Tamarín Capítulo9

E
n 1953, James Watson y Francis Crick publicaron un artículo de un par de páginas en la revista Nature titulado
"Estructura molecular de los ácidos nucleicos: Una estructura para el ácido nucleico de la desoxirribosa". Empezaba
de la siguiente manera: "Queremos sugerir una estructura para
la sal del ácido nucleico de la desoxirribosa (D.N.A.). Esta estructura tiene características nuevas que son de un considerable interés biológico". Este artículo, en el que por primera vez
se establecía el modelo correcto del DNA, se ha convertido en
un hito en la era moderna de la genética molecular, comparado
por algunos con los trabajos de Mendel y de Darwin. (Watson,
Crick y el cristalógrafo de rayos X Maurice Wilkins ganaron
el premio Nobel por este trabajo; Rosalind Franklin, también
cristalógrafa de rayos X, fue reconocida, a título postumo, por
haber desempeñado un papel fundamental en el descubrimiento
de la estructura del DNA.) Una vez determinada la estructura
del material genético, casi inmediatamente se logró comprender su funcionamiento y su modo de replicación.
EN BUSCA DEL MATERIAL GENÉTICO
Propiedades que requiere un material genético
Empezaremos dando un vistazo a las propiedades que debe tener un material genético y repasando la evidencia de que los
ácidos nucleicos constituyen el material genético. Para constituir los genes, el DNA debe contener información para controlar la síntesis de los enzimas y proteínas de una célula u organismo, autocopiarse con una gran fidelidad aunque con u
nivel bajo de mutación y estar localizado en los cromosomas.
Control de los enzimas
El crecimiento, el desarrollo y el funcionamiento de una célula
están controlados por sus proteínas, principalmente por los enzimas. De esta manera, la naturaleza del fenotipo de una célula
está controlada por la síntesis de proteínas en el interior de la
célula. El material genético debe determinar la presencia y las
cantidades eficaces de enzimas en la célula. Por ejemplo, proporcionándole sales inorgánicas y glucosa, una célula de
E. coli puede sintetizar, mediante sus rutas bioquímicas controladas por enzimas, todos los componentes que necesita para
el crecimiento, la supervivencia y la reproducción.
En este punto necesitamos repasar alguna información básica referente a los enzimas. Un enzima es una proteína que actúa como catalizador de un proceso metabólico específico sin
que él mismo quede notablemente alterado por la reacción. La
mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas pueden producirse también sin su mediación, pero sólo en condiciones
demasiado extremas como para que tengan lugar dentro de los
sistemas vivientes. Por ejemplo, muchas oxidaciones ocurren
naturalmente a altas temperaturas. Los enzimas consiguen que
estas reacciones tengan lugar dentro de la célula disminuyendo
lo que se llama la energía de activación (∆G) de una reacción
en particular. En otras palabras, un enzima permite que tenga
lugar una reacción sin el suplemento de energía proporcionado
generalmente por el calor (fig. 9.1).
Replicación
La mayoría de los procesos metabólicos, tales como la biosintesis o la degradación de moléculas, ocurren en rutas metabólicas en las que un enzima facilita cada una de las etapas
véase capítulo 2). En la figura 9,2 se muestra la ruta metabólica para la conversión de la treonina en isoleucina (dos aminoácidos). Cada producto de reacción de la ruta es alterado por
una enzima que lo convierte en el producto siguiente. Por ejemplo, el enzima treonina deshidratasa convierte la treonina en
ácido α-cetobutírico. Los enzimas están compuestos por polímeros de aminoácidos plegados; la secuencia de aminoácidos
determina la estructura final de un enzima. El material genético
determina la secuencia de aminoácidos (véase capítulo 11). La
estructura tridimensional de los enzimas les permite llevar a
cabo su función. Un enzima se combina con su substrato o sus
substratos (las moléculas sobre las que actúa) en una parte del
enzima denominado centro activo (fig. 9.3). El substrato
"encaja" dentro del centro activo, el cual tiene una forma que
sólo permite entrar los substratos específicos. Esta manera de
encajar un enzima con su substrato se llama modelo de funcionamiento enzimátíco de la llave y la cerradura. Cuando los
substratos están en posición correcta en el centro activo del enzima, se da la reacción particular que cataliza el enzima. Los
productos de la reacción se separan entonces del enzima y lo
dejan listo para repetir el proceso. Los enzimas pueden trabajar a velocidades fenomenales. Algunos pueden catalizar hasta
un millón de reacciones por minuto.
No todas las proteínas de la célula funcionan como catalizadores. Algunas son proteínas estructurales, como la queratina, el componente principal del cabello. Otras proteínas son
reguladoras, esto es, controlan el ritmo de producción de otros
enzimas. Y aún otras están implicadas en otras funciones diferentes; las albúminas, por ejemplo, ayudan a regular la presión
osmótica de la sangre.
El material genético debe hacer réplicas de sí mismo con precisión para que cada célula hija reciba una copia exacta. También se necesita una cierta mutabilidad, o capacidad de
cambiar, porque sabemos que el material genético ha cambiado, o evolucionado, a lo largo de la historia de la vida en la
Tierra. En su artículo de 1953, Watson y Crick establecieron
ya el proceso de replicación basado en la estructura del DNA.
Tal como veremos, la mutabilidad es también una consecuencia natural de este proceso.
Localización
Se sabe desde principios de siglo que los genes, las unidades
funcionales discretas del material genético, se encuentran en
los cromosomas dentro del núcleo de las células eucarióticas:
el comportamiento de los cromosomas durante las etapas de
división celular de la mitosis y de la meiosis imita el comportamiento de los genes. Por lo tanto, el material genético en eucariotas debe ser una parte de los cromosomas.
Durante mucho tiempo, las proteínas se consideraron como los componentes celulares con mayor probabilidad de ser
el material genético porque tienen la complejidad molecular
necesaria. Los aminoácidos se pueden combinar de una manera casi ilimitada, creando millares y millares de proteínas diferentes. La primera prueba de que el material genético es el
ácido desoxirribonucleico (DNA) fue proporcionada en 1944
por Oswald Avery y sus colaboradores. El modelo de Watson
y Crick de 1953 puso fin a un período durante el cual se pensó
en el DNA como material genético pero sin que se conociera
su estructura.
Evidencia de que el DNA es el material genético
Transformación
En 1928, F. Griffith informó que un determinado tipo de bacterias muertas por tratamiento térmico (calor) podían "transformar" bacterias vivas de otro tipo. Griffith demostró esta trans-
RECUADRO 9.1
ESTRUCTURA MOLECULAR DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS: UNA ESTRUCTURA PARA EL
ÁCIDO NUCLEICO DE LA DESOXIRRIBOSA
Queremos sugerir una estructura para la sal del ácido nucleico de la desoxirribosa (D.N.A.). Esta estructura presenta
características nuevas que tienen un considerable interés
biológico.
Una estructura para el ácido nucleico ya ha sido propuesta por Pauling y Corey'. Ellos nos proporcionaron amablemente su manuscrito antes de su publicación. Su modelo
consta de tres cadenas entrelazadas, con les fosfatos cerca
del eje de la fibra y las bases en el exterior. En nuestra opinión, esta estructura es insatisfactoria por dos razones: (1)
Creemos que el material que da los diagramas de rayos X
es la sal, no el ácido libre. Sin los átomos de hidrógeno ácidos no está claro qué fuerzas podrían mantener unida la
estructura, especialmente porque los fosfatos cargados negativamente cerca del eje se repelerían entre sí. (2) Algunas
de las distancias de van der Waals parecen ser demasiado
pequeñas.
También ha sido sugerida otra estructura de tres cadenas
por Fraser (en prensa). En su modelo los fosfatos están en el
exterior y las bases en el interior, enlazadas entre sí mediante puentes de hidrógeno. Tal como se describe esta estructura está bastante mal definida y por esta razón ya no volveremos a comentarla.
Deseamos proponer una estructura de la sal del ácido
nucleico de la desoxirribosa radicalmente diferente. Esta estructura tiene dos cadenas helicoidales enroscadas alrededor
del mismo eje (véase el esquema). Hemos hecho los supuestos químicas habituales, a saber, que cada cadena consta de
grupos diéster fosfato que unen residuos β-D-desoxirribofuranosa mediante enlaces 3' → 5'. Las dos cadenas (pero no
sus bases) están relacionadas mediante un eje de simetría
perpendicular al eje de la fibra. Ambas cadenas siguen hélices dextrógiras, pero debido al eje de simetría las secuencias
de átomos en las dos cadenas discurren en direcciones
opuestas. Cada cadena se parece un poco al modelo de
Furberg2 N°l; esto es, las bases están en el interior de la hélice y los fosfatos en el exterior. La configuración del azúcar
y de los átomos próximos es como en la "configuración estándar" de Furberg, estando el azúcar casi perpendicular a la
base que lleva unida. En las dos cadenas hay un residuo
cada 3,4 Å en la dirección z. Hemos supuesto un ángulo de
36° entre los residuos adyacentes de la misma cadena, por
lo que la estructura se repite cada 10 residuos en la misma
cadena, esto es, cada 34 Å. La distancia entre un átomo de
fósforo y el eje de la fibra es de 10 Å. Como los fosfatos están en el exterior, los cationes tienen un acceso fácil a ellos.
La estructura es abierta y su contenido en agua bastante
alto. A contenidos de agua menores podemos esperar que
las bases se inclinen de manera que la estructura podría volverse más compacta.
La característica novedosa de la estructura es la manera
en que las dos cadenas se mantienen unidas por las bases púricas y pirimidínicas. Los planos de las bases son perpendiculares al eje de la fibra. Las bases se mantienen unidas por
pares: una sola base de una cadena está unida por puentes de
hidrógeno a una sola base de la otra cadena, de manera que
las dos están juntas con idénticas coordenadas z. Una de las
bases de cada par debe ser una purina y la otra una pirimidina para que se dé el enlace. Los enlaces de hidrógeno se forman como sigue: posición 1 de la purina con posición 1 de
la pirimidina; posición 6 de la purina con posición 6 de la
pirimidina.
Si se supone que las bases sólo aparecen en la estructura
en la forma tautomérica más plausible (esto es, con la configuración ceto en vez de la enol) se encuentra que solamente pueden enlazarse unos pares de bases específicos. Estos
pares son: adenina (purina) con timina (pirimidina) y guanina (purina) con citosina (pirimidina).
En otras palabras, si en cualquiera de las cadenas uno de
los miembros de un par es una adenina, entonces según estas suposiciones el otro miembro debe ser una timina; lo
mismo para la guanina y la citosina. La secuencia de bases
de una sola cadena no parece que este restringida de ninguna manera. Sin embargo, si solo se pueden formar unos pares específicos, la consecuencia es que dada la secuencia de
bases de una cadena, entonces la secuencia de la otra cadena
queda determinada automáticamente.
Se ha encontrado experimentalmente3,4 que la razón de
las cantidades de adenina y timina y la razón de guanina y
citosina, son siempre muy próximas a la unidad para el ácido nucleico de la desoxirribosa.
Probablemente sea imposible construir esta estructura
con el azúcar ribosa en vez de la desoxirribosa, dado que el
átomo de oxígeno extra podría hacer un contacto de van der
Waals demasiado cercano.
(Continúa en la página siguiente)
por completo, en datos experimentales publicados y argumentos estereoquímicos.
No ha escapado a nuestra atención que el emparejamiento específico que hemos postulado sugiere inmediatamente
un posible mecanismo de copia para el material genético.
Los detalles completos de la estructura, incluyendo las
condiciones que se han supuesto en su construcción, así
como con un conjunto de coordenadas de los átomos, se publicarán en otro lugar.
Estarnos muy agradecidos al Dr. Jerry Donohue por sus
consejos y críticas constantes, especialmente sobre distancias interatómicas. También hemos sido estimulados por un
conocimiento general de la naturaleza de los resultados experimentales no publicados y de las ideas del Dr. M. H. F.
Wilkins, de la Dra. R. E. Franklin y de sus colegas del
King's College, Londres. Uno de nosotros (J. D. W.) ha recibido la ayuda de una beca de la National Foundation for
Infantile Paralysis.
./. D. Watson F.
H. C. Cria
Medical Research Council Unit for the Study ofthe Molecular
Structure of Biological Systems, Cavendish Laboratory, Cambridge. 2 de Abril
1
Pauling, L. y Corey, R. B., Nature, 171,346 (1953); Proc.
U.S. Nat. Acad. Sci, 39, 84 (1953).
2
Furberg, S., Acta. Chem, Scand., 6, 634 (1952).
Chargaff, E., para referencias véase Zamenhof, S., Brawerman, G. y Chargaff, E., Biochim. et Biophys. Acta. 9, 402
(1952).
4
Wyatt, G. R., J. Gen Physiol., 36, 201 (1952)
3
Los datos de rayos X publicados previamente5,6 sobre el
ácido nucleico de la desoxirribosa son insuficientes para
una prueba rigurosa de nuestra estructura. Hasta donde podemos determinar, es aproximadamente compatible con los
datos experimentales, pero debe considerarse como no demostrada hasta que se haya contrastado con resultados más
exactos. Algunos de ellos se ofrecen en las comunicaciones
siguientes. No éramos conscientes de los detalles de los resultados presentados en ellas cuando ideamos nuestra estructura, la cual esta basada fundamentalmente, aunque no
formación usando dos cepas de la bacteria Streptococcus pneumoniae. Una cepa (S) producía colonias lisas porque las células producían una cápsula de polisacáridos. Esto provocaba
una bacteriemia (infección bacteriana) fatal en los ratones.
Otra cepa (R), que no poseía cápsula de polisacáridos, producía
colonias rugosas en las placas de Petri (fig. 9.4); esta cepa no
producía efectos patológicos en los ratones. Las bacterias de la
cepa rugosa son fagocitadas por los glóbulos blancos de la san-
5
Astbury, W. T., Symp. Soc. Exp. Biol. 1, Nucleic Acid 66
(Camb. Univ. Press. 1947).
6
Wilkins, M. H. F., y Randall, J. T., Biochim. et Biophys. Acta.
10, 192 (1953).
Reproducido con autorización de Nature, Vol. 171: 737-738,
Copyrigth © 1953 Macmillan Magazines Ltd.
gre de los ratones; las bacterias de la cepa lisa virulenta sobreviven porque están protegidas por su cubierta de polisacáridos.
Griffith encontró que ni las células del tipo S muertas ni las
células vivas del tipo R causaban bacteriemia por sí mismas en
los ratones. Sin embargo, cuando a los ratones se les inyectaba
una mezcla de células del tipo R vivas con células del tipo S
muertas, aquéllos desarrollaban una bacteriemia idéntica a la
causada por la inyección de células del tipo S vivas (fig. 9.5).
Placa
de Petri con colonias lisas y rugosas de Streptococcus
pneumoniae. Las colonias de la cepa R (rugosas) están a la
izquierda y las colonias S (lisas) a la derecha en el mismo agar
3,5 aumentos.
O. T. Avery, C. M. Macleod, and M. McCarly. "Studies on the
Chemical Nature of the Substunce Inducing Transformation of
Pneumococcal Types". Reproducido del Journal of Experimental
Medicine 79 (1944):137-158, fig. 1 por permiso de los derechos
de autor de Rockefeller University Press. Reproducido con autorización. Fotografía tomada por el Sr. Joseph B. Haulenbeek.
dimiento de extracción, por el análisis químico del material
transformador y mediante la demostración de que los únicos enzimas que destruían la capacidad transformadora eran enzimas
que destruían el DNA. Este estudio proporcionó la primera evidencia experimental de que el DNA era el material genético: el
DNA transformaba las bacterias de tipo R en bacterias de tipo S.
Marcaje de fagos
Por lo tanto, había algo en las células S muertas que transformaba las bacterias del tipo R en células del tipo S.
En 1944, Oswald Avery y dos de sus colaboradores, C.
MacLeod y M. McCarty, describieron la naturaleza de la substancia transformadora. Avery y sus colaboradores hicieron su
trabajo in vitro (literalmente, en vidrio), usando la morfología
de las colonias en el medio de cultivo en vez de la bacteriemia
en el ratón como evidencia de la transformación. Descartaron
las proteínas, los hidratos de carbono y los lípidos por su proce-
A partir de los virus también se ha obtenido información valiosa sobre la naturaleza del material genético. De particular
interés son los estudios realizados con virus bacterianos, los
bacteriófagos o fagos. Como los fagos sólo constan de ácido
nucleico rodeado de proteína, se prestan muy bien para el problema de determinar si el material genético es la proteína o el
ácido nucleico.
En 1952, A. D. Hershey y M. Chase publicaron los resultados de la investigación que dio lugar al concepto de que el
Cuando se mezclaron fagos marcados con 32P con células ni
marcadas de E. coli, Hershey y Chase encontraron que la marca
de 32P había entrado en las células bacterianas y que la generación siguiente de fagos que surgieron de las células
infectadas llevaban una cantidad significativa de marca de 32
P. Cuando se mezclaron fagos marcados con 35S con células
de E. coli no marcadas, los investigadores encontraron que la
marca de 35S permanecía en su mayor parte en el exterior de
las bacterias. Hershey y Chase demostraron de esta manera
que la cubierta proteica externa de un fago no entra en la
bacteria que infecta, mientras que el material interior del fago,
que consiste en DNA, entra en la célula bacteriana (fig. 9.6).
Puesto que el DNA es responsable de la producción de los
fago nuevos durante el proceso de infección, el DNA y no la
proteina debe ser el material genético.
El RNA como material genético
DNA es el material genético y ayudó a explicar la naturaleza
del proceso de infección vírica. Como todos los ácidos nucleicos contienen fósforo mientras que las proteínas no, y ya que
la mayoría de la proteínas contienen azufre (en los aminoácidos cisteína y metionina) mientras que los ácidos nucleicos no,
Hershey y Chase diseñaron un experimento con el uso de isótopos radiactivos del azufre y del fósforo para seguir el rastro separadamente a las proteínas víricas y a los ácidos nucleicos
durante el proceso de infección. Emplearon el bacteriófago llamado T2 y la bacteria Escherichia coli. Los fagos fueron marcados por crecimiento en bacterias cultivadas en un medio de
cultivo que contenía los isótopos radiactivos 35S o 32P. Entonces
procedieron a identificar el material inyectado en las células
por fagos adheridos a la pared bacteriana.
En algunos virus, el material genético es el RNA (ácido ribonucleico) (véase recuadro 9.2). El virus del mosaico del tabaco
(TMV) que infecta las plantas del tabaco consiste sólo en RNA
(ácido ribonucleico) y proteína. La única y larga molécula
RNA está empaquetada en una estructura cilíndrica formada
por cerca de dos mil copias de una sola proteína (fig. 9.7). No
se encuentra DNA en los viriones (partículas víricas). En
1955, H. Fraenkel-Conrat y R. Williams mostraron que un virus se puede descomponer in vitro en sus partes componentes
y reconstruir después en forma de virus viable. Este hallazgo
condujo a los experimentos de Fraenkel-Conrat y B. Singer,
que reconstruyeron TMV con componentes procedentes de cepas diferentes (fig. 9.7). Por ejemplo, combinaron el RNA del
TMV común con la proteína de la cepa enmascarada (M) del
TMV. También hicieron la combinación recíproca de proteína
del tipo común y RNA de tipo M. En ambos casos el TMV
producido durante el proceso de infección fue el del tipo asociado al RNA, no a la proteína. Así se demostró que era el ácido nucleico (RNA en este caso) el material genético. Esto se
confirmó en experimentos subsiguientes en los que se restregaron hojas de la planta con RNA puro de TMV. El resultado
fue una infección normal con una nueva generación de virus
típicos cubiertos de proteína.
QUÍMICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Una vez identificado el DNA (o el RNA) como material genético, necesitamos examinar la estructura química de estas
moléculas. Su estructura nos proporcionará una buena información de cómo funciona.
Los ácidos nucleicos están formados por la unión de nucleótidos de una manera repetitiva en largos polímeros a
modo de cadenas. Los nucleótidos están constituidos por tres
componentes: fosfato, azúcar y una base nitrogenada (tabla
9.1 fig 9.8). Una vez incorporado en un ácido nucleico, un
núcleo-
RECUADRO 9.2
PRIONES: EL EQUIVALENTE BIOLÓGICO
DEL HIELO NUEVE
El material genético es, sin excepción, DNA o bien RNA,
es RNA sólo en unos pocos virus. Dado que prácticamente
todas las enfermedades contagiosas son de origen bacteriano o vírico, esto significa que todas las enfermedades infecciosas también están causadas por organismos con DNA o
RNA como material genético. Sin embargo, hay una situación muy interesante en la que una enfermedad infecciosa
parece ser causada por un agente sin material genético. Tres
enfermedades nerviosas de los seres humanos y cuatro de
los animales son causadas, según se cree, por proteínas sin
DNA o RNA. Las enfermedades humanas son el kuru, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y la enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker. Las enfermedades de animales
son el prurigo lumbar (ovejas y cabras), la encefalopatía espongiforme bovina, la encefalopatía contagiosa del visón y
la diarrea crónica (ciervo y alce). Todas estas enfermedades
son extremadamente lentas en su desarrollo, todas son fatales y se cree que todas están causadas por la ingestión de una
proteína de un individuo infectado; no hay curación y se
desconoce el mecanismo de acción.
Las enfermedades parecen ser causadas por una proteína
similar a la producida normalmente en el cerebro de los individuos sanos. El término prion (abreviación de partícula
infecciosa proteica) ha sido dado a estos agentes por Stanley
Prusiner de la Universidad de California en San Francisco.
Junto con sus colegas aisló la proteína prion (PrP) y más recientemente localizó el gen que codifica la proteína. Además de la forma infecciosa, hay una forma familiar de estas
enfermedades (heredada) resultante de la mutación del gen
que codifica la proteína prion activa en individuos normales
(probablemente al menos en todos los mamíferos).
Aunque no hay curación para estas enfermedades, por lo
menos el kuru parece que casi se haya erradicado. Se encon-
el fosfato de un nucleótido y el grupo hidroxilo (OH) del carbono 3' de una molécula adyacente. Mediante estos enlaces
fosfodiéster pueden polimerizarse cadenas de nucleótidos
muy largas (fig. 9.11).
Estructura biológicamente activa
Aunque se conocía la identidad de los nucleótidos polimerizados para formar una cadena de DNA o de RNA, la estructura
real de estos ácidos nucleicos que funcionaban como material
tró solamente entre los habitantes de una parte de Nueva
Guinea que practicaban el canibalismo. En cuanto abandonaron esta práctica, se detuvo la expansión de esta enfermedad; el kuru no parece generarse de un modo importante por
mutación en los habitantes del área. Mediante el control de
las prácticas alimentarias se cree que la encefalopatía espongiforme bovina también desaparecerá. En el pasado se
alimentaba a las terneras con suplementos proteínicos hechos con animales infectados.
La pregunta obvia que se plantea es: ¿cómo puede una
proteína que parece que no contiene material genético dar
lugar a una enfermedad infecciosa cuando se ingiere? Desafortunadamente, por el momento no hay respuesta. Sin embargo, Prusiner ha sugerido diversos mecanismos mediante
los que una proteína infecciosa puede inducir que se vuelvan infecciosas las copias de una proteína normal. Uno de
estos mecanismos implica una cascada en la que una PrP infecciosa se une a una PrP normal dando lugar a dos PrP
infecciosas. Según esto, una produce dos, dos producen
cuatro, cuatro producen ocho y así sucesivamente. Como
Nancy Touchetle advirtió, en un escrito en The Journal of
NIH Research, esta es la manera en que Kurt Vonnegut describió el comportamiento del mítico hielo nueve en su libro
de 1963, La cuna del gato. Tal como puede recordar quien
haya leído este libro, una sola semilla provocó que toda el
agua de la tierra, por una reacción en cadena como la descrita, se convirtiera en un nuevo tipo de hielo. No es que hayamos recurrido a la ciencia ficción para que explique el
misterio del funcionamiento de los priones; sin embargo,
parece razonable suponer que la comprensión del mecanismo de funcionamiento del prion nos proporcionará una novedad biológica.
genético permaneció desconocida hasta 1953. La impresión
general era que la estructura biológicamente activa del DNA
era más compleja que una simple sucesión de nucleótidos unidos mediante enlaces fosfodiéster y que estaban implicadas
varias cadenas interaccionantes. En 1953, Linus Pauling, un
premio Nobel que descubrió la estructura α-hélice de las proteínas, estaba investigando una estructura de tres cadenas para
el material genético, mientras que Watson y Crick decidieron
que una estructura con dos cadenas era más consistente con las
RECUADRO 9.3
¿POR QUÉ FOSFATOS?
En el DNA los nucleótidos están conectados mediante fosfatos. Recientemente (1987, Science 235:1173-78), F. H.
Westheimer formuló la pregunta: "¿Por qué la Naturaleza
eligió los fosfatos?" La respuesta parece bastante simple. La
molécula de fosfato tiene varias propiedades que la hacen
ideal para unir subunidades en polímeros en el mundo bioquímico (fig. 9.8, arriba). En primer lugar, el grupo fosfato
puede formar enlaces y puede por tanto conectar dos compuestos (fig, 9.11). Los enlaces que se han formado a partir
de los fosfatos (enlaces fosfodíéster) tienen la propiedad
adicional de ser estables, aunque se pueden romper fácilmente por hidrólisis enzimática. En otras palabras, los enlaces son estables, pero los residuos de nucleótidos pueden ser
Í eliminados para conservarlos durante, por ejemplo, diversos procesos de replicación y reparación que comentaremos
más tarde. Cuando se separa un nucleótido, no es destruido
durante el proceso.
Una vez que se ha formado el enlace fosfodiéster, un
átomo de oxígeno del grupo fosfato todavía está ionizado
negativamente. Esta propiedad es extremadamente importante porque hace que sea menos probable el hecho de que el
enlace fosfodiéster se rompa espontáneamente (una carga
negativa protege frente a un ataque nucleofílico) y la ionización negativa mantiene a los nucleótidos y al DNA dentro
de membranas, específicamente la membrana nuclear de los
eucariotas y la membrana celular de los procariotas. Como
los compuestos cargados negativamente son muy insolubles
en lípidos, los fosfatos se mantienen dentro de membranas
por su ionización. Westheimer concluye: "Todas estas condiciones las cumple el ácido fosfórico y no hay ninguna alternativa obvia".
DNA no estaban en una relación de 1:1:1:1. Sus resultados
fueron extremadamente importantes para Watson y Crick en
el desarrollo de su modelo.
cies (tabla 9.3). Encontró que aunque la cantidad relativa de
un nucleótido dado difiere entre las especies, la cantidad de
adenina era siempre igual a la de timina y la cantidad de guanina siempre igual a la de citosina. Esto es, en el DNA de todos los organismos estudiados, hay una correspondencia de
1:1 entre las bases púricas y pirimidínicas. Esto se conoce
como regla de Chargaff. Las observaciones de Chargaff refutaron la hipótesis del tetranucleótido; las cuatro bases del
El modelo de Watson-Críck
Con la información disponible, Watson y Crick empezaron a
construir modelos moleculares. Encontraron que una estructura
posible era una en la que dos hélices se enroscaran entre sí
(una doble hélice) con los esqueletos de azúcar-fosfato hacia
afuera y las bases en el interior. Esta estructura encajaría con
las dimensiones establecidas para el DNA mediante cristalografía de rayos X si cada una de las bases de las dos cadenas
estuviera enfrentada con otra formando los peldaños de una
escalera de caracol (fig. 9.13). El diámetro de la hélice sólo se
podría mantener constante (cerca de 20 Å, unidades angstrom)
si hubiera una base púrica y otra pirimidínica en cada peldaño.
Dos purinas por peldaño sería demasiado grande y
dos pirimidinas sería demasiado pequeño.
Después de experimentos adicionales con modelos
de las bases, Watson y Crick encontraron que los
enlaces de hidrógeno necesarios para formar los
peldaños de su escalera helicoidal podrían darse
fácilmente entre ciertos pares de bases, los pares
que Chargaff encontró en frecuencias iguales. (Los
enlaces de hidrógeno son enlaces muy débiles que
implican la compartición de un hidrógeno entre dos
átomos electronegativos, tales como O y N).
Enlaces de hidrógeno termodinámicamente
estables se forman entre timina y adenina, y entre
citosina y guanina (fig. 9.14). La relación se
denomina complementariedad. Hay dos puentes
de hidrógeno entre adenina y timina (A=T) y tres
entre citosina y guanina (C≡G).
Otro punto acerca de la estructura del DNA está
relacionado con el hecho de que cada cadena
presenta polaridad. Esto es, un extremo de una
cadena del DNA tendrá un fosfato 5' y el otro
extremo tendrá un grupo hidroxilo 3'. Watson y
Crick encontraron que sólo se podían formar
enlaces de hidrógeno si la polaridad de las dos
cadenas iba en direcciones opuestas; esto es, si las
dos cadenas eran antiparalelas (fig. 9.15).
Desnaturalización del DNA
Los estudios de desnaturalización indicaron
que los enlaces de hidrógeno en el DNA se dan
de la manera sugerida por Watson y Crick. Los
enlaces de hidrógeno, a pesar de ser débiles
individualmente,
confieren
estabilidad
estructural a una molécula que tenga un gran
número de ellos. Sin embargo, los en las de
hidrógeno se pueden romper y las cadenas del
DNA separarse, mediante calentamiento de la
molécula de DNA. Se alcanza un punto en el
cual la agitación térmica supera a los enlaces de
hidrógeno y la molécula se desnaturaliza (se
"funde"). Es lógico que cuantos más enlaces de
hidrógeno contengan un DNA, mayor será la
temperatura necesaria parada naturalizarlo. En
consecuencia, como un par de bases G-C
(guanina-citosina) tiene tres enlaces de
hidrógeno mientras que un par de bases A-T
(adenina-timina) sólo tiene dos, cuanto mayor sea
el contenido de G-C de una molécula dada de
DNA, mayor será la temperatura requerida para
desnaturalizar este DNA. Se ha encontrado que
esta relación existe realmente (fig. 9.16).
Requisitos del material genético
Volvamos brevemente a los requisitos que hemos
dicho que debe cumplir un material genético: (1)
regulación de la síntesis de proteínas, (2)
autorreplicación y (3) localización en el núcleo
(en los organismos con núcleo). ¿Cumple el
DNA (O en su ausencia el RNA) estos
requisitos?
Regulación de los enzimas
En los próximos capítulos examinaremos los
detalles de la tesis de proteínas. En este momento
sólo es necesario observa
que el DNA posee la complejidad necesaria para
dirigir la síntesis de proteínas. A pesar de que en
la hélice doble la complementariedad restringe la
base que se opone a otra, no hay restricción
en la secuencia de bases de una cadena dada.
Más tarde demostraremos que una secuencia de
tres bases en el DNA especifica un aminoácido
determinado durante la síntesis de proteínas. El
código genético determina la relación entre las
bases del DNA y los aminoácidos de las
proteínas.
Replicación
En su artículo de 1953, Watson y Crick
sugirieron cómo podría replicarse el DNA. Su
observación partía de la propiedad de
complementariedad. Como la secuencia de bases
en una cadena complementaria a la secuencia de
bases de la cadena opuesta, cada cadena podría
actuar como molde para una nueva hélice doble.
Esto podría darse si simplemente se abriera la
“cremallera" de la molécula, dejando que cada
cadena especificara por complementariedad la
secuencia de bases en una cadena nueva (fig. 9.17).
La mutabilidad podría ser debida al mal
emparejamiento o a otros errores durante la
replicación.
Localización
El requisito de la localización es que el DNA debe
residir en e1 núcleo de los eucariotas, donde los genes
están en cromosomas, o en los cromosomas de
procariotas y virus. Tanto en procariotas como en
eucariotas la mayor parte del DNA de la célula está
en los cromosomas. Y todos los virus contienen
DNA o RNA. Por lo tanto, el DNA satisface
potencialmente todos los requisitos para ser el
material genético. El RNA puede cumplir con los
mismos requisitos en los virus de RNA y en los
viroides.
Formas alternativas del DNA
La forma del DNA que hemos descrito hasta ahora
se denomina DNA B. Es una hélice dextrógira:
gira en el sentido de las agujas del reloj cuando su
eje se recorre en dirección descendente. Las bases
están apiladas casi perpendicularmente al eje
principal con cerca de diez pares de bases por
vuelta (34 Å; véase fig. 9.13). Sin embargo, el
DNA puede adoptar otras formas. Si el contenido
en agua aumenta hasta cerca del 75%, se da la
forma A del DNA (DNA A). En esta forma las
bases están inclinadas con respecto al eje y hay
más pares de bases por vuelta. Sin embargo, éstas
y otras formas conocidas del DNA son variaciones
relativamente menores de la forma dextrógira B.
En 1979, Alexander Rich y sus colaboradores
del MIT descubrieron una hélice levógira que
llamaron DNA Z porque su esqueleto formaba una
estructura en zigzag (fig. 9.18). El DNA Z se
encontró por análisis cristalográfico de rayos X de
moléculas de DNA muy pequeñas compuestas por
secuencias repetidas G-C en una cadena y las
consecuencias complementarias C-G en la otra
(alternancia de purinas y pirimidinas). El DNA Z
se parece a un DNA B en el cual cada base ha
girado
180 grados, resultando una estructura en zigzag levógira
(fig. 9.19). (Nos referimos a la configuración original de
las bases como configuración anti; la configuración
girada se denomina configuración sin).
Originalmente se pensó que el DNA Z era una
estructura que podría no tener interés para los biólogos
porque requiere concentraciones de sal muy altas para
mantenerse estable. Sin embargo, se ha encontrado
recientemente que el DNA Z puede estabilizarse en
condiciones fisiológicas normales si se añaden grupos
metilos a las citosinas. El DNA Z puede estar implicado
en la regulación de la expresión génica en eucariotas.
Volveremos sobre este problema en el capítulo 15.
REPLICACIÓN DEL DNA
En su artículo de 1953, Watson y Crick sugirieron
que la replicación de la hélice doble podría tener lugar
por desenrollamiento del DNA, con lo que cada cadena
podría formar una nueva hélice doble al actuar como
molde para la síntesis de una nueva cadena (véase fig.
9.17). Por ejemplo, cuando una
hélice doble es desenrollada en un par de bases
adenina-timina (A-T), una de las cadenas
separadas debe llevar A y la otro debe llevar T.
Durante la replicación, la A en el DNA molde
deberá emparejarse con T en la cadena de DNA
recién replicada, dando lugar a un par de bases AT. La T en la otra cada molde deberá emparejarse
con A en la otra cadena recién implicada, dando
lugar a otro par de bases A-T. Así, un par de bases
A-T en una hélice doble dará lugar a dos pares
den bases A-T en dos hélices dobles. Este
proceso debe repetirse en cada par de bases de la
hélice doble de una molécula de DNA. Este
mecanismo
se
llama
replicación
semiconservativa porque, si bien no se conserva
la hélice doble en la replican sí lo hace cada una de
las dos cadenas. Cada molécula de DNA hija tiene
una cadena molde intacta y una cadena recién
replicada intacta. Ésta no es la única manera en que
podría darse replicación. Dos formas de
replicación alternativas son la conservativa y la
dispersiva. En la replicación conservativa, en la
cual la hélice doble original completa actúa como
molde de una nueva, una molécula hija consistiría
en el DNA paterno original y la otra molécula hija
debería ser DNA totalmente nuevo En la
replicación dispersiva, algunas partes de la hélice
doble original se conservan y otras no. Las
moléculas hijas consistirían en parte de molde y en
parte de DNA recién sintetizado. En realidad, la
categoría dispersiva es una categoría "cajón de
sastre" que lo abarca todo, incluyendo cualquier
otra posibilidad además de la replicación
conservativa
y
la
semiconservativa.
RECUADRO 9.4
DNA DE CADENA TRIPLE
En condiciones naturales, el RNA de cadena sencilla y
el DNA de cadena doble son la norma. Sin embargo, se
ha encontrado que en condiciones de laboratorio es
posible conseguir que una tercera cadena de DNA se
intercale en el surco mayor de una hélice doble de DNA
normal de una manera específica de secuencia. Esto es,
la tercera cadena de DNA no se intercalará en cualquier
lugar, sino que formará una hélice triple estable en una
secuencia específica (Fig. 1 del recuadro). Las reglas de
unión son menos precisas que lo normal en cuanto que
no todas las secuencias son reconocidas y que el
reconocimiento puede depender de las secuencias
cercanas. Teniendo esto en cuenta, una timina en la
tercera cadena reconocerá una adenina en un par de bases
adenina-timina (T-A-T) y una citosina en la tercera
cadena reconocerá una guanina en un par de bases
guanina-citosina (C-G-C).
Las cadenas triples de nucleótidos fueron creadas
por primera vez por tres científicos del National
Institutes of Health en 1957, Alexander Rich, David
Davies y Gary Felsenfeld, mientras estaban produciendo
ácidos nucleicos artificiales. En aquel momento el
DNA de cadena triple parecía ser solamente una
curiosidad de laboratorio. Actualmente parece ser de
interés porque puede tener utilidad tanto experimental
como clínica. (Rich tuvo aparentemente la misma
experiencia en su codescubrimiento del DNA Z, el cual
pareció primero una rareza pero actualmente es un gran
foco de atención; véase capítulo 15.) Recientemente, sin
embargo, dos grupos de investigación, uno en California
y otro en París, han sido capaces de formar hélices
triples en DNA natural. Actualmente se están
persiguiendo dos aplicaciones de esta tecnología. Ambas
aplicaciones surgen porque una cadena sencilla de DNA
es capaz de reconocer una secuencia relativamente larga
de DNA de cadena doble en un cromosoma. Por lo tanto
es posible localizar selectivamente un secuencia génica
específica. Una vez que se ha localizado una determinada
secuencia en un cromosoma mediante la tercera cadena,
se pueden llevar a cabo dos cosas. Primero, debido a la
formación del DNA triple, se puede impedir la expresión
de un gen en particular. Este hecho está siendo
investigado para combatir el SIDA (véase capítulo 15).
Mediante la misma técnica, el DNA triple puede ser
abortivo, un método seguro para evitar la implantación de
un feto a base de evitar la expresión de los genes afectados
por la hormona progesterona. El segundo uso del DNA
triple es cortar el DNA por un lugar específico mediante la
adición de un compuesto cortante en ambos extremos de la
tercera cadena del DNA. Una vez que se haya intercalado
la tercera cadena, el compuesto puede romper la hélice
doble original. Por ejemplo, Strobel y Dervan del
California Institute of Technology usaron un compuesto
químico que contiene hierro unido a los dos extremos 3' y
5' de la tercera cadena del DNA. La reacción de corte se
inicia entonces mediante la adición de un tercer
compuesto químico. El corte de la doble hélice original
puede ser de gran valor en la moderna tecnología del
DNA recombinante, como la que se utiliza en el proyecto
genoma humano (véase capítulo 12).
No sabemos aún si el DNA de cadena triple será o no
de gran valor en el futuro. Sin embargo, hay muchas
posibilidades de que resulte de utilidad terapéutica y en el
estudio y cartografía del genoma humano.
(Continúa en la página siguiente)
Demostración autorradiográfica de la
replicador) del DNA
El modo semiconservativo de replicación fue verificado
fotográficamente por J. Cairns en 1963 utilizando la
técnica de la autorradiografía. Esta técnica aprovecha
el hecho de que los átomos radiactivos impresionan
las películas fotográficas. Los granos de plata visibles
en la película se pueden contar para obtener una estima
de la cantidad de material radiactivo presente. Cairns
cultivó la bacteria E. coli en un medio que contenía
timina radiactiva, un componente de uno de los
nucleótidos del DNA. La radiactividad estaba en el
tritio (3H). Entonces extrajo el DNA bacteriano
cuidadosamente e hizo una autorradiografía. La figura
9.21 muestra un ejemplo. La interpretación de esta
autorradiografía revela varios puntos. Primero, el DNA
de E. coli es circular, algo que ya se sabia en aquel
momento. Segundo, el DNA se replica manteniendo la
integridad del círculo. Esto es, el círculo no parece que
se rompa durante el proceso de la replicación del DNA;
se forma una estructura theta intermediaria (parecida en
su forma a la letra griega theta, θ). Tercero, la
replicación del DNA parece
que tenga lugar en una o dos uniones Y que se desplazan a lo
largo del círculo, lo cual además corrobora el modo semiconservativo de replicación. El DNA se desenrolla en un punto y
la replicación tiene lugar en la unión Y, de manera semiconservativa, en una o ambas direcciones (véase fig. 9.17).
La manera en que las dos uniones Y se mueven a lo largo
del círculo hasta la etapa final en la que se forman dos círculos
nuevos se esquematiza en la figura 9.22. Los pasos en sí mismos no apoyan un modo de replicación unidireccional ni uno
bidireccional. Esto es, se formaría una estructura theta tanto si
en la replicación están activas una o las dos uniones Y. Sin embargo, con la autorradiografía es posible determinar si el crecimiento nuevo ocurre en sólo una o en ambas direcciones.
En algunos casos, la radiactividad no se aplicó a la célula
hasta que la replicación del DNA ya había empezado. En estos
casos, la marca radiactiva apareció después de que la estruc-
tura theta ya había empezado a formarse. La figura 9.23
ilustra los resultados hipotéticos para la replicación tanto
unidireccional como bidireccional. Mediante el recuento
de los granos de plata en las autorradiografías, Cairns
encontró que el crecimiento era bidireccional. Este
hallazgo fue verificado posteriormente mediante análisis
tanto genéticos como autora gráficos.
En eucariotas las moléculas de DNA (cromosomas) más largas que en procariotas y no son circulares;
hay múltiples lugares de iniciación de la replicación.
Así, cada cromosoma eucariótico está compuesto por
muchas unidades replicación, o replicones (segmentos
de DNA con un solo origen de replicación). En
comparación, el cromosoma de está compuesto por un
solo replicón. En los eucariota unidades de replicación
forman "burbujas" (u "ojos") en el DNA durante la
replicación (fig. 9.24).
ción de la secuencia de nucleótídos de muchas de estas regiones clave en el DNA y en el RNA.
En E. coli sólo hay tres enzimas conocidos que puedan polimenzar nucleótidos en una cadena de DNA en crecimiento.
Estos enzimas son las DNA polimerasas I, II y III. La DNA
polimerasa I, descubierta por Arthur Kornberg, que posteriormente fue galardonado con el premio Nobel por este trabajo,
se utiliza principalmente en el relleno de pequeños segmentos
de DNA durante los procesos de reparación y de replicación.
Por el momento, el papel exacto de la DNA polimeras II
no está completamente claro, aunque se sabe que puede
servir como una polimerasa de reparación alternativa si
la DNA polimerasa I ha resultado dañada por una
mutación. La DNA polimerasa III es la principal
polimerasa activa duna replicación normal del DNA.
En el modelo más simple de la replicación del DNA
nucleótidos nuevos se añadirían, de acuerdo con las
reglas de complementariedad, simultáneamente a
ambas cadenas del
lelas nuevas con las dos cadenas sencillas como molde, una de
las cadenas nuevas debería sintetizarse en dirección 5' → 3' y
la otra en dirección 3'→ 5'.
Sin embargo, todas las polimerasas conocidas añaden nucleótidos solamente en dirección 5' → 3'. Esto es, la polimerasa catalizará un enlace entre el primer grupo 5' -PO4 de un
nuevo nucleótido y el carbono 3'-OH del último nucleótido de
la cadena recién sintetizada (fig. 9.25). Las polimerasas no
pueden crear el mismo enlace entre el fosfato 5' de un nucleótido que ya esté en el DNA y el extremo 3' de un nucleótido
nuevo. Por lo tanto, el modelo simple necesita alguna revisión,
a menos que exista un enzima todavía no descubierto que pueda sintetizar DNA añadiendo nucleótidos al extremo 5 '-PO4.
Como la mayoría de los biólogos moleculares creen que no se
podrá encontrar una polimerasa con esta especificidad, la conclusión es que necesitamos un modelo mejor de la replicación
del DNA.
Replicación continua y discontinua del DNA
DNA recién sintetizado en la horquilla de replicación conforme el DNA se va abriendo. Pero hay un problema debido a la
naturaleza antiparalela del DNA: las dos cadenas de un DNA
de hélice doble discurren en direcciones opuestas. Recorriendo la hélice doble, por ejemplo, una cadena será la 5' —> 3',
mientras que la otra será la cadena 3' —> 5'. Estas direcciones
se refieren a la numeración a través de los azúcares cuando se
sigue una dirección específica. En la figura 9.25, si se va desde
el pie de la figura hacia arriba, la cadena de la izquierda es
3'→ 5' y la de la derecha es 5' → 3'. Como la replicación
del DNA implica la formación de dos hélices dobles antipara-
La evidencia autorradiográfica nos lleva a creer que la replicación se da simultáneamente en ambas cadenas. La replicación
continua es posible, naturalmente, en la cadena molde
3'→ 5', que empieza con el cebador 3'-OH necesario. (El
cebador es un DNA de cadena doble, o bien como veremos un
híbrido DNA-RNA, que continúa como DNA de cadena sencilla molde. La cadena que se está sintetizando tiene un 3'-OH
disponible; véase fig. 9.25). En la cadena complementaria tiene lugar una forma de replicación discontinua, mediante la
cual se van replicando pequeños segmentos desde la unión Y
hacia atrás (fig. 9.26). Estos segmentos cortos, llamados fragmentos de Okazaki en honor de R. Okazaki que fue quien los
descubrió, tienen por término medio 1500 nucleótidos en
procariotas y 150 en eucariotas. La cadena sintetizada continuamente se denomina cadena adelantada y la cadena sintetizada discontinuamente se llama cadena retrasada.
Una vez que ha comenzado, la replicación continua del
DNA puede proseguir indefinidamente. En el molde de la cadena adelantada la DNA polimerasa III tiene lo que se llama
una gran procesividad: en cuanto se une, no abandona el molde hasta que se ha replicado la cadena completa. La replicación discontinua, sin embargo, requiere la repetición de cuatro
pasos: síntesis del cebador, elongación, eliminación del cebador con relleno del hueco y ligación.
Síntesis del cebador y elongación
Con el fin de sintetizar cada fragmento de Okazaki, se debe generar de novo (del latín, de nuevo) un cebador. Ninguna de las
DNA polimerasas puede hacerlo. El cebador es sintetizado por
uno de los dos enzimas siguientes: la RNA polimerasa, el enzima de la transcripción (véase capítulo 10) o, más frecuentemente, la primasa, una RNA polimerasa cifrada por el gen
dnaG. El cebador tiene de dos a sesenta nucleótidos, según la
especie, y se encuentra al inicio del fragmento de Okazaki (fig.
9.27). El resultado es un cebador corto de RNA que proporciona el grupo 3'-OH libre que la DNA polimerasa III necesita
para sintetizar el fragmento de Okazaki, La DNA polimerasa
III continúa hasta que alcanza el RNA cebador del fragmento
de Okazaki sintetizado previamente. En este punto se para y
abandona el DNA (fig. 9.27).
Las tres polimerasas procarióticas no sólo pueden añadir
nucleótidos nuevos a una cadena en crecimiento en el sentido
5' → 3' sino que también pueden quitar nucleótidos en el sentido opuesto 3' —> 5'. Nos referimos a esta propiedad como
actividad exonucleásica 3'—> 5'. Los enzimas que pueden degradar los ácidos nucleicos se clasifican como exonudeasas si
eliminan nucleótidos a partir de un extremo de una cadena de
nucleótidos o como endonucleasas si pueden romper el esqueleto azúcar-fosfato en medio de una cadena de nucleótidos. A
primera vista, la actividad exonucleásica parece una propiedad
extremadamente curiosa para tenerla una polimerasa I
menos que tengamos en cuenta su capacidad de corr
complementariedad de las bases). Si la complementa
es la adecuada, es decir, si se ha insertado un núcleo
rrecto, la polimerasa puede quitar el nucleótido incor
ner el adecuado y continuar su camino. Esto se con
actividad de corrección de pruebas de la DNA pe
Además, los cebadores de RNA de los fragmentos d
pueden eliminarse merced a la actividad exonucleás:
Eliminación del cebador y rellenado del huet
La DNA polimerasa I es una polimerasa cuando añai
tidos de uno en uno y una exonucleasa cuando quití
dos de uno en uno. Para completar un fragmento dí
la DNA polimerasa I usa sus dos capacidades. (Lo;
de la DNA polimerasa I no pueden conectar correcti
fragmentos de Okazaki.) La DNA polimerasa I completa el I
fragmento de Okazaki mediante la eliminación del RNA cebador anterior y su substitución con nucleótidos de DNA (fig.
9.28). Cuando la DNA polimerasa I ha completado sus actividades nucleásica y polimerásica, los dos fragmentos de Okazaki previos ya están casi completos. Lo único que queda por
hacer es un solo enlace fosfodiéster.
Ligación
La DNA polimerasa no puede hacer el enlace final para unir
los fragmentos de Okazaki al DNA sintetizado previamente.
En la figura 9.29 se muestra la configuración que debe rematarse. Un enzima, la DNA ligasa, completa la tarea haciendo
el enlace fosfodiéster final en una reacción que consume energía.
Una cuestión de interés evolutivo es por qué se emplea
RNA para el cebado de la síntesis del DNA. ¿Por qué no se
emplea DNA directamente y se evita la actividad exonucleásica y de resíntesis que se muestran en la figura 9.28? Una posible respuesta es que como el cebado es inherentemente más
proclive al error que la síntesis normal del DNA, es mejor para
la célula tener que eliminar los nucleótidos cebadores y reemplazarlos por DNA sintetizado de una manera que tiende menos al error antes de completar la síntesis del DNA. Si los
nucleótidos cebadores son RNA, entonces la DNA polimerasa
I puede reconocerlos y eliminarlos en el paso final de la sínte-
sis del fragmento de Okazaki, momento en que los reemplaza
con nucleótidos de DNA insertados con una menor probabilidad de error (fig. 9.28).
Otra cuestión de interés evolutivo es por qué la síntesis del
DNA no puede tener lugar en dirección 3' → 5'. Quizás la
respuesta tenga que ver con la corrección de pruebas y la eliminación de nucleótidos incorrectos. Cuando un nucleótido
incorrecto es encontrado y eliminado, el nucleótido que vaya
a colocarse a continuación, en sentido 5' → 3', tendrá un
extremo trifosfato disponible para proporcionar la energía
para su propia incorporación (fig. 9.25). Consideremos lo que
po-
guiente nucleótido que vaya a incorporarse. La polimerización
continuada requeriría por lo tanto de pasos enzimáticos adicionales a fin de proporcionar la energía para que el proceso continúe. Esto podría hacer el proceso considerablemente más
lento. Tal como es, el proceso trabaja a una velocidad de
aproximadamente cuatrocientos nucleótidos incorporados por
segundo con una tasa de error de aproximadamente un emparejamiento incorrecto por cada cien mil bases, mejorado por la
corrección de pruebas hasta una tasa de sólo un error cada diez
millones. (Otros sistemas de reparación pueden mejorar esta
tasa de error otro millar de veces, hasta cerca de un error cada
1010 veces que es replicada una base; véase capítulo 16.)
El origen de replicación del DNA
Cada replicón (p. ej., el cromosoma de E. coli o un segmento
de un cromosoma eucariótico) debe tener una región en la que
se inicie la replicación del DNA. En E. coli esta región es conocida como el locus genético oriC. Para que empiece la replicación deben darse varios pasos. Primero, el lugar específico
de origen debe ser reconocido por las proteínas apropiadas.
Entonces el sitio debe ser abierto y estabilizado. Finalmente,
debe iniciarse una horquilla de replicación en ambos sentidos,
que implica la replicación continua y discontinua del DNA. A
pesar de que se conocen muchas de las proteínas implicadas,
no se conocen todos los pasos a nivel enzimático; de aquí que
nuestra comprensión sea un poco incompleta. Sigue una descripción de la que se conocen la mayoría de los pasos.
OriC, el origen de replicación de E. coli, tiene una longitud de cerca de 245 pares de bases y es reconocido por proteínas llamadas proteínas iniciadoras que abren la hélice
doble. Las proteínas iniciadoras participan después en la
unión de primosomas, un complejo de dos proteínas: una
primasa, que crea los cebadores de RNA, y una DNA
helicasa, que desenrolla el DNA en la unión Y (fig. 9.30). A
medida que los primosomas se desplazan a lo largo del
DNA, crean cebadores de RNA que la DNA polimerasa III
utiliza para iniciar los fragmentos de Okazaki. En cierto
momento, empieza la síntesis de la cadena adelantada y
entonces la actividad de la unión Y procede como se ha
indicado anteriormente (figs. 9.27, 9.28 y 9.29).
En algunos fagos y plásmidos, la iniciación de la replicación no se lleva a cabo con un cebador de RNA sino con una
proteína. Esta proteína proporciona la configuración cebadora
con el grupo OH de un aminoácido (véase capítulo 11). No se
ha establecido bien el principio general de este cebado. Otra
interacción proteica interesante en el origen de replicación implica lo contrario a la iniciación de la síntesis de DNA, es decir, la inhibición de la iniciación de la síntesis del DNA. Esto
se consigue mediante una proteína descubierta recientemente
llamada desconectora. Esto es, esta proteína se une al DNA en
oriC y aparentemente evita que comience la replicación del
DNA. Esto lo consigue mediante su actividad de unión que
impide que las proteínas iniciadoras abran el DNA. Por lo tan-
to esta proteína puede ser un componente muy importante en el
control del ciclo celular al detenerlo desde el comienzo.
Presumiblemente, cuando llega el momento adecuado para
que empiece el ciclo celular, esta proteína es eliminada.
Procesos en la unión Y
Tenemos ahora una imagen de la replicación del DNA en la
que un primosoma se mueve a lo largo del molde de la cadena
retrasada, abriendo el DNA (actividad helicasa) y creando cebadores de RNA (actividad primasa). Una DNA polimerasa III
se desplaza a lo largo del molde de la cadena adelantada generando la cadena adelantada mediante replicación continua del
DNA mientras que una segunda DNA polimerasa III se desplaza hacia atrás desde la unión Y, creando fragmentos de
Okazaki. Las proteínas de unión a cadena sencilla (proteínas
ssb) mantienen estabilizada la cadena sencilla de DNA (abierta) durante este proceso y la DNA polimerasa I y la ligasa van
conectando los fragmentos de Okazaki (fig. 9.31).
Esta imagen simple se complica ligeramente por el hecho
de que, al parecer, una sola DNA polimerasa hace la cadena retrasada completa en vez de desprenderse del DNA al terminar
un fragmento de Okazaki y ser reemplazada por otra nueva en
el cebador más reciente cerca de la unión Y. Además hay evidencias de que las síntesis de las cadenas retrasada y adelantada están coordinadas. Ha surgido el modelo del replisoma, en
el que las dos copias de la DNA polimerasa III están unidas entre sí y trabajan concertadamente con el primosoma en la
unión Y (fig. 9.32). De acuerdo con este modelo, un solo replisoma, que consta de dos copias del holoenzima de la DNA
polimerasa III (cada una constituida de hecho por siete subunidades), una helicasa y una primasa, se desplaza a lo largo del
DNA. El molde de la cadena adelantada alimenta inmediatamente una polimerasa, mientras que el molde de la cadena retrasada no es usado por la polimerasa hasta que se ha colocado
un RNA cebador en la cadena, lo que significa que se ha abierto una cadena sencilla larga (mil quinientas bases) (fig. 9.32a).
Conforme el replisoma se va desplazando, se forma otro
segmento de cadena simple a partir del molde de la cadena retrasada. Más o menos en el momento en que se completa el
fragmento de Okazaki, se ha creado un nuevo RNA cebador
(fig. 932b). El fragmento de Okazaki es liberado (fig. 9.32c)
y se inicia un nuevo fragmento de Okazaki, empezando con el
último cebador (fig. 9.32d), volviendo el replisoma a la misma
configuración que en la figura 9.32o, pero un fragmento de
Okazaki más adelante.
Superenrollamiento
La simplicidad y la elegancia de la molécula de DNA esconde
un problema inevitable de enrollamiento. Como la molécula
de DNA está constituida por dos cadenas que se enroscan una
en la otra, ciertas operaciones, como la replicación del DNA y
su finalización, tropiezan con dificultades topológicas. Hasta
este momento, hemos visto el cromosoma circular de E. coli
en su estado "relajado" (por ej., figs. 9.21 y 9.22). Sin embargo, en la célula hay enzimas que provocan que el DNA quede
enrollado más de la cuenta (superenrollado positivamente) o
menos enrollado que lo normal (superenrollado negativamente).
El superenrollamiento positivo proviene de demasiadas
vueltas de DNA en una longitud dada o de que la molécula se
enrosque en sí misma (fig, 9.33).
El superenrollamiento positivo aparece al hacer que la hélice doble circular se enrolle sobre sí misma en la misma dirección en que gira la hélice (hacia la derecha), mientras que el
superenrollamiento negativo se obtiene haciendo que la doble
hélice se enrolle alrededor de sí misma en dirección opuesta al
giro de la hélice (hacia la izquierda). El primer estado aumenta el
número de vueltas de una hélice alrededor de la otra (el
número de enlace, L), mientras que el último lo disminuye.
Las tres formas del DNA de la figura 9.33 tienen todas la
misma
FIGURA 9.34 - La topoisomerasa I puede reducir el enrollamiento del DNA mediante el paso de
una cadena de la hélice doble a través de la otra.
secuencia aunque difieren en su número de enlace. Nos
referimos a ellas como a isómeros topológicos
(topoisómeros). Los enzimas que provocan o alivian
estos estados se denominan topoisomerasas.
Las
topoisomerasas
afectan
el
superenrollamiento mediante uno de los dos
procedimientos posibles. Las topoisomerasas del tipo I
rompen una cadena de la hélice doble y, mientras aguantan los extremos rotos, pasan la otra cadena a través de
la rotura. A continuación la rotura es sellada (fig.
9.34). Las
topoisomerasas del tipo II (p.ej., la DNA girasa en E. coli) hacen algo parecido pero, en vez de romper una cadena de la hélice doble, rompen las dos y pasan otra hélice doble a través de
la rotura temporal.
Conforme la replicación del DNA avanza, se produce superenrollamiento positivo por delante de la unión Y. Este
superenrrollamiento es eliminado por la acción de topoisomerasas que o bien crean superenrollamiento negativo por delante de la unión Y en preparación para la replicación o bien
relajan el supereiirollamienlo positivo después de que se haya
generado. Los componentes principales de la replicación del
DNA de E. coli se resumen en la tabla 9.4.
Terminación de la replicación
La terminación de la replicación de un cromosoma circular no
presenta problemas topológicos importantes. La replicación
en estructura theta (véase fig. 9.22) termina cuando las dos
uniones Y han recorrido totalmente la molécula. La cadena
adelantada en un molde cierra la cadena retrasada que empezó en el otro sentido y lo mismo ocurre con el otro molde. El
proceso termina cuando faltan unas veinticinco vueltas en un
punto no específico del cromosoma (no hay un locus de "terminación"). Entonces una topoisomerasa libera los dos círculos y la DNA polimerasa I y la ligasa los cierran (fig. 9.35).
Se han explorado varios mecanismos diferentes para la terminación de los cromosomas lineales de algunos virus y de todos los genomas eucarióticos. Las moléculas lineales tienen el
problema de completar el último fragmento de Okazaki. Un
RNA cebador justo en el extremo del molde 3'→ 5' no puede
ser reemplazado por la DNA polimerasa I (fig. 9.36), suponiendo incluso que se pueda colocar un último cebador justo
en el extremo de la molécula. En los eucariotas un enzima, la
telomerasa, añade repeticiones de una corta secuencia de nucleótidos en cada extremo del cromosoma (telómero; véase capítulo 14).
ESTRUCTURAS DE REPLICACIÓN
El modelo de replicación del DNA que hemos presentado aquí
proviene principalmente de evidencias recogidas de E. coli,
cuyo genoma se replica mediante la estructura intermedia en
theta (fig. 9.22). Sin embargo, se dan otros dos modos de replicación en los cromosomas circulares: el círculo rodante y el
lazo D.
Modelo del círculo rodante
En el modo de replicación del círculo rodante se hace una
mella (una rotura en uno de los enlaces fosfodiéster) en una de
las cadenas del DNA circular, lo que da lugar a una replicación
de un círculo y una cola (fig. 9.37). Esta forma de replicación
ocurre en el cromosoma Hfr de E. coli, o plásmido F, durante
la conjugación (véase capítulo 7). La célula F+ o Hfr retiene la
molécula hija circular mientras va pasando la cola lineal a la
célula F-. Este método también lo usan varios fagos que llenan
sus cabezas (cubiertas proteicas) con DNA lineal replicado a
partir de una molécula parental circular.
En el modelo de replicación del círculo rodante, la mella
hecha en una cadena crea un extremo 3 '-OH libre y un extremo 5'-PO4 libre (fig. 9.37). La síntesis de una cadena circular
nueva ocurre por adición de nucleótidos al extremo 3' empleando la cadena complementaria intacta como molde. No se
Modelo del lazo D
Los cloroplastos y las mitocondrias tienen sus propias
moléculas de DNA circular (véase capítulo 17) que parecen
replicarse por un mecanismo ligeramente diferente a los
descritos. El origen de replicación está en un punto distinto
en cada una de las dos cadenas molde parentales (fig.
9.38). La replicación empieza en una cadena, desplazando
a la otra mientras se va formando un lazo de
desplazamiento o estructura lazo D. La replicación
continúa hasta que el proceso sobrepasa el origen de
replicación de la otra cadena. Entonces se inicia la replicación en la segunda cadena, en sentido opuesto. El resultado
es que se forman dos círculos. Algunas especies tienen
cloroplastos y mitocondrias con DNA circulares en los que
se forman múltiples lazos D.
LA REPLICACIÓN DEL DNA EUCARIÓTICO
necesita cebador porque la rotura original produce una
configuración de cebador (3'-OH). Conforme se van
añadiendo nucleótidos a un extremo de la cadena rota
de manera continua, el otro extremo se va desplazando
en forma de cola 5'-PO4. A medida que el molde
circular se replica, la cola 5'-PO4 se va replicando de
manera discontinua y la hélice doble resultante puede
ser separada del círculo de hélice doble mediante una
nucleasa. La DNA ligasa cierra la cadena circular
replicada y puede unir los extremos de la cola
replicada en un círculo en célula F-, o se puede
empaquetar la molécula lineal en una cabeza de fago,
dependiendo de cual sea el tipo de DNA circular
replicado.
Tal como hemos visto anteriormente, los cromosomas
lineales eucarióticos tienen usualmente múltiples orígenes de
replicación que dan lugar a figuras llamadas "burbujas" u
"ojos". Los orígenes de replicación múltiples permiten a los
eucariotas replicar sus grandes cantidades de DNA en un
tiempo relativamente corto, incluso aunque la replicación del
DNA eucariótico sea considerablemente más lenta por la
presencia de las proteínas histonas asociadas al DNA para
formar la cromatina (véase capítulo 14). Por ejemplo, la
horquilla de replicación de E. coli se mueve a cerca de
veinticinco mil pares de bases por minuto, mientras que la
unión Y eucariótica se mueve a sólo cerca de dos mil pares de
bases por minuto. El número de replicones en los eucariotas
varía desde cerca de quinientos en la levadura hasta unos
sesenta mil en una célula diploide de mamífero.
como de la retrasada. La DNA polimerasa β es la polimerasa
de reparación principal (como la polimerasa I en procariotas).
La DNA polimerasa γ parece que está implicada principalmente en la replicación del DNA mitocondrial.
RESUMEN
Un material genético debe ser capaz de controlar el fenotipo de
una célula u organismo (esto es, dirigir la síntesis de proteínas), debe ser capaz de replicarse y debe estar localizado en los
cromosomas. Avery y sus colegas demostraron que el DNA
era el material genético cuando determinaron que el agente
transformante era el DNA. Griffith había descubierto originalmente el fenómeno de la transformación de la bacteria Streptococcus en el ratón. Hersey y Chase demostraron que era el
DNA del bacteriófago T2 lo que entraba en la célula bacteriana y Fraenkel-Conrat que en los virus sin DNA (virus de
RNA), tales como el virus del mosaico del tabaco, el RNA actuaba como material genético. Así, hacia 1953 la evidencia
apoyaba fuertemente a los ácidos nucleicos (DNA o, en su ausencia, RNA) como el material genético.
Chargaff observó en el DNA una relación 1:1 de adenina
(A) con timina (T) y citosina (C) con guanina (G). Wilkins,
Franklin y sus colegas mostraron, mediante cristalografía de
rayos X, que el DNA era una hélice de dimensiones específicas. Siguiendo estas líneas de evidencia, Walson y Crick propusieron en 1953 el modelo de estructura del DNA de la hélice
dublé. En su modelo el DNA está constituido por dos cadenas,
dispuestas en sentidos opuestos con esqueletos azúcar-fosfato
y las bases dispuestas hacia adentro. Las bases de las dos cadenas forman puentes de hidrógeno entre ellas con la única limitación de que A sólo puede emparejarse con T y G con C.
Esto explica las relaciones cuantitativas que encontró Chargaff
entre las bases. Las temperaturas de fusión del DNA también
apoyan esta hipótesis estructural porque los DNA con mayor
contenido en G-C tienen una temperatura de fusión, o desnaturalización, más elevada; los pares G-C tienen tres puentes de
hidrógeno mientras que los pares A-T sólo tienen dos. El modelo de DNA presentado es el de la forma B. El DNA puede
existir en otras formas, incluso en la forma Z, una hélice doble
levógira que puede ser importante en el control de la expresión
génica en los eucariotas.
El DNA se replica mediante el desenrollamiento de la hélice doble, actuando cada cadena como molde para una hélice
doble nueva. Esto funciona debido a la complementariedad:
sólo los pares de bases A-T, T-A, G-C, C-G forman puentes de
hidrógeno estables dadas las limitaciones estructurales del
modelo. Este modelo de replicación se dice que es semiconservativo. Meselson y Stahl demostraron que era correcto en un
experimento con nitrógeno pesado. Autorradiografías de DNA
en replicación mostraron que la replicación procede bidireccionalmente a partir de un punto de origen.
Los cromosomas procarióticos son circulares con un único
punto de iniciación de la replicación. El DNA eucariótico es
lineal con múltiples puntos de iniciación de la replicación.
Las DNA polimerasas son enzimas que añaden nucleótidos sólo en dirección 5' → 3'. La replicación en la cadena
molde 5' → 3' procede en pequeños segmentos que avanzan
hacia atrás a partir de la unión Y. Presumiblemente, la restricción 5' → 3' tenga que ver con la capacidad de de las
DNA polimerasas para corregir errores en la complementariedad de las bases. La polimerasa III es el enzima activo en
replicación y la polimerasa I está implicada en la reparación
del DNA. Otros muchos enzimas están implicados en la formación de fragmentos de Okazaki, en el desenrollamiento
del DNA y en la relajación del superenrollamiento. Se conoce muy poco sobre los sistemas eucarióticos.