EIA HE4 - Fujirebio Diagnostics, Inc.

LY.
ON
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FO H E N
ALW I N S E
W
SAY AG E D
S
IE
CK
EA
TH O PA U PPL KIT
T
E
S
H
HT
WIT
ES
EIA HE4
REF
404-10
IVD
Instrucciones de uso. 2014-12
Use By/Годно до/Použitelné do/
EN
EXPLANATION OF SYMBOLS
Holdbar til/Verwendbar bis/
BG
ОБЯСНЕНИЕ НА СИМВОЛИТЕ
Ημερομηνία λήξης/Fecha
CS
VÝZNAM SYMBOLŮ
DA
SYMBOLFORKLARING
DE
ERKLÄRUNG DER SYMBOLE
EL ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΜΒΟΛΩΝ
ES
SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS
ET
SÜMBOLITE SELGITUS
FR
EXPLICATION DES SYMBOLES
Použite´né do/ Uporabno do/
HR
OBJAŠNJENJE SIMBOLA
Upotrebljivo do/Son Kullanma Tarihi
HU
JELMAGYARÁZAT
IT
SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI
LT
SIMBOLIŲ PAAIŠKINIMAI
LV
SIMBOLU SKAIDROJUMS
NL
VERKLARING DER SYMBOLEN
de caducidad/Kõlblik kuni/
Utiliser jusque/Rok valjanosti/
Felhasználható/Utilizzare entro/
Sunaudoti iki/Izlietot līdz/Houdbaar
tot/Brukes innen/ Użyć przed /
Prazo de validade/Expiră la/
Использовать до/Använd före/
Batch code/Номер на партида/
Číslo šarže/Lotnummer/
Chargenbezeichnung/Αριθμός
Παρτίδας/Código de lote/Partii
kood/Code du lot/Kod serije/
NOSYMBOLFORKLARING
PL
OBJAŚNIENIE SYMBOLI
PT
EXPLICAÇÃO DOS SÍMBOLOS
RO
SEMNIFICAŢIA SIMBOLURILOR
RU
ОБОНАЧЕНИЯ
Sarzsszám/Codice del lotto/
Partijos kodas /Partijas kods /Lot
nummer/Partikode/Kod partii/
Código do lote/Număr de lot/
Номер лота/Lotnummer/Číslo
SVSYMBOLFÖRKLARING
šarže/Številka serije/Kod partije/
SK
VÝZNAM SYMBOLOV
Parti Kodu
SL
RAZLAGA SIMBOLOV
SR
OBJAŠNJENJE SIMBOLA
TR
SEMBOLLERİN AÇIKLAMALARI
1
Date of manufacture/Дата на
8 oC
производство/Datum výroby/
Produktionsdato/Herstellungsdatum/
Ημερομηνία παραγωγής/Fecha de
2 oC
Temperature limitation/
Температурни граници/
Teplotní omezení/
Temperaturbegrænsning/
fabricación/Valmistamise kuupäev/
Temperaturbegrenzung/
Date de fabrication/Datum proizvodnje/
Περιορισμοί θερμοκρασίας/
Gyártási idő/Data di produzione/
Límites de temperatura/
Pagaminimo data/Ražošanas datums/
Temperatuuri piirang/
Productiedatum/Fremstillingsdato/
Limite de température/
Data produkcji/Data de fabrico/Data
Temperaturno ograničenje/
fabricaţiei/Дата производства/
Hőmérsékletre vonatkozó korlátozás/
Tillverkningsdatum/Dátum výroby/Datum
Limiti di temperatura/
izdelave/Datum proizvodnje/Üretim tarihi
Temperatūriniai apribojimai/
Temperatūras ierobežojums/
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device/
Temperatuurbeperking/
Медицински уред за диагностика
Temperaturbegrensninger/
ин витро/Diagnostický zdravotnický
Temperatury graniczne/
prostředek in vitro/Medicinsk udstyr til
Limite de temperatura/
in vitro-diagnostik/In-vitro-Diagnostikum/
Limite de temperatură/
Ιατροτεχνολογικό προϊόν για διάγνωση
Температурный режим/
In Vitro/Dispositivo médico para
Temperaturbegränsning/
diagnóstico in vitro/In vitro diagnostiline
Teplotné obmedzenie
Omejitev temperature/
meditsiiniseade/Dispositif médical de
diagnostic in vitro/Diagnostički medicinski
Temperaturno ograničenje/
uređaj In Vitro/In vitro orvosdiagnosztikai
Sıcaklık sınırlaması/
eszköz/Dispositivo medico per test
diagnostici in vitro/In Vitro Diagnostinė
Contains sufficient for <96> tests/Съдържа
Medicinos Priemonė/Medicīniska ierīce
достатъчно количество за тестове
in vitro diagnostikai/In vitro-diagnostisch
<96>/Lze použit pro <96> testů/Indeholder
medisch instrument/In vitro diagnostisk
tilsttrækkeligt/Inhalt ausreichend für <96>
medisinsk utstyr/Wyrób medyczny do
Prüfungen/Περιεχόμενο επαρκές για
diagnostyki in vitro/Dispositivo Médico
«96» εξετάσεις/Contenido suficiente para
de Diagnóstico In Vitro/Dispozitiv medical
<96> ensayos/Kogusest piisab <96> testi
pentru diagnostic in vitro/Только для
läbiviimiseks/Contenu suffisant pour “96”
диагностики In Vitro/Endast för in
tests/Sadrži dovoljno za <96> testova/A
vitro-diagnostik/ Zdravotnícka pomôcka na
doboz tartalma <96> vizsgálat elvégzéséhez
diagnostiku in vitro/In vitro diagnostični
elegendő/Contenuto sufficiente per “96”
pripomoček/Diagnostički medicinski
saggi/Turinys skirtas atlikti <96> tyrimus/
uređaj In Vitro/<96> testleri için yeterlilik
Saturs pietiekams <96> testiem/Inhoud
içerir
voldoende voor “96” testen/til ”96” test/
Tilstrekkelig innhold for <96> prøver/
REF
Catalogue number/Каталожен номер/
Wystarczy na wykonanie <96> testów/
Katalogové číslo/Katalognummer/
Conteúdo suficiente para “96” ensaios/
Bestellnummer/Αριθμός καταλόγου/
Conţinut suficient pentru 96 de teste/
Número de catálogo/Kataloogi number/
Содержит достаточные количества для
Numéro de catalogue/Kataloški broj/
«96» определений/Innehåller tillräckligt
Katalógusszám/Numero di catalogo/
till “96” antal tester/Obsah postačuje na
Katalogo numeris/Numurs katalogā/
tento počet testov: <96>/Vsebina zadostuje
Catalogusnummer/Katalognummer/
za <96> testov/Sadržina dovoljna za <96>
Numer katalogowy/Número do catálogo/
testova/<96> testleri için yeterlilik içerir
Număr de catalog/Номер по каталогу/
Produktnummer/Katalógové číslo/
Kataloška številka/Kataloški broj/
Katalog numarası
2
Consult Instructions for Use/
ORIG
HUM
Human/С човешки произход/Lidské/
Прочетете инструкцията за
Humant/Human/δείγματα αναφοράς/
употреба/Konzultujte s návodem
Humano/Inimpäritolu/Humaine/Ljudskog
k použití/Se brugsanvisning/Siehe
porjekla/Humán/Origine Umana/
Gebrauchsanweisung/Συμβουλευτείτε
Žmogaus kilmės/Cilvēku izcelsmes/
τις Οδηγίες σχετικά με τη χρήση/
Human/Menneske/Ludzka/Humano/
Consulte las instrucciones de uso/
Origine umană/Человеческого
Vt kasutusjuhendit/Consulter le mode
происхождения/Human/Ľudské/
d’emploi/Pročitajte upute za uporabu/
Humanega izvora/Ljudskog porekla/İnsan
Olvassa el a használati utasítást/
Consultare le istruzioni per l’uso/Dėl
ORIG
MOU
From mouse/С миши произход/Myší/
naudojimo žiūrėkite instrukcijas/Izlasiet
Fra mus/Maus/απο ποντίκι/de ratón/
lietošanas instrukciju/Raadpleeg de
Hiirtelt/De souris/Mišijeg porjekla/
instructies voor gebruik/Les instruksene
Egérből/Murino/Pelės kilmės/No peles/
før bruk/Sprawdzić w instrukcji użycia/
Van muizen/Fra mus/Mysia/Do rato/De
Consulte as Instruções de Utilização/
la şoareci/Мышиного происхождения/
Consultaţi instrucţiunile de utilizare/
Från mus/Myšie/Mišjega izvora/Mišijeg
Обратитесь к инструкции по
porekla/Fareden
применению/Se bruksanvisning/
Prečítajte si návod na používanie/
ORIG
BOV
Bovine/С говежди произход/
Pročitajte uputstvo za upotrebu/
Hovězí/Bovin/Rind/από βοοειδή/
Kullanım Talimatlarına Bakınız
Bovino/Veistelt/Bovine/Rogate stoke/
Szarvasmarha/Bovino/Jaučio/No
CONT
Contents of kit/Съдържание на набора/
liellopa/Bovien/Bovin/Wołowy/Bovino/
Obsah soupravy/Kittets indhold/Inhalt
Origine bovină/крупного рогатого
des Kits/Περιεχόμενα του κιτ/Contenido
скота/Från ko/Hovädzie/Govejega
del kit/Komplekt sisaldab/Contenu du
izvora/Rogate krupne stoke/Bovin
kit/Sadržaj opreme/A készlet tartalma/
Contenuto del kit/Rinkinio turinys/
Komplekta saturs/Inhoud van de set/
Settets innhold/Zawartość zestawu/
Reconstitute with/Разтваряне с/
Rozřeďte pomocí/Rekonstitueres med/
Rekonstituieren mit/Ανασύσταση με/
Conteúdo do kit/Conţinutul setului/
Reconstituir con/Lahjendamine/
Компоненты набора/Kit innehåll/
Reconstituer avec/Rekonstituirajte s/
Obsah súpravy/Vsebina kompleta/Sadržaj
Feloldáshoz/Ricostituire con/Atkurti,
opreme/Kitin içindekiler
ištirpdant su/Atšķaidīt ar/Reconstitutie
met/Rekonstitueres med/Odtworzyć
Biological risks/Биологическа
za pomocą/Reconstituir com/A
опасност/Biologická rizika/Biologisk
se reconstitui cu/Растворить в/
fare/Biologische Gefahren/Βιολογικοί
Rekonstituera med/Rozrieďte pomocou/
κίνδυνοι/Riesgos biológicos/
Rekonstituirajte z/s/Ponovno formiranje
Bioloogilised ohud/Risques biologiques/
sa/Yeniden oluşturulur
Biološkli rizici/Biológiai kockázatok/Rischi
biologici/Biologinis pavojus/Bioloģiskais
Manufacturer/Производител/Výrobce/
risks/Biologische risico’s/Biologiske
Producent/Hersteller/Kατασκευαστής/
risikoer/Zagrożenie biologiczne/Riscos
Fabricante/Tootja/Fabricant/Proizvođač/
biológicos/ Biologisk risk/Pericole
Gyártó/Fabbricante/Gamintojas/
biologice/Биологическая опасность/
Ražotājs/Fabrikant/Produsent/
Biologicky rizikové/Biologické riziká/
Producent/Fabricante/Producător/
Biološkli rizici/Biyolojik riskler
Производитель/Tillverkare/ Výrobca/
Izdelovalec/Proizvođač/Üretici
3
4
EIA HE4
Instrucciones de uso
ES
Kit de ensayo enzimoinmunométrico
Para 96 determinaciones
USO PREVISTO
El EIA HE4 es un ensayo enzimoinmunométrico para la determinación cuantitativa de
HE4 en suero humano. El ensayo ha de ser utilizado como ayuda en la monitorización
de la respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer ovárico epitelial invasivo. El
análisis seriado de valores en el ensayo de HE4 de la paciente debe utilizarse en
combinación con otros métodos clínicos para la monitorización del cáncer ovárico.
También ha sido diseñado para utilizarse conjuntamente con los ensayos
ARCHITECT CA125 II, EIA CanAg CA125 o Lumipulse G CA125II, como ayuda en
la estimación del riesgo de cáncer ovárico epitelial en mujeres premenopáusicas y
posmenopáusicas que presentan una masa pélvica. Los resultados deben interpretarse
en combinación con otros métodos según las guías terapéuticas y clínicas estándares.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO
La proteína epididimal humana 4 (HE4) pertenece a la familia de proteínas ácidas
séricas con núcleo de 4 enlaces disulfuro (WFDC) con posibles propiedades
inhibidoras de la tripsina. Otras proteínas de esta familia son la SLPI, la elafina
y la PS20 (WFDC1) (1, 2). El gen HE4 codifica una proteína de 13 kD, aunque
en su forma glucosilada madura tiene aproximadamente 20-25 kD y consta de
un péptido simple con dos dominios WFDC (3). La HE4 fue identificada por vez
primera en el epitelio del epidídimo distal y originalmente se pronosticó que sería
un inhibidor de la proteasa implicado en la maduración espermática (4, 5). Desde
entonces se ha comunicado que la HE4 se expresa en varios tejidos normales,
incluidos los epitelios de los tejidos respiratorio y reproductivo, así como en el
tejido del cáncer ovárico (6-10). Además de su expresión a nivel celular, se ha
detectado HE4 secretada a niveles elevados en el suero de pacientes con cáncer
ovárico. En un estudio de casos y controles que comparó pacientes con cáncer
ovárico con mujeres sanas y pacientes con enfermedades benignas, Hellström et
al. descubrieron que la HE4 detectaba el cáncer ovárico con una sensibilidad del
67 % y un nivel de especificidad del 96 % (11). En un estudio posterior que evaluó
numerosos biomarcadores conocidos del cáncer ovárico, la HE4 presentó la máxima
sensibilidad en la detección del cáncer ovárico, particularmente durante la fase
inicial de la enfermedad. En este estudio, la combinación de HE4 y CA125 fue un
predictor más preciso de neoplasias malignas que cualquiera de los marcadores
por separado, con una sensibilidad del 76 % y una especificidad del 95 % (12).
5
El cáncer ovárico es la cuarta causa más frecuente de muerte relacionada con el cáncer
en mujeres en todo el mundo. En Europa, la tasa de mortalidad oscila entre 3,6 y 9,3
por cada 100,000 mujeres (13). Los síntomas de cáncer ovárico están relacionados
con la presencia de masas anexiales y son a menudo vagos e inespecíficos. El objetivo
principal de la evaluación diagnóstica de una masa anexial es determinar si es benigna
o maligna. Se estima que entre el 5 y el 10 % de las mujeres estadounidenses se
someterán a una intervención quirúrgica por una posible neoplasia ovárica durante su
vida y entre el 13 y el 21 % de dichas mujeres tendrán un tumor ovárico maligno (14).
El American College of Obstetricians and Gynecologists Practice Bulletin publicado en
2007 indica lo siguiente: “Las mujeres con cáncer ovárico atendidas por médicos con
formación y especialización avanzadas en el tratamiento del cáncer ovárico, como los
oncólogos ginecólogicos, presentan mejores índices generales de supervivencia que
las que reciben tratamiento sin este tipo de colaboración”. (15). Dado que la mayoría
de masas anexiales son benignas, es importante determinar preoperatoriamente si una
paciente presenta un alto riesgo de neoplasia ovárica maligna, con el fin de asegurar
un tratamiento adecuado (15). Desde el informe inicial de 1988, la impresión clínica, la
CA125 sérica y la ecografía, junto con la TC, la RM y la TC/TEP, han sido los estándares
para determinar si una masa anexial es una neoplasia maligna (16). Aunque la bibliografía
abunda en artículos que describen cuál es la modalidad más precisa, la combinación
de exploración física, CA125 y diagnóstico por imagen proporciona el valor pronóstico
positivo más elevado (17-19). Para mejorar la clasificación de pacientes con masa pélvica,
el EIA HE4 puede utilizarse simultáneamente con los ensayos ARCHITECT CA125 II,
EIA CanAg CA125 o Lumipulse G CA125II, como ayuda en la estimación del riesgo
de cáncer ovárico epitelial en una paciente. Los resultados deben interpretarse en
combinación con otros métodos según las guías terapéuticas y clínicas estándar. Un
uso complementario del EIA HE4 es la ayuda en la monitorización de la respuesta al
tratamiento en pacientes con cáncer ovárico epitelial invasivo. Los resultados deben
utilizarse en combinación con otros métodos clínicos usados para la monitorización
del cáncer ovárico.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
El EIA HE4 es un inmunoensayo en fase sólida no competitivo basado en la técnica
de sandwich directa, que usa dos anticuerpos monoclonales de ratón, 2H5 y 3D8,
dirigidos contra dos epítopos del dominio C-WFDC de la HE4. Los calibradores, los
controles y las muestras de las pacientes se incuban junto con el anticuerpo monoclonal
(MAb) 2H5 anti-HE4 biotinilado en microtiras revestidas con estreptavidina. La HE4
presente en los calibradores o muestras es adsorbida en las microtiras recubiertas con
estreptavidina por el MAb anti-HE4 biotinilado durante la incubación. A continuación,
las tiras se lavan e incuban con el MAb 3D8 anti-HE4 marcado con HRP. Después
del lavado, se añade sustrato tamponado/reactivo cromógeno (peróxido de hidrógeno
y 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) a cada pocillo y se deja que se produzca la reacción
enzimática. Si hay antígeno, durante la reacción enzimática se desarrollará un color azul.
La intensidad del color es proporcional a la cantidad de HE4 presente en las muestras.
6
La intensidad del color se determina en un espectrofotómetro de microplacas a 620 nm
(o bien a 405 nm tras la adición de solución de parada). Se construyen curvas de
calibración para cada ensayo representando el valor de la absorbancia con respecto
a la concentración de cada calibrador. Finalmente, se leen las concentraciones de
HE4 de las muestras de las pacientes a partir de la curva de calibración.
REACTIVOS
•Cada kit EIA HE4 contiene reactivos para 96 determinaciones.
•La fecha de caducidad del kit viene indicada en la etiqueta de la parte exterior
de la caja.
•No use el kit después de la fecha de caducidad.
• No mezcle reactivos de diferentes lotes de kits.
• Conserve el kit a una temperatura de 2 ºC a 8 ºC. No lo congele.
• Los reactivos abiertos se mantienen estables según los plazos indicados en
la tabla siguiente siempre que no estén contaminados, se almacenen en los
recipientes originales nuevamente cerrados y se manipulen debidamente. Vuelva
a dejarlos a una temperatura de 2 ºC a 8 ºC inmediatamente después de su uso.
Componente
CantidadAlmacenamiento y estabilidad
tras el primer uso
MICROPLA
Microplaca1 placa
2-8 °C hasta la fecha de
caducidad indicada en la placa
12 x 8 pocillos separables recubiertos con estreptavidina. Después de abrir el envase,
devuelva inmediatamente las tiras no utilizadas a la bolsa de aluminio con desecante.
Vuelva a cerrarla cuidadosamente para mantenerlos secos.
CAL
HE4
A
Calibrador A del HE4
1 x 8 mL2-8 °C hasta la fecha de
caducidad indicada en el vial
Solución salina tamponada con fosfato que contiene albúmina sérica bovina,
un colorante amarillo inerte y un conservante antimicrobiano sin azida. Listo para
su uso. Debe utilizarse también para la dilución de las muestras.
7
Componente
CantidadAlmacenamiento y estabilidad
tras el primer uso
Calibradores B-F del HE4
5 viales, liofilizadosEstabilidad tras
la reconstitución
4 semanas a 2-8 °C
4 meses a -20 °C o una
temperatura inferior
CAL
HE4
B
CAL
HE4
C
CAL
HE4
D
CAL
HE4
E
CAL
HE4
F
1 x 1 mL
1 x 1 mL
1 x 1 mL
1 x 1 mL
1 x 1 mL
Los calibradores liofilizados contienen antígeno HE4 en una solución salina
tamponada con fosfato con albúmina sérica bovina, un colorante amarillo inerte
y un conservante antimicrobiano sin azida. Para reconstituir con agua destilada
o desionizada antes de su uso.
NOTA: La concentración exacta de HE4 es específica del lote y se indica en la
etiqueta de cada vial.
Controles del HE4
2 viales, liofilizadosEstabilidad tras
la reconstitución
4 semanas a 2-8 °C
4 meses a -20 °C o una
temperatura inferior
CONTROL
HE4
1 1 x 1 mL
CONTROL
HE4
2
1 x 1 mL
Los controles liofilizados contienen antígeno HE4 en una matriz sérica humana
y un conservante antimicrobiano sin azida. Para reconstituir con agua destilada
o desionizada antes de su uso.
BIOTIN
Anti-HE4
Anti-HE4 con biotina
1 x 15 mL 8
2-8 °C hasta la fecha de
caducidad indicada en el vial
Anticuerpo monoclonal anti-HE4 de ratón marcado con biotina, aproximadamente
1 μg/mL. Contiene solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2), albúmina sérica
bovina, agentes bloqueantes, detergente, un colorante rojo inerte y un conservante
antimicrobiano sin azida. Listo para su uso.
Componente
CONJ
Anti-HE4
CantidadAlmacenamiento y estabilidad
tras el primer uso
Marcador, anti-HE4 con HRP 1 x 0,75 mL2-8 °C hasta la fecha de
caducidad indicada en el vial
Solución de reserva de anticuerpo monoclonal anti-HE4 de ratón marcado con
HRP, aproximadamente 40 μg/mL. Contiene conservantes antimicrobianos sin
azida. Para diluir con diluyente para marcador antes de usar.
DIL
CONJ
Diluyente para marcador
1 x 15 mL2-8 °C hasta la fecha de
caducidad indicada en el vial
Solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2) que contiene albúmina sérica
bovina, agentes bloqueantes, detergentes, un colorante azul inerte y un conservante
antimicrobiano sin azida. Listo para su uso.
SUBS
TMB
Sustrato-HRP con TMB 1 x 12 mL2-8 °C hasta la fecha de
caducidad indicada en el vial
Contiene peróxido de hidrógeno tamponado y 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB).
Listo para su uso.
STOP
Solución de parada1 x 15 mL
2-8 °C hasta la fecha de
caducidad indicada en el vial
Contiene ácido clorhídrico 0,12 M. Listo para su uso.
9
Componente
WASHBUF
CantidadAlmacenamiento y estabilidad tras
el primer uso
25X Concentrado de lavado 1 x 50 mL 2-8 °C hasta la fecha de
caducidad indicada en el frasco
Solución salina tamponada con Tris-HCl y estabilizada con Tween 20. Contiene
Germall II como conservante. Para diluir 25 veces con agua destilada o desionizada
antes de usar.
Indicaciones de inestabilidad
La solución de sustrato-HRP con TMB debe ser incolora o ligeramente azulada.
Un color azul indica que el reactivo se ha contaminado y debe desecharse.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Para uso diagnóstico in vitro:
• Siga las instrucciones que figuran en el prospecto. La fiabilidad de los resultados
del ensayo no puede garantizarse si no se siguen las correspondientes
instrucciones de empleo.
•Manipule todas las muestras de las pacientes como potencialmente infecciosas.
Se recomienda que el reactivo original humano y las muestras humanas se
manipulen de acuerdo con el estándar de la OSHA sobre patógenos transmitidos
por la sangre (20). Debe aplicarse el nivel de bioseguridad 2 (21), u otras
prácticas adecuadas de bioseguridad, para manipular materiales que contienen
o se sospecha que contienen agentes infecciosos.
•Siga las directrices locales para la eliminación de todos los materiales de desecho.
Advertencia
Los materiales usados en la preparación del reactivo original humano han sido
analizados y se ha comprobado que no reaccionan con los anticuerpos anti-VIH 1 y 2,
el anticuerpo anti-VCH y el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Puesto
que ningún método puede descartar completamente la presencia de enfermedades
transmitidas por la sangre, la manipulación y eliminación de los reactivos originales
humanos de este producto deben realizarse como si fueran potencialmente infecciosos.
RECOGIDA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
El EIA HE4 está destinado para utilizarse con suero (incluido el suero recogido en
tubos de centrifugadora (SST)). El plasma y otros líquidos corporales no se han
validado para su uso con el EIA HE4. Recoja la sangre mediante venopunción y siga
las instrucciones de procesamiento del fabricante del tubo de recogida. Cuando se
evalúen muestras seriadas, debe utilizarse el mismo tipo de muestra en todo el estudio.
10
El suero puede conservarse entre 2 ºC y 8 °C durante 3 días antes de ser analizado.
Para periodos más largos, guarde las muestras a -40 °C o a una temperatura inferior.
Lleve las muestras congeladas a temperatura ambiente y mézclelas
COMPLETAMENTE invirtiéndolas con cuidado varias veces antes del análisis.
Las muestras que contienen partículas grandes deben centrifugarse a 10,000 x g
durante 10 minutos antes del uso para eliminar cualquier material particulado que
pueda haberse formado en el proceso de descongelación.
PROCEDIMIENTO
Materiales necesarios pero no suministrados con el kit
1.Agitador de microplacas
2.
La agitación debe ser entre moderada y vigorosa, aproximadamente a 700‑1,100
oscilaciones por minuto.
Lavadora de microplacas
La lavadora automática de placas debe ser capaz de realizar 1, 3 y 6 ciclos
de lavado y debe tener un volumen de llenado mínimo de 350 µL por pocillo
y ciclo de lavado.
Se recomienda emplear una pipeta de 8 canales con puntas de plástico
desechables para administrar 350 µL, si no se utiliza una lavadora automática
de microplacas.
3. Espectrofotómetro de microplacas
Debe utilizarse una longitud de onda de 620 nm y/o 405 nm y un rango de
absorbancia de 0 a 3,0.
4. Pipetas de precisión
Deben usarse puntas de plástico desechables que permitan administrar
volúmenes en microlitros. Se recomienda utilizar una pipeta de 8 canales o una
pipeta dispensadora con puntas de plástico desechables para la administración
de 100 µL, aunque no es absolutamente necesario. Pipetas para administrar
volúmenes de mililitros.
5. Agua destilada o desionizada
Para la reconstitución de los calibradores del HE4 y los controles del HE4
y para la elaboración de la solución de lavado diluida.
Notas del procedimiento
1. E
s necesaria una plena comprensión de estas instrucciones de empleo que
figuran en el prospecto para garantizar el uso adecuado del kit EIA HE4. Los
reactivos suministrados con el kit están pensados para utilizarse como una
unidad integral. No mezcle reactivos idénticos de kits con números de lote
diferentes. No use los reactivos del kit después de la fecha de caducidad
impresa en la parte exterior de la caja.
2. Debe dejarse que los reactivos alcancen la temperatura ambiente (20-25 ºC)
antes de utilizarlos. Las muestras deben mezclarse suave pero completamente
tras la descongelación. El ensayo solo debe realizarse a temperaturas
comprendidas entre 20 ºC y 25 ºC para obtener resultados precisos.
11
3. A
ntes de comenzar a pipetear los calibradores y las muestras de las pacientes,
es aconsejable marcar las tiras para poder identificar claramente las muestras
durante y después del ensayo.
4. El requisito de un lavado eficaz y profundo para la separación del antígeno
unido y no unido y los reactivos de los complejos anticuerpo-antígeno unidos
a la fase sólida es uno de los pasos más importantes en un EIA. A fin de
garantizar un lavado eficaz, compruebe que todos los pocillos estén
totalmente llenos con solución de lavado hasta el borde superior
durante cada ciclo de lavado, que la solución de lavado se administre
con una velocidad de dispensación adecuada, que la aspiración de
los pocillos entre y después de los ciclos de lavado sea completa y
que los pocillos estén vacíos. Si queda líquido en los pocillos, invierta
la placa y golpéela con cuidado contra papel absorbente.
-Lavador automático de tiras: Siga las instrucciones del fabricante para efectuar
una limpieza y un mantenimiento apropiados y realice el número necesario
de ciclos de lavado antes y después de cada paso de la incubación. El
dispositivo de aspiración/lavado no debe dejarse de pie con la solución de
lavado durante períodos prolongados, ya que las agujas podrían obstruirse,
lo que provocaría una mala dispensación y aspiración de líquido.
5. La solución de sustrato-HRP con TMB es muy sensible a la contaminación. Para
conseguir la estabilidad óptima de la solución de sustrato-HRP con TMB, vierta
la cantidad necesaria del vial a un recipiente limpiado a fondo o, preferiblemente,
a una bandeja de plástico desechable, para evitar la contaminación del reactivo.
Utilice siempre puntas de pipeta de plástico desechables limpias (o puntas
de pipeta dispensadora).
6. Utilice siempre puntas de pipeta de plástico desechables limpias, así como
una técnica de pipeteado preciso adecuada, al manipular muestras y reactivos.
Evite que la punta de la pipeta toque la superficie del líquido para impedir su
contaminación. Emplear una técnica de pipeteado apropiada es especialmente
importante al manipular las muestras y el sustrato-HRP con TMB.
Preparación de los reactivos
Estabilidad del reactivo preparado
Calibradores B-F del HE4 4 semanas a 2-8 ºC
4 meses a -20 °C o una temperatura inferior
Añada exactamente 1,0 mL de agua destilada o desionizada a cada vial. Deje
reposar al menos 15 minutos para reconstituir y mezcle suavemente antes del uso.
NOTA: La concentración de los calibradores se indica en las etiquetas y debe
usarse para el cálculo de los resultados.
12
Preparación de los reactivos
Estabilidad del reactivo preparado
Controles 1 y 2 del HE4
4 semanas a 2-8 ºC
4 meses a -20 °C o una temperatura inferior
Añada exactamente 1,0 mL de agua destilada o desionizada a cada vial y mezcle
suavemente. Deje reposar al menos 15 minutos para reconstituir y mezcle
suavemente antes del uso. NOTA: Los rangos de los controles están indicados
en las etiquetas.
Solución de lavado2 semanas a 2-25 °C
en un recipiente cerrado
Vierta los 50 mL del concentrado de lavado en un recipiente limpio y diluya 25 veces
añadiendo 1,200 mL de agua destilada o desionizada para conseguir una solución
de lavado tamponada.
Solución de trabajo de marcador4 semanas a 2-8 ºC
en un recipiente cerrado
Prepare la cantidad necesaria de solución de trabajo de marcador mezclando
50 μL de marcador, anti-HE4 con HRP, con 1 mL de diluyente para marcador por
tira (véase la tabla siguiente):
Número de tiras
Marcador, anti-HE4 con HRP Diluyente para marcador
(µL) (mL) 1 50 1
2100 2
3150 3
4200 4
5250 5
6300 6
7350 7
8400 8
9450 9
10500
10
11550
11
12600
12
Asegúrese de usar un tubo limpio de plástico o vidrio para preparar la solución
de trabajo de marcador.
Alternativa: Vierta el contenido del marcador, anti-HE4 con HRP, en el vial de
diluyente para marcador y mezcle suavemente. Compruebe que todo el contenido del
vial del marcador, anti-HE4 con HRP, se transfiere al vial de diluyente para marcador.
13
NOTA: La solución de trabajo de marcador es estable durante 4 semanas a una
temperatura de 2 ºC a 8 ºC. No prepare más solución de trabajo de marcador de
la que vaya a utilizar en este periodo y asegúrese de almacenarla correctamente.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Realice cada determinación por duplicado para los dos calibradores, los controles
y las muestras desconocidas. Debe elaborarse una curva de calibración en cada
ensayo. Todos los reactivos y muestras deben llevarse a temperatura ambiente
(20-25 ºC) antes de su uso.
1. Para empezar, prepare los calibradores B-F, los controles 1 y 2, la solución de
lavado y la solución de trabajo de marcador. Es importante usar recipientes
limpios. Siga las instrucciones cuidadosamente.
2. Transfiera el número necesario de tiras de microplacas a un soporte de tiras.
(Devuelva inmediatamente las tiras no utilizadas a la bolsa de aluminio con desecante
y vuelva a cerrarla cuidadosamente). Lave cada tira una vez con la solución de
lavado. No lave más tiras de las que puedan manejarse en 30 minutos.
3. Pipetee 25 µL de cada uno de los calibradores del HE4 (CAL A, B, C, D, E
y F), los controles del HE4 (C1 y C2) y las muestras desconocidas (desc.)
en los pocillos de tiras de acuerdo con el esquema siguiente:
1
2
3
A
Cal
A
Cal
E
Primera
Desc.
B
Cal
A
Cal
E
Primera
Desc.
C
Cal
B
Cal
F
2
Desc.
D
Cal
B
Cal
F
2
Desc.
E
Cal
C
C1
F
Cal
C
C1
G
Cal
D
C2
H
Cal
D
C2
4
5
6
7, etc.
4. A
ñada 100 μL de anti-HE4 con biotina a cada pocillo usando una pipeta de precisión
de 100 μL (o una pipeta de precisión de 100 μL de 8 canales). Evite que la punta
de la pipeta toque la superficie del líquido para impedir su contaminación.
14
5. Incube la placa durante 1 hora (± 10 min) a temperatura ambiente (20-25 ºC)
agitándola constantemente usando un agitador de microplacas.
6. Tras la primera incubación, aspire y lave cada tira 3 veces usando el procedimiento
de lavado descrito en las notas del procedimiento (punto 4).
7. Añada 100 µL de solución de trabajo de marcador a cada pocillo. Use el mismo
procedimiento de pipeteado que en el punto 4 anterior.
8. Incube el marco durante 1 hora (± 5 min) a temperatura ambiente (20-25 °)
agitando constantemente.
9. Tras la segunda incubación, aspire y lave cada tira 6 veces usando
el procedimiento de lavado descrito en las notas del procedimiento (punto 4).
10. Añada 100 µL de sustrato-HRP con TMB a cada pocillo utilizando la misma
técnica de pipeteado que en el punto 4 anterior.
El sustrato-HRP con TMB debe añadirse a los pocillos con la mayor rapidez
posible y el tiempo entre la adición al primer pocillo y la adición al último debe
ser inferior a 5 minutos.
11. Incube durante 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente (20-25 °C),
agitando constantemente. Evite la exposición a luz solar directa.
12. Lea inmediatamente la absorbancia a 620 nm en un espectrofotómetro de
microplacas.
Opción
Si el laboratorio no tiene acceso a un lector de microplacas capaz de leer a 620 nm,
la absorbancia puede determinarse tal como se indica en el punto 12 alternativo
siguiente:
Alt. 12. Añada 100 µL de solución de parada, mezcle y lea la absorbancia a
405 nm en un espectrofotómetro de microplacas dentro de los 15 minutos
siguientes a la adición de la solución de parada.
Rango de medición
El EIA HE4 mide concentraciones entre 15 y 900 pM. Si se espera obtener
concentraciones de HE4 superiores al intervalo de medición, se recomienda
diluir las muestras con calibrador A del HE4 antes del análisis (véase “Cálculo de
resultados con muestras diluidas”).
Control de calidad
Los controles 1 y 2 de HE4 deben utilizarse para la validación de cada serie de
ensayos. Los rangos de los resultados esperados están indicados en las etiquetas
de los viales.
Los resultados del ensayo HE4 deben considerarse válidos si:
-Los valores medios de los duplicados de control se encuentran dentro de los
rangos especificados.
- Las réplicas de duplicados de los calibradores B-F y los controles no superan
un CV del 15 %.
- Las réplicas de duplicados del calibrador A (cero) no difieren entre sí más
de 0,06 unidades de densidad óptica (DO).
15
Si un ensayo produce resultados no válidos para el calibrador o el control, deberán
revisarse completamente los reactivos, la precisión de las pipetas, la lavadora de placas
y el rendimiento del lector y, a continuación, se repetirán los análisis. Cada laboratorio
puede asimismo preparar sus propios grupos de suero con diferentes niveles, que
pueden utilizarse como controles internos para garantizar la precisión del ensayo.
Material de referencia
Como no se dispone de material de referencia común para el antígeno HE4, los
valores del calibrador del EIA HE4 se asignan de acuerdo a una serie de estándares
de referencia internos.
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
Si se usa un lector de espectrofotómetro de microplacas con programa de cálculo
incorporado, consulte el manual del espectrofotómetro y cree un programa usando
la concentración indicada en la etiqueta de cada uno de los calibradores del HE4.
Para el cálculo automático de los resultados de HE4, se recomienda usar cualquiera
de los métodos siguientes:
• Método de ajuste de la curva spline cúbica. El calibrador A debe estar
incluido en la curva con el valor 0 pM.
• Interpolación con evaluación punto a punto. El calibrador A debe estar
incluido en la curva con el valor 0 pM.
• Método de ajuste de la curva cuadrática. El calibrador A debe estar incluido
en la curva con el valor 0 pM.
NOTA: No deben usarse métodos de evaluación por regresión lineal ni paramétricos
de grado 4. Para la evaluación manual, se construye una curva de calibración
representando los valores de absorbancia (A) obtenidos para cada calibrador del
HE4 frente a la correspondiente concentración de HE4 (en pM).
Las concentraciones de HE4 desconocidas pueden leerse después a partir de la curva
de calibración usando el valor de absorbancia medio de cada muestra de paciente.
Cálculo de resultados con muestras diluidas
Si las muestras en un análisis inicial dan valores de HE4 superiores a 900 pM, deben
diluirse a 1/10 y 1/100 con calibrador A del HE4 para obtener la concentración
de HE4 exacta de las muestras.
- Dilución a 1/10 = 50 µL de muestra + 450 µL de calibrador A del HE4
- Dilución a 1/100 = 50 µL de dilución a 1/10 + 450 µL de calibrador A del HE4
La concentración de HE4 de la muestra no diluida se calcula entonces de la
manera siguiente:
- Dilución a 1/10: 10 x valor medido
- Dilución a 1/100: 100 x valor medido
16
Cálculo del valor ROMA
El algoritmo de riesgo de neoplasia ovárica maligna (risk of Ovarian Malignancy
Algorithm, ROMA) es una prueba sérica que combina los resultados de HE4,
CA125 y estado menopáusico en un valor ROMA.
Cálculo del índice pronóstico
Se calcula un índice pronóstico (IP) para mujeres premenopáusicas y
posmenopáusicas por separado utilizando las ecuaciones (1) y (2) indicadas a
continuación. Para calcular el IP, los valores de ensayo obtenidos con el EIA HE4
y con los ensayos ARCHITECT CA125 II, EIA CanAg CA125 o Lumipulse G
CA125II, respectivamente, se introducen en la ecuación aplicable del algoritmo
siguiente, en función del estado menopáusico de la mujer.
(1) Mujer premenopáusica
Índice pronóstico (IP) = -12,0 + 2,38*LN[HE4] + 0,0626*LN[CA125]
(2) Mujer posmenopáusica
Índice pronóstico (IP) = -8,09 + 1,04*LN[HE4] + 0,732*LN[CA125]
Cálculo del valor ROMA
Para calcular el valor ROMA (es decir, la probabilidad predictiva), introduzca el
valor calculado del índice predictivo en la ecuación (3):
(3) Valor ROMA (%) = exp(IP) / [1 + exp(IP)] * 100
Los ejemplos siguientes pueden utilizarse para validar los cálculos del IP y del
valor ROMA:
Estado
menopáusico
HE4
(pM)
CA125
(U/mL)
Cálculo del IP
IP
ROMA
(%)
Premenopáusico
37,5
74,9
-12,0+(2,38*3,624)
+(0,0626*4,316)
-3,10388
4,29
Premenopáusico
386,6
21,8
-12,0+(2,38*5,957)
+(0,0626*3,082)
2,371517
91,5
Posmenopaúsico
66,7
11,3
-8,09+(1,04*4,200)
+(0,732*2,425)
-1,94683
12,5
Posmenopaúsico
383,1
22,7
-8,09+(1,04*5,948)
+(0,732*3,122)
0,381799
59,4
17
18
REF
404-10
Prepare Wash Solution
Prepare Tracer working solution
Prepare HE4 Controls
Prepare HE4 Calibrators
1.
Step
HE4
DIL
CONJ
25X
CONJ
Anti-HE4
WASHBUF
1, 2
CONTROL HE4
B, C, D, E, F
CAL
Vial/Plate
Tracer, HRP Anti-HE4
(µL)
Tracer Diluent
(mL)
1
50
1
2
100 2
3150 3
4
200 4
5
250
5
6
300
6
7
350
7
8
400
8
9
450
9
1050010
1155011
12
600
12
No. of
Strips
Dilute 50 mL of Wash Concentrate with 1200 mL
of distilled or deionised water.
Mix 50 µL of Tracer, HRP Anti-HE4 with 1mL of
Tracer Diluent per strip:
Add 1 mL of distilled or deionised water to each
vial and mix gently. Allow to stand for at least 15
minutes. NOTE: The exact concentration of each
calibrator is stated on the label. Reconstituted
stability: 4 weeks at 2-8oC.
Procedure
Prepare the components directly before use. Use wash and incubation conditions according to the Instructions.
Note. The assay should only be performed at temperatures between 20–25oC to obtain accurate results.
HE4 EIA
Protocol Sheet
19
Wash
MICROPLA
12.
100 µL in each well
Allow to mix at 20–25oC
Read at 405 nm within 15 min
STOP MICROPLA
MICROPLA
Alt,12Add Stop Solution
Alt,13Mix
Alt,14Read absorbance
Read absorbance
30 min shaking at 20–25oC
620 nm
MICROPLA
1 hour shaking at 20–25oC
Wash each well six times with Wash Solution.
Use manual or automatic washer.
100 µL in each well
11.Incubate
MICROPLA
MICROPLA
TRACER WORKING
SOLUTION
MICROPLA
MICROPLA
BIOTIN Anti-HE4
100 µL in each well
Add TMB HRP-Substrate
CONTROL HE4
1, 2
100 µL in each well
1 hour shaking at 20–25oC
Wash each well three times with Wash Solution
Use manual or automatic washer.
25 µL in each well
CAL
A, B, C, D, E, F
HE4
Wash each well once with Wash Solution.
Use manual or automatic washer.
MICROPLA
SUBS TMB
10.
Wash
Add Tracer working solution
7.
9.
Wash
6.
Incubate
Incubate
5.
8.
Add Biotin Anti-HE4
4.
3. Add calibrators, controls
and samples
2.
1155011
12
600
12
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Las pacientes con cáncer ovárico confirmado pueden presentar valores del ensayo
HE4 en el mismo intervalo que las mujeres sanas. Ciertos tipos histológicos de
cáncer ovárico, por ejemplo, los tumores mucinosos o de células germinales,
raramente expresan HE4, por lo que no se recomienda emplear HE4 para monitorizar
pacientes con diagnóstico de cáncer ovárico mucinoso o de células germinales
(7). Inversamente, puede haber niveles elevados de antígeno HE4 en mujeres
con enfermedad no maligna. Por tanto, el nivel de HE4 no puede usarse como
prueba absoluta de la presencia o ausencia de enfermedades malignas, y no debe
utilizarse la prueba de HE4 en el cribado del cáncer. Los resultados de la prueba
deben interpretarse solo conjuntamente con los resultados de otros análisis y
procedimientos de diagnóstico de las enfermedades y tratamiento de las pacientes
y la prueba de HE4 no puede sustituir a ninguna exploración clínica establecida.
El algoritmo de riesgo de neoplasia ovárica maligna no se ha validado para los
siguientes grupos de pacientes: pacientes tratadas previamente por tumor maligno,
pacientes actualmente en quimioterapia y pacientes menores de 18 años de edad.
La forma de la función matemática denominada «Algoritmo de riesgo de malignidad
ovárica» (ROMA) depende del estatus premenopáusico o posmenopáusico de una
mujer. El estatus premenopáusico o posmenopáusico debe basarse en la función
ovárica determinada mediante datos disponibles que procedan de la evaluación
clínica y la historia médica. El valor ROMA no incluye edad, historial familiar, signos
clínicos ni resultados de diagnóstico por imagen y debe interpretarse en combinación
con estos parámetros.
La incapacidad del EIA HE4 y/o del ensayo CA125 para funcionar como se ha
indicado, o un error en el cálculo de los resultados, puede conducir a una evaluación
de riesgo inexacta o un tratamiento inadecuado de la paciente. En concreto, un
resultado falsamente bajo del ensayo puede llevar a determinar que la paciente
tiene bajo riesgo de cáncer ovárico epitelial, lo que podría derivar a la paciente a
un nivel de asistencia menos especializado.
Por tanto, el uso de los resultados del ensayo sin considerar los demás resultados
de laboratorio, los estudios de diagnóstico por imagen y la evaluación clínica podría
suponer un riesgo.
Los anticuerpos anti-reactivo (anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) o anticuerpos
heterófilos) de la muestra de la paciente pueden interferir ocasionalmente con el
ensayo, aunque se incluyan agentes bloqueantes específicos en los tampones.
El ensayo debe realizarse en un entorno con temperatura controlada, ya
que la incubación a temperaturas superiores al intervalo recomendado
de 20-25 °C puede dar resultados falsamente bajos.
20
VALORES ESPERADOS
La distribución de los niveles de HE4 determinados en 1983 muestras se indica
en las tablas siguientes:
Distribución de los valores del ensayo HE4
Número 0,0 - 150,0 pM
de sujetos
150,1 300,0 pM
300,1 500,0 pM
> = 500,1 pM
APARENTEMENTE SANAS
Mujeres
(premenopáusicas)
423 416 (98 %)
4 (0,9 %) 0 (0,0 %)
3 (0,7 %)
Mujeres
(posmenopáusicas)
443 424 (96 %) 16 (3,6 %) 2 (0,5 %)
1 (0,2 %)
CASOS BENIGNOS
Embarazo
Trastorno ginecológico
0 (0,0%)
0 (0,0%)
347 324 (93 %) 18 (5,2 %) 1 (0,3 %)
4 (1,2 %)
22
21 (95 %)
1 (4,5%)
benigno
Otros casos benignos
Hipertensión/Insuf.
107
96
81 (76 %)
8 (7,5 %) 7 (6,5 %) 11 (10 %)
75 (78 %) 16 (17 %) 2 (2,1 %)
3 (3,1 %)
cardiaca congestiva
CÁNCER
127
27 (21 %)
18 (14%) 21 (16 %) 61 (48 %)
Cáncer de mama
46
40 (87 %)
4 (8,7 %) 2 (4,3 %)
0 (0,0 %)
Cáncer de pulmón
50
28 (56 %) 16 (32 %) 6 (12 %)
0 (0,0 %)
Cáncer ovárico
Cáncer de endometrio
Cáncer gastrointestinal
266 203 (76 %) 36 (14 %) 11 (4,1 %) 16 (6,0 %)
56
47 (84 %)
21
8 (14 %) 0 (0,0 %)
1 (1,8 %)
Niveles del ensayo HE4 distribuidos por edad para mujeres aparentemente sanas
Resultado de HE (pM)
Edad
(años)
N
Mediana
Percentil 95
< 40
316
47,6
81,6
40–49
110
48,2
110,6
50–59
179
52,5
104,4
60–69
208
60,7
113,0
≥70
53
91,1
233,3
En este estudio, el 98 % de las mujeres premenopáusicas sanas presentaron un
valor en el EIA HE4 < 150 pM y el 96 % de las mujeres posmenopáusicas sanas
presentaron un valor en el EIA HE4 < 150 pM. Se recomienda que cada laboratorio
establezca su propio valor de referencia para la población de interés.
Monitorización del estado de la enfermedad en pacientes diagnosticadas de cáncer ovárico
La eficacia del EIA HE4 como ayuda en la monitorización del estado de la enfermedad
en pacientes con cáncer ovárico se determinó evaluando los cambios en los niveles
de HE4 en muestras de suero seriadas de 80 pacientes en comparación con los
cambios en el estado de la enfermedad. Se llevó a cabo un estudio con un total de
354 pares de observaciones, con una media de 4,4 observaciones por paciente.
Un cambio positivo en la HE4 se definió como un incremento en el valor que fuera
al menos un 25 % superior al valor anterior de la prueba. Este nivel de cambio
tiene en cuenta la variabilidad del ensayo y la variabilidad biológica. El 60 % de
las muestras de pacientes (76/126) con un cambio positivo se correlacionó con la
progresión de la enfermedad, mientras que el 75 % de las muestras seriadas de
paciente (171/228) sin cambios significativos en el valor de HE4 se correlacionó
con la ausencia de progresión. La concordancia total fue del 70 % (247/354). La
tabla siguiente presenta los datos en un formato 2 x 2.
Cambio en el estado de la enfermedad por par secuenciado
Aumento en la concentración de HE4
Progresión No progresión
Total
>25 % 76
57133
< 25 % 50
171221
Total126
228354
22
La tabla siguiente muestra la distribución por paciente. El 93 % de los juegos
de sueros de paciente (54/58) con un cambio positivo se correlacionó con la
progresión de la enfermedad, mientras que el 32 % de los juegos de sueros (7/22)
que no mostraron cambios significativos en el valor de HE4 se correlacionó con la
ausencia de progresión. La concordancia total en este estudio fue del 76 % (61/80).
Cambio en el estado de la enfermedad por paciente
Aumento en la concentración de HE4
Progresión No progresión
Total
>25 %
54
15 69
< 25 % 4 7
11
Total
58
22 80
Estimación del riesgo en pacientes que presentan masa pélvica
La eficacia del EIA HE4 en combinación con el CA125 determinado mediante los
ensayos ARCHITECT CA125 II, EIA CanAg CA125 o Lumipulse G CA125II, para
la estimación del riesgo de cáncer ovárico epitelial en pacientes que presentan
masa pélvica se determinó en un ensayo clínico prospectivo, multicéntrico y doble
ciego. Se desarrolló un algoritmo (ROMA, véase página 17) para la estimación del
riesgo de cáncer ovárico epitelial. Este algoritmo tiene en cuenta los valores de
HE4 y CA125, así como el estado menopáusico de la paciente. El algoritmo calcula
una probabilidad pronóstica de encontrar cáncer ovárico epitelial al realizar cirugía.
En el estudio prospectivo se incluyó un total de 502 pacientes y se determinó la
probabilidad pronóstica de cáncer ovárico, así como la posibilidad de separación
en grupos de bajo y alto riesgo basada en valores ROMA.
La distribución de frecuencias acumuladas de los valores ROMA para casos benignos
y casos de cáncer ovárico, incluidos los tumores de potencial maligno bajo (LMP),
calculada mediante el algoritmo, se indica en las figuras 1 y 2, respectivamente, para
la combinación de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125 II, y en las figuras 3 y 4
para la combinación de ensayos EIA HE4 + EIA CanAg CA125. La combinación de
ensayos EIA HE4 + Lumipulse G CA125II mostró una distribución de frecuencias
muy similar a la de la combinación de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125
II. Las gráficas de la distribución de frecuencias ilustran la distribución de las
pacientes con enfermedad benigna y cáncer ovárico epitelial (incluyendo LMP),
respectivamente, en diferentes puntos de corte del valor ROMA.
23
Benigno (N=200)
Cáncer (N=34)
% de casos de cáncer con valor ROMA inferior
% de casos benignos con valor ROMA inferior
Fig. 1 Distribución de frecuencias acumuladas de los valores ROMA para mujeres
premenopáusicas. Combinación de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125 II
Valor ROMA: EIA HE4 + Architect CA 125 II
Benigno (N=151)
Cáncer (N=117)
Valor ROMA: EIA HE4 + Architect CA 125 II
24
% de casos de cáncer con valor ROMA inferior
% de casos benignos con valor ROMA inferior
Fig. 2 Distribución de frecuencias acumuladas de los valores ROMA para mujeres
posmenopáusicas. Combinación de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125 II
Benigno (N=200)
Cáncer (N=34)
% de casos de cáncer con valor ROMA inferior
% de casos benignos con valor ROMA inferior
Fig. 3 Distribución de frecuencias acumuladas de los valores ROMA para mujeres
premenopáusicas. Combinación EIA HE4 + EIA CanAg CA125
Valor ROMA: EIA HE4 + CanAg CA 125
Benigno (N=151)
Cáncer (N=117)
Valor ROMA: EIA HE4 + CanAg CA 125
25
% de casos de cáncer con valor ROMA inferior
% de casos benignos con valor ROMA inferior
Fig. 4 Distribución de frecuencias acumuladas de los valores ROMA para
mujeres posmenopáusicas. Combinación EIA HE4 + EIA CanAg CA125
Estratificación en grupos de bajo y alto riesgo
Se empleó el algoritmo de riesgo de neoplasia ovárica maligna para estratificar a las
mujeres en grupos de riesgo para detectar cáncer ovárico epitelial. Se utilizaron los
siguientes puntos de corte con objeto de alcanzar un nivel de especificidad del 75 %.
Debe tenerse en cuenta que los diferentes puntos de corte para la estratificación
del riesgo en grupos de alto y bajo riesgo deben seleccionarse en función del
ensayo CA125 que se utilice.
Puntos de corte para alcanzar un nivel de especificidad del 75 %, para la combinación
de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125II:
Mujeres premenopáusicas
Valor ROMA > 13,1 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Valor ROMA < 13,1 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Mujeres posmenopáusicas
Valor ROMA > 27,7 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Valor ROMA < 27,7 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Puntos de corte para alcanzar un nivel de especificidad del 75 %, para la
combinación de ensayos EIA HE4 + CanAg CA125:
Mujeres premenopáusicas
Valor ROMA > 12,5 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Valor ROMA < 12,5 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Mujeres posmenopáusicas
Valor ROMA > 14,4 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Valor ROMA < 14,4 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Puntos de corte para alcanzar un nivel de especificidad del 75 %, para la
combinación de ensayos EIA HE4 + Lumipulse G CA125II:
Mujeres premenopáusicas
Valor ROMA > 13,1 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Valor ROMA < 13,1 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Mujeres posmenopáusicas
Valor ROMA > 27,7 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
Valor ROMA < 27,7 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial
La estratificación del riesgo en alto riesgo de presentar cáncer ovárico epitelial
en todas las pacientes con masa anexial mediante los valores ROMA con un nivel
de especificidad del 75 % se muestra en la tabla 1, incluida la estratificación del
riesgo obtenida por separado para los grupos de pacientes premenopáusicas y
posmenopáusicas, respectivamente. La sensibilidad de la estratificación de pacientes
con cáncer ovárico epitelial (estadio I-IV) en el grupo de alto riesgo fue del 94 %,
con una especificidad del 75 %, de manera que el 75 % de las mujeres con masa
pélvica benigna quedaron clasificadas en el grupo de bajo riesgo. Los valores
26
pronósticos positivos y negativos fueron del 58 % y del 97 %, respectivamente.
Tabla 1: Estratificación del riesgo en alto riesgo de presentar cáncer ovárico epitelial
(EOC) en pacientes con masa anexial utilizando la combinación de ensayos EIA
HE4 + ARCHITECT CA125 II para calcular el valor ROMA.
Punto de corte premenopáusico > 13,1 % para la estratificación en el grupo de
alto riesgo con un nivel de especificidad del 75 %,
Punto de corte posmenopáusico > 27,7 % para la estratificación en el grupo de
alto riesgo con un nivel de especificidad del 75 %.
Mujeres premenopáusicas
n = 234
Mujeres posmenopáusicas
n = 268
Mujeres premenopáusicas y posmenopáusicas combinadas
n = 502
26/34 (76%)
108/117 (92%)
134/151 (89%)
10/16 (63%)
3/6 (50%)
13/22 (59%)
6/7 (86%)
24/28 (86%)
30/35 (86%)
EOC estadios
I-IIIC a
7/8 (88%)
35/39 (90%)
42/47 (89%)
EOC estadios
I-IV
16/18 (89%)
EOC estadios
I-IV y LMP
combinados
Potencial
maligno bajo
EOC estadios
I-II
105/111 (95%)
121/129 (94%)
Cáncer ovárico epitelial estadio I-IIIb y estadio IIIC (epiplón negativo, ganglio
linfático positivo)
a Las tasas de falsos negativos y el porcentaje de cáncer ovárico epitelial estratificado
en bajo riesgo de presentar cáncer ovárico epitelial en pacientes con masa anexial,
calculados mediante el valor ROMA con un nivel de especificidad del 75 %, se
muestran en la tabla 2. La estratificación en grupos de alto y bajo riesgo de presentar
cáncer ovárico epitelial mediante el algoritmo ROMA con una especificidad del
75 % generó una tasa de falsos negativos general del 6,2 %. El 3% de todos los
casos estratificados en el grupo de bajo riesgo presentaron cáncer ovárico epitelial.
27
Tabla 2:Tasa de falsos negativos (FNR) y porcentaje de cáncer ovárico epitelial,
calculados mediante el valor ROMA, para todos los casos estratificados en el grupo
de bajo riesgo en pacientes con masa anexial.
Punto de corte premenopáusico < 13,1 % para la estratificación en el grupo de bajo
riesgo con un nivel de especificidad del 75 %; punto de corte posmenopáusico < 27,7 %
para la estratificación en el grupo de alto riesgo con un nivel de especificidad del 75 %.
Cáncer ovárico
Tasa de falsos negativos
epitelial a
(FNR)
Porcentaje de cánceres en
el grupo de bajo riesgo
Cánceres
Cánceres
falsos
totales
FNR
negativos
Cánceres
Benignos
falsos
verdaderos
%
negativos
positivos
Premenopáusicas
2
18
11,1%
2
149
1,3%
Posmenopáusicas
6
111
5,4%
6
113
5,0%
Todas las pacientes
8
129
6,2%
8
262
3,0%
No están incluidos los tumores de potencial maligno bajo (LMP); b FNR = Falso
negativo/(verdadero positivo + falso negativo); c Falso negativo/(verdadero negativo
+ falso negativo)
a
No hubo diferencias estadísticamente significativas en la sensibilidad y especificidad
del valor ROMA utilizando los valores del ARCHITECT CA125 II, el EIA CanAg
CA125 o el Lumipulse G CA125IIpara distinguir entre trastornos benignos y cáncer
ovárico epitelial. Mediante la combinación de ensayos EIA CanAg CA125 + EIA
HE4, la sensibilidad de la estratificación en el grupo de alto riesgo de las pacientes
con cáncer ovárico epitelial en estadios I-IV fue del 93 %. Los valores pronósticos
positivos y negativos fueron del 57 % y del 97 %, respectivamente. Mediante la
combinación de ensayos Lumipulse G CA125II + EIA HE4, la sensibilidad para
la estratificación en el grupo de alto riesgo de las pacientes con cáncer ovárico
epitelial en estadios I-IV fue del 93 %. Los valores pronósticos positivos y negativos
fueron del 58 % y del 97 %, respectivamente.
CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO
Precisión
La precisión del ensayo HE4 es ≤ 15 % de CV total. Se realizó un estudio siguiendo
la directriz EP5-A2 (22) del National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS/CLSI). Se analizó un grupo de cuatro muestras de suero, con dos lotes
de reactivos, en réplicas de dos, en dos momentos separados por 20 días. Los
datos de dicho estudio se resumen a continuación*.
28
Muestra
Lote de
reactivos
n
Conc. media
(pM)
DE
CV intraa- DE total
intraanalí- nalítico
(pM)
tico (pM) (%)
CV total
(%)
1
1
80
50,3
0,81
1,6
2,34
4,7
2
80
48,0
0,69
1,4
2,17
4,5
1
80
75,3
1,81
2,4
2,96
3,9
2
80
72,4
1,73
2,4
4,70
6,5
1
80
255
5,68
2,2
12,0
4,7
2
80
242
5,21
2,2
12,8
5,3
1
80
407
6,22
1,5
14,5
3,6
2
80
385
8,71
2,3
21,6
5,6
2
3
4
* Datos representativos; los resultados de laboratorios específicos pueden diferir
de los aquí presentados.
Límite de detección
El límite de detección del ensayo EIA HE4 es < 15 pM. El límite de detección (LD)
corresponde al límite superior del intervalo de confianza del 95 % y representa la
mínima concentración de antígeno HE4 que puede distinguirse de cero. Se empleó
la directriz EP17-A (23) del NCCLS para diseñar los experimentos sobre el LD. Se
realizó un estudio en el que el calibrador A del HE4 (cero) y 4 muestras de sujetos
sanos diluidas a 5 pM con diluyente de muestras fueron analizados en réplicas de
24 por prueba en 4 pruebas efectuadas en dos días separados. El LD se calculó
de la manera siguiente:
LD (pM) = 5,0 pM x (1,65 x DE0 + 1,65 x DE5) / (DO5 - DO0)
El límite de detección del kit EIA HE4 fue < 2,5 pM.
Sensibilidad funcional
La sensibilidad funcional del ensayo EIA HE4 es < 25 pM. La sensibilidad funcional se
expresa como la concentración de un analito en la que el CV es del 20 %. Se empleó
la directriz EP5-A2 (22) del NCCLS para diseñar los experimentos de determinación
de la sensibilidad funcional. Se realizó un estudio en el que un grupo de sensibilidad de
cinco miembros se analizó en réplicas de 4 en 2 pruebas en 20 días diferentes con dos
lotes de reactivos. La sensibilidad funcional determinada para el EIA HE4 fue < 5 pM.
Recuperación
La recuperación media del ensayo EIA HE4 es del 100 ± 15 %. Se realizó un estudio
en el que se añadieron diluciones de una muestra de paciente con concentraciones
conocidas de HE4 a muestras de suero humano normales. La concentración de HE4
se determinó mediante el ensayo EIA HE4 y se calculó el porcentaje de recuperación
resultante. Los datos representativos de este estudio se resumen en la tabla siguiente*.
29
Muestra
Valor del ensayo
endógeno (pM)
Antígeno HE4 añadido Valor del ensayo
(pM)
HE4 observado
(pM)
Porcentaje de
recuperación (%)**
1 44,6 1560,6102
7596,0 89
350397 96
650686 96
2 41,1 1555,7 99
7595,2 91
350400 98
650657 93
3 40,6 1554,0 97
7595,1 91
350403 99
650680 96
4 46,6 1563,3103
75106 97
350410 99
650645 90
5 40,2 1556,5102
75102 98
350402 99
650676 96
La recuperación media entre las cuatro concentraciones enriquecidas que indica
la tabla fue del 97 %.
* Datos representativos; los resultados de laboratorios específicos pueden diferir
de los aquí presentados.
**% de recuperación = Concentración de HE4 observada (pM) / Concentración
de HE4 endógena (pM) + HE4 añadido (pM)
Efecto de gancho por dosis alta
El efecto gancho por dosis altas es un fenómeno en el que muestras con niveles
muy elevados pueden situarse dentro del rango dinámico del ensayo. En el EIA
HE4 no se observó efecto gancho por dosis altas para las muestras que contenían
hasta 300,000 pM de antígeno natural HE4.
30
Linealidad de dilución
La linealidad de dilución media del ensayo EIA HE4 es del 100 ± 15 %. Se realizó
un estudio para el EIA HE4 diseñado según la directriz EP6-A (24) del NCCLS/
CLSI. Las muestras de suero con valores de HE4 elevados se diluyeron mediante
el calibrador A del HE4 (cero).
Se determinó la concentración de HE4 para cada dilución y se calculó el porcentaje
(%) de recuperación. Los datos representativos de este estudio se resumen en
la tabla siguiente*.
Muestra
Factor de
dilución final
Valor obtenido Valor esperado Porcentaje de
(pM)
(pM)
recuperación (%)**
1Sin diluir889,6889,6100
1:1,25720,0711,7101
1:1,7543,1533,8101
1:2450,6444,8101
1:2,5345,9355,897,2
1:5183,6177,9103
1:1097,689,0109
1:2049,144,5110
1:4025,922,2116
2Sin diluir697,0697,0100
1:1,25544,9557,697,7
1:1,7429,8418,2103
1:2361,1348,5104
1:2,5275,9278,899,0
1:5134,5139,496,5
1:1074,469,7107
1:2039,134,9112
1:4021,017,4120
3Sin diluir680,2680,2100
1:1,25499,7544,291,8
1:1,7354,4408,186,8
1:2296,7340,187,2
1:2,5247,2272,190,9
1:5124,9136,091,8
1:1061,768,090,7
1:2034,634,0102
1:4018,417,0109
Recuperación media entre las tres muestras diluidas indicadas arriba = 101 %.
* Datos representativos; los resultados de laboratorios específicos pueden diferir
de los aquí presentados.
**% de recuperación = Concentración de HE4 obtenida x Factor de dilución /
Concentración de HE4 sin diluir.
31
Especificidad analítica
La especificidad analítica media del ensayo EIA HE4 es del 100 ± 15 %. Se han
realizado estudios de recuperación para comparar los sueros que contienen los
compuestos siguientes (en las concentraciones indicadas) con sueros de control.
Se ha empleado la directriz EP7-A (25) del NCCLS para diseñar los experimentos
sobre interferencias. Se estudiaron las siguientes sustancias y concentraciones
y se observó que no interfieren con la prueba.
Interferencias séricas endógenas
Concentración de análisis
Triglicéridos30 mg/mL
Bilirrubina0,2 mg/mL
Hemoglobina10 mg/mL
Proteína total120 mg/mL
Interferencias con medicamentos quimioterapéuticos
Concentración de análisis
Carboplatino500 µg/mL
Cisplatino165 µg/mL
Clotrimazol0,3 µg/mL
Ciclofosfamida500 µg/mL
Dexametasona10 µg/mL
Doxorrubicina1,16 µg/mL
Leucovorina2,68 µg/mL
Melfalán2,8 µg/mL
Metotrexato45 µg/mL
Paclitaxel3,5 ng/mL
Enfermedades clínicas que pueden interferir
El ensayo EIA HE4 se evaluó utilizando muestras con HAMA y factor reumatoide
(FR) para evaluar adicionalmente la especificidad del ensayo. Se evaluaron
cinco muestras positivas para el HAMA y cinco muestras positivas para el FR
con respecto al porcentaje de recuperación del antígeno de HE4 añadido a
cada muestra a aproximadamente 50 y 450 pM. Los resultados de recuperación
media se resumen en la tabla siguiente*.
Enfermedad clínica Número de muestras % de recuperación media
HAMA 5101
FR 5 95
* Datos representativos; los resultados de laboratorios específicos pueden diferir
de los aquí presentados.
32
GARANTÍA
Los datos de rendimiento aquí presentados se obtuvieron usando el
procedimiento de ensayo indicado. Cualquier cambio o modificación del
procedimiento no recomendado por Fujirebio Diagnostics puede afectar
a los resultados, en cuyo caso Fujirebio Diagnostics rechaza todas las
garantías expresas, implícitas u obligatorias, incluida la garantía implícita
de comerciabilidad e idoneidad para el uso.
33
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35
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