conservamos Vol. 6 G u ía Téc n i c a d e P reservación en Biblio t e c a s EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE PRODUCTOS PARA EL CONTROL DEL BIODETERIORO EN LOS FONDOS HISTÓRICOS DE LA BIBLIOTECA NACIONAL DE COLOMBIA conservamos Gu í a Té c n i c a d e P reservación en Bibliotec as 3 4 5 6 6 9 14 25 27 30 1. Resumen 2. Introducción 3. Planteamiento del problema y justificación 4. Objetivos 5. Marco teórico 6. Metodología 7. Resultados y discusión 8. Conclusiones y recomendaciones 9. Bibliografia 10. Anexos Artículos/Aydee Camila Vargas Ángel Biblioteca Nacional de Colombia Diseño gráfico/Diagramación/Ilustración Sebastian Rojas Acero Taller Digital/Conservación Guía Técnica para la Preservación en Bibliotecas ©Biblioteca Nacional de Colombia – 2011 Ministerio de Cultura Biblioteca Nacional de Colombia Calle 24 No. 5-60 (57+1) 3816464 Bogotá, Colombia. www.bibliotecanacional.gov.co conservamos 3 El papel es objeto de numerosos factores de deterioro biótico y abiótico, que pueden causar la degradación irreversible de importantes documentos y obras de arte gráfica, consolidadas como patrimonio documental. Muchos agentes químicos y físicos pueden favorecer estos procesos y los microorganismos, en especial los hongos filamentosos, juegan un papel importante en el biodeterioro de este soporte. Es por ello que el grupo de Conservación de la Biblioteca Nacional de Colombia centra su acción en la conservación del patrimonio bibliográfico y documental mediante la implementación de medidas preventivas y de conservación interventiva de manuscritos, encuadernaciones, impresos, entre otros. Así, este trabajo propuso evaluar agentes químicos para el control del biodeterioro en dos fases. La primera en respuesta a la eliminación de los microorganismos (tres morfotipos de hongos filamentosos: Cladosporium Morfotipo 1, Penicillium Morfotipo 6, Aspergillus Morfotipo 1, un morfotipo de levadura: Rhodotorula mucilaginosa y un morfotipo de Bacilos esporulados Gram positivos RI0020) como agentes causales del biodeterioro a través de la evaluación de agentes químicos con la metodología de Dilución-Neutralización propuesta en las Normas Técnicas Colombianas 5540 y 5473, y la segunda estableciendo los posibles cambios físico-químicos que podían generarse en el soporte papel como efecto secundario por la aplicación del producto, por medio de la evaluación del cambio cromático y la cuantificación de azúcares reductores por la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico, como indicador de la degradación del soporte. Las pruebas de laboratorio evidenciaron que los amonios cuaternarios (QAS) son agentes microbicidas eficaces frente a los cinco microorganismos evaluados, el Enilconazol presenta buena actividad frente a hongos filamentosos y la bacteria Gram positiva, y el Etanol 75% manifiesta su efecto únicamente sobre hongos, por el contrario, la Plata coloidal presenta un bajo espectro mostrando actividad exclusivamente sobre el hongo xerófilo Aspergillus morfotipo 1 y la levadura. Respecto a las pruebas físico-químicas, se encontró que los QAS generan cambios cromáticos en el papel manual y que ningún agente químico genera degradación del soporte; por ello, las posibles correlaciones entre la composición del papel y la del agente químico se presentan y discuten. Concluyendo, todos los productos evaluados presentaron actividad al menos frente a dos de los microorganismos con los que se enfrentaron, sin embargo, se evidenció que los QAS son los más efectivos. Por ello, se puede optar por su uso en los procesos de saneamiento documental en soporte tipo papel industrial. Para los procesos de saneamiento sobre papel manual se puede considerar el uso de Clinafarm spray. conservamos 4 2. INTRODUCCIÓN Colombia posee un patrimonio documental rico, variado y valioso, conformado por manuscritos y algunos de los primeros libros impresos en Europa y América, periódicos, revistas, libros publicados hoy, fotografías, mapas, partituras, grabados, folletos, vídeos, discos, cintas e inclusive publicaciones digitales de años recientes (Biblioteca Nacional, 2009). De la materialidad de las unidades documentales, el soporte más representativo es el papel, material que presenta alta susceptibilidad frente a factores ambientales, biológicos, químicos y físicos. El biodeterioro de este soporte puede evidenciarse por la presencia de manchas, debilitamiento y faltantes estructurales, que pueden llevar a la pérdida total o parcial del documento (Archivo General de la Nación, 2010). La Biblioteca Nacional de Colombia actualmente trabaja en el Programa Nacional de Preservación (PNP) derivado del Decreto 763 del 2009 por el cual se reglamenta parcialmente la Ley 397 de 1997, modificada por la Ley 1185 de 2008 y la Ley 814 de 2003 en lo pertinente al Patrimonio Cultural de la Nación de naturaleza material y al Régimen Especial de Protección de los Bienes de Interés Cultural, que tiene como objetivo formular las directrices y el manejo para la salvaguarda y conservación de la memoria documentada que en cualquier soporte custodian bibliotecas tanto públicas como patrimoniales del país. En ese contexto, el Grupo de Conservación de la Biblioteca Nacional de Colombia ha encaminado esfuerzos para el desarrollo de investigaciones en el control de los diversos factores que atentan contra el documento como registro testimonial de la información. De acuerdo con lo anterior se llevo a cabo la investigación conjunta con la Pontificia Universidad Javeriana sobre el biodeterioro de las unidades documentales del Fondo Anselmo Pineda, ésta permitió conocer los diferentes microorganismos (hongos, levaduras y bacterias) implicados en la degradación del material, y se constituyó en el insumo para establecer el banco de cepas del laboratorio del Grupo de Conservación de la Biblioteca Nacional, el cual cuenta con aproximadamente 57 diferentes morfotipos de hongos, siendo los filamentosos los más representativos. El trabajo de aislamiento y conservación es una tarea permanente que ha permitido obtener nuevos microorganismos como bacterias, a partir de unidades con indicadores de biodeterioro. En ese escenario, y considerando que los microorganismos son un factor relevante de deterioro y generan afecciones en la salud de los funcionarios, el siguiente trabajo se llevo a cabo con el fin de evaluar diferentes agentes químicos como productos de control para el biodeterioro, conociendo la microbiota causante del deterioro de las unidades bibliográficas de la Biblioteca Nacional y evaluando además posibles efectos secundarios de éstos sobre la materialidad de los soportes. Igualmente, es un trabajo que contribuye en gran medida, a la mejora continua de los procedimientos en el ámbito de saneamiento documental, al apoyar la implementación del programa de rotación de productos desinfectantes, reducir el impacto ambiental por el uso inadecuado de los mismos y reducir los costos para la entidad, al conocer los productos de síntesis química más eficicaces (menor concentración). conservamos 5 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN En las bibliotecas se conocen las constantes amena- zas que generan las condiciones ambientales de los depósitos, los diferentes tipos de contaminación, las prácticas inadecuadas de almacenamiento, consulta y reproducción, entre otros (Biblioteca Nacional, 2009); sin embargo, no se suelen tomar las medidas de control necesarias. En ocasiones estos espacios ofrecen las condiciones microclimáticas (temperatura y humedad) adecuadas para el crecimiento de microorganismos e insectos y además debido a la naturaleza orgánica del papel, sustrato ideal para diferentes organismos, dichos lugares contribuyen a la proliferación de los mismos, siendo los hongos los microorganismos más comúnmente encontrados (Nieves et al., 2009). Los hongos son capaces de hidrolizar una gran variedad de polímeros, incluyendo la celulosa, como resultado de su eficiente complejo enzimático (Da Silva et al., 2006); así, los hongos celulolíticos pueden utilizar el papel como sustrato cuando se presentan condiciones medioambientales favorables consiguiendo destruir este soporte en corto tiempo y este proceso se conoce como biodeterioro (Adamo et al., 2003). Ante situaciones como ésta, que amenazan permanentemente las colecciones, es necesario desarrollar acciones preventivas y correctivas que incluyan, además de la preservación de la salud de los funcionarios y usuarios de las bibliotecas, la conservación de las colecciones bibliográficas y documentales. Específicamente frente al problema del biodeterioro, el grupo de Conservación de la Biblioteca Nacional implementó durante los últimos años el uso del agente antimicrobiano Timsen, para realizar procesos de saneamiento documental, en forma masiva y puntual, de acuerdo con el nivel de afectación de cada unidad bibliográfica. Aunque el Timsen, como amonio cuaternario, presenta ventajas en su uso como agente desinfectante sobre las unidades bibliográficas, su permanente utilización en los últimos años, como el de cualquier otro agente microbicida, ha podido generar un problema, pues la constante presión sobre los microorganismos puede desencadenar mecanismos de resistencia, y no sólo es una dificultad en la Biblioteca, lo es en general en el campo de la conservación de bienes culturales, ya que este producto se ha empleado indiscriminadamente. Esta particularidad se ha evidenciado en las rutinas de control de calidad post tratamiento del material documental, donde se ha observado crecimiento de colonias bacterianas y fúngicas luego de una semana de intervención. Aunado a lo anterior, el personal del Grupo de Conservación y Restauración de la Biblioteca Nacional de Colombia desconocía alternativas a este desinfectante y cuál era la concentración efectiva del producto para tratamientos de biodeterioro e inclusive de saneamiento ambiental. De acuerdo con lo anterior, es importante señalar que como medida preventiva en varios sectores industriales como el de alimentos, hospitales, entre otros, se ha implementado el programa de rotación de desinfectantes, siendo esta la mejor medida para evitar la aparición de fenómenos de adaptación y resistencia microbiana, especialmente cuando se define una situación de riesgo con la permanencia de microorganismos después de los procesos de saneamiento. conservamos 6 Así, este proyecto no sólo se propuso evaluar este amonio cuaternario sobre la microbiota propia de la Biblioteca Nacional de Colombia (bacterias, hongos filamentoso y levaduras), establecer su concentración de trabajo y así verificar su efectividad, sino además evaluar otros productos de control de síntesis química: Clinafarm spray®, Wescosan®, Plata coloidal y Etanol 75% como alternativa para eliminar los microorganismos y que no generen efectos secundarios sobre los materiales constitutivos del papel, percibidos en cambios en la resistencia de su estructura, variaciones en el pH y otros efectos en las propiedades físico-químicas. De esta manera, los resultados de la investigación contribuyen a formular alternativas de productos para implementar el programa de rotación de desinfectantes en la Biblioteca, para ejecutar las tareas de saneamiento documental y ambiental siguiendo una metodología idónea, en miras de asistencia técnica pertinente en esta materia para las bibliotecas a nivel local y regional del país. 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo General Evaluar cinco agentes microbicidas para el control del biodeterioro de las unidades documentales en soporte papel de la Biblioteca Nacional de Colombia, considerando los posibles efectos secundarios sobre el material. 4.2. Objetivos específicos 4.2.1. Evaluar la susceptibilidad de los microorganismos aislados con mayor frecuencia de los fondos documentales de la Biblioteca Nacional de Colombia frente a cinco agentes químicos: Timsen, Clinafarm®, Wescosan®, Plata coloidal y Etanol al 75% de acuerdo con la metodología establecida en la normatividad vigente (Dilución-neutralización). 4.2.2. Evaluar los posibles efectos secundarios de los productos de control sobre el papel, mediante pruebas físico-químicas como medición de cambios cromáticos y de azúcares reductores como indicador de la degradación del soporte. 5. MARCO TEÓRICO 5.1. Biocidas aplicados en el campo de la conservación y restauración del Patrimonio Documental. Las fuentes históricas constituyen la materia prima de la historia. Comprenden todos los documentos, archivos y objetos que trasmiten una información significativa referente a los hechos que han tenido lugar, especialmente en el pasado, los cuales han sido salvaguardados en variedad de soportes a lo largo del tiempo (Pascual, 2010). Así, se demuestra que el valor que los documentos representan es muy grande y por ello surge el interés de conservar y preservar ese legado, pues así se logran transmitir los testimonios de la historia que se han desarrollado con los años. El deterioro biológico de los documentos constituye uno de los motivos de pérdida de información y para enfrentar este problema han surgido diferentes metodologías, para la identificación de los agentes causales y su control; ejemplo de ello son la microscopía electrónica de barrido (Guiamet et al., 2011), espectroscopia FTIR (Zotti et al., 2008), conservamos 7 implementación de radiaciones gamma (Da Silva et al., 2006,), tratamiento con diferentes productos como mezclas de metil y propil parabenos (Neves et al., 2009), compuestos antifúngicos (BHT, BHA, azoles) e inhibidores de la quitinsintasa (Fabrii et al., 1997), entre otros. Uno de los agentes químicos de mayor empleo en las décadas de los 80’s y 90’s fue el timol, usado en forma cristalina como sólido sublimable. Diversos estudios indican que no elimina los propágulos de hongos ni las células bacterianas, puede ocasionar alergias e irritación en las vías respiratorias y además se le atribuyen efectos cancerígenos. Otros químicos como o-fenilfenol (OFF), formaldehido, p-formaldehido, pentaclorofenol, óxido de etileno y etanol al 70% también fueron ampliamente utilizados, sin embargo, su alta toxicidad, al igual que la del timol, y la baja efectividad del etanol al 70% contra bacterias, descartó su uso (Valentin, 2005; Tiano, 2002). En la actualidad, se ha recurrido al uso de agentes químicos fungicidas y bactericidas aplicados por imprimación, baño o por cámaras de gas. Sin embargo, numerosos trabajos evidencian que algunos de los microbicidas aún usados producen cambios en las propiedades físico-químicas de los soportes y son agentes capaces de ocasionar problemas medioambientales y de salud (Valentin, 2005). Por ello, se hace evidente la necesidad de evaluar agentes químicos responsables con el medio ambiente, efectivos en su propósito de biocontrol y que además no generen ningún impacto sobre los documentos históricos. Específicamente en la Biblioteca Nacional, el biodeterioro se ha tratado en forma puntual por imprimación, localmente sobre las zonas afectas. 5.2. Biocidas En general biocida, es un término que describe agentes químicos usualmente de amplio espectro que inactivan microorganismos. Son moléculas orgánicas o inorgánicas utilizadas para desinfectar, sanitizar o esterilizar objetos y superficies, y para preservar materiales del proceso de degradación microbiológica (Chapman, J, 2003; McDonnell & Russell, 1999). Los antisépticos son biocidas o productos que destruyen o inhiben el crecimiento de microorganismos en un tejido vivo, y los desinfectantes son igualmente biocidas pero generalmente son productos aplicados en objetos inanimados o superficies (McDonnell, G & Russell, D, 1999). Entre los factores que afectan la actividad antimicrobiana de los biocidas se encuentran el tiempo de contacto, la concentración, la temperatura, el pH, la presencia de materia orgánica y el tipo de microorganismo, considerando que existen diferencias en la estructura y fisiología de cada uno de ellos (Russell, A.D, 2003). De esta manera, los mecanismos de acción de los biocidas pueden dividirse en cuatro categorías: (i) los biocidas oxidativos participan en reacciones de oxidación mediada por radicales de la materia orgánica, (ii) agentes electrofílicos que incluyen iones inorgánicos como la plata, cobre y mercurio y biocidas orgánicos como el formaldehido y las isotiazolinonas, (iii) biocidas catiónicos como los amonios cuaternarios y alcoholes, que desestabilizan la membrana conduciendo a la rápida lisis celular y finalmente, (iv) agentes protonóforos, como algunos ácidos débiles como el sórbico y benzoico, que interfieren con la habilidad de la membrana celular para mantener el balance de pH, resultando en acidificación del interior de las células e interrupción del metabolismo (Chapman, J, 2003). 5.2.1. Alcoholes Los alcoholes presentan actividad antimicrobiana de amplio espectro contra bacterias en su forma vegetativa, virus y hongos, pero no tienen acción esporicida, pueden inhibir la esporulación y la germinación de esporas, pero este efecto es reversible. Por no ser esporicidas los alcoholes no son recomendados para esterilización, pero son ampliamente utilizados para desinfección de superficies y tejidos vivos. Bajas concentraciones también se utilizan como preservantes y para potencializar la actividad de otros biocidas. Generalmente la actividad antimicrobiana de los conservamos 8 alcoholes es baja a concentraciones por debajo del 50% y óptima en el rango de 60 a 90%. Su mecanismo de acción se basa en el daño a la membrana celular y denaturación de proteínas que conduce a la interrupción del metabolismo y lisis celular (McDonnell, G & Russell, D, 1999). 5.2.2. Aldehídos Están incluido dentro de los agentes electrofílicos, que reaccionan covalentemente con nucleófilos celulares, inactivando enzimas. Su acción se dirige a bacterias esporuladas y no esporuladas, afectando las uniones intermoleculares de los grupos aminos de las proteínas bacterianas (Russell, 2003). antisépticos y desinfectantes durante mucho tiempo. Su mecanismo de acción se basa en el daño a la membrana celular conduciendo a la lisis y fuga de los constituyentes intracelulares (McDonnell, G & Russell, D, 1999). Específicamente, los vapores de timol (compuesto fenólico) fueron ampliamente utilizados en labores de conservación y control del biodeterioro, sin embargo, debido a los riesgos que representan para la salud humana y a los efectos deletéreos causados en los soportes, fueron reemplazados por otro tipo de compuestos (Rakotonirainy & Lavédrine, 2005). 5.2.5. Amonios cuaternarios Las sales de plata y otros metales pesados como el cobre actúan sobre los grupos funcionales de las enzimas fúngicas, causan la liberación de iones de potasio del plasma y membrana citoplasmática. Los iones de plata pueden interactuar con los ácidos nucleídos específicamente las bases nitrogenadas del DNA (McDonnell, G & Russell, D, 1999). Los compuestos de amonio cuaternario (QAS) representan una familia de compuestos antimicrobianos, considerados como agentes activos catiónicos potentes por su actividad desinfectante, ya que son activos frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas, hongos y virus (Buffet-Bataillon et al.; 2011). Tienen como estructura básica al ión amonio (NH4), la cual al ser modificada, da lugar a las diferentes generaciones y su acción es atribuida a la inactivación de enzimas, desnaturalización de proteínas esenciales y la rotura de la membrana celular. La Plata coloidal fue evaluada al resultar ser una opción como producto innovador en el área de conservación documental en el país, pues su uso se ha visto encaminado al tratamiento de aguas y patologías humanas. Es eficaz frente a un amplio rango de bacterias (Gram positivas y Gram negativas), hongos filamentosos y levaduras. Frente a su acción, se han propuesto diferentes mecanismos como la inhibición de las enzimas implicadas en el proceso respiratorio de óxido-reducción celular, interacción con radicales tipo tiol presentes en membrana celular, modificación en el transporte celular de K+ e interacción con el ADN causando daño en los ácidos nucleicos (Chamakura, 2011). El Timsen, actualmente utilizado en los procesos de saneamiento llevados a cabo en la Biblioteca, es una sal mejorada de amonio con elevada actividad microbiocida, compuesto altamente estable, desprovisto de olor y en soluciones preparadas es incoloro (BAM, s.f.). Según la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer y la Administración de Salud y Seguridad Ocupacional, el Timsen no es carcinogénico, no es irritante ni emana gases, rompe la tensión superficial en un 56% por lo que proporciona un gran poder de penetración y además es 100% biodegradable (Alvarado et al., 2010). 5.2.3. Compuestos de Plata 5.2.4. Fenoles Debido a su actividad antimicrobiana, los compuestos fenólicos han sido utilizados como Wescosan® es un desinfectante catiónico a base de amonio cuaternario de cuarta generación. El dimetil di-octil-decil cloruro de amonio combinado con glutaraldehído y glioxal otorgan al producto un gran poder microbicida, resistencia a materia orgánica, conservamos 9 menor producción de espuma y mayor capacidad de biodegradación (West químicos, 2010). 6.1. Microorganismos de prueba - Criterios de inclusión 5.2.8. Azoles La actividad microbicida de los cinco agentes fue evaluada frente a tres morfotipos de hongos filamentosos: Cladosporium Morfotipo 1, Penicillium Morfotipo 6, Aspergillus Morfotipo 1, un morfotipo de levadura: Rhodotorula mucilaginosa y un morfotipo de Bacilos esporulados Gram positivos RI0020. Los azoles forman una familia heterogénea de fármacos que comparten la presencia de un anillo azólico central y con ello el mecanismo de acción antifúngico, que consiste en la inhibición de la síntesis del ergosterol. Estos actúan sobre los sistemas enzimáticos dependientes del citocromo P450, lo que interfiere en el metabolismo del lanosterol llevando a una disminución del ergosterol y, de forma secundaria, a un acúmulo de esteroles anómalos (esteroles 14-alfa-metilados) (Howard, 2006). Clinafarm spray® es un producto que contiene Enilconazol, un compuesto fungicida azol que inhibe la síntesis del ergosterol por el bloqueo en la acción de 14-alfa-demetilasa. Fue seleccionado debido a que los principales contaminantes sensibles a este compuesto son hongos tales como Aspergillus, microorganismos ampliamente recuperados de los ambientes y unidades documentales de la Biblioteca, aunque también se ha demostrado que posee actividad contra cocos y bacilos Gram positivos (Dragpharma, 2003). 6. METODOLOGÍA La metodología que se desarrolló está basada en la normatividad existente para la evaluación de desinfectantes químicos según AOAC International (Asociación oficial de Químicos Analistas), AFNOR (Association Française de Normalisation) e ICONTEC (Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación) bajo las Normas Técnicas Colombianas 5540 y 5473. Dichos microorganismos, fueron aislados a partir de los fondos documentales de la Biblioteca Nacional de Colombia por lo que son considerados agentes deteriorantes propios de las colecciones; la mayoría de estos corresponden a hongos filamentosos, siendo los géneros de mayor frecuencia de aparición Penicillium sp., Aspergillus sp. y Cladosporium sp, como se reporta en el estudio realizado por Manrique y Patiño (2011). Así mismo, la levadura Rhodotorula mucilaginosa y la bacteria Gram positiva esporulada fueron aisladas a partir de documentación con indicadores de biodeterioro sugiriendo su participación en el deterioro del material bibliográfico custodiado por la Biblioteca Nacional de Colombia. conservamos 10 6.2. Evaluación de la actividad microbicida de los agentes químicos: Timsen, Clinafarm®, Wescosan®, Plata coloidal y Etanol 75% 6.2.1. ensayo Preparación del Inóculo - Suspensión de 6.2.1.1. Bacterias y Levaduras Se realizaron suspensiones de los microorganismos en solución de cloruro de sodio - triptona (Anexo 2) con ayuda de perlas de vidrio y agitador Vortex. El número de células en la suspensión se ajustó a un valor comprendido entre 1,5 x 108 UFC/ml y 5,0 x 108 UFC/ml para el inóculo bacteriano y de 1,5 x 107 UFC/ml y 5,0 x 107 UFC/ml para el inóculo de levaduras, mediante espectrofotómetro (longitud de onda 620nm) conociendo que los valores idóneos de la densidad óptica se encuentran entre 0,150 y 0,460 para el inóculo bacteriano y de 0,200 y 0,350 para el inóculo de levaduras – NTC 5540 y NTC 5473 (ICONTEC, 2007). Posteriormente, para evaluar la viabilidad, se realizó recuento de células a partir de diluciones seriadas, sembrando en superficie las diluciones 10-6 y 10-7 sobre medio TSA (bacterias), y 10-5 y 10-6 sobre medio MEA (levaduras) por triplicado. Las placas se incubaron a 30 ± 1 °C durante 20h-48 h. 6.2.1.2. Hongos Filamentosos Se realizaron suspensiones de los microorganismos en solución estéril de polisorbato 80 al 0,05 % y se verificó bajo microscopio la ausencia de micelio y propágulos germinados. El número de células en la suspensión se ajustó a un valor comprendido entre 1,5 x 107 conidios/ml y 5,0 x 107 conidios/ ml, estimando el número de células por medio de cámara de New Bauer - NTC 5540 (ICONTEC, 2007). Luego se realizó recuento para evaluar la viabilidad de las células, a partir de diluciones seriadas y sembrando en superficie las diluciones 10-5 y 10-6 sobre medio MEA para los hongos Penicillium Morfotipo 6 y Cladosporium Morfotipo 1 y sobre DG-18 para Aspergillus Morfotipo 1, por triplicado. Las placas se incubaron a 30 ± 1 °C durante 72h-96h. Pasado el tiempo de incubación se realizó el recuento de UFC. 6.2.2. Soluciones de ensayo del producto Las soluciones de ensayo del producto se prepararon a diferentes concentraciones partiendo de la solución concentrada del producto (Timsen, Clinafarm spray®, Wescosan®). Las diferentes concentraciones correspondieron a: 1) la indicada por el fabricante; 2) una concentración por encima que corresponde al doble de la indicada en la etiqueta del producto y 3) una concentración por debajo que corresponde a la mitad de la recomendada. El solvente utilizado fue agua destilada. Estas soluciones del producto de ensayo se prepararon a una concentración 1,25 veces mayor de la deseada, pues durante el procedimiento el producto resulta diluido en un 80%. Como excepción, la Plata coloidal se evaluó una única concentración, partiendo del hecho de que el producto ya venía listo para usar. 6.2.3. Actividad microbicida de los agentes químicos comerciales 6.2.3.1. Condiciones experimentales a) Temperatura (°C): La temperatura obligatoria del ensayo fue de 20 °C (NTC 5540 y 5473) b) Tiempo de contacto (t, min): El tiempo de contacto obligatorio fue de 60 min (NTC 5540 y 5473); los tiempos de contacto adicionales correspondieron a 15 min y 30 min ± 10s. conservamos 11 c) Neutralizantes: el agente neutralizador que se utilizó tanto para los compuestos de amonio cuaternario como para el azol y la plata coloidal fue el recomendado por las NTC 5540 y NTC 5473 correspondiente a Polisorbato 80- LecitinaHistidina (ICONTEC, 2007) (Anexo 2). 6.2.3.2. Método de diluciónneutralización Para determinar la concentración de producto que tiene acción microbicida, se preparó una solución con 1,0 mL del inóculo microbiano, 1,0 mL de solución Cloruro de sodio -Triptona y 8,0 mL de una de las soluciones de ensayo del producto en un tubo estéril. Ésta se mantuvo a temperatura controlada de 20 ± 1 °C para el tiempo de contacto seleccionado t. Transcurrido el tiempo t, se tomó 1,0 mL de la mezcla de ensayo y se transfirió a un tubo contenido con 1,0 mL de agua destilada y 8,0 mL del neutralizador. La temperatura se mantuvo controlada a 20 ± 1 °C. Después de un tiempo de neutralización de 5min ± 10s, se tomó una muestra de la mezcla de ensayo neutralizada y se sembró en superficie: bacterias: TSA y hongos filamentosos y levaduras: MEA y DG18, por triplicado. Las placas fueron incubadas a 25 ± 1 °C por 72-96 horas en el caso de los hongos filamentosos, a 30 ± 1°C por 42-48 horas para las levaduras y a 30 ± 1°C por 24 horas para las bacterias. Después del tiempo de incubación, se realizó el recuento de UFC y los datos fueron enfrentados contra los resultados de viabilidad. Bajo las mismas condiciones se evaluaron todas las soluciones de ensayo del producto. tomó una alícuota de esta mezcla y se sembró en superficie: bacterias: TSA y hongos filamentosos y levaduras: MEA y DG-18, por triplicado. Las placas fueron incubadas a 25 ± 1 °C por 72-96 horas en el caso de los hongos filamentosos, a 30 ± 1°C por 4248 horas para las levaduras y a 30 ± 1°C por 24 horas para las bacterias. Pasado el tiempo de incubación se realizó el recuento de UFC. Los resultados obtenidos fueron comparados con los datos de viabilidad. 6.2.3.4. Verificación de la ausencia de toxicidad del neutralizador frente a los microorganismos de trabajo Para cerciorarse de que el agente neutralizador por si solo no causara ningún efecto sobre los microorganismos de prueba, se mezcló 8,0 mL de neutralizador y 1,0 mL de agua destilada en un tubo estéril, al cual se añadió 1,0 mL de suspensión del microorganismo ajustada a 102 células/mL. La temperatura se mantuvo controlada a 20 ± 1 °C durante 5 min ± 10 s. Transcurrido el tiempo, se tomó una alícuota de esta mezcla y se sembró en superficie, por triplicado. Las placas se incubaron a 25 ± 1°C por 72-96 horas en el caso de los hongos filamentosos, a 30 ± 1°C por 42-48 horas para las levaduras y a 30 ± 1°C por 24 horas para las bacterias. Pasado el tiempo de incubación se realizó el recuento de UFC. Los resultados obtenidos fueron comparados con los datos de viabilidad. 6.2.3.3. Prueba del neutralizador 6.2.4. Verificación de la actividad microbicida del Etanol 75% Para comprobar que el neutralizador lograba detener la acción del producto, se mezclaron partes iguales de una de las soluciones de ensayo del producto con el neutralizador (4,0 mL). Seguidamente, se añadieron 2,0 mL de suspensión del microorganismo ajustada a 102 células/mL. La temperatura se mantuvo controlada a 20 ± 1°C durante 5 min ± 10 s. Transcurrido el tiempo, se Para evidenciar el efecto microbicida que posee el etanol 75%, usado como solvente de los productos a evaluar en los procesos de saneamiento llevados a cabo en la Biblioteca Nacional de Colombia, se evaluó su actividad utilizando la metodología descrita en el numeral 6.2.3.2. Esto permitió relacionarlo como posible agente potenciador de los demás productos usados en los procesos de saneamiento. conservamos 12 6.2.5. Interpretación de los resultados La actividad microbicida de los agentes químicos comerciales se calculó bajo los parámetros establecidos por la normatividad Internacional vigente, trazable a las NTC en Colombia. Así, para cada concentración del producto y cada condición experimental, se calculó la Reducción (Log R) en el número de UFC/mL en la suspensión del ensayo N. Seguidamente, para cada microorganismo del ensayo, se registró la concentración más baja del producto que cumplió con un Log R= 4 en el caso de actividad fungicida y Log R= 5 para la actividad bactericida (NTC 5540 Y 5473). La concentración más baja del producto activo frente al microorganismo, es la concentración microbicida determinada según la normatividad. 6.3. Pruebas Físico químicas para establecer posibles efectos secundarios sobre el soporte Para llevar a cabo la evaluación de los posibles efectos secundarios que el agente químico podría generar sobre el papel, se utilizaron patrones de soporte en papel manual e industrial suministrados por los restauradores del grupo de conservación de la Biblioteca Nacional de Colombia. Los productos utilizados para llevar a cabo estos ensayos fueron seleccionados de acuerdo con los resultados obtenidos bajo el numeral 6.2. 6.3.1. Selección del material en soporte papel para los ensayos Para llevar a cabo los ensayos físico-químicos se utilizaron dos tipos de papel (manual e industrial) sin técnicas de registro. La selección del material fue aleatoria y se tuvo en cuenta que estuvieran libres de cualquier signo de biodeterioro y fueran lo más homogéneas. La medida establecida para las probetas o muestras de papel correspondió a 3cm x 5cm. 6.3.2. Envejecimiento acelerado de las muestras de papel Para simular el envejecimiento natural de los soportes tipo celulósico, como el papel, las muestras fueron sometidas a envejecimiento acelerado (Norma Tappi T453) considerando el parámetro temperatura, pues es uno de los principales factores abióticos que pueden modificar las matrices en condiciones inadecuadas de almacenamiento. Esta etapa se desarrolló en el Laboratorio del Grupo de Conservación y Restauración del Archivo General de la Nación bajo la asesoría de la Química Natalia Delgado. Las muestras fueron puestas en contacto con los agentes químicos por imprimación. La concentración del producto utilizada fue seleccionada bajo los resultados obtenidos en la primera fase del proyecto correspondiente a la evaluación de la actividad microbicida de los agentes químicos. Se aseguró en todos los casos de tener una muestra de papel sin desinfectante como control. Para el envejecimiento, las muestras se dispusieron en el horno a una temperatura constante de 105±2 °C. Los tiempos (en horas) seleccionados de exposición a esta condición fueron de 72±0.75 y 144±1.5 correspondientes a 25 y 50 años respectivamente, de envejecimiento natural. Finalmente, con el fin de evaluar degradación del soporte a lo largo del tiempo como efecto secundario por acción de los agentes químicos, se realizó la cuantificación de azucares reductores por el método colorimétrico del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). Inicialmente se realizó una curva patrón mediante la cuantificación de diferentes concentraciones de glucosa, preparando las muestras a partir de una solución concentrada de glucosa 40mM. La metodología usada para la medición de estos azúcares se encuentra descrita en el Anexo 4. Las determinaciones de absorbancia se realizaron a una conservamos 13 longitud de onda de 540nm, ajustando el cero de absorbancia con el blanco de la prueba. Para cuantificar azúcares reductores en las muestras de papel, se preparó un extracto acuoso con el soporte, utilizando 0.17g del papel y 2.55mL de agua destilada. Para ello, la probeta fue troceada en pequeños fragmentos lo que facilitó su maceración con agua destilada. La mezcla fue dejada en reposo durante 24 horas y posteriormente centrifugada. En último lugar, se realizó la cuantificación siguiendo la metodología descrita en el protocolo. 6.3.3. Cambio cromático Se evaluó el cambio en el color del soporte al tiempo cero y para los dos tiempos mencionados anteriormente. Para ello se realizó un registro fotográfico evidenciando el cambio cromático como un efecto directo del producto sobre el material (contacto agente químico-papel). Esta etapa se desarrolló en el Laboratorio del Grupo de Conservación de la Biblioteca Nacional de Colombia bajo el asesoramiento de la Fotógrafa documental Constanza Medina, y bajo las condiciones de captura ya estandarizadas con las que trabaja la Biblioteca (Anexo 3). 6.4. Estrategia de análisis Para facilitar el análisis estadístico de los datos obtenidos en el estudio, se procedió a codificar la información para cada tratamiento realizado. Así, se establecieron códigos de 6 dígitos organizados de la siguiente forma (Tabla 1): Tabla 1. Codificación de los tratamientos biológicos DÍGITO 1 DÍGITO 2 DÍGITO 3 y 4 DÍGITO 5 y 6 DÍGITO 5 y 6 Microorganismo Agente Concentración Tiempo Tiempo 0,5:100 5 15 1:100 10 2:100 20 0,3% 30 0,6% 60 1,2% 12 0,5g/L 5 1g/L 10 2g/L 20 Aspergillus Morfotipo 1 Cladosporium Morfotipo 1 Penicillium Morfotipo 6 1 2 3 Clinafarm Wescosan Timsen 1 2 3 Rhodotorula mucilaginosa 4 Plata Coloidal 4 5ppm 50 Bacilo Gram positivo RI0020 5 Etanol 5 75% 75 30 60 conservamos 14 Así, por ejemplo el código 445015 significa que el procedimiento metodológico fue realizado con Rhodotorula mucilaginosa frente al agente químico Plata coloidal a una concentración de 5ppm, y con un tiempo de contacto de 15 minutos. Los resultados de la actividad microbicida de los productos sobre los diferentes géneros microbianos, fueron estadísticamente evaluados mediante una prueba de comparación de medias (ANOVA de un sólo factor) y analizados mediante de la prueba PostHoc de Duncan, en el programa SPSS. Esto nos permitió conocer si existían diferencias significativas entre los tratamientos, para cada agente químico y cada microorganismo evaluado. Para la presentación de los resultados se usó estadística descriptiva (comparativa usando tablas, gráficos y medidas descriptivas como el promedio y la desviación estándar) utilizando el programa SigmaPlot 12.0. De la misma forma, los resultados obtenidos en los ensayos físico-químicos fueron codificados (Tabla 2) y sometidos al mismo análisis estadístico y presentación de resultados. Tabla 2. Codificación de los tratamientos fisicoquímicos DIGITO 1 Tipo de papel DIGITO 2 Agente Manual 1 Industrial 2 Clinafarm Wescosan Timsen 1 2 3 DIGITO 3 y 4 Concentración DIGITO 5 y 6 Tiempo de envejecimiento 0,5:100 0,3% 0,5g/L 25 años 50 años 05 03 05 25 50 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1. Evaluación de la actividad microbicida de los agentes químicos: Timsen®, Clinafarm®, Wescosan®, Plata coloidal y Etanol 75%. Para iniciar, se observó que el agente neutralizador seleccionado cumplió con su objetivo de detener la actividad microbicida de los agentes, pudiendo así realizar una medida exacta de los microorganismos sobrevivientes después de los tratamientos probados; los resultados mostraron que después de cinco minutos de contacto a 20°C la suspensión mantuvo el número de células con la que se partió (resultados no mostrados). De igual forma, se evidenció que el agente neutralizador utilizado no era tóxico para ninguno de los microorganismos de prueba observándose que no hubo reducción logarítmica de la suspensión utilizada para el ensayo (resultados no mostrados). Los resultados de esta primera fase se dividieron en dos partes. El primer análisis estadístico relacionó los datos de reducción (LogR) obtenidos por cada producto frente a los cinco microorganismos de prueba. Para los cinco casos, ANOVA mostró que existen diferencias significativas entre los resultados para cada microorganismo, al obtenerse datos de significancia menores a 0.05 (Anexo 6). La prueba de comparaciones múltiples PostHoc de Duncan dividió los resultados LogR en subconjuntos de acuerdo con la cantidad de logaritmos reducidos y que para los cinco diferentes casos se disponen desde la A hasta la N. Las figuras 1A, 1B, 1C, 1D y 1E presentan dichos resultados. conservamos 15 A1 A2 conservamos 16 A3 A4 A5 Figura 1. Resultados de reducción logarítmica para los cinco microorganismos de prueba frente a A1) Clinafarm, A2) Wescosan, A3) Timsen, A4) Plata Coloidal y A5) Etanol 75%. conservamos 17 Clinafarm spray®, Wescosan® y Timsen® muestran actividad contra todos los microorganismos de prueba. La plata coloidal mostró un bajo espectro al evidenciarse actividad sólo frente al hongo xerófilo Aspergillus Morfotipo 1 y Rhodotorula mucilaginosa (Figura A4). De igual forma, se observa que el Etanol 75% no es activo frente al Bacilo Gram positivo (Figura A5). Para todos los productos se observa que no hay diferencias importantes entre los resultados obtenidos para cada concentración evaluada y el tiempo de contacto al que estuvo expuesto el microorganismo con el producto (Figura 1). Sin embargo, las concentraciones por debajo de la recomendada por el fabricante suelen ser las que menor actividad presentan en conjunto con el tiempo de contacto más bajo, lo cual generalmente no compromete la eficacia de los productos evidenciada en la reducción de 4-5 logaritmos como lo exige la normatividad. La única excepción se da frente al bacilo Gram positivo donde los mayores tiempos de contacto con el producto Clinafarm muestran la reducción celular exigida en la norma. La segunda parte del análisis estadístico relacionó los datos de reducción (Log R) obtenidos para cada microorganismo frente a los cinco productos evaluados. Al igual que en la primera parte, ANOVA reveló que existen diferencias significativas entre los resultados para cada agente químico, al mostrar datos de significancia menores a 0.05 (Anexo 7). La prueba de comparaciones múltiples PostHoc de Duncan dividió los resultados LogR en subconjuntos de acuerdo con la cantidad de logaritmos reducidos y que para los cinco diferentes de distribuyen desde la A hasta la K. Las figuras 2A, 2B, 2C, 2D y 2E presentan dichos resultados. B1 conservamos 18 B2 B3 conservamos 19 B4 B5 Figura 2. Resultados de reducción logarítmica para B1) Aspergillus M1, B2) Cladosporium M1, B3) Penicillium M6, B4) Rhodotorula mucilaginosa y B5) Bacilo Gram positivo RI0200, frente a los cinco agentes químicos. conservamos 20 De acuerdo con lo anterior, se evidencia que cada microorganismo presenta mayor susceptibilidad a ciertos principios activos. Así, se puede observar que en general, los hongos filamentosos Cladosporium M1 y Penicillium M6 son susceptibles a todos los productos (Figura 3 – B2 y B3), exceptuando a la Plata coloidal, y el hongo xerófilo Aspergillus M1 es sensible frente a todos los productos evaluados (Figura 3 – B1); Rhodotorula mucilaginosa es más sensible al efecto de los QAS y en menor grado al Enilconazol (principio activo del Clinafarm) (Figura 3 – B4) y por su lado, el bacilo Gram (+) es más susceptible al Wescosan, QAS de cuarta generación, y a la mayor concentración de Timsen (Figura 3 – B5). Adicionalmente, y de acuerdo con lo propuesto en la normatividad, se determinó la concentración microbicida de cada agente químico para cada microorganismo, registrando la concentración más baja del producto que cumplió con un Log R= 4 en el caso de actividad fungicida y Log R= 5 para la actividad bactericida (NTC 5540 Y 5473). Tabla 3. Concentración microbicida para cada agente químico evaluado de acuerdo con el microorganismo de prueba. Microorganismo Agente químico Concentración microbicida (CM) Aspergillus Morfotipo 1 Clinafarm spray® 0,5:100 Wescosan® 0,3% Timsen ™ 0,5 g/L Plata Coloidal 5 ppm Clinafarm spray® 0,5:100 Wescosan® 0,3% Timsen ™ 0,5 g/L Plata Coloidal --- Clinafarm spray® 0,5:100 Wescosan® 0,3% 0,3% Timsen ™ 0,5 g/L Plata Coloidal --- Clinafarm spray® 0,5:100 Wescosan® 0,3% Timsen ™ 2 g/L Plata Coloidal 5ppm Clinafarm spray® 2:100 Wescosan® 0,3% Timsen ™ 0,5 g/L Plata Coloidal --- Cladosporium Morfotipo 1 Penicillium Morfotipo 6 Rhodotorulla mucilaginosa Bacilo Gram + Esporulado Partiendo de lo anterior, se hace la relación de cada agente químico frente a cada microorganismo. Si bien es conocido que los azoles tienen especificidad hacia hongos filamentosos y levaduras, considerando que su mecanismo de acción se relaciona con la inhibición en la síntesis de ergosterol y toxicidad directa sobre los fosfolípidos presentes en membrana, se observó efecto microbicida sobre la suspensión bacteriana al reducir la concentración celular en 4 logaritmos (Figuras A1 y B5). Aunque no hay muchos estudios que muestren la actividad antibacterial de este antifúngico, Rostom y col. (2009) atribuyen a los azoles una actividad efectiva en la inhibición de la proteína transportadora enoil- acil reductasa (Fabl) un novedoso target antibacteriano. En su estudio, los resultados revelaron que los compuestos azoles evaluados tuvieron efecto antibacterial sobre bacterias Gram positivas y Gram negativas, siendo las Gram positivas las más sensibles a su actividad microbicida, en especial S. aureus y B. subtilis (Rostom et al., 2009). Por otro lado, en el estudio de Emami y col. (2008) se observa que los valores de concentración del producto efectivas frente a levaduras como Candida albicans y Saccharomyces cerevisiae y hongos filamentosos como Aspergillus niger fluctúan entre valores de 0.25 y 32 μm/mL, siendo las levaduras los microorganismos más sensibles al efecto de los azoles. Esto difiere de los resultados obtenidos en este estudio, pues Rhodotorula mucilaginosa resultó ser el microorganismo menos sensible a la acción del Enilconazol; esta resistencia puede asociarse a mecanismos celulares y moleculares, por ejemplo, alteraciones en la enzima diana (14-α-esterol desmetilasa), disminuyendo con ello la afinidad de la enzima por los azoles, alteración en otras enzimas de la ruta de biosíntesis del ergosterol o a bombas de flujo activas que liberan el antifúngico al exterior de la célula (Cowen et al., 2002; Marichal et al, 1999). Comparándose el valor conservamos 21 de la concentración microbicida (CM) para el azol de éste estudio, que fue de 1.5 μm/mL, con los valores obtenidos en el reporte de Emani y col., se puede mencionar que Clinafarm se encuentra en el rango de los más efectivos, frente a los tres diferentes tipos de microorganismos. Los amonios cuaternarios (QAS), son desinfectantes ampliamente usados en diferentes industrias, pues su naturaleza anfifílica y por lo tanto sus propiedades surfactantes los hace eficaces, reduciendo la tensión superficial y atrayendo cargas negativas como las encontradas en la superficie bacteriana, causando finalmente un daño citolítico (Caillier et al., 2009). Los resultados de este estudio demuestran que tanto el Timsen como el Wescosan son desinfectantes efectivos contra los cinco microorganismos evaluados, siendo el Wescosan el agente químico que mejores resultados presentó logrando reducir suspensiones microbianas entre 5 y 6 logaritmos (Figura A2)(Anexo 9). La mayor eficacia del Wescosan puede atribuirse a que éste agente químico es un QAS de cuarta generación, lo que significa que posee cadenas dialquílicas lineales y contrario al Timsen, no posee anillo bencénico lo que contribuye a su mayor poder microbicida (West químicos, 2010). Además, este agente presenta una pequeña cantidad de glutaraldehído, compuesto de alto espectro y actividad esporicida (McDonell y Russel, 1999), que potencia la actividad del principio activo. Al igual que en este estudio, Cailler y col. reportan en su investigación que los QAS presentan una actividad antibacteriana y antifúngica óptima, en su caso contra los microorganismos evaluados Staphylococcus aureus, Aspergillus niger y Candida albicans, en concentraciones aproximadas de 253μg/L, 140μg/L y 261μg/L respectivamente, sin embargo Pseudomonas aeruginosa, la bacteria Gram negativa usada, fue un poco más resistente al efecto microbicida evidenciándose efecto con concentraciones aproximadas de 324μg/L. Ellos confieren el efecto de los diferentes QAS a la naturaleza de la cadena lateral de hidrocarburos reportando que la longitud de la cadena de hidrocarburos juega un papel importante en la actividad biológica debido a su influencia en la hidrofobicidad general de los compuestos (Caillier et al., 2009). Aún así, es importante mencionar que para este estudio la CM para el Wescosan es de 300mg/L y para el Timsen de 200mg/L, concentraciones aproximadamente 1000 veces más alta que las evaluadas por Cailler y col. (2009) y que por ello pueden haberse obtenido resultados favorecedores. Estos resultados permiten considerar a los QAS como productos para los procesos de saneamiento documental, pues su espectro es alto, la concentración efectiva es baja, y sus costos son relativamente bajos, puntos que se tienen en cuenta dentro de los procesos de conservación y los administrativos de la biblioteca. Si bien llegaran a causar daños importantes en las matrices documentales, comprobándose esto con la evaluación de otros parámetros como humedad relativa y exposición a radiaciones UV, podrían tenerse en cuenta para los procesos de saneamiento ambiental de los depósitos. Por otro lado, la evaluación de la Plata Coloidal mostró resultados interesantes al evidenciarse efecto microbicida solamente sobre Aspergillus Morfotipo 1, hongo xerófilo aislado del fondo documental Anselmo Pineda y la levadura Rhodotorula mucilaginosa (Figura A4). Contrario a lo esperado, no se observó reducción logarítmica en la solución microbiana para los hongos filamentosos Penicillium Morfotipo 6, Cladosporium Morfotipo 1 y el Bacilo Gram positivo esporulado, encontrándose reportes en los que las nanoparticulas de plata causan un efecto adverso sobre bacterias Gram positivas como Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis en soluciones con concentraciones mayores a 2 μg/mL de Ag (Zhang et al., 2008) y sobre hongos levaduriformes como Candida glabrata y Saccharomyces cerevisiae en concentraciones de 5 μm/mL (Rodríguez et al., 2011). Aunque la concentración del producto evaluado es superior a la utilizada por Zhang y col., e igual a la utilizada por Rodríguez y col. se evidenció inactividad frente a estos tres microorganismos. Se ha descrito que la actividad antimicrobiana de la Plata depende, además de la estabilidad coloidal, directamente del tamaño y forma de la partícula, pues partículas más pequeñas tienen mayor proporción de superficie específica en relación al volumen y más átomos de metal en la superficie disponibles para interactuar con la membrana de los microorganismos (Chamakura et al., 2011; Ruparelia et al., 2008; Zhang et al., 2008). Conforme conservamos 22 a esto podría indicarse que el agente químico usado no presentó las condiciones de tamaño y forma de partícula necesarias para generar efectos adversos sobre todos los microorganismos del estudio. reporta Tiano (2002), este producto ya ha sido utilizado en procesos de saneamiento documental, pero suele ser descartado al observarse inactividad frente a bacterias. Respecto a los resultados con Cladosporium Morfotipo 1 (Anexo 8), la resistencia puede atribuirse a la presencia de melanina en sus esporas, pues es sabido que este compuesto es importante para la supervivencia y la longevidad de los propágulos (Urán y Cano, 2008). Se ha sugerido que la presencia de melanina en muchos microorganismos genera mayor resistencia a los compuestos antimicrobianos y principalmente a los antimicóticos, y es por ello que los hongos dematiáceos suscitan un especial interés entre los otros hongos que sintetizan melaninas pues estos presentan mayor resistencia a los antimicóticos disponibles (Urán y Cano, 2008). A pesar de los resultados y considerando que los hongos xerófilos son una población muy importante de microorganismos en las bibliotecas, la Plata coloidal se descarta como un desinfectante a usar en los procesos de saneamiento, pues su espectro es bajo y otros desinfectantes como los amonios cuaternarios pueden realizar el mismo efecto de inhibición. 7.2. Pruebas Físico químicas para establecer posibles efectos secundarios sobre el soporte. Finalmente, de acuerdo con lo esperado el etanol 75% mostro buena actividad frente a los hongos pero nula acción sobre el bacilo Gram positivo. Aunque McDonell y Russel (1999) mencionan que los alcoholes exhiben actividad frente a bacterias en su forma vegetativa incluida Micobacterium, en concentraciones superiores al 50%, relacionan dicha actividad a alcoholes de tipo isopropil, que difiere del evaluado en el estudio siendo un etil-alcohol, y a ello puede deberse la diferencia en resultados. También reportan que los alcoholes pueden inhibir la germinación de esporas, pero que dicha acción puede ser reversible, lo que difiere de este estudio, pues la mejor actividad se presentó frente a hongos filamentosos (Figura A5). Para el caso de la Biblioteca Nacional de Colombia, su uso puede encaminarse como potenciador de otros agentes, pues aunque este agente es activo contra hongos filamentosos, población aislada con mayor frecuencia de los fondos documentales y depósitos, las bacterias también constituyen un importante grupo que hay que controlar. Además, como lo La realización de estos ensayos se llevo a cabo con tres productos: Clinafarm®, Wescosan® y Timsen®. Esta selección se baso en los resultados obtenidos para la primera fase, justificándose en las buenas actividades de los agentes y su espectro de acción. De igual manera, las concentraciones de elección correspondieron a las obtenidas bajo los parámetros de la norma como “concentración microbicida” expuestas en la Tabla 3, siendo las más bajas (la mitad de la concentración recomendada por el fabricante) las utilizadas. Los resultados del análisis estadístico para la cuantificación de azúcares reductores mediante la técnica del ácido dinitrosalicilico (Anexo 10) muestran que no hay diferencias significativas en la cantidad de azúcares del soporte después de aplicado el producto con tiempos de envejecimiento A1 de 25 y 50 años, encontrándose valores de significancia superiores a 0.05. Aún así, es necesario mencionar que los valores de la desviación estándar son altos y por lo tanto se difiere la existencia de diferencias importantes entre las réplicas de los experimentos (Figura 3). Esto se puede relacionar con posibles errores de manipulación durante el proceso y con la heterogeneidad de los extractos acuosos de las muestras, pues al analizar la composición de las matrices de papel se observa que estos soportes estan compuestos por material fibroso y aditivos funcionales como encolantes, abrillantadores ópticos y agentes consolidantes, que pueden variar en composición para cada tipo de papel, y en cantidad para cada trozo del mismo (Vaillant y Valentin, 1996). Lo anterior, también puede explicar la posible existencia de interferentes de la reacción de DNS, al desconocerse la composición exacta de las muestras de papel. conservamos 23 Contrario a lo esperado se evidencia que la cantidad de azúcares reductores no es variable a lo largo del tiempo, tanto en papel manual e industrial después de la impregnación del producto, pues los datos de los controles mostraron el mismo comportamiento (Figura 3 - B1 y B2). Con estos resultados se infiere que los agentes quimicos evaluados para el control del biodeterioro no son agentes causales de la degradación del soporte, o si bien lo son, la degradación no esta relacionada con la descomposición de la célulosa, principal componente del papel. De existir degradación en el soporte, ésta podría atribuirse a factores como la temperatura (termodegradación), radiaciones UV (fotodegradación) y ataque de microorganismos y/o sus metabolitos (biodegradación), que en todos los casos puede favorer la hidrólisis ácida o alcalina del material celulósico, y su oxidación (Vaillant y Valentin, 1996). Aunque para la cuantificación de azúcares reductores, se usa el método de DNS con mayor frecuencia debido a su rapidez, conveniencia y menor toxicidad (Colombatto y Beauchemin, 2003), en este estudio se recomienda el uso de técnicas más sensibles, como la Técnica de Somogyi-Nelson, capaz de detectar ázucares reductores en concentraciones desde 20μg/mL (González y Castellanos, 2003), pues se conoce que el método de DNS presenta una desventaja, además de una sensibilidad mil veces menor, al no existir una estequiometría relacionada con el desarrollo de color, ya que por lo general, los equivalentes reductores de los oligómeros se incrementan al aumentar el grado de polimerización de los azúcares y por ello el número real de grupos reductores hemiacetal es sobreestimado (Haltrich et al., 1996). Lo anterior permite explicar por qué se evidenciaron mayor cantidad de azúcares reductores en el papel industrial, pues se sabe que la diferencia existente entre estos dos tipos de papel es primordialmente el tipo de fibra vegetal usada, siendo para el papel manual el algodón esparto y para el industrial las fibras madereras (Bringas, s.f ). Esto también se puede explicar, al conocerse que los papeles elaborados a partir de fibras madereras son más susceptibles a la degradación tanto por factores bióticos y abióticos, pues la lignina presente es sensible a procesos de hidrólisis y oxidación (Vaillant y Valentin, 1996). Figura 3. Concentración de glucosa (mM) en papel impregnado con 3 agentes químicos para papel industrial y manual después de 25 años y 50 años de envejecimiento. conservamos 24 Los resultados de cambio cromático, mostraron datos interesantes al evidenciarse cambio en el color del soporte después del envejecimiento acelerado únicamente para papel manual, en especial aquellas muestras impregnadas con QAS. Como se observa en las Figura 4 y 5, la muestra presenta bordes amarillos que son notorias al ser comparadas con las muestras control (Anexo 11). Este cambio de color se puede relacionar con presencia de cloro en la composición de los amonios cuaternarios, siendo el principio activo del Timsen es el Alquil-Dimetil-Bencil-Amonio Clorado y para el Wescosan es el Dimetil-Di OctilDecil Cloruro de Amonio, y se sabe que residuos de este elemento pueden generar ácido clorhídrico (HCl), un ácido fuerte, que al disociarse en H+ Cl‐, genera un protón que puede romper el enlace B‐ acetal de la celulosa, principal componente del papel manual. Dicha presencia de ácidos en el papel pueden difundirse, atacando las zonas amorfas de la celulosa, dado que contienen agua intermolecular, y esto lleva a la pérdida de resistencia mecánica del papel y por supuesto a su amarillamiento (Odor, s.f.; Calderón, 2003). Otro factor importante, y reportado en la fabricación de papel manual, es la presencia de A polímeros complejos como las proteínas presentes en las colas animales empleadas en el proceso de impermeabilización del papel (Asunción, 2004) y de sustancias utilizadas como aglutinantes, entre ellas, la gelatina (Alarcón, s.f ) que además de favorecer el ataque microbiológico favorecen el cambio cromático del mismo, pues retienen el cloro acumulándose lentamente y finalmente amarillando y debilitando el soporte (Cotton Incorporated, 2002). La ausencia de cambio cromático en el papel industrial puede deberse a la diferencia de fibras usadas en su elaboración del mismo, pues aunque éste presenta en su estructura lignina aportada por las fibras madereras, y es sabido que este compuesto posee una región molecular en la que la diferencia de energía entre dos orbitales atómicos cae en el rango del espectro visible de los grupos cromóforos, a los que se atribuye el amarillamiento (Piantanida et al., 2005), las condiciones experimentales evitaron la exposición de las muestras a rayos UV que pudiesen afectar los resultados de cambio cromático proporcionados exclusivamente por los agentes químicos. B Figura 4. Captura fotográfica detallada para muestra de papel manual impregnado con A) Timsen 0.5g/L y B) Wescosan 0.3% después de 25 años de envejecimiento. conservamos 25 posee actividad frente a al bacilo Gram positivo relacionando dicho efecto con la inhibición de la proteína transportadora enoil- acil reductasa. Por otra parte, la Plata Coloidal no resultó ser un agente microbicida efectivo frente a los microorganismos de prueba, propios de los fondos documentales y ambientes de la Biblioteca Nacional de Colombia, encontrado que su espectro de acción es el más bajo de todos los productos evaluados. La resistencia de Cladosporium frente a este agente se atribuye a la presencia de melanina en sus esporas, pues se sabe que este compuesto juega un papel importante para la supervivencia y la longevidad de las mismas. Finalmente, y conforme a lo esperado, no se observó actividad por parte del Etanol 75% frente al Bacilo Gram positivo. Figura 5. Captura fotográfica detallada para muestra de papel manual impregnado con A) Timsen 0.5g/L y B) Wescosan 0.3% después de 50 años de envejecimiento. 8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 8.1. Conclusiones En general todos los productos evaluados presentaron actividad al menos frente a dos de los microorganismos con los que se enfrentaron. Sin embargo, se evidenció que los QAS son los más efectivos logrando actuar frente a los cinco microorganismos y en general cumpliendo con lo exigido por la normatividad al reducir entre 4 y 5 logaritmos las suspensiones de ensayo. Diferente a lo esperado, se observó que el Clinafarm Respecto a las pruebas físico químicas realizadas para evidenciar cambios en el soporte por la aplicación de estos productos, se encontró que los QAS son generadores de amarillamiento en papel manual, tanto después de 25 años como 50 años de envejecimiento, lo cual se atribuye a la presencia de cloro en sus principios activos, que puede formar compuestos ácidos favoreciendo el debilitamiento del soporte y generando cambios de color y que además puede acumularse gradualmente en los componentes proteicos, presentes en aditivos funcionales como colas animales y aglutinantes usados especialmente en la fabricación de papel manual, generando así el amarillamiento. Por el contrario, se observó que ninguno de los compuestos genera cambios de color en papel industrial después de 25 y 50 años de envejecimiento. Finalmente, se evidencia que la cuantificación de azúcares reductores no se puede relacionar con la degradación del soporte, pues no se encontraron diferencias significativas en la cantidad de azúcares presentes en las muestras sometidas a tratamiento y los controles. Por lo anterior, se concluye que los productos Wescosan y Timsen pueden ser utilizados para el control del biodeterioro sobre soporte papel tipo industrial, y el producto Clinafarm puede ser utilizado sobre papel manual, todos a la mitad de la concentración recomendada por el fabricante. conservamos 26 8.2. Recomendaciones 1. En caso de optar por la utilización de los productos aquí evaluados, se recomienda efectuar análisis de envejecimiento acelerado con los parámetros de humedad relativa y radiaciones UV, para relacionar posibles efectos de éstos factores y los productos químicos sobre la matriz del soporte papel. 2. Se recomienda: realizar la evaluación de los productos utilizando como solvente Etanol 75%, para así evidenciar si existe un efecto sinérgico entre los agentes químicos, o si definitivamente el etanol no potencia la actividad de los mismos. 3. Se recomienda: realizar un análisis de fibras de papel antes y después de la aplicación del agente químico para evidenciar cambios más específicos en la composición de las matrices. 4. Se recomienda: utilizar técnicas más sensibles para la medición de azúcares reductores, que puedan detectar cantidades pequeñas de los mismos y así poder relacionarlas con la descomposición del soporte. 5. Se recomienda: realizar evaluación de los productos para el control del biodeterioro frente a los microorganismos de interés simulando las condiciones in situ. 6. Se recomienda: evaluar la pertinencia de implementar un programa de rotación de desinfectantes, considerando como alternativa los productos analizados en este estudio. 7. Dada la posibilidad de efectos secundarios en el soporte papel con agentes químicos, se recomienda estudiar productos de síntesis natural para el control del biodeterioro. conservamos 27 BIBLIOGRAFÍA Adamo, M.; Maddauga, G.; Missini, G.; Tronelli, P. Susceptibility of cellulose to attack by cellulolitic microfungi after gamma irradiation and ageing. Restaurator. 2003, 24: 145-151. Alvarado, G.; Sosa, A.; Florez, F.; De la Garza, M. Determinación de la efectividad del Timsen, Hipoclorito de sodio al 2.6% e hidróxido de sodio al 0.1N en la limpieza de conductos radiculares. Revista Odontológica Latinoamericana. 2010, 2 (1): 19-23. Archivo General de la Nación. 2010. Evaluación de la actividad antimicrobiana de tres extractos de plantas y su efecto sobre algunas propiedades del papel y de las tintas. http://archivogeneral.gov.co/?idcategoria=3196. Consultado en Junio de 2011. Asunción. J. 2004. El papel. Técnicas y métodos tradicionales de elaboración. Segunda edición. Parramón Ediciones .Barcelona, España. pp 102-111. BAM S.A. Hoja de datos de seguridad–Timsen. http://bam.com.co/.../hoja20%de20%datos20%de20% seguridad20%timsem.doc. Consultado en Junio de 2011. Biblioteca Nacional de Colombia. 2009. Plan Nacional de Patrimonio bibliográfico y documental. http:// bibliotecanacional.gov.co/recursos_user//programa_nacional_preservacion_proy09.pdf. Bringas J. s.f. Causas del deterioro del patrimonio documental. http://www.adabi-ac.org/ccre/descargas/art7_ deterioro.pdf. Consultado en Mayo de 2010. Browining, B. Analysis of paper. Primera Edición. Marcel Academy, Inc. New Acad, Estados Unidos. 1969, 80p. Buffet-Bataillon, S.; Branger, B.; Cormier, M.; Bonnaure-Mallet, M.; Jolivet-Gougeon, A. Effect of higher minimum inhibitory concentrations of quaternary ammonium compounds in clinical E. coli isolates on antibiotic susceptibilities and clinical outcomes. Journal of Hospital Infection. 2011, 79 (2): 141-146Cabrera, C.; Gómez, R.; Zúñiga, A. La resistencia de bacterias a antibióticos, antisépticos y desinfectantes una manifestación de los mecanismos de supervivencia y adaptación. Colombia Médica. 2007, 38 (2):149-158. Caillier, L.; Taffin de Givenchy, E.; Levy, R.; Vandenberghe, Y.; Géribaldi, S.; Guittard, F. Synthesis and antimicrobial properties of polymerizable quaternary ammoniums. European Journal of Medicinal Chemistry. 2009, 44: 3201–3208. Chamakura, K.; Perez, B.; Luo, Z.; Bashir, S.; Liu, J. Comparison of bactericidal activities of silver nanoparticles with common chemical disinfectants. Colloids and surfaces: Biointerfaces. 2011, 84: 88-96. Chapman, J. Biocide resistance mechanisms. International biodeterioration and biodegradation. 2003, 51:133138. Colombatto, D; Beauchemin, K. A proposed methodology to standardize the determination of enzymic activities present in enzyme additives used in ruminant diets. Canadian Journal of Animal Science. 2003, 83: 559-668. Consultado en Junio de 2011. Cotton Incorporated. Revisión de las causas de amarillamiento en las telas. 2002. http://www.detextiles.com/ conservamos 28 files/CAUSAS%20DEL%20AMARILLAMIENTO%20EN%20LOS%20TEJIDOS.pdf. Consultado en Noviembre de 2010. Cowen L.: Anderson J.; Kohn M. Evolution of Drug Resistance in Candida albicans. Review of Microbiology. 2002, 56: 139-165. Da Silva, Manuela; Moraes, A.; Nishikawa, M.; Gatti, M.; Vallim de Allencar, M.; Brandao, L.; Nobrega, A. Inactivation of fungi from deteriorated paper materials by radiation. International biodeterioration and biodegradation. 2006, 57: 163-167. Dragpharma. 2003. Ficha informativa- Clinafarm spray. http://www.dragpharma.cl/fichas.php?index=1592. Consultado en Junio de 2011. Emami, S.; Foroumadi, A.; Falahati,M.; Lotfali,E.; Rajabalian,S.; Ebrahimi,S.; Farahyar, S.; Shafiee, A. 2-Hydroxyphenacyl azoles and related azolium derivatives as antifungal agents. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2008, 18: 141–146. Fabrii, A.; Ricelli, A.; Brassini, S.; Fanelli, C. Effect of different antifungals on the control of paper biodeterioration caused by fungi. International biodeterioration and biodegradation. 1997, 59 (1): 61- 65. Giovanna Piantanida,G.; Bicchieri,M.; Coluzza, C. Atomic force microscopy characterization of the ageing of pure cellulose paper. Polymer. 2005, 46: 12313–12321 Gonzales, H.; Catellanos, O. Alternatives for modifying the Somogy-Nelson method for determinating reducing sugars by using their thermical possibilities. Revista Ingenieria e Investigación. 2003, 52: 56-65. Guiamet, P.; Borrego, S.; Lavin, P.; Perdomo, I.; Gómez, S. Biofouling and biodeterioration in material stroed at the Historical Archive of the museum of La Plata – Argentina and at the National Archive of the Republic of Cuba. Colloids and Surfaces : Biointerfaces. 2011, 85:229-234. Haltrich D, Nidetzky B, Kulbe KD, Steiner W, Zupancic S. Production of fungal xylanases. Bioresource Technology. 1996, 58: 137-161. Howard, S.; Webster, I.; Moore, C.; Gardiner, R.; Park, S.; Perlin, D.; Denning, D. Multi-azole resistance in Aspergillus fumigatus. International journal of Antimicrobial agents. 2006, 28: 450-453. Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación. Norma Técnica Colombiana 5374- Desinfectantes químicos: Ensayo cuantitativo de suspensión para la evaluación de la actividad Bactericida de los desinfectantes Químicos para instrumental utilizado en el sector salud. Bogotá, D.C, Colombia. 2007, 12p. Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación. Norma Técnica Colombiana 5540- Antisépticos y Desinfectantes químicos: Ensayo cuantitativo de suspensión para la evaluación de la actividad fungicida de los desinfectantes químicos para Instrumental utilizado en el sector salud. Bogotá, D.C, Colombia. 2007, 11p. Manrique, A; Patiño, Ma. Estudio del microbiodeterioro del Fondo documental Anselmo Pineda de la Biblioteca Nacional de Colombia. Tesis de Pregrado. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana. 2011. Marichal, P., Koymans, L., Willemsens, S., Bellens, D., Verhasselt, P., Luyten, W., Borges, M., Ramaekers, F.C., Odds, F.C., Van den Bossche, H. Contribution of mutations in the cytochrome conservamos 29 P450 14-a-demethylase (Erg11, Cyp51p) to azole resistance in Candida albicans. Microbiology. 1999, 145: 2701-2713. Neves, E.; Schafer, S.; Phillips, A.; Canejo, J.; Maedo, M. Antigunfal effect of different methyl and propyl paraben mixtures on the treatment of paper biodeterioration. International biodeterioration and biodegradation. 2009, 63: 267-272. Odor, A. 2003. Mecanismos químicos de la transformación del papel. http://adabi-ac.org/ccre/descargas/art8_ mecanismos.pdf. Consultado en noviembre de 2010. Pascual F., Mayra. Almacenamiento, conservación y preservación en el escenario informacional y las tecnologías. Revista Documentación. 2010, 19:75- 81. Pedroza A.; Quevedo B.; Matiz A. Manual de Laboratorio de Procesos Biotecnológicos. Primera Edición. Editorial Javeriana. Bogotá, D.C., Colombia. 2007, 22-48-68 p. Rakotonirainy, M.; Lavédrine, B. Screening for antifungal activity of essential oils and related compounds to control the biocontamination in libraries and archives storage areas. International Biodeterioration & Biodegradation. 2005, 55: 141–147 Rodríguez-Argüelles , M.; Sieiro,C.; Cao,R.; Nasi, L. Chitosan and silver nanoparticles as pudding with raisins with antimicrobial properties. Journal of Colloid and Interface Science. 2011, 364 (1): 80-84. Rostom, S.; Ashour, H.; Razik, H.; Fattah, A.; El-Din, N. Azole antimicrobial pharmacophore-based tetrazoles: Synthesis and biological evaluation as potential antimicrobial and anticonvulsant agents. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2009, 17: 2410–2422. Ruparelia, J.; Chatterjee, A.; Duttagupta, S.; Mukherji, S. Strain specificity in antimicrobial activity of silver and copper nanoparticles. Acta Biomaterialia. 2008, 4: 707–716. conservamos 30 Tiano, Piero. 2002. Biodegradation of cultural heritage: Decay mechanisms and control Methods - 9th ARIADNE Workshop “Historic Material and their Diagnostic”, ARCCHIP, Prague. http://www.arcchip.cz/w09/w09_tiano. pdf. Consultado en Julio de 2011. Urán, Ma.; CanoReview: Melanin: implications in some disease pathogenesis and its capacity to evade the host immune response. Asociación Colombiana de Infectología. 2008, 12 (2): 357-377. Vaillant, C.; Valentín, N. 1996. Principios básicos de la conservación documental y causas de su deterioro. Madrid: Ministerios de Educación y Cultura. p23. Valentin, N. 2005. Biodeterioro de los materiales de archivos y Museos: conservación y prevención. Instituto del Patrimonio Histórico Español. http://www.aecidcf.org.co/.../MI%2018.283%20Valentin,%20Nieves. Consultado en Julio de 2011. West químicos. 2010. Ficha informativa- Wescosan sp. http://westquimica.com. Consultado en Junio de 2011. Zhang Y.; Peng H.; Huanga W.; Zho Y.; Yan D. Facile preparation and characterization of highly antimicrobial colloid Ag or Au nanoparticle. Journal of Colloid and Interface Science. 2008, 325: 371–376. Zotti, M.; Ferroni, A.; Calvini, P. Microfungal biodeterioration of historic paper: preliminary FTIR and microbiological analyses. International biodeterioration and biodegradation. 2008, 62: 186-194. conservamos 31 ANEXO 1 Medios de cultivo y reconstitución de cepas • Agar tripticasa de soya (TSA) -Triptona, digestión pancreática de caseína 15,0 g/L -Peptona de soya, digestión pancreática de harina de soya 5,0 g/L -Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g/L -Agar 15,0 g/L Usar agua destilada como diluyente. Se esteriliza en autoclave. Después de la esterilización, el pH del medio debe ser equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a 20 °C. • Agar extracto de malta (MEA) -Extracto de malta 30,0 g/L -Peptona de soya 3,0 g/L -Agar 15,0 g/L Usar agua destilada como diluyente. Se esteriliza en autoclave. Después de la esterilización el pH del medio debe ser equivalente a 5,6 ± 0,2 cuando se mide a 20ºC. • Agar DG-18 - Peptona 5 g/L -Peptona de soya, digestión pancreática de harina de soya 5,0 g/L - Glucosa 1 g /L - Sulfato de Magnesio 0,5 g/L - Dicloran - Cloranfenicol - Agar 0,002 g/L 0,05 g/L 15 g/L - Glicerol 220 g/L Usar agua destilada como diluyente. Se esteriliza en autoclave. Después de la esterilización el pH del medio debe ser equivalente a 5,6 ± 0,2 cuando se mide a 25ºC. • Reconstitución de las cepas (Pedroza et al., 2007) - Hongos filamentosos: retirar un sobre de cada uno de los hongos del refrigerador. Bajo condiciones de esterilidad destapar el sobre de papel y retirar un disco de papel con cepa preservada. Transferir y sembrar el disco invertido de tal manera que el micelio quede en contacto con el agar PDA. Incubar las cajas a 25ºC por cinco días. Verificar la pureza del aislamiento realizando una preparación con azul de lactofenol y presencia de bacterias por medio de una coloración de Gram. conservamos 32 - Hongos levaduriformes: retirar un tubo eppendorf del congelador, dejar descongelar el vial a temperatura ambiente. Bajo condiciones de esterilidad destapar el tubo, flamear la boca y tomar una muestra. Sembrar por aislamiento la asada sobre agar PDA. Incubar las cajas a 30ºC por 48 horas. Verificar pureza del aislamiento mediante coloración de Gram. - Bacterias: retirar un tubo eppendorf del congelador, dejar descongelar el vial a temperatura ambiente. Bajo condiciones de esterilidad destapar el tubo, flamear la boca y tomar una muestra. Sembrar por aislamiento la asada sobre agar nutritivo. Incubar las cajas a 37ºC por 24 horas. Verificar pureza del aislamiento mediante coloración de Gram. ANEXO 2 Soluciones de trabajo • Diluyente - Solución de cloruro de sodio triptona - Triptona, digestión pancreática de caseína 1,0 g - Cloruro de sodio (NaCI) 8,5 g - Agua destilada 1L Se esteriliza en autoclave. Después de la esterilización el pH del medio debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a 20 °C. • Neutralizador recomendado por la NTC 5540 y 5473 - Polisorbato 80 30 g/L - L-histidina 1 g/L - Lecitina 3 g/L Mezclar en solución de cloruro de sodio triptona o en tampón fosfato de concentración 0,0025 mol/L • Disolución tampón de fosfato 0,25 mol/L - Potasio dihidrógeno fosfato 34 g - Agua destilada 500 mL Se lleva a volumen a 1000mL y se esteriliza en autoclave. Ajustar a pH 7,2± 0,2 con solución de NaOH 1mol/L. conservamos 33 ANEXO 3 Características macro y microscópicas de los microorganismos del estudio Aspergillus Morfotipo 1 Cladosporium Morfotipo 1 Penicillium Morfotipo 6 Microorganismo Características macroscópicas Características microscópicas Anverso blanco crema, reverso café en la parte central y verde oscuro en la parte externa de la colonia, con textura pulverulenta, sin pigmento difusible al medio. Hifas hialinas, metula ramificada, conidioforos hialinos, fiálides en forma de botella, conidios esféricos y hialinos. Anverso verde oscuro, reverso verde oliva con textura pulverulenta, sin pigmento difusible al medio. Hifa delgada, conidióforos cortos, conidios ovales y dematiaceos. Anverso blanco, reverso blanco y amarillo en la zona central, textura pulverulenta, sin pigmento difusible al medio. Hifa hialina gruesa, vesícula rodeada por fiálides de las cuales se desprenden conidios hialinos pequeños. conservamos 34 Bacilo Gram positivo Espo- Rhodotorula Mucilaginosa rulado Microorganismo Características macroscópicas Características microscópicas Colonias naranjas brillantes, de textura cremosa y húmeda-mucoide. Células ovales de 2.5 – 6.5 um de tamaño, que tiñen con cristal violeta. Colonias blancas-crema, de textura cremosa y opacas. Bacilos Gram positivos curvos, esporulados y de tamaño mediano. ANEXO 4 Condiciones de captura fotográfica – Biblioteca Nacional de Colombia Para la captura fotográfica se tuvieron en cuenta los siguientes parámetros: Tabla 1. Parámetros estandarizados para captura fotográfica CÁMARA SONY 360 ALFA Lente SONY DT 16 -105MM Dimensiones de la captura 1014 X 1526 Resolución 350 PPP Profundidad de Bits 24 Punto de foco F/11 Tiempo de exposición 1/5 Velocidad ISO 100 Tamaño 138,800 KB conservamos 35 Tener en cuenta que las capturas se realizaron en la caja de luz como lo indica la Figura 1, bajo la estandarización de foto documentación con la que se trabaja en la Biblioteca Nacional de Colombia. El fondo de trabajo fue de color negro como se observa en la Figura 2. Figura 1. Caja de Luz para captura fotográfica documental Figura 2. Captura fotográfica de las probetas con fondo negro. ANEXO 5 Cuantificación de azúcares reductores por la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico Metodología descrita en el manual de laboratorio de procesos biotecnológicos (Pedroza et al., 2007) • Curva patrón para la determinación de azúcares reductores - Preparación de las soluciones de concentración conocida (1mM-40mM): preparar las muestras de diferentes concentraciones a partir de la solución stock de glucosa 40mM, teniendo en cuenta la Ley de la Volumetría. - Determinación de la concentración de glucosa por DNS: a partir de cada una de las soluciones de concentración conocida, depositar 0.25mL de cada una en tubos 16x100 mm y seguir el protocolo descrito en la tabla 1. conservamos 36 Tabla 1. Metodología para elaborar curva patrón de glucosa Concentración mM Reactivo Blanco 1 2 4 6 8 10 Glucosa (ml) - 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Agua (ml) 0.25 - - - - - - 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Reactivo DNS 0.25 (ml) Calentar a ebullición los tubos de 16x100 mm sin el papel aluminio por cinco minutos y posteriormente detener la reacción por inmersión de los tubos en hielo durante cinco minutos. Agua destilada (ml) 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 Proteger los tubos de la luz y realizar las determinaciones de absorbancia a una longitud de onda de 540nm, ajustar el cero de la absorbancia con el blanco de la prueba. • Absorbancias de la curva patrón Tabla 2. Resultados de la curva patrón de glucosa Absorbancia 540nm [ ] Glucosa Réplica 1 (mM) 1 0,029 Réplica 2 Réplica 3 Abs 0,024 0,025 0,026 Desviación Estándar 0,0026 2 4 0,093 0,205 0,073 0,181 0,089 0,199 0,085 0,195 0,0106 0,0125 6 0,308 0,342 0,283 0,311 0,0296 8 0,453 0,459 0,485 0,466 0,0170 10 0,59 0,551 0,582 0,574 0,0206 15 20 1,223 1,616 1,24 1,624 1,244 1,537 1,236 1,592 0,0112 0,0481 25 1,996 1,958 1,96 1,971 0,0214 30 2,459 2,222 2,397 2,359 0,1229 35 2,759 2,757 2,801 2,772 0,0248 40 3,113 2,883 3,039 3,012 0,1174 conservamos 37 Figura 1. Curva patrón de Glucosa • Representación gráfica de los resultados Depositar 50mL de agua destilada en un vaso de precipitado de 250mL, adicionar 1.6g de hidróxido de sodio y disolver con agitación en plancha magnética a temperatura ambiente. Posteriormente, adicionar lentamente 43.8g de tartrato de sodio y potasio hasta que se disuelva por completo. Para proteger el reactivo de la luz, envolver el vaso de precipitado con papel aluminio y agregar lentamente 1g de DNS. Completar con agua destilada hasta 100mL en un balón aforado de 100mL. Dejar en agitación durante 12 horas en un frasco oscuro. Almacenar a temperatura ambiente y en frasco oscuro. Rotular el frasco con el nombre y concentración de la solución, así como la fecha de preparación y el nombre del responsable del reactivo (Miller, 1959). • Reactivos - Ácido 3,5-di-nitrosalicílico (DNS) Componentes: -Ácido 3,5-di-nitrosalicílico 1g -Tartrato de sodio y potasio 43.8g -Hidróxido de sodio 1.6g -Agua destilada - Solución patrón de glucosa 40mM Componentes: -Glucosa anhidra 7.2g - Agua destilada 1L En 500mL de agua destilada disolver 7.2g de glucosa anhidra, completar a 1000mL en un balón volumétrico. Almacenar en tubos falcon de 15mL y congelar a -15°C. Rotular el frasco con el nombre y concentración de la solución, así como la fecha de preparación y el nombre del responsable del reactivo. conservamos 38 ANEXO 6 ANOVA y pruebas PostHoc – Evaluación de agentes químicos • Clinafarm conservamos 39 • Wescosan conservamos 40 • Timsen conservamos 41 • Plata Coloidal conservamos 42 ANEXO 7 ANOVA y pruebas PostHoc – Microorganismos evaluados • Aspergillus Morfotipo 1 conservamos 43 • Cladosporium Morfotipo 1 conservamos 44 • Penicillium Morfotipo 6 conservamos 45 • Rhodotorula mucilaginosa conservamos 46 • Bacilo Gram positivo Esporulado RI0020 conservamos 47 ANEXO 8 Registros fotográficos – Resultados Plata Coloidal frente a Cladosporium Morfotipo 1 A1 B2 A2 B3 A3 C1 Figura 1. Resultados de la Plata Coloidal frente a Cladosporium Morfotipo 1. A) Viabilidad del Inóculo. B) Evaluación del Agente químico vs. Microorganismo. C) Prueba de la actividad y la toxicidad del Agente Neutralizante B1 C2 conservamos 48 ANEXO 9 Registros fotográficos – Resultados Wescosan frente a Penicillium Morfotipo 6 Figura 1. Resultados de Wescosan frente a Penicillium Morfotipo 6. A) Viabilidad del Inóculo. B) Evaluación del Agente químico vs. Microorganismo. C) Prueba de la actividad y la toxicidad del Agente Neutralizante conservamos 49 ANEXO 10 ANOVA y pruebas PostHoc – Determinación de azúcares reductores • Papel Manual • Papel Industrial • • 25 Años 50 Años conservamos 50 ANEXO 11 Cambio cromático – Papel Manual e Industrial • Tiempo cero D Figura 1. Registro fotográfico de las muestras de papel industrial y manual para el tiempo cero. Los productos aplicados a las muestras corresponden A) Clinafarm-Papel Industrial, B) Wescosan-Papel Industrial, C) Timsen-Papel Industrial, D) Clinafarm-Papel Manual, F) Wescosan-Papel Manual y G) Timsen-Papel Manual. conservamos 51 • 25 años Figura 2. Registro fotográfico de las muestras de papel industrial y manual para 25 años de envejecimiento. Los productos aplicados a las muestras corresponden H) Timsen-Papel Manual, I) Wescosan-Papel Manual, J) Clinafarm-Papel Industrial y K) Timsen-Papel Industrial. Figura 3. Registro fotográfico de las muestras de papel industrial y manual para 50 años de envejecimiento. Los productos aplicados a las muestras corresponden L) Clinafarm-Papel Manual, M) Timsen-Papel Manual, N) Clinafarm-Papel Industrial y O) Wescosan-Papel Industrial. conservamos 52 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Codificación de los tratamientos biológicos. Tabla 2. Codificación de los tratamientos fisicoquímicos. Tabla 3. Concentración microbicida para cada agente químico evaluado de acuerdo al microorganismo de prueba. ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Resultados de reducción logarítmica para los cinco microorganismos de prueba frente a A1) Clinafarm, A2) Wescosan, A3) Timsen, A4) Plata Coloidal y A5) Etanol 75%. Figura 2. Resultados de reducción logarítmica para B1) Aspergillus M1, B2) Cladosporium M1, B3) Penicillium M6, B4) Rhodotorula mucilaginosa y B5) Bacilo Gram positivo RI0200, frente a los cinco agentes químicos. Figura 3. Concentración de glucosa (mM) en papel impregnado con 3 agentes químicos para A1) papel manual, A2) papel industrial, B1) después de 25 años de envejecimiento y B2) después de 50 años de envejecimiento. Figura 4. Captura fotográfica detallada para muestra de papel manual impregnado con Timsen (0.5g/L) y Wescosan (0.3%) después de 25 años de envejecimiento. Figura 5. Captura fotográfica detallada para muestra de papel manual impregnado con Timsen (0.5g/L) después de 50 años de envejecimiento. ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1. Medios de cultivo y reconstitución de cepas. Anexo 2. Soluciones de trabajo. Anexo 3. Características macro y microscópicas de los microorganismos del estudio. Anexo 4. Condiciones de captura fotográfica – Biblioteca Nacional de Colombia. Anexo 5. Cuantificación de azúcares reductores por la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico. Anexo 6. ANOVA y pruebas PostHoc – Evaluación de agentes químicos. Anexo 7. ANOVA y pruebas PostHoc – Microorganismos evaluados. Anexo 8. Registros fotográficos – Resultados Plata Coloidal frente a Cladosporium Morfotipo 1. Anexo 9. Registros fotográficos – Resultados Wescosan frente a Penicillium Morfotipo 6. Anexo 10. ANOVA y pruebas PostHoc – Determinación de azúcares reductores. Anexo 11. Cambio cromático – Papel Manual e Industrial.