Manual de laboratorio para el estudio de

Manual de laboratorio para el estudio de
microorganismos anaerobios obligados
Editores
Fernando Rodríguez - Elizabeth Martín - Carolina Laverde
Olga Lucía Mayorga - Fredy Carvajal - Tatiana Alejandra Rodríguez
Jorge Alberto Rodríguez
Octubre de 2011
Rodríguez, Fernando; Martín, Elizabeth; Laverde, Carolina; Mayorga, Olga Lucía; Carvajal, Fredy; Rodríguez, Tatiana Alejandra;
Rodríguez, Jorge Alberto (Eds.) / Manual de laboratorio para el estudio de microorganismos anaerobios obligados. Bogotá:
Corpoica, 2011. 36 p.
Palabras Clave: TÉCNICAS DE LABORATORIO, ANAEROBIOSIS, FERMENTACIÓN ANAERÓBIA, DIGESTIÓN RUMINAL,
BIORREACTORES
© Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, Corpoica
Línea de atención al cliente: 018000121515
[email protected]
www.corpoica.org.co
ISBN: 978-958-740-072-4
CA:
71060717482
CUI:1295
Primera edición: Octubre de 2011
Tiraje:
1.000 ejemplares
Edición: Marcela Ríos, Germán Afanador Téllez
Producción editorial:
Diagramación, impresión y encuadernación
www.produmedios.org
Diseño:
Impreso en Colombia
Printed in Colombia
Contenido
Agradecimientos........................................................................................................ 5
Introducción............................................................................................................. 7
Conceptos generales....................................................................................................... 9
PREPARACIONES.............................................................................................................. 11
Preparación de solución mineral - Sal l...................................................................... 13
Preparación de solución mineral - Sal ll.................................................................... 13
Solución de Resazurina.............................................................................................. 14
Preparación de Hemina.............................................................................................. 14
Preparación solución de vitaminas............................................................................ 15
Preparación solución de antibiótico........................................................................... 15
Preparación de medio de Celobiosa-agar.................................................................. 16
Preparación de medio de dilución para microorganismos
ruminales ........................................................................................................... 17
Preparación de medio agar de crecimiento para Hongos
Anaerobios Ruminales (har)............................................................................. 18
Preparación de medio caldo celobiosa para hongos
celulolíticos ........................................................................................................ 19
Preparación de medio de crecimiento para bacterias
anaerobias ......................................................................................................... 20
Preparación de medio pyg (Peptone-yeast Extract-glucose) .................................... 21
Colecta de muestras de contenido ruminal para el aislamiento
de Hongos Anaerobios Ruminales (har)........................................................... 21
Colecta de muestras de contenido ruminal para la recuperación
de bacterias celulolíticas.................................................................................... 22
Cultivo de Hongos Anaerobios Ruminales (har)....................................................... 23
Cultivo de bacterias anaerobias obligadas................................................................. 23
Evaluación de viabilidad bacteriana........................................................................... 24
Crioconservación de bacterias anaerobias................................................................ 25
Crioconservación de Hongos Anaerobios Ruminales (har)...................................... 25
Recuperación de Hongos Anaeróbicos Ruminales (har) a partir de heces............... 26
Pruebas bioquímicas (Actividad metabólica bacteriana)........................................... 27
3
Degradabilidad de celulosa evaluada por pérdida de peso de
sustrato - para bacterias ruminales.................................................................... 28
Tinción diferencial de Gram....................................................................................... 28
Coloración dapi para Hongos Anaerobios Ruminales (har)...................................... 29
Tinción orange g para Hongos Anaerobios Ruminales (har).................................... 29
Evaluación de la producción de gas in vitro (bacterias celulolíticas).......................... 30
Producción de microorganismos anaeróbicos en biorreactores
Bioflo 110 de 14 litros......................................................................................... 31
Lavado y limpieza de biorreactores Bioflo 110.......................................................... 33
Esterilización de biorreactores Bioflo 110.................................................................. 34
4
Agradecimientos a
Ricardo Mojica, Luz Stella Guativa, Giselle Mackenzie, Luz Aida
Moya, Angela Wellman, Giselle Mora, Norfa Ríos, Martha
Cecilia Ospina y Solains Cañón, por la contribución metodológica
y experimental para el aislamiento, cultivo, cuantificación e
identificación de bacterias y hongos ruminales.
Martha Liliana Arcos, Faisury Ossa, Martha Isabel Montes,
Diego Rodríguez y Carlos Augusto Ospina, por la contribución
para la identificación, caracterización y conservación de
microorganismos de origen ruminal.
Diana Alfonso, Angélica Bermúdez, por la contribución al
escalamiento a nivel de biorreactor de bacterias ruminales.
Héctor Anzola, Alberto Navas, Ricardo Torres, Tito Díaz, Germán
Afanador, Claudia Forero, Rolando Barahona, Henry Carrillo,
Juan Rodríguez, Juana Galindo y Yoandra Marrero, visionarios
que creyeron posible e impulsaron, mediante su gestión y
conocimiento científico, el desarrollo de una plataforma para
la investigación y el estudio de microorganismos anaerobios del
tracto gastrointestinal y de sus aplicaciones biotecnológicas en
la agroindustria.
5
Microfotografía electrónica de barrido de esporangio
de hongo anaerobio ruminal (LMM-CBB-Corpoica)
Introducción
L
os microorganismos anaerobios obligados demandan para su crecimiento
condiciones especiales asociadas a bajos potenciales redox, que les permiten
sobrevivir y proliferar en ambientes con ausencia total de oxígeno. Uno de los
ambientes anaerobios más estudiados es el rumen, órgano digestivo de algunos
herbívoros que ha sido considerado como el biorreactor de la naturaleza, con
una capacidad sin precedentes de autorregulación y control. Las herramientas
moleculares hoy disponibles develan que solo conocemos entre el 1% y el 5%
de las especies que hoy habitan el rumen; sin embargo, y gracias a la microbiología clásica y los métodos de cultivo tradicional, se cuenta hoy con el mayor
conocimiento bioquímico y fisiológico de las especies más abundantes de este
ecosistema, y probablemente de su función en el complejo interactoma microbio-hospedero.
Las reglas y estrategias para aislar, cultivar y propagar en el laboratorio un microorganismo anaerobio obligado del rumen son simples:
1. Mantener la muestra ruminal colectada alejada de todo contacto con oxígeno hasta su traslado al laboratorio.
2. Una subsecuente dilución y siembra de la muestra en medios pre-reducidos;
esto es, en substratos donde la saturación parcial de oxígeno es minimizada mediante ebullición y un efecto complementario de agentes reductores
como la HCl-cisteína.
3. Una incubación a temperaturas correspondientes al interior del saco ruminal
de 39o C.
Así, el propósito de este manual de laboratorio es brindar de manera detallada métodos y estrategias de aislamiento, purificación, cultivo, conservación e
identificación de las especies bacterianas y fungales que predominan en el rumen.
Adicionalmente, se incluyen protocolos para el manejo y producción de biomasa
bacteriana en biorreactores de 3 y 14 L, al igual que cálculos de cinéticas de crecimiento asociadas a utilización de substrato y rendimiento asociado.
7
Los protocolos aquí presentados son el resultado de la adaptación instrumental y logística de los métodos desarrollados originalmente por los pioneros de la
microbiología ruminal y del estudio de las especies más anaerobias que habitan el
tracto gastrointestinal de los herbívoros y ambientes similares. Entre estos pioneros se encuentran los investigadores P. N. Hobson, M. P. Bryant, R. E. Hungate, W.
E. C. Moore, M. J. Allison, B. Dehority, C. G. Orpin, T. Bauchop y K. N. Joblin. Los métodos propuestos en este manual son fácilmente adaptables a un laboratorio con
condiciones básicas para el cultivo de anaerobios, reemplazando la adquisición y
uso de cabinas anaeróbicas por el método del tubo rodante ‘roll-tube’.
Por su parte, las técnicas de recuperación y cuantificación de poblaciones
microbianas específicas siguen las normas y estrategias clásicas de utilización de
medios selectivos que privilegian rutas metabólicas de algunas especies, géneros o poblaciones organizadas en taxas mayores y que privilegian su proliferación in vitro.
El conocimiento de la diversidad genética-microbiana que alberga el tracto
digestivo de distintas especies animales en Colombia y de sus complejas interacciones, ha sido alcanzado gracias a los desarrollos metodológicos presentados en
este manual de laboratorio. Estas metodologías lograron vincular dicho conocimiento al desarrollo de innovaciones tecnológicas para mejorar la producción y la
salud de especies animales de importancia para el país.
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Conceptos generales
SALES MINERALES: mezcla de soluciones minerales con macro y micro nutrientes esenciales para el crecimiento del microorganismo.
RESAZURINA: reactivo indicador redox; indica si hay oxígeno (rojo) o no (incoloro) en un medio de cultivo.
HEMINA: fuente de hierro para el microorganismo durante su crecimiento en el
cultivo.
FLUIDO RUMINAL CLARIFICADO (FRC): el líquido ruminal es una fuente de enriquecimiento en el medio de cultivo para los microorganismos anaerobios.
Este se utiliza para los medios de cultivo tras un proceso de clarificación,
que consiste en tomar el líquido ruminal de un bovino fistulado o canulado.
Dicho líquido es filtrado para descartar componentes sólidos mediante la
utilización de gasa; posteriormente se centrifuga a 8.000 r.p.m. a 4° C por 45
min, y se almacena y conserva a -20° C. Solo se descongela en el momento
de ser utilizado.
ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES (AGV): son compuestos de cadena carbonada corta
que se producen durante la degradación fermentativa de los alimentos en el
rumen y pueden ser convertidos en glucosa, ácidos aminados o ácidos grasos
por los microorganismos ruminales o por las células del animal. Generalmente se consideran como AGV el ácido fórmico, el acético, el propiónico, el butírico, el isobutírico, el 2-metilbutírico, el valérico, el isovalérico, el caproico y
el caprílico; siendo el acético, el propiónico y el butírico los que se producen
en mayor cantidad durante la fermentación.
NÚMERO MÁS PROBABLE (MPN- Most Probable Number): es una estrategia
eficiente de estimación de densidades poblacionales, especialmente cuando
una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica
se basa en la determinación de presencia o ausencia en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en
muestras de suelo u otros ambientes; por tanto, un requisito importante de
este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la
9
población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en
diluciones seriadas.
Este método ha sido adaptado para el aislamiento y conteo de unidades formadoras de colonia (UFC) y unidades formadoras de talo (UFT) de los diferentes microorganismos anaerobios ruminales. Se emplea un tubo de ensayo
que es herméticamente sellado con un tapón y un agrafe de aluminio, evitando así el ingreso de oxígeno, y mediante la técnica denominada ‘roll tube’ o
tubo rodante.
ROLL TUBE: en esta técnica se permite que un tubo conteniendo medio de crecimiento con agar fundido y microorganismos gire a velocidades cercanas a
los 1.200 r.p.m. en un aparato llamado rolling, que permite la distribución
uniforme del medio agar por todo el tubo mientras es enfriado con agua.
TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM: permite diferenciar dos grandes grupos de
bacterias: Gram positivas (+) y Gram negativas (-). El fundamento radica en la
diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram
positivas tienen una gruesa capa de péptido-glicano en su pared, mientras
que las Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano más fina y una
capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (cristal
violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante solo en
las Gram (-), entretanto que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las
células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un
colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.
DAPI (4´,6-diamidino-2-phenylindole): coloración empleada para microscopia
de fluorescencia, en la que el ADN fluorese bajo luz ultravioleta (UV), iluminando la posición del núcleo celular y orgánulos nucleoides, y por lo tanto
pueden ser diferenciados.
FIBRA DETERGENTE NEUTRA-FDN: en vegetales con importante fracción fibrosa, es fundamental conocer la dinámica digestiva de la misma. El análisis de
Fibra Detergente Neutra y Ácida-FDA (Van Soest et al., 1991) permite conocer con alto grado de certeza estos aspectos. El análisis de Fibra Detergente
Neutra (FDN) abarca a todos los componentes de la pared celular (celulosa,
hemicelulosa, lignina y sílice). En términos prácticos, la FDN es inversamente
proporcional a la capacidad de consumo que los animales tendrán sobre ese
alimento (a más FDN, menos consumo voluntario).
10
Esporangio de hongo anaerobio ruminal
tenido con DAPI (LMM-CBB-Corpoica)
Procedimientos de laboratorio
• PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN MINERAL - SAL l
MATERIALES Y REACTIVOS (para 1.000 mL)
Balón aforado de 1.000 mL.
Botella ámbar de 1.000 mL.
Fosfato de potasio monobásico - K2HPO4 (3 g/L).
Agua destilada 1.000 mL.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar el fosfato de potasio monobásico.
2. Colocar el fosfato de potasio monobásico en el balón aforado.
3. Llevar a volumen.
4. Agitar.
5. Transferir la solución a la botella ámbar.
RECOMENDACIÓN
- Mantener en refrigeración a 4o C.
Referencia bibliográfica:
Bryant, M. P. y Burkey, L. A. (1953). Cultural methods and some characteristics of some of the more
numerous groups of bacteria in the bovine rumen. J. Dairy Sci. 36: 205-217.
• PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN MINERAL - SAL ll
MATERIALES Y REACTIVOS (para 1.000 mL)
Balón aforado de 1.000 mL.
Barra de agitación.
Botella ámbar de 1.000 mL.
Agitador automático.
Fosfato de potasio dihidrogenado - K H2PO4 (3 g/L).
Sulfato de amonio - (NH4)2 SO4 (6 g/L).
Cloruro de sodio - NaCl (6 g/L).
Sulfato de magnesio heptahidratado - MgSO4·7H2O (1,23 g/L).
Cloruro de calcio dihidratado - CaCl2.2H2O (0,79 g/L).
Agua destilada.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar los reactivos.
2. Colocar los reactivos en el balón aforado.
3. Llevar a volumen con el agua destilada.
4. Agitar durante una hora.
5. Transferir la solución a la botella ámbar.
RECOMENDACIÓN
- Mantener en refrigeración a 4o C.
Referencia bibliográfica:
Bryant, M. P. y Burkey, L. A. (1953). Cultural methods and some characteristics of some of the more
numerous groups of bacteria in the bovine rumen. J. Dairy Sci. 36: 205-217.
13
• SOLUCIÓN DE RESAZURINA
MATERIALES Y REACTIVOS
Balón aforado de 100 mL.
Botella ámbar de 100 mL.
Resazurina (0,1 g/100 mL).
Agua destilada.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar 0,1 g de resazurina.
2. Colocar la resazurina en el balón aforado.
3. Llevar a volumen.
4. Agitar.
5. Transferir la solución a la botella ámbar.
RECOMENDACIÓN
-Mantener en refrigeración a 4o C.
Referencia bibliográfica:
Holdeman, L. V. y W. E. C. Moore (ed.) (1972). Anaerobe laboratory manual. V.P.I. Anaerobe
Laboratory. Blacksburg, Virginia: Virginia Polytechnic Institute and State University.
• PREPARACIÓN DE HEMINA
MATERIALES Y REACTIVOS
Dos balones aforados de 50 mL.
Barra de agitación. Agrafe y tapón de caucho.
Agitador automático.
Botella ámbar de 100 mmL.
Pinza de agrafar.
Hemina.
Agua destilada y desionizada.
Hidróxido de sodio NaOH 0,5 M.
Etanol absoluto.
PROCEDIMIENTO
Solución A
1. Pesar 4 g de hidróxido de sodio.
2. Colocarlo en el balón.
3. Agregar 5 mL de etanol absoluto.
4. Agitar el hidróxido de sodio hasta disolver.
5. Completar a 50 mL con agua destilada y desionizada.
Solución B
1. Pesar 0,1 g de hemina.
2. Colocarla en el balón de 50 mL.
3. Completar a volumen con agua destilada y desionizada.
RECOMENDACIONES
- Adicionar la solución A a la B en constante agitación.
- Mantener en refrigeración a 4o C.
Referencia bibliográfica:
Kudo, H.; Imai, S.; Arakaki, C.; Minato, H. y Cheng, K. J. (1991). Practical laboratory manual for
ruminology. Gráfica e Editora Sorocaba Ltda. Jircas-Japón. Inta-Argentina. pp. 80.
14
• PREPARACIÓN SOLUCIÓN DE VITAMINAS
MATERIALES Y REACTIVOS (para preparar 100 mL)
Balón aforado de 100 mL.
Agitador automático.
Barra de agitación.
Ácido fólico 0,02 g.
Piridoxina monohidrocloridro 0,1 g.
Biotina 0,02 g.
Riboflavina 0,05 g. Tiamina 0,05 g.
Ácido nicotínico 0,05 g.
Ácido pantoténico 0,05 g.
Ácido p-aminobenzoico 0,05 g.
Filtro de nitrocelulosa de 0,22 µm para filtración.
Microtubos de 1,5 mL tipo Eppendorf® (estériles)
PROCEDIMIENTO
1. Pesar los reactivos.
2. Colocar los reactivos en el balón aforado.
3. Llevar a volumen con el agua destilada.
4. Agitar durante una hora.
5. Filtrar con filtro de nitrocelulosa (0,22 µm).
6. Dispensar en microtubos de 1,5 mL.
RECOMENDACIONES
- Verificar que la mezcla de vitaminas no presente turbidez.
- Mantener en refrigeración a 4o C.
Referencia Bibliográfica:
Bryant, M. P. y Burkey, L. A. (1953). Cultural methods and some characteristics of some of the more
numerous groups of bacteria in the bovine rumen. J. Dairy Sci. 36: 205-217.
• PREPARACIÓN SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICO
MATERIALES Y REACTIVOS (cantidades para 100 mL)
Portafiltro (limpio y estéril).
Estreptomicina (0,250 g).
Beaker.
Ampicilina (1,00 g).
Guantes de látex.
Tetraciclina (0,20 g).
Jeringa de 5 mL (estéril).
Cloranfenicol (0,50 g).
Agitador automático.
Microtubos de 1,5 mL tipo Eppendorf® (estériles).
Membrana de filtración (membrana filtro de nitrocelulosa Millipore® de 0,22 µm).
Balón aforado (según la cantidad de reactivo a preparar).
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PROCEDIMIENTO
1. Trabajar en cámara de flujo laminar o en las condiciones de máxima asepsia.
2. Esterilizar el portafiltro con membrana de filtración (membrana filtro de nitrocelulosa Millipore® de 0,22µm).
3. Pesar los reactivos.
4. Disolver el cloranfenicol en etanol en una proporción de 6 mL por cada 100 mL
de solución de antibiótico.
5. Pesar y disolver los demás antibióticos (estreptomicina, ampicilina y tetraciclina)
en 94 mL de agua destilada.
6. Mezclar las soluciones en un beaker sobre plancha de agitación por aproximadamente 30 minutos; sellar con papel adherente de vinilo.
7. Tomar con la jeringa la mezcla de antibióticos, que debe estar en continua agitación.
8. Ubicar la jeringa en la parte superior del portafiltro.
9. Filtrar con filtro de nitrocelulosa (0,22µm), ubicado en el portafiltros.
10.Oprimir la jeringa hasta que salga el líquido por la parte inferior del portafiltro,
dejando gotear sobre el microtubo.
11.Dispensar en microtubos de 1,5 mL.
RECOMENDACIONES
- Verificar que la mezcla de antibióticos no muestre turbidez.
- Mantener en refrigeración a 4o C.
Referencia bibliográfica:
Gualdrón, L. B.; Mayorga, O. L.; Rodríguez, D. A.; Manovacía, N. P.; Martín, L. A.; Carulla, J. E. y Barahona, R. (2007). Actividad fibrolítica de hongos ruminales aislados de ecosistemas tropicales.
Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. ISSN: 0120-2952. Ed. Centro de Publicaciones Universidad Nacional de Colombia. v.54 fasc.2. p.257 – 270.
• PREPARACIÓN DE MEDIO DE CELOBIOSA-AGAR
MATERIALES Y REACTIVOS (para 100 mL)
Botella de vidrio tipo Schott® (500 mL).
Barra de agitación.
Mechero.
Red de gasificación.
Agitador automático.
Probeta de 100 mL.
Autoclave.
Gradillas.
Pipeta (10 mL) y pipeteador. Agrafes y tapones
Tubos de ensayo (16 x 200 mm)
para técnica MPN.
Sal I 15 mL.
Sal II 15 mL.
Fluido ruminal clarificado (FRC) 40 mL.
Extracto de levadura 0,250 g.
Celobiosa 0,1 g.
Bicarbonato de sodio 0,6 g.
Agar-agar 1,33 g.
Agua destilada 40 mL.
Resazurina 0,1 mL.
HCl-cisteína anhidra 0,1 g.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar el extracto de levadura, la celobiosa y el agar.
2. Colocarlos en la botella Schott®.
3. Adicionar sal I, sal II, fluido ruminal, agua destilada y resazurina.
4. Ajustar el pH a 7,2 (soluciones empleadas para ajuste de pH: NaOH 30% y HCl 0,1 N).
5. Adicionar el bicarbonato de sodio.
16
.
6.
7.
8.
9.
Ebullir durante 10-15 minutos (prerreducción).
Retirar el medio del fuego y gasificar con CO2.
Agregar la HCl-cisteína.
Cuando el medio tenga una coloración amarilla, distribuir 4,5 mL en los tubos de ensayo (MPN) en continua gasificación.
RECOMENDACIONES
- Esterilizar el medio.
- Mantener el medio a 46° C hasta dispensarlo, para evitar su solidificación.
Referencias bibliográficas:
Bryant, M. P. y Burkey, L. A. (1953). Cultural methods and some characteristics of some of the more
numerous groups of bacteria in the bovine rumen. J. Dairy Sci. 36: 205-217.
Hungate, R. E. (1957). Microorganisms in the rumen of cattle fed a concentrate ration. Can. J. Microbial. 3: 289-311.
• PREPARACIÓN DE MEDIO DE DILUCIÓN PARA MICROORGANISMOS
RUMINALES
MATERIALES Y REACTIVOS (para 100 mL)
Botella de vidrio tipo Schott® (500 mL).
Tapas y tapones.
Probeta (100 mL).
Barra de agitación.
Mechero.
Autoclave.
Gradillas.
Pipeta (10 mL) y pipeteador.
Tubos de ensayo tapa rosca (16x150 mm).
Agitador automático.
Red de gasificación.
Sal I 15 mL.
Sal II 15 mL.
Bicarbonato de sodio 0,6 g.
Agua destilada 40 mL.
Resazurina 0,1% - 0,1 mL.
HCl-cisteína anhidra 0,1 g.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar en la botella Schott la sal I, sal II, agua destilada y resazurina.
2. Ajustar el pH a 7,2 (NaOH 30% y HCl 0,1 N).
3. Adicionar el bicarbonato de sodio.
4. Prerreducir durante 10-15 minutos.
5. Retirar el medio del fuego y gasificar con CO2.
6. Agregar la HCl-cisteína.
7. Cuando el medio esté transparente, distribuir 9 mL en los tubos tapa rosca
(Hungate, 1957) en continua gasificación con CO2.
RECOMENDACIONES
- Continuar gasificación con CO2.
- Esterilizar en autoclave por 20 min a 121 °C.
Referencias bibliográficas:
Bryant, M. P. y Burkey, L. A. (1953). Cultural methods and some characteristics of some of the more
numerous groups of bacteria in the bovine rumen. J. Dairy Sci. 36: 205-217.
Hungate, R. E. (1957). Microorganisms in the rumen of cattle fed a concentrate ration. Can. J. Microbial. 3: 289-311.
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• PREPARACIÓN DE MEDIO AGAR DE CRECIMIENTO PARA HONGOS
ANAEROBIOS RUMINALES (HAR)
MATERIALES Y REACTIVOS (para 100 mL)
Botella de vidrio tipo Schott® (500 mL).
Agrafes y tapones.
Barra de agitación.
Mechero.
Red de gasificación.
Probeta (100 mL).
Gradillas.
Pipeta (10 mL) y pipeteador.
Tubos de ensayo para técnica MPN.
Autoclave.
Agitador automático.
Fluido ruminal clarificado 25 mL o 250 mL de solución de AGV.
Hemina 0,2 mL.
Sal I 17 mL.
Sal II 17 mL.
Agar-agar 1,33 g.
Extracto de levadura 0,05 g.
Bicarbonato de sodio 0,6 g.
Agua destilada 50 mL.
Resazurina 0,1 mL.
HCl-cisteína anhidra 0,1 g.
Celobiosa 0,2 g.
Glucosa 0,2 g.
Neopentona 0,1 g.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar el extracto de levadura, la glucosa, la celobiosa, el agar y la neopeptona.
2. Colocar los reactivos en la botella tipo Schott.
3. Adicionar sal I, sal II, fluido ruminal clarificado (FRC), agua destilada, resazurina
y hemina.
4. Ajustar el pH a 7,2 (NaOH 30% y HCl 0,1 N).
5. Adicionar el bicarbonato de sodio.
6. Prerreducir durante 10-15 min.
7. Retirar el medio del fuego y gasificarlo con CO2.
8. Agregar la HCl-cisteína.
9. Cuando el medio tenga una coloración amarilla o transparente al usar AGV,
distribuir 4,5 mL en los tubos de ensayo para técnica MPN en continua gasificación.
RECOMENDACIONES
- Esterilizar el medio.
- Mantener el medio a 46° Chasta dispensarlo, para evitar su solidificación.
- Agregar 10 mL de vitamina y 10 mL de antibiótico a cada tubo al momento de usar.
Referencias bibliográficas:
Cañón, S.; Rodríguez, F.; Afanador, G. y Díaz, T. (1999). Descripción del hongo celulolítico Neocallimastix frontalis aislado de bovinos en pastoreo. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias Rev.
Col. Cienc. Pec. 12 (Suppl.): 128.
Joblin, K. N. (1981). Isolation, enumeration, and maintenance of rumen anaerobic fungi in rolltube. Appl. Environ. Microbiol. 42: 1119-1122.
Orpin, C. G. (1975). Studies of the rumen flagellate Neocallimastix frontalis. J. Gen. Microbiol. 91:
249-262.
Rodríguez, F.; Mora, L. G.; Ríos, N. y Díaz, T. E. (1997). Ruminomyces elegans, asilamiento y descripción de su ciclo biológico. Revista Científica de UNINCCA. 3 (1): 29-35.
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• PREPARACIÓN DE MEDIO CALDO CON HENO DE AVENA O PAPEL PARA
HONGOS CELULOLÍTICOS
MATERIALES Y REACTIVOS (para 100 mL)
Botella Schott® (500 mL).
Barra de agitación.
Mechero.
Red de gasificación.
Probeta.
Agrafes y tapones.
Gradillas.
Pipeta (10 mL) y pipeteador.
Tubos de ensayo.
Autoclave.
Fragmentos de heno de avena
seco o papel filtro (0,5 x 0,5 cm).
Fluido ruminal clarificado (FRC) 25 mL
o 250 mL de solución de AGV.
Sal I 17 mL.
Sal II 17 mL.
Extracto de levadura 0,05 g.
Bicarbonato de sodio 0,6 g.
Agua destilada 50 mL.
Resazurina 0,1 mL.
Neopentona 0,1 g.
HCl-cisteína anhidra 0,1 g.
Hemina 0,2 mL.
Agitador automático.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar el extracto de levadura y la neopeptona y colocarlo en la botella Schott®.
2. Adicionar sal I, sal II, fluido ruminal, agua destilada, resazurina y hemina.
3. Ajustar el pH a 7,2 (NaOH 30% y HCl 0,1 N).
4. Adicionar el bicarbonato de sodio.
5. Prerreducir durante 10-15 min.
6. Retirar el medio del fuego y gasificar con CO2.
7. Agregar la HCl-cisteína.
8. Cuando el medio tenga una coloración amarilla con FRC o transparente al usar AGV,
distribuir 10 mL en los tubos con los fragmentos de heno o con papel celulosa.
RECOMENDACIONES
- En caso de utilizar la mezcla de ácidos grasos volátiles, completar el volumen
faltante con agua desionizada.
- Esterilizar en autoclave.
- Agregar 0,2 mL de vitaminas y 0,2 mL de antibiótico a cada tubo.
Referencias bibliográficas:
Cañón, S.; Rodríguez, F.; Afanador, G. y Díaz, T. (1999). Descripción del hongo celulolítico Neocallimastix frontalis aislado de bovinos en pastoreo. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias Rev.
Col. Cienc. Pec. 12 (Suppl.): 128.
Joblin, K. N. (1981). Isolation, enumeration, and maintenance of rumen anaerobic fungi in rolltube. Appl. Environ. Microbiol. 42: 1119-1122.
Orpin, C. G. (1975). Studies of the rumen flagellate Neocallimastix frontalis. J. Gen. Microbiol. 91:
249-262.
Rodríguez, F.; Mora, L. G.; Ríos, N. y Díaz, T. E. (1997). Ruminomyces elegans, asilamiento y descripción de su ciclo biológico. Revista Científica de UNINCCA. 3 (1): 29-35.
19
• PREPARACIÓN DE MEDIO DE CRECIMIENTO PARA BACTERIAS
ANAEROBIAS
MATERIALES Y REACTIVOS (para 100 mL)
Botella tipo Schott® (500 mL). Sal I 15 mL.
Barra de agitación. Sal II 15 mL.
Mechero. Fluido ruminal clarificado 40 mL.
Red de gasificación. Extracto de levadura 0,260 g.
Agitador automático. Agar-agar 1,76 g.
Probeta (100 mL). Celobiosa 0,050 g.
Autoclave. Glucosa 0,0332 g.
Gradillas. Almidón 0,0668 g.
Pipeta (10 mL). Xilano 0,0668 g.
Tubos tipo MPN. Bactocasitona 1,5 g.
Agrafes. Bicarbonato de sodio 0,6 g.
Tapones de caucho.
Agua destilada 40 mL.
Resazurina 0,1 mL. HCl-cisteína anhidra 0,1 g.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar extracto de levadura, celobiosa, glucosa, almidón, xilano, bactocasitona y agar.
2. Colocar los reactivos en la botella Schott®.
3. Adicionar sal I, sal II, fluido ruminal, agua destilada y resazurina.
4. Ajustar el pH a 7,2 (soluciones empleadas para ajuste de pH: NaOH 30% y HCl 0,1 N).
5. Adicionar el bicarbonato de sodio.
6. Prerreducir durante 10-15 min.
7. Retirar el medio del fuego y gasificar con CO2.
8. Agregar la HCl-cisteína.
9. Cuando el medio tenga una coloración amarilla, distribuir 4,5 mL en los tubos
MPN en continua gasificación a una temperatura de 46 oC.
RECOMENDACIÓN
- Esterilizar en autoclave.
Referencias bibliográficas:
Bryant, M. P. y Burkey, L. A. (1953). Cultural methods and some characteristics of some of the more
numerous groups of bacteria in the bovine rumen. J. Dairy Sci. 36: 205-217.
Holdeman, L. V. y Moore, W. E. C. (ed.). (1972). Anaerobe laboratory manual. V.P.I. Anaerobe Laboratory. Blacksburg, Virginia: Virginia Polytechnic Institute and State University.
Kudo, H.; Imai, S.; Arakaki, C.; Minato, H. y Cheng, K. J. (1991). Practical laboratory manual for
ruminology. Gráfica e Editora Sorocaba Ltda. Jircas-Japón. Inta-Argentina. pp. 80.
20
• PREPARACIÓN DE MEDIO PYG (Peptone-Yeast Extract-Glucose)
MATERIALES Y REACTIVOS (para 100 mL)
Botella tipo Schott®.
Sal I 2 mL.
Barra de agitación.
Sal II 2 mL.
Mechero.
Triptona 0,5 g.
Red de gasificación.
Extracto de levadura 1 g.
Agitador automático.
Glucosa 1 g.
Autoclave. Hemina 1 mL. Gradillas. Bicarbonato de sodio 0,6 g.
Pipeta (10 mL). Agua destilada 100 mL.
Tubos tipo MPN.
Resazurina 0,1 mL.
Agrafes.
HCl-cisteína anhidra 0,1 g.
Tapones de caucho. Probeta. PROCEDIMIENTO
1. Pesar el extracto de levadura, la glucosa y la triptona.
2. Colocar los reactivos en la botella Schott®
3. Adicionar sal I, sal II, agua destilada, resazurina y hemina.
4. Ajustar el pH a 7,2 (NaOH 30% y HCl 0,1 N).
5. Adicionar el bicarbonato de sodio.
6. Prerreducir durante 10-15 min.
7. Retirar el medio del fuego y gasificar con CO2.
8. Agregar la HCl-cisteína.
9. Cuando el medio tenga una coloración amarilla, distribuir 10 mL en los tubos
MPN en continua gasificación.
RECOMENDACIÓN
- Esterilizar en autoclave a 121 °C y 15 lb presión.
Referencia bibliográfica:
Holdeman, L. V. y Moore, W. E. C. (ed.). (1972). Anaerobe laboratory manual. V.P.I. Anaerobe Laboratory. Blacksburg, Virginia: Virginia Polytechnic Institute and State University.
• COLECTA DE MUESTRAS DE CONTENIDO RUMINAL PARA EL AISLAMIENTO
DE HONGOS ANAEROBIOS RUMINALES (HAR)
MATERIALES
Termo a 39o C.
Termómetro.
Tubos tapa rosca.
Sonda para succión.
Bomba de succión.
PROCEDIMIENTO
1. Armar el montaje según la figura:
21
a. Cánula
b. Manguera o sonda para succión
c. Recipiente colector o tubo de ensayo para técnica de Hungate.
d. Bomba de succión o bomba de vacío.
2. Introducir la sonda a través de la cánula del animal.
3. Succionar con la bomba, generando vacío.
4. Una vez recolectada la muestra en el tubo, tapar herméticamente con la tapa
rosca y transportarla al laboratorio a 39o C.
5. Inocular en medio de dilución inmediatamente se llegue al laboratorio.
RECOMENDACIÓN
- La muestra de contenido ruminal se debe tomar de 1 a 1,5 horas post-alimentación.
Referencia bibliográfica:
Martín, E.; Pérez, E.; Cañón, S.; Rodríguez, J y Rodríguez, F. (2005). Sonda oro-ruminal experimental
como alternativa para la obtención de microorganismos anaeróbicos del rumen. Revista Corpoica. 6 (1): 39-42.
• COLECTA DE MUESTRAS DE CONTENIDO RUMINAL PARA LA RECUPERACIÓN
DE BACTERIAS CELULOLÍTICAS
MATERIALES
Hielera.
Bomba de succión.
Hielo.
Montaje de toma de muestra.
Sonda de succión.
PROCEDIMIENTO
1. Armar montaje según figura:
2. Introducir la sonda a través de la cánula o
vía oro-ruminal.
3. Succionar, generando vacío.
4. Una vez recolectada la muestra en el
recipiente de toma de muestra,
transportarla al laboratorio en hielera.
5. Sembrar después de 4 horas de tener la
muestra en hielo.
RECOMENDACIÓN
- La muestra de contenido ruminal se debe tomar antes de alimentar el
animal (hora cero).
Referencia bibliográfica:
Martín, E.; Pérez, E.; Cañón, S.; Rodríguez, J. y Rodríguez, F. (2005). Sonda oro-ruminal experimental
como alternativa para la obtención de microorganismos anaeróbicos del rumen. Revista Corpoica. 6 (1): 39-42.
22
• CULTIVO DE HONGOS ANAEROBIOS RUMINALES (HAR)
MATERIALES
Jeringas de 3 mL.
Agujas tipo Wintrobe.
Baño de María a 39° C y a 46o C.
Agujas de 21G x 38 mm.
Aparato Rolling.
PROCEDIMIENTO
1. Tomar 1 mL del tubo MPN para técnica ‘roll tube’, en el cual se recogió la muestra
de fluido ruminal filtrada.
2. Diluirlo 1 en 10 hasta lograr la dilución deseada.
3. Tomar 2 mL de la dilución a sembrar y distribuirla en volúmenes de 0,5 mL en tres
tubos con medio agar de crecimiento, el cual se encuentra a 47° C y con previa
adición de solución de vitaminas y antibióticos. La dilución sobrante se descarta.
4. Colocar los tubos con medio de crecimiento sembrados en el rolling y hacerlos
girar a velocidad constante de 30 a 40 segundos, a la vez que se les deja caer agua
para su enfriamiento.
RECOMENDACIÓN
- Los tubos deben ser incubados a 39° Cen posición inclinada (30°) durante 72 horas
para hacer posterior conteo de UFT/mL.
Referencias Bibliográficas:
Cañón, S.; Rodríguez, F.; Afanador, G. y Díaz, T. (1999). Descripción del hongo celulolítico Neocallimastix frontalis aislado de bovinos en pastoreo. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias Rev.
Col. Cienc. Pec. 12 (Suppl.): 128.
Cañón, S.; Rodríguez, F.; Afanador, G. y Díaz, T. (1999). Identificación taxonómica y ultra estructural
de un hongo anaerobio ruminal celulolítico aislado de bovinos en pastoreo. Revista Colombiana
de Ciencias Pecuarias Rev. Col. Cienc. Pec. 12 (Suppl.): 127.
Joblin, K. N. (1981). Isolation, enumeration, and maintenance of rumen anaerobic fungi in rolltube. Appl. Environ. Microbiol. 42: 1119-1122.
Orpin, C. G. (1975). Studies of the rumen flagellate Neocallimastix frontalis. J. Gen. Microbiol. 91:
249-262.
Rodríguez, F.; Mora, L. G.; Ríos, N. y Díaz, T. E. (1997). Ruminomyces elegans, asilamiento y descripción de su ciclo biológico. Revista Científica de UNINCCA. 3 (1): 29-35.
• CULTIVO DE BACTERIAS ANAEROBIAS OBLIGADAS
MATERIALES
Jeringas de 3 mL.
Agujas tipo Wintrobe.
Licuadora.
Montaje de filtración.
Agujas de tuberculina de 22 g.
Aparato Rolling.
Centrífuga.
Baño de María a 39° Cy a 46 oC.
23
PROCEDIMIENTO
1. Homogeneizar la muestra durante un minuto a velocidad media.
2. Filtrarla en condiciones anaeróbicas.
3. Centrifugar 15” a 750 r.p.m.
4. Tomar 1 mL del sobrenadante y diluirlo 1 en 10 hasta lograr la dilución deseada.
5. Tomar 2 mL de la dilución a sembrar y distribuirla en volúmenes de 0,5 mL en tres
tubos con medio de crecimiento agar, el cual se encuentra a 47° C (la dilución
sobrante se descarta).
6. Colocar los tubos inoculados en el rolling y hacerlos girar a velocidad constante de 30
a 40 segundos, a la vez que se les deja caer agua para su enfriamiento.
RECOMENDACIÓN
- Los tubos deben ser incubados a 39° C posición inclinada (30°) durante 72 horas
para hacer el conteo de UFC/mL.
Referencias Bibliográficas:
Bryant, M. P. y Burkey, L. A. (1953). Cultural methods and some characteristics of some of the more
numerous groups of bacteria in the bovine rumen. J. Dairy Sci. 36: 205-217.
Hungate, R. E. (1957). Microorganisms in the rumen of cattle fed a concentrate ration. Can. J. Microbial. 3: 289-311.
• EVALUACIÓN DE VIABILIDAD BACTERIANA
MATERIALES
Mecheros.
Cepa a evaluar.
Medio de crecimiento.
Medio de dilución.
Aparato Rolling.
Jeringas de 3 mL.
Red de gasificación (CO2).
Baño de María a 39° Cy a 46 oC.
PROCEDIMIENTO
1. Tomar 1 mL del tubo en el que se tiene la cepa y transferirlo a medio de dilución.
2. Realizar nueve diluciones 1/10.
3. De la dilución a sembrar se toman 2 mL y se distribuye 0,5 mL en cada uno de
tres tubos de ensayo para técnica MPN, los cuales deben contener 4,5 mL de me
dio de crecimiento (agar).
4. Colocar los 3 tubos sembrados en el aparato de rolling y rotarlos a velocidad
constante de 30-40 segundos, suministrándoles agua.
5. Llevar a incubar a 39o C, con inclinación de 30°.
6. Después de 72 horas de incubación, contar las colonias por tubo y promediar
las 3 réplicas por dilución para obtener las UFT/mL.
Referencias bibliográficas:
Bryant, M. P. y Burkey, L. A. (1953). Cultural methods and some characteristics of some of the more
numerous groups of bacteria in the bovine rumen. J. Dairy Sci. 36: 205-217.
Hungate, R. E. (1957). Microorganisms in the rumen of cattle fed a concentrate ration. Can. J. Microbial. 3: 289-311.
24
• CRIOCONSERVACIÓN DE BACTERIAS ANAEROBIAS
MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos tapa rosca.
Gradillas.
Centrífuga.
Tanque de nitrógeno líquido.
Red de gasificación.
Dimetil sulfóxido al 5%.
Agujas tipo Wintrobe.
Jeringas de 5 mL.
Crioviales (criotubos) de 2 mL.
Caldo de crecimiento.
Hielo.
PROCEDIMIENTO
1. Inocular 0,3 mL de un cultivo de 24 horas de la cepa pura en 3 mL de caldo de
crecimiento hasta que el microorganismo alcance la etapa final de la fase
logarítmica e inicie la fase estacionaria con una suspensión cerca de 12 x 10e8,
tubo número cuatro en la escala de Mac Farland.
2. Centrifugar el tubo inoculado a 4.000 g durante 30 minutos.
3. Remover anaeróbicamente el sobrenadante.
4. Al pellet bacteriano obtenido adicionarle dimetil sulfóxido al 5% (esterilizado) en
proporción 3:1.
5. Dispensar en crioviales.
6. Colocar la mezcla en hielo durante 15 minutos.
7. Almacenar en nitrógeno líquido.
8. Para reactivar el cultivo se calienta el criovial a 39o C y se inocula 50 µl en medio de
crecimiento fresco.
Referencia bibliográfica:
Pegg, D. E.; Day, J. G. y Stacey, G. N. (2007). Principles of Cryopreservation. In: Cryopreservation
and Freeze-Drying Protocols, Second Edition. Methods in Molecular Biology (Humana Press).
368: 39–57.
• CRIOCONSERVACIÓN DE HONGOS ANAEROBIOS RUMINALES (HAR)
MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos tapa rosca.
Gradillas.
Tanque de nitrógeno líquido.
Red de gasificación.
Etilenglicol 1,28 M.
Fluido ruminal clarificado (FRC) al 10%.
Agujas tipo Wintrobe.
Crioviales.
Caldo de crecimiento.
Hielo.
Hielo seco.
PROCEDIMIENTO
1. Tomar un cultivo de 72 horas (medio caldo con heno como sustrato).
2. Colocar 5 fragmentos de cada uno con 140 esporangios/mm2.
3. Adicionar 0,75 mL de FRC al 10% y 0,75 de etilenglicol al 1,28 M por cada vial.
4. Colocar los crioviales en hielo durante 15 minutos.
5. Llevar los crioviales al hielo seco durante 24 horas.
6. Transferirlos a nitrógeno en fase gaseosa a -193o C.
25
7. Para reactivar el cultivo se someten los viales a un choque térmico a 39° Cen
agitación durante 15 minutos. Se colocan los fragmentos en caldo-heno fresco y
se incuba a 39° Cdurante 72 horas.
RECOMENDACIONES
- Evaluar viabilidad en UFT/mL y esporangios/mm2.
- Control de esterilidad; sembrar en medio glucosa sin antibiótico.
Referencias Bibliográficas:
Cañón, S.; Rodríguez, F.; Afanador, G. y Díaz, T. (1999). Criopreservación en nitrógeno líquido y evaluación de la viabilidad del hongo celulolítico Neocallimastix frontalis. Revista Colombiana de
Ciencias Pecuarias. Rev. Col. Cienc. Pec. 12 (Suppl.): 132.
Pegg, D. E.; Day, J. G. y Stacey, G. N. (2007). Principles of Cryopreservation. In: Cryopreservation
and Freeze-Drying Protocols, Second Edition. Methods in Molecular Biology (Humana Press).
368: 39–57.
• RECUPERACIÓN DE HONGOS ANAERÓBICOS RUMINALES (HAR)
A PARTIR DE HECES
MATERIALES Y REACTIVOS
Frascos de plástico con tapa rosca
(capacidad 20 mL).
Nevera o termo para transporte a 39o C.
Termómetro.
Jeringas de 3 mL.
Red de gasificación Vitaminas (pág. 15).
Medio celobiosa-glucosa (pág. 18).
Gradillas.
Mechero.
Pinzas estériles.
Medio de dilución (pág. 17). Medio caldo heno-papel (pág. 19).
Antibiótico (pág. 15).
PROCEDIMIENTO
1. Con un guante limpio tomar una muestra (5 mL) de heces recién eliminadas por
el animal y colocarlas en un frasco plástico, taparlo y marcar, e inmediatamente
colocarlo a 39 oC.
2. Transportarlo la muestra a 39o C en el termo o en una nevera portátil que contenga
bolsas de agua a 39o C.
3. En el laboratorio, en completa esterilidad, tomar con una pinza y sostener una
muestra de 0,5 mL en continua gasificación con CO2, lavándola con 30 mL de medio
de dilución hasta ver limpia la fibra presente en las heces. Colocar inmediatamente
las fibras en 10 mL de medio heno-papel adicionando entre 0,20-0,50 mL tanto de
solución de vitaminas, como de solución de antibióticos.
4. Incubar durante 48 horas, tomar una muestra del sobrenadante y observar si hay
presencia de zoosporas, si las hay, hacer un roll-tube de inmediato en medio agar
celobiosa-glucosa; de lo contrario, continuar la incubación hasta las 72 horas y
nuevamente observar la presencia de las zoosporas para proceder a hacer un rolltube.
5. Cuando se vea la formación de colonias en el cultivo se puede continuar con el
proceso normal de aislamiento, propagación, identificación y conservación de los
hongos obtenidos.
26
RECOMENDACIÓN
- Se puede estimular al animal a eliminar las heces con masaje rectal o con agua fría.
Referencia bibliográfica:
Martín, E.; Pérez, E.; Cañón, S.; Rodríguez, J. y Rodríguez, F. (2005). Sonda oro-ruminal experimental
como alternativa para la obtención de microorganismos anaeróbicos del rumen. Revista Corpoica. 6 (1): 39-42.
• PRUEBAS BIOQUÍMICAS (Actividad Metabólica Bacteriana)
MATERIALES Y REACTIVOS
Botella Schott®.
Agrafes y tapones.
Barra de agitación.
Mechero.
Red de gasificación.
Probeta.
Gradillas.
Pipeta y pipeteador.
Tubos.
Autoclave.
Inositol.
Yodo.
Glucosa.
Glicerol.
D-xilosa.
L-arabinosa.
Maltosa.
Celobiosa.
Sucrosa.
Lactosa.
Galactosa.
Manitol.
Rafinosa.
Extracto de levadura.
Adonitol.
Ramnosa.
Dulcitol.
Ribosa.
Eritritol.
Salicina.
Esculina.Sorbosa.
Fructosa.
Sorbitol.
Almidón.
Trealosa.
Manosa.
Xilano.
Melezitosa.
Xilosa.
Melibiosa.
Azul de bromocresol.
Pectina.
Agitador automático.
Fluido ruminal. Esculina.
Sal I.
Sal II.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar 0,25 g de extracto de levadura y 0,5 de tripticasa, y colocarlas en la botella Schott®.
2. Adicionar 15 mL de sal I, 15 mL de sal II, 40 mL de FRC, 30 mL de agua destilada y
100 mL de resazurina.
3. Ajustar el pH a 7,2 (calibrar con soluciones NaOH 30% y HCl 0,1 N).
4. Adicionar 0,6 g de bicarbonato de sodio.
5. Prerreducir durante 10-15 minutos.
6. Retirar el medio del fuego y gasificar con CO2.
7. Agregar la HCl-cisteína.
8. Cuando el medio tenga una coloración amarilla, agregar 0,5 g del sustrato a
evaluar, distribuir en los tubos y esterilizar por 12 minutos.
RECOMENDACIÓN
- Agregar 10 mL de vitamina a cada tubo a la hora de utilizarlo. Después de inocular
los medios con el microorganismo, incubar 1 semana. Transcurrido este tiempo,
agregar 4 gotas de azul de bromotimol como indicador de viraje de pH (rango entre pH 6,0 y 7,6), y para el almidón 4 gotas de yodo.
Referencia bibliográfica:
Holdeman, L. V. y Moore, W. E. C. (ed.) (1972). Anaerobe laboratory manual. V.P.I. Anaerobe Laboratory. Blacksburg, Virginia: Virginia Polytechnic Institute and State University.
27
• DEGRADABILIDAD DE CELULOSA EVALUADA
POR PÉRDIDA DE PESO DE SUSTRATO - PARA BACTERIAS RUMINALES
MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos tapa rosca (tipo Hungate).
Agujas tipo Wintrobe.
Baño de María a 39o C.
Centrífuga.
Red de gasificación (CO2).
Congelador de -20o C.
Medio caldo de celobiosa 0,1% (pág. XX).
Reactivo de FDN.
Celulosa en polvo.
Alcohol comercial.
Crisoles de vidrio sinterizado.
Bomba de vacío.
PROCEDIMIENTO
1. Activar la cepa a evaluar en caldo de celobiosa 0,1% y hacer tres pases consecutivos
como adaptación del microorganismo al medio de cultivo. En el último pase parar
el crecimiento (refrigerando la muestra) a una densidad óptica de 0,8.
2. Pesar 0,2 g de celulosa en polvo en tubo tapa rosca y adicionar 8 mL de medio
con una composición por cada 100 mL: 15 mL de sal I y II; 40 mL de AGV; 0,250 g
de extracto de levadura; 100 mL de resazurina; 0,6 g de NaHCO3; 40 mL de agua
destilada; 0,1 g de HCl-cisteína. Esterilizar por 15 minutos a 15 lb de presión.
3. Inocular el medio con 2 mL del cultivo de la cepa pura descrita en el numeral uno
e incubar a 39o C durante 5 días; transcurrido el tiempo de incubación, centrifugar
el cultivo por 10 minutos a 3.000 rpm y retirar el sobrenadante.
4. Agregar al pellet obtenido 10 mL de reactivo de FDN y colocar en baño de María en
ebullición durante una hora, filtrar en crisoles de vidrio sinterizado con ayuda de una
bomba de vacío, lavar el residuo con alcohol y secarlo a 105o C durante 12 horas.
5. Dejar enfriar los crisoles en un desecador y obtener la diferencia de peso para
calcular el porcentaje de degradabilidad.
• TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM
REACTIVOS
Solución de cristal violeta: cristal violeta 2%, etanol 20%, oxalato de amonio 0,8%, agua
desionizada 80%.
Solución de yodo: yodo 1%, etanol 20%, yoduro de potasio 2%, agua desionizada 80%.
Alcohol-yodado: solución de yodo (B) 5%, etanol 95%.
Colorante de contraste: safranina 0,25%, etanol 10% y agua desionizada 90% (también
se puede utilizar fuchina básica 0,10%, etanol 10% y agua desionizada 90%).
PROCEDIMIENTO
1. Se disuelve el cristal violeta con etanol, se disuelve el oxalato de amonio con el
agua; se mezclan las soluciones, se deja reposar la solución resultante durante 24
horas y se filtra.
2. Se disuelve el yodo con el etanol, aparte se disuelve el yoduro de potasio con el agua
y luego se mezclan. Algunos autores sugieren disolver conjuntamente el yodo y el
yoduro previamente, mezclándolo solamente con agua y sin añadir el etanol.
3. Mezclar cualquiera que sea la versión escogida con el etanol.
4. Para cualquiera de estas soluciones se mezcla el colorante con el etanol (si la escogida
fue la solución con fuchina se deja reposar 24 horas y se filtra, luego se agrega el agua).
28
RECOMENDACIONES
- Realizar una excelente fijación.
- Revisar el estado de los reactivos.
- Usar los siguientes tiempos: A = 1 min; B = 1 min; C = 1/2 min; y D = 2 min.
Referencia bibliográfica:
Holdeman, L. V. y W. E. C. Moore (ed.). (1972). Anaerobe laboratory manual. V.P.I. Anaerobe Laboratory. Blacksburg, Virginia: Virginia Polytechnic Institute and State University.
• COLORACIÓN DAPI PARA HONGOS ANAEROBIOS RUMINALES (HAR)
MATERIALES Y REACTIVOS
Viales.
Papel aluminio.
Micropipeta (10 mL).
Balón aforado.
Agua desionizada-destilada.
Botella ámbar.
Agitador y barra magnética.
Ácido cítrico.
Potenciómetro.
Fosfato de sodio (Na2HPO4).
Filtros de 0,22 µm.
DAPI (4´,6-diamidino-2-phenylindole).
Puntas de 100 µL. Porta y cubre objetos.
PROCEDIMIENTO
1. Disolver 0,001 g de DAPI en 100 mL de agua destilada (pH 7,0).
2. Filtrar a través de la membrana de 0,22 µm y dispensar en viales en cantidad de 1
mL (recubrir los viales con papel aluminio para impedir el paso de la luz).
3. Preparación del buffer Mcllvaine´s, pH 7,0.
4. Solución A: 0,1 mol/l de ácido cítrico (disolver 19,2 g del ácido cítrico en un litro
de agua destilada).
5. Solución B: 0,2 mol/l Na2HPO4 (28,4 g de Na2HPO4 en un litro de agua destilada).
6. Preparar 100 mL del buffer y ajustar a pH 7,0.
7. Mezclar 1 mL de la solución de DAPI y 9 mL del buffer Mcllvaine´s.
8. Colocar el micropreparado y adicionar una gota de la mezcla (DAPI- buffer), dejarla sobre el micropreparado en un lugar oscuro y tras 5 minutos observar al
microscopio con el sistema de fluorescencia.
Referencia bibliográfica:
Lowe, S.E.; Griffith, G. G.; Milne, A.; Theodorou, M. K. y Trinci, A. P. J. (1987). The life cycle and
growth kinetics of an anaerobic rumen fungus. J. Gen. Microbiol. 133: 1815-1827.
• TINCIÓN ORANGE G PARA HONGOS ANAEROBIOS RUMINALES (HAR)
MATERIALES Y REACTIVOS
Balón aforado.
Agua desionizada-destilada.
Agitador y barra magnética.
Potenciómetro.
Láminas y laminillas.
Botella ámbar.
Reactivo Orange G.
29
PROCEDIMIENTO
1. Disolver 0,001 g de Orange G en agua destilada (pH 7,0).
2. Filtrar a través de la membrana de 0,22 µm y dispensar en viales en cantidad de 1
mL (recubrir los viales con papel aluminio para impedir el paso de la luz).
3. Colocar el micropreparado, adicionar una gota de la mezcla de Orange G y dejarlo en un lugar oscuro. Tras 5 minutos observar al microscopio con el sistema de
fluorescencia.
Referencia bibliográfica:
Scheehan, D. C. y Hrapchak, B. B. (1980). Theory and practice of histotechnology. 2nd. Ed.
• EVALUACIÓN DE
LA PRODUCCIÓN DE GAS IN VITRO (BACTERIAS CELULOLÍTICAS)
MATERIALES:
Substrato a evaluar.
Cultivo de la bacteria en fase exponencial.
Botellas de 50 mL.
Tapones de caucho butilo de cuello largo (nuevos).
Agitadores.
Autoclave.
Jeringas de 1 mL y 3 mL estériles.
Agrafes estériles.
Equipo de producción de gas in vitro.
MEDIO:
General (100 mL): 15 mL de sal I; 15 mL de sal II; 40 uL de AGV; 0,250 g de extracto
de levadura; 0,100 µL de resazurina; 0,60 g de NaHCO3; 40 mL de agua destilada y
0,100 g de HCl-cisteína.
PROCEDIMIENTO
1. Preparar el medio general de bacterias y esterilizarlo a 15 lb de presión por 20
minutos; adicionar 9,8 mL a cada una de las botellas, en las que se ha colocado
con anterioridad 0,1 g del substrato a evaluar, el cual se debe esterilizar con luz
ultravioleta (UV) por 15 minutos.
2. Adicionar 2 gotas de solución de vitaminas a cada frasco e inocular la bacteria a
evaluar tomando una alícuota de 200 mL con una jeringa de 1 mL estéril y gasificada.
3. Llevar las botellas inoculadas al equipo de producción de gas in vitro, el cual debe
encenderse una hora antes para estabilizar la temperatura en 39o C.
4. Ajustar el programa Atlantis para correr una caja completa:
a. Snapshot>Setup>New files – Nombre del archivo > OK>OK
b. Graph>Setup – a axis max > 18000 > OK>OK
c. Time Trigger>Setup 1200> OK
5. Insertar los sensores en las botellas y revisar las conexiones observando el monitor
Snaphot (las lecturas deben estar entre 1,2 y 1,4 en todos los canales).
6. Apagar los sensores y ajustar la presión a cero en cada botella, asegurándose
de que el sistema de agitación funcione correctamente. Revisar las lecturas de
los sensores, las cuales deben estar entre 1,2 y 1,4 cuando la temperatura esté
equilibrada a 39o C.
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7. Para iniciar las lecturas se hace doble clic en el punto negro de la barra del monitor Time
Trigger, el cual debe cambiar a rojo para luego dejar correr los datos por 48 horas.
8. Después de la incubación de 48 horas, el archivo queda grabado en el directorio
C:/AFW/Data y se almacena en un dispositivo de memoria USB.
9. Desmontar los cultivos y medir su pH.
10. A los cultivos que contienen FDN o materia seca se les adiciona solución de FDN
(Fibra Detergente Neutra) y se llevan a un baño de María de 92o C por una hora.
11. Pesar las bolsas de nylon y registrar sus pesos.
12. Después de la incubación por una hora, el contenido de los frascos es depositado
en cada bolsa debidamente marcada.
13. Lavar con agua caliente para eliminar la solución de FDN y adicionar etanol
absoluto al 70%, llevando las muestras a la incubadora.
14. Después de secadas, las bolsas se pesan y se registran los pesos.
15. Calcular el porcentaje de FDN realizando la diferencia del peso de la bolsa más
residuo, y el peso de la bolsa sola se divide por el peso de muestra introducida a
la bolsa y se multiplica por 100.
16. Para el correcto manejo de los datos de incubación, todos deben ser almacenados
en el programa AFW (Atlantis para Windows), se toman como un archivo ASCII
(Texto) y se manejan en hoja de cálculo (Excel) mediante los Macro: Box_mac.xlm;
Ed_Sheet.xlm y Senscal.xln.
Referencia bibliográfica:
Theodorou, M. K.; Williams, B. A.; Dhanoa, M. S.; McAllan, A. B. y France, J. (1994). A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant
feeds. Animal Feed Sci. Tech. 48: 185-197.
• PRODUCCIÓN DE MICROORGANISMOS
ANAERÓBICOS EN BIORREACTORES BIOFLO 110 DE 14 LITROS
MATERIALES Y REACTIVOS
Agua destilada. Mangueras. Pinzas. Jeringas. Recipiente para extracto de fermentación.
Medio para fermentación.
Inóculo microbiano.
CO2.
Recipientes para la centrífuga.
EQUIPOS:
Centrífuga Sorvall Rc 6 Plus. Autoclave.
Electrodos. Cilindro de CO2.
Fermentador Bioflo 110, New Brunswick Scientific 3L.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar el fermentador en la base.
2. Conectar las mangueras de entrada y salida del agua, ubicadas en la parte inferior
del fermentador, con las mangueras correspondientes a la entrada y salida del
agua de la llave.
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3. Prender la unidad dos (2) oprimiendo el interruptor que se encuentra en el módulo uno.
4. Verificar que la llave de paso principal del agua esté abierta.
5. Abrir la pinza de paso de agua ubicada en la manguera que suministra el agua al
fermentador.
6. Verificar en la pantalla principal que la CPU se encuentre en la unidad dos (2). Si
no es el caso, oprimir el botón superior izquierdo para cambiar de unidad.
7. Seleccionar el botón de la variable Temperatura, oprimir el botón Control y
seleccionarAuto, luego colocar un valor de set point de 5o C y oprimir Enter para
llenar la chaqueta del fermentador.
8. Regresar a la pantalla principal oprimiendo el botón superior izquierdo.
9. Llenar la chaqueta del fermentador con agua a través de las mangueras hasta
aproximadamente 2 L.
10. Cambiar el set point de la temperatura a 50o C y ajustar hasta que llegue a 39o C.
11. Asegurarse de que todos los electrodos estén propiamente conectados.
12. Agregar 3 mL de glicerina en el tubo donde se introduce el termostato.
13. Introducir el termostato en el tubo correspondiente.
14. Colocar el motor en eje del fermentador presionando con sumo cuidado hasta
que empalme adecuadamente las aberturas del motor con las clavijas del eje.
Verificar la estabilidad del motor.
15. Conectar la manguera de CO2 al filtro de entrada de gases al fermentador.
16. Verificar en la pantalla principal que la CPU se encuentre en la unidad dos (2). Si
no es el caso, oprimir el botón superior izquierdo para cambiar de unidad.
17. Seleccionar el botón de la variable Agitación, oprimir el botón Control y seleccionar
Auto, luego colocar el valor del set point deseado y oprimir Enter.
18. Regresar a la pantalla principal oprimiendo el botón superior izquierdo.
19.Seleccionar el botón de la variable pH, oprimir el botón Control y seleccionar
Auto, luego colocar el valor del set point deseado y oprimir Enter.
20. Regresar a la pantalla principal oprimiendo el botón superior izquierdo.
21. Esperar hasta que todas las variables alcancen los valores de set point deseados.
22. Quitar uno de los tornillos que permiten la entrada al fermentador.
23. Por medio de un embudo agregar el medio previamente esterilizado.
24. Gasificar por media hora.
25. Esperar el tiempo adecuado de inoculación.
26. Inyectar el inóculo a través del orificio de entrada.
27. Gasificar nuevamente.
28. Esperar el tiempo adecuado de fermentación.
29. Colocar el recipiente adecuado en el extremo de la manguera de salida del medio
ubicada en la tapa del fermentador.
30. Introducir aire por el filtro de entrada de aire y colocar una pinza en el filtro de
salida de aire para crear una presión positiva y descargar el líquido.
31. Retirar la pinza de la manguera de salida y esperar a que se llene el recipiente.
32. Seguir el protocolo de lavado del fermentador de 14 litros Bioflo 110.
33. Centrifugar a 8.000 r.p.m. a una temperatura de 4o C durante 20 minutos en la
centrífuga Sorvall Rc 6 Plus con el rotor número 33 (SLC 4000).
34. Asegurarse de que todos los recipientes estén al mismo nivel.
35. Pasado el tiempo de centrifugación, retirar el sobrenadante. Transferir el pellet a
un recipiente estéril y refrigerar a 4o C.
36. Llevar el sobrenadante a esterilización.
37. Dispensar directamente al sifón.
38. Seguir el protocolo de esterilización del fermentador de 3 litros Bioflo 110 al
finalizar la fermentación.
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Referencia bibliográfica:
Alfonso, D. M.; Villanueva, A. B.; Rodríguez, F. y Carvajal, F. O. (2011). Producción de biomasa y escalamiento de microorganismos ruminales con potencial probiótico. En: Desarrollo de Probióticos
para Ganaderías Productoras de Leche.
• LAVADO Y LIMPIEZA DE BIORREACTORES BIOFLO 110
MATERIALES Y REACTIVOS
Agua.
Solución diluida de jabón (1:70).
Guantes de látex. Fermentador Bioflo 110
Jabón. Área adecuada para lavado.
Churruscos.
PROCEDIMIENTO
1. Descargar el agua de la chaqueta del fermentador hasta la mitad, retirando la
pinza de la manguera de salida y entrada del agua del fermentador.
2. Preparar una solución diluida de jabón (1:70). No se debe utilizar detergente directamente en el vaso, porque pueden quedar trazas de jabón que contaminen
la fermentación e impidan el proceso.
3. Adecuar el área de lavado para que el lugar esté desocupado y así evitar posibles golpes o contaminación.
4. Retirar el electrodo de pH con sumo cuidado de no golpearlo, lavarlo y colocarlo
en un sitio seguro.
5. Retirar el electrodo de CO2 con sumo cuidado de no golpearlo, lavarlo y colocarlo en un sitio seguro.
6. Retirar la tapa del fermentador ubicando los tornillos y las arandelas en un recipiente para evitar perderlos.
7. Retirar los deflectores del vaso, uniendo sus extremos para facilitar su salida.
8. Aplicar la solución de jabón y refregar con un churrusco el vaso del fermentador.
9. Lavar con abundante agua el vaso.
10. Aplicar la solución de jabón y refregar con un churrusco la tapa del fermentador,
incluyendo los accesorios que se encuentran incrustados en ella. Tener cuidado
de no mojar los filtros.
11. Lavar la tapa con abundante agua.
12. Aplicar la solución de jabón y refregar con un churrusco los deflectores y el montaje de toma muestra.
13. Lavar con abundante agua.
14. Destapar las mangueras que se encuentran envueltas en papel kraft.
15. Lavar las mangueras con abundante agua a presión, evitando la utilización de
jabón.
16. Seguir el protocolo de esterilización del fermentador de 14 litros Bioflo 110 al
finalizar el proceso de lavado.
Referencia Bibliográfica:
New Brunswick Scientific Co., Inc. Guide to Operations. BioFlo 110 Modular Benchtop Fermentor.
Manual No. M1273-0054- January 12, 2005. pp. 175.
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• ESTERILIZACIÓN DE BIORREACTORES BIOFLO 110
MATERIALES Y REACTIVOS
Fermentador de 14 L Bioflo 110.
Accesorios del fermentador de 14 L Bioflo 110.
Residuos de la fermentación.
PROCEDIMIENTO
1. Si se acaba de terminar una fermentación, verificar que el control de todas las
variables se encuentre apagado (OFF) (temperatura, agitación, bomba A, bomba
B, bomba C, pH, CO2).
2. Apagar el equipo desde el interruptor principal.
3. Quitar el motor del eje del fermentador halando hacia arriba.
4. Retirar el sensor de temperatura (termopar) que se encuentra en la tapa del
fermentador.
5. Desconectar el cable del sensor de pH que se encuentra ubicado en la tapa del
fermentador.
6. Colocar la tapa de seguridad al sensor de pH (tapa de color rojo).
5. Desconectar el cable del sensor de CO2 que se encuentra ubicado en la tapa del
fermentador.
8. Colocar la tapa de seguridad al sensor de CO2 (tapa metálica con cadena).
9. Colocar un tapón de gasa ajustado con cinta de enmascarar a cada uno de los
filtros (salida y entrada de gas) en la parte exterior del filtro.
10. Forrar todo el filtro en papel aluminio. Colocar una pinza en la manguera del
filtro de entrada de gas.
11. Desocupar el agua de la chaqueta del fermentador asegurándose de que el nivel
del agua de la chaqueta quede por lo menos a la mitad.
12. Colocar una pinza en la manguera de salida del agua de la chaqueta ubicada en
la parte inferior del fermentador.
13. Desmontar el fermentador de la base y colocarlo en una superficie firme y resistente.
14. Aflojar los tornillos que ajustan la tapa del fermentador y uno de los tornillos de
la parte superior de la tapa.
15. Colocar una pinza en la manguera de descarga que se encuentra en la tapa del
fermentador, envolver en papel kraft y sellar con cinta de enmascarar.
16. Colocar una pinza en la manguera del toma muestra que se encuentra en la tapa
del fermentador.
17. Colocar una pinza en la manguera de entrada del inóculo.
18. Colocar papel aluminio en la boquilla de la entrada del inóculo y el medio, que
se encuentra ubicada en la tapa del fermentador.
19. Listo para esterilizar.
20. Separar turno para esterilizar el fermentador con el auxiliar del laboratorio de
control biológico encargado del área de esterilización.
Referencia bibliográfica:
New Brunswick Scientific Co., Inc. Guide to Operations. BioFlo 110 Modular Benchtop Fermentor.
Manual No. M1273-0054- January 12, 2005. pp. 175.
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Terminó de imprimirse
en octubre de 2011 en
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Bogotá, DC, Colombia