secuencias amarilla y verde). También se
resaltan las tres zonas de este dominio sensibles a mutaciones puntuales (secuencias en gris,
azul oscuro y subrayado).
Los productos obtenidos en las PCRs 1 y 2 fueron analizados (6 μl) en geles de
agarosa al 1.5% utilizando como buffer de corrida TAE 1X (Tris Base 2M, Ácido Acético
Glacial 5,71%, EDTA 0,05 M pH 8). La corrida electroforética se llevó a cabo en una cámara
horizontal “Easy CastTM” con un voltaje de 100 V y tiempo de corrida de 20 min. La
visualización de las bandas se hizo empleando un transiluminador de luz ultravioleta DyNA
Light Dual Intensity UV Transiluminator. Los geles fueron fotografiados en un equipo Gel
Doc 2000TM “Gel Documentation System”, PC, 220-240 V y analizados por el uso del
software Quantity One 4.2.1 de Biorad.
78
Purificación de los productos de la PCR.
Los productos de la PCR 2 (dominioTK) fueron corridos en geles de agarosa de bajo
punto de fusión (Promega) al 2.5 % y las bandas con el tamaño esperado fueron cortadas y
colocadas en eppendorf de 1.5 ml identificados. El método de purificación empleado fue el
“kit Wizard® PCR preps DNA purification system” y se siguió el mismo protocolo
especificado en la sección de diagnóstico molecular.
Secuenciación automática.
Las muestras purificadas fueron enviadas para análisis por secuenciación automática.
Las cantidades y concentraciones de productos y cebadores (sentido ABL-F4 y antisentido
ABL-R6) fueron preparadas de acuerdo a lo establecido por el centro de secuenciación
automática CEESAN. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con respecto a la
secuencia reportada para este dominio en la base de datos del “Gene Bank” y adicionalmente
fueron alineadas usando el software presente en la página web http://bio.lundberg.gu.se/
79
RESULTADOS
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BCR/ABL
Con el objeto de confirmar no solo la presencia del oncogen BCR/ABL en los
pacientes venezolanos con LMC, sino además de poder establecer la presencia de las
diferentes variantes que han sido reportadas en la literatura, se estandarizaron los
protocolos para el diagnóstico molecular de la translocación 9:22, lo cual implicó
amplificar por PCR, clonar y secuenciar las muestras de los pacientes que resultaron
positivos para esta translocación.
Extracción de ARN total.
Los dos métodos empleados en el laboratorio de genética molecular humana para la
estandarización de la extracción del ARN total a partir de sangre periférica (SP) o médula
ósea (MO) dieron resultados muy satisfactorios, debido a que, en ambos casos, se pudo
obtener un ARN total de buena calidad y concentración. Es importante mencionar que en el
caso particular de la extracción de ARN total a partir de MO, no fue necesario hacer
ninguna variación en el protocolo gracias a que el uso del gradiente con Ficoll, para la
obtención de células mononucleares, permitió la eliminación de espículas y restos de grasas
provenientes de este tipo de muestra.
Extracción de ARN total. Protocolo A (Chomczynski y Sacchi, 1986).
De los 297 pacientes a los que se les hizo extracción de ARNt, 50 fueron procesados
usando el método descrito por Chomczynski y Sacchi (1986), el cual fue modificado en el
laboratorio. Este método permitió hacer una purificación óptima del ARNt tanto de médula
ósea (MO) como de sangre periférica (SP) en los pacientes estudiados. La integridad y
abundancia del ARNt extraído fue evidenciado tanto por la ubicación de las bandas
respectivas en el gel, como por su separación e intensidad. En efecto, en la figura 23 se
observan las dos bandas más resaltantes de las extracciones del ARNt de los pacientes,
correspondientes a los ARNs ribosomales (ARNr) 28S y 18S y la banda más débil ubicada
80
en la parte inferior del gel corresponde al ARNr 5S. Es posible apreciar que entre los ARNr
28S y 18S se encuentra una región que corresponde a la mayor proporción de ARN
mensajeros (ARNm), obtenido durante el proceso de extracción.
Cabe destacar que durante el proceso de extracción del ARNt también fue posible
encontrar que en algunos casos, la cantidad de ARNt obtenida fue baja, como se puede
apreciar en el caso de la muestra del paciente 108 (figura 24/ carril 1), sin embargo esto no
afectó los posteriores análisis realizados sobre las muestras. Aún en los casos de muestras
que presentaron una degradación parcial, fue posible realizar los ensayos posteriores por
PCR, ya que los fragmentos amplificados se encontraban delimitados en un promedio de
tamaño comprendido entre 300/820 pb. Por otra parte, también fue posible encontrar que en
algunos casos las extracciones obtenidas contenían abundante cantidad de ARNt, esto
debido a la cuantiosa cantidad de células inmaduras presentes en muchos de los pacientes
analizados, observadas durante el desarrollo del protocolo de extracción, como por ejemplo
el caso de los pacientes 19 y 20 (figura 24/ carriles 4 y 5), que resultaron diagnosticados
como positivos para BCR/ABL. Para estos casos de presencia abundante de ARNt, se
procedió a la preparación de las diluciones respectivas, en modo de evitar que las
reacciones de amplificación posteriores se vieran inhibidas por exceso de muestra.
108
mo
112
mo
13
sp
19
sp
20
mo
28 S
ARNm
18 S
5S
1
2
3
4
5
Figura 24. Extracción de ARNt. Los ARNt extraídos de los pacientes 108, 112, 13, 19 y 20 fueron corridos
en geles de agarosa al 1%. Los carriles 1, 2 y 5 corresponden a ARNt obtenidos a partir de médula ósea (mo)
y los carriles 3 y 4 corresponden a ARNt obtenidos a partir de sangre periférica (sp). Los ARNr de mayor
abundancia (28S, 16S y 5S), así como la distribución de los ARNm son indicados en la figura.
81
Extracción de ARN total. Protocolo B (Usando Trizol).
Del total de 297 muestras analizadas, 247 ARNt fueron obtenidos usando el reactivo
Trizol (Invitrogen), tal como lo señala el protocolo original de la casa comercial. En la
figura 25 se muestra la corrida en geles de agarosa de los ARN’s de los pacientes 25, 42,
43, 54, 69 y 70. Como se puede observar, las muestras presentaron variación en la
concentración del ARNt, identificándose, al igual que en el primer protocolo, los diferentes
tipos de ARN ribosomal y mensajero. En este caso tampoco se observaron indicios de
degradación en estas muestras y aunque algunas presentaron una baja concentración
(Paciente 42 y 69), estas pudieron ser usadas en los experimentos de retro-transcripción y
amplificación por PCR sin ningún tipo de contratiempo.
Los datos obtenidos en la cuantificación espectrofotométrica de las muestras,
empleando ambos métodos de extracción, revelaron que la mayoría de ellas presentaron
valores ubicados en el rango entre 1.8 y 2.0 en la relación OD260/ OD280, indicando un buen
grado de pureza en todas las muestras producidas en ambos tipos de protocolos. Es
importante resaltar que los dos tipos de muestras (sangre periférica y médula ósea) usadas
en las dos técnicas de extracción dieron un buen rendimiento indiferentemente de su
procedencia, siendo el factor preponderante para una mayor cantidad obtenida, el número
de células iniciales sobre las cuales se hizo la extracción. Como ya se indicó con
anterioridad, visualmente fue posible predecir un mayor rendimiento en la cantidad
obtenida, por simple observación de un mayor número de células durante el procesamiento
de las muestras.
Por último, debemos mencionar que lograr obtener un ARN total puro e íntegro fue
un paso fundamental en este trabajo, el cual garantizó la obtención de resultados confiables
en las técnicas posteriores en las que éste fue usado. Un ARN puro es de vital importancia
si se toma en consideración que en técnicas como la RT-PCR convencional y la RT-PCR en
Tiempo Real cualquier contaminante puede influir significativamente en la actividad de las
enzimas involucradas en las diferentes reacciones, así como también en la función de algún
otro compuesto.
82
25
42
43
54
69
70
mo
mo
sp
sp
mo
mo
28 S
ARNm
18 S
5S
1
2
3
4
5
6
Figura 25. Extracción de ARNt con Trizol. Los ARNt extraídos de los pacientes 25, 42, 43, 54, 69 y 70
fueron corridos en geles de agarosa al 1%. Los carriles 1, 2, 5 y 6 corresponden a ARNt extraídos a partir de
médula ósea (mo) y los carriles 3 y 4 corresponden a ARNt obtenidos a partir de sangre periférica (sp). Los
ARNr de mayor abundancia (28S, 16S y 5S), así como la distribución de los ARNm son indicados en la
figura.
Determinación de la translocaciòn BCR/ABL por transcripción inversa a partir de
ARNt y su posterior amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (RTPCR).
De las 297 muestras de pacientes a las que se les realizó RT-PCR, 200 (67.3%)
resultaron positivas y 97 (32.7%) resultaron negativas para el oncogen BCR/ABL. Del total
de 200 pacientes positivos obtenidos se determinó que 87/200 (43.5%) mostraron solo la
variante b2a2, 79/200 (39.5%) presentaron solo la variante b3a2 y 7/200 (3.5%) mostraron
la variante e1a2. Del restante grupo de pacientes, 25/200 (12.5%) y 2/200 (1%) presentaron
simultáneamente en co-expresión las variantes b2a2/b3a2 y b2a2/e1a2, respectivamente
(ver Tabla VII).
En todas las PCR realizadas para cada paciente fue amplificado simultáneamente un
control positivo interno (el gen BCR), en modo de verificar la ausencia de falsos negativos.
En algunos de los análisis realizados sobre las muestras de los pacientes LMC, no se
obtuvo
amplificación
de
este
control
interno.
Curiosamente
estas
muestras
fundamentalmente correspondieron a pacientes LMC con abundante cantidad de células
inmaduras (observadas durante la obtención de la muestra (mo/sp) y extracción del ARNt),
sobre las cuales se demostró por PCR ser positivas para la quimera BCR/ABL. Para este
resultado inesperado de la amplificación del control interno (BCR) no encontramos una
83
explicación, ya que durante la translocación que ocurre en la célula inmadura, esta
mutación se presenta tan solo en uno de los alelos, quedando el otro alelo con la posibilidad
de permitir la amplificación del control positivo, en este caso el gen BCR.
Tabla VII. Cuadro resumen de los 200/297 pacientes LMC positivos para la translocación BCR/ABL y sus
respectivas variantes obtenidas.
Variantes BCR/ABL
N° de pacientes
b2a2
87 (43.5%)
b3a2
79 (39.5%)
e1a2
7 (3.5%)
b2a2/b3a2
25 (12.5%)
b2a2/e1a2
2 (1%)
Total
200 (100%)
La figura 26 muestra el resultado molecular obtenido por RT-PCR de algunas de las
diferentes variantes de la translocación BCR/ABL encontradas en algunos pacientes
sospechosos clínicamente de LMC. Los diferentes tamaños de bandas producidos por PCR
que se pueden apreciar en el gel de agarosa, corresponden a los 3 únicos tipos de variantes
que fueron obtenidas en este estudio. A través de la combinación de diferentes cebadores
específicos fue posible detectar estas variantes. En el caso de las variantes b2a2 y b3a2, el
uso de los cebadores B2B (sentido) y CA3 (antisentido) (ver metodología) permitió su
detección, ya sea en forma individual (carriles 1 y 2, variante b2a2 (310 bp) y carril 3
variante b3a2 (380 bp)), o en forma de múltiples variantes expresándose simultáneamente
en un mismo paciente (carril 4, variantes b2a2 y b3a2). Por otra parte, la variante e1a2 (480
bp, carriles 5 y 6) fue determinada usando los cebadores BCR-C (sentido) y CA3
(antisentido).
84
Durante todas las amplificaciones realizadas por PCR para la determinación de las
variantes en estudio, fue realizado en paralelo la amplificación de un control interno el cual
nos permitió determinar cuando podríamos estar en presencia de falsos negativos, tal como
se explicó en el segundo párrafo de esta sección. El carril 7 de la figura 26, muestra la
amplificación positiva del control interno (BCR) de 808 pb del paciente 20, el cual a su vez
resultó positivo para la variante b2a2.
M
1
112
2
20
3
174
4
5
6
110
12434
12902
7
8
20
800 bp
BCR (Control Interno) (808 pb)
500 bp
BCRABL (e1a2) (480 pb)
BCRABL (b3a2) (380 pb)
300 bp
BCRABL (b2a2) (310 pb)
Figura 26. Amplificación por RT-PCR de las diversas variantes de BCR-ABL. Las muestras amplificadas
de los pacientes 112, 20, 174, 110, 12434 y 12902 fueron corridas en un gel de agarosa al 1.5%. Los carriles 1
y 2 muestran el producto de amplificación para la variante b2a2 (310 bp), el carril 3 muestra la variante b3a2
(380 bp), el carril 4 muestra la co-expresión de las variantes b2a2 y b3a2, los carriles 5 y 6 muestran la
variante e1a2 (480 bp), el carril 7 muestra la amplificación del control interno BCR (808 bp) y el carril 8
muestra el control negativo de reacción. M corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp.
Clonación de productos de PCR con variantes de BCR/ABL
Del número total de 297 pacientes estudiados (sospechosos clínicamente de LMC)
200 resultaron positivos para las diferentes variantes. Para determinar si los puntos de
fusión de algunas de las variantes de los pacientes con LMC estudiados, correspondían a las
secuencias reportadas en la literatura, 10 muestras (4 b2a2, 4 b3a2 y 2 e1a2) fueron
clonadas para facilitar el proceso de secuenciación, en particular durante el proceso de
secuenciación manual, en donde al inicio fue prácticamente imposible secuenciar
directamente a partir de productos de PCR, mas no así a partir de plásmidos con las
secuencias respectivas a ser secuenciadas. Los clones que se obtuvieron permitieron a su
vez almacenar material de muestras de pacientes positivos para diferentes variantes, y ser
85
usados como controles positivos, o simplemente conservar estos productos debido a que en
muchas oportunidades los ARNt se fueron degradando con el tiempo.
De cada uno de los productos de PCR clonados correspondientes a los 10 pacientes
estudiados, se lograron aislar varios clones contentivos de los diferentes insertos. La figura
27 muestra una foto representativa del crecimiento bacterial que por lo general se obtuvo en
estos casos. La coloración azul observada en las colonias indicó que estas no poseían el
inserto (región Lac Z del ADN bacterial no interrumpida), mientras que las colonias
blancas o con bordes azulados indicaron la presencia del inserto.
Colonias Azules
(Inserto Ausente)
Colonias Blancas
(Inserto Presente)
Figura 27. Determinación de colonias positivas conteniendo el fragmento clonado. Se observa el
crecimiento de colonias correspondiente a células competentes DH5α transformadas con el vector pGEM T
easy, ligado al inserto de interés. Las células fueron crecidas en placas que contenían 25 ml del medio
nutritivo LB agar con Ampicilina (100 μg/ml), IPTG (100 mg/ml) y X-gal (40 mg/ml).
A partir de las placas conteniendo las bacterias transformadas, se procedió al
crecimiento en suspensión de algunas de las colonias blancas de los 10 clones.
Posteriormente se extrajeron, mediante mini-preparaciones, los diferentes plásmidos
purificados a ser secuenciados, en los cuales se pudo confirmar la presencia de los
respectivos insertos en los plásmidos presentes en las bacterias transformadas, mediante
análisis de restricciones de los plásmidos con la enzima EcoRI (ver Anexo B). A manera de
ejemplo, en la figura 28 se pueden observar algunos de los clones positivos para la
presencia del inserto b2a2 en los pacientes 20 y 130, a través de las bandas obtenidas
86
(carriles 3, 4, 5, 7, 8, 11 12 y 14), posterior al análisis de restricción. En el caso de pacientes
positivos para las variantes b3a2 y e1a2 se procedió de la misma manera (datos no
mostrados).
Clones Paciente 20
Clones Paciente 130
Plásmidos
500 pb
Insertos (310 pb)
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14
Figura 28. Determinación de clones positivos. La digestión de los clones se llevo a cabo con la enzima de
restricción EcoRI, para la identificación de plásmidos positivos que contenían el inserto (carriles: 3, 4, 5, 8,
11, 12 y 14). Las muestras de los pacientes 20 y 130 fueron corridas en geles de agarosa al 2%. Se cargaron
10 μl de la reacción por carril y el gel fue corrido durante 20 min. a 60 mV. Las flechas indican los insertos
liberados así como los plásmidos linearizados. Carril 1 corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp.
Secuenciación de las muestras clonadas o productos de PCR de las diferentes
variantes de BCR/ABL.
A través del proceso de secuenciación de tan solo algunas muestras se buscó
determinar: 1) si coincidía el punto de fusión de las quimeras secuenciadas, en sus
respectivas variantes, con las secuencias reportadas en la base de datos; 2) cambios
significativos en el marco de lectura de la quimera BCR/ABL obtenida con los cebadores
empleados, que pudieran originar modificaciones de aminoácidos esenciales tanto en los
dominios perteneciente a la región de ABL como en la región de BCR que conforma la
quimera. Estos cambios pudieran estar relacionados con la producción de quimeras con
mayor actividad oncogénica. Cabe destacar que en los geles de agarosa siempre se
observaron los productos amplificados a tamaños similares a los reportados en la literatura,
sin embargo en vista de que esta simple observación no es suficiente para garantizar que las
quimeras obtenidas fueran similares en secuencia a las reportadas, se tomaron algunas
muestras en forma aleatoria para producir su secuencia y verificarlo con respecto a lo
reportado.
87
Secuenciación manual.
Los primeros análisis de secuenciación fueron realizados en forma manual debido a
que no se tenía la expectativa, para aquel entonces, de poder realizar las secuencias
automáticas. Sin embargo, es importante mencionar que estas secuencias manuales se
hicieron a partir de productos previamente clonados y no a partir de productos de PCR, tal
como se explicó en la sección anterior.
Efectivamente, 5 de los 10 pacientes estudiados (20, 54, 112, 130 y 139) fueron
secuenciados de manera manual con éxito, lo que permitió realizar una lectura adecuada de
las mismas. Los experimentos de secuenciación manual fueron hechos por duplicado para
cada paciente.
La figura 29 muestra la secuenciación manual del paciente 112, positivo para la
variante b2a2 de BCR/ABL. Como se observa en esta figura, las flechas gruesas indican el
punto de fusión de los genes bcr y abl, descritos en la literatura para la translocación
BCR/ABL. Las flechas delgadas indican la lectura de algunas de las bases observadas,
resaltando en azul el punto de fusión. Cabe destacar, que en algunos casos en donde estaban
2 bases similares consecutivas en la secuencia, se formaba una banda más gruesa, no
definiéndose la separación de las 2 bandas, esto ocasionalmente dificultaba un poco el
análisis.
Cada una de las secuencias manuales obtenidas de los pacientes con LMC (20, 54,
112, 130 y 139) fueron leídas y alineadas entre ellas y con respecto a la secuencia de la
quimera BCR/ABL (número de acceso: AJ131467), en modo de verificar que estas
secuencias mostraban el punto de fusión BCR/ABL para la variante b2a2 reportado en la
literatura.
88
c
a
t
c
a
a
t
a
a
g
g
a
a
g
a
a
g
c
c
c
t
t
T
G
C
BCR
ABL
A
Figura 29. Secuencia manual del paciente 112 (b2a2). Corrida electroforética en gel de poliacrilamida al
6% de la secuencia del clon del paciente 112, positivo para la variante b2a2. Las flechas gruesas indican la
región de fusión de la translocación BCR/ABL. Las flechas delgadas indican algunas de las bases obtenidas
en el electroferograma. La corrida se hizo a un voltaje de 2000 V por 2 min. y luego a un voltaje de 1000 V
por 7 h. El gel fue teñido por tinción con plata, secado, escaneado y las imágenes fueron almacenadas.
Como se puede observar en la figura 30, todos los pacientes presentaron el mismo
punto de fusión BCR/ABL (variante b2a2) reportado en la literatura bajo el número de
acceso AJ131467. Cabe destacar que durante el proceso de lectura de las secuencias
manuales se detectó un único cambio de base T/C en la posición 402 de la secuencia
BCR/ABL (en el segmento correspondiente al gen abl), en los pacientes 112 y 139 (99% de
homología) lo cual no produjo ningún cambio de aminoácidos.
89
Estos resultados de secuenciación manual permitieron confirmar que los pacientes
20, 54, 112, 130 y 139 no sólo son positivos para la translocación BCR/ABL, sino que
además son portadores de la variante b2a2 específicamente.
BCR/ABL
Score = 349 bits (176), Expect = 2e-93
Identities = 179/180 (99%), Gaps = 0/180 (0%)
(Variante b2a2)
Pac.20
1
Pac.54
1
Pac.112
1
Pac.130
1
Pac.139
1
BCR/ABL
274
a.a
I
Pac.20
61
Pac.54
61
Pac.112
61
Pac.130
61
Pac.139
61
BCR/ABL
334
a.a
121
Pac.54
121
Pac.112
121
Pac.130
121
Pac.139
121
BCR/ABL
394
P
L
T
I
N
K
E
E
A
L
Q
R
P
V
A
S
D
F
Q
G
L
S
E
A
A
R
W
N
S
K
E
N
L
L
A
G
E
N
D
P
N
L
F
V
A
L
Y
D
60
60
60
60
333
120
120
120
120
120
393
P
AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGAAAACGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGT
|||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGAAAACGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG
|||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC
S
60
E
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
P
Pac.20
a.a
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
180
180
180
180
180
453
F
Figura 30. Alineación de las secuencias manuales de los pacientes LMC 20, 54, 112, 130, 139 y la secuencia
reportada para la translocación BCR/ABL (variante b2a2, número de acceso: AJ131467). La zona resaltada
en letras verdes indica la secuencia del cebador sentido B2B usado para la detección de la translocación. Las
flechas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl. Las letras en azul indican la secuencia aminoacídica. Los
recuadros azules indican un mismo cambio de base T/C (en la posición 402) detectado en los pacientes LMC 112
y 139, el cual no implicó cambio de aminoácidos.
90
Secuenciación Automática.
Una vez que se pudo contar con la facilidad de poder enviar a secuenciar de manera
automática las muestras, se procedió a verificar las secuencias que fueron realizadas de
modo manual y otras muestras adicionales, de las variantes b2a2 (7), b3a2 (5) y e1a2 (3).
Las secuencias automáticas fueron alineadas en bloques para poder analizar posibles
cambios ocurridos entre las diferentes secuencias.
Variante b2a2.
La figura 31 muestra la secuenciación automática de 7 pacientes con LMC (20, 54,
93, 112, 130, A9 y A6), en los cuales se confirmó la presencia de la variante b2a2. Como se
observa en esta figura, las flechas gruesas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl,
descrito en la literatura para la translocación BCR/ABL, variante b2a2. Como se puede
apreciar fueron detectados 3 polimorfismos en los pacientes LMC 93, 112 y 130, todos
ubicados en la región del gen abl perteneciente a la quimera. En el caso de los pacientes
LMC 93 y 112 se encontró un mismo polimorfismo T/C en la posición 402 (abl), mientras
que en el paciente LMC 130 fue detectado otro polimorfismo T/C en la posición 434 (abl).
En los 3 casos no hubo cambio de aminoácidos, por lo tanto las mutaciones detectadas
fueron consideradas como silentes.
Por su parte, la figura 32 muestra los electroferogramas parciales correspondientes a
las secuencias de los pacientes 93 y A9 donde es posible apreciar el punto de fusión de la
quimera BCR/ABL variante b2a2. Con este resultado, llevado a cabo en un grupo de
pacientes LMC, fue posible confirmar la existencia del punto de fusión BCR/ABL
reportado en la literatura (Melo y Col. 1993).
91
Variante b2a2.
BCR/ABL
(Variante b2a2)
20
1
54
1
93
1
112
1
A9
1
A6
1
BCR/ABL 274
a.a
20
61
54
61
93
61
112
61
A9
61
A6
61
BCR/ABL 334
a.a
20
121
54
121
93
121
112
121
A9
121
A6
121
BCR/ABL 394
a.a
20
181
54
181
93
181
112
181
A9
181
A6
181
BCR/ABL 454
a.a
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAAGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG
I P L T I N K E E A L Q R P V A S D F E
60
60
60
60
60
60
333
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCCTCAGGGTTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
|
|| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC
P Q G L S E A A R W N S K E N L L A G P
120
AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGAAAACGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC
|||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGAAAACGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC
|||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCAC
|||
||| | | |||
|
AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC
S E N D P N L F V A L Y D F V A S G D N
180
ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGA
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
240
ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAA
T L S I T K G E K L R V L G Y N H N G E
92
120
120
120
120
120
393
180
180
180
180
180
453
240
240
240
240
240
513
20
241
54
241
93
241
112
241
A9
241
300
A6
241
300
BCR/ABL 514
TGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||
||||||||||||||||||||||||||
TGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||
TGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||
TGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGC
|||||||||||||||||||||||||||
300
300
300
300
TGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGC
a.a
W
C
E
A
Q
T
K
N
G
Q
546
G
Figura 31. Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC 20, 54, 93, 112, 130, A9 y A6 y la
secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante b2a2, número de acceso: AJ131467). La
zona resaltada con letras verdes indica la secuencia del cebador sentido B2B usado para la detección de la
translocación. Las flechas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl. Las letras en azul indican la secuencia
aminoacídica correspondiente a la región secuenciada. Los recuadros azules indican un mismo cambio de base
T/C (2 en la posición 402 [pacientes LMC 93 y 112] y 1 en la posición 434 [paciente LMC 130]) los cuales no
implicaron cambios de aminoácidos.
A
Pac LMC A9.
ABL/BCR
B
Pac LMC 93.
ABL/BCR
Figura 32. Secuencias de los pacientes LMC 93 y A9 con el punto de fusión de la quimera BCR/ABL,
variante b2a2. Panel A: paciente LMC A9. Panel B: Paciente LMC 93. Todas las secuencias fueron realizadas en
ambos sentidos usando los cebadores B2B y CA3. Las flechas señalan el punto de fusión b2a2.
93
Variante b3a2.
La figura 33 muestra la secuenciación automática de 5 pacientes con LMC (A15,
A16, A17, A18 y A19), en los cuales se confirmó la presencia de la variante b3a2. Como se
observar en esta figura, las flechas gruesas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl,
descrito en la literatura para la translocación BCR/ABL, variante b3a2. Como se puede
apreciar, a diferencia de la variante b2a2, no fueron detectados cambios en la secuencia de
ninguno de los 5 pacientes analizados.
La figura 34 muestra los electroferogramas parciales correspondientes a las
secuencias de los pacientes A15 y A19 donde es posible apreciar el punto de fusión de la
quimera BCR/ABL variante b3a2. Con este resultado, llevado a cabo en un grupo de
pacientes LMC, fue posible confirmar la existencia del punto de fusión BCR/ABL
reportado en la literatura (Melo y Col. 1993).
Variante b3a2.
BCR/ABL
A15
1
A16
1
A17
1
A18
1
A19
1
BCR/ABL 274
a.a
A15
61
A16
61
A17
61
A18
61
A19
61
BCR/ABL 334
a.a
A15
121
A16
121
A17
121
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT
I P L T I N K E D D E S P G L Y G F L N
60
60
60
60
60
333
GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA
V I V H S A T G F K Q S S K A L Q R P V
120
GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC
|||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
180
94
120
120
120
120
393
180
180
A18
121
A19
121
BCR/ABL 394
a.a
A15
181
A16
181
A17
181
A18
181
A19
181
BCR/ABL 454
a.a
A15
241
A16
241
A17
241
A18
241
A19
241
BCR/ABL 514
a.a
GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC
|||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||||||||||||||
GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||
GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC
A S D F E P Q G L S E A A R W N S K E N
180
CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG
L L A G P S E N D P N L F V A L Y D F V
240
GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT
A S G D N T L S T K G E K L R V L G Y N
180
453
240
240
240
240
513
300
300
300
300
300
546
Figura 33. Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC A15, 16, 17, 18 y 19 y la
secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante b3a2, número de acceso: AJ131466). La
zona resaltada con letras verdes indica la secuencia del cebador sentido B2B usado para la detección de la
translocación. Las flechas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl. Las letras en azul indican la secuencia
aminoacídica correspondiente a la región secuenciada. La zona resaltada tanto de la secuencia nucleotídica como
de la secuencia de aminoácidos indican el excedente de la porción de abl presente en esta variante.
A
Pac LMC A15.
ABL/BCR
B
Pac LMC A19.
ABL/BCR
Figura 34. Secuencias de los pacientes LMC A15 y A19 con el punto de fusión de la quimera BCR/ABL,
variante b3a2. Panel A: paciente LMC A15. Panel B: Paciente LMC A19. Todas las secuencias fueron realizadas
en ambos sentidos usando los cebadores B2B y CA3. Las flechas señalan el punto de fusión b2a2.
95
Variante e1a2.
La figura 35 muestra la secuenciación automática de 2 pacientes LMC (A7 y A14),
en los cuales se confirmó la presencia de la variante e1a2. Como se puede apreciar en esta
figura, las flechas gruesas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl, descrito en la
literatura (Melo y Col. 1996) para la translocación BCR/ABL, variante e1a2. En este caso,
no se encontraron cambios en las secuencias de los pacientes LMC con respecto a la
secuencia reportada (AF113911).
Variante e1a2.
A7
1
A14
1
BCR/ABL
a.a
1
A76
1
A14
61
CAACAGTCCTTCGACAGCAGCAGTCCCCCCACGCCGCAGTGCCATAAGCGGACCCGGCAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAACAGTCCTTCGACAGCAGCAGTCCCCCCACGCCGCAGTGCCATAAGCGGCACCGGCAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAACAGTCCTTCGACAGCAGCAGTCCCCCCACGCCGCAGTGCCATAAGCGGCACCGGCAC
Q Q S F D S S S P P T P Q C H K R H R H
BCR/ABL 61
a.a
TGCCCGGTTGTCGTGTCCGAGGCCACCATCGTGGGCGTCCGCAAGACCGGGCAGATCTGG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TGCCCGGTTGTCGTGTCCGAGGCCACCATCGTGGGCGTCCGCAAGACCGGGCAGATCTGG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TGCCCGGTTGTCGTGTCCGAGGCCACCATCGTGGGCGTCCGCAAGACCGGGCAGATCTGG
C P V V V S E A T I V G V R K T G Q I W
60
60
60
120
120
120
BCR/ABL
(Variante e1a2)
A7
121
CCCAACGATGGCGAGGGCGCCTCCCATGGAGACGCAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCCAACGATGGCGAGGGCGCCTCCCATGGAGACGCAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
180
A14
121
BCR/ABL
a.a
121
CCCAACGATGGCGAGGGCGCCTCCCATGGAGACGCAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCA
P N D G E G A S H G D A E A L Q R P V A
180
A7
181
240
A14
181
BCR/ABL
a.a
181
TCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTT
S D F E P Q G L S E A A R W N S K E N L
A7
241
300
A14
241
BCR/ABL
a.a
241
CTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCC
L A G P S E N D P N L F V A L Y D F V A
A7
301
360
A14
301
BCR/ABL
a.a
301
AGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAAT
S G D N T L S I T K G E K L R V L G Y N
A7
361
420
A14
361
CACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAAC
96
180
240
240
300
300
360
360
420
BCR/ABL
a.a
361
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAAC
H N G E W C E A Q T K N G Q G W V P S N
420
Figura 35. Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC A7 y A14 y la secuencia
reportada para la translocación BCR/ABL (Variante e1a2, número de acceso: AF113911). La zona
resaltada con letras verdes indica la secuencia del cebador sentido BCR-C usado para la detección de la
translocación. Las flechas indican el punto de fusión de los genes bcry abl. Las letras en azul indican la
secuencia aminoacídica correspondiente a la región secuenciada.
La figura 36 muestra los electroferogramas parciales correspondientes a las
secuencias de los pacientes LMC A7 y A14 donde es posible apreciar el punto de fusión de
la quimera BCR/ABL variante e1a2. Con este resultado fue posible confirmar la existencia
del punto de fusión BCR/ABL reportado en la literatura (Melo y Col. 1996).
Pac LMC A7.
ABL/BCR
A
Pac LMC A14.
ABL/BCR
B
Figura 36. Secuencias de los pacientes LMC A7 y A14 con el punto de fusión de la quimera BCR/ABL,
variante e1a2. Panel A: paciente LMC A7. Panel B: Paciente LMC A14. Todas las secuencias fueron hechas
en ambos sentidos usando los cebadores BCR-C y CA3. Las flechas señalan el punto de fusión e1a2.
Es importante resaltar que en las secuencias obtenidas para las variantes b2a2 y
e1a2, la región correspondiente al gen abl es la misma (lectura a la derecha de la flecha)
mientras que la región perteneciente al gen bcr varió en cada una de ellas (lectura a la
izquierda de la flecha). Estos resultados evidencian el hecho de que en efecto el gen bcr
puede presentar diferentes puntos en su estructura que son sensibles a rupturas y con
capacidad para fusionarse de manera no aleatoria con el gen abl independientemente de la
zona donde se fraccione.
97
Análisis estadístico de los resultados obtenidos en el diagnóstico molecular de
BCR/ABL.
A partir de los datos obtenidos del diagnóstico molecular de los 200 pacientes
positivos para las diferentes variantes de la quimera BCR/ABL (ver tabla VII), se procedió
a realizar un análisis de frecuencia (ver tabla VIII) que permitió comparar la presencia de
las diferentes variantes (sean solas o en co-expresión múltiple) de los pacientes LMC
venezolanos con respecto a la reportada en la literatura internacional. Adicionalmente, se
analizó si existía una correlación significativa de la aparición entre la translocación
BCR/ABL y sus diferentes variantes, con respecto a la edad y el sexo, por separado.
Frecuencia de la quimera BCR/ABL en pacientes LMC venezolanos.
En el laboratorio se recibieron 297 muestras de pacientes diagnosticados
clínicamente con LMC, los cuales fueron posteriormente verificados mediante el uso de
herramientas moleculares. Como ya se mencionó, 200 pacientes fueron molecularmente
confirmados como LMC, lo cual a su vez, facilitó la determinación de la frecuencia de la
quimera BCR/ABL en estos pacientes (ver tabla VIII). Como se puede apreciar en la tabla
XI, el cálculo de la frecuencia de la quimera BCR/ABL en los pacientes venezolanos con
respecto a los datos reportados en países como México, Ecuador, Chile y Brasil muestran
que la frecuencia encontrada de la quimera BCR/ABL en nuestro estudio fue menor (alfa
0.05, χ2 > 5.024) que lo reportado en la literatura (Melo y Col. 1998; Meissner y Col. 1999;
Artigas y Col. 2002; Paz y Miño y Col. 2002), observándose que de los 297 pacientes
diagnosticados clínicamente con LMC, 200 (67,3%) de ellos resultaron ser realmente
pacientes LMC. La presencia de la translocación BCR/ABL es considerada el distintivo
para clasificar un paciente con LMC (Cross y Col. 1994; Melo y Col. 1996; Deininger y
Col. 2000). Por otra parte, los 97 (32.7%) pacientes restantes clínicamente diagnosticados
con LMC, fueron negativos para la presencia de la quimera BCR/ABL, lo cual sugiere que
estos pacientes a pesar de presentar una clínica similar, no pueden ser considerados como
LMC por no expresar la translocación distintiva de la misma.
Tabla VIII. Cálculo de la frecuencia de BCR/ABL en pacientes venezolanos con LMC y su comparación con
la frecuencia esperada de 95% de positivos para BCR/ABL, reportado en otros países (Melo y Col. 1996).
98
Positivo
Negativo
Total (n)
Frecuencia
Observada
Frecuencia
Esperada
χ2
Alfa/2
0.025
0,673
0,327
0,95
0,05
518,638
5,024
297
Frecuencia de las variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2 en pacientes
LMC venezolanos.
Basado en que no existen muchos reportes que reflejen la distribución de las
diferentes variantes de BCR/ABL, se podría afirmar que no hay un consenso que permita
decir cual debería ser la frecuencia esperada para cada una de las variantes conocidas, tal
como si ha sido descrita para la frecuencia de la translocación BCR/ABL en general. Por
esta razón, las frecuencias esperadas empleadas para la comparación entre las variantes de
BCR/ABL fueron de igual valor para cada una de ellas (la misma probabilidad de
ocurrencia de cada variante). En la tabla IX es posible apreciar la frecuencia de las
diferentes variantes BCR/ABL encontradas en los pacientes LMC venezolanos, la
frecuencia de igualdad esperada (igual valor para todas = 0,2) y su comparación.
Tabla IX. Frecuencia de las diferentes variantes BCR/ABL encontradas en los pacientes LMC venezolanos y
su comparación con un modelo de distribución uniforme.
Variante
n
Frecuencia
Frecuencia
Observada
Esperada
b2a2
87
0,435
0,2
b3a2
79
0,395
0,2
e1a2
7
0,035
0,2
b2a2/b3a2
25
0,125
0,2
b2a2/e1a2
2
0,01
0,2
Total
200
99
χ2
162,2
Alfa/2
0.025
11,143
Inicialmente los 200 pacientes LMC positivos para la translocación BCR/ABL,
fueron agrupados de acuerdo a las variantes presentes en cada uno. Cabe destacar que el
ensayo molecular a través del uso de cebadores específicos, una buena separación
electroforética y el uso de un marcador de peso molecular, permitió definir que variante
tenía cada paciente. Por lo tanto, se determinó que 87 pacientes LMC presentaron la
variante b2a2, 79 la variante b3a2, 7 la variante e1a2, 25 presentaron la coexpresión de las
variantes b2a2/b3a2 y 2 la coexpresión de las variantes b2a2/e1a2 (tabla IX).
Adicionalmente, en la tabla IX se puede apreciar que cada variante se presentó en
una proporción diferente a la esperada, siendo las más frecuentes las variantes b2a2 (0,435)
y b3a2 (0,395), seguidas de las mismas variantes en co-expresión b2a2/b3a2 (0,125); y por
último, se encontraron con menor frecuencia la variante e1a2 (0,035) y las variantes en coexpresión b2a2/e1a2 (0.010). Estos resultados, reflejan una disparidad con respecto a lo
esperado (χ2 > 162,2 - alfa 0.05), mientras que un análisis donde se contemplaron solo las
variantes mas frecuentes (b2a2 y b3a2 por separado), nos indicó que ambas variantes tienen
igual probabilidad de ser encontradas en los pacientes LMC (χ2 = 0.39 - alfa 0.05) (ver tabla
X).
Tabla X. Frecuencia de las variantes b2a2 y b3a2 encontrada en los pacientes LMC venezolanos y su
comparación con un modelo de distribución uniforme.
Variante
n
Frecuencia
Frecuencia
Observada
Esperada
b2a2
87
0,435
0,5
b3a2
79
0,395
0,5
Total
166
100
χ2
0.39
Alfa/2
0.025
5.02
Comparación de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2 y b2a2/b3a2 entre
pacientes LMC venezolanos y otros países latinoamericanos.
Una vez establecidas las frecuencias de las variantes encontradas en los pacientes
LMC venezolanos, se decidió comparar estos datos contra los datos latinoamericanos
reportados en la bibliografía. En vista de que los escasos estudios latinoamericanos no
reportan todas las variantes encontradas en este trabajo, la comparación de las frecuencias
entre Venezuela y otros países latinoamericanos solo se realizó con aquellas variantes que
coincidieron con este estudio; por lo tanto en esta sección solo fueron consideradas 2 de las
variantes por separadas (b2a2 y b3a2) y la co-expresión b2a2/b3a2, las cuales fueron
encontradas como las mas frecuentes en este trabajo.
La tabla XI muestra el p valor de la comparación entre las frecuencias determinadas
por este trabajo, con las frecuencias reportadas en México (Arana-Trejo RM y Col. 2002),
Ecuador (Paz y Miño y Col. 2002), Brasil (Meissner y Col. 1999) y Chile (Artigas y Col.
2002), usando un alfa corregido de 0,005. Con este análisis se determinó que no existe
ninguna diferencia significativa entre Venezuela y México con respecto a las variantes b2a2
y b3a2, sea por separado o en su condición de co-expresión b2a2/b3a2.
En el caso de Ecuador, solo fue posible comparar con respecto a las 2 variantes mas
frecuentes encontradas (b2a2 y b3a2), ya que en el estudio ecuatoriano no fue reportado
ningún caso con ambas variantes en co-expresión (b2a2/b3a2). Sin embargo, a diferencia
del análisis efectuado con respecto a México, el estudio del Ecuador reportó una baja
frecuencia para la variante b3a2, la cual al ser comparada con el valor obtenido en este
estudio mostró una diferencia estadísticamente significativa (p = 0,0002) (ver tabla XI).
Con respecto a los valores obtenidos en este estudio y comparándolos con los de
Brasil, no se obtuvieron diferencias significativas para ninguna de las variantes, ya sea por
separado (b2a2 y b3a2) o en co-expresión (b2a2/b3a2). Por último, con respecto a Chile
sólo se pudo comparar la variante b3a2, no encontrándose ninguna diferencia significativa
de la frecuencia con respecto a lo reportado en este estudio. Es importante hacer notar el
contraste apreciable entre los diferentes números de muestras procesadas (“n”) en los
101
estudios realizados en Ecuador, Brasil y Chile (37, 33 y 11 respectivamente), con respecto a
los estudiados en México (250) y Venezuela (200) (este estudio).
Tabla XI. Valores de p obtenidos de la comparación entre las frecuencias de las variantes (b2a2, b3a2,
b2a2/b3a2) encontradas en Venezuela y en otros países latinoamericanos. n = n° de pacientes LMC
estudiados. En rojo se señala el valor de p con una diferencia significativa.
n
Venezuela/México
Venezuela/Ecuador
Venezuela/Brasil
Venezuela/Chile
200/250
200/37
200/33
200/11
Variante
b2a2
0,0969 (87/120)
b3a2
0,6213 (79/88)
b2a2/b3a2
0,4126 (25/17)
b2a2
0,0789 (87/35)
b3a2
0,0002 (79/2)
b2a2/b3a2
b2a2
0,0057 (87/13)
b3a2
0,0131 (79/14)
b2a2/b3a2
b2a2
0,0504 (25/6)
b3a2
0,0613 (79/6)
b2a2/b3a2
alfa corregido 0,0056
Comparación de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y
b2a2/b3a2 de los pacientes LMC venezolanos con respecto a la edad y el sexo.
En la medida en que se fueron recopilando los datos de las diferentes variantes
encontradas en los pacientes LMC, y basado en que la leucemia mieloide crónica es una
enfermedad que ha sido reportada predominantemente en adultos, este trabajo analizó si
había alguna correlación estadísticamente significativa entre la aparición de alguna (s) de
las variantes y la edad en que fueron diagnosticados clínica y molecularmente los pacientes.
Adicionalmente se extendió el análisis con respecto al sexo.
102
La figura 37(A) muestra el resultado obtenido para la distribución de las variantes
encontradas en los pacientes LMC con respecto a la edad. Como es posible apreciar el
mayor número de casos estuvo comprendido entre las edades de 21 a 60. Al mismo tiempo,
se pudo observar que las variantes más frecuentes estuvieron presentes en todos los grupos
de edad, mientras que la coexpresión de variantes (b2a2/b3a2; b2a2/e1a2) fue más
frecuente en pacientes mayores de 20 años.
En el caso de la distribución de la enfermedad con respecto al sexo (Fig. 37 B) se
pudo observar que todas las variantes presentaron una distribución similar en ambos sexos.
Por último, la figura 37(C) muestra el análisis estadístico de regresión logística realizado
con el programa R (R Development Core Team 2006) mediante el cual se evaluaron las
variables sexo y edad, con respecto a las variantes BCR/ABL encontradas en los pacientes
LMC venezolanos. Este análisis determinó que no existen razones suficientes para pensar
que hay una relación de los casos de LMC observados con la edad o el sexo, esto quiere
decir, que el riesgo de padecer la enfermedad no es directamente proporcional a la edad, ni
se relaciona con el sexo. Aunque esto último pudiera parecer una contradicción con lo
observado en la figura 37 A, lo que nos está indicando es que existe una edad media en la
cual es mayor la posibilidad de que la enfermedad sea detectada y que esta edad media
corresponde al grupo de los adultos.
Para descartar que la mayor incidencia en la detección de la LMC, en la población
adulta, no fuera resultado de un efecto de la distribución de edades de la población general
venezolana, se comparó la distribución de edad de los pacientes LMC con respecto a la
población general. La figura 38 muestra que la distriución de edad dentro de la enfermedad
(barras) no sigue la misma tendencia que la distribución de edad de la población general
(línea azul), por lo tanto, la mayor frecuencia de la enfermedad entre los 20 y 60 años no es
resultado de la distribución de edad de la población venezolana.
103
B
A
N° de pacientes BCR/ABL positivos
n 87
80
M
F
n 79
60
40
n 25
n 25
20
n7
n 7
0
b2a2
b3a2
Edad
n2
e1a2
b2a2/
b3a2
b2a2/
e1a2
Variantes
C
Coeficiente
Error Estándar
p valor
r2
0,01
Intercepto
-0,154
0,908
0,86
Edad
0,011
0,019
0,57
Sexo
0,669
1,264
0,59
Interacción
-0,021
0,028
0,45
Figura 37. Análisis de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2 de los
pacientes LMC venezolanos con respecto a la edad y el sexo. (A) indica la distribución de las variantes
encontradas vs la edad. (B) indica la distribución de las diferentes variantes estudiadas vs el sexo. (C) Análisis
estadístico de regresión logística para evaluar las variables sexo y edad (Programa R [Development Core
Team 2006]). Los datos empleados corresponden al total de pacientes LMC positivos (200) para la
translocación BCR/ABL.
0.015
0.010
0.000
0.005
Probabilidad
0.020
Distribucion por grupo de edad en pacientes LMC y la poblacion general Venezolana
10
20
30
40
50
60
70
80
EDAD
Figura 38. Distribución por grupos de edades de los pacientes BCR/ABL y distribución de la
población general Venezolana. El histograma de frecuencia muestra como están distribuidas las edades de
los pacientes LMC positivos para la quimera BCR/ABL. La línea azul muestra la distribución de la
población venezolana (Tomado de http://www.ocei.gov.ve)
104
DETECCIÓN DE OTRAS TRANSLOCACIONES QUE INDUCEN
LEUCEMIA: PANEL DE DIAGNÓSTICO.
A partir de las diferentes PCR’s realizadas para la estandarización de las 7
translocaciones en estudio y del control interno GAPDH, los diversos productos obtenidos
fueron corridos en geles de agarosa al 1.5% para su visualización. Es importante mencionar
que una vez que fueron optimizadas las condiciones de PCR para cada translocación, se
realizaron
al menos tres
repeticiones de cada una de ellas. Para ninguna de las
translocaciones estudiadas se contó con un control positivo de los tamaños reportados y
dado que los cebadores empleados permiten la identificación de nuevas variantes dentro de
las zonas estudiadas para cada translocación, se esperaba observar la presencia de variantes
no reportadas, tal como pudo observarse en la referencia tipo (Pallisgaard y Col. 1998). En
efecto, la figura 39 muestra el ordenamiento de las 7 translocaciones que fueron
estandarizadas usando 40 pacientes que dieron negativos para la quimera BCR/ABL.
La figura 39 A muestra una corrida electroforética representativa de los pacientes
con sintomatología clínica de LMC que fueron estudiados para la translocación
CBFβ/MYH11. Solo dos (3 y 4) de los tres carriles presentaron productos de amplificación
para esta alteración, también conocida como inv 16. La banda observada en el carril 3,
aunque es tenue, corresponde con uno de los tamaños esperados (241 pb) para esta
translocación (ver tabla III en Metodología). Por su parte, la banda observada en el carril 4,
con un tamaño aproximado de 150 pb, podría corresponder con el producto esperado de
174 pb, sin embargo no se puede dar fe cierta de esto hasta no obtener la secuencia de este
producto. Por su parte, la figura 39 B muestra el gel de agarosa representativo de los
pacientes a los que se les amplificó la translocación AML1/ETO. En este caso se puede
decir que aunque se observaron bandas bien definidas en dos de los pacientes analizados
(carriles 2 y 3), estas no correspondieron con el tamaño esperado (353 pb) para esta
translocación, también identificada como t(8:21). Adicionalmente, se pudo observar que
entre las bandas observadas para cada paciente existió disparidad de tamaño
(aproximadamente150 y 180 p). Este resultado llamó poderosamente la atención puesto que
105
este patrón se repitió en todas las repeticiones realizadas. Para descartar la presencia de
nuevas variantes para esta translocación se hace indispensable la secuenciación de estos dos
productos.
Figura. 39 Estandarización por RT-PCR de 7 translocaciones vinculadas en el origen y evolución de
otros tipos de leucemias. Las 7 translocaciones fueron identificadas como A) CBFβ/MYH11 (inv 16), B)
AML1/ETO (8:21), C) MLL/AF4 (4:11), D) E2A/PBX1 (1:19), E) SIL/TAL (TAL 1D), F) TEL/AML1 (12:2)
y G) PML/RARα (15:17). GAPDH (H) fue usado como control interno. Todos los productos de PCR fueron
corridos en un gel de agarosa al 1.5% a 80 V durante 30 min. El carril marcado con la letra M en todas la
corridas corresponde al marcador de peso molecular de 100 pb. El carril 1, en todas las translocaciones
analizadas, corresponde al control negativo de la reacción, con excepción del control interno donde el control
negativo se ubicó en el carril 9. Los carriles 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 corresponden al producto de PCR obtenido a
partir de los ADNc de los pacientes analizados. Las flechas indican las bandas obtenidas en cada
translocación.
Para la translocación MLL/AF4 la figura 39 C muestra los productos de
amplificación de dos muestras (carriles 2 y 3) con diagnóstico clínico para LMC. En el
carril 2 se pude observar la amplificación muy tenue de una banda de aproximadamente
185 pb, la cual concuerda con uno de los tamaños esperados para esta alteración también
conocida como t(4;11). Adicionalmente, en el carril 3 se observó la presencia de dos bandas
106
bien definidas con tamaños aproximados de 160 pb y 400 pb. La co-expresión observada
en este paciente podría ser la misma reportada en la referencia tipo, en la cual se obtuvo la
co-expresión de dos productos de 159 y 404 pb respectivamente. Con respecto a la
translocación E2A/PBX1, también conocida como t(1:19), la figura 39 D mostró la
amplificación de una banda bien definida en uno de los tres pacientes analizados. Este
producto de amplificación, ubicado en el carril 2, presentó un tamaño de aproximadamente
190 pb, el cual no correspondió con el tamaño reportado (376 y 403 pb) en la publicación
usada como tipo para estandarizar esta translocación. La especificidad de esta banda podría
sugerir la presencia de una nueva variante en este paciente. Por otro lado, el estudio de la
translocación SIL/TAL1 mostró la presencia de amplificado en dos (carriles 2 y 4) de las
tres muestras estudiadas en el ejemplo representativo. En la figura 39 E se puede evidenciar
que el carril 2 presentó una banda de amplificación bien contundente, la cual se ubicó por
encima de los 200 pb. Este producto de amplificación no se correspondió con el tamaño
esperado para esta translocación. Sin embargo, el carril 4 presentó una banda igualmente
definida pero el tamaño del producto fue de menor tamaño en comparación con el obtenido
en el carril 2. Este último producto presentó un tamaño muy cercano a los 200 pb, el cual
podría corresponderse con el tamaño de 185 pb reportado para esta translocación.
Con respecto al estudio de la translocación TEL/AML1, debemos aclarar que para
esta translocación en particular se emplearon los cebadores usados por Satake y Col. 1997,
debido a que esta translocación ya se estaba estandarizando en laboratorio para el momento
en el que se incluyeron estos experimentos. Como se muestra en la figura 39 F, dos (carriles
2 y 3) de los tres pacientes analizados presentaron productos de amplificación para la
translocación. En el carril 2 se evidenció un producto amplificado de aproximadamente 200
pb, el cual no coincidió con ninguno de los posibles productos esperados para esta
translocación. Sin embargo, el carril 4 presentó un producto de amplificación de
aproximadamente 239 pb, el cual si coincidió con uno de los productos esperados. Por
último, la figura 39 G muestra la corrida electroforética de tres de los productos obtenidos
para la translocación PML/RARα. Como se puede observar, sólo uno de los tres pacientes
analizados presentó una banda lo suficientemente definida y con tamaño de
aproximadamente 430 pb, la cual correspondió con el tamaño esperado para la variante
107
BCR1. Es importante destacar que esta translocación fue una de las más difíciles de
estandarizar puesto que en ninguna de las prueba realizadas se logró obtener una única
banda, de hecho, en la misma figura se puede observar de presencia de bandas inespecíficas
en todas las muestras estudiadas. Por último, la figura 39 H muestra varias de las corridas
para el gen control GAPDH en las muestras estudiadas, como se puede observar GAPDH
siempre pudo ser amplificado en las muestras con una buena intensidad.
La tabla XII presenta un resumen de las translocaciones encontradas en los 40
pacientes analizados. Entre las 7 translocaciones estudiadas TEL/AML1 y PML/RARα
fueron las más frecuentes, mientras que la CBFβ/MYH11 fue menos frecuente. Las
translocaciones MLL/AF4 y E2A/PBX1 fueron co-expresadas, en algunos casos, junto con
la translocación TEL/AML1 (datos no mostrados).
Tabla XII. Resumen de los resultados obtenidos en la RT-PCR realizada a 40 pacientes de los 96 que dieron
negativos para la quimera BCR/ABL.
CBFβ/MYH11
AML1/ETO
(inv 16)
(8:21)
MLL/AF4
(4:11)
E2A/PBX1
(1:19)
SIL/TAL
(TAL 1D)
TEL/AML PML/RAR
11 (12:21)
α (15:17)
2
analizados
Pacientes
5
4
6
3
11
9
108
CITOMETRíA DE FLUJO
En la unidad de citometría de flujo del Banco Municipal de Sangre (BMS) se
realizaron los análisis para la determinación de los inmunofenotipos usados de rutina en el
diagnóstico de algunos tipos de leucemias. Como ya se explicó en la metodología, fueron
procesadas muestras de médulas óseas y sangre periférica, aunque durante el diagnóstico
inicial es usualmente recomendable el uso de médula ósea, dejando el estudio de sangre
periférica para pruebas de control en pacientes previamente diagnosticados. Un total de 10
muestras recibidas, fueron evaluadas con el Panel A para diagnosticar LLA, LMA y LMC.
De los 10 pacientes analizados 3 resultaron positivos para LMC en fase inicial, 3
resultaron positivos para LMC en fase de crisis blástica linfoide (LMC CBL) y 4 resultaron
positivos para LMC en fase de crisis blástica mieloide (LMC CBM). Estas últimas fases
pudieron ser identificadas debido al gran número de blástos que presentaron las muestras.
La figura 40 muestra el ordenamiento de los dot plots de las poblaciones celulares
representativas de las tres fases estudiadas en este trabajo con respecto al dot plot de una
persona en condición normal. Como se puede observar, en 3 (graficas inferiores) de los 4
gráficos mostrados la distribución de las poblaciones celulares de la serie blanca sufrió una
alteración tanto en el tamaño como en la granularidad, con respecto a una persona normal
(gráfica superior), mostrándose un aumento en la población linfocitaria y una caída
considerable (principalmente en los casos de crisis blástica) de las poblaciones que indican
madures celular (monocitos y granulocitos). Este hecho denotó entonces la posible
presencia de una gran cantidad de células inmaduras cuya corroboración de inmadures y
tipo de linaje (linfoide o mieloide) debió ser identificado mediante un inmunofenotipo
(anticuerpos monoclonales específico).
109
Figura 40. Dot-plots de la población celular (por tamaño y granularidad) de los tres casos de LMC
analizados. El eje Y de todas las gráficas incluye la variable tamaño, mientras que el eje X incluye la variable
granularidad. Los tres casos de estudio presentados incluyen LMC (Leucemia mieloide crónica), LMCCBM
(Leucemia mieloide crónica en crisis blástica linfoide) y LMCCBL (Leucemia mieloide crónica en crisis
blástica mieloide). Las 3 gráficas alineadas en la parte inferior de la figura representan los casos con LMC
analizados, mientras que la gráfica ubicada en la parte superior representa el caso de una persona en condición
normal.
Caso LMC:
La Figura 41 muestra un resultado gráfico representativo, por análisis de citometría
de flujo, de un paciente clínicamente sospechoso de LMC. Además de este caso ilustrado,
se identificaron 2 casos adicionales bajo este mismo esquema metodológico.
110
Figura 41. Dot-plots de las poblaciones celulares de un paciente con LMC analizado. En la parte superior
de la figura se ubicaron los gráficos de dispersión del caso tratado vs un caso normal, mientras que en la parte
media e inferior se ubicaron los gráficos de fluorescencia de los antígenos de superficie celular que se usaron
para descifrar esta alteración. Los gráficos de los marcadores de superficie celular fueron todos mixtos,
usando la variable granularidad (SSC) en el eje Y y la variable Ag en el eje X. Los puntos de color negro
identificaron los diferentes tipos de poblaciones celulares formados. Los puntos de color rojo en las gráficas
de fluorescencia identificaron los antígenos estudiados.
Como se puede observar en los dot plots, la distribución de las poblaciones
celulares del paciente con LMC no presentó mucha variación (encontrándose
principalmente dos poblaciones delineadas como R1 (en rojo) y R2 (en azul)) con respecto
al gráfico de una persona normal. En este caso el paciente presentó tanto células maduras
como inmaduras y lo que se pudo observar fue una mínima tendencia de las poblaciones
111
hacia el lado izquierdo de la gráfica, lo que podría indicar la presencia o inicio de una
anormalidad.
Cuando se analizó en detalle la región R1, con los antígenos de superficie celular
CD34, CD45 y CD117 (figura 41A, 41B y 41C respectivamente), usados para evidenciar la
presencia de células inmaduras o blástos y células hematopoyéticas en la muestra, las
gráficas de fluorescencia mixta mostraron un buen porcentaje de una población celular (en
rojo) con características hematopoyéticas (CD 45 +), así como la poca presencia células
inmaduras o blastos (CD 34 - y CD 117 -). Por su parte, el análisis de esta misma región
con los antígenos CD 13 + y CD 33 + (figura 41D y E respectivamente) evidenciaron
(también en rojo) el carácter aberrante y mieloide respectivo de las poblaciones observadas.
Estos resultados indicaron que el paciente en estudio presentó una LMC (debido a la
presencia de células hematopoyéticas aberrantes de origen mieloide), la cual no pudo ser
clasificada en fase crónica o acelerada debido a la poca cantidad de blastos presentes en la
misma.
Caso LMC en Crísis Blástica (CB) linfoide:
En la figura 42 se presenta el resultado gráfico representativo, por análisis de
citometría de flujo, de un paciente clínicamente sospechoso de LMC en crisis blástica.
Además de este caso ilustrado, se identificaron 3 casos adicionales bajo este mismo
esquema metodológico.
El dot plot mostró una contundente variación en la distribución de las diferentes
poblaciones celulares de la muestra de un paciente con LMC con respecto a la población
celular de una muestra normal. En este caso, se evidenció claramente la predominancia de
una población linfocitaria con respecto a las otras poblaciones, indicado por el
ordenamiento de abajo hacia arriba de la gráfica en color rojo. Esta zona fue delimitada
como región R1 y fue analizada posteriormente con anticuerpos monoclonales específicos
mediante los dot plots, donde la coloración roja o verde identificó la expresión de cada uno
de ellos.
112
Figura 42. Dot-plots de la población celular de un paciente representativo de los 3 casos de LMC en
crisis blástica analizados. En este caso se ejemplifica una LMC en CB con linaje linfoide. En la parte
superior de la figura se ubicaron los gráficos de dispersión del caso tratado vs un caso normal. En la parte
media e inferior se ubicaron los gráficos de fluorescencia de los marcadores de superficie celular y
citoplasmáticos que fueron usados para identificar esta alteración. Todos los gráficos de marcadores de
superficie celular y de marcadores citoplasmáticos fueron mixtos.
Los dot plots para analizar la región R1 demostraron la presencias de un alto
porcentaje (89%) de células blásticas y progenitores hematopoyéticos en la muestra, tal
113
como lo demuestran los marcadores de superficie celular CD 117 y CD 34 (figura 42 D y E
respectivamente). Un análisis más exhaustivo de estos blastos permitió evidenciar el
carácter aberrante de los mismos (CD 13, figura. 42B).
Durante el proceso de identificación del linaje de los blastos observados, se
encontró un porcentaje considerable de expresión del marcador de progenitores linfoides y
mieloides (CD 11c, figura. 42A), el cual, al ser analizado junto con los marcadores CD33
(progenitor mieloide, figura 42C) y HLA-DR (marcador de linaje linfoide, figura 42F)
evidencio el carácter linfoide de los blastos encontrados. Como se puede observar, el
marcador de linaje linfoide tuvo un mayor porcentaje de expresión en comparación con
CD33. Estos resultados permitieron diagnosticar al paciente como un LMC en crisis
blástica de origen linfoide.
Caso LMC en crísis blástica (CB) mieloide:
La figura 43 presenta el resultado gráfico representativo, por análisis de citometría
de flujo, de un paciente clínicamente sospechoso de LMC en fase de crisis blástica (CB).
Además de este caso ilustrado, se identificaron 4 casos adicionales bajo este mismo
esquema metodológico.
Como se muestra en el gráfico de dispersión, el paciente con LMC presenta una
completa variación en la distribución de las poblaciones celulares analizadas en
comparación con una muestra normal. Al igual que en el caso anterior, se observó un
aumento exacerbado de la población linfocitaria (90%), evidenciado por el aumento de
puntos negros de abajo hacia arriba de la parte izquierda de la gráfica (resaltado en un
óvalo). Esta zona también fue delimitada como región R1 y fue analizada con anticuerpos
monoclonales específicos en los diferentes gráficos de fluorescencia mixtos, donde se
evidenció la expresión de cada antígeno a través de una coloración fucsia.
114
A
D
E
B
F
C
115
G
H
J
I
K
L
M
116
Figura 43. Dot-plots de la población celular de un paciente con LMC en crisis blástica. En este caso se
ejemplifica una LMC en CB con linaje mieloide. En la parte superior de la figura se ubicaron los gráficos de
dispersión del caso tratado vs un caso normal. En la parte media e inferior se ubicaron los 13 gráficos de
fluorescencia de los marcadores de superficie celular y citoplasmáticos que fueron usados para identificar esta
alteración. Todos los gráficos de marcadores de superficie celular y de marcadores citoplasmáticos fueron
mixtos. La coloración fucsia en los diferentes gráficos identificó los antígenos estudiados.
Para una precisa identificación de esta alteración se estudió la expresión de 11
antígenos de superficie celular y 2 antígenos citoplasmáticos. Los gráficos de fluorescencia
mixtos para la expresión de CD34 y CD 117 (figura 43 C y 43 H, respectivamente)
demostraron la presencia de blastos y células progenitoras hematopoyéticas en la región
analizada, así como el carácter aberrante temprano de las mismas (CD 13 y CD 19, figura
43 D y F respectivamente).
La identificación del linaje de los blastos también fue analizado a través de los
gráficos de fluorescencia mixtos. De los marcadores de linaje linfoide empleados (CD 10,
CD 20, CD 15, CD 19, CD 4 y CD 8), solo 1 (CD 10) presentó una expresión considerable
(ver figuras 43 A, B, E, F, J y K respectivamente). Es importante mencionar que los
antígenos para células T citotóxicas dieron porcentajes muy bajos (CD 4 y CD 8
respectivamente) como para poder hacer la relación entre ellos. Adicionalmente, la no
expresión de los antígenos de células B citoplasmáticos IgG y TDT (figura 40 L y M
respectivamente) evidenciaron el origen mieloide de los blastos estudiados. Este hecho fue
corroborado por la expresión de los antígenos de precursores mieloides CD 33 y CD 11c
(figuras 43 G e I respectivamente).
Estos datos, permitieron emitir un diagnóstico
contundente de una LMC en crisis blástica con linaje mieloide.
Por último, es imprescindible mencionar que todos los casos de LMC en crisis
blástica que resultaron positivos por inmunofenotipo, también dieron positivos para el
oncogen BCR/ABL. Sin embargo, en los casos donde se intuía una fase inicial por
citometría no siempre dieron positivos para el oncogen.
117
FACTORES IMPLICADOS EN LA RESISTENCIA AL
TRATAMIENTO DE LA LMC CON IMATINIB
MODIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR BCR/ABL.
En vista de que este estudio fundamentalmente se enfocó en la leucemia mieloide
crónica (LMC) presente en pacientes venezolanos, se quiso determinar si la translocación
BCR/ABL presente en estos pacientes, guardaba relación con posibles variaciones en la
expresión de algunos genes que previamente han sido reportados en estudios con
microarreglos (Ohmine y Col 2001). Por lo tanto, en este trabajo se decidió implementar el
uso de la técnica PCR en Tiempo Real, para evaluar comparativamente los niveles de
expresión de algunos genes, tanto en pacientes con LMC como en personas no afectadas
por esta enfermedad.
Selección de los pacientes a ser evaluados.
La tabla XIII muestra los 23 pacientes que fueron seleccionados para el estudio de
las variaciones de expresión génica, determinados por PCR convencional. Como ya se
mencionó en la metodología, los pacientes fueron agrupados de acuerdo a la fase de la
enfermedad, establecida clínicamente por los médicos del servicio hospitalario y por el
fenotipo determinado por citometría de flujo, dando origen a 3 grupos de pacientes: 1) Fase
crónica (FC), 2) Fase acelerada (FA) y 3) Fase de crisis blástica (CB). Entre los parámetros
considerados en la tabla XIII se encuentran el sexo, donde se observó un mayor número de
hombres padeciendo la enfermedad (17/23) con respecto a las mujeres (6/23), la edad (la
cual osciló entre los 16 y 55 años) y la cuantificación de la quimera BCR/ABL por PCR
cuantitativo, la cual evidenció un aumento en la expresión de la quimera en aquellos
pacientes pertenecientes al grupo de CB con respecto a las otras dos fases estudiadas. El
parámetro del tratamiento con Imatinib evidenció no sólo una elevada irregularidad en su
consumo por parte de los pacientes con LMC sobre los cuales se administró el fármaco,
sino también la presencia de variaciones en la respuesta al tratamiento en aquellos pacientes
que si cumplen fielmente el tratamiento. Esta variación en la respuesta al tratamiento con
Imatinib incluyó respuesta al tratamiento (RT), respuesta hematológica (RH), respuesta
118
citogenética (RC) y no respuesta (NR). Por último, los parámetros resumidos en la tabla
XIII también indican que: a) varios de estos pacientes han sido tratados por años (MR y AG
por ejemplo) y b) afortunadamente muy pocos pacientes han fallecido desde que se les
diagnosticó la enfermedad. Adicionalmente es importante mencionar que 1) ninguno de los
pacientes usados en este estudio fue sometido a transplante de médula ósea y 2) sólo en
algunos casos el riesgo Sokal pudo ser medido.
Fase Crónica
Fase Acelerada
Crisis Blástica
Pacientes
Pacientes
Pacientes
Tabla XIII. Pacientes LMC positivos incluidos en el estudio de expresión génica mediante la técnica de PCR
en Tiempo Real. RT= respondió al tratamiento (Imatinib), TI= Tratamiento irregular, RH= respuesta
hematológica, NR= no respondió, --= No se sabia porque eran pacientes referidos del interior.
Paciente
Sexo
Edad
FC
M
35
AG
M
41
AG
M
PCR
Tratamiento
Diagnóstico
Cuantitativa
Imatinib
Inicial.
_
ST
02-02-05
No
23-08-00
No
_
TI
_
TI
Fallecido
No
FG
M
_
RT
LM
M
55
_
TI
04-10-01
No
No
35
13-06-05
No
ZB
F
2.54%
RT
RB
M
_
TI
No
JS
F
_
TI
No
DF
M
_
_
No
CC
F
_
NR
No
JH
M
10.9%
RH
No
HP
M
13.76%
RT
No
OH
M
13.7%
RH
FA
M
34%
RH
11%
NR
2.74%
RH
2.5%
RH
16
No
20-10-05
No
JC
M
MR
F
M la C
F
GP
M
_
RH
Si
AA
M
85.8%
NR
Si
37.5%
RH
85.8%
_
53
46
No
21-02-98
No
No
ML
F
JG
M
NP
M
_
_
Si
GF
M
1.6%
RT
No
119
03-04-03
No
Estandarización de las condiciones de amplificación por PCR.
Eliminación de ADNg en las muestras de ARNt usadas en la síntesis de ADNc.
Previo a la estandarización de las condiciones de PCR para cada uno de los
productos a ser amplificados se procedió a verificar, post tratamiento con ADNasa, la no
presencia de ADNg en las muestras de ARNt debido a que su presencia podría afectar los
resultados obtenidos en los ensayos de PCR en Tiempo Real, ya sea a través de
amplificados inespecíficos o de productos específicos obtenidos a partir de la amplificación
de la secuencia del gen presente en el ADNg. La figura 44 muestra una corrida
electroforética donde la amplificación del gen control (GAPDH) es observada sólo en la
muestra de ADNc sintetizado a partir de ARNt previamente tratado con ADNasa (carril 3).
Por otra parte, las amplifiaciones directas, a partir del ARNt tratado previamente con
ADNasa o ARNt sin tratar (carriles 2 y 4 respectivamente), no mostraron bandas de
amplificación del tamaño esperado, tal como se observó en la amplificación del ADNg (346
bp). Es importante destacar la amplificación inespecífica (“smear”) que se observó con la
muestra de ARN que no fue tratada con ADNasa (carril 4), este producto inespecífico
podría alterar los valores de cuantificación relativa que se estarían produciendo con el
análisis de PCR en Tiempo Real.
200 pb
1
2
3
4
M
Figura. 44. Ensayos de amplificación por PCR convencional en muestras previamente tratadas con
ADNasa. (1) Control negativo de la reacción. (2) Amplificación del gen GAPDH usando ARNt tratado con
ADNasa. (3) Amplificación del gen GAPDH usando ADNc sintetizado a partir de ARNt previamente tratado
con ADNasa. (4) Amplificación del gen GAPDH a partir de ARNt sin tratamiento con ADNasa. (6) Marcador
de peso molecular 100 bp.
Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR convencional para los
genes GAPDH, Lyn y AKAP12.
120
Las condiciones para la amplificación por PCR convencional de los genes a estudiar
Lyn y AKAP12 (también conocido como Gravin) fueron estandarizadas. Adicionalmente,
para determinar si los productos obtenidos en la estandarización de esta PCR correspondían
con los esperados para los genes en estudio y a su vez evaluar posibles amplificaciones
inespecíficas que podrían estarse presentando en los ensayos, se procedió a evaluar
mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.5%, los productos amplificados, tanto del
gen control GAPDH como el de los genes Lyn y AKAP12. Como se puede apreciar en la
figura 45 el tamaño del producto de los genes GAPDH (243 pb) (carriles 2), LYN (218 pb)
(carril 3) y AKAP12 (264 bp) correspondieron al tamaño esperado, no observándose en el
gel otros productos secundarios que pudieran alterar el análisis del ensayo.
300 pb
200 pb
1
2
3
4
M
Figura. 45 Estandarización de la amplificación por PCR convencional de los genes GAPDH, Lyn y
AKAP12. (1) Control negativo de la reacción para el gen GAPDH. (2) Amplificación del gen GAPDH (243
pb). (3) Amplificación del gen LYN (218 pb). (4) Amplificación del gen AKAP12 (264 pb). Marcador de
peso molecular 100 bp.
Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR en Tiempo Real para
los genes GAPDH, Lyn y AKAP12.
Para determinar si los productos obtenidos en la estandarización de la PCR en
Tiempo Real correspondían con los obtenidos en la PCR convencional para los genes en
estudio y a su vez, evaluar posibles amplificaciones inespecíficas con el “Light Cycler”, se
procedió a evaluar mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.5% los productos
amplificados por PCR en Tiempo Real tanto del gen control GAPDH como de los genes
Lyn y AKAP12. Como se puede apreciar en la figura 46, el tamaño del producto de los
genes GAPDH (243 pb) (carriles 2 y 3) y Lyn (218 pb) (carriles 8 y 9) correspondieron con
121
los tamaños esperados, no observándose en el gel otros productos secundarios que pudieran
alterar la fluorescencia. En el caso del gen AKAP12 lamentablemente no se pudo obtener
un producto específico del tamaño esperado durante el ensayo de PCR en Tiempo Real, a
pesar de que durante los ensayos de estandarización con los cebadores empleados en una
PCR convencional fue posible obtener un productos de 264 bp (figura 45, PCR
convencional). Esta limitante, obtenida repetidamente en al menos 4 experimentos
realizados separadamente, no permitió continuar con la evaluación de la expresión de este
gen ya que solo se observaron productos inespecíficos de amplificación. Esto resalta la
importancia que tiene la evaluación de las condiciones de PCR en Tiempo Real previo a la
cuantificación, de modo de estar seguro que los resultados obtenidos permitirán realizar un
análisis real de la situación.
B
A
C
E
D
F
G
200 bp
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Figura. 46. Gráficas de amplificación, curva de fusión y corrida en agarosa 1.5% de los productos de
amplificación de los genes GAPDH, AKAP12 y LYN en personas normales y pacientes con LMC. Las
gráficas de amplificación (A, B y C) fueron construidas usando el software del equipo al mismo tiempo que se
producían los productos de amplificación. Estas gráficas permitieron apreciar la fluorescencia emitida por el
producto formado versus el número de ciclos especificados en el programa al momento de cargar las
muestras. Las curvas de fusión (D, E y F) fueron construidas al final de cada amplificación. Estas gráficas
permitieron comparar la fluorescencia producida por el producto versus la variación de la temperatura en
orden ascendente. Cada línea de color formada en las gráficas representa una muestra cargada. La leyenda en
negro identifica cada muestra y gen usado. La agarosa al 1.5% (G) fue corrida durante 30 min. a 80 V. En
todas las corridas se usó un marcador de peso molecular de 100 pb.
Por otra parte, debemos mencionar que durante los ensayos de estandarización de la
PCR en Tiempo Real fueron procesadas muestras tanto de ADNc de pacientes leucémicos
122
(figura 46 carriles 3, 6 y 9), como ADNc de personas normales (figura 43 carriles 2, 5 y 8).
Como se puede apreciar, en el proceso de amplificación de ambos tipos de muestra (en los
casos de los genes GAPDH y LYN) no se observaron variaciones en el gel.
Evaluación por PCR en Tiempo Real del gen Lyn en pacientes venezolanos con LMC.
El gen Lyn fue tomado como punto de partida en los estudios de expresión génica
debido a que ha sido reportada tanto su participación en la cascada de señalización de la
quimera BCR/ABL como su potencial transformante, dado a que este gen codifica para una
proteína con actividad tipo tirosina quinasa igual que BCR/ABL (Dai, y Col. 2004;
Rodriguez, y Col. 2004). Adicionalmente, estudios con microarreglos y RT-PCR en Tiempo
Real han demostrado que su expresión puede verse afectada en líneas celulares y pacientes
con LMC, así como en otros tipos de leucemias como la LLC (Contri, A. y Col. 2005).
Por lo tanto, debido a la importancia que pudiera tener este gen con el desarrollo de
la Leucemia Mieloide Crónica, principalmente hacia la fase de crisis blástica, se decidió
evaluar sus niveles de transcripción en 23 pacientes venezolanos diagnosticados clínica y
molecularmente como LMC con respecto a individuos normales (Tabla XIII).
Las PCRs en Tiempo Real de los pacientes LMC, tanto para el control interno
GAPDH como para Lyn, fueron corridas en varias tandas de amplificación donde siempre
fueron incluidos controles de reacción, muestras de las diferentes fases de la enfermedad y
controles normales. Las figuras 47, 48, 49 y 50 muestran 4 tandas de amplificación
representativas de los resultados obtenidos en este estudio. Como se puede observar, las
gráficas de amplificación (A y B en cada figura) muestran un comportamiento cinético
donde se evidencia un inicio del proceso de amplificación, aproximadamente en el ciclo 20,
que luego alcanza una fase linear o de crecimiento exponencial y culmina en una fase de
saturación. La eficiencia de amplificación de cada muestra dependió de la calidad del ARNt
usado.
Las curvas de temperatura de fusión para los genes GAPDH y LYN (C y D en cada
figura) muestran los diferentes puntos máximos correspondientes a los productos esperados
123
para cada gen estudiado en las muestras procesadas. Como se puede apreciar en la gráfica
47, el punto máximo correspondiente a la temperatura de fusión para el gen GAPDH
presentó una mayor temperatura de fusión (Panel C, aproximadamente 85°C) con respecto
al gen Lyn (panel D, aproximadamente 82°C), esta diferencia se explica debido al mayor
tamaño del producto amplificado para GAPDH (243 pb) con respecto al producto de Lyn
(218 pb). Por otro lado, en las figuras 47, 48, 49 y 50 (panel E) se pueden visualizar las
corridas electroforéticas en geles de agarosa de la mayoría de los productos amplificados
durante el análisis realizado por PCR en Tiempo Real. Como se puede ver, por el tamaño
del producto amplificado, cada una de las bandas se correspondió con el tamaño esperado
para cada gen amplificado y las variaciones observadas en la intensidad de las bandas en
los geles de electroforesis no fueron tomadas como cambio en la expresión ya que estas
variaciones fueron debidas a la pérdida inevitable de muestra al momento de romper los
capilares para cargar el producto en los geles de agarosa. Cabe destacar que aunque en
todas las gráficas de amplificación (A y B de las 4 figuras) se observó amplificación en la
línea correspondiente al agua, esta fue debido a los dímeros de cebadores y no a una
contaminación en el tubo de control de la reacción, tal como se puede corroborar en las
curvas de fusión y en los geles de agarosa de todas las tandas.
124
B
A
C
D
E
Figura 47. Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres
fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 1. Las gráficas de amplificación (Paneles A y B)
fueron construidas por el software del equipo al mismo tiempo que se producía el producto de amplificación.
Esta gráfica ilustró la fluorescencia emitida por el producto formado vs el número de ciclos especificados en
el programa al momento de cargar las muestras. Las curvas de temperatura de fusión (Paneles C y D) fueron
construidas al final de la amplificación. Estas gráficas comparan la fluorescencia producida por el producto vs
la variación de la temperatura en orden ascendente. Cada línea de color formada en las gráficas representa una
muestra cargada. Las barras y círculos rojos demuestran los picos máximos de temperatura de fusión para
cada gen. La leyenda en negro identifica cada muestra por código y especifica que gen fue usado. La agarosa
(E) fue corrida durante 30 min. a 80 V. En todas las corridas se usó un marcador de peso molecular de 100 pb.
A
B
C
D
E
Figura 48. Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres
fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 2. Las gráficas de amplificación (Paneles A y B)
corresponden a la fluorescencia emitida por el producto formado versus el número de ciclos especificados en
el programa al momento de cargar las muestras. Las curvas de temperatura de fusión (Paneles C y D) fueron
construidas al final de la amplificación, las gráficas comparan la fluorescencia producida por el producto
versus la variación de la temperatura en orden ascendente. Cada línea de color formada en las gráficas
representa una muestra cargada. La leyenda en negro identifica cada muestra por código y especifica el gen
amplificado. La agarosa (Panel E) fue corrida durante 30 min. a 80 V. En todas las corridas se usó un
marcador de peso molecular de 100 pb.
125
A
A
C
B
B
C
D
D
E
Figura 49. Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres
fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 3. Las gráficas de amplificación (Paneles A y B)
corresponden a la fluorescencia emitida por el producto formado vs el número de ciclos especificados en el
programa al momento de cargar las muestras. Las curvas de temperatura de fusión (Paneles C y D) fueron
construidas al final de la amplificación, las gráficas comparan la fluorescencia producida por el producto
versus la variación de la temperatura en orden ascendente. Cada línea de color formada en las gráficas
representa una muestra cargada. La leyenda en negro identifica cada muestra por código y especifica el gen
amplificado. La agarosa (Panel E) fue corrida durante 30 min. a 80 V. En todas las corridas se usó un
marcador de peso molecular de 100 pb.
B
A
D
A
C
E
Figura 50. Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres
fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp.4. Las gráficas de amplificación (Paneles A y B)
corresponden a la fluorescencia emitida por el producto formado vs el número de ciclos especificados en el
programa al momento de cargar las muestras. Las curvas de temperatura de fusión (Paneles C y D) fueron
construidas al final de la amplificación, las gráficas comparan la fluorescencia producida por el producto vs
la variación de la temperatura en orden ascendente. Cada línea de color formada en las gráficas representa una
muestra cargada. La leyenda en negro identifica cada muestra por código y especifica el gen amplificado. La
agarosa (E) fue corrida durante 30 min. a 80 V. En todas las corridas se usó un marcador de peso molecular de
100 pb.
126
Estadística de la RTQ-PCR.
Los puntos de cruce obtenidos a partir de las curvas de amplificación, por el método
de la segunda derivada, fueron usados para el cálculo de la expresión relativa “Ratio” de
expresión de los genes GAPDH y Lyn (ver Anexo C). La tabla XIV muestra los valores de
punto de cruce para los genes GAPDH y Lyn en los 23 pacientes con LMC, en sus
diferentes fases, y en los 13 individuos normales tomados como controles. También se
presentan los valores de los Ratios obtenidos para cada muestra y la división entre el Ratio
de cada muestra y el Ratio promedio de los controles normales. Las últimas filas de cada
sección de la tabla evidencian los valores de los promedios y la desviación estándar
obtenidos para cada parámetro analizado.
127
Tabla XIV. Valores obtenidos a partir de la amplificación por PCR en Tiempo Real de los genes GAPDH y
Lyn. Las filas resaltadas indican las diferentes fases de la LMC y los controles normales. Las columnas
indican los diferentes parámetros calculados. Las iniciales representan los nombres de las muestras.
Fase Acelerada
Crisis Blástica
Normales
Pacientes
Personas
Pacientes
Pacientes
Fase Crónica
Paciente
Punto de Cruce
Punto de cruce
Gen GAPDH
Gen Lyn
Ratio
Ratio enfermo/
Ratio promedio normal
FC
29.12
27.61
0.94814560
0.96600379
AG
24.96
24.88
0.99679487
1.01556936
AG
24.90
25.66
1.03052209
1.04993183
FG
26.01
26.27
1.00999616
1.02901929
LM
24.97
26.28
1.05246296
1.07228595
ZB
27.56
23.49
0.85232221
0.86837558
RB
27.06
22.90
0.84626755
0.86220688
JS
26.94
24.91
0.92464736
0.94206297
Promedio
26.44
25.25
0.95764485
0.97568196
desv
1.51086541
1.54511211
0.07860551
0.08008603
DF
22.30
21.10
0.99103139
1.00969733
CC
22.23
21.36
0.96086370
0.97896143
JH
22.12
21.87
0.98869801
1.00732000
HP
23.07
22.25
0.96445600
0.98262140
OH
26.30
22.99
0.87414449
0.89060888
FA
22.03
21.75
0.98729006
1.00588553
JC
23.13
21.31
0.96454821
0.98271534
MR
22.26
22.33
1.00314465
1.02203874
Promedio
22.93
22.12
0.96677206
0.98498108
desv
1.42520174
0.48275992
0.04042330
0.04118467
M la C
23.25
24.18
1.04
1.05958825
GP
25.84
28.48
1.10216781
1.12292635
AA
23.85
21.59
0.90524109
0.92229118
ML
24.90
22.62
0.90843373
0.92554396
JG
25.43
23.47
0.92292568
0.94030885
NP
34.23
27.95
0.81653520
0.83191453
1.13887885
GF
19.86
22.20
1.11782477
Promedio
25.33714286
24.3357143
0.97330395
0.9916360
desv
4.398907873
2.77046841
0.11394112
0.11608718
0.97441104
SB
27.98
26.76
0.95639743
EH
25
24.18
0.96720000
0.98541708
CS
27.18
22.73
0.8367667
0.85202783
KN
20.58
21.42
1. 04081633
1.06041996
LE
27.11
23.18
0.85503504
0.87113951
RM
22.64
23.54
1.03975265
1.05933625
KL
26.28
27.06
1.02968037
1.04907425
EM
28.80
29.58
1.02708333
1.04642830
GP
22.60
27.26
1.20619469
1. 2289132
YA
27.67
22.91
0.82797253
0.84356728
SF
22.56
24.46
1.08421986
1.10464099
FC
29.23
24.67
0.84399589
0.85989244
1.06473189
LE
25.75
26.91
1.04504854
Promedio
25.64461358
24.9738462
0.98151333
1
desv
2.756285591
2.34376314
0.11430382
0.11645672
128
La figura 51 muestra la gráfica con los valores obtenidos del Ratio de expresión
relativa del gen Lyn en pacientes con LMC en las diferentes fases de la enfermedad. Como
se puede observar en el gráfico, los promedios de todos los tratamientos (FC, FA y CB) no
evidenciaron cambios en la expresión de este gen en comparación con el grupo control (N).
La variación observada de los ratios en las diferentes fases de tratamiento fue similar a la
observada en el grupo normal, lo que indica que esta variación es producto de la variación
intrínseca esperada en cualquier sistema biológico.
1,4
1,2
LYN Ratio
1
0,8
0,6
FC
FA
CB
N
0,4
0,2
0
Figura 51. Gráfica de la expresión relativa del gen LYN en controles (N, puntos blancos) y pacientes
LMC en las diferentes fases clínicas de enfermedad, fase crónica (FC, puntos sólidos), fase acelerada
(FA, triángulo sólido) y crisis blástica (CB, cuadros sólidos). La línea sólida en cada tratamiento muestra el
promedio obtenido del número de pacientes para cada caso, mientras que la línea punteada representa el valor
al cual no hay diferencia de expresión entre los pacientes y los normales.
Adicional a los cálculos con los promedios, también se hizo un análisis
de
aleatorización de la expresión génica del gen Lyn en los pacientes con LMC mediante el
remuestreo bootstrap de 50.000 replicas, con el fin de comparar la expresión del gen
housekeeping GAPDH con el gen estudiado Lyn según el método modificado de Rest
(Matthew, H; David, C y Pfaffl, M 2006).
La figura 52 muestra los diagramas de caja obtenidos para la expresión relativa
aleatorizada de los genes GAPDH y LYN en las diferentes fases de la LMC. Como se
129
puede observar, la expresión relativa del gen LYN en las diferentes fases de la LMC no
presentó variación con respecto a la expresión del gen GAPDH.
Figura 52. Gráfica de la expresión relativa aleatorizada de los genes GAPDH y Lyn en las diferentes
fases clínicas de la LMC, fase crónica (FC), fase acelerada (FA) y crisis blástica (CB). La línea central de
cada caja muestra la mediana, los límites superior e inferior de la caja muestra los espacios intercuartil. Las
líneas punteadas señalan la distancia hacia los extremos de la distribución. Los círculos vacíos muestran los
valores que quedan fuera de la distribución.
130
DETECCIÓN DE MUTACIONES PUNTUALES EN EL DOMINIO TIROSINAQUINASA DE LA QUIMERA BCR/ABL.
Con el objetivo de evidenciar si la presencia de mutaciones puntuales en el dominio
tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL en pacientes venezolanos con LMC era el
detonante principal de la resistencia al tratamiento con Imatinib, se estandarizaron dos
protocolos de PCR para analizar las mismas 23 muestras de pacientes positivos para la
quimera BCR/ABL usadas en los ensayos de expresión génica.
Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR para el punto de
fusión y el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL.
Para determinar si los productos obtenidos en la estandarización de los dos
protocolos de PCR correspondían con los esperados para el punto de fusión BCR/ABL y el
dominio tirosina quinasa, se procedió a evaluar mediante electroforésis en geles de agarosa
al 1.5% los productos amplificados de las dos regiones del gen abl en estudio.
La figura 53 muestra los productos de amplificación de algunos de los pacientes
analizados. Como se puede observar, en varias muestras se logró obtener una banda del
tamaño esperado (1200 pb) para el punto de fusión de la quimera BCR/ABL. En las
muestras donde no se observaron bandas en el primer intento o se evidenciaron bandas
inespecíficas, fue necesario montar otra PCR con un nuevo ADNc, puesto que los intentos
para mejorar la amplificación usando otras temperaturas no dieron resultados satisfactorios.
Por su parte, la figura 54 muestra los geles de agarosa 1.5% para los productos
purificados del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL en los pacientes con
LMC. En estos geles, se observó la presencia de una única banda de aproximadamente 565
pb en todas la muestras analizadas cuando fueron usados los cebadores ABL-F4 y ABL-R6.
A diferencia de la PCR 1 para el punto de fusión, esta amplificación fue muy fácil de
obtener y su alto rendimiento permitió realizar las purificaciones correspondientes, hecho
que garantizó una alta eficiencia en la secuenciación automática.
131
Figura 53. Estandarización del protocolo de PCR empleado para la amplificación del punto de fusión
de la quimera BCR/ABL en pacientes con LMC. El carril 1, en ambos geles, corresponde al control
negativo de la reacción. Los carriles 2 al 16, en el gel inferior, corresponden a las diferentes muestras que
fueron cargadas y el último carril (M) corresponde al marcador de peso molecular de 100 pb. La flecha roja
identifica al producto obtenido (1200 pb) con los cebadores B2B y ABL- R6, el cual incluye tanto a la
quimera BCR/ABL como al dominio tirosina quinasa.
Figura 54. Estandarización del protocolo de PCR empleado para la amplificación del dominio tirosina
quinasa de la quimera BCR/ABL en pacientes con LMC. El carril 1corresponde al control negativo de la
reacción. Los carriles del 2 al 21, corresponden a las diferentes muestras que fueron cargadas en el gel y el
último carril (M) corresponde al marcador de peso molecular de 100 pb. La flecha roja identifica al producto
obtenido (565 pb) con los cebadores ABL- F4 y ABL- R6, el cual correspondió al dominio tirosina quinasa.
132
Secuenciación automática del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL de
los pacientes con LMC.
A partir de los productos purificados de la PCR 2 (correspondiente al dominio
tirosina quinasa) se lograron secuenciar automáticamente 15 muestras LMC de forma
satisfactoria. En la figura 55 se muestra la alineación de todas la secuencias obtenidas, así
como su comparación con la secuencia reportada para este dominio (NM 005157; ver
anexo D) y su secuencia aminoacídica. Esta alineación demostró que ninguna de las
secuencias analizadas presentó mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa
estudiado. Las porciones coloreadas en azul y ubicadas en los extremos de la alineación de
secuencias representan los cebadores empleados, mientras que las porciones coloreadas en
verde, naranja y azul representan las zonas funcionales del dominio tirosina quinasa como
son el bolsillo de unión al ATP, el loop catalítico y el loop de activación respectivamente.
DTQ
aa
TCCCCCAACTACGACAAGTGGGAGATGAACGC
F1
1
F2
1
F3
1
F5
1
F6
1
F10
1
F11
1
F12
1
F13
1
F14
1
F15
1
F16
1
F17
1
F18
1
F19
1
DTQ
aa
721
F1
61
TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ACGGACATCACCATGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ACGGACATCACCATGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC
T D I T M K H K L G G G Q Y G E V Y E G
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
133
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
780
120
F2
61
F3
61
F5
61
F6
61
F10
61
F11
61
F12
61
F13
61
F14
61
F15
61
F16
61
F17
61
F18
61
F19
61
DTQ
Aa
781
F1
121
F2
121
F3
121
F5
121
F6
121
F10
121
F11
121
F12
121
F13
121
F14
121
F15
121
F16
121
F17
121
F18
121
F19
121
DTQ
aa
841
F1
181
F2
181
F3
181
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG
V W K K Y S L T V A V K T L K E D T M E
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
840
GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
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GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG
V E E F L K E A A V M K E I K H P N L V
180
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC
240
134
180
180
180
180
180
180
180
180
180
180
180
180
180
180
900
240
240
F5
181
F6
181
F10
181
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181
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F19
181
DTQ
Aa
901
F1
241
F2
241
F3
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F5
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F6
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F10
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241
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241
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241
DTQ
Aa
961
F1
301
F2
301
F3
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F5
301
F6
301
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTGATGACC
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CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC
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CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC
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CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC
Q L L G V C T R E P P F Y I I T E F M T
240
240
240
240
240
240
240
240
240
240
240
240
960
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TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300
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TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300
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TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 1020
Y G N L L D Y L R E C N R Q E V N A V V
CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC
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CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC
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CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC
135
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360
360
360
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F10
301
F11
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aa
F1
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aa
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F3
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F6
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421
F11
421
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360
CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360
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CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360
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CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360
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CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360
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CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360
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CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360
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CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 1080
L L Y M A T Q I S S A M E Y L E K K N F
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
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ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
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ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------------ 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 1140
I H R D L A A R N C L V G E N H L V K V
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
-----------------------------------------------------------||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC
136
480
480
480
480
480
480
480
F12
421
F13
421
F14
421
F15
421
F16
421
F17
421
F18
421
F19
421
DTQ 1141
aa
F1
481
F2
481
F3
481
F5
481
F6
481
F10
481
F11
481
F12
481
F13
481
F14
481
F15
481
F16
481
F17
481
F18
481
F19
481
DTQ 1201
aa
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 1200
A D F G L S R L M T G D T Y T A H A G A
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCA-------------------------------------------------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCAT------------------------------------------------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AA---------------------------------------------------------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------------ 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AA---------------------------------------------------------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCTCCATCAAG 1260
K F P I K W T A P E S L A Y N K F S I K
Figura 55. Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC F1, F2, F3, F5, F6, F10, F11, F12,
F13, F14, F25, F16, F17, F18, F19 y la secuencia reportada para el dominio tirosina quinasa de la quimera
BCR/ABL (número de acceso: NM 005157). La zona resaltada en azul claro indica las secuencias a las que se
unen los cebadores sentido ABL-F4 y antisentido ABL-R6. Las letras mayúsculas en color fucsia indican la
secuencia aminoacídica del dominio tirosina quinasa. La zona resaltada en verde corresponde al bolsillo de unión
al ATP en el dominio. Las letras color naranja dentro de la zona verde corresponden al loop catalítico del
dominio. Las letras en color azul remarcadas corresponden al loop de activación del dominio.
137
A continuación, la tabla XV presenta un resumen de los resultados obtenidos en el
estudio de los tres factores implicados en el mecanismo de resistencia al tratamiento con
Imatinib en pacientes venezolanos con LMC, donde sólo se consideraron los 15 pacientes que
pudieron ser secuenciados para el dominio tirosina quinasa.
Tabla XV. Resumen de los resultados obtenidos en el estudio de los factores que afectan la respuesta al
tratamiento con imatinib. Las filas resaltadas indican las diferentes fases de la LMC. Las columnas indican los
diferentes parámetros calculados. Las iniciales en la columna de pacientes, representan los nombres de las
muestras. Las iniciales en la columna de tratamiento indican la respuesta que tuvieron los pacientes al
Imatinib: ST= sin tratamiento, TI= tratamiento irregular, RT= responde al tratamiento, RH= respuesta
hematológica, NR= no responde al tratamiento y -- = no se cuantificó o no se sabe su respuesta al tratamiento
porque son pacientes referidos del interior.
Paciente
Expresión del
Fase Crónica
Fase Acelerada
Crisis Blástica
Pacientes
Pacientes
Pacientes
gen Lyn
Mutación puntual
Cuantificación de
En el DTQ
BCR/ABL
Respuesta al
tratamiento con
Imatinib
FC
No varió
No se encontró
_
ST
LM
No varió
No se encontró
_
TI
JS
No varió
No se encontró
_
ZB
No varió
No se encontró
GZ
No varió
No se encontró
0.99%
NR
LP
No varió
No se encontró
17.8%
NR
2.54%
TI
RT
HP
No varió
No se encontró
13.76%
RT
OH
No varió
No se encontró
13.7%
RH
JH
No varió
No se encontró
10.9%
JC
No varió
No se encontró
11%
MR
No varió
No se encontró
2.74%
RH
GF
No varió
No se encontró
1.6%
RT
ML
No varió
No se encontró
37.5%
RH
M la C
No varió
No se encontró
2.5%
RH
AA
No varió
No se encontró
85.8%
NR
RH
NR ni con Nilotinib
Como se puede observar en la tabla XV los 15 pacientes analizados se encontraron
distribuidos en las diferentes fases clínicas de la LMC, donde 4 muestras se ubicaron en la
fase crónica, 5 muestras se ubicaron en la fase acelerada y 4 muestras se ubicaron en la fase
138
de crisis blástica. Los estudios de expresión del gen Lyn mostró que ninguno de los
pacientes varió la expresión de este gen con respecto a los controles normales. En el estudio
de las mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa, se encontró que estos pacientes
tampoco presentaron mutaciones puntuales en ninguna de las regiones de este dominio. Por
su parte, la cuantificación de la quimera BCR/ABL en estos mismos pacientes si evidenció
valores en porcentajes de la expresión de esta quimera. Los valores reportados oscilaron en
un rango entre 1.6% y 85.8%, observándose los mayores porcentajes en la fase de crisis
blástica. Cuando estos porcentajes fueron comparados con el valor internacional esperado
(0.001%) para un paciente que prácticamente no expresa la quimera y que en consecuencia
está respondiendo satisfactoriamente al tratamiento con Imatinib, se encontró que todos
nuestros valores estuvieron muy por encima del valor esperado. Estos resultados indicaron
que desde el punto de vista de la expresión del encogen BCR/ABL, los pacientes analizados
presentaron resistencia al tratamiento con Imatinib.
Con respecto a la respuesta al tratamiento con Imatinib observada por los médicos
tratantes, se obtuvo que 3 pacientes presentaron respuesta con Imatinib (RT), 5 presentaron
respuesta hematológica (RH), 2 presentaron un tratamiento irregular (TI), 1 estaba sin
tratamiento al momento de tomar la muestra (ST)
y 2 no presentaron respuesta al
tratamiento con Imatinib (NR). Así mismo, se observó que uno de estos últimos pacientes
(JC) tampoco respondió al tratamiento con el inhibidor de segunda generación conocido
como Nilotinib.
139
DISCUSIÓN
La leucemia mieloide crónica (LMC) es una patología clínica que ha sido
reportada mundialmente como una de las más comunes dentro del gran grupo que
conforman las leucemias y su estudio ha marcado pauta en la identificación y compresión
de otras leucemias (Faderl y Col. 1999). El descubrimiento de la alteración genética que
la causa, las transformaciones celulares que desencadenan su progresión y fase final, así
como las estrategias que han sido empleadas para su tratamiento han permitido mejorar y
aumentar la supervivencia y calidad de vida de las personas que la padecen.
Son innumerables las investigaciones que se han avocado a la búsqueda de una
cura definitiva contra esta enfermedad y aunque existen muchos grupos de trabajo, tanto
en Europa como en América y el resto del mundo, es importante resaltar la labor
invaluable de investigadores como Junia Melo, Michael Dininger, John Goldman, Stefan
Faderl, Wolf Hofmann, Hagop Kantarjian, Charles Sawyer, David Barnes, James Griffin
y Susan Branford, entre otros, quienes utilizando diferentes herramientas moleculares y
bioquímicas han ido despejando las incógnitas que hacían impenetrable el complejo
mundo de la LMC, transformándola de una enfermedad incurable y mortal a una
enfermedad donde el paciente, si es diagnosticado a tiempo, tiene muchas probabilidades
de sobrevivencia.
En América del sur son escasas las investigaciones que han sido publicadas sobre
pacientes con LMC en comparación con el resto del mundo. Sin embargo, los estudios
realizados en países como Brasil, Chile, Argentina, Ecuador y Bolivia han permitido
conocer el espectro de frecuencia con que se presenta esta patología en cada una de estas
poblaciones, lo que a su vez amplió más el conocimiento sobre la misma y su
comparación entre poblaciones. En el caso particular de Venezuela, se podría decir que
actualmente el estudio de la LMC ha tenido un gran avance ya que muchos datos
citogenéticos e incluso moleculares han sido reportados tanto en revistas nacionales como
expuestos en congresos internacionales. El pionero en los estudios moleculares de la
141
LMC en Venezuela es el Dr. José Luís López, quien no solo creó el primer laboratorio de
biología molecular para la detección de la LMC a nivel nacional, sino que además ha
capacitado a un grupo considerable de personas para el diagnóstico de esta. El trabajo que
a continuación se discute contó con su valiosa colaboración y permitió terminar
satisfactoriamente tanto la parte del diagnóstico molecular de la LMC como lo referente a
la citometría de flujo y los estudios de resistencia al tratamiento con Imatinib.
En este contexto, el presente trabajo reporta el estudio molecular del oncogen
BCR/ABL causante de la leucemia mieloide crónica o LMC en pacientes venezolanos
provenientes de los centros de referencia nacional: Banco Municipal de Sangre (BMS) y
del hospital Dr. Miguel Pérez Carreño (HMPC). La detección molecular se centró en la
búsqueda del punto de fusión de los genes bcr y abl que originan la translocación t(9;22),
esta incluyó la detección de las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 reportadas para la LMC
mediante el uso de la técnica de RT-PCR convencional con cebadores específicos para
cada una de ellas. Todas las variantes obtenidas de algunos pacientes fueron clonadas y
secuenciadas. La posibilidad de encontrar otras alteraciones (mutaciones puntuales) en la
región donde ocurre la fusión BCR/ABL también fue analizada. Los datos obtenidos
permitieron realizar análisis de frecuencia de la translocación BCR/ABL y de cada una de
las variantes encontradas en nuestra población con respecto a las reportadas en otros
países latinoamericanos, así como su relación con la edad y el sexo.
Este trabajo reporta la presencia de un gran número de pacientes (97) con
sintomatología clínica de leucemia, sospechosos de LMC pero que resultaron negativos al
estudio molecular de BCR/ABL. Por esta razón, se decidió incluir la detección de otras
translocaciones asociadas a otros tipos de leucemias, lo cual no solo permitió determinar
si estos pacientes sufrían de esas alteraciones sino que además permitió establecer un
diagnóstico molecular más completo de estas patologías en el laboratorio. La
estandarización del panel de leucemia desarrollado en este trabajo será usado a futuro
tanto para la búsqueda de otras translaciones en un mismo paciente, sospechoso de LMC
negativo para la translocación BCR/ABL, como para el análisis de aquellos pacientes con
142
sintomatología clínica no definida para un tipo específico de leucemia. Todo esto
redundará en un rápido y mayor número de muestras procesadas con resultados
confiables.
Adicionalmente, debido a la importancia que aún tienen los análisis por citometría
de flujo durante el diagnóstico inicial de las leucemias (linaje celular de los blástos),
también realizaron inmunofenotipos en algunas de las muestras de pacientes con LMC
referidos del Banco Municipal de Sangre, haciendo mayor énfasis en los casos LMC en
crisis blástica. Estos datos permitieron confrontar mas de un método diagnóstico sobre un
mismo paciente, lo cual ayudó a evaluar en conjunto ventajas y desventajas de ambos
métodos y estrategias que permitieran acelerar con eficiencia el diagnóstico de las
personas afectadas.
Por último, en vista de la gran importancia que ha tenido el tratamiento con el
fármaco Imatinib en la supervivencia de pacientes con LMC, se llevó a cabo un último
estudio que incluyó el análisis de tres de los principales factores que han sido implicados
en la resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes LMC en las tres diferentes fases
de la enfermedad.
En detalle, con respecto la estandarización de los protocolos de extracción de
ARN total para el diagnóstico molecular de la quimera BCR/ABL se encontró que ambos
proporcionaron excelentes resultados. Así, los resultados obtenidos con el método de
guanidine isothiocyanate de Chomczynski y Sacchi (1987) concordaron con los obtenidos
por Lee y col. (1995), Tobal y col. (2000), Deininger y col. (2000), Hofmann y col.
(2002) y Ohmine y col. (2003), quienes trabajando con PCR multiplex en pacientes LLA
con BCR/ABL positivo, RT-PCR semicuantitativa en enfermedad mínima residual de
pacientes con LMA, differential display en líneas celulares que reproducen la LMC para
estudios de expresión génica, estudios de expresión génica con microarreglos de
Oligonucleótidos en pacientes LLA Ph+ tratados con Imatinib y estudios de expresión
génica usando microarreglos de DNA
en líneas celulares BCR/ABL+ resistentes a
143
Imatinib respectivamente, lograron obtener un ARN total de óptima calidad. Una de las
principales ventajas de este método es que ha sido muy recomendado para aquellos
laboratorios que están comenzando pues garantiza buenos resultados con reactivos más
económicos. Sin embargo, el hecho de usar reactivos que pueden ser preparados en el
laboratorio puede traer como consecuencia la probabilidad de contaminación en la
extracción del ARN total, dado que involucra la preparación de todas las soluciones en el
laboratorio. Por último, está el hecho de que el método de Chomczynski y Sacchi (1987)
contempla un protocolo más laborioso que implica más pasos en el proceso de extracción
(comparado con el método de trizol) lo que podría ser otra fuente de contaminación de
este método.
Por su parte, los resultados obtenidos con el método de trizol fueron comparables
con los reportados en trabajos como los de Pierce y col. (2000), Roche-Lestienne y col.
(2002), Kaneta y col. (2003), Hui y col. (2003), Barbouti y col. (2003), Branford y col.
(2003), Jiang y col. (2004), Boultwood y col. (2004), Zeng y col. (2005) y muchos otros,
quienes obtuvieron un ARN total con un buen rendimiento y pureza que podía ser usado
en estudios de líneas celulares expresando BCR/ABL para estudios de señalización
celular, estudios de identificación de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa
de la quimera BCR/ABL usando RFLP RT-PCR y ASO-PCR, estudios de expresión
génica usando microarreglos, cuantificación por RT-PCR en tiempo real de la respuesta a
tratamiento en pacientes LMC, estudios con FISH y RT-PCR de otros tipos de
translocaciones presentes en pacientes LMC en crisis blástica, secuenciación
automatizada para detección de mutaciones, estudios de desregulación de la expresión
génica por BCR/ABL, etc. Estas y muchas otras investigaciones ponen de manifiesto la
generalización que ha tomado este método en diferentes tipos de estudios moleculares de
la LMC.
Una de las principales ventajas del método de trizol con respecto a otros métodos
es que este permite, una vez que es agregado a las células en estudio, no solo la lisis de
estas si no que además esta solución puede ser almacenada para procesamientos
144
posteriores sin que el ARN sufra algún daño debido a que la solución de trizol es capaz
de estabilizar las moléculas de ARN minimizando su degradación tal como fue reportado
por Branford y col. (2003).
Con respecto a la detección por RT-PCR del punto de fusión BCR/ABL, en este
trabajo se reporta la identificación de la translocación BCR/ABL en sus diversas
variantes en 200 pacientes venezolanos con diagnóstico clínico de LMC. Estos resultados
fueron confirmados por secuenciaciones automáticas posteriores en algunas de las
muestras, en las que se evaluó no solo el punto de fusión BCR/ABL sino también la
presencia de otras alteraciones (posibles mutaciones puntuales) en las secuencias
adyacentes al punto de fusión de la quimera.
En referencia a la frecuencia de aparición de la translocación BCR/ABL en
nuestros pacientes se determinó que de los 297 pacientes analizados molecularmente,
67.3% (200) fueron casos positivos para LMC, mientras que un 32.7% (97) correspondió
a casos negativos. Nuestros resultados no concordaron con los reportados por Cross y
Melo (1994), Barnes y Melo (2003), Ohsaka y Col. (2002), Wong y col. (2003),
Mundhada y col. (2004), Ray y col. (2004), quienes encontraron que de un 100% de
casos de LMC clínicamente diagnosticados un 90-95% presentó la translocación
BCR/ABL distintiva de la enfermedad mientras que un 5% no la presentó. Así mismo,
con lo reportado por Goh y Col. (2006) quienes reportaron un porcentaje mayor (98%)
del transcrito BCR/ABL en los pacientes coreanos con LMC.
La discrepancia en los resultados obtenidos en este trabajo y la reportada en la
bibliografía pudo deberse a varios factores: A) una discordancia en la exigencia de la
clasificación clínica de los posibles pacientes LMC en nuestro país con respecto a otros
países, es decir, puede ser que debido a que la sintomatología clínica de la LMC es muy
similar a muchos otros síndromes mielodisplásicos, los médicos tratantes podrían, a
propósito, solicitar la realización del oncogen BCR/ABL aún cuando se sospeche que
algunos pacientes no sufren de LMC. Quizá los médicos prefieren ser flexibles en la
145
realización del diagnóstico a arriesgarse a que algún paciente potencialmente positivo se
les quede fuera del diagnóstico, B) al ser los dos centros hospitalarios, utilizados en esta
investigación, sitios de referencia nacional para el estudio de las leucemias, llegan
muchas muestras provenientes de diferentes regiones del interior con un diagnóstico
previo de posible LMC del cual no se tiene certeza porque no se cuenta con la historia
clínica del paciente, C) muchas de las muestras llegan sin la solicitud de ser analizadas
primero por el citómetro de flujo (pues esto aumentaría los costos) antes de hacer el
diagnóstico molecular para tener una idea del linaje celular que estas presentan y así
poder descartar de antemano aquellas muestras con características diferentes, D) el hecho
de que muchos médicos tratantes mandan muestras de pacientes que son síndromes
mielodisplásicos en proceso de transformación a LMC o LMA para que se les realice el
oncogen, estas muestras pueden o no dar positivas para BCR/ABL y F) el tipo de muestra
(SP o MO) a partir de la cual se realizaron los análisis.
En relación a este último punto, es bien sabido que pacientes que están en el inicio
de la enfermedad pudieran resultar negativos a un análisis molecular a partir de SP, por lo
tanto el hecho de que algunas muestras fueran tomadas a partir de SP, pudo haber
generado la presencia de falsos negativos. Todos los casos antes mencionados pudieron
conllevar entonces a la obtención de un mayor número de resultados negativos para la
detección de la translocación en comparación con lo reportado, razón por la cual se hace
imprescindible poder comunicar estos datos a los servicios de hematología y a los
médicos que integran estos servicios, de modo de garantizar que se tomen medidas que
permitan orientar a estos profesionales en el tipo de paciente que debe ser analizado
molecularmente. Cabe destacar, que la recomendación no solo incluiría el detalle del
procesamiento molecular, sino además lo referente a la toma y tipo de muestra por parte
de los médicos del interior del país.
Adicional a la detección de la translocación BCR/ABL en general, este trabajo
también reporta los primeros datos vinculados a la identificación de 3 de las variantes
creadas por los diferentes puntos de ruptura en el gen bcr (b2a2, b3a2 y e1a2) en los 200
146
pacientes LMC que resultaron positivos para esta translocación. El análisis de frecuencia
realizado para las variantes b2a2 y b3a2 mostró un alto porcentaje de estas dos variantes,
43.5% (87 pacientes) y 39.5% (79 pacientes) respectivamente, con respecto a la variante
e1a2 la cual presentó una frecuencia menor de 3.5% (7 pacientes). Estas variaciones en
las frecuencias fueron analizadas estadísticamente y se observaron diferencias
significativas entre estos dos grupos, lo se que traduce en una prevalencia de las variantes
b2a2 y b3a2 en comparación con la variante e1a2. Sumado a esto, también se evaluó
estadísticamente si la pequeña diferencia observada entre las dos variantes más frecuentes
(b2a2 y b3a2) era significativa, encontrándose una diferencia no significativa entre ambas
variantes, lo que indicó una misma probabilidad de aparición para ambas en los pacientes
venezolanos con LMC. Estos resultados fueron similares con los reportados por Cross y
col. (1994), Arana-trejo y col. (2002), Meissner y Col. (1998); Gonzalez y col. (1993) y
Dongen y Col. (1999) quienes trabajando con diferentes cantidades de pacientes con
LMC también encontraron una mayor frecuencia de estas variantes con respecto a las
demás. Estos mismos autores también observaron la misma predominancia de aparición
entre las variantes b2a2 y b3a2 (ver tabla XI en resultados).
En contraste, Paz-Miño y col. (2002) reportaron una mayor frecuencia de la
variante b2a2 (94.6%) con respecto a la variante b3a3 (5.4%), en 37 pacientes LMC de la
población ecuatoriana. Por su parte y en contraposición con las dos frecuencias del
trabajo anterior, los trabajos de Artigas y col. (2002), Auewarakul y Col. (2006) y
Mondal y Col. (2006) reportaron una mayor frecuencia de la variante b3a2 (100%/11
pacientes, 73%/139 pacientes y 57%/122 pacientes, respectivamente), con respecto a la
variante b2a2 (0%/11, 27%/139 y 27%/122 pacientes, respectivamente) en pacientes
chilenos, tailandeses y de la India. Las variaciones encontradas por los autores chilenos
fueron asociadas principalmente a variaciones étnicas debido al alto grado de mestizaje
presente en este país, en el caso de Venezuela aún cuando se presenta una población
donde el mestizaje es predominante, no se observó una tendencia marcada hacia una de
estas variantes (ver tabla XI en resultados).
147
En relación con la variante e1a2 se encontró que ésta se expresó con una baja
frecuencia (3.5%) en los 200 pacientes con LMC estudiados en comparación con las otras
variantes analizadas. Es importante destacar que esta variante es expresada generalmente
en pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA), sin embargo algunos trabajos han
reportado su presencia en algunos pacientes con LMC. En tal sentido, Melo y Col.
(1994), Kirk y Col. (1996), Melo (1997), Lemes y col. (1999), Roumier y Col. (1999),
Ohsaka y col. (2002) y Andrikovics y Col. (2007) reportaron la expresión de la variante
e1a2 en pacientes con LMC con una frecuencia muy baja (Ohsaka y Col. 2002, Melo y
Col. 1994), la cual fue considerada como un caso raro en pacientes con LMC y se
relacionó con un tipo específico de leucemia (leucemia mielomonocítica crónica
(LMMC) (Selleri y Col. 1990, Roumier y Col. 1999). Adicionalmente, Melo y Col.
(1996) sugirieron que p190BCR/ABL, como también es conocida la variante e1a2, podía ser
considerada como una forma especifica de LMC en la que las características
citomorfológicas son intermedias entre LMC y LMMC. Por su parte, Ohsaka y Col.
(2002) han considerado que estos casos deben ser tratados como una enfermedad
heterogénea, puesto que en varios de ellos el componente monocítico no estuvo presente.
Esta variante también ha sido relacionada con eventos secundarios de la misma LMC, es
decir, con la evolución de la enfermedad y resistencia al tratamiento con Imatinib
(Ohsaka y Col. 2002, Andrikovics y Col. 2007).
En este estudio en particular no se observó ninguna relación directa entre la
variante e1a2 y la fase de la enfermedad en la que se encontraban los pacientes. Así
mismo, la respuesta al tratamiento también varió para cada paciente. Con respecto al
componente monocítico, se encontró que el único paciente de los 7 reportados,
perteneciente al centro de referencia BMS no presentó monocítosis, sin embargo este
paciente llamó mucho la atención porque aunque fue positivo para el encogen BCR/ABL
y citogenéticamente fue analizado como un caso de LMC, también presentó una sobreexpresión del gen JAK2 el cual ha sido principalmente relacionado con las patologías
Policitemia Vera y Trombocitemia Esencial (Dra. Osiris Da Costa, comunicación
personal). La variabilidad observada en nuestro paciente con respecto a los parámetros: a)
148
fase de la enfermedad, b) respuesta al tratamiento y c) presencia de un fenotipo indicativo
de otras enfermedades diferentes de la LMC, nos induce a pensar en un carácter
heterogéneo para esta condición en nuestro paciente tal como ha sido reportado por
Ohsaka y Col. (2002), sin embargo habría que hacer un estudio mucho más exhaustivo
sobre este punto antes de poder hacer cualquier aseveración.
Adicional a la identificación de las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 por separado,
también se reporta la identificación de la co-expresión de las variantes b2a2/b3a2 y
b2a2/e1a2. Los resultados obtenidos en el cálculo de la frecuencia de estas coexpresiones evidenció un elevado porcentaje de expresión de la co-expresión de las
variantes más frecuentes (12.5% para b2a2/b3a2) con respecto a una muy baja expresión
de la co-expresión que involucra una de las variantes mas frecuentes (en este caso b2a2)
y a la variante menos frecuente e1a2 (1% para b2a2/e1a2). En referencia a la coexpresión de las variantes b2a2/b3a2, los resultados obtenidos en este estudio fueron
similares a los reportados por Arana-trejo y Col. (2002), Meissner y Col. (1999),
Pallisgaard y Col. (1998), Dongen y Col. (1999) y Mondal y Col. 2006 quienes también
identificaron esta co-expresión en pacientes con LMC y en líneas celulares ya
establecidas, usando las técnicas de RT-PCR y multiplex RT-PCR. En cuanto a la
frecuencia de expresión de esta misma co-expresión, Arana-trejo y Col. (2002) y
Meissner y Col. (1999) observaron una frecuencia similar a la encontrada en este trabajo,
mientras que por el contrario Donger y Col. (1999) y Goh y Col. (2006) reportaron una
frecuencia de 5% y < 2% respectivamente. Estas diferencias en la frecuencia de expresión
de la co-expresión b2a2/b3a2 quizá pudieron deberse a la técnica empleada por estos
autores para la detección de las mismas, como se sabe (Pallisgaard y Col. 1998) una PCR
multiplex puede generar problemas de inespecificidad por competencia de cebadores a la
hora de la amplificación o al número de muestras empleadas para el estudio. En cuanto a
la presencia y frecuencia de la co-expresión b2a2/e1a2 en pacientes LMC tenemos que
nuestros resultados fueron muy similares a los reportados por van Rhee y Col. (1996).
Estos investigadores reportaron la presencia de esta coexpresión tanto en pacientes en
fase crónica como en crisis blástica con una frecuencia muy baja. En contraste, este
149
trabajo determinó que los 3 pacientes que presentaron esta co-expresión se encontraban
en fase acelerada.
Es indispensable aclarar que aunque en la discusión de las frecuencias de las
diferentes variantes y co-expresiones se incluyeron reportes de varios países, en la tabla
XI presentada en los resultados (donde se hace la comparación de la frecuencia obtenida
en este trabajo con respecto a la obtenida en otros países), sólo se consideraron los
trabajos realizados por latinoamericanos (México, Brasil, Ecuador y Chile) debido a que
sus trabajos fueron los únicos que presentaron detalles completos de los valores de las
frecuencias obtenidas para cada variante.
Con respecto a la amplificación del gen bcr como control interno, se observó un
buen resultado en aquellos pacientes que dieron negativos para la translocación
BCR/ABL, descartando la posibilidad de ser falsos negativos. Estos pacientes mostraron
una banda muy nítida a 800 pb, correspondiente al tamaño esperado para el producto de
este gen, sin embargo, algunos de los pacientes que resultaron positivos para la
translocación presentaron una amplificación del gen bcr que varió desde una banda tenue,
pero distinguible, a la ausencia total de la misma. Estos resultados son similares a los
obtenidos por Cross y Col. (1994) quienes aplicando RT-PCR en pacientes con posible
LMC también encontraron variaciones en las amplificaciones del gen bcr en pacientes
positivos para la translocación BCR/ABL. Cabe por lo tanto destacar que usando el
control interno para amplificar el gen bcr, se pudo determinar con mucho grado de
certeza que en los pacientes que no amplificaron la translocación, esto era debido a que
realmente no estaba presente dicha mutación, incluso descartando posibles errores
técnicos del método empleado. Aquellos pocos casos en que no se detectó ninguna banda
durante la amplificación, fueron repetidos y atribuidos a errores técnicos.
Pacientes que resultaron positivos por PCR para BCR/ABL presentaron una
variación en la detección del gen bcr, sin embargo en estos casos no importó la ausencia
150
de la amplificación del gen control bcr, debido a que lo importante era que ya se estaba
determinando la presencia de la translocación BCR/ABL.
Dos últimos aspectos importantes que se consideraron en este trabajo fueron la
edad y el sexo en relación con las frecuencias de las variantes encontradas. En el caso de
la edad, los resultados obtenidos no mostraron ninguna relación significativa o tendencia
entre la edad y la enfermedad o con alguna variante en particular, aún cuando se observó
la predominancia de dos grupos de edades (21-40 y 41-60) en casi todas las variantes
encontradas. Estos resultados fueron compatibles con los de Rosas-Cabral y Col. (2003),
quienes no encontraron ninguna relación directa entre la edad y la presencia de
BCR/ABL y sus variantes. Sin embargo, la gráfica que combina la distribución de las
edades de los pacientes positivos para la translocación BCR/ABL vs la distribución de la
población venezolana por edad, mostró una tendencia de la población venezolana a
expresar la enfermedad en edades comprendidas entre los 30 y los 60 años
aproximadamente, lo que cataloga a la LMC como una enfermedad que
predominantemente se presenta en adultos. Nuestros resultados fueron compatibles con
los publicados por Sawyer y Druker (1999), Melo y Col. 2003. Auewarakul y Col. (2006)
y Mondal y Col. 2006, quienes clasifican a la LMC como una enfermedad que se
manifiesta principalmente en adultos. Adicionalmente, el trabajo de Auewarakul y Col.
(2006) también reportó una relación de la variante b3a2 con pacientes de mayor edad.
Con respecto al sexo, en este trabajo no se encontró una relación significativa entre
algunas de las variantes encontradas por separado o en general con un sexo en particular.
Estos resultados se compaginan con los reportados por Goh y Col. (2006) quienes
tampoco hallaron una relación entre las variantes y el sexo.
Dado que este es el primer trabajo formal, con fines de investigación y
académico, que se realiza en Venezuela en el diagnóstico molecular tanto del oncogen
BCR/ABL como de cada una de sus variantes, se propuso la preservación de las
diferentes variantes de la translocación BCR/ABL que pudieran expresar lo pacientes
Venezolanos. En tal sentido, en este trabajo se reporta la clonación satisfactoria de las
151
variantes b2a2, b3a2 y e1a2, expresadas en pacientes con LMC. Dicho clonaje, permitió
contar con material de respaldo que a posteriori puediera ser usado como control en la
estandarización de otras translocaciones para el análisis de mutaciones puntuales en
diferentes regiones de la quimera y para estudios de expresión génica. Adicionalmente,
los clones también pueden servir para la creación de líneas celulares con características
específicas que permitan continuar los estudios de estos tipos de patologías y así avanzar
en el estudio tanto de la LMC como el de otras leucemias.
Por su parte, las secuenciaciones automáticas de las variantes obtenidas por RTPCR corroboraron de manera definitiva la presencia de cada una de ellas en los pacientes
con LMC. La alineación en bloques de los grupos de pacientes con respecto a cada
variante reportada demostró la presencia de los puntos de fusión correspondiente a las
variantes b2a2, b3a2 y e1a2. Tal como se documentó en la sección de RT-PCR, los
puntos de fusión reportados en este trabajo son los mismos que han sido señalados en la
mayoría de los trabajos relacionados con este tema. No se encontraron variantes del punto
de fusión diferentes a las reportadas.
En relación a las secuencias obtenidas para la variante b2a2, se observó que
además del punto de fusión que identifica a esta variante, también se encontró la
presencia de sustituciones de bases T/C en la porción abl de 3 (pacientes 93, 112 y 130)
de las secuencias analizadas. Sin embargo, cuando se hizo la conversión de bases a
aminoácidos de la región estudiada, se observó que ninguna de las sustituciones
encontradas produjo cambios en el marco de lectura proteica. En este sentido, Mondal y
Col. (2006) reportaron la presencia de este mismo polimorfismo en pacientes LMC de la
India, el cual fue asociado con la presencia de co-expresiones de variantes BCR/ABL.
Esta asociación del polimorfismo difiere de los resultados observados en este trabajo
puesto que los tres pacientes que presentaron este polimorfismo presentaron solo la
variante b2a2. Adicionalmente, Meissner y Col. (1998) y Saussele y Col. (2000) también
demostraron la presencia del polimorfismo T/C en la quimera BCR/ABL, pero este se
ubicó en la región bcr (exon b2) a 8 bases del punto de fusión BCR/ABL en pacientes
152
LMC. Además, Saussele y Col. (2000) reportaron una significante frecuencia (28,8%) de
este polimorfismo tanto en pacientes LMC como en otros síndromes mielodisplásicos y
leucemias agudas. Dada la prevalencia del polimorfismo en todos los pacientes LMC
estudiados, estos investigadores propusieron el uso de este polimorfismo como marcador
para diferenciar los alelos bcr rearreglados en heterocigotos versus los normales.
Aún cuando las variaciones polimórficas en la secuencia de la porción abl
reportadas en este trabajo no influyen para nada en la producción de la proteína final,
llaman la atención debido a que es justo en la porción abl, de la quimera BCR/ABL,
donde se localizan la mayoría de los dominios funcionales y reguladores de este híbrido.
Con base en esto, se decidió hacer una búsqueda electrónica del dominio de la porción
abl involucrado en la zona de secuenciación donde se encontraron los cambios y esta
reveló que dicha zona corresponde al dominio SH3 de la quimera BCR/ABL reportada.
El dominio SH3 es uno de los principales en la regulación de la actividad tirosina
quinasa (TK) tanto de c-ABL como de la quimera BCR/ABL. En condiciones normales el
dominio SH3 de la proteína ABL es capaz de asociarse intramolecularmente con
diferentes regiones (punto de unión entre los dominios SH2 y SH1 (tirosina quinasa) y
con la porción C-terminal) de esta molécula e inducir su inactivación o autoinhibición
(Mayer y Baltimore 1994; Moarefi y Col. 1997; Hofmann y Col. 2002; Smith y Col.
2003). Adicional a esto, también se ha demostrado la asociación del dominio SH3 de
ABL con otras proteínas reguladoras (Abi 1 y 2) de su actividad (Dai y Col. 2001).
Aunque en principio, estos hallazgos parecieran hablar a favor de la aparición de
polimorfismos o mutaciones puntuales en la región SH3 de la quimera BCR/ABL que
eliminen la capacidad reguladora de esta región los trabajos de Lionberger y Col. (2000),
Smith y Col. (2003) y Meyn y Col. (2006) plantean que la perdida de esta regulación es
debido a procesos de fosforilación tanto en el mismo dominio SH3 como en los diferentes
dominios a los cuales se une y que este proceso puede ser realizado tanto por la
oligomerización de la propia quimera BCR/ABL como por proteínas pertenecientes a la
153
familia Src. Por otra parte, trabajos como los de Cross y Col. (1999); Stanglmaier y Col.
(2003) y Nieborowska-Skorska y Col. (1999) demostraron que mutaciones en el dominio
SH3 más bien inhiben la unión de BCR/ABL a otras proteínas en su efecto transformante.
Esta misma situación ha sido reportada por Ren y Col. (2005) para la proteína PI3K,
donde mutaciones en el dominio SH3, en su subunidad p58, inhibió la interacción de esta
proteína con la misma BCR/ABL y que esto a su vez, inhibió el crecimiento
independiente de los factores de crecimiento y citoquinas en las células que la producen.
En el caso de las secuencias para las variantes b3a2 y e1a2 se encontró un 100% y
99%, respectivamente, de homología con la secuencia reportada en el gen-Bank para
estas variantes. Además, se pudo observar que, a diferencia de lo encontrado para la
variante b2a2, ninguna de las secuencias analizadas para estas variantes presentó
sustituciones en su porción abl o bcr.
Ya que el diagnóstico molecular de la quimera BCR/ABL fue negativo en 97
pacientes clínicamente sospechosos de LMC, se llevó a cabo la determinación de 7 tipos
de translocaciones relacionadas con otros trastornos neoplásicos en estos pacientes. Esta
detección fue basada en el hecho de que prácticamente todas las leucemias son originadas
por translocaciones cromosómicas que producen proteínas híbridas funcionales que son
capaces de inducir transformaciones malignas en los pacientes que las expresan (Zheng y
Col. 2007). Sin embargo, es importante mencionar que son pocas las leucemias que
presentan una única translocación que marque su inicio, tal como lo son las
translocaciones BCR/ABL y PML/RARα respectivamente. En el caso de otras leucemias
como la LMA y LLA se ha demostrado que tanto su origen como su evolución están
relacionadas con la presencia de dos o más translocaciones las cuales, en la mayoría de
los casos, pueden implicar un buen o mal pronóstico para la vida del paciente (Lo coco y
Col. 1999; Nasedkina y Col. 2002; Zhu y Col. 2005; Wan y Col. 2007; Zheng y Col.
2007).
154
Con base a lo anteriormente expuesto, se llevó a cabo la estandarización de las
translocaciones BCR/ABL (9:22) p190, E2A/PBX-1 (1:19), MLL/AF4 (4:11) y
TEL/AML (12:21) vinculadas con el desarrollo de la leucemia LLA. Las translocaciones
AML/ETO (8:21), PML/RARα (15:17)
y CBFβ/MYH11 (INV 16) frecuentemente
encontradas en la leucemia LMA y por último, la translocación PML/RARα (15:17) la
cual está asociada con la presencia de la leucemia LPA (Ver esta misma sección en
resultados).
En los últimos años varios grupos de trabajo han realizado grandes esfuerzos por
estandarizar multiplex PCRs que permitan, en una sola reacción y en un tiempo mínimo,
amplificar tanto las translocaciones de buen y mal pronóstico ya conocidas, como las
posibles variantes que se generan de estas. En este contexto, Pallisgaard y Col. (1998),
Scurto y Col. (1998), van Dongen y Col. (1999), Ariffin y Col. (2003) y Liang y Col.
(2002) han reportado la estandarización de multiplexs RT-PCRs donde, además de poner
a punto todos los aspectos relacionados con una amplificación rápida y eficiente, también
han desarrollado nuevos métodos de análisis de los fragmentos obtenidos en cada una de
ellas. Así, Scurto y Col. (1998) estandarizaron una multiplex PCR donde los análisis de
los productos de amplificación fueron realizados por Southern blot o dot-blot
hybridization, Dupont y Col. (2002) estandarizaron una multiplex PCR donde los
productos de PCR fueron analizados por fluorescencia en capillares y Shi y Col. (2003)
quines estandarizaron una multiplex PCR donde los productos de amplificación fueron
identificados y cuantificados por un equipo de PCR en Tiempo Real.
En este estudio en particular, es importante mencionar que aunque en el inicio de
la estandarización de las translocaciones se tuvo la intención de usar una PCR multiplex
igual a la reportada por Pallisgard y Col. (1998), esta idea fue modificada debido al alto
grado de inespecificidad de bandas (datos no mostrados). Dado que nuestro objetivo
principal no era estandarizar PCRs multiplex, sino lograr obtener un buen amplificado de
cada translocación que pudiera ser usado en el diagnóstico y pronóstico de estas
alteraciones, se decidió hacer las reacciones de PCRs por separado pero en paralelo,
155
manteniendo el mismo programa de temperaturas reportado por Pallisgard y Col. (1998)
para todas las translocaciones. En cuanto al método de verificación de los productos
obtenidos, se siguió el procedimiento estándar que incluyó la corrida en geles de agarosa.
Los resultados obtenidos en este trabajo para cada translocación son similares a los
obtenidos por Pallisgard y Col. (1998) y los de Ariffin y Col. (2003), quienes observaron
la presencia tanto de bandas esperadas, de acuerdo a los cebadores empleados, como la
presencia de nuevas variantes creadas por “splicing alternativo”. Cabe destacar que los
cebadores usados en la amplificación de cada translocación fueron creados de tal manera
que se pudiera evidenciar la presencia de variantes dentro de cada una de ellas si las
hubiera. Desafortunadamente, no se contó con controles positivos (ya fuesen pacientes o
líneas celulares) que permitieran evidenciar la presencia de algunas de las translocaciones
aún cuando se tenían los cebadores para amplificarlas.
En pacientes que padecen de leucemia LLA, la presencia de las translocaciones
BCR/ABL p190, E2A/PBX1 y MLL/AF4 han sido asociadas con un mal pronóstico en
comparación con pacientes que no presentan estas translocaciones, mas aún estos
pacientes presentan una menor respuesta al tratamiento (Crist y Col. 1990; Chessells y
Col. 2002; Ariffin y Col. 2003). En el caso particular de la translocación MLL/AF4, esta
ha sido asociada con una LLA muy agresiva en niños (Nasedkina y Col. 2002). Por el
contrario, la translocación TEL/AML1, una de las más comunes en niños con LLA, ha
sido asociada a un buen pronóstico, en el que los pacientes muestran una excelente
respuesta al tratamiento seguida de una remisión completa o un porcentaje de recaída
muy bajo. El logro de la detección de la translocación TEL/AML1 por métodos
moleculares aumentó significativamente la calidad de vida de los pacientes LLA debido
al buen pronóstico que ella indica. Anteriormente no se tenía conocimiento de esta
translocación debido a que el rearreglo cromosomal que la produce es criptico o
silencioso, es decir, no podía ser identificado por métodos citogenéticos (Shurtleff y Col.
1995; Rubnitz y Col. 1997).
156
Con base en estos descubrimientos, la terapia moderna para niños con LLA ha
incluido en su método de riesgo estratificado la detección de la translocación
TEL/AML1, como marcador de bajo riesgo de muerte y las translocaciones BCR/ABL
(p190), MLL/AF4 y E2A/PBX1 como marcadores de alto riesgo de muerte (Nasednika
2003). Desde el punto de vista del tratamiento, los pacientes con LLA que presentan las
translocaciones BCR/ABL (p190) y la MLL/AF4 reciben una combinación de altas dosis
de quimioterapias y transplante de médula ósea y en el caso particular de la BCR/ABL el
fármaco Imatinib es incluido en el tratamiento (Karachunskii y Col. (2002) nombrado por
Nasedkina y Col. (2003); http://www.cancer.org). La detección temprana de las
translocaciones de mal pronóstico en los pacientes con LLA unida a la aplicación
inmediata de las estrategias de tratamiento antes mencionadas, han permitido aumentar la
tasa de supervivencia de estos pacientes en un 65% (Arico y Col.2000).
En el caso de la LMA, la presencia de las translocaciones AML/ETO,
CBFβ/MYH11 y PML/RARα han sido asociadas con un buen pronóstico, mientras que
todas las translocaciones que involucren al cromosoma 11q23 (MLL) están asociadas con
un muy mal pronóstico, como lo son las translocaciones MLL/AF6, MLL/AF9 y
MLL/ELL entre otras (http://www.cancer.org). La translocación AML/ETO ha sido
reportada en un 6-8% en pacientes LMA adultos y en un 10-14% en niños con LMA y es
especialmente encontrada en la LMA subtipo M2. Por su parte, la translocación
CBFβ/MYH11 es encontrada en un 5-7% de pacientes LMA y es estrechamente asociada
con el subtipo LMA-M4. La translocación PML/RARα ha sido reportada en un 5-10% de
pacientes LMA y es asociada con el
subtipo M3. En contraparte, la translocación
BCR/ABL es raramente encontrada en la LMA (Martineau y Col. 1998; Van Dongen y
Col. 1999). Es importante recalcar que aunque la translocación PML/RARα es propia de
la LPA, esta es incluida en el panel de la LMA porque existen pacientes que pueden
sufrir un proceso de transformación de LMA a LPA, de hecho la LPA es considerada por
muchos autores como un subtipo de la LMA (subtipo M3) (Douer 2000; Lengfelder y
Col. 2005). En cuanto al tratamiento empleado en los pacientes LMA, se recomienda el
uso de quimioterapias en las que el tipo de drogas a combinar, su concentración y tiempo
157
de aplicación van depender de las translocaciones que cada paciente exprese
(http://www.cancer.org).
Por último, en el caso de la LPA, la translocación PML/RARα se ha convertido
en el distintivo característico de su inicio debido a que todos los pacientes que presentan
la translocación desarrollan los diferentes síntomas de esta enfermedad. La identificación
de dicha translocación se ha convertido en los últimos años en sinónimo de buen
pronóstico dado que ha sido demostrado que el 100% de los pacientes que la presentan
tienen una excelente respuesta al tratamiento con ATRA (ácido retinoico todo trans. En
estos paciente, al igual de cómo ocurre en otras translaciones, se ha evidenciado la
presencia de pacientes que se han vuelto resistentes al tratamiento y se ha demostrado que
dicha resistencia es debida a la aparición de otras translocaciones que asocian al gen
RARα con otros genes como NPM y PLZF. Estos hallazgos han conllevado a la
búsqueda de nuevos fármacos que permitan contrarrestar sus efectos. Es así como
actualmente el tratamiento de la LPA ha incluido el uso de compuestos arsénicos como el
trióxido arsénico (Lo coco y Col. 1999).
La detección de todas estas translocaciones también es importante para los
estudios de enfermedad mínima residual, donde pacientes que ya han entrado en una
etapa de remisión completa son monitoreados eventualmente para prevenir una recaída.
La aparición de alguna de las translocaciones de mal pronóstico implicaría la reaparición
inminente de la enfermedad en estos pacientes (Dongen y Col. 1999; Boeckx y Col.
2002).
Los grandes avances en la identificación de diferentes translocaciones y su
asociación con un pronósticos clínicos específicos, para un tipo de leucemia dada, ha
permitido la producción de fármacos con gran efectividad en el tratamiento de leucemias
que años atrás eran consideradas altamente tóxicos, tales como son los casos particulares
de la LMC BCR/ABL (9:22) tratada actualmente con Imatinib y la LPA PML/RARa
(15:17) que es tratada con ATRA (Nasedkina 2003).
158
El último fin de la estandarización de todas estas translocaciones es poder crear a
futuro, pero en un corto plazo, en nuestro país, arreglos en membrana o microarreglos
que involucren la mayoría de las translocaciones reportadas y sus posibles variantes para
cada tipo de leucemia que permitan ofrecer una mayor gama de translocaciones y
variantes que amplíen la información diagnóstica y pronóstica para cada paciente en un
tiempo mínimo. En este sentido, los trabajos recientes de Nasedkina y Col. 2002 y 2003,
Shi y Col. 2003 y Chun y Col. (2007) están marcando pauta en el desarrollo una
metodología que combina el uso de la multiplex PCR y la hibridización con
microarreglos de oligonucleótidos para una más precisa identificación de los diversos
transcritos de fusión que causan las leucemias.
Adicional a los estudios de diagnóstico molecular de los pacientes con LMC, en
este trabajo también reportamos el análisis inmunofenotípico de 10 pacientes LMC que
resultaron positivos para la quimera BCR/ABL. La evaluación de estas muestras con el
panel de leucemias demostró que para los 3 pacientes con LMC en fase crónica el
inmunofenotipaje no fue significativo para el establecimiento de un diagnóstico
contundente de esta patología, tal como ha sido reportado en trabajos anteriores (Darrell y
Kenneth 1997; Bain y Col. 2002). La presencia de una muy elevada proporción (> 80%)
de células pertenecientes a la serie mieloide madura y un bajo porcentaje (< 2%) de la
serie inmadura permitió dar solo un diagnóstico sugestivo de LMC, indicado por la alta
expresión de los marcadores hematopoyéticos de origen mieloide CD45, CD33 y CD13.
Sin embargo, en los casos LMC en crisis blástica estos mismos análisis si permitieron
hacer una excelente caracterización de la patología. Una vez evidenciada la presencia de
una gran cantidad de blastos en las 7 muestras restantes (> 50 y 80% respectivamente),
los inmunofenotipos con marcadores de superficie celular y citoplamáticos permitieron la
clasificación de estas crisis blásticas en mieloides y linfoides. Estos resultados, a
diferencia de los obtenidos en la LMC en fase crónica, si tuvieron un gran impacto en los
procedimientos médicos que se sucedieron para tratar de salvar la vida de estos pacientes.
Luego de la verificación de la presencia del encogen BCR/ABL, por métodos
159
moleculares, todos estos pacientes fueron iniciados en el tratamiento con Imatinib 600
mg y se pudo observar que los pacientes que presentaron una crisis blástica mieloide
comenzaron a responder al tratamiento, mientras que dos de los pacientes que
presentaron una crisis linfoide murieron al poco tiempo de iniciado el tratamiento.
Adicionalmente se pudo observar que pocos meses después de iniciado el
tratamiento con Imatinib los pacientes con crisis blástica mieloide tuvieron una mejor
respuesta a este (algunos presentaron solo una respuesta hematológica) con respecto al
paciente en crisis blástica linfoide, quien presentó una resistencia completa al Imatinib.
Una baja respuesta al tratamiento, recaídas y posterior muerte en pacientes LMC con
crisis blástica linaje linfoide han sido reportadas previamente. En este sentido, Druker y
Col. (2001) y Lahayet y Col. (2005) han encontrado que pacientes LMC con crisis
blástica linfoide, ya sea linaje B o T, siempre tienen una peor respuesta a la enfermedad
aún cuando se aplique tratamiento con Imatinib y que esto mismo ocurre en pacientes con
LLA positivos para BCR/ABL. Por su parte, Talpaz y Col. (2006) encontraron que
pacientes con LMC en crisis blástica linfoide recaen nuevamente en la enfermedad luego
de 6 meses de tratamiento aun cuando son tratados con inhibidores de segunda
generación como el dasatinib. Gracias a este tipo de análisis los investigadores han
coincidido en que el tratamiento en pacientes con crisis blástica linfoide, así como en
pacientes con LLA BCR/ABL+, debe ser combinado y mucho más prolongado (Lahayet
y Col. 2005).
La inclusión al mercado de nuevos citómetros de flujo que permiten hacer un
análisis con cuatro colores en lugar de dos ha permitido ampliar aun más el campo del
estudio tanto de leucemias en sus fases iniciales e intermedias como de otros síndromes
mielodisplásicos. En este contexto, Kussick y Wood (2003) demostraron que en un
paciente en fase crónica se pudo identificar un proceso de transformación blástica donde
los blastos presentaron un inmunofenotipo de linaje linfoide tipo T. Adicionalmente se
ha reportado que en la actualidad la citometría de flujo esta siendo ampliamente incluida
en los estudio de tratamiento de la LMC debido a la identificación de subpoblaciones de
160
células hematopoyéticas troncales en pacientes con LMC que han sido involucradas en la
resistencia al fármaco Imatinib (Jiang y Col. 2007; Brendel y Col. 2007). La
identificación de estas poblaciones celulares (Cd34+, CD38- y lin-) y la posterior
identificación de la quimera BCR/ABL en ellas está marcando pauta en la búsqueda de
mecanismos adicionales que participan en la resistencia a este compuesto, que hasta
ahora es el tratamiento más eficaz contra este tipo de leucemia. Todos estos hallazgos
demuestran que la técnica de inmunofenotipaje por citometría de flujo y los estudios
moleculares deben co-existir para garantizar un diagnóstico integro que vaya a favor de la
supervivencia de los pacientes que presentan estas patologías
Con respecto a los estudios relacionados con la resistencia al tratamiento con
Imatinib en pacientes con LMC, en el presente trabajo reportamos los resultados
obtenidos en el análisis de tres de los factores mayormente implicados en esta resistencia.
De los dos factores que involucran alteraciones en la quimera BCR/ABL, como lo son las
mutaciones en el dominio tirosina quinasa y la modificación de los niveles de expresión
de BCR/ABL, se encontró que ninguno de los pacientes analizados presentaron alguna de
las mutaciones puntuales reportadas para el dominio tirosina quinasa de BCR/ABL. En
cambio, los estudios de cuantificación de la expresión de BCR/ABL si mostraron un
aumento significativo en la expresión de esta quimera en la mayoría de los pacientes
examinados, principalmente en las etapas de fase acelerada y de crisis blástica. Por su
parte, el estudio del factor que involucra la alteración de la expresión de proteínas como
LYN que están relacionadas con la cascada de señalización “aguas abajo” de BCR/ABL
demostró que el gen Lyn no presentó alteración en sus niveles de expresión en ninguna
de las muestras analizadas, independientemente de la fase en la que se encontraban los
pacientes. Estos resultados indican que en estos pacientes venezolanos el mecanismo de
resistencia al Imatinib estuvo asociado con un aumento en la expresión de la quimera
BCR/ABL, la cual fue capaz de evadir el efecto bloqueante del fármaco Imatinib.
La reactivación de la quimera BCR/ABL por aumento en su expresión en
pacientes con LMC ha sido ampliamente reportada (Le coutre y Col. 2000; Hochhaus y
161
Col. 2002; Chelysheva y Col. 2007). Además, se ha demostrado que este aumento puede
ocurrir por reamplificación génica de la quimera, ya sea por duplicaciones a nivel del gen
híbrido BCR//ABL o por la aparición de trisomia de los cromosomas 9 y 22 (Le coutre y
Col. 2000; Weisberg y Griffin 2000), por un aumento directo en la producción de ARN
mensajeros para BCR/ABL (Olavarria y Col. 2001; Chelysheva y Col. 2007) o por ambos
(Sirulink y Col. 2001; Hochhaus y Col. 2002). Nuestros resultados son consistentes con
los reportados por todos estos autores, quienes trabajando con muestras de pacientes con
LMC o con diferentes tipos de líneas celulares demostraron un aumento en la expresión
de BCR/ABL. Es importante aclarar que en este trabajo no se hicieron determinaciones
citogenéticas (bandeo G o Fish) para verificar si el aumento en los niveles de mensajero
fue debido a modificaciones a nivel cromosómico o genómico.
Los estudios del aumento en la expresión de BCR/ABL en líneas celulares
establecidas, a partir de pacientes con LMC o de células transfectadas con BCR/ABL que
son resistentes a Imatinib, ha ofrecido una amplia gama de respuestas con respecto a la
resistencia a fármacos en células expresando BCR/ABL, debido a que en ellas han podido
ser observados varios mecanismos de resistencia que aún han sido encontrados en
pacientes (Weisberg y Griffin 2000; Keeshan y Col. 2001; La Rosée y Col. 2004).
La respuesta al tratamiento con Imatinib también se ha relacionado directamente
con la fase de la enfermedad en la cual se encuentre el paciente. A nivel clínico, ha sido
establecido que el uso de Imatinib es capaz de inducir una respuesta hematológica y
citogenética en pacientes en diferentes fases de la LMC, principalmente en pacientes con
fase crónica temprana donde se ha observado un 100% de respuesta hematológica y un
87% de respuesta citogenética al fármaco. En contraparte, en pacientes en fase acelerada
y en crisis blástica la respuesta a Imatinib puede disminuir considerablemente
observándose solo una respuesta de 16% y 8% respectivamente (Sawyer C. y Col. 2002;
Radich J y Col. 2006). Así mismo, esa respuesta al fármaco ha estado asociada con una
inducción de la disminución de los niveles de BCR/ABL, mientras que la resistencia al
fármaco ha estado asociada con un aumento en sus niveles de expresión (Barnes y Col.
162
2005). A este respecto, los datos de este trabajo reportan que en todas las fases analizadas
se observaron tanto pacientes que respondieron al tratamiento como pacientes que no lo
hicieron, aún cuando todos presentaron altos niveles de expresión de BCR/ABL en
relación con el valor reportado de no expresión (0.001%). Con base en esto, podemos
inferir que en el caso de la fase crónica, los dos pacientes que no respondieron al
tratamiento con Imatinib debieron su resistencia a diferentes factores, donde el paciente
que presentó niveles más altos de BCR/ABL de (17.8 %) debió su resistencia a un alto
número de moléculas de la quimera que no pudieron ser eliminadas con la dosis de
Imatinib suministrada (para fase crónica generalmente se administran 400 mg/d),
mientras que el paciente con un porcentaje mucho menor (0.99%) de BCR/ABL su
resistencia pudo deberse a mecanismos independientes de la expresión de la quimera y al
hecho de que quizá este paciente pudiera encontrarse en una etapa tardía de esta fase, tal
como ha sido reportado (Branford y Col. 2003; Dai y Col. 2004; Radich y Col. 2006). El
caso donde si hubo respuesta al Imatinib se podría decir que el paciente se encontraba en
una etapa temprana de la fase crónica, que aunado a un porcentaje relativamente bajo
(2.54%) de expresión de la quimera permitió que el fármaco (400 mg/d) pudiera cumplir
su efecto. En estos casos también habría que considerar el tiempo de tratamiento que
tenía cada uno de los pacientes al momento de la toma de la muestra.
En el caso de la fase acelerada podemos decir que casi todos los pacientes
respondieron al tratamiento aunque la mayoría presentó solo una respuesta hematológica
(esta es la última respuesta que se pierde antes de entrar en la etapa de resistencia al
Imatinib (Dra. Osiris Da Costa comunicación personal). Estos resultados podrían hablar
de una posible recaída (hacerse resistentes) en estos pacientes en un período corto, lo cual
es muy común en esta fase de la enfermedad. Con respecto al paciente que presento
respuesta a Imatinib aún con valores elevados de BCR/ABL (13.76%) podemos decir que
quizá este paciente fue tratado con la dosis más alta (600 mg/d) del tratamiento al
momento de su diagnóstico y quizá esto indujo la eliminación a gran escala de la
quimera. En cuanto a la fase de crisis blástica se observó que el paciente que tuvo
respuesta al tratamiento fue el que presentó los niveles más bajos de BCR/ABL, dado que
los pacientes en esta ultima fase generalmente son tratados con las dosis más altas del
163
fármaco nosotros podemos especular que la alta dosis de Imatinib (600 mg/d), al igual
que el caso anterior, también pudo tener efecto sobre los niveles de BCR/ABL. Además,
este caso podría ser un ejemplo de cómo aún en etapas avanzadas de la enfermedad solo
la quimera puede estar ejerciendo el efecto transformante, tal como lo evidenció la
respuesta inmediata de este paciente al ser tratado con Imatinib. Por su parte, el paciente
que no respondió al tratamiento con Imatinib es obvio que debió su resistencia al
exacerbado aumento en los niveles de BCR/ABL (85.8%), éste murió al poco tiempo de
ser diagnosticado. Este último resultado es consistente con lo reportado por Radich J y
Col. (2006) quienes reportaron una menor respuesta a Imatinib por parte de los pacientes
en la etapa de crisis blástica y con lo reportado por Druker y Col. (2001) en cuanto al
fallecimiento temprano de pacientes en crisis blástica. En resumen, estos resultados
inducen a pensar que la respuesta que pueda tener un paciente al Imatinib va a depender
de la etapa de la enfermedad en la que este se encuentre al momento de ser diagnosticado,
de la cantidad de quimera que éste expresando y finalmente de la dosis de Imatinib que le
sea colocada en el inicio de su tratamiento. Estos resultados también demuestran que
Imatinib es capaz de actuar en las diferentes fases de la LMC en pacientes con
diagnostico reciente e inducir una respuesta como ha sido reportado con anterioridad
(Hochhaus y Col. 2002 y Branford y Col. 2002; Lahaye y Col. 2005; Kantarjian y Col.
2006).
En relación a la ausencia de mutaciones puntuales en nuestros pacientes podemos
decir que ésta pudo deberse a varios factores: 1) la presencia de mutaciones puntuales ha
sido detectada en paciente en etapas muy avanzadas de la enfermedad, principalmente en
pacientes con una resistencia secundaria (el paciente se recupera completamente y luego
de 6 meses aproximadamente vuelve a recaer) (Gorre y Col. 2001; Branford y Col. 2002
y 2003; Shah y Col. 2002; Corbin y Col. 2003; Melo y Col. 2003; Kantarjian y Col.
2006; Shah y Col. 2007). En nuestro caso, todos los pacientes examinados
correspondieron al grupo que presentaba una resistencia primaria, es decir, estos
pacientes vienen de un primer diagnóstico en el que se les colocó por primera vez el
fármaco Imatinib, tuvieron una respuesta inicial pero que al poco tiempo recayeron. 2)
Aunque existen varios reportes que demuestran la presencia de mutaciones puntuales en
164
pacientes con LMC todavía existe una gran controversia en la frecuencia de aparición de
las mismas (Roche-Lestienne y Col. 2002; Branford y Col. 2002). 3) Algunos autores
(Hochhaus y Col. 2002; Roche-Lestienne y Col. 2002) no catalogan estas mutaciones
como marcadores de resistencia al tratamiento con Imatinib debido a que estas también
han sido encontradas en pacientes con LMC que nunca han sido sometidos a tratamiento.
4) Para que estas mutaciones puedan ser detectadas muchos autores han tenido que
recurrir a métodos de detección muy sensibles (Shah y Col. 2002; Willis y Col. 2005;
Sorel y Col. 2005; Hughes y Col. 2006), lo que ha llevado a aumentar la creencia de la
baja frecuencia de las mismas aún cuando se hayan identificado diversos tipos de estas.
Con respecto a este punto, en este trabajo la presencia de las mutaciones puntuales fue
evidenciada usando el método de secuenciación directa igual que Branford y Col. 2003,
quienes empleando este método en 144 pacientes con LMC lograron hacer la
identificación de varias mutaciones en 27 pacientes en etapas avanzadas de la LMC. 6) El
último factor que pudo originar la ausencia de mutaciones en este estudio fue el número
de pacientes empleados en el análisis, sobre todo en lo que se refiere a los pacientes en
fase acelerada y de crisis blástica. Estos resultados hablan en favor de una baja frecuencia
de estas mutaciones y de la necesidad de aumentar el número de muestras, así como el
afinamiento técnico, para lograr dar con estas.
Con base en los reportes anteriores muchos investigadores piensan que, aunque
han sido identificadas más de 50 mutaciones diferentes en pacientes con LMC resistentes
al tratamiento con Imatinib (ver figura 56), estas mutaciones pueden ser consideradas
como un efecto oncogénico secundario dependiente o independiente de BCR/ABL que
puede aparecer con la evolución de la enfermedad en la que además, pueden ser
estimulados otros cambios a nivel de la propia quimera o en otras proteínas con actividad
tirosina quinasa (Gorre y Col. 2001; Roche-Lestienne y Col. 2002).
165
Figura 56. Mutaciones puntuales encontradas en el dominio tirosina quinasa (SH1) de la quimera
BCR/ABL asociadas con la resistencia clínica a Imatinib. Los recuadros de colores identifican los
diferentes dominios de BCR/ABL. La porción agrandada corresponde al dominio tirosina quinasa, también
identificado como el dominio SH1. Los óvalos resaltados con las letras P, C y A corresponden a la región
P-loop, catalítica y de activación de este dominio. Las líneas verticales identificadas con códigos
corresponden a las diferentes mutaciones que han sido identificadas.
En lo concerniente a la ausencia de cambios en los niveles de expresión del gen
Lyn en pacientes con LMC resistentes al tratamiento con Imatinib se ha observado que, al
igual que con las mutaciones puntuales, las modificaciones en su expresión y la de otros
genes han sido observadas en pacientes en etapas muy avanzadas o finales de la LMC,
principalmente en pacientes o en líneas celulares con resistencia secundaria a Imatinib y
en pacientes con LLA Ph+ (Hofmann y Col. 2002; Donato y Col. 2003; Jing y Col.
2005). Como se mencionó en párrafos anteriores, quizá el hecho de que los pacientes
empleados en este estudio presentaran una resistencia primaria contra Imatinib pudo ser
el factor que determinó la ausencia de sobre-expresión en este gen.
Por otro lado, la sobre-expresión del gen Lyn también ha sido vinculada
directamente a procesos de transformación celular en los que la célula se ha vuelto
independiente de la sobre-expresión de la quimera BCR/ABL. En este contexto, los
trabajos de Dai y Col. (2004 a y b) usando las líneas celulares K562 y LAMA84,
166
resistentes a altas dosis de Imatinib, demostraron que en estas células la resistencia a
Imatinib no era causada por sobre-expresión de BCR/ABL (los niveles de expresión de
este fueron bajos) sino por la sobre-expresión de Lyn (Imatinib no inhibe a Lyn). Este
hecho fue confirmado por el tratamiento de las dos líneas celulares con los agentes
flavopiridol y bortezomib, los cuales redujeron drásticamente la expresión Lyn y Hck
(ambas pertenecientes a la familia src) y en consecuencia produjeron una inducción a
apoptosis en ambas líneas celulares. Lo que evidenció que el efecto transformante era
ejercido por Lyn y no por sobre-expresión de BCR/ABL. Trabajos adicionales como los
de Donato y Col. (2003), Jing y Col. (2005), Ito y Col. (2007) y Rahmani y Col. (2007)
soportan estos datos y al mismo tiempo plantean que la sobre-expresión de Lyn en
pacientes resistentes a Imatinib es un mecanismo secundario a la sobre-expresión de
BCR/ABL que ocurre generalmente por el descontrol celular que ha causado la quimera
en su proceso de transformación inicial y que es mayormente observado cuando los
niveles de la quimera son abruptamente disminuidos por efecto de la inhibición por
Imatinib. La extrapolación de los resultados que arrojan estas investigaciones, con
respecto a los resultados obtenidos en este trabajo permiten especular que, dada la sobreexpresión de BCR/ABL en todos los pacientes analizados, la sobre-expresión de Lyn no
fue aumentada puesto que la quimera estaría ejerciendo por si misma su efecto
transformante en estas células. Estos datos también ayudan a corroborar que, en efecto,
todos nuestros pacientes se encontraban en una etapa de resistencia primaria para el
momento de toma de las muestras.
Adicionalmente, es importante destacar que la mayoría de las investigaciones
donde se ha observado sobre-expresión del gen Lyn han sido realizadas en líneas
celulares establecidas que presentan una resistencia elevada al imatinib y los estudios de
expresión génica que evidenciaron dicho aumento estuvieron basados fundamentalmente
en estudios con microarray (Ohmine y Col. 2003). Con respecto a este último aspecto es
imprescindible mencionar que la técnica de cuantificación relativa usada en este estudio
incluyó el uso de SYBR Green como compuesto fluorescente para identificar el proceso
de amplificación. Este procedimiento es visto por varios investigadores como un método
de baja sensibilidad debido a la inespecificidad que presenta este compuesto al unirse al
167
ADN, lo que pudo haber generado un background en los resultados obtenidos. Quizá un
aumento mínimo de expresión pudo estar enmascarado dentro del background creado por
este compuesto, aunque en nuestro trabajo fueron tomadas todas las medidas necesarias
de procesamiento de muestras y obtención de datos. Además, en este caso se hace
necesario recordar que en este estudio todos los datos fueron normalizados por el uso del
gen housekeeping GAPDH. A este respecto, en la actualidad se están creando kits
específicos de detección para diferentes genes que son producidos con el mismo
fundamento empleado para la cuantificación de la quimera BCR/ABL (con sondas
TaqMan), los cuales permitirán aumentar aún más la sensibilidad en estas detecciones.
Los resultados obtenidos en el estudio de las mutaciones y expresión génica
sugieren que los próximos estudios deben estar enfocados en pacientes con períodos
relativamente largos de resistencia primaria, a estudios de enfermedad mínima residual y
principalmente aquellos pacientes que hayan presentado recaídas con resistencia
secundaria a Imatinib.
Además de los factores de resistencia al Imatinib que ya han sido discutidos en
secciones anteriores, otras investigaciones han puesto en evidencia la activación de otros
mecanismos que desencadenan resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes con
LMC. En este sentido, los trabajos de Gorre y Col. (2002) y Pocaly y Col. (2007)
demostraron la implicación de la sobre-expresión de las proteínas Hsp 90 y 70
respectivamente, en mecanismos de resistencia a imatinib independientes de BCR/ABL.
Estas proteínas han sido vinculadas a la degradación de proteínas pro-apoptóticas. Por su
parte, los trabajos de Yang y Col. (2003) evidenciaron que la hipermetilación de los sitios
CpG del área promotora de genes como JunB, puede actuar otro mecanismo de
resistencia a Imatinib usado por BCR/ABL para inhibir sobre-expresión de genes que
promueven la diferenciación o apoptosis celular. Así mismo, los trabajos de GambacortiPasserini y Col. (2000) demostraron que la resistencia a Imatinib en modelos animales no
fue debida a ninguno de los factores entes mencionados sino a la presencia en el plasma
de una glicoproteína ácida α1 (AGP), la cual fue capaz de unirse a Imatinib de una
168
manera dosis-dependiente inhibiendo así su entrada a células BCR/ABL+. Ellos también
encontraron que los niveles de esta proteína en el plasma habían sido elevados después
del tratamiento con Imatinib. De igual forma, Ertmer y Col. (2007) demostraron que
células de mamíferos tratadas con Imatinib fueron inducidas a autofagia (proceso de
degradación dependiente de lisosomas) y que esta inducción fue dependiente de la dosis
de fármaco suministrada. Este proceso también fue observado en diferentes tipos de
líneas celulares, lo que indicó que este es un proceso que ocurre de manera general en
todas las células. Igualmente, Dai y Col. (2004 a y b), trabajando con diferentes tipos de
líneas celulares resistentes a Imatinib, hablaron de la presencia de mutaciones puntuales
en sitios adyacentes al dominio tirosina quinasa que pudieran causar una inhibición
alostérica que impida la unión de este fármaco con BCR/ABL.
Uno de los hallazgos que ha causado más revuelo en las investigaciones de
resistencia a Imatinib fue la demostración de que pacientes que adquieren una remisión
citogenética completa de la LMC presentaan células progenitoras (CD34+; CD38+) y
células troncales hematopoyética (HSC) quiescentes (CD34+; CD38-) que expresaban la
quimera BCR/ABL y que estas no fueron eliminadas por el tratamiento con Imatinib aún
después de dos años de tratamiento (Holyoake y Col. 2001; Bhatia y Col. 2003). Estos
autores demostraron por Fish y RTQ-PCR que estas células presentaban niveles
aumentados de BCR/ABL con respecto a las células mononucleares de la médula ósea.
Ellos observaron que Imatinib no indujo apoptosis en las células progenitoras que
transportaban la quimera. Bhatia y Col. (2003) evidenciaron que la persistencia de estas
células no fue debida a la reamplificación de BCR/ABL y supusieron que como en estas
células había sido reportada la actividad de una bomba de exflujo (ABCB1 ó MDR1 y
ABCB2, Thomas y Col. 2004; Brendel y Col. 2007), esta podría estar causando la
resistencia a Imatinib. Adicionalmente, Sengupta y Col. 2007, también encontraron que
en pacientes con crisis blástica las vías de señalización implicadas en la renovación
autocrina de las células troncales pueden ser afectadas por BCR/ABL en su
transformación inicial pero que luego estas pueden hacerse independientes de esta
quimera por activación continua de estas vías (Shh, Wnt, Notch y sonic hedgehog), lo
que las conduce a posteriori a un estado de proliferación descontrolado. Por su parte, los
169
trabajos de Holyoake y Col. (2001) demostraron que células HSC silentes que expresaban
la quimera BCR/ABL adquirían la capacidad de salirse de manera espontánea de la fase
Go del ciclo celular y entrar a un estado continuo de ciclo celular, mientras que las
células que presentaron una disminución de los transcritos BCR/ABL fueron inducidas a
quiescencia. Estos autores también mostraron que estas células primitivas, aisladas de
pacientes con LMC, son capaces de sobrevivir en ausencia de factores de crecimiento
como IL-3 y G-CSF y esto ha sido relacionado con una activación anormal (inducida por
BCR/ABL) de la producción autocrina de estos factores. En confirmación con estos
hallazgos, Jiang y Col. (2007) corroboraron la inducción de los mecanismos de sobreexpresión de BCR/ABL, activación celular por la inducción autocrina de lo factores IL-3
y G-CSF y la expulsión de Imatinib por proteínas transportadoras en células troncales
quiescentes.
Estos trabajos concluyen que estas células hematopoyéticas, ya sean quiescentes o
proliferantes, tienen un papel fisiológico determinante en la patología de la resistencia a
Imatinib, principalmente en los pacientes que sufren recaída en la enfermedad. Este
mecanismo de resistencia está marcando pauta en la búsqueda de nuevos fármacos que
contrarresten el efecto de BCR/ABL.
Aunque aún existe una gran controversia entre los diferentes factores que pueden
inducir la resistencia a Imatinib en pacientes con LMC, varios autores (Gorre y Col.
2001; Olavaria y Col. 2001; Barnes y Col. 2005) están de acuerdo en que la sobreexpresión de BCR/ABL es el mecanismo primario que desencadena la resistencia inicial
contra Imatinib, el cual puede ser sustituido en etapas avanzadas por la activación de
mecanismos secundarios como los mencionados anteriormente.
Todas las investigaciones analizadas hasta ahora permiten evidenciar el carácter
redundante de la quimera BCR/ABL tanto en su proceso de transformación celular
inicial como en la adquisición de resistencia al tratamiento con Imatinib. Este hecho ha
traído como consecuencia la búsqueda de nuevos compuestos que sean capaces de atacar
170
a la quimera BCR/ABL y a otras quinasas tales como las pertenecientes a la familia Src,
lo cual podría proveer un tratamiento mucho más efectivo para personas con LMC y LLA
Ph+, principalmente en aquellas que se encuentran en un estado avanzado de la
enfermedad (Kantarjian y Col. 2006). En este contexto, varios tipos de inhibidores de
tirosina quinasa han sido desarrollados recientemente (ver tabla XVI). Estos fueron
creados de acuerdo a los escenarios de resistencia que se han ido presentando.
Tabla XVI. Compuestos inhibidores de proteínas tirosina quinasa y su espectro de acción. PDFGR=
receptor-β del factor de crecimiento derivado de plaquetas. MAP= proteína activada por mitógenos.
Tomado de Kantarjian y Col. 2006.
DROGA
QUINASA INHIBIDA
Imatinib
BCR/ABL, c-Kit, PDGFR.
Dasatinib
BCR/ABL, familia quinasa Src, c-Kit, PDGFR, quinasa
receptora de epinefrina.
Nilotinib
BCR/ABL, c-Kit, PDGFR.
SKI606
BCR/ABL, familia quinasa Src.
VX680
BCR/ABL, quinasas Aurora, quinasa Flt3.
BIRB 796
BCR/ABL, quinasa p38 MAP.
ONO12380
BCR/ABL, quinasa LYN.
Adafostin
BCR/ABL, otras tirosinas quinasas.
El desarrollo de estos inhibidores involucró varios aspectos, en lo referente al
ataque de la quimera BCR/ABL se quiso asegurar una respuesta eficaz con los fármacos
aún en pacientes que presentasen mutaciones tan críticas como la T315I. En los casos
donde el problema fue la alta expresión de la quimera BCR/ABL se quiso obtener un
compuesto que lograra la erradicación completa de esta a concentraciones muy bajas para
poder así garantizar una mejor calidad de vida al paciente durante tratamiento. En
relación con la sobre-expresión de otras quinasas como LYN, se planteó la necesidad de
171
crear un fármaco que con baja toxicidad para el organismo, que tuviera una acción dual,
es decir, que lograra eliminar tanto a BCR/ABL como a otras quinasas para de esta
manera evitar la ingesta de dos fármacos diferentes que pudieran crear efectos
secundarios mayores a la cura (Kantarjian y Col. 2006).
Todos estos hallazgos han permitido el ensamblaje por piezas de un escenario
celular que abarca la identificación de muchas de las vías de señalización que pueden ser
“tomadas” por la quimera BCR/ABL en su efecto transformante inicial y como éstas son
modificadas a un nivel tal que permite el establecimiento, a posteriori, de una resistencia
a gran escala contra fármacos como el Imatinib. Todos estos eventos nos permiten
resumir que muy probablemente, el sendero a seguir en el tratamiento de esta enfermedad
será la creación de un sistema de ataque que involucre la combinación de varios
compuestos químicos específicos contra los puntos críticos que son “blancos” por la
quimera tanto a nivel de células troncales como en las diferentes etapas de diferenciación
celular que permita el resguardo de la estabilidad de los diferentes procesos celulares que
al final son los que mantienen la homeostasis de la vida.
.
172
CONCLUSIONES
1. Se logró el diagnóstico molecular de la translocación BCR/ABL en 200 pacientes
venezolanos con clínica de Leucemia Mieloide Crónica (LMC). Las variantes
encontradas fueron las b2a2, b3a3 y e1a2, así como la co-expresión entre ellas. Estos
resultados demuestran que la técnica de RT-PCR usada fue altamente sensible en la
detección de esta anomalía genética.
2. Las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 pudieron ser clonadas y secuenciadas manual y
automáticamente de forma satisfactoria. Las variantes analizadas presentaron el punto
de fusión BCR/ABL reportado, pero en la secuencia de la variante b2a2 de algunos
pacientes también se evidenció la presencia de una mutación puntual silente C/T en la
porción abl de la fusión (3 en la posición 402 y 1 en la posición 434). La región donde
se localizó la mutación puntual correspondió con el dominio SH3 de la proteína ABL.
3. La frecuencia de la translocación BCR/ABL en los pacientes venezolanos analizados
fue de 67.3% (200/297). Este valor fue diferente al reportado internacionalmente
(95%) para esta translocación en pacientes con LMC. Por su parte, las variantes
tuvieron una frecuencia de 43.5% (87 pac.) para b2a2, de 39.5% (79 pac.) para b3a2,
de 3.5% (7 pac.) para e1a2 y las co-expresiones b2a2/b3a3 (25 pac.) y b2a2/e1a2 (1
pac.) quedaron incluidas dentro del 13.5% restante. Las variantes b2a2 y b3a2
presentaron una mayor frecuencia comparación con la variante e1a2 y las
coexpresiones de ellas, así mismo sus co-expresiones presentaron mayor frecuencia
que la variante e1a2. La frecuencia de las variantes b2a2 y b3a2 fue igual a la
reportada en México, Brasil y Chile. Mientras que la co-expresión b2a2/b3a2 fue más
alta que la reportada por México y Brasil. La variante e1a2, generalmente presente en
pacientes con LLA, fue expresada en pacientes con LMC con una baja frecuencia.
4. No se observó ninguna correlación entre las variantes BCR/ABL encontradas y la edad
o el sexo en los 200 pacientes estudiados. Sin embargo, con respecto a la edad se
173
observó que de acuerdo a la distribución general de la población venezolana existe una
mayor probabilidad de detección de la enfermedad en personas adultas, principalmente
a partir de los 40 años de edad.
5. El gen bcr, aunque muestra una excelente amplificación en pacientes negativos para la
translocación BCR/ABL, presentó variaciones en su expresión en pacientes que
presentaron la translocación.
6. Se logró la estandarización satisfactoria de un panel de diagnóstico de otras
translocaciones asociadas a diferentes tipos de leucemias, el cual permitió hacer la
clasificación molecular de 40 de los 97 pacientes que dieron negativos para la
translocación BCR/ABL. Se encontraron 2 pacientes positivos para CBFβ/MYH11, 5
pacientes positivos para AML1/ETO, 6 pacientes positivos para E2A/PBX1, 3
pacientes positivos para SIL/TAL, 11
pacientes positivos para TEL/AML y 9
pacientes positivos para PML/RARα. Estos resultados demuestran la importancia de
este panel en la detección de otras translocaciones en pacientes donde no se tenga una
certeza de su clínica, en la detección de varias translocaciones en un mismo paciente y
en el procesamiento de un mayor número de muestras en un tiempo menor.
7. Se logró la identificación por citometría de flujo (inmunofenotipo) de 10 pacientes con
clínica de LMC. A 3 de estos pacientes solo se les pudo dar un diagnóstico sugestivo
de LMC, mientras que a los otros 7 se les pudo hacer la clasificación de una LMC en
fase de crisis blástica y además, por este mismo método, se les consiguió identificar el
linaje celular de los blastos que presentaba cada uno: 4 presentaron un linaje mieloide
y 3 presentaron un linaje linfoide. Esta última identificación fue determinante en el
tratamiento y supervivencia del paciente. Todos los pacientes en crisis blástica también
dieron positivos para la translocación. Estos hallazgos demostraron el uso
indispensable de esta herramienta en la clasificación completa de estas patologías.
174
8. El estudio de la resistencia a Imatinib en 23 pacientes con LMC en diferentes fases de
la enfermedad, evidenció que de los tres factores analizados, el aumento en los niveles
de expresión de la quimera BCR/ABL pareciera ser uno de los factores principalmente
implicados en la resistencia contra Imatinib. En contraparte,
la presencia de
mutaciones puntuales en su dominio tirosina quinasa y el aumento en los niveles de
expresión del gen Lyn parecieran no estar relacionadas con esta resistencia. Estos
resultados no son determinantes dado que se deberían analizar los otros factores
relacionados con la resistencia a Imatinib para poder dar una conclusión contundente a
este respecto.
175
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202
Anexos
204
Anexo A
Esquema representativo del protocolo realizado durante la clonación de las diferentes
variantes de BCR/ABL.
205
Anexo B
Plásmido pGEM-T easy empleado en la clonación de las diferentes variantes BCR/ABL.
A.
B.
206
Anexo C
Cálculo de los ratios de los diferentes genes a partir de cDNA
Muestra
Paciente FC
FC
AG
AG
FG
LM
ZB
RB
JS
promedio
desv
Paciente FA
DF
C de C
JH
HP
OH
FA
JC
MR
promedio
desv
Paciente en CB
M la C
GP
AA
ML
JG
NP
GF
promedio
desv
Normal
S
E
C
K
L
R
K
E
G
Para
BCR/ABL
Gen
GAPDH
Gen LYN
ratio
Ratioenfermo/ratio promedio
normal
29.12
27.61
24.96
24.88
24.9
25.66
26.01
26.27
24.97
26.28
27.56
23.49
27.06
22.9
26.94
24.91
26.44
25.25
1.51086541 1.54511211
0.9481456
0.99679487
1.03052209
1.00999616
1.05246296
0.85232221
0.84626755
0.92464736
0.95764485
0.07860551
0.96600379
1.01556936
1.04993183
1.02901929
1.07228595
0.86837558
0.86220688
0.94206297
0.97568196
0.08008603
22.3
22.1
22.23
21.36
22.12
21.87
23.07
22.25
26.3
22.99
22.03
21.75
23.13
22.31
22.26
22.33
22.93
22.12
1.42520174 0.48275992
0.99103139
0.9608637
0.98869801
0.964456
0.87414449
0.98729006
0.96454821
1.00314465
0.96677206
0.0404233
1.00969733
0.97896143
1.00732
0.9826214
0.89060888
1.00588553
0.98271534
1.02203874
0.98498108
0.04118467
24.18
1.04
28.48 1.10216718
1.05958825
1.12292635
23.85
21.59 0.90524109
24.9
22.62 0.90843373
25.43
23.47 0.92292568
34.23
27.95 0.8165352
19.86
22.2 1.11782477
25.33714286 24.3557143 0.97330395
4.398907873 2.77046841 0.11394112
0.92229118
0.92554396
0.94030885
0.83191453
1.13887885
0.991636
0.11608718
23.25
25.84
27.98
25
27.18
20.58
27.11
22.64
26.28
28.8
22.6
26.76
24.18
22.73
21.42
23.18
23.54
27.06
29.58
27.26
0.95639743
0.9672
0.83627667
1.04081633
0.85503504
1.03975265
1.02968037
1.02708333
1.20619469
207
0.97441104
0.98541708
0.85202783
1.06041996
0.87113951
1.05933625
1.04907425
1.0464283
1.2289132
Y
S2
F
L2
promedio
desv
27.67
22.91 0.82797253
22.56
24.46 1.08421986
29.23
24.67 0.84399589
25.75
26.91 1.04504854
25.64461538 24.9738462 0.98151333
2.756285591 2.34376314 0.11430382
208
0.84356728
1.10464099
0.85989244
1.06473189
1
0.11645672
Anexo D
Secuencia nucleotídica y aminoacídica de ABL donde se resaltan los diferentes dominios
de la proteína, el punto de fusión con BCR y los cebadores empleados para su
amplificación.
ABL 1: NM 005157
1 aaa
K
61 tcc
21
S
121 cag
41
G
181 gaa
61
E
241 cta
81
L
301 tgt
100
C
361 aac
120
N
421 ctg
140
L
481 cag
160
G
541 tct
180
S
601 cat
200
H
661 cgc
220
R
721 acg
240
T
781 gtg
260
V
841 gtg
280
V
901 cag
300
Q
961 tac
320
Y
1021 ctg
340
L
1081 atc
I
1141 gct
A
1201 aag
K
1261 tcc
1
atg
M
tcc
S
ggt
G
aat
N
agc
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Dominio SH3
Dominio SH2
Dominio SH1 o TK;Bolsillo de unión del ATP;Loop catalítico;Loop de activación
Cebadores
Punto de fusión
Secuencia aminoacídica de ABL1
1
61
121
181
241
301
361
421
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210
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Anexo E
CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACIÓN
(Hoja 1 de 3)
Titulo del Estudio: Estudio molecular del encogen BCR/ABL t(9:22) en pacientes
venezolanos con Leucemia Mieloide Crónica.
Objetivos de la investigación:
Usted está invitado a participar, donando una muestra de su sangre o médula ósea,
en un estudio donde mediante análisis genéticos se detectará la presencia del encogen
BCR/ABL que evidenciaría que el tipo de leucemia que presenta el paciente es la LMC.
Procedimientos:
El estudio tendrá una duración de cuatro años. Si usted acepta participar
necesitaremos:
1. De una muestra de sangre o de médula ósea (2-5 ml).
2. Que le suministre al médico tratante la información requerida para rellenar la historia
médica.
3. Que podamos contactarlo en caso de requerir una segunda muestra o datos
adicionales que complementen dicho estudio.
Con su muestra de sangre se procederá única y exclusivamente al análisis genético
que permita determinar si usted posee la alteración genéticas conocidas que causa LMC.
Los análisis genéticos serán realizados mediante técnicas de biología molecular que
permitan identificar las alteraciones en los cromosomas 9 y 2 relacionados con la LMC.
Las muestras serán almacenadas en Laboratorio de Genética Molecular Humana
bajo la responsabilidad del Dr. René Utrera y el resto de la muestra será conservada hasta
finalizar la investigación después de la cual será desechada.
Importancia y beneficios de su participación:
Mediante este estudio, que podrá realizarse gracias a su valiosa colaboración con sólo
proporcionar una muestra de su sangre o médula ósea, se podrá avanzar en los estudios de
diagnóstico y resistencia a esta enfermedad, lo cual permitirá la aplicación, por parte del
médico responsable, de tratamientos más efectivos para evitar un avance de la enfermedad
hacia una fase terminal. Conjuntamente con los beneficios mencionados anteriormente, que
podrá proporcionarle a corto plazo este estudio, los resultados obtenidos con su muestra a
su vez permitirán obtener datos que serán utilizados para establecer una estadística de esta
patología en nuestro país. Los resultados obtenidos una vez finalizado este estudio serán
publicados en revistas científicas especializadas.
Riesgos:
Su participación no implica riesgo ni inconveniente para su salud ni la de sus
familiares.
Confidencialidad:
Todos los datos obtenidos de la investigación serán mantenidos en absoluto secreto y
toda la información sobre su persona será solo accesible a los investigadores y médicos
involucrados en el estudio. Su identidad no será hecha pública en ninguno de los
manuscritos científicos o en las presentaciones que se realicen en eventos científicos.
211
CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACIÓN (continuación)
(Hoja 2 de 3)
Derecho a negarse a participar:
La participación es este estudio es voluntaria. Usted puede negarse a participar en el
estudio o interrumpir su participación en cualquier momento. Si usted se niega a participar en
el estudio, esto no afectará el tipo de atención que recibirá por parte de su médico.
Preguntas:
Debido a que se utilizaron algunos términos técnicos en este formulario de
consentimiento, si existe algo que usted no entienda, por favor pregunte sobre esto sin
dudarlo.
Por favor tome su decisión de participar en este estudio sólo después de haber
examinado detenidamente el contenido de este formulario.
En caso de emergencia o que tenga cualquier pregunta, en cualquier momento sobre
el estudio por favor contacte al investigador principal:
Investigador Principal:
Dr. René Utrera
Médico Responsable:
Dr. José Luís López
Centro de Investigación:
Universidad Simón Bolívar
Laboratorio de Genética Molecular Humana
[email protected]
0212 9064212 0412 7190731
Centro Asistencial
Banco Municipal de Sangre de Caracas
Esquina de pirineos, San José, Caracas
[email protected]
0416 6237612
212
CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACIÓN (continuación)
(Hoja 3 de 3)
Consentimiento:
Yo,______________________ portador(a) de la cédula de identidad _____________he sido
informado(a) de manera amplia, clara y sencilla y mis preguntas han sido contestadas en
relación al estudio sobre el Estudio molecular del encogen BCR/ABL t(9:22) en
pacientes venezolanos con Leucemia Mieloide Crónica, que se llevará a cabo en
forma conjunta entre el Laboratorio de Genética Molecular Humana de la Universidad Simón
Bolívar (USB), el Banco Municipal de sangre de Caracas y la fundación instituto de estudio
avanzados IDEA, coordinado por el Dr. René Utrera y por lo tanto manifiesto estar de
acuerdo en participar en él, por lo que autorizo me sean tomadas las muestras sanguíneas
necesarias para tal fin. He recibido una copia de este consentimiento.
Nombre y apellido: ___________________________
Firma: _________________________
Fecha:
/
/
________________________
Firma del investigador
principal
Testigos:
Nombre y apellido
C.I.
Firma
1.
213
2.
214