universidad complutense de madrid facultad de ciencias químicas

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
PREPARACIÓN DE BIOSENSORES AMPEROMÉTRICOS
ALEJANDRO SAMANIEGO MIRACLE
MADRID, JUNIO 2007
ÍNDICE
2
ÍNDICE
ÍNDICE
Objetivos
5
1. Introducción
7
1.1. Estructura de los nanotubos de carbono
26
1.2. Síntesis de los nanotubos de carbono
26
1.3. Purificación de los nanotubos de carbono
26
1.4. Dopado de nanotubos
26
1.5. Mecanismos de crecimiento
26
1.6. Propiedades y aplicaciones de los nanotubos
26
2. Materiales y métodos
25
2.1. Aparatos y electrodos
26
2
2.2. Reactivos y disoluciones
26
3
2.3. Procedimientos
27
2.3.1. Preparación de oro coloidal (Aucoll)
27
2.3.2. Modificación de los electrodos con SAMs
27
2.3.3. Deposición del oro coloidal en las SAMs de cisteamina
28
2.3.4. Electrodeposición de nanopartículas de oro sobre GCEs
28
2.3.5. Coinmovilización de la enzima y el mediador
29
3. Resultados y discusión
30
3.1. Electrodos de oro modificados
33
3.2. Electrodos de carbono vitrificado modificados
40
Conclusiones
43
Bibliografía
45
3
OBJETIVOS
OBJETIVOS
OBJETIVOS
En este trabajo se describe la fabricación y las atractivas características de los
electrodos compósitos de nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs)-Teflon,
basado en la dispersión de MWCNTs en una matriz aislante de Teflon. El material
resultante
de
MWCNTs-Teflon
posee
nuevas
posibilidades
para
diseños
electroquímicos ya que combinan las ventajas de los MWCNTs y de los electrodos
compósitos. Las propiedades electrocatalíticas de los MWCNTs no se ven afectadas por
su asociación con el aislante Teflon y permite una rápida transferencia electrónica,
minimiza el ensuciamiento de la superficie y presenta una superficie renovable. Estas
ventajas de los electrodos compósitos de MWCNTs se comparan con los electrodos
compósitos de grafito-Teflon. Se observa que el electrodo compósito de MWCNTsTeflon muestra una gran mejora en la electrooxidación del NADH con respecto al
electrodo compósito de grafito-Teflon. Se estudia la influencia del potencial aplicado en
la respuesta del NADH. Las medidas amperométricas para el NADH a un potencial de
+0.3 V muestra una gran diferencia en sensibilidad con respecto al electrodo de grafitoTeflon. La incorporación de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) en la matriz del
electrodo compósito permite la construcción de un biosensor de etanol sin mediador. El
biosensor de ADH-MWCNTs-Teflon permite obtener un límite de detección para el
etanol de 32 µM. La repetibilidad de las medidas amperométricas del etanol, la
reproducibilidad con diferentes biosensores, la vida media y el tiempo de
almacenamiento presentan, en general, ventajas con respecto a otros biosensores de
ADH-CNTs.
5
OBJETIVOS
1. INTRODUCCIÓN
6
INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
Hasta antes de 1985 se pensaba que solo había dos formas ordenadas de carbono
elemental: el grafito y el diamante (Figura 1 a y b).
Figura 1: (a) Estructura del grafito cristalino, donde se observa las capas de grafito
2D hexagonales. (b) Estructura cristalina del diamante, donde se observa l estructura
densamente empaquetada, la cual provee de la dureza característica. (c) Estructura
cristalina del fullereno C60, donde se observan 12 anillos pentagonales y 20
hexagonales. (d) Estructura cristalina del nanotubo de carbono, donde se observa las
semiestructuras de fullerenos en sus extremos.
7
INTRODUCCIÓN
Pero en 1985 los químicos Harold Kroto, de la Universidad de Sussex (Reino
Unido), James Heath, sean O´Brien, Robert Curl y Richard Smalley de la Univerisdad
de Rices (Estados Unidos), demostraron la existencia de una nueva familia de formas
elementales de carbono, denominados fullerenos. Los fullerenos son moléculas
“huecas” de carbono, ver Figura 1 c, que poseen anillos pentagonales y hexagonales.
En 1996, Smalley, Kroto y Curl ganaron el premio Nóbel de química por este
descubrimiento.
En 1991, el físico japonés Sumio Iijima [Iijima, 1991] del laboratorio de
investigaciones fundamentales NEC en Tsukuba, Japón, observó, usando un
microscopio electrónico, la existencia de moléculas tubulares en el hollín formado a
partir de una descarga de arco usando grafito. Investigaciones posteriores determinaron
que estos tubos eran macromoléculas formadas por átomos de carbono puro de
alrededor de un micrómetro de largo y de entre 1 y 100 nanómetros de diámetro, que
poseían semiestructuras de fullereno en sus extremos (Figura 1 c), por lo cual, fueron
bautizadas apropiadamente como nanotubos de carbono de pared múltiple, “multiwall
nanotubes” (MWNT).
En 1992, los físicos Noriaki Kamada, Shin-ichi Sawada y Atsushi Oshiyama
observaron nanotubos de carbono de pared única, “single-wall nanotubes” (SWNT),
nanoestructuras que poseen propiedades electrónicas y mecánicas muy especiales
[Hamada, 1992]. Un SWNT ideal se puede describir como una capa bidimensional de
grafito “enrollada” formando un cilindro de décimas de micrones de longitud y radio del
orden de los nanómetros. Dependiendo de su helicidad y de su diámetro, el nanotubo
puede comportarse como conductor o semiconductor. Esta particular dependencia de
8
INTRODUCCIÓN
sus propiedades electrónicas con la geometría de los nanotubos se ha demostrado
experimentalmente, lo cual ha generado gran interés por sus posibles usos en
nanoelectrónica y dispositivos nano-mecánicos como transistores nanométricos, puntas
de prueba de Microscopios Electrónicos, etc.
En 1993, los físicos Sumio Iijima e Ichihashi demostraron la existencia de
nanotubos de pared única SWNT [Tu, 2005].
El nombre de “nanotubo” tiene su origen del hecho que estos objetos poseen
estructura tubular con diámetros del orden de un nanómetro (nm), o sea, un millonésimo
de milímetro.
1.1. ESTRUCTURA DE LOS NANOTUBOS DE CARBONO
La geometría y la mayoría de las propiedades de los nanotubos de carbono
dependen de su diámetro y ángulo chiral, también llamado helicidad. Estos dos
parámetros, diámetro y helicidad, resultan completamente definidos por los dos índices
de Hamada (n, m) (Figura 2) [Hamada, 1992]. Además, dependiendo de la forma de
envolverse se pueden presentar los tres tipos de nanotubos [Huber, 2002], como se
muestra en la Figura 3.
Hay varios criterios de clasificación de los nanotubos de carbono:
•
De acuerdo al número de capas se clasifican en:
Nanotubos de capa única (SWNT).- Son los que se pueden describir como una capa
bidimensional de grafito “enrollada” formando un cilindro de décimas de micrones
9
INTRODUCCIÓN
de longitud y radio del orden de los nanómetros, los cuales además poseen en sus
extremos semiestructuras de fullerenos (Figura 4).
Figura 2: se muestra el SWNT, que puede ser construído enrollando una hoja de
grafito de tal forma que coincidan dos sitios cristalográficamente equivalentes de la
red hexagonal.
Figura 3: Tipos de nanotubos de carbono [Huber, 2002].
10
INTRODUCCIÓN
•
De acuerdo al número de capas se clasifican en:
Nanotubos de capa única (SWNT).- Son los que se pueden describir como una capa
bidimensional de grafito “enrollada” formando un cilindro de décimas de micrones
de longitud y radio del orden de los nanómetros, los cuales además poseen en sus
extremos semiestructuras de fullerenos (Figura 4).
Nanotubos de capa múltiple (MWNT).- Son aquéllas formadas por capas
concéntricas de forma cilíndrica, las cuales están separadas aproximadamente una
distancia similar a la distancia interplanar del grafito (Figura 5) [Iijima, 1991].
•
De acuerdo a una clasificación genérica en:
Nanotubos chiral.- No tienen simetría de reflexión y no son isomórficos.
Nanotubos no-chiral.- (zigzag y armchair) Poseen simetría de reflexión y son
isomórficos.
•
De acuerdo a los índices de Hamada (m, n) [Hamada, 1992]
Nanotubos armchair.- Los nanotubos tendrán esta denominación si (n = m) y si
posee una helicidad de φ = 0°.
Nanotubos zigzag.- Se llamará así cuando (m = 0) y poseen una helicidad de φ =
30°.
11
INTRODUCCIÓN
Nanotubos chiral.- Los nanotubos son tipo chiral si (n > m > 0) y si además poseen
una helicidad de 0° < φ < 30°.
Figura 4: Vista de un MWNT donde se aprecian las capas concéntricas la cual fue
descubierta y sintetizada en 1991 [Capaz, 2003].
12
INTRODUCCIÓN
Figura 5: Vista de un MWNT donde se aprecian la capa única que va a dar forma al
nanotubo, fue sintetizada en 1993 [Capaz, 2003].
Las técnicas más usadas para caracterizar (obtener información de su grado de
pureza, ordenamiento, su distribución de diámetros, etc) a los nanotubos de carbono
son:
Espectroscopía Raman.- Nombre en homenaje al físico Chandrasekhara raman, que
descubrió, en 1928, el efecto en que se basa esta técnica. En ella se hace incidir luz
sobre una muestra y se observa que la luz es dispersada. La diferencia de energía entre
los fotones incidentes y los que son dispersados por los átomos de la muestra
proporcionan información sobre la estructura atómica de los nanotubos.
Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM).- Esta técnica es insustituible en el
estudio de la morfología de los nanotubos de carbono o la detección de partículas
metálicas incorporadas a los nanotubos de carbono. Son experimentos difíciles, ya que
poseen baja sección de choque de carbono para dispersión de electrones, además de las
dificultades de manipulación de nanotubos individuales (Figura 6 y 7).
13
INTRODUCCIÓN
Figura 6. Imagen TEM de cuerdas de nanotubos que crecen en ejes de 10-50 unidades,
unidos por interacciones débiles (Van der Waals). Estos consisten en una red
triangular con parámetros de red aproximadamente igual a d + 3.15 Å [Capaz, 2000].
Figura 7. Imagen TEM de un MWNT, donde se aprecian las capas concéntricas de los
nanotubos de carbono [Hawrylak, 2004].
Microscopía Electrónica de barrido (SEM).- Es comúnmente usada en análisis previos,
en la verificación de los arreglos de nanotubo sobre los soportes, para el mapeo de los
diferentes componentes metálicos (Figura 8).
14
INTRODUCCIÓN
Figura 8. Imagen SEM de nanotubos de carbono obtenidos por descomposición
catalítica de etileno sobre catalizadores de hierro [Hawrylak, 2004].
Microscopía de Fuerzas Atómicas (AFM).- Se han configurado como herramientas
indispensables para interrogar las propiedades de sistemas de tamaño nanométrico. El
carácter local y el preciso control de las interacciones electromagnéticas permite a esta
técnica la investigación del estado químico, mecánico o eléctrico de estructuras
nonométricas, con independencia de la naturaleza de las nanoestructuras.
Microscopía de efecto Túnel (STM).- Mediante esta técnica, se puede medir el
diámetro del nanotubo, ángulo chiral y la distancia interatómica. Esta técnica es una de
las más utilizadas para la investigación a escala nanométrica (Figura 9).
Figura 9. Imagen STM de un SWNTobtenido luego de un tratamiento de ultrasonido
para una desagregación efectiva [Capaz, 2000].
1.2. SÍNTESIS DE LOS NANOTUBOS DE CARBONO
15
INTRODUCCIÓN
Aunque Sumio Iijima [Iijima, 1991] fue el primero en ver un nanotubo, otros se
adelantaron en su fabricación. Sin saberlo, los hombres de Neandertal fabricaron
pequeñas cantidades de nanotubos en las hogueras con que calentaban sus cuevas.
Separados por el calor, los átomos de carbono se recombinan en el hollín; unos
engendran glóbulos amorfos, otros unas esferas llamadas “fullerenos” y otros largas
cápsulas cilíndricas, los “nanotubos”. La ciencia ha descubierto tres formas de fabricar
hollín que contienen una proporción notable de nanotubos. Hasta ahora, sin embargo,
los tres métodos sufren algunas limitaciones importantes: todos producen mezclas de
nanotubos con una amplia gama de longitudes, muchos defectos y variedad de
torsiones.
Los principales métodos de síntesis de nanotubos de carbono son el método de
descarga por arco, el de vaporización por láser y el método de deposición química. A
continuación pasaremos a describirlos brevemente a cada uno de ellos.
a) Síntesis por el método de arco [Huber, 2002].
En 1992 Thomas Ebbeser y Pullickel M. Ajayan, del laboratorio de
investigación Fundamental de NEC, publicaron el primer método de fabricación de
cantidades macroscópicas de nanotubos. Consiste en conectar dos barras de grafito
(Figura 10) con diámetros de 0,5 a 40 mm a una fuente de alimentación con voltaje
de 20 – 50 V, separarlas unos milímetros y accionar un interruptor. Al saltar una
chispa de corriente DC de 50 - 120 A entre las barras y una presión base de 400 torr
de helio, el carbono se evapora en un plasma caliente. Parte del mismo se vuelve a
condensar en forma de nanotubos.
16
INTRODUCCIÓN
Rendimiento normal: Hasta un 30 por ciento en peso.
Ventaja: Las altas temperaturas y los catalizadores metálicos añadidos a las barras
puede producir nanotubos de pared única y multiple con pocos defectos
estructurales.
Figura 10. Diagrama del método de síntesis de nanotubos de carbono por descarga
de arco voltaico [Capaz, 2000] .
Limitaciones: Los nanotubos tienden a ser cortos (50 micras o menos) y depositarse
en formas y tamaños aleatorios. Durante el proceso también son formados el
carbono amorfo y los fullerenos.
Distribución de diámetros: Típicamente se obtiene un amplio rango de diámetros de
nanotubos; además el crecimiento del nanotubo de ∼1 µm ocurre típicamente en 0.1
17
INTRODUCCIÓN
s; es decir cada 10-5 s es adicionado un anillo de carbono: crecimiento lento [Capaz,
2000].
Figura 11. Distribución de diámetros de nanotubos de carbono [Capaz, 2000].
De la Figura 11 podemos ver que:
• Los nanotubos de menor diámetro son de (∼7 Å ): idéntico al de C60.
• Los nanotubos de mayor diámetro son de (∼16,5 Å ).
• Los nanotubos en mayor número son de (∼10,6 Å ).
b) Síntesis por el método de vaporización por láser [Huber, 2002].
Un grupo de la Universidad de Rice se ocupaban, del bombardeo de un metal
con pulsos intensos de láser para producir moléculas metálicas más extravagantes
cuando les llegó la noticia del descubrimiento de los nanotubos. En su dispositivo
sustituyeron el metal por barras de grafito. No tardaron en producir nanotubos de
18
INTRODUCCIÓN
carbono utilizando pulsos de láser en lugar de electriciad para generar gas caliente
(1200 ºC) de carbono a partir del que se forman los nanotubos. Ensayaron con
varios catalizadores (Fe, Co, Ni) y lograron, por fin, las condiciones en que se
producen cantidades prodigiosas de nanotubos de pared única.
Rendimiento normal: Hasta un 70 por ciento.
Ventaja: Producen nanotubos de pared única con una gama de diámetros que se
pueden controlar variando la temperatura de reacción.
Limitaciones: Este método necesita láseres muy costosos.
c) Síntesis por el método de crecimiento de vapor [Capaz, 2003].
Morinubo Endo, de la Universidad de Shinshu en Nagano, introdujo, en la
fabricación de nanotubos, el método de la deposición química en fase de vapor
(CVD). Se muestra en la Figura 12 . Se coloca un sustrato de Fe, Co, Ni que actúa
como catalizador formando una película fina de 1 a 50 nm de espesor en un horno
de atmósfera inerte de helio a baja presión, se calienta a 600 ºC y lentamente se
añade gas metano, acetileno o benceno, liberándose átomos de carbono, que se
pueden recombinar en forma de nanotubos.
Debido a las altas temperaturas, el metal (catalizador) se aglutina en
nanopartículas separadas que sirven como centros de crecimiento que formarán la
19
INTRODUCCIÓN
base de los nanotubos; por lo tanto, el tamaño de la partícula define el diámetro del
nanotubo que será creado [Fan, 2003].
Figura 12. Nanotubos obtenidos por el método de CVD, utilizando nanopartículas
metálicas como catalizadores. Las nanopartículas son las regiones más brillantes
de la imagen, localizadas en las extremeidades de los nanotubos [Capaz, 2003].
Rendimiento normal: de 20 a casi 100 por ciento.
Ventaja: La técnica de CVD es la más sencilla de los tres métodos para su
aplicación a escala industrial. Podría emplearse en fabricar nanotubos largos,
necesarios en las fibras empleadas en materiales compuestos.
Limitaciones: Los nanotubos fabricados así suelen ser de pared múltiple y a veces
están plagados de defectos. De ahí que los nanotubos tengan sólo una décima de la
resistencia a la tracción respecto a los fabricados por la descarga de arco.
d) Otros métodos de síntesis.
20
INTRODUCCIÓN
Desde su descubrimiento de los nanotubos de carbono originada por la pirólisis
de electrodos de grafito en atmósfera controlada de helio, los nanotubos también
vienen siendo sintetizados por otros métodos, tales como la síntesis catalítica,
usando metales de transición sobre soportes de sílica alúmina y también zeolitas.
Otro método es el llamado proceso HiPCO, que consiste en la descomposición de
monóxido de carbono a altas presiones y altas temperaturas.
1.3. PURIFICACIÓN DE LOS NANOTUBOS DE CARBONO
La purificación de los nanotubos de carbono envuelve etapas de oxidación selectiva,
ataques con sustancias químicas, centrifugación, filtrado, etc. El objetivo es separar a
los nanotubos de otras formas indeseables que son producidas durante la síntesis, tales
como fullerenos y el carbono amorfo [Hawrylak, 2004]. Algunos de los procesos más
importantes son:
• Tratamiento ácido.- En general este tratamiento podría remover el catalizador,
la superficie del metal debe estar en contacto con el ácido que típicamente puede
ser HNO3, HF. El ácido solamente tiene efecto sobre el metal catalizador y no
sobre los nanotubos u otras partículas de carbono.
• Tratamiento térmico.- Debido a las altas temperaturas (873K – 1373K) los
nanotubos podrían ser reordenados logrando disminuir los defectos originales.
• Tratamiento por ultrasonido.- Con esta técnica las partículas son separadas
debido a las vibraciones ultrasónicas. Las aglomeraciones de diferentes
21
INTRODUCCIÓN
nanopartículas al estar sometidas a vibraciones ultrasónicas podrían ser más
dispersas.
• Purificación magnética.- En este método los nanotubos de carbono en
suspensión son mezclados con nanopartículas inorgánicas (principalmente ZrO2
o CaCO3) en un baño ultrasónico para quitar las partículas ferromagnéticas,
luego de un tratamiento químico podríamos obtener SWNT de alta pureza.
• Microfiltración.- Consiste en la separación de partículas de SWNT y una
cantidad pequeña de nanopartículas de carbono que son atrapadas en el filtro.
Las otras nanopartículas (metal catalizador, fullerenos y nanopartículas de
carbono) están pasando por medio del filtro.
• Oxidación.- Es el proceso para remover las impurezas o el transparente/claro de
la superficie del metal. La principal desventaja de la oxidación es que no son
solamente las impurezas oxidadas, también los SWNT son afectados.
Afortunadamente los daños a los SWNT son mucho menores. La oxidación a
temperaturas elevadas puede ser repesentada por:
C + O2 → CO2 ó 2C + O2 → 2CO
Alternativamente, la oxidación por tratamiento con disolución ácida de
permanganato de potasio puede ser descrita por:
3C + 4KMnO4 + 4H+ → 4 MnO2 + 3CO2 + 4K+ + 2H2O
1.4. DOPADO DE NANOTUBOS
22
INTRODUCCIÓN
Mediante este proceso (Figura 13) cabe la posibilidad de introducir en la
estructura del nanotubo de carbono de forma controlada y predeterminada, durante el
proceso de síntesis algún tipo de impureza (átomos de otro elemento químico) para
alterar sus propiedades [Capaz, 2003].
Figura 13. Muestra de nanotubos dopados con nitrógeno, obtenida por el método de
descarga de arco. La presencia de nitrógeno hace que aparezcan estructuras en forma
de bambú [Capaz, 2003].
1.5. MECANISMOS DE CRECIMIENTO
Los nanotubos de carbono son siempre cerrados y, crecen por adsorción de C2
próximo a los defectos pentagonales de las puntas. Los nanotubos están abiertos durante
la síntesis y crecen por incorporación de átomos de carbono en las extremidades, como
se muestra en la Figura 14. Para el crecimiento por descarga de arco el proceso surge
por adición de C2 y C3; pero la adición en posiciones herradas puede hacer que el
nanotubo se cierre.
23
INTRODUCCIÓN
Figura 14. Crecimiento del nanotubo por el método de descarga de arco en la cual
crece por adición de C2 y C3 [Capaz, 2003].
1.6. PROPIEDADES Y APLICACIONES DE LOS NANOTUBOS
En general, la propiedades de los nanotubos dependen principalmente de los
siguientes factores: el número de capas concéntricas que posee, la manera en que es
enrollado y del diámetro del nanotubo.
(a) Propiedades electrónicas
•
Transportan bien la corriente eléctrica.
• Pueden actúar con característica metálica, semiconductora o también
superconductora (Figura 15).
• Para que un nanotubo sea metálico debe de cumplirse que la diferencia (n – m =
3i) deber ser múltiplo de 3, en caso contrario será semiconductor [Capaz, 2000].
(b) Propiedades mecánicas
•
Uno de los materiales más “duros” conocidos (similar a los diamantes).
•
Presenta una altísima “resistencia mecánica”.
•
Presenta una altísima flexibilidad.
24
INTRODUCCIÓN
(c) Propiedades elásticas
•
Por su geometría, podría esperarse que los nanotubos sean extremadamente
duros en la dirección del eje, pero por el contrario son flexibles a deformaciones
perpendiculares al eje.
•
La curvatura causa aumento de la energía: los nanotubos son menos estables que
el grafito, y cuanto menor es el diámetro menor es la estabilidad.
Figura 15. Carácter electrónico de cada tipo de nanotubo[Capaz, 2000].
•
Para grandes deformaciones radiales, los anotubos pueden ser inestables
(colapso). Esto ocurre principalmente para nanotubos de gran diámetro.
•
Las características mecánicas de los nanotubos son superiores a las fibras de
carbono; resistencia a deformaciones parciales, flexibilidad. Las cuales las hacen
idóneas a muchas aplicaciones posibles.
(d) Propiedades térmicas
25
INTRODUCCIÓN
•
Presenta altísima conductibilidad térmica en la dirección del eje del nanotubo.
Estas propiedades únicas de los nanotubos se utilizan para la obtención de
compuestos conductores o de alta resistencia mecánica, dispositivos de almacenamiento
y conversión de energía, dispositivos semiconductores en escala nanométrica y sensores
en general, y detección electroquímica en particular [Zhao, 2002].
Estudios recientes han demostrado que los nanotubos poseen una gran actividad
electrocatalítica y un mínimo ensuciamiento de la superficie de diseños electroquímicos.
Un comportamiento electroquímico mejorado del citocromo c [Wang, 2002a], del ácido
ascórbico [Wang, 2002b], del NADH [Musameh, 2002] y de las hidrazinas [Zhao,
2002] ha sido descrito en los electrodos modificados con nanotubos de carbono. La
capacidad de los nanotubos de carbono de promover las reacciones de transferencia
electrónica del NADH y del peróxido de hidrógeno es prometedora para los biosensores
amperométricos basados en enzimas deshidrogenasas y oxidasas. El principal
inconveniente para desarrollar estos biosensores desde el punto de vista práctico es la
insolubilidad de los nanotubos de carbono en la mayoría de los disolventes. Los
electrodos modificados con nanotubos de carbono descritos en la bibliografía se basan
en la adición de una disolución de nanotubos de carbono/ácido sulfúrico sobre la
superficie de un electrodo de carbono vitrificado [Zhao, 2002], un procedimiento que
no es compatible con la inmovilización de biocomponentes. Por ello, hay una gran
necesidad de desarrollar nuevos procedimientos de fabricación para ampliar las
aplicaciones de los sensores electroquímicos basados en nanotubos de carbono.
26
INTRODUCCIÓN
Un electrodo compósito es un material que presenta al menos una fase
conductora y una fase aislante [Tallman, 1990]. Presentan las siguientes ventajas:
− Frente a los electrodos de una fase conductora simple, los electrodos compósitos
al fabricarse dan flexibilidad en lo que respecta a forma, tamaño además de gran
facilidad para adaptarse a variedad de configuraciones electródicas.
− Proporcionan una mayor relación señal/ruido, lo que implica un menor límite de
detección.
− Versatilidad, ya que permiten la incorporación de especies para mejorar la
selectividad o sensibilidad del material electródico como la inmovilización de
moléculas biológicas.
− Su superficie puede regenerarse por simple pulido.
De entre los materiales compósitos disponibles los formados por grafito y
Teflón son especialmente adecuados para la preparación de biosensores enzimáticos
[Wang, 1993]. El uso de pastillas compósitas de grafito-Teflón para la construcción de
electrodos con enzimas ha sido ampliamente estudiado por nuestro grupo [Serra, 2001],
[Guzmán-Vázquez de Prada, 2003], [Peña, 2001]. Los biosensores resultantes son
fácilmente renovables por pulido y permiten la incorporación de biomoléculas y otros
modificadores sin enlaces covalentes, haciendo así el proceso de fabricación del
electrodo fácil, rápido y barato.
Este trabajo describe un procedimiento nuevo y simple para preparar de forma
efectiva sensores electroquímicos con nanotubos de carbono de pared múltiple
27
INTRODUCCIÓN
(MWCNTs), basados en materiales compósitos de MWCNTs-Teflon, de forma similar a
los compósitos de grafito-Teflon. El fin último es utilizar este diseño de sensores
electroquímicos para la construcción eficaz de biosensores amperométricos de enzimas
deshidrogenasas, ya que se ha demostrado que la modificación de electrodos con
nanotubos de carbono produce electrocatálisis en la electrooxidación del NADH
[Wang, 2005]. En este trabajo, se incorpora la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) a
la matriz del electrodo compósito de MWCNTs-Teflon y de esta forma se fabrica un
biosensor de etanol sin mediador. Este nuevo biosensor combina las propiedades de los
nanotubos de carbono con las ventajas de los electrodos compósitos de Teflon
[Guzmán-Vázquez de Prada, 2003].
Las características analíticas de los diseños recientes de electrodos modificados
con nanotubos de carbono se muestran en la Tabla 1 [Tsai, 2007], [Lawrence, 2006],
[Tsai, en prensa], [Zhu, 2007], [Retna Raj, 2006], [Chakraborty, 2007], [Zeng,
2007], [Pumera, 2006] y [Zhu, 2007]. En relación con los biosensores enzimáticos
basados en electrodos compósitos de nanotubos de carbono, han demostrado tener
características analíticas mejoradas debido a las propiedades únicas de los nanotubos de
carbono y a las bien conocidas ventajas de los diseños de los electrodos compósitos:
fácil renovación de su superficie y bajas corrientes de fondo [Pedano, 2004].
Electrodo
ADH-PVA-CNT-GCE
Potencial Intervalo
detección, lineal,
V
mM
+0.7
Hasta 1.5
ADH-MB-CNT-CPE
0.0
ADH-PDDA-CNT-GCE
+0.1
r
-
0.05-10.0 0.9998
0.5-5.0
28
0.998
Pendiente, LOD,
µA/mM
µM
0.196
13
0.597
5
-
90
Ref.
[Pedano,
2004]
[Santos,
2006]
[Liu,
2007]
INTRODUCCIÓN
ADH-Aucoll-MWCNTsTeflon
ADH-MWCNTs-Teflon
+0.3
0.02-1.0 0.9995
2.27
4.7
+0.3
0.1-1.0
1.8
32
0.998
Este
trabajo
Este
trabajo
Tabla 1. Características analíticas de los biosensores basados en nanotubos de
carbono para la determinación de etanol.
29
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Reactivos y disoluciones
Grafito en polvo (Ultra Carbon, Bay City, MI, USA) o nanotubos de carbono
(MWCNT, Brighton, MA) y Teflon en polvo (Aldrich) se usaron para la fabricación del
electrodo compósito. Se preparan disoluciones de 0.1 M de etanol (Scharlau), NADH
(Sigma, 98%) y NAD+ (Sigma, 97%) en una disolución reguladora de fosfato (0.05 M,
pH 7.4). Se prepararon estándares más diluidos mediante la apropiada dilución de la
misma disolución reguladora de fosfato, el cual también se utilizó como electrolito
soporte. Todos los productos fueron reactivos de grado analítico y el agua utilizada fue
obtenida de un sistema de purificación Millipore Milli-Q (Millipore, Bedford, NA,
USA). La enzima utilizada fue la alcohol deshidrogenasa, ADH (de levadura de
panadero, Sigma, 450,000 U/mg).
2.2. Aparatos y electrodos
Las medidas amperométricas en disolución agitada fueron llevadas a cabo con
un potenciostato PGSTAT 12 de Autolab para controlar los valores de potencial
aplicados. El paquete de software electroquímico GPES 4.7 (General Purpose
Electrochemical Systems, EcoChemie B.V.). Se utilizó una célula electroquímica
equipada con 3 electrodos (10 ml BAS VC-2), un hilo de platino como electrodo
auxiliar, un electrodo de referencia de Ag/AgCl/3M KCl
(BAS MF-2083) y un
electrodo compósito de (a) grafito-Teflon o (b) MWCNTs-Teflon como electrodos de
30
2. MATERIALES Y MÉTODOS
trabajo. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente en disolución
reguladora de fosfato (0.05 mol L-1, pH 7.4) como electrolito soporte.
2.3. Preparación de los electrodos compósitos de grafito-Teflon o de MWCNTsTeflon
Los sensores de grafito-Teflon o MWCNTs-Teflon se fabricaron en forma de
pastillas cilíndricas como se detalla a continuación. Se mezclan grafito, 50 mg y 50 mg
de Teflon y a continuación se procede a mezclar manualmente. Se demostró en trabajos
anteriores que el porcentaje final de Teflon (50%) proporcionaba características
mecánicas y de conductividad adecuadas para los materiales compósitos [Manso,
2007]. La mezcla se coloca en un extremo de un tubo de Teflon. El contacto eléctrico se
establece a través de un tornillo de acero inoxidable con punta plana que es introducido
por el otro extremo del tubo de Teflon (Figura 16).
Tornillo de acero inoxidable
Pastilla de grafito-Teflon o MWCNTsTeflon
Teflon
Figura 16. Esquema del electrodo compósito de grafito-Teflon o MWCNTs-Teflon.
31
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.5. Preparación del biosensor compósito de ADH-MWCNTs-Teflon
El biosensor de ADH-MWCNTs-Teflon se fabricó como sigue. MWCNTs, 50
mg, y 9.3 mg de alcohol deshidrogenasa y se mezcló manualmente durante 20 min.
Finalmente, se añadieron 50 mg de Teflon y se mezcló de nuevo manualmente hasta su
completa homogeneización. La mezcla resultante se coloca en un extremo de un tubo de
Teflon, como se describió anteriormente.
32
2. MATERIALES Y MÉTODOS
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
33
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Comparación de los electrodos compósitos de grafito-Teflon y MWCNTsTeflon
Se va a describir el atractivo comportamiento de los nuevos electrodos
compósitos de MWCNTs-Teflon con relación a la detección del NADH, que está
involucrado en una gran cantidad de aplicaciones de biosensores. También se muestran
experimentos de control, utilizando electrodos compósitos de grafito-Teflon, para
demostrar las ventajas de los nuevos sensores de MWCNTs-Teflon.
La composición de electrodo compósito de MWCNTs-Teflon es la misma que la
optimizada en un trabajo anterior [Manso, 2007]. De esta forma, la relación es 50/50
w/w de MWCNTs-Teflon, preparada como se indicó en la Sección 2.3. de Materiales y
Métodos. La Figura 17 compara los voltamperogramas hidrodinámicos para una
disolución de NADH 1.0x10-3 mol L-1 sobre un electrodo compósito de (a) grafitoTeflon 50/50 w/w y (b) MWCNTs-Teflon 50/50 w/w. Se observan corrientes anódicas
muy pequeñas a potenciales inferiores a +0.4 V para el electrodo de grafito-Teflon. Por
el contrario, para el electrodo compósito de MWCNTs-Teflon se observan corrientes
anódicas significativas para potenciales más positivos que 0.0 V. Estos resultados, están
de acuerdo con los descritos en la bibliografía utilizando un electrodo de carbono
vitrificado modificado con CNT [Musameh, 2002], que muestran el conocido efecto
electrocatalítico de los CNTs hacia la oxidación del NADH debido a las propiedades
únicas de los nanotubos de carbono [Iotov, 1998]. Curiosamente, la forma de la
representación de la curva i vs. E es parecida a la descrita por Musameh y col. con un
34
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
electrodo de carbono vitrificado modificado con MWCNTs [Musameh, 2002]. Estos
autores atribuyen dicha forma a la complicada ruta de oxidación y a la intervención de
reacciones superficiales.
0,000025
0,00002
i, A
0,000015
0,00001
0,000005
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
E, V
Grafito-Teflon
MWCNTs-Teflon
Figura 17. Voltamperogramas hidrodinámicos para una disolución de NADH 1.0x10-3
mol L-1 en disolución reguladora de fosfato 0.05 mol L-1 de pH 7.4 sobre electrodos
compósitos de: (♦) grafito-Teflon y () MWCNTs-Teflon.
Con el objetivo de obtener un compromiso razonable entre sensibilidad y
selectividad, las amperometrías en disolución agitada se realizaron a valores de
potencial de detección de +0.3 V. La Figura 18 muestra las respuestas amperométricas
típicas obtenidas a +0.3 V para adiciones sucesivas de NADH 1.0x10-4 mol L-1 sobre
electrodos de grafito-Teflon y MWCNTs-Teflon. Se observa una gran diferencia en
sensibilidad para el electrodo compósito de MWCNTs-Teflon. De hecho, la pendiente
del calibrado para el intervalo de concentración 1.0x10-4 – 1.0x10-3 mol L-1 NADH para
el electrodo de grafito-Teflon es de 5.34x10-7 A mol-1 L, que es menor que la obtenida
sobre el electrodo de MWCNTs-Teflon (1.8x10-2 A mol-1L). Otras ventajas relevantes
35
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
de las respuestas amperométricas del NADH sobre este electrodo compósito son el bajo
nivel de ruido obtenido, y la rapidez de las medidas, la corriente estacionaria se alcanza
en 10-15 s.
(a)
(b)
Figura 18. Amperogramas en disolución agitada para adiciones sucesivas de NADH
1.0x10-4 mol L-1 sobre electrodos compósitos de (a) MWCNTs-Teflon y (b) grafitoTeflon, en disolución reguladora de fosfato 0.05 mol L-1 de pH 7.4
El intervalo de linealidad obtenido para el NADH en el electrodo de MWCNTsTeflon es de 2x10-5 – 1.0x10-3 mol L-1 (r = 0.995). El valor de la pendiente del calibrado
es de 1.8x10-2 A mol-1L.
La repetibilidad para NADH 2.0x10-4 mol L-1NADH sobre el electrodo de
MWCNTs-Teflon proporcionó una desviación estándar relativa, RSD, de 3.7% (n=10),
que es significativamente menor que el RSD obtenido utilizando el electrodo de
36
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
grafito-Teflon, 6.5%. Esta mejor repetibilidad debe estar relacionada con la capacidad
de los MWCNTs para minimizar el ensuciamiento sobre la superficie del electrodo
después de la oxidación del NADH [Musameh, 2002].
3.2. Biosensor de ADH-MWCNTs-Teflon
Las características mencionadas anteriormente del electrodo compósito de
MWCNTs-Teflon para la detección amperométrica de NADH a valores moderados de
potencial, nos lleva a desarrollar un biosensor electroquímico sin mediador de ADH
basado en la incorporación de la enzima dentro de la matriz compósita. Se introdujo 9.3
mg enzima ADH incorporada en la mezcla para fabricar el biosensor (la optimización se
llevará a cabo posteriormente a este trabajo). Hay que mencionar que entre 6-7
biosensores pueden fabricarse con esta mezcla optimizada (ver Sección 2.5. de
Materiales y Métodos).
Las características analíticas para la determinación de etanol utilizando el
biosensor de ADH-MWCNTs-Teflon se muestran en la Tabla 1, junto con las
características analíticas obtenidas utilizando un biosensor de ADH-Aucoll-MWCNTsTeflon construido de igual forma, pero con el oro coloidal. El límite de detección se
calculó utilizando el criterio de 3 señal del ruido. Además, se obtuvo un valor de RSD
calculado para las pendientes de las rectas de calibrado (n = 3) de 8.0% para el
biosensor de ADH-MWCNTs-Teflon. De acuerdo con los datos mostrados en la Tabla
2, ambos valores de pendiente y el límite de detección fueron notablemente mejores
cuando se utiliza oro coloidal que los obtenidos para el biosensor de ADH-MWCNTsTeflon así como otros biosensores de CNTs. Así, la sensibilidad, trabajando a un
potencial de detección de 400 mV menor, es diez veces mayor que la obtenida con un
37
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
electrodo de poli(vinilalcohol)-CNT-GCE [Tsai, 2007], y casi cuatro veces mayor que
la obtenida para un biosensor preparado con Meldola Blue utilizado como mediador
[Santos, 2006]. Además, el límite de detección obtenido con el biosensor de ADHAucoll-MWCNTs-Teflon es aproximadamente 20 veces menor que el obtenido utilizando
un biosensor con SWCNTs modificados con PDDA [Liu, 2007].
Diferentes aspectos relacionados con la estabilidad del biosensor de ADHMWCNT-Teflon fueron evaluados. En primer lugar, se realizaron medidas
amperométricas sucesivas, sin regeneración de la superficie del electrodo para 6
disoluciones diferentes de etanol 2.0x10-4 mol L-1. Se obtuvo un valor de RSD del 8.0
%. Además, la reproducibilidad de las respuestas obtenidas con tres diferentes
biosensores de ADH-MWCNTs-Teflon fue también evaluada. Para ello, el biosensor se
utilizó para medir en diferentes días la señal amperométrica de una disolución de etanol
1.0x10-4 mol L-1 (n=3). El valor medio de las tres medidas realizadas con tres diferentes
biosensores proporciona un RSD del 9.0%, demostrando una reproducibilidad aceptable
en la construcción de los biosensores compósitos. Además, la vida media de un
biosensor de ADH-MWCNTs-Teflon se calculó realizando tres medidas diarias de una
concentración de etanol 6.0x10-4 mol L-1. El biosensor de ADH-MWCNTs-Teflon
muestra una pérdida de al menos el 40 % de la respuesta inicial después de 24 horas.
Una mayor estabilidad del biosensor puede obtenerse incorporando oro coloidal a la
mezcla compósita debido a la capacidad de las nanopartículas de oro para adsorber las
proteínas, reteniendo su actividad biológica. También, se consideró la estabilidad de
almacenamiento. Almacenando la mezcla compósita en seco a –18 °C, los biosensores
preparados de esta mezcla después de 1 mes de almacenamiento, proporcionan una
medida amperométrica del etanol que no difiere considerablemente de los resultados
38
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
obtenidos con un biosensor preparado con una mezcla reciente. Estos resultados
relacionados con la estabilidad del biosensor son, en general, ventajosos comparados
con los resultados proporcionados para los biosensores de ADH-CNTs mostrados en la
Tabla 1.
39
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
40
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
41
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
Hemos demostrado que los nanotubos de carbono constituyen un nuevo material
compósito disponible para la preparación de biosensores enzimáticos de etanol sin
mediador. Este biosensor es fácilmente renovable por pulido y permite la incorporación
de biomoléculas y otros modificadores sin enlaces covalentes, haciendo así el proceso
de fabricación del electrodo fácil, rápido y barato. Este diseño, permite, además la
incorporación del oro coloidal, que va a permitir que las proteínas conserven su
actividad biológica por adsorción y la modificación de los electrodos con este tipo de
nanopartículas proporcionará un microambiente similar al entorno natural de las
proteínas, reduciendo el efecto aislante de la capa de proteína para la transferencia
electrónica directa a través de los túneles conductores de los nanocristales de oro. La
morfología de la superficie de las nanopartículas de oro, y la interacción entre las
nanopartículas y la superficie del electrodo, son factores importantes que contribuyen a
mejorar el contacto eléctrico entre la proteína redox y el material del electrodo. Su
aplicación para el diseño de un biosensor compósito de etanol, basado en el empleo de
los nanotubos de carbono, oro coloidal y la enzima alcohol deshidrogenasa está en
estudio.
41
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
42
BIBLIOGRAFÍA
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