Procedimiento de ensayos de actividad antimicrobial

Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Fajardo
Métodos de investigación
Objetivos:
Preparación de bacterias para ensayos de actividad antimicrobial
Preparación de controles para cada variable
Materiales:
Caldo nutriente (400mL)
3 bacterias seleccionadas previamente cultivadas
Antibiótico polimixin B
Micropipetas de 200 µL, 50 µL y 1,000µL
Tips o puntas de micropipetas
Goteros estériles
Tubos de ensayo con 2 mL de caldo nutriente
Estándar Mc Farland preparado anteriormente
Espectrofotómetro
cuvetas
Tubos de centrifuga de 15mL estériles (10)
Microtubos 15 estériles
Mecheros (3)
Encendedores de mecheros (3)
Pipetas serológicas esteriles
Pipeteadores (3)
Agua estéril de autoclave (3) 100mL c/u
Encubadora a 37 grados
Sonicador
Papeles litmus para medir pH
Alcohol al 70%
guantes
Resumen de procedimiento :
Este experimento consiste en la preparación de ensayos de acción antimicrobial midiendo viabilidad
bacteriana. Todos prepararán tubos de ensayo pequeños con 2 ml de caldo nutriente con sus respectivas
bacterias y tratamientos. Tratamiento con nanopartículas : tres tubos por cada concentración de
nanopartículas (21,42 y 83 µg/mL) para la variable experimental (9) y con sus respectivos controles con la
mismas concentraciones de nanopartículas (9), 3 controles no tratados y los (9) controles positivos con el
antibiótico que será polimixin B. Prepararán la solución de este antibiótico a la misma concentración de
las nanopartículas. Deben preparar las bacterias que deberán ser previamente cµLtivadas por el personal
técnico y colocadas en la encubadora del lab 105 a 37 grados. El medio de cultivo (caldo nutriente) debe
estar estéril y a temperatura de encubación a 37 grados también.
A. Preparación de las bacterias:
1. Use técnicas asépticas, limpiando la mesa con alcohol, encendiendo el mechero y flameando los
contenedores de bacteria y medio.
2. RotµLe los tubos, experimentales y controles de concentraciones de nanopartículas, controles
no tratados y controles de antibiótico.
3. Con un gotero estéril o pipeta esteril tome 1 mL del cultivo original de la bacteria preparado por
el personal técnico y colóquelo en una cuveta de espectrofotómetro.
4. Prepare el blanco con medio de cultivo solo.
5. Mida la absorbancia de ambos a 600nm en el espectrofotómetro.
6. Prepare otra cuveta con 1 ml de su estándar Mc Farland y mida su absorbancia a 600 nm.
7. CalcµLe la razón de cuan concentrada está su cultivo de bacteria. Recuerde que el estándar es
de 0.5 Mc Farland que implica que hay 107 CFU/mL y que este debe tener una absorbancia de
alrededor de 0.10 OD. Por tanto si su muestra de bacteria tiene 0.7 OD entonces hay que diluirla
7 veces para obtener la turbidez o cantidad de bacterias necesarias para el experimento.
a. Ecuación 1 : OD muestra/OD estándar Mc Farland = factor de dilución.
b. Ecuación 2 : 2 mL / factor de dilución = cantidad en mL que debe añadir al tubo para
obtener esa cantidad de bacterias requerida para el experimento.
8. Añada el volumen calcµLado a un tubo de ensayo con medio de cultivo y mida la absorbancia de
1mL de este cultivo en el espectrofotómetro. Esta debe estar entre 0.1 OD o cercano al Mc
Farland.
9. Si el volumen es más de 100µL, entonces extraiga el volumen del tubo original y añada entonces
el volumen calculado de cultivo de bacteria.
10. Repita esto con cada tubo de experimentales y controles de concentraciones, controles no
tratados y controles de antibiótico.
B. Preparación de controles con antibiótico:
1. Preparar solución de antibiótico a 1mg/1ml en un microtubo estéril.
2. Debe pesar 1 mg de antibiótico en la balanza analítica del lab de química pues es 0.001 g de
antibiótico sólido y luego añada al tubo 1mL de medio de cultivo estéril.
3. Mezcle agitando el tubo tapado.
4. Preparará en total 9 tubos. Para preparar los 3 tubos de concentración 83 µg/mL debe extraer
del tubo con las bacterias 166µL y descartar este volumen. Esto es para obtener el volumen final
de 2mL de lo contrario esto afectará la concentración final. Debe añadir 166 µL de la solución
de 1mg/mL de antibiotico a cada tubo que contenga el caldo nutriente con las bacterias.
5. Para preparar los 3 tubos de concentración 42 µg/mL debe añadir 84 µL de esta solución a cada
tubo.
6. Para preparar los 3 tubos de concentración 21 µg/mL debe añadir 42 µL de esta solución a cada
tubo.
C. Preparación de experimentales:
Grupo con variable de tiempo de encubación:
Use técnicas asépticas. Preparará sus 9 controles con nanopartículas y sus experimentales de la misma
forma y los colocará en la encubadora. Rotule los experimentales con el numero 72 horas para que
pueda distinguirlo. Lo único que variará será su ensayo de medir absorbancia a las 72 horas a los
experimentales. Estas bacterias serán guardadas en la encubadora del lab 105 a 37 grados hasta el
viernes para medir la absorbancia a 72 horas. Rotular y notificar al personal técnico.
Grupo con variable de temperatura:
Use técnicas asépticas. Preparará sus 9 controles con nanopartículas y sus experimentales de la misma
forma. Colocará sus controles en la encubadora y sus experimentales en la nevera del lab 105 a 4
grados. Anote la temperatura de ambos equipos. Rotule los experimentales con la temperatura para
que pueda distinguirlo. Lo único que variará será su ensayo es la temperatura de incubación de los
experimentales. Estas bacterias serán guardadas en la nevera del lab 105 por 48 horas.
Grupo con variable de pH:
1. Use técnicas asépticas para trabajar con bacterias. Si desea puede usar guantes.
2. Usará un gotero de plástico estéril o pipeta Pasteur para preparar en un microtubo estéril una
solución de medio de cultivo con HCl concentrado. No use las micropipetas pues se pueden
dañar.
3. Mida el pH con papel de litmus colocando una gota con el gotero.
4. Verifique el pH que se obtiene.
5. También puede usar el metro de pH. Debe calibrar primero.
6. Prepare primero los tubos con las bacterias, añada una gota de la solución y verifique el pH.
7. Titule hasta llegar al pH correcto. Solo añada el volumen necesario a cada tubo.
D. Preparación de tratamientos con nanopartículas:
1.
Su solución de nanopartículas en medio de cultivo a 1mg/1ml en un microtubo debe estar
previamente estéril hecho por el personal técnico y guardado en nevera.
2.
Mezcle o resuspenda las nanopartículas con el sonicador por un minuto. Para esto debe primero
limpiar la punta del sonicador con alcohol al 70% y pasar un kimwipe. Esto debe hacerse bajo
supervisión de la profesora. Coloque la punta del sonicador en la solución y encienda el mismo.
Al final limpie de nuevo el sonicador con alcohol y kimwipes.
3.
Preparará en total 9 tubos. Para preparar los 3 tubos de concentración 83 µg/mL debe extraer
del tubo con las bacterias 166µL y descartar este volumen. Esto es para obtener el volumen final
de 2mL de lo contrario esto afectará la concentración final. Debe añadir 166 µL de la solución
de 1mg/mL de nanopartículas sonicadas a cada tubo que contenga el caldo nutriente con las
bacterias.
4.
tubo.
Para preparar los 3 tubos de concentración 42 µg/mL debe añadir 84 µL de esta solución a cada
5.
tubo.
Para preparar los 3 tubos de concentración 21 µg/mL debe añadir 42 µL de esta solución a cada
6.
Si las puntas de micropipetas o pipetas tocaron alguna superficie debe cambiarlas pues se
contaminan y dañan la muestra.
6.
Los tubos preparados serán sus controles de concentración de nanopartículas. Repita este
procedimiento con sus experimentales.
Nota: Sus controles no tratados y los de antibiótico no llevan nanopartículas.
7.
Al finalizar limpie la mesa con alcohol y las micropipetas. Coloque las bacterias en su respectivo
lugar, nevera o encubadora del lab 105. Todo lo que haya tenido contacto con bacteria debe ser
descartado en la bolsa de autoclave y los beakers deben ser llevados a esterilizar.
E. Medir crecimiento bacteriano
1. A las 24 y 48 horas debe presentarse la laboratorio 108, encender el espectrofotómetro. Buscar sus
cultivos en el lab 105.
2. Debe colocar 1 mL de medio solo como blanco en cuveta.
3. Tomar una muestra de 1 mL de cada tubo y poner en cuveta y medir la absorbancia a 600nm al
menos 2 veces. Anotar. Repita con sus controles y experimentales anótelo en una tabla.
4. Limpie todo y decarte según indicado en el paso 7 de la sección D.
Preparado por : Dra. Millie L. González, Ph.D., enero a mayo 2015