(Microsoft PowerPoint - Clase Enzimas 2014 1\252 parte [Modo de

Cátedra Quimica y Bioquímica de los Alimentos
Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales
Universidad Nacional de Misiones
ENZIMAS
Dra. María Alicia Martos
ENZIMAS
Definición:
Son proteínas, sintetizadas por los organismos vivos
que actúan como catalizador biológico, catalizando
todas las reacciones del metabolismo celular.
En 1850 (siglo XIX) Louis Pasteur concluyo que la fermentación de
azúcar a alcohol estaba catalizada por “fermentos”.
En 1878 se le acuñó el término enzima, que viene del griego "en
la levadura“.
En 1897 Eduard Buchner descubrió que los enzimas de la
fermentación podían actuar cuando se separaban de las células.
Pero no se conocía la naturaleza química de las enzimas.
En 1926, James B. Sumner logró cristalizar la ureasa y se
demostró la naturaleza proteica de las enzimas: Postuló: “Todos
los enzimas son proteínas”.
Louis Pasteur
Eduard
Buchner
ESTUDIO DE LAS ENZIMAS EN EL CAMPO DE LOS ALIMENTOS
Las enzimas alimentarias se pueden clasificar en dos
grupos:
1. Aquellas que se encuentran en los alimentos: ENDÓGENAS.
1. Aquellas que se añaden a los alimentos para producir un cambio
deseable: EXÓGENAS.
ESTUDIO DE LAS ENZIMAS EN EL CAMPO DE LOS ALIMENTOS
Endógenas:
Responsables de los cambios que sufren los alimentos y que
afectan su calidad.
Ejémplo:
a) Frutas y verduras tras su recolección y maduración.
b) Modificación de las grasas por hidrólisis de triglicéridos
(rancidez).
c) Decoloración de frutas y verduras.
d) Participan en la alteración de tejidos animales post mortem.
e) Pérdida de la nube de jugos cítricos.
Exógenas:
Se las utilizan como reactivos analíticos.
Procesado de alimentos (facilitar los procesos de extracción,
filtración, clarificación etc.).
Mejorar el sabor.
Elaborar productos nuevos con propiedades sensoriales
distintas, (productos lácteos, panificados, etc.).
Nomenclatura
International Union of Pure and Àpplied Chemistry (IUPAC)
International Union of Biochemistry (IUB)
Publicaron en 1984 las reglas para la clasificación y nomenclatura de las enzimas.
EC de la EC (Enzyme Comission)
Número
Número de 4 dígitos
Primer dígito: Reacción química que cataliza la enzima.
Las enzimas se clasifican en 6 grandes grupos o clases según el tipo
de reacción que catalizan:
Clase 1: Oxidorreductasas; Clase 2: Transferasas; Clase 3:
Hidrolasas ; Clase 4: Liasas; Clase 5: Isomerasas; Clase 6: Ligasas.
Clase 1: Oxidorreductasas
Catalizan reacciones de oxidorreducción..
Clase 2: Transferasas
Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno)
Ejemplo:
hexoquinasa
(fosfotransferasa)
Clase 3: Hidrolasas
Catalizan las reacciones de hidrólisis
Esteres, Enlaces glicosídicos, Enlaces peptídicos, Anhídridos de ácido.
Glucosa + Galactosa
Clase 4: Liasas
Catalizan reacciones que de modo no hidrolítico,
escinden grupos de sus sustratos con formación
deOoo
dobles enlaces
Ej: Pectinliasa
Clase 5: Isomerasas
Catalizan el reordenamiento espacial de grupos del sustrato, (catalizan
transposiciones dentro de una molécula).
Clase 6: Ligasas
Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un
nucleótido trifosfato como fuente de energía (ATP)
Segundo dígito: agrupan a las enzimas según el tipo de enlace que
hidroliza:
ej hidrolasas: 3.1, de enlaces éster, el 3.2 de enlaces glicosídicos, el 3.4 de
enlaces peptídicos, etc.
Tercer dígito: ofrece más información con respecto al sustrato que utiliza
la enzima.
Ej para una hidrolasa de uniones éster 3.1, el tercer número indicará si se
trata de un enlace éster carboxílico (3.1.1), tioéster (3.1.2), monofosfato
(3.1.3) etc.
Cuarto dígito: es un número de registro de la enzima en el grupo
correspondiente.
Estructura
Son Proteínas globulares de diferentes tamaños.
Enzimas formadas por una sola cadena peptídica: 13-50 kDa.
Enzimas extracelulares y secretadas al medio: 30-50 kDa.
Las enzimas oligoméricas tienen masas moleculares entre 80 –
100 kDa.
Estructura esta estabilizada por puentes de H, interacciones iónicas e
hidrofóbicas y en algunos casos por enlaces disulfuro.
La actividad catalítica de las enzimas depende de la integridad
de su conformación proteica nativa.
Muchas enzimas son complejos formados por una parte de naturaleza
proteínica (apoenzima) y otra que no los es (cofactor)
apoenzima + cofactor
Holoenzima
= holoenzima
Apoenzima
Cofactor
Los cofactores pueden ser :
a) Iones metálicos
b) Coenzimas (moléculas orgánicas complejas)
Iones Metálicos
como cofactores:
Cationes: Cu, Mo, Zn,
Mg, Fe, Mn, Ca.
Aniones: Cloruros.
Coenzimas:
Suelen contener en su
estructura, alguna
vitamina (tiamina, niacina,
piridoxina, riboflavina,
ácido pantoténico).
MECANISMO DE ACCION DE LAS ENZIMAS
La primera fase en la catálisis enzimática es la unión del sustrato al
sitio activo de la enzima para formar el “complejo enzima-sustrato” .
Sitio activo enzima: porción de la proteína que participa directamente
en la unión y la transformación del sustrato. Constituido por unos
pocos aa que integran un microambiente específico para que se
produzca la unión con el sustrato.
Solo presentan actividad cuando tienen una
conformación espacial que permite establecer una
disposición óptima de los aminoácidos en el sitio
catalítico.
Teorías propuestas para explicar la union E-S
1. Modelo de llave-cerradura (Emil Fischer, 1894)
Según esta teoría se considera al sitio activo de una enzima como una
estructura rígida, como la de una cerradura, en la cual el sustrato debe
acoplarse como una llave en su cerradura.
Emil Fisher - Premio
Nobel de Química 1902
2. Modelo del Ajuste Inducido (Daniel E. Koshland, 1958)
En este modelo se propone que la enzima es flexible y al enlazarse al
sustrato se induce un cambio en el sitio activo de tal manera que se
altera su forma (cambio de conformación) y se ajusta a la del sustrato.
Daniel E. Koshland, Jr
Propiedades de las enzimas
1. Poseen gran poder catalítico
S
k
P
V = k . [S]
k: constante de velocidad.
Según la teoría del estado de transición
k = (kbT/h) . e - ∆G#/RT
∆Gº: variación de energía libre.
∆G#: energía de activación.
A < ∆G#, k >>
La velocidad dependerá de la barrera energética (∆G#)
Los enzimas aumentan la velocidad de una reacción al disminuir la
energía de activación, sin sufrir ninguna modificación química.
S+E
ES
E+P
V = k . [S]
k = (kbT/h) . e - ∆G#/RT
2. Elevado grado de especificidad
Cada enzima cataliza un solo tipo de reacción y casi siempre actúa
sobre un único sustrato, el que debe reunir ciertas características
estructurales para que pueda ser utilizado como sustrato.
Esta especificidad permite utilizar las enzimas como reactivos
analíticos.
Modifican selectivamente determinados componentes
de un alimento sin alterar otros. Esto las diferencia de
los catalizadores no biológicos.
3. Actúan a bajas Temperaturas
Lo que puede ser beneficioso o perjudicial
Importante en alimentos. Permite el procesamiento enzimático de
alimentos a temperaturas moderadas (25 ºC y 50 ºC).
Pero son responsables de las reacciones
degradativas de los alimentos refrigerados o
congelados.
Otras propiedades de las enzimas
3. No se consumen ni se modifican durante la catálisis.
4. Son sustancias naturales y atóxicas.
5. Se las puede inactivar al finalizar la reacción.
6. Son efectivas en pequeñas cantidades.
Cinética Enzimática
Primeramente, tiene lugar la formación del complejo enzima-sustrato ES.
Luego se liberan el P y la E.
La formación del complejo ES es rápida pero su descomposición en P y E
es lenta: K2 < k1
En los primeros instantes de la reacción
la velocidad de formación de producto
se define como velocidad inicial y está
dada por:
Vi = dP/dt = K2 . [ES]
[E]T = Elibre + [ES]
Cuando [S] >> [E], la E está saturada
y se encuentra totalmente en la forma
ES, por lo que se encuentra a su
máxima velocidad:
Vi = vmax = K2 . [E]T
Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un
comportamiento lineal.
Pero a medida que la reacción transcurre, la velocidad de la reacción va
disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción.
Por lo tanto se procede a medir la velocidad inicial de la reacción
(v0), es decir cuando se tiene sustrato en exceso (saturante).
Vi = vmax = K2 . [E]T
Figura 1: Curva de progreso de
una reacción enzimática. La
pendiente representa, en el
período inicial, la velocidad de la
reacción. La zona de la meseta
representa el equilibrio de la
reacción (no confundir con la
saturación).
La relación entre la velocidad de la reacción y el sustrato se describe
por la ecuación de Michaelis – Menten (1913):
Ecuación que representa una hipérbola.
Siendo :
Vmax: cuando la velocidad de reacción se
hace independiente de la concentración de
sustrato. Este valor depende de la cantidad de
enzima presente.
Km: indica la afinidad E por S. Es independiente de la concentración de
enzima y es característica de cada enzima según el sustrato utilizado.
A bajas concentraciones de sustrato, es decir cuando Km > [S],, vi es
proporcional a la [S] y se tiene una ecuación de primer orden: V = k’ [S]..
A altas [S] (saturante
(saturante)) , es decir
Km<<<<[S], la ec
ec.. es de “orden cero” y vi
es independiente de la [S], la enzima
alcanza su saturación y se obtiene la vmax.
Cuando [S] >> KM se alcanza Vmax
V = Vmax (que sería constante)
El tramo intermedio, en el que la [S] ≈ Km
correspondiente a una cinética de
orden mixto y se ajusta a la ecuación de
Michaelis-Menten.
A elevada concentration de sustrato la enzima estará saturada
(mayor número de centros catalíticos estarán ocupados), lo que
incrementará la eficiencia de la reacción, y la velocidad será máxima
y constante.
Vmax se alcanza cuando todos los centros activos están
ocupados con la enzima.
Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten
(Determinar los parámetros cinéticos Vmax y Km)
Tranformaciones matemáticas de la
ecuación de Michaelis-Menten:
La expresión más utilizadas es la
representación de Lineweaver-Burk.
Gráfica de Lineweaver-Burke
Medida de la actividad enzimática
La enzima no se puede medir en términos de concentración ya que puede
estar presente pero en forma desnaturalizada.
Por ello se emplea la “Unidad de Actividad Enzimática”.
La actividad enzimática se expresa en Unidades Enzimáticas:
1 UE = “Cantidad de enzima que se requiere para transformar en
producto 1 µmol de sustrato por minuto en condiciones stándard”
(condiciones ópitmas de pH, fuerza iónica y temperatura).
Producto formado o
sustrato consumido
0,800
A c . g a la c tu ró n ic o (g /l)
0,700
0,600
0,500
0,400
Por métodos espectroscópicos.
0,300
0,200
Cromatografía.
0,100
Cambios en el pH.
0,000
0
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo (min)
Cambios en la viscosidad etc.
Se deben medir velocidades iniciales (rango lineal).
Se puede medir a un tiempo fijo siempre que este dentro del rango lineal de
la curva de P en función del tiempo.
La determinación se debe efectuar con exceso de sustrato (velocidad
inicial).
Cálculo actividad enzimática
UE/ml = (∆DO/min) * (1/ε.b) * (Vf/Vi * fd)
∆DO: variación en la densidad óptica
ε : coeficiente de extinción molar.
b: espesor de la cubeta
Vf: volumen total de reacción
Vi: volumen de la muestra en el ensayo.
fd. Factor de dilución de la enzima.
ε : absorbancia a una determinada longitud de onda de una solución
1 M de la sustancia determinada en una cubeta de 1 cm, a 25 ºC.
Factores que alteran las enzimas
La actividad catalítica depende de la integridad de su
conformación proteica nativa.
Cualquier ruptura de alguna
interacción iónica esencial.
Desnaturalización
Pérdida de la actividad catalítica
Para actuar en forma óptima requieren ciertas
condiciones de temperatura, pH, fuerza iónica, etc.
condiciones en que su estructura tridimensional es
estable y su carga óptima para interactuar con el sustrato.
Factores
mas
importantes
Temperatura
pH
1. Efecto de la Temperatura sobre la actividad enzimática
La ec. de Arrhenius predice que la velocidad de la reacción
aumenta con la temperatura.
k = Ae-Ea/RT
A : factor de Arrhenius.
Ea : es la energía de activación.
R: es la constante de los gases.
Pero las reacciones enzimáticas se ajustan a esta ecuación en
el intervalo en el que la enzima es estable.
Las enzimas, al ser proteínas, a partir de cierta
temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor.
Temperatura
óptima
Generalmente entre
30 – 40 ºC y por encima
de 45 ºC, comienzan a
desnaturalizarse.
El CALOR provoca la desnaturalización de las enzimas.
2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática
El pH afecta la actividad enzimática:
1. Cambia el grado de
ionización de los aa
del sitio activo
Afecta la capacidad de unión
de la E con su sustrato.
2. Altera la ionización de ciertos
grupos fuera del sitio activo.
Produciéndose una alteración
de su conformación nativa.
Los enzimas poseen grupos químicos ionizables en las cadenas
laterales de sus aminoácidos:
carboxilos –COOH
amino -NH2
tiol –SH
imidazol, etc.
Según el pH del medio, estos grupos tendrán carga eléctrica
positiva, negativa o neutra.
pH óptimo de actividad
Habrá un pH en el cual la conformación de la enzima y la
ionización de los grupos funcionales de los aa del sitio activo
será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el
llamado pH óptimo.
pH óptimo de algunas enzimas:
Enzima
Pepsina (bovina)
Catalasa (hígado de bovino)
pH óptimo
2,0
3 – 10
Renina (ternero)
3,5
Poligalacturonasa (tomate)
4,0
Ficina (higo)
5,6
Polifenoloxidasa (durazno)
6,0
α-amilasa bacteriana
7,0
El pH de los alimentos varía entre 3,0 a 7,0, las frutas pueden tener
un pH mas ácido (2,2).
Para la aplicación de las enzimas en alimentos se usan enzimas que
presenten actividad al pH propio del alimento, ya que este rara vez se
modifica.
Regulación de la actividad enzimatica
Métodos para regular la actividad enzimática
Mantener la integridad de las células y tejidos.
Tratamientos térmicos.
Almacenamiento a bajas temperaturas.
Cambios del pH.
Disminución de la actividad acuosa.
Adición de sustancias químicas (inhibidores enzimáticos).
Uso de atmósfera modificada.
A veces se combinan varios métodos
El control de las enzimas es un reto para el tecnólogo de los alimentos.
1. Mantenimiento de la integridad de las células y tejidos
Se debe asegurar la compartimentalización de los enzimas en los
orgánulos de las células.
Conservar el alimento
Pérdida de la integridad
de células o tejidos.
Produce ruptura celular y liberación de los enzimas
las que se ponen en contacto con el sustrato.
Se desencadenan reacciones enzimáticas en forma incontrolada.
Ej. Liberación de PPO (deseable en el te pero no en frutas y verduras)
2. Tratamientos térmicos:
En alimentos se usan tratamientos térmicos como método de
conservación de manera de eliminar microorganismos y enzimas
indeseables.
Aun en alimentos congelados pueden ocurrir reacciones enzimáticas
indeseables.
Importante en alimentos conocer la temperatura de
desnaturalización de una determinada enzima para
inactivarla.
Cinética de inactivación térmica
El calor provoca desnaturalización.
Inactivación enzimática sigue una cinética de primer orden.
EN
k
EN : Actividad enzimática de la enzima nativa.
ED
ED: actividad enzimática de la enz. desnatural.
v = - d[EN]/dt = k . [EN]
Log [EN]t
T = cte.
Integrando
Ln [EN]t = - k. t + ln [EN]o
Log
Log [EN]t = - k. t + log [EN]o
2,3
Pendiente: k/2,3
tiempo
(ec. 1)
Permite conocer el tiempo del TT para disminuir la actividad de ciertas
enzimas en los distintos alimentos.
A mayor temperatura mayor
Gráfica de inactivación térmica
es la constante de velocidad
de inactivación, según
Arrhenius.
Log [EN]t
50 ºC
60 ºC
70 ºC
k = Ae-Ea/RT
80 ºC
tiempo
A constante
Ea es la energía de activación
R es la constante de los gases
Valor de reducción decimal: D
D = tiempo necesario para inactivar, a una dada temperatura,
un 90 % de la actividad enzimática original.
Log [EN]t =
t = log
- k. t + log [EN]o
2,3
[EN]0
- 1/D
. 2,3/k
[EN]t
[EN]o
= 10
t = 2,3/k = D
[EN]t
Log [EN]t =
Log [EN]t
- 1
D
. t + log [EN]o
T = cte.
t
Se necesita conocer los
perfiles tiempo (D) vs T
para inactivar una enzima
Gráficos de Inactivación térmica de enzimas presentes en la leche (D f T).
Tipos de tratamientos térmicos
Esterilización:
Se somete el alimentos a Temperaturas 115 – 127 ºC. En autoclaves.
Afecta el valor nutricional del alimento (vitaminas) y organoléptico.
Pasteurización:
Inactivación de enzimas y destrucción de microorganismos sensibles
a la altas temperaturas.
No afecta el valor nutritivo o las características organolépticas del
alimento.
Temp. alta y tiempos cortos: 71,7 ºC – 15 seg.
Temp. baja y tiempos largos: 62,8 ºC – 30 min.
Inactivación térmica de enzimas presentes en la leche .
Pasteurización de la leche realizada
para eliminar microorganismos
patógenos: 63 ºC – 30 min
Inactiva la Fosfatasa alcalina
Indicador de la eficacia
del TT.
Escaldado:
Objetivo: eliminar la actividad de enzimas endógenas.
Tratamiento térmico moderado que se aplica a frutas y hortalizas
antes de realizar otras operaciones (congelación, deshidratación,
secado o enlatado).
Maíz, brócoli, coliflor, judías verdes, arvejas, etc, desarrollan durante
el almacenamiento en congelación aromas y flavores indeseables.
Las frutas, verduras, legumbres deshidratadas se deterioran si no se
inactivan sus enzimas.
Gráficos de Inactivación térmica de enzimas presentes en
papas
Peroxidasa
(enzima + resistente al calor)
Peroxidasa
D
(min)
Fenoloxidasa
Indicador de la inactivación
de todas las enzimas
Lipasa
Indicador del proceso de
escaldado
El límite térmico de esta enzima es de 75 a 82 °C
Lipooxigenasa
T (º C)
Así se han determinado valores para tiempo de escaldado:
Arvejas
escaldado de judías
verdes
Antes del proceso de enlatado se escalda el producto para remover
el oxigeno disuelto, inactivar enzimas.
3. Temperaturas bajas
Refrigeración
Conservación a Temperaturas por encima de su punto de congelación
(6 y 8 ºC), durante días o semanas.
La congelación
Descenso de la temperatura del alimento, por debajo de su punto de
congelación (ej. – 18 ºC).
Se detiene el crecimiento microbiano.
Se reducen las velocidades de las reacciones químicas y
enzimáticas (el agua se inmoviliza y no actúa como disolvente o
reactivo).
4. Cambios del pH
Para inhibir la actividad enzimática endógena de un alimento se puede
reducir el pH, mediante la adición de ácidos disponibles como
aditivos.
Ejemplo:
Adición de ácido cítrico o fosfórico a las frutas, luego del pelado y
cortado, para llevarlas a pH < 4 y retardar así las reacciones de
pardeamiento enzimático (PPO).
5. Disminución de la actividad acuosa
Las enzimas deben presentar un cierto grado de
hidratación para ser activas.
Al disminuir aw, la actividad enzimática disminuye debido
a:
Menor cantidad de sustrato disuelto.
Menor velocidad a la cual el sustrato difunde hacia la enzima.
Pero…
Las verduras y frutas deshidratadas se deterioran cuando no se
inactivan sus enzimas mediante un tratamiento de escaldado.
La lipasas que contiene los aceites puros actúan a bajas aw.
OTROS métodos que se pueden utilizar para el control son:
Agregado de productos químicos: Se pueden agregar algunos
compuestos para inhibir la enzima o para bloquear los sustratos.
El agregado de agentes quelantes que secuestran iones
metálicos esenciales para la actividad de la enzima.
Eliminación de oxígeno: minimiza las reacciones oxidativas
catalizadas por enzimas.