OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE TEJIDO CEREBRAL PARA INYECCIÓN
INTRANEURONAL DE TRAZADORES: EXPERIENCIA DEL BT-CIEN
Rodal I.1, Gómez E.1, Benavides-Piccione R.2,3, Martín LJ.1, De Felipe J.2,3,4, Rábano A.1
1 Departamento
2
de Neuropatología y Banco de Tejidos de la Fundación CIEN, Madrid
Laboratorio Cajal de Circuitos Corticales (CTB), Madrid
3 Instituto
Cajal (CSIC), Madrid
4 Centro
de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas
(CIBERNED)
Los estudios de inyección intraneuronal de trazadores permiten analizar con gran
detalle la morfología de las neuronas, incluyendo las espinas dendríticas, que
representan un componente crucial en la estructura y función de las células
piramidales. De hecho, las espinas dendríticas se consideran las estructuras básicas
en los procesos de plasticidad, aprendizaje y memoria, y constituyen por ello un tema
del máximo interés en estos momentos. De esta forma, este tipo de estudios aportan
datos fundamentales a proyectos como el Human Brain Project. En tejido cerebral post
mortem estas técnicas permiten estudiar las alteraciones morfológicas asociadas a
diferentes lesiones tisulares, como las placas neuríticas y los ovillos neurofibrilares.
Para ello, las muestras deben reunir unas condiciones de conservación excepcionales.
El Banco de Tejidos CIEN viene colaborando con el Laboratorio Cajal de Circuitos
Corticales (Centro de Tecnología Biomédica) en la optimización de estos
procedimientos.
Se requiere un intervalo post mortem (IPM) no superior a 2-3 horas, lo que exige una
disponibilidad rápida del donante fallecido, y la extracción inmediata del cerebro. Las
muestras se introducen inmediatamente en paraformaldehido al 4% en tampón fosfato
(0.1M, pH 7.4), donde se mantienen durante 24h a 4ºC. Se obtienen secciones de
vibratomo y se tiñen con Nissl para identificar las áreas corticales y los límites
laminares. Las neuronas individuales se inyectan intracelularmente con Lucifer Yellow.
Posteriormente, se hacen dobles inmunotinciones con anti-Lucifer Yellow y otros
anticuerpos como anti-PHF-tauAT8 o anti-PHF-tauPHF-1 (p.ej., para visualizar la patología
neurofibrilar). Finalmente, se reconstruye el árbol dendrítico, así como la densidad,
longitud y volumen de las espinas dendríticas, escaneando estos parámetros mediante
microscopía confocal y reconstruyendo completamente las imágenes en 3D.
La ubicación del BT-CIEN en el Centro Azheimer y la tramitación rápida de
donaciones externas permite conseguir IPM especialmente cortos, y obtener muestras
adecuadas para estas técnicas.
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