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2° Congreso Nacional de Química Médica
López-Orduña y col.
CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN
CAPN-10 EN CELULAS BLANCAS DE SANGRE
PERIFÉRICA Y EN LA LÍNEA CELULAR 293T
ab
a
c
b
a
Eduardo López Orduña, Jaime García-Mena, Jesús Kumate y Miguel Cruz López.. Unidad
de investigación Médica en Bioquímica, Hospital de Especialidades Centro Médico. Nacional
Siglo XXI, IMSS; Avenida Cuauhtemoc N°330, Col. Doctores, México D.F., C.P.. 06725,Tel.
b
56276900, ext. 21477 Tel. directo: 57612358, e-mail: [email protected]. Laboratorio 6,
Departamento de Genética y Biología Molecular, CINVESTAV; Avenida Instituto Politécnico
Nacional 2508, Colonia Zacatenco, México D.F. Tel. 50613800, ext. 5328, e-mail:
C
[email protected], Fundación IMSS
RESUMEN
Se han estudiado más de 250 genes candidato sin la identificación de algún gen
marcador predominante a diabetes tipo 2 (DT2). De estos genes el que codifica para la
calpaina 10 humana (CAPN-10), parece tener mayor relación con DT2. El polimorfismo
SNP-43 se ha considerado un marcador de asociación y riesgo en población mexiconorteamericana. El SNp43 G/G se ha relacionado con niveles disminuidos de mRNA
en músculo de pacientes con DT2 y con alteraciones en diversos parámetros
bioquímicos. Hasta la fecha no se ha estudiado la expresión de genes relacionados
con el desarrollo de DT2 en células blancas de sangre periférica. Objetivos: estudiar
la relación del SNP-43 y su contribución a la alteración de la estabilidad del mRNA de
CAPN-10 en linfocitos de sangre periférica, de pacientes DT2 y sujetos sanos.
Determinar el tiempo de vida media de dicho gen en la línea celular 293T, para tratar
de encontrar una relación entre el SNP-43 y la estabilidad de los mensajeros de
CAPN-10 como un posible mecanismo molecular de la contribución de CAPN-10 en la
patogénesis de la DT2. Metodología: En doce individuos, 6 sujetos sanos (3 GG y 3
AA para el SNP-43) y 6 pacientes DT2 (3 GG y 3 AA para el SNP-43) se determinó por
RT-PCR la presencia de un fragmento de 400 pb que incluye los exones 3 y 4,
comunes a 6 de los 8 transcritos reportados para CAPN10. Conclusiones: La
expresión del gen CAPN10 en células blancas de sangre periférica es baja, tanto en
sujetos sanos como en pacientes DT2, independiente de la presencia del SNP43 y sin
afectar el orden de unión de los exones 3 y 4. El tiempo de vida media determinado en
la línea celular 293T para CAPN-10 fue de 4 horas contrastado contra el tiempo de
vida media de 5.65 horas para beta actina.
Palabras clave: Calpaina 10, expresión, vida media
Agradecimientos: Trabajo financiado por CINVESTAV y FOFOI-IMSS.
INTRODUCCIÓN
Hasta ahora, más de 250 genes candidato han sido estudiados para demostrar
su asociación con el desarrollo de DT2; estos genes codifican proteínas involucradas
en la señalización de la insulina, transporte de glucosa, síntesis de glucógeno, síntesis
y absorción de ácidos grasos, diferenciación adipocítica y factores transcripcionales
entre otros (Florez JC,2003). Uno de los genes más promisorios y cuestionados de
asociación es el gen de la CAPN10 localizado dentro de la región NIDDM1. Este es el
primer gen localizado por posicionamiento clonal estudiado en 170 familias,
postulándose como candidato para conferir mayor susceptibilidad a diabetes tipo 2 en
México-Norteamericanos (Horikawa Y, 2001). El primer locus de susceptibilidad de
CAPN10 fue descrito en la comunidad México-Americana de Starr County, Texas, con
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varios polimorfismos asociados como riesgo a padecer diabetes. Los polimorfismos
más relevantes son las variantes en los sitios denominados SNP-43, INS/DEL19 y
SNP-63 (Horikawa Y, 2000; Evans JC 2001; Horikawa Y, 2003). De acuerdo con el
primer reporte, la variación en el gen CAPN10 conocida como SNP-43 (UCSNP-43,
G→A), incrementa un 14% el riesgo atribuible para desarrollar DT2 en población
mexico-americana (Horikawa Y, 2000). Sin embargo, otros estudios no apoyan esta
observación original (Turner MD, 2005). La no replicación de estos estudios entre
diferentes poblaciones puede simplemente explicarse a los diferentes niveles de
mezcla génica (addmixture) o bien por sesgos en las aproximaciones estadísticas o
número de individuos bajo estudio (Turner MD, 2005). Investigaciones realizadas en el
grupo étnico de los indios Pima, reveló que el genotipo G/G para el SNP-43 se
encuentra asociado con una disminución en el recambio de insulina y pérdida gradual
en el control de la glucosa (Horikawa Y, 2000; Yang X, 2001). Además estos
individuos homocigotos G/G tuvieron niveles reducidos de RNAm de CAPN10 en
músculo esquelético (Baier LJ, 2000; Yang X, 2001).
OBJETIVOS
Genotipificar en una muestra de población de la ciudad de México el
polimorfismo SNP-43. Analizar la relación del SNP-43 y su posible contribución a la
alteración de la estabilidad del mRNA de CAPN-10 en linfocitos de sangre periférica,
de pacientes con DT2 y sujetos sanos. Determinar el tiempo de vida media de dicho
gen en la línea celular 293T.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Sujetos de Estudio. Los individuos reclutados para estos estudios están
radicados en la ciudad de México. La muestra consistió de 36 individuos divididos en
dos categorías fenotípicas: 18 pacientes diagnosticados con diabetes tipo 2 (SDT2) y
18 sujetos sanos (SS) no relacionados y sin antecedentes de la enfermedad en al
menos 2 generaciones previas. Los participantes fueron citados para la evaluación
clínica y toma de muestra sanguínea (12 horas de ayuno), para análisis bioquímicos y
extracción de ácidos nucléicos. Se evaluaron los siguientes analitos: glucosa en
ayunas, colesterol total, colesterol unido a proteínas de alta y baja densidad (HDL y
LDL) y triglicéridos. Los ensayos bioquímicos de todos los individuos fueron realizados
en el equipo automatizado ILab 350 (Instrumentation Laboratory, IL). En la misma cita
todos los participantes fueron revisados y sujetos a entrevista por un médico
endocrinólogo y registrados sus datos antropométricos (estatura, peso, índice de masa
corporal) así como la presión arterial. A partir de éste grupo se seleccionaron 6
individuos de cada categoría para realizar los estudios de expresión de CAPN10.
Líneas Celulares. Se empleó la línea celular 293T epiteliales, provenientes de
riñón a su vez derivada de la 293T/17 (ATCC CRL-11268). Las células 293T fueron
cultivadas en botellas de 75cm2 con 10ml de medio DMEM (Gibco, Laboratories)
suplementado con glutamina 4mM, 1.5 g/L NaHCO3, 25mM de glucosa y 10% de
suero fetal bovino. Esta línea celular fue crecida a una temperatura de 37°C y con una
atmósfera de 5% de CO2, el cambio de medio se realizó cada 48 horas de acuerdo a
las especificaciones de la ATCC, realizando tres subcultivos previos al estudio de
decaimiento. Se empleó el método de exclusión de azul de Tripano (Sigma) para
determinar la viabilidad celular.
Extracción de DNA genómico y Genotipificación del SNP-43. A partir de 4 ml de
sangre tomada con el sistema Vacutainer (Becton-Dickinson) con EDTA como
anticoagulante, se extrajo el DNA genómico empleando el sistema comercial QIAamp
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(Qiagen), siguiendo las instrucciones de la empresa fabricante. La integridad del DNA
fue verificada por medio de la medición espectrofotométrica a 260/280 nm y por
electroforesis en gel de agarosa al 0.8% teñidos con bromuro de etidio y
documentados digitalmente. La detección del SNP-43 fue realizada para todas las
muestras de DNA, incluida la línea celular, empleando la sonda Taqman (Número de
ensayo: C__27483762_10) que detecta el UCSNP-43 (SNP-43 G/A) localizado en la
región rs3792267 del gen CAPN10. La discriminación alélica se realizó por medio del
software del equipo automatizado 7900 HT (Applied Biosystems). La secuencia de la
sonda fue la siguiente: 5´-GCT CAC GCT TGC TGT GAA GTA AGG C [A/G] TTT GAA
GGT GAG GCT AAG CCT TGA C-3´.
Extracción de RNA total y cuantificación de los mensajeros de CAPN10. El
RNA total fue purificado a partir de 1.0X107 células blancas de sangre periférica y a
partir de 2.2X106 células cultivadas (293T), empleando el sistema comercial QIAamp
RNA Blood, siguiendo el protocolo proporcionado por la empresa (Qiagen). El RNA
extraído fue tratado con DNasa Q (Promega) y la integridad fue verificada por
electroforesis en gel de agarosa al 1.0% y espectrofotometría a 260/280 nm. Se realizó
la síntesis de cDNA a partir de 1µg de RNA total, tanto de los sujetos participantes
como de las líneas celulares, empleando la enzima Super Script II (Invitrogen) e
iniciadores de hexámeros al azar (random primers). La detección de los transcritos de
CAPN10 fue realizada por PCR en tiempo real empleando el sistema DNA Fast Start
SYBR-green (Roche) y el sistema de detección Light Cycler 2.0 (Roche). Los
iniciadores para el exón 3 (197 pb) fueron E3F 5´-GTC ATT CCT CCG GGA CAG-3´ y
E3R 5´-TTG GCG TAG ACC TTT TCC AG-3´, para exon 4 (190 bp) E4F 5´- GGG TCC
TAC GAG CAC CTG T-3´ y E4R 5´-AGC AGC TGA TCA GAC ACT GG-3´. Con los
iniciadores E3F y E4R es posible amplificar un fragmento de 387 pb, el cuál flanquea a
los exones 3 y 4 del gen CAPN10. El empleo de este par de iniciadores permite
diferenciar la amplificación de CAPN10 a partir de RNAm o cDNA de una amplificación
de DNA genómico por diferencia en el tamaño de los fragmentos, ya que el producto
de amplificación a partir de DNA genómico corresponde a un fragmento de 1600 pb al
incluir al intrón 3. También se determinó la vida media de beta actina. Los iniciadores
diseñados amplifican un fragmento de 597 pb, siendo la secuencia de los iniciadores la
siguiente: BaF 5´- CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3´ y BaR 5´-AGG GTA
CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3´. Los fragmentos de 387 pb de CAPN10
conteniendo los exónes 3 y 4 y de 587 pb del fragmento de beta actina fueron
amplificados y clonados en el vector pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen), para generar los
plásmidos denominados pTopo-CAPN10-387 y pTopo-Bac-587 respectivamente.
Diluciones seriales con un rango de 104 a 108 moléculas de cada plásmido fueron
empleadas para construir curvas estándar a partir de las cuales se calculó el número
de copias para cada gen.
Ensayo de decaimiento de RNAm de CAPN10. La línea celular 293T fue
cultivada de acuerdo a la descripción previa y la vida media de los transcritos de
CAPN10 fue determinada como una estimación a partir del decaimiento del número de
copias del fragmento exón 4 en la línea celular tratada con 1 µM de actinomicina D
(Sigma). Veinticuatro horas previas al tratamiento las células fueron contadas y
transferidas de las botellas de 75cm2 a placas de 10cm2 en alícuotas de 2.2X106
células cada una. Bajo estas condiciones se realizaron 3 experimentos independientes
con recolección de células cada 2 horas durante 8 horas y aislamiento de RNA total.
Análisis estadístico. Todos los valores bioquímicos y antropométricos fueron
expresados como promedio ± una desviación estándar. Las diferencias
estadísticamente significativas entre los grupos fenotípicos (SDT2 y SS) fueron
determinados por medio de una prueba de ANOVA.
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RESULTADOS
La muestra bajo estudio consistió de 36 individuos. La tabla 1 resume los
parámetros bioquímicos y antropométricos. Podemos resaltar el hecho de que la
hiperglucemía característica de la enfermedad, mientras que el grupo SS se encuentra
dentro de lo normal y ausencia de resistencia periférica a la insulina. Los niveles de
colesterol total no presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los
grupos contrastados. El IMC para los dos grupos bajo estudio mostraron encontrarse
por arriba de de 25, lo cual nos esta indicando que muestra se encuentra con
sobrepeso y obesidad moderada principalmente en el grupo de sujetos SDT2. Los
niveles de insulina y la resistencia a la insulina en tejidos periféricos son concordantes
con cada uno de los grupos, observándose los mayores niveles de insulina y
resistencia en los sujetos SDT2 y los niveles normales de insulina y ausencia de
resistencia a la misma en individuos SS. Estas diferencias observadas en estos
parámetros bioquímicos y antropométricos nos permiten establecer la adecuada
clasificación de los individuos en las dos categorías fenotípicas.
Característica
Edad (años)
2
IMC (kg/m )
PAD (mmHg)
PAS (mmHg)
Glucosa (mg/dl)*
Colesterol (mg/dl)
LDL (mg/dl)*
HDL (mg/dl)
TG (mg/dl)
T2D
51.02
27.81
123.93
83.94
172.07
221.48
139.31
45.12
229.62
±SD
7.41
3.80
16.05
16.75
72.43
46.10
40.72
11.74
129.51
HT2DNB
50.93
26.96
118.40
75.83
86.70
207.43
80.71
41.19
209.30
±SD
5.06
3.31
8.93
7.01
5.38
38.22
27.29
18.55
54.00
Tabla 1. Perfiles antropométricos y bioquímicos de la muestra.*Diferencia significativa p<0.05
Se genotipificaron los 36 individuos divididos en las dos categorías fenotípicas
el SNP-43 de CAPN10 encontrándose una frecuencia de 0.65 para el alelo G y 0.35
para el alelo A en los individuos SDT2, y para los individuos SS de 0.58 para el alelo G
y 0.42 para el alelo A. Como se muestra en la figura 1A CAPN10 se expresa en
células blancas de sangre periférica, pudiéndose diferenciar los productos de 190
(exon 3), 197 (exon 4) y 387 (exón 3-4) a partir de cDNA y o bien un fragmento de
1300 pb a partir de DNA genómico. En 12 individuos, 6 SDT2 y 6 SS, se examinó si el
orden de los exones después del splicing se encontraba afectado por el SNP-43 en su
versión G/G. El fragmento de 387 pb pudo detectarse en los 12 individuos analizados
independientemente del alelo portado para el SNP-43 o el fenotipo (figura 1B). Para
abordar si el genotipo G/G afectaba la estabilidad de los mensajeros, la línea celular
293T fue genotipificada para el SNP-43, determinándose su homocigocidad para el
alelo G. La vida media observada para CAPN10 en células 293T fue de t½ = 8.00 y la
para beta actina t½=6.35.
DISCUSIÓN
En el presente trabajo, hemos demostrado la expresión de CAPN10 en células
blancas de sangre periférica. Nuestros datos sugieren que la expresión de CAPN10 no
se ve afectada en el corte del intrón 3 y la fusión de los exones 3 y 4, por la presencia
del genotipo G/G para el SNP-43. Pudimos demostrar el apropiado splicing del intron
3, tanto en sujetos SDT2 y SS de forma independiente al genotipo G/G para el SNP-43
por detección del fragmento de 387 pb, mismo que fue clonado y secuenciado,
corroborar el orden adecuado de los exones fusionados. La vida media de los
transcritos de CAPN10 en la línea celular 293T, con genotipo G/G, fue de 8.00 horas,
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el cual es indicativo de que no afecta la estabilidad del pre-mRNA y mRNA, ya que
esta vida media fue realizada a partir de cDNA sintetizado con random primers, lo que
nos permitió evaluar el la estabilidad de los transcritos de CAPN10 durante todo el
procesamiento del mismo.
A
B
Figura 1. Expresión de CAPN10 en células blancas de sangre periférica. A) Detección de los productos
de PCR de 190 pb (línea 1) para el exon 3, 197 pb (línea 2) para el exon 4 y 387 pb (línea 3) para la
fusión de los exones 3-4. En la línea 4 se observa el produto de 1300 pb a partir de DNA genómico que
incluye al intron 3. B) Detección del producto de PCR de 387 pb a partir de 4 individuos SDT2, 2
individuos SNP-43 A/A (líneas 1 y 2) y 2 individuos SNP-43 G/G (líneas 3 y 4); y de 4 individuos SS, 2
individuos SNP-43 A/A (líneas 7 y 8) y 2 individuos SNP-43 G/G (9 y 10). Como controles se emplearon
las células 293T y jurkat (líneas 5, 6 y 11,12).
CONCLUSIONES
Queda demostrada la expresión de CAPN10 en células blancas de sangre
periférica, al determinar la presencia de los exónes 3 y 4 por RT-PCR en tiempo real.
En la línea celular 293T la vida media de CAPN10 es de 8.00 horas en empleando 1
µM de actinomicina D, lo que permite observar una estabilidad en los mensajeros de
CAPN10 independiente del genotipo G/G para el SNP-43
BIBLIOGRAFÍA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Florez J C, Hirschhorn J, Altshuler D, 2003 The inherited basis of diabetes mellitus: implications for
the genetic analysis of complex traits. Annu Rev Genomics Hum Genet 4:257-291
Horikawa Y, Oda N, Cox N J, Li X, Orho-Melander M, Hara M, Hinokio Y, Lindner TH, Mashima H,
Schwarz PE, del Bosque-Plata L, Horikawa Y, Oda Y, Yoshiuchi I, Colilla S, Polonsky KS, Wei S,
Concannon P, Iwasaki N, Schulze J, Baier L J, Bogardus C, Groop L, Boerwinkle E, Hanis C L, Bell
GI. 2000 Genetic variation in the gene encoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus.
Nat Genet 26: 163-175
Evans JC, Frayling TM, Cassell PG, et al. Studies of association between the gene for calpain-10 and
type 2 diabetes mellitus in the United Kingdom. Am J Hum Genet 2001; 69: 544-552
Turner M D, Cassell P G, Hitman G A. 2005 Calpain-10: from genome search to function
Diabetes/Metabolism Research and Reviews, Volume 21, Issue 6 , Pages 505 - 514
Yang X, Pratley RE, Baier LJ, et al. 2001 Reduced skeletal muscle calpain-10 transcript level is due to
a cumulative decrease in major isoforms. Mol Genet Metab 73: 111-113
Baier LJ, Permana PA, Yang X, et al. 2000 A calpain-10 gene polymorphism is associated with
reduced muscle mRNA levels and insulin resistance. J Clin Invest 106: R69-R73