Lab. Histología y Anatomía - Benemérita Universidad Autónoma de

Fac. Cs. Qs. Dpto. De ANÁLISIS CLÍNICOS
LABORATORIO DE HISTOLOGÍA Y ANATOMÍA
Q.F.B
BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
ÁREA ESPECÍFICA DE ANALISIS CLINICOS
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
ASIGNATURA DE:
HISTOLOGIA Y ANATOMIA
CÓDIGO:
FECHA DE ELABORACIÓN:
NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR:
TIPO DE ASIGNATURA:
LQF 215L
MARZO DE 2006
FORMATIVO
CB
PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN:
D.C BERTHA ALICIA LEÓN CHÁVEZ
M.C. MARISELA TORRES Y SOTO
M.C. AIDA OSORNO TECPA
M.C. RAFAEL MUÑOZ BEDOLLA
M.C. SARA SILVIA DOMÍNGUEZ BAEZ
M.C. LOURDES MARTINEZ MORENO
M.C. MARTHA ALICIA SALGADO JUÁREZ
M.C. ROSA MARIA AGUILAR GARDUÑO
HORAS PRÁCTICA. 2
TOTAL DE CRÉDITOS: 0
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PRÁCTICAS
I.- Estudio del líquido seminal.
2.- Desarrollo embrionario.
3.- Manejo de las técnicas histológicas.
4.- Disección de animal de laboratorio, preparación de soluciones y colorantes.
5.- Procesamiento de tejidos para su inclusión en parafina.
6.- Realización de Cortes histológicos.
7.- Desparafinación e hidratación de los cortes y Tinción de hematoxilina-eosina (de los 4
tejidos).
8- Observación de tejido epitelial
9. Observación de tejido conectivo: cartílago y hueso
10.- Tinción de Mallory y observación de tejido muscular
11.- Observación de células sanguíneas en un frotis
12.- Tinción de Golgi y para mielina. Observación de tejido nervioso
BIBLIOGRAFIA
Manual de Técnicas Histológicas. Elvira estrada Flores, Leonor Peralta Zamora,
Patricia Rivas Manzano. AGT editor, S.A.
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PRACTICA No. 1
ESTUDIO DEL LÍQUIDO SEMINAL
INTRODUCCION.OBJETIVO.- Que el alumno aprenda a manejar las variables que nos pueden dar
información acerca de la “capacidad fecundante” de un líquido seminal.
MATERIAL Y MÉTODO.- Portaobjetos, cubreobjetos, pipeta Pasteur, cámara de
Neubauer, microscopio.
MATERIAL BIOLÓGICO.- Muestra de semen recién emitida.
REACTIVOS.- Solución salina fisiológica, solución de Saunders y Macomber (*)
colorantes de Giemsa y May Grüenwald. (**)
PROCEDIMIENTO.Lo primero que debe realizarse es la observación microscópica de una gota de semen
entre portaobjetos y cubreobjetos, para tener una visión panorámica del material
examinado en lo referente a la cantidad aproximada, a la morfología y a la motilidad de los
espermatozoides.
INTRODUCCIÓN.
El estudio del semen suele ser parte de la investigación completa de una infertilidad que
comprenda a los cónyuges de un matrimonio estéril.
En relación con la investigación de la esterilidad, es importante reconocer el
objetivo propio del examen del semen. En primer lugar, sólo constituye una historia
detallada
y
una
exploración
física
general.
También
pueden
estar
indicados
procedimientos especializados, como las pruebas tiroideas, de función suprarrenal e
hipofisiaria, o incluso una biopsia testicular.
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El estudio del semen tiene una limitación inherente, que consiste en que los
estándares de calidad del semen se basa en los resultados de estudios de una población
de varones pertenecientes a parejas fértiles e infértiles. En consecuencia, estos
estándares de calidad son índices relativos y no absolutos de fertilidad o de esterilidad
(con la única excepción de una aspermia completa). Además, se recomienda
generalmente que, en caso de un resultado anormal en el estudio del semen, se repita la
prueba una o más veces.
FISIOLOGÍA DEL LIQUIDO SEMINAL.
El semen o líquido seminal esta formado por la secreción de los túbulos seminíferos
del aparato reproductor masculino y de las glándulas relacionadas (vesículas seminales,
próstata y bulbouretrales o de Cowper). consta de espermatozoides suspendidos en el
plasma seminal. Su función consiste en facilitar un medio nutritivo de osmolalildad y
volumen adecuados para vehiculizar los espermatozoides hacia el moco endocervical,
donde termina su contribución al proceso de fertilización. Recién eyaculado el semen, es
líquido, coagula con rapidez y experimenta una licuación alrededor de los 15 minutos
después de haber sido emitido. No contiene ni protrombina ni trombina, pero sí
fibrinógeno y tromboplastina, aun cuando no se conoce muy bien el mecanismo de la
coagulación, éste parecería producirse por la transformación de fibrinógeno en fibrina. La
licuación ulterior ocurre por la actividad enzimática de la fibrinolisina. El estudio analítico
del líquido seminal se denomina “espermiograma o espermatograma”.
TESTÍCULOS. Los espermatozoos, que comprenden menos del 5% del volumen del
semen, son el único tipo de células presentes en número apreciable en el semen normal.
Se depositan abundantemente en las porciones ampollares de los conductos deferentes
hasta el momento de eyaculación. Los espermatozoides almacenados en el epidídimo son
prácticamente inactivos por las elevadas concentraciones de carnitina y de glicerilfosforilcolina y de la disminución de suministro de oxígeno, sobreviven aproximadamente
hasta un mes.
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VESÍCULAS SEMINALES. Aproximadamente el 60% del volumen del semen se deriva de
las vesículas seminales. Este líquido amarillo o incluso muy pigmentado, como resultado
de su elevado contenido en flavina. Las vesículas seminales son la fuente principal de
fructuosa, también contiene potasio y ácido cítrico y en menor cantidad ácido ascórbico,
ergotioneína y fosforilcolina. También proporciona el sustrato que permite la coagulación
del semen después de la eyaculación.
PRÓSTATA. La próstata constituye aproximadamente al 20% del volumen total del
semen. Su liquido lechoso es ligeramente ácido, con un pH aproximadamente de 6.5,
resultante fundamentalmente de su elevado contenido en ácido cítrico. También contiene
enzimas proteolíticas y en fosfatasa ácida.
MODO DE RECOLECCIÓN.
La muestra de semen se recomienda recoger después de un periodo de
continencia de 3 días. La muestra más satisfactoria es la que se recoge en la consulta del
médico o en el laboratorio de patología clínica mediante masturbación. La muestra se
puede recoger en un frasco de vidrio de boca ancha, limpio, sin detergente o en recipiente
adecuados de plásticos o de polietileno. Aunque el polietileno disminuye la motilidad de
los espermatozoides. La muestra debe tener menor de 3 o 3 horas de preferencia de 30
minutos.
EXAMEN MACROSCOPICO.
CARACTERISTICAS FÍSICAS.
El semen recién eyaculado es un coagulo muy viscosos, opaco blanco o grisáceo,
que puede tener un olor mohosos o acre. Después de 10 a 20 minutos, el coagulo se licua
espontáneamente para formar un líquido translucido, turbio y viscoso, que es ligeramente
alcalino, con pH alrededor de 7.7. Volumen del semen normal equivale a 1 a 5 ml.
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EXAMEN MICROSCOPICO.
RECUENTOS DE ESPERMATOZOIDES. Después de la licuefacción del semen, los
espermatozoides pueden contarse en la cámara de recuento de un hemocitómetro, tras
una dilución inicial efectuada en una pipeta de leucocitos. Se mezcla bien el semen y se
absorbe una muestra hasta la marca 0.5 de la pipeta. Después se diluye hasta la marca
11 con la solución siguiente:
Bicarbonato sódico
5 gr
Formalina (neutra)
1 ml
Agua destilada
100 ml
Después de cargar la cámara del hemocitómetro (cámara de Neubauer) siguiendo
la misma técnica que para el recuento de leucocitos, se deja que los espermatozoides
inmovilizados sedimenten durante 2 minutos. Se cuentan entonces en 2 mm2 (2
cuadriculas grandes). Esta cifre, multiplicada por 100,000 dará el número de
espermatozoides por mililitro.
Valores de referencia > de 20 millones/ml
La cantidad normal por mililitro es de 28 – 225 millones y se considera en general
como límite inferior de la fecundidad del semen un mínimo de 60 millones/ml.
En el grabado de la página siguiente aparece la cuadrícula de la Cámara de
Neubauer. Solamente deben contarse los cuadros L y al final se aplica la fórmula:
N x 20 x 10 / 4 por 1000
MOTILIDAD.
Se coloca una pequeña gota de semen líquido en el portaobjeto de un
microscopio, precalentado hasta la temperatura corporal y después se tapa con un
cubreobjetos en el que se ha untado un circulo de vaselina. La motilidad se valora
observando varios campos con el objetivo seco más potente hasta que se haya contado
por lo menos un total de 200 espermatozoides. Es esencial enfocar a través del grosor
total de cada campo, de modo que se incluyan los espermatozoides inmóviles que hayan
podido asentar en el fondo del medio. Se registra el % de espermatozoides que muestra
una autentica motilidad, así como clasificarlos en rápidos, lentos e inmóviles.
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Referencia: En un eyaculado normal examinado entre 30 y 60 minutos aproximadamente
son móviles el 90% de los espermatozoides. 61% móviles, pueden ser rápidos, lentos o
de balanceo
MORFOLOGÍA.
La observación morfológica de los espermatozoides se hace sobre material
recogido en portaobjetos, dejados secar al aire y coloreados por distintos métodos.
Uno de los métodos más utilizados es el de May-Grüenwald-Giemsa o
hematoxilina.
La extensiones se preparan en portaobjetos limpios de modo idéntico a las de la
sangre. Teñir con hematoxilina.
1) Con formalina al 10% (v/v) durante 1 minuto.
2)
Lavar con agua,
3) Hematoxilina de Harris, durante 2 minutos
4) Lavar con agua
5) Secar al aire
6) Observar con objetivo de inmersión en aceite.
La observación microscópica en los espermatozoides muestra una cabeza de
forma ovalada, un cuello, un segmento intermedio y por último una cola.Las anomalías
morfológicas pueden consistir en alteraciones de la cabeza del espermatozoide, según su
tamaño, puesto que a veces se observan espermatozoides bicefálicos. Las formas
anormales pueden presentar a veces cabezas muy aguzadas o bien redondeadas en
exceso. La cola del espermatozoide puede ser atípica y presentar una mala implantación
o una duplicación. Algunos autores aceptan hasta un 10% de formas anómalas en sus
distintos tipos.
El semen normal contiene menos del 30% de formas anormales, presencia de
hematíes, leucocitos y células epiteliales.
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Un hombre que presenta entre un 20 y un 60% de espermatozoides
anómalos, las probabilidades de tener un hijo sano oscilan entre el 55 y el 58.9%. De un
60 a un 80% de formas anómalas producen una tasa de fertilidad del 46.2%. Si existe
más de un 80% de formas anómalas, la fertilidad potencial desciende al 14%.
FORMAS ANORMALES.
2 cabezas, 2 colas, macromegalia (cabeza grande), micromegalia (cabeza
pequeña)
NOTA: Recién obtenida la muestra, se debe determinar el pH y se anotará el color,
aspecto, viscosidad y volumen.
(*) La solución de Saunders y Macomber debe prepararse en el momento. Para 100 ml de
agua destilada, agregar 5 gramos de bicarbonato de sodio y un mililitro de formol.
(**) En lugar de los colorantes citados, se puede teñir el extendido de semen con la
tinción rápida para frotis sanguíneo, fijando con metanol previamente y después
introduciendo la preparación 10 segundos en el colorante A, enjuagando y 10 segundos
en el colorante B, enjuagando y secando al aire.
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PRACTICA NO. 2
DESARROLLO EMBRIONARIO
INTRODUCCION.Los cordados a los que pertenece la especie humana son tripoblásticos, es decir,
se desarrollan a partir de tres hojas germinativas o capas embrionarias.
A partir de las primeras etapas del desarrollo, las células resultantes de la
segmentación del huevo tienden a ordenarse en grupos celulares claramente
distinguibles. Las mas superficiales se distribuyen formando una capa continua que por su
situación externa se denomina ectodermo, y las mas internas constituyen una hoja que
circunda una cavidad y toma el nombre de endodermo. Entre ambas capas se forma mas
adelante un tercer grupo celular distribuido en forma mas irregular que conocemos con el
nombre de mesodermo.
En diferentes grupos de cordados en los que la vida embrionaria es “larga”,
aparecen diversas estructuras y mecanismos accesorios que aseguran la alimentación y
protección del embrión. La nutrición se asegura fundamentalmente mediante la creación
de reservas en el citoplasma del huevo (vitelo).
En
el
embrión
humano
la
gastrulación
(consiste
especialmente
en
desplazamientos celulares) se desarrolla en forma muy similar a la del embrión de pollo.
El huevo propiamente dicho (la yema) presenta citoplasma activo únicamente en
uno de los polos, el resto del huevo esta ocupado por vitelo. Una cáscara calcárea sirve
de protección mecánica, aunque como es porosa permite el intercambio de gases; una
sustancia mucoproteica (la clara) actúa como depósito acuoso.
Cuando el huevo empieza a desarrollarse solo se segmenta el citoplasma activo
del polo y por lo tanto se forma un embrión plano, colocado como un pequeño vidrio de
reloj, apoyado sobre la yema. Este comienza luego a plegarse, transformándose en un
cilindro.
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Por encima del embrión se forma una cámara acuosa, el saco amniótico, que
permite el desarrollo del embrión en un medio líquido, libre de compresiones y
malformaciones.
La yema ha quedado encerrada asimismo en un saco, el saco vitelino en cuya
pared hay vasos que llevan el material nutritivo hacia el embrión. Una estructura adicional,
la alantoides, en cuya pared también existen vasos sanguíneos, permite el intercambio
gaseoso a nivel de cáscara. El hombre como todos los mamíferos, se desarrolla a partir
de huevos con muy poco vitelo, pero tiene las siguientes características:
a) El embrión adopta en un principio la forma de un disco plano y
secundariamente se pliega, transformándose en cilíndrico.
b) El saco amniótico (aunque se forma por un mecanismo distinto)
c) La alantoides (en el embrión humano muy poco desarrollada).
d) El saco vitelino (pequeño y sin función nutritiva).
La embriología experimental ha permitido conocer los movimientos celulares de
la gastrulación en diversas clases de vertebrados. Los embriones de mamíferos por
desarrollarse en el interior del útero materno no se prestan para el estudio experimental.
Sin embargo, la gran similitud entre el proceso de gastrulación en los mamíferos y el
mismo proceso en las aves, ha permitido aplicar en los mamíferos y el hombre algunas de
las conclusiones extraídas de la experimentación de aquellas.
En el pollo, la blástula esta constituida por un disco (blastodisco) formado por dos
capas celulares, ectoblasto y endodermo, disco que se halla situado en el polo superior de
la yema. También en el pollo, aparece una línea primitiva con un nódulo de Hensen.
OBJETIVO.- Identificar el blastodisco, así como los anexos que le son
característicos a l embrión de pollo y hacer una comparación con las características de un
embrión de mamífero.
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MATERIAL Y METODO.- Caja de Petri, pinzas,tijeras, solución salina fisiológica
para anfibios, y como material biológico un huevo de 4 días de incubación.
PROCEDIMIENTO.- Utilice un huevo de cuatro o cinco días de incubación. La
incubación puede hacerla en una estufa a 30ºC y una humedad relativa de 56%, lo cual se
logra poniendo un recipiente con agua en la estufa, cerca de los huevos que deberán
voltearse cada 12 horas para que el calor se propague uniformemente. Después de cuatro
o cinco días puede comprobar el crecimiento del embrión, observando el huevo en un
cuarto obscuro e iluminándolo con un foco. Si desea observar el blastodisco y las
membranas anexas que se han formado, perfore cuidadosamente el cascarón del lado
romo y con las tijeras corte el cascarón en la cámara de aire, para evitar dañar la
alantoides y que pueda ocasionar un sangrado de los vasos sanguíneos contenidos en
ella. Vierta el contenido del huevo en un recipiente que contenga solución salina al 0.7% a
39ºC para que el embrión se mantenga con vida durante más tiempo, pueda hacer las
observaciones detalladas de las estructuras que se han mencionado anteriormente.
De la colección de fetos que hay en el laboratorio observe el tamaño de la cabeza
a las nalgas de cada uno, para calcular la edad.
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PRACTICA 3
MANEJO DE LAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
OBJETIVO. El alumno conocerá la importancia de la preservación de los tejidos para su
estudio histológico.
Introducción.
Las células cuando son extraídas de los organismos mueren por falta de nutrientes
y de factores de su micro-ambiente y sufren procesos de descomposición debido a la
acción de enzimas como proteasas, lipasas, DNAasas, RNAasas que comienzan a
destruir el tejido. Los tejidos deben ser tratados para su preservación, por lo que se
utilizan diversas técnicas de preservación para mantener las estructuras conservadas de
la célula. La técnica a utilizar depende del tipo de estudio y del tipo de tejido a utilizar. Si
desean realizar un estudio rápido del tejido se utiliza la técnica por congelación la cual
permite detener la actividad de las enzimas. Si desea realizar un estudio más completo de
la estructura celular y requiere mayor tiempo de realización se puede utilizar la
preservación por fijación del tejido. Los estudios más finos de la célula como la
observación de su ultraestructura el tejido pasa por fijación mas rigurosa para poder
obsérvalo por microscopio electrónico.
Existen reactivos aclaradores que actúan borrando o moderando los índices de
refracción de los elementos tisulares. Mientras menos contrastes más claros aparecerán
los preparados y más fácil será la apreciación de los elementos coloreados. Entre los más
usados tenemos esencias o aceites de clavo, de cedro o de orégano, xilol, tolueno y
cerosota.
Reactivos opacantes actúan de modo contrario a los reactivos aclarantes,
oscureciendo el contorno celular y robando transparencia a la preparación. Este efecto es
útil cuando se observan células sueltas, filamentos libres y superficies que exhiben
expansiones delicadas ( aire, alcohol, éter, acetona, agua corriente).
Reactivos aisladores liberando los elementos celulares de los tejidos o al menos,
facilitando su disociación mecánica. Los más usados son el ácido nítrico al 25%, potasa al
40%, alcohol al 30%, ácido sulfúrico diluido, ácido pícrico a saturación.
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Reactivos ablandantes se usan para reblandecer los tejidos excesivamente
duros, como hueso y dientes, en virtud que disuelven las sales de calcio. Tenemos a los
ácidos nítricos, tricloracético, crómico, clorhídrico y pícrico que se emplea en saturación.
Reactivos inofensivos, también llamados soluciones fisiológicas, líquido de
Ringer, de Locke, de Bizozero, solución amortiguadora de fosfatos (PBS).
Reactivos
colorantes
son
sustancias
que
permiten
distinguir
detalles
estrucutrales invisibles o poco aparentes al microscopio, encontramos dos tipos
generales:
a) colorantes naturales, extraídos de productos animales o vegetales, como el
carmín, la hematoxilina, la orceína y la safranina.
b) Colorantes artificiales, conocidos como colorantes de anilina, colorantes de carbón
o colorantes sintéticos.
Reactivos conservadores son aquellos que protegen a los tejidos de la
putrefacción, conservan el color y evitan cambios que pudieran sufrir las
preparaciones histológicas. Estos reactivos eliminan el agua del preparado,
evitando todo crecimiento bacteriano, otra veces sustituyen el agua por materias
resinosas imputrescible. Tenemos a la glicerina, bálsamo de Canadá, resinas
sintéticas, gelatina, licor de Apathy y licor de Ferrant.
Métodos histológicos.
La célula es la estructura básica vital del organismo y esta compuesta
principalmente de proteínas, hidratos, lípidos y sales inorgánicas, por lo que el objetivo
principal de la fijación es la preservación de los componentes celulares para así evitar la
autolisis y la proliferación que altera los componentes celulares, conservando la
arquitectura y composición tisular lo más semejante a como se encuentra en el organismo
vivo, así como también el de seleccionar el agente fijador.
Los tipos de fijación son variados y depende del tejido. Algunos funcionan
deshidratando los tejidos como son los alcoholes (etanol, metanol), o combinados con
ácidos (ácido acético, pícricos), ácidos crómicos. Otros fijadores polimerizan para formar
un red entre la célula y de esa formar conservar la estructura celular, tales como
formaldehído, formol y paraformaldehído, glutaraldehído. Otros más son compuestos más
fuertes como cacodilato o sales de osmio, platino y mercurio.
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Las desventajas del uso de los fijadores es que son tóxicos para las células vivas
de nuestro cuerpo, pueden ser irritantes, fijan las células y algunos son cancerigenos, por
lo que se deben utilizar con las medidas adecuadas (guantes, gafas protectoras,
mascarillas). El tiempo de fijación oscila entre 30 minutos a 12 horas dependiendo del
grosor del tejido, las células libres requieren solo de 30 minutos, tejido delgado de 2 horas
y más grueso hasta de 12 horas, entre más delgado sea el tejido mejor se fijará.
Una imagen igual ha de observarse en todos los tejidos idénticos obtenidos de
diferentes individuos de una misma especie.
Su reproducibilidad en todas las preparaciones histológicas obtenidas de los
tejidos, independientemente del proceso de fijación.
Principios generales de la fijación.
No existe un método universal de fijación
No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido
Un defecto de fijación jamás puede ser corregido
Es imposible realizar un estudio histológico sobre un material con graves defectos
de fijación.
FORMALDEHÍDOS (ALDEHIDOS)
Concentración patrón: 4% p/v en agua
Formula química HCHO
Descripción. Monoaldehído, el mas simple de la familia de los aldehídos, gas incoloro,
muy soluble en agua, precipita en un sedimento blanco (polímero paraformaldehído). El
formol comercial tiene 40% de formaldehído y 10-15 metanol. La formalina comercial es
10% formol (4% formaldehído) con 1 –1.5% de metanol en tampón de fosfatos.
Ionización mínima
Reacción con las proteínas. Aditivo, se integra a los tejidos y células, gelifica las proteínas
no las coagula, retiene parte de los grupos reactivos de las proteínas.
Reacción con los lípidos. Los lípidos son preservados pero no necesariamente fijados.
Reacción con ácidos nucleicos: El ADN y ARN son reducidos parcialmente por la
formalina.
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GENERALIDADES.
Cantidad. Por lo menos de 10 a 15 volúmenes de fijador deben de ser utilizados por cada
volumen de tejido.
Penetración: ningún fijador penetrará más de 2 a 5 mm, en tejido dolido, y 0.5 cm en tejido
poroso, en un periodo de 24 horas.
Tiempo: la mayoría de los tejidos deben de permanecer en fijación por lo menos 12 horas.
Temperatura: la mayoría de los fijadores se realizan a temperatura ambiente.
Calor: el calor coagulará las proteínas, pero no se recomienda para la fijación.
Una vez fijado el tejido se procede a realizar cortes del tejido para su observación
al microscopio. El grosor de las rebanas oscilan entre 300 micras a 100 amstrong. Para
cortar el tejido se utilizan microtomos, existen diferentes tipos: tenemos el criostacto
(congelación), vibratomo (vibración), microtomos de deslizamientos simples o por
congelamiento y los ultramicrotomos. Las cuchillas que se utilizan para cortar el tejido
tenemos de acero inoxidable (microtomos) y de vidrio o de diamante (ultramicrotomos). El
filo de las cuchillas tienen un lado con un ángulo y otro recto, la parte recta del filo se
coloca hacia abajo y la parte con ángulo se coloca hacia arriba.
El procesamiento de corte del tejido depende del microtomo a utilizar, si el corte se
realiza con un vibratomo este no requiere la fijación del tejido, puesto que se realiza
cortes de un grosor entre 100 a 300 micras, este tipo de estudio se utiliza para el estudio
del tejido en rebanas donde la célula se requiere que este viva, la célula se mantiene viva
por un tiempo determinado manteniéndola en una solución fisiológica y oxigenada. Por
congelación el tejido es fijado y posteriormente se pasa a una solución de sacarosa al
10% en solución isotónica por 12 horas, este procedimiento protegerá el tejido de la
congelación. Posteriormente, se congela el tejido con CO2 (-15 a –20º C) y se prosigue a
realizar cortes entre 6 micras a 50 micras. Si se utiliza un microtomo de deslizamiento
simple, el tejido debe ser protegido con un polímero extra como es la parafina y lograr
rebanas de grosor de 8 micras. El tejido una vez fijado, se procede a deshidratarlo con
alcoholes al 70%, 80%, 96% y 100%. Posteriormente, se pasa a xilol 100% y después a la
parafina, se realizan bloques de parafina y estos son cortados en frío. Las rebanas son
colocadas en portaobjetos y desparafinadas.
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La parafina se quita calentando los portaobjetos durante 20 minutos en una
estufa, después se pasan a un proceso de hidratación (xilol, alcohol al 100%, 96%, 80% y
70%) y en una solución isotónica, para su posterior proceso de tinción. Los
ultramicrotomos se utilizan para microscopio electrónico, el tejido es fijado con una mezcla
de paraformaldehido (4%) -glutaraldehído (2%), posteriormente se pasan una solución de
osmio (2%) la función del osmio es fijadora y tiñedora. El tejido fijado pasa a un proceso
de polimerización con resinas plásticas. Se realizan bloques con la resina plástica y se
procede a cortar en los ultramicrotomos, se utilizan las cuchillas de vidrio o de diamante,
logrando cortes hasta de 100 amstrong.
La técnicas de
tinción varia de la estructura a observar, tenemos colorantes
básicos y ácidos que van a teñir macromoléculas ácidas o alcalinas (hematoxilina, eosina,
wright). Tenemos otros colorantes con afinidad a ciertas grupos químicos como son los
colorantes proteicos que se unen a grupos aminos libres, sulfhídricos libres o hidroxilo
libres, ejemplos de estos tenemos Coomassie, cristal violeta, nitrato de plata, azul de
metileno). O tenemos otros específicos a estructuras como dicromatos para teñir
proteínas de la matriz extracelular. Existen otro tipo de colorantes fluorescentes que solo
son visibles con una lámpara de tungsteno, donde emite longitudes de onda de
ultravioleta, existen las técnicas de inmunofluorescencia donde se utiliza anticuerpos que
reconocen un antígeno especifico, y posteriormente se utiliza un segundo anticuerpo
conjugado con un fluorómetro (FICT, rhodamina), o con una enzima y se visualiza con el
sustrato colorimétrico (peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc).
Las rebanas una vez teñidas pueden ser conservadas por muchos años una vez
que son protegidas del medio exterior utilizando resinas sintéticas o bálsamo de Canadá.
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CUESTIONARIO.
1.- Investigue la definición de un fijador.
2.- Investigue la definición de un colorante.
3.- Cual es el fundamento de los colorantes de hematoxilina y eosina, que tipo de color se
tiñen las diferentes estructuras celulares.
4.- Que estudios pueden realizar con el procesamiento de tejidos.
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PRACTICA NO 4
DISECCIÓN DE ANIMALES DE LABORATORIO.
OBJETIVO. El alumno conocerá los diferentes órganos y aparatos que componen un ser
vivo.
INTRODUCCIÓN.
Un ser vivo cuenta con una serie de órganos y aparatos para su sobrevivencia,
todos ellos funcionan como un todo para el procesamiento de alimentos, obtención de
nutrientes y oxigeno y la coordinación del movimiento, protección del medio exterior. El
aparato digestivo funciona como un proveedor de nutrientes obtenidos del medio exterior,
lo procesa desde su degradación mecánica y química hasta su absorción al organismo.
Así tenemos en la degradación mecánica y química el alimento pasa por boca, esófago,
estomago e intestino. Su absorción se lleva a cabo en el intestino delgado y grueso. El
aparato circulatorio transportará los diferentes nutrientes a todo el organismo, la fuerza
motriz de la circulación de los nutrientes por la sangre la realiza el corazón. Uno de los
nutrientes esenciales para la vida es el oxigeno que es capturado por el aparato
respiratorio. Los nutrientes son metabolizados y eliminados por riñón, pulmón y piel. El
sistema nervioso se encarga de la planeación, control y regulación de las funciones del
organismo, por lo que, aparte del corazón es primeramente nutrido que otros órganos o
sistemas.
MATERIAL Y REACTIVOS.
1. Equipo de disección (tijeras, pinzas hemostáticas, pinzas de disección, bisturí,
etc).
2. Tabla de disección.
3. frasco de vidrio de 2 litros
4. frascos de plásticos de 100 ml, boca ancha
5. frasco de vidrio de mayonesa de 500 ml
6. éter
7. solución de ácido nítrico al 5%
8. 250 ml solución salina isotónica
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9. 2 litro formol al 10%.
10. algodón
11. bolsa amarilla para deshecho de animales.
12. guantes, gafas protectoras, navajas, (traer los alumnos)
METODOLOGÍA.
Llevar una rata por equipo y un hueso de pierna de pollo fresco colocarlo en formol
al 10%.
1.- El animal será anestesiado con éter en el frasco de 2 litros.
2.- Una vez dormido el animal, se coloca en la tabla de disección y se sujeta a esta.
3.- Se realiza una incisión en la parte media del abdomen y se corta la piel hacia los
lados. Después se corta el músculo y se expone los órganos que se encuentra en el
abdomen. Se identifica el estómago, intestinos, hígado, páncreas, bazo, riñón y aparatos
reproductores. Se prosiguen a extraer el corazón abriendo el tórax del animal, los
pulmones, timo, tiroides, paratiroides. Y por último se extrae el cerebro.
4.- Los órganos extraídos serán depositados en solución salina para lavar la sangre y
pasarlos a frascos de plásticos con formol al 10%.
5.- El hueso de pollo en un frasco con formol al 10% que se mantuvo por 12 horas. Se
lava con agua corriente, por 10 minutos. Se
le realiza el procedimiento de
descalcificación. Se pasa a un frasco una porción del hueso con ácido nítrico al 5%
durante 48 horas.
6.- Los restos del animal serán llevados al bioterio para su incineración.
CUESTIONARIO.
1.- Para que se usa el formol al 10%
2.- En que consiste la descalcificación
2.- Que órganos compone el aparato digestivo
3.- Que órganos compone el aparato respiratorio
4.- Que órganos compone el aparato cardiovascular
5.- Que órganos compone el aparato urinario
6.- que órganos componen el aparato reproductor.
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BIBLIOGRAFÍA.
1.- Manual de Técnicas histológicas. Elvira Estrada Flores, Leonor Peralta Zamora y
Patricia Rivas Manzano. Edit. AGT.
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PRACTICA 5
PROCESAMIENTO DE TEJIDOS PARA INCLUSIÓN EN PARAFINA.
OBJETIVO. El alumno aprenderá a procesar los tejidos para su estudio histológico.
Introducción.
Se denomina método o técnica histológica al conjunto de operaciones destinadas
a demostrar la disposición estructural de los tejidos. Cada método incluye una serie de
actos técnicos para determinar cada particularidad de una estructura dada. Existen un
gran numero de métodos, por lo cual se mencionará dos grupos generales.
1.- Métodos para examen en vivo. Este se puede realizarse en líquidos orgánicos, en
tejidos disociables y en membranas transparentes, manteniéndose en un reactivo
inofensivo o bien mediante el método de los cultivos celulares.
2.- Métodos para el examen de tejidos privados de vitalidad. La dificultad de ver
directamente con el microscopio la arquitectura natural de la mayoría de los tejidos, por su
grosos y opacidad, y sobre todo por la rápida descomposición que experimentan, ha dado
lugar a una serie de operaciones indispensables para evidenciar la estructura tisular y
consérvala durante mucho tiempo en preparaciones fijas, las que son muy útiles en todos
los campos de la biología. En este curso solo se mencionará este tipo de métodos.
Procedimiento de inclusión en parafina.
Casi todos los tejidos pueden ser cortados mediante su inclusión en sustancias
especiales, obteniéndose en general cortes más finos que con la congelación. Este
procedimiento es especialmente útil para tejidos no excesivamente duros, y no se debe
usar en piezas que hayan sufrido la acción de endurecedores energéticos, ni en tejidos
que tengan estructuras muy laxas. Las operaciones necesarias para este procedimiento
son: fijación, lavado, deshidratación, inclusión y corte.
Fijación. Se lleva a cabo mediante cualquier fijador, según se requiere.
Lavado. Después de la fijación es casi siempre necesario el lavado en el disolvente
adecuado, según el fijador, en muchos casos se utiliza el lavado abundante en agua de la
llave, con tiempo variable de acuerdo al fijador.
Deshidratación. Los disolventes de la parafina empleada en la inclusión como el xilol, no
se mezclan con el agua, por lo que es preciso una deshidratación de la pieza con
alcoholes graduales, hasta el absoluto, para que la sustancia de inclusión penetre bien en
los tejidos.
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Inclusión. Es la operación mediante la cual se hace penetrar en la pieza deshidratada una
materia solidificante que tiene a lo mas consistencia del tejido y facilita la ejecución de
cortes finos.
MATERIAL Y REACTIVOS
1 kg de parafina
2 litros de alcohol al 80%
2 litros de alcohol al 96%
2 litros de alcohol absoluto
2 litros de xilol
20 bolsas de gasa (5 por equipo, traer el alumno)
guantes (por alumno)
gafas protectoras por alumno
navajas (por el alumno)
INCLUSIÓN EN PARAFINA.
1.- Fijar en formol al 10% por 24 horas, como mínimo.
2.- Lavar en agua corriente de 15 a 30 minutos, como mínimo. El hueso descalcificado es
cortado como los demás tejidos.
3.- colocar los tejidos cortados en cortes delgados y colocarlos en las cápsulas o
cassettes y después en la canastilla. Programar el aparato para que lleve a cabo la
deshidratación con alcoholes de concentración ascendente, de 80, 96 y 100%,
permanecerá 1 hora en el histokinet cada uno.
4.- posteriormente, pasarán los tejidos a xilol y al último a la parafina derretida a 60º C.
5.- El procesamiento dura aproximadamente entre 12 horas.
6.- Realizar los bloques en parafina
CUESTIONARIO.
1.- Investigue cuales son las acciones de los fijadores.
2.- Que desventajas presentan los fijadores.
3.- Investigue la función de los agentes fijadores y cuales son (ácidos minerales, sales
metálicas, ácidos orgánicos, reductores orgánicos, formol).
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PRACTICA 6
REALIZACIÓN DE CORTES HISTOLÓGICOS
OBJETIVO. El alumno aprenderá a preparar los bloques de parafina para obtener cortes
delgados en el microtomo.
INTRODUCCIÓN.
La variación de imágenes microscópicas depende esencialmente de su calidad
técnica, la cual viene determinada tanto por el microscopio como por la naturaleza del
objeto (tejido), que se examina. Muchas veces no se conoce precisamente a esta última
condición la suficiente importancia en la investigación de las preparaciones histológicas.
La diferencia de la imagen, debidas al objeto, se suelen checar al microscopio,
cuando en numerosas ocasiones han de atribuirse a la imperfecta confección de los
cortes obtenidos con el micrótomo.
La precisión óptica del microscopio deberá correr con la precisión mecánica de
micrótomo, si se quiere que el resultado de todo el empeño técnico, no dependerá
exclusivamente de las circunstancias sugestivas, como son la destreza y la experiencia en
el empleo del micrótomo y del microscopio. En la actualidad los micrótomos se valoran en
base a otros criterios que los empleados hace años, ya no son decisivas únicamente las
precisiones técnicas de un micrótomo, sino también el grado de eficacia con que el
usauario puede llevar a la práctica el potencial ofrecido.
El micrótomo es un instrumento mecánico con el que se realizan secciones
tisulares translúcidas de un espesor micrométrico y lo suficientemente delgadas,
susceptibles de ser colocadas para permitir el potencial ofrecido.
Todos los micrótomos tienen principios básicos semejantes en su funcionamiento,
los cuales son:
a) Un portabloques es en el que se sostiene el material que se va a cortar, el cual
avanza discontinuamente sobre una cuchilla, debido a un mecanismo regulable
de cremallera. De manera periódica se hace incidir el bloque sobre la cuchilla,
obteniéndose secciones tisulares de grueso equivalente al previamente
seleccionado en el tornillo micrométrico que controla el mecanismo de avance.
En los portabloques antiguos, la fijación del bloque se realiza adhiriéndolo, con
parafina previamente calentada a la superficie rugosa del portaobjetos, los
micrótomos modernos poseen un mecanismo de pinza, en que se adapta a
cualquier tipo de base o molde con el que esta fabricado el bloque. Es
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conveniente que el portabloques este también provisto de orientación que
garantice su parelismo con la cuchilla.
b) Un portacuchillas clásico. El cual consiste en un dispositivo de fijación basado
en una pinza orientable especialmente, esta pinza permite variar el angulo de
inclinación de la cuchilla, así como también su grado de aproximación al
portaobjetos.
c) Mecanismo de avance del portabloques sobre la cuchilla, este es un sistema
mecánico electrónico que proporciona cortes sucesivos de tejido a partir del
bloque. El continuo perfeccionamiento de los sistemas de avance, así como su
monitorización ha permitido una progresiva mejora de las técnicas de corte.
Existen diversos tipos de micrótomos, entre los cuales destacan los siguientes:
1.- Micrótomo oscilatorio o de balance
2.- Micrótomo de rotación o tipo Minot
3.- Micrótomo de deslizamiento
4.- Criostato o criotomo
5.- ultramicrótomo.
MATERIAL Y REACTIVOS
1 kg de parafina
1 vaso de precipitado de 1 litro
1 varilla de vidrio
1 bolsa de hielo (por grupo)
100 portaobjetos
papel aluminio (por los alumnos) o cajitas de cartón grueso diseñadas por el alumno de 2
X 3 cm o laminas de acero inoxidable gruesas (0.2 – 0.3 cm) de 2 x 4 cm (4 por equipo).
EQUIPO:
Refrigerador
Micrótomo rotatorio tipo Minot
Cuchillas
Baño de flotación
Plancha con termostato para fijar las preparaciones histológicas
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Horno o estufa para desparafinado
PROCEDIMIENTO:
1.- Previo al corte se realiza afilado y asentado de cuchillas
2.- Cortes histológicos en micrótomo rotatorio tipo Minot.
a) Enfriamento del bloque en refrigerador o hielo.
b) Fijación del portabloques en el micrótomo
c) Orientación del bloque
d) Orientación de la cuchilla del micrótomo, con el bloque para su desbastado.
e) Selección del espesor del corte.
f)
Realización de las secciones.
•
Rebajar el corte hasta que el tejido se vea integro.
•
Cortar a 5 micras
•
Colocación del corte y extensión con un pincel en el baño de flotación.
•
Marcar las laminillas con el número correspondiente a la muestra.
•
Selección y colocación del corte en el portaobjeto
•
Escurrir el exceso de agua en las preparaciones histológicas
•
Fijación a calor de las preparaciones histológicas (plancha con termostato
a 56 – 58º C)
•
Desparafinado de los cortes histológicos en horno o estufa a 60º C durante
30 min.
RESULTADOS: cortes bien elaborados, sin mellas y plegamientos.
CUESTIONARIO.
1.- Que función tiene la parafina
2.- Cual es la importancia de realizar cortes histológicos, en que lo aplicarías.
3.- Que estudios realizarías con cortes por criostato.
4.- Que estudios realizarías con cortes por ultramicrótomo.
5.- Que problemas tuvieron en realizar los cortes histológicos en el laboratorio.
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PRACTICA 7
DESPARAFINACIÓN E HIDRATACIÓN DE LOS CORTES Y TINCIÓN CON
HEMATOXILINA Y EOSINA.
OBJETIVO. El alumno aprenderá a procesar los cortes en parafina para su tinción.
Los métodos de coloración se puede dividir en las siguientes categorías.
1.- Coloración generales y especificas.
Las primeras se basan en el teñido intenso de los núcleos y débil del protoplasma,
o en la fuerte coloración de ambas partes con colorantes distintos.
2.- Coloraciones progresivas y regresivas.
El tejido adquiere la coloración lentamente y progresivamente, se usa sobre todo
con los colorantes que dan coloraciones muy sólidas o difíciles de diferenciar, por
ejemplo, el azul de metileno, azul de algodón, carmín y hematoxilina.
3.- Coloraciones simples y combinadas.
Los colorantes simples son aquellas que se obtienen con un solo colorante, ácido
o básico. Según su naturaleza son monocromáticos o metacromáticos. En el primer caso,
todos los elementos son teñidos en el tono del baño colorante, en el segundo caso ciertos
elementos tisulares viran el color a un tono diferente. Tenemos de los metacromáticos al
violeta de metilo, azul de anilina, violeta de cresil, azul de cresil, azul de toluidina, rojo
neutro, safranina, verde jano, etc. Las coloraciones combinadas pueden ser paracticadas
haciendo actuar diversos colorantes.
El fundamento de cualquier método de tinción radica en la propiedad que poseen
los tejidos para incorporar y fijar de modo variable diversas sustancias coloreadas
llamadas colorantes.
La célula que es un porción de materia orgánica, tiene una composición
determinada que varía discretamente según el tipo de tejido y unas características físicas
propias, que determinan la posibilidad de ser teñidas. Se debe de tomar en cuenta que en
su estado normal las células presentan muy poco contraste, por lo que hay un segundo
elelmento que es el colorante que se añada para aumente el contraste de las diferentes
estructuras celulares. Los colorantes pueden ser usados para colorear tanto tejido vivo
como tejido
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fijado y el propósito de tinción es marcar los constituyentes del tejido y la célula de la
manera más evidente.
En la actualidad se acepta que existe una serie de mecanismo interrelacionados
fisicoquímicamente que actúan en el complejo mecanismo de la tinción celular.
Se distinguen dos mecanismos que son: electro-adsorción y adsorción por tensión
superficial que actúan simultáneamente.
La electro-adsorción se da por reacción de cargas eléctricas de polaridad opuesta
(+ y -) y si se tiene en cuenta el carácter anfótero de las proteínas, se entiende la
importancia que tiene el pH en este proceso de coloración en relación con el punto
isoelétrico de las estructuras a teñir.
La adsorción por tensión superficial se da por adherencia de las sustancias a la
superficie. Los diversos mecanismos de este fenómeno pueden darse sin intervenir
fuerzas electrostácticas (apolar). Esta capacidad de adsorción aria de una sustancia a
otra, pues la tensión superficial de las diferentes estructuras también varia.
En las coloraciones por medio físicos se trata de una pura difusión del colorante
(coloración por impregnación) y en las coloraciones por adsorción se originan
precipitaciones.
La coloración química exclusiva se da por la reacción entre el colorante y el
sustrato según un proceso químico bien diferenciado, un ejemplo es la demostración del
hierro (tinción de Perls).
Tinción de hematoxilina y eosina. (hematoxilina de Harris-eosina alcohólica).
1.-Para teñir los cortes es indispensable desparafinar los cortes e hidratarlos, par lo cual
se pasan a xilol y a cambios de alcohol, en concentraciones descendentes de la siguiente
manera.
a) colocar en 2 cambios sucesivos de xilol, de 5 minutos cada uno.
b) Alcohol-xilol (50-50%) 10 baños
c) Colocar en alcoholes de 100, 96, 80, solución isotónica, 10 baños (durante 2
minutos).
3.- Lavar los cortes en agua corriente.
4.- Teñir con hematoxilina de Harris 3 minutos
5.- lavar con agua de la llave 5 min.
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6.- diferenciar con alcohol ácido al 70% baño rápido
7.- lavar en agua corriente, solución saturada de carbonato de litio baños., lavar en agua
corriente.
8.- Contrastar con eosina alcohólica de 1 a 3 min
9.- deshidratar con alcoholes de 96º (dos cambios) y absoluto, durante 5 min en cada
alcohol, alcohol-xilol,
10.- Aclarar con xilol durante 2 min.
11.- montar las preparaciones histológicas con resina y cubreobjetos, retirando el exceso
de este.
12.- Colocar en laminilla, en la parte superior una etiqueta con el nombre del tejido.
RESULTADOS.
Núcleos y cartílago
azul morado
Protoplasma y sustancias intercelulares
de naranja a rojo
Preparación de los colorantes.
Hematoxilina de Harris
- hematoxilina (Merck)
1.0 g
-
oxido rojo de mercurio y
0.5 gr
-
sulfato de aluminio y amonio o potasio (alumbre) 20 g
-
alcohol etílico absoluto
-
agua destilada
10 cc
200 cc
- Eosina alcohólica
-
eosina azulosa
1.0 g
-
orange G
1.0 g
-
alcohol de 70º
100 cc
1.- Disolver la hematoxilina en el alcohol absoluto
2.- El alumbre en el agua destilada con ayuda de calor
3.- retirar del calor y añadir el óxido de mercurio lentamente
4.- Calentar hasta un color púrpura oscuro.
5.- Retirar de la frama, inmediatamente colocar en agua fría hasta que enfríe
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6.- El colorante se coloca en un frasco oscuro y esta listo para usarse
7.- agregar de 2 a 4 ml de ácido acético por 100 ml de solución.
NOTA. Como regla general en la preparación de esta hematoxilina tiene que tomarse en
cuenta que todos los componentes de la formula deben agregarse en el orden establecido
y deben de estar disueltos totalmente antes de agregar el siguiente.
Se mezcla todo en frío y se filtra.
Cuestionario.
1.- Que estructuras observó en las laminillas
2.- Dibuje y señale cada estructura tisular de los diferentes cortes de tejido realizado
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PRACTICA NO. 8
OBSERVACION DE TEJIDO EPITELIAL
INTRODUCCION.- El tejido epitelial es un conjunto de células que cumple con
funciones de revestimiento, secreción o absorción. De acuerdo a la función que
desempeña, la forma de las células se adapta a las necesidades de dicha función. Así por
ejemplo, si se trata de la función de revestimiento o protección, la célula adquiere en su
citoplasma, sustancias que la hagan resistente (queratina). Si la función es de secreción o
bien de absorción, la célula sufre modificaciones en su borde libre (cilias,
microvellosidades, flagelos) que le permiten aumentar la superficie de absorción o
secreción.
Las céluklas del tejido epitelial carecen de sustancia intersticial y se apoyan en una
estructura llamada membrana basal. Debido a la existencia de esta membrana, la célula
epitelial adquiere polaridad, es decir,
la orientación de sus organelos, que hacen
distinguir en ella una región basal y otra apical.
El tejido epitelial tiene su origen en su mayor parte en el ectodermo, aunque
también procede del mesodermo y del endodermo. El tejido epitelial de revestimiento lo
encontramos en la piel; el de secreción en las glándulas y mucosas y el de absorción en
la mucosa intestinal, que cumple tanto con funciones de absorción como de secreción. El
tejido epitelial de secreción o Glandular, puede ser de secreción interna (glándulas
endocrinas) o de secreción externa (glándulas exocrinas). Ejemplo de las primeras lo
encontramos en el ovario, cuyo producto de secreción (estrógenos) pasan a la circulación;
y ejemplo de secreción externa, las glándulas salivales que vierten su contenido en la
cavidad bucal.
OBJETIVO.- Observar las características morfológicas de las células epiteliales
que cumplen con las funciones antes mencionadas.
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MATERIAL
Y
MÉTODO.-
Microscopio,
portaonjetos,
agujas,
pinzas,
cubreobjetos, abatelenguas, azul de metileno, verde de metilo, y como material biológico:
células epiteliales de la mucosa bucal humana, de piel de rana y ciliadas de la mucosa
bucal de rana. (*)
Para observar glándulas y otros
ejemplos de epitelio solicitar al
maestro(a) las preparaciones.
(*) Puede cambiar la muestra por el tejido ciliado de una almeja.
PROCEDIMIENTO.- Primera parte: introduzca un abatelenguas en la cavidad
bucal y rasspe la cara interna del carrillo. Deposite ese raspado en algodón y haga un
segundo raspado. Deposite el contenido de ese segundo raspado en un portaobjetos que
contenga una gota de agua. Extienda la preparación y caliente a la llama del mechero
hasta desecación sin que llegue a quemar el portaobjetos el dorso de la mano. Agregue
unas gotas de azul de metileno sobre toda el área de extensión realizada. Deje actuar el
colorante un par de minutos e incline el portaobjetos para tirar el colorante en exceso.
Lave con agua utilizando un gotero para no eliminar la muestra, hasta que ya no se
desprenda colorante. Coloque un cubreobjetos de forma que éste caiga como se cierran
las tapas de un libro, para evitar la formación de burbujas de aire. Localice el área ideal
para la observación (células aisladas) con seco débil y enfoque y observe con seco fuerte.
NOTA.- Puede observar con objetivo de inmersión, si después de lavar, seca al aire la
preparación y agrega una gota de aceite de inmersión.
La preparación debe parecer como un mosaico de células planas, poligonales,
mas o menos irregulares; abundan las células aisladas, en cuyas caras se observa los
trazos de inserción de unas células con otras. El material observado procede de la capa
superficial o capa de descamación del epitelio pluriestratificado de la mucosa bucal. En
su mayoría son células muertas o células que están en periodo de degeneración.
El azul de metileno tiñe intensamente el núcleo, y con menos color el citoplasma,
que presenta un cierto aspecto granuloso.
Segunda parte: En el agua del acuario o de los recipientes en donde se tienen
ranas, se depositan trozos de piel muy fina y transparente, que procede del epitelio de la
piel de las ranas. Con unas pinzas finas tome con cuidado estos trozos de piel y corte un
trozo no mayor a un par de cm2. El trozo de epitelio de rana, tomado del acuario se
monta sobre un portaobjetos. Con una tira de papel filtro se limpia el exceso de agua, sin
que el papel pase
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por el epitelio. Se tiñe agregando unas gotas de verde de metilo-acético (colorante
y fijador al mismo tiempo), se coloca un cubreobjetos y se observa con seco fuerte. Con
esta técnica de tinción, los núcleos y las membranas celulares se tiñen de color verde
mas intenso que el que toma el resto de la célula. El aspecto general de la preparación es
el de un epitelio pavimentoso. Se puede observar muy claramente la forma poligonal de
las células unidas y acopladas, sin aspecto de discontinuidad por sus bordes.
Tercera parte: sujete una rana entre las manos, procurando que mantenga la boca
abierta. Raspe el paladar de la rana, preferiblemente en su zona mas baja, con un
abatelenguas (teniendo cuidado de no sangrar el tejido por exceso de presión al raspar).
En un portaobjetos ponga una gota de suero salino para anfibios (NaCl al 0.7%) y
deposite el producto obtenido. Ayúdese con una aguja para desprender el raspado del
abatelenguas y deposítelo y extiéndalo en el suero. Con poco aumento localice la zona
en donde se encuentran los grupos de células que se han conseguido con la
escarificación del paladar de la rana y observe a aumento fuerte.
Si no se pudiera trabajar con una rana, consiga una almeja viva y abra las valvas
para que con un abatelenguas haga un raspado del tejido mucoso del interior,
depositándolo en un portaobjetos conteniendo una gota de suero fisiológico y coloque un
cubreobjetos. Busque con seco débil el sitio donde se localizan las células con las
microvellosidades en movimiento.
Observe además las preparaciones de colección.
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Figura 10. Epitelio seudoestratificado columnar ciliado. Hematoxilina-eosina de tráquea
Figura 11. Epitelio estratificado de transición- Hematoxilina-eosina, vejiga urinaria
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PRACTICA NO. 9
OBSERVACION DE TEJIDO CONECTIVO
INTRODUCCION.- El tejido conectivo tiene como función principal, unir los otros
tres tejidos del cuerpo (epitelial, muscular y nervioso). El tejido conectivo se desarrolla a
partir de la capa media del embrión, o sea del mesodermo. Este tejido se caracteriza por
poseer diversos tipos de células y fibras, todo contenido en una matriz de sustancia
amorfa. Las variedades celulares, las diferentes fibras y la composición química de la
sustancia amorfa son muy variadas dependiendo de la función que cada tejido conectivo
tenga asignada. Habitualmente la clasificación del tejido conectivo se basa en el tipo de
células, fibras y sustancia amorfa que posee y en la proporción entre ellas. Por esta razón
se le clasifica en dos grandes grupos, tejido conectivo propiamente dicho y tejido
conectivo especial. El primero se subdivide según la proporción de los elementos que lo
componen, en tejido conectivo laxo y denso. El tejido conectivo laxo forma la capa de
refuerzo de los epitelios, como en el tejido subcutáneo de la piel, o forma endotelios que
protegen y sujetan los órganos como la pleura y la membrana mesentérica. También
forma parte de otros tejidos como el perimisio de los músculos, que forman los tendones
(conectivo fibroso).
OBJETIVO.- Localizar las zonas que nos pueden proporcionar tejido conectivo y
observar las características de sus partes integrantes.
MATERIAL Y METODO.- Microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, pinzas, navajas,
agujas. El material de observación debe buscarse en las zonas que se mencionaron
anteriormente de ranas, conejos o mamíferos pequeños.
PROCEDIMIENTO.- Primera parte: para explorar bien y aprender mas acerca de
las células y sustancias intercelulares del tejido conectivo laxo ordinario, interesa cortar
pequeñas partes del mismo y ponerlas encima de portaobjetos. Tales preparaciones se
logran fácilmente en animales de prueba pequeños, como el ratón. La piel y el tejido
subcutáneo se separan de los músculos del muslo; esto desgarra el tejido
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“areolar” (tejido conectivo) siguiendo el plano de despegamiento y puede tomar
con pinzas, pequeñas porciones de tejido a este nivel. Corte y monte en portaobjetos
esas
porciones. Debe evitar las porciones que contienen grasa visible. Monte las
porciones logradas en solución salina isotónica y extiéndalas con ayuda de agujas. Se
tratan con azul de metileno durante dos minutos y se coloca un cubreobjetos. Se
observa con seco fuerte.
Segunda parte: Corte un trocito de membrana mesentérica del intestino. Deposite
la muestra en un portaobjetos y extiéndala con ayuda de agujas. Fije la preparación
durante 5 minutos con alcohol de 96º. Se puede emplear otro fijador como formol diluido,
para evitar alteraciones con los constituyentes celulares, ante los tratamientos que se
desarrollan a continuación. Lave con agua con ayuda de un cuentagotas. Verifique que el
tejido esté bien extendido y agregue entonces hematoxilina. Deje actuar el colorante
durante 15 minutos. Lave con agua. Agregue alcohol-acético durante unos segundos y
vigile el proceso de decoloración hasta que el tejido presente una tonalidad violeta suave.
Este paso se hace con objeto de llevar a cabo la diferenciaición, es decir, por lo general
se tiñen con exceso en la hematoxilina y es preciso quitar el colorante de aquellas
estructuras celulares que no son específicas de la hematoxilina y que la retienen con poca
intensidad. El alcohol-acético se prepara uno a uno. Se lava con agua. Se neutralizan los
restos de ácido con agua carbonatada (carbonato de sodio al 5%) durante un minuto. Se
lava con agua. Se tiñe con eosina durante 5 minutos y se lava con agua. Con una tira de
papel filtro se seca el exceso de agua de la preparación y se pone una gota de glicerina.
Se coloca un cubreobjetos y se comprime ligeramente para hacer salir (si se formó)
alguna burbuja de aire. Observe con aumento fuerte y ponga atención a las diferentes
estructuras teñidas por la hematoxilina o la eosina según su afinidad.
Tercera parte: Tejido conectivo fibroso. Corte un trozo de tendón de una pata, de
los llamados vulgarmente “nervios” de la carne. Los tendones unen los músculos al
hueso. El trozo de tendón se pone sobre un portaobjetos con suero salino fisiológico y se
extiende con ayuda de las agujas. Se pone un cubreobjetos cuidando que no quede la
preparación sin líquido. Observe a seco débil para localizar la zona mas apta y cambie a
seco fuerte. El tendón es un tejido muy duro formado por la asociación de haces de fibras
colágenas y elásticas, en posición paralela y orientada en la dirección que ejerce el
músculo su fuerza. Se destacarán algunas células conectivas moldeadas y comprimidas
entre las fibras.
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Deposite en el borde superior de la preparación una gota de ácido acético al 1%.
Las fibras se hinchan en una masa común. Los núcleos de las células se hacen mas
visibles.
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Figura 30. Tejido conectivo alveolar, método de Verhoeff
Figura 31. Tejido conectivo alveolar, Brazilina
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Figura 36. Tejido conectivo alveolar. Técnica de Sudan IV, células grasas y tendón
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ESTUDIO DE TEJIDO CARTILAGINOSO
INTRODUCCION.- El cartílago es un tipo de tejido conectivo especial denso con
funciones de sostén. Está formado por fibras colágenas y en algunos casos fibras
elásticas que están conmtenidas en una sustancia amorfa en estado de gel muy firme.
Sus células se denominan condrocitos.
El cartílago se clasifica en tres tipos: hialino, elástico y fibroso. El mas abundante
es el hialino. Es de color blanco perlino debido a la constitución de la sustancia
intercelular constituída principalmente por ácido condroitínsulfúrico y colágena. Las
células o condrocitos se encuentran en los espacios de la sustancia amorfa en grupos o
“nidos celulares”. Los condrocitos son células maduras que se han rodeado de sustancia
intercelular que fue producida por sus antecesores o células jóvenes llamadas
condroblastos, las cuales son activas y producen las sustancias que forman la matriz
amorfa o sustancia intercelular. Estas células son intensamente basófilas, característica
que disminuye en las células maduras.
OBJETIVO.- Comprobar las características tintoriales y morfológicas de este tejido.
MATERIAL Y METODO.- Microscopio, microtomo (navaja), portaobjetos,
cubreobjetos, pinzas, agujas, y como material biológico para observación de cartílago
hialino, puede utilizar el esternón de la rana o bien la cabeza del fémur de conejo o
ejemplares jóvenes de aves. Para la observación de cartílago fibroso y elástico se
pueden utilizar los discos intervertebrales, la epiglotis y el pabellón de la oreja. Puede
utilizar el cartílago de la “pechuga” de pollo para cartílago hialino.
PROCEDIMIENTO.- Haga un corte de las muestras antes mencionadas o de la
cabeza del fémur de alguno de los animales ya indicados. Haga el corte de la zona blanda
cuidando de no forzar el corte. Si se observa resistencia al cortar, nos indica que se ha
agotado la zona de cartílago.
Una vez obtenido el corte, se procede a teñir como sigue: se fija el corte con
alcohol de 96º o formol al 10% durante 5%. Se lava con agua y se tiñe con azul de
metileno al 1 %
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durante dos minutos. Se lava con agua y seca el exceso de agua con una tira de
papel filtro, se agrega una gota de glicerina y se cubre con el cubreobjetos. Deberá
observar la matriz amorfa del tejido teñida de violeta uniforme y diáfana, en el caso de
cartílago hialino y de aspecto fibroso en los otros tipos. Las células cartilaginosas o
condroblastos rodeadas de un anillo que contrasta con las sustancias restantes del tejido.
Haga otro corte y tiña según la técnica de hematoxilina-eosina como sigue: fije la
muestra con alcohol de 96º o formol al 10% durante 5 minutos, agregue hematoxilina
durante 15 minutos, lave con agua antes y después de la aplicación de hematoxilina.
Agregue alcohol-acético para lograr la diferenciación, lave con agua, neutralice con agua
carbonatada y lave con agua, agregue eosina durante 5 minutos y lave con agua. Seque
el exceso de agua con una tira de papel filtro y agregue una gota de glicerina tapando
después con un cubreobjetos. Deberá observar la sustancia intercelular o amorfa teñida
de rojo por la eosina y los condroblastos teñidos por la hematoxilina, los núcleos bien
diferenciados y teñidos. Las células las podrá observar en pareja o en grupos.
ESTUDIO DE TEJIDO OSEO
INTRODUCCION.- El hueso es un tejido conectivo especializado en funciones de
sostén y protección, cuya matriz intercelular calcificada le proporciona dureza y rigidez.
El tejido óseo o hueso consta de una sustancia amorfa o intercelular calcificada o
mineralizada de fibras colágenas y células llamadas osteoblastos (activas o maduras) que
producen la sustancia intercelular como el tropocolágeno o precursor de la colágena y
mucopolisacáridos ácidos. Estas células se rodean de la sustancia intercelular que
producen y pasan a ser osteocitos o células maduras.
La matriz intercelular o calcificada está formada por unidades llamadas laminillas
ósea. La disposición de estas unidades determinan dos variedades de hueso que son:
hueso poroso o esponjoso y hueso compacto. El hueso esponjoso también
llamado
reticular se observa como una red cuya proyección tridimensional corresponde a un
conjunto de láminas que delimitan un laberinto de cavidades. El hueso compacto en
cambio, es una masa sólida sin cavidades visibles. Sin embargo, microscópicamente está
formado por los sistemas de Havers que son espacios o conductos conocidos como
Conducto de Haver
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rodeado de laminillas dispuestas concéntricamente. Entre estos sistema s se
disponen otras laminillas a manera de relleno y forman los sistemas intersticiales. Las
células están dispuestas en la superficie de las laminillas óseas. Los espacios que deja la
matriz calcificada se encuentran inervados y vascularizados.
Para realizar estudios de preparaciones de hueso, es necesario descalcificarlo.
OBJETIVO.- Identificar cada uno de los componentes del tejido óseo.
MATERIAL Y METODO.- Microscopio, portaobjetos,, cubreobjetos, navaja, pinzas,
agujas y como material biológico un hueso largo de rata, ratón, rana o ave.
PROCEDIMIENTO.- Primera parte: Observación de un hueso en forma
longitudinal. El fémur se introduce en una solución descalcificadora (ácido nítrico al 10 %).
La descalcificación es completa si se atraviesa fácilmente el hueso con una aguja. Se
neutraliza el hueso introduciéndolo en una solución de carbonato al 10% y se lava con
agua corriente. Con una navaja se hace un corte longitudinal de todo el hueso, o al menos
de parte de la caña o diáfisis y de una de las cabezas o epífisis. En la cabeza se
observará, la configuración articular de esta región, el cartílago articular que la recubre, la
médula ósea esponjosa o médula roja del hueso, el cartílago de conjunción que separa
las epífisis de las diáfisis, el hueso compacto de las diáfisis ya en la caña o cuerpo del
hueso y la médula ósea amarilla alojada en la diáfisis o tuétano del hueso, además el
periostio o membrana envolvente del hueso.
Segunda parte: Se introduce el hueso en una solución fijadora como formol al 20%
durante 3-5 días. Se lava con agua abundante y se pasa a una solución descalcificadora,
hasta que el hueso se pueda atravesar fácilmente con una aguja. Se vuelve a lavar
durante una hora como mínimo y se neutraliza en una solución de agua carbonatada al
10% hasta que el hueso al contacto con papel indicador ya no dé indicios de contener
ácido. Se fija con formol al 10% durante 24 horas y se hacen los cortes, lavando antes en
forma abundante. Se tiñe con azul de metileno durante 3 minutos yn se hace otra
preparación con la técnica de hematoxilina-eosina.
NOTA.- Vea la técnica en la práctica anterior.
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Figura 50. Cartílago hialino costal. Hematoxilina-eosina
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Figura 56. Hueso compacto, sistema de Havers, Hematoxilina-eosina
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PRACTICA NO. 10
OBSERVACION DE TEJIDO MUSCULAR
INTRODUCCION.- El tejido muscular esta formado por células fusiformes llamadas
fibras musculares, que poseen la característica de acortarse, siguiendo su eje mayor
al ser estimuladas; esta propiedad se conoce como CONTRACTILIDAD muscular.
El tejido muscular se clasifica según su morfología en estriado y liso, es decir, si las
fibras musculares están atravesadas transversalmente por estrías, o no lo están,
respectivamente. Se hace otra clasificación desde el punto de vista fisiológico en
voluntario e involuntario, si depende su contracción de la voluntad o no. El músculo
estriado puede ser esquelético o cardiaco siendo este último de tipo involuntario.
Las fibras musculares están rodeadas por una membrana citoplasmática o
sarcolema. El citoplasma o sarcoplasma contiene a los componentes fundamentales
de la célula como sarcosomas (mitocondrias) y retículo sarcoplásmico (REL).
OBJETIVO.- Observar las características del tejido muscular y destacar las
diferencias entre el músculo estriado y liso.
MATERIAL Y METODO.- Microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, pinzas, agujas, y
como material biológico, muestras de músculo esquelético, cardiaco y liso (intestino
o vejiga).
PROCEDIMIENTO.- Primera parte: corte un trozo pequeño de músculo esquelético
(fresco) de unos 5 mm de longitud por unos dos de grosor y colóquelo sobre un
portaobjetos encima de unas gotas de suero fisiológico. Con las agujas procure
separa la muestra minuciosamente, procurando que quede bien “desflecado”.
Durante esta manipulación debe cuidarse que el material no se quede seco. Tiña
según la técnica de hematoxilina-eosina.
Puede observar los núcleos de color violeta debido a que captan la
hematoxilina y el resto de fibra con sus estriaciones, aparece impregnada
de rojo intenso que le da la eosina.
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Las fibras musculares son 1000 veces mas largas que anchas, poseen una
membrana fina o sarcolema que contiene a su citoplasma no diferenciado o
sarcoplasma. Las células son sincicios y sus núcleos guardan una posición
periférica debajo del sarcolema.
Si es posible, es decir, si cuenta con una muestra de tejido muscular cardiaco,
haga una preparación y tiña como lo hizo con el esquelético, y podrá observar que
las fibras cardiacas tienen mayor longitud que las voluntarias y que se ramifican
con las fibras vecinas.
Segunda parte: debido a que no hay órganos formados exclusivamente por
fibras musculares lisas, ya que éstas forman túnicas en muchos órganos, se
obtienen de la disociación de los órganos que las contienen.
Obtenga un corte transversal de intestino o vejiga urinaria de un mamífero
joven como conejo o rata (que haya permanecido en alcohol durante 8 días),
colóquelo en un portaobjetos, disócielo cuidadosamente con las agujas cuidando
que esté húmedo con alcohol o formol al 10% )fijador). Tiña según la técnica de
hematoxilina-eosina. Observará las fibras alargadas con los extremos afilados y
con un núcleo oval grande casi central.
Método tricr{omico de Gallego
1.- fijar en formol al 10%
2. hacer cortes por micrótomo
3. lavar en agua destilada
1. teñir con la solución de fucsina, durante 5 min. Conviene teñir el mismo día que
se hicieron los cortes
2. pasar los cortes al virofijador, durante 5 minutos, aquí se dejan todos los cortes
y uno por uno se montan en el portaobjetos t se van pasando por:
3. lavar en agua destilada
4. hacer una coloración de fondo con picrocarmin de indigo, durante 1 min.
5. deshidratar en trs cambios con alcohol de 96º , de 1 a 3 min. Cada uno
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6. aclarar en dos cambios de xilol, de 1 a 3 min cada uno
7. cubrir con balsamo de Canadá o resina.
Resultados
Núcleos
rojo violáceo
Hacer colágeno
azul verdoso
Fibras musculares
verde amarillento
Queratina y eritrocitos
amarillo
Preparación de las soluciones
-
- solución de fucsina
-
formol al 1%
10 cc
-
fucsina fenicada de Ziehl
5 gotas
-
ácido acético
1 gota
-
- virofijador
-
formol al 1%
10 cc
-
ácido acético
2 a 4 gotas
-
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Figura 72. Músculo esquelético. Técnica de plata
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PRACTICA NO. 11
OBSERVACION DE CÉLULAS SANGUÍNEAS EN UN FROTIS
INTRODUCCION.- La sangre es un tipo de tejido conectivo especial, constituido
por una “sustancia” líquida que se mantiene en movimiento permanente dentro del
sistema cardiovascular.
La sangre está formada esencialmente por dos componentes: una sustancia
intercelular líquida o plasma y elementos figurados, entre los que se encuentran los
eritrocitos, hematíes o glóbulos rojos, leucocitos o glóbulos blancos y restos o fragmentos
citoplasmáticos derivados de células especiales de la médula ósea, llamados plaquetas.
Las funciones de la sangre son variadas y complejas como son: transporte de
elementos necesarios para el funcionamiento de los distintos órganos, como oxígeno,
agua y sustancias alimenticias, recolección de elementos de desecho, transporte de
secreciones que regulan el funcionamiento de algunos sistemas y contribución a la
defensa del organismo.
La morfología de las células sanguíneas se estudia habitualmente por el método
del frotis, que consiste en extensiones delgadas, homogéneas, de una gota de sangre
periférica sobre un portaobjetos.
OBJETIVO.- Aprender a diferenciar las células sanguíneas.
MATERIAL Y METODO.- Lancetas estériles, portaobjetos, microscopio, colorante
de Giemsa, colorante de Wright, colorante de May Grüenwald.
NOTA: se puede sustituir la muestra por una obtenida por punción venosa y
utilizando los colorantes para tinción rápida.
PROCEDIMIENTO.- Si elige la técnica de la lanceta estéril, pique la yema de uno
de los dedos o del lóbulo de la oreja y deposite una gota en un portaobjetos limpio en uno
de sus extremos, y con otro portaobjetos extienda la gota en forma horizontal de derecha
a izquierda y procurando se forme entre los dos portaobjetos un ángulo de 45º. Deje secar
al aire y tiña con cualquiera de los colorantes según se indica a continuación; pero si se
utiliza sangre de punción venosa con anticoagulante, el frotis debe hacerse colocando una
gota de
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sangre en la parte media inferior del portaobjetos, y con otro se extiende hacia
arriba uniformemente la gota y se deja en contacto los dos portaobjetos
deslizando
lentamente el de arriba hasta que forme el extendido central. Se deja secar al aire, se fija
con metanol y se tiñe con la técnica rápida, colocando el frotis 15 segundos en el
colorante A, lavando con agua, y 15 segundos en el colorante B, se lava y se seca para
observar con una gota de aceite de inmersión con el objetivo de 100X.
Coloración de Giemsa
1. Fije el frotis con alcohol metílico durante 5 minutos.
2. Agregue solución diluida de colorante de Giemsa recién preparada (3 gotas de
colorante de Giemsa concentrada por cada ml de agua destilada) y cuente 20
minutos.
3. Lave con agua corriente.
4. Seque al aire y observe con objetivo de inmersión.
Coloración de Wright
1. Cubra el frotis con un número conocido de gotas de colorante de Wright
durante 2 minutos.
2. Añada el mismo número de gotas de agua destilada, mezcle y deje actuar la
mezcla durante 8 minutos.
3. Lave con agua corriente.
4. Seque al aire y observe con objetivo de inmersión.
Método Panóptico de Pappenheim
8. Cubra el frotis con 4 gotas de colorante de May Grüenwald durante 3 minutos.
9. Añada la misma cantidad de agua destilada procurando que se mezclen y deje
actuar la mezcla durante un minuto.
10. Escurra el líquido y sin previo lavado, añada solución diluida de Giemsa recién
preparada, dejándola actuar durante 10 minutos.
11. Seque y observe con objetivo de inmersión.
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Figura 146. Frotis sanguíneo. Linfocito pequeño, método de Wright
Figura 147. Frotis sanguíneo. Linfocito mediano, método de Wright
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Figura 148. Frotis sanguíneo. Monocito y plaquetas, método de Wright
Figura 149. Frotis sanguíneo. Polimorfo basófilo, método de Wright
Figura 150. Frotis sanguíneo. Polimorfo neutrófilo, método de Wright
Figura 151. Frotis sanguíneo. Polimorfo eosinófilo, método de Wright
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PRACTICA NO. 12
TINCIÓN DE GOLGI. OBSERVACION DE TEJIDO NERVIOSO
INTRODUCCION.- En el tejido nervioso, las células se han
especializado
específicamente para transmitir impulsos de una parte del cuerpo a otra. . Este proceso
es rápido y prosigue por tractos circunscritos, compuestos de células nerviosas en serie.
El impulso pasa de una célula a otra a través de brechas submicroscópicas conocidas
como sinapsis. Cada célula nerviosa posee por lo menos una prolongación citoplásmica
muy larga, de manera que el número de unidades requeridas para transmitir el impulso
se mantenga al mínimo. La unidad básica del tejido nervioso es la neurona – una célula
nerviosa y todas sus prolongaciones citoplásmicas . La gran mayoría de las células
nerviosas tienen muchas prolongaciones citoplásmicas y se denominan por lo tanto,
neuronas multipolares,; en estas células nerviosas, solo una de las prolongaciones, el
axón, conduce el impulso del cuerpo celular hacia fuera. Las demás prolongaciones,
llamadas dendritas, conducen el impulso hacia el cuerpo celular. Algunas células
nerviosas solo poseen dos prolongaciones, un axón y una dendrita y se denominan
neuronas bipolares. Finalmente algunas células nerviosas pueden
exhibir
solo una
prolongación celular que se divide casi inmediatamente, a manera de T, en un axón y una
dendrita, estas células se conocen como neuronas seudounipolares.
Los cuerpos neuronales del sistema nervioso central yacen en la materia gris, o en
acumulos localizados en la materia blanca. La materia gris comprende vastas áreas de
células nerviosas y sus neuroglias de sostén, que se encuentran en las cortezas del
cerebro y del cerebelo y en la región central de la médula espinal. La materia blanca esta
compuesta de las prolongaciones citoplasmáticas de las células nerviosas y sus
neuroglias de sostén.
Los acumulos de neuronas que se encuentran en la materia
blanca, son, usualmente aunque no siempre, llamados núcleos, se encuentran en todas
las partes del sistema nervioso central.
OBJETIVO.- Que el alumno conozca macroscópicamente las partes del sistema nervioso
y la imagen microscópica del tejido nervioso.
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MATERIAL Y METODO.- microscopio
MATERIAL BIOLOGICO.- Colección de partes del sistema nervioso humano contenidos
en resina y laminillas con cortes de cerebro, cerebelo y médula espinal.
PROCEDIMIENTO.a) Observar los bloques de resina que contienen las muestras de fragmentos de
cerebro, cerebelo y médula espinal humanos.
b) Observar al microscopio las preparaciones de colección de tejido nervioso.
c) Comentar para ambos casos las imágenes con la información teórica de la
bibliografía.
Tinción de Golgi
1.- Realización de cortes de 150 µm (desde aquí se puede realizar cortes a 10 µm)
2.- Inmersión en solución fijadora 24 horas a temperatura de 4º C.
3.- Fijación. Mezclar
dicromato de potasio
2% (p/v)
50 ml
paraformaldehido
40% (p/v)
10 ml
Ac acético glacial
5 ml
Adicionar 15 ml por bloque de tejido, durante 48 hrs a 25º C (oscuridad)
4.- Lavado en agua desionizada, agitando por 30 min.
5.- Impregnación.
Solución de nitrato de plata 0.75% (p/v), adicionar 15 ml/bloque de tejido, 24 horas a
temperatura ambiente y oscuridad.
6.- Realizar cortes a 10 µm
7.- Deshidratar y montar los portaobjetos.
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Figura 113. Sistema nervioso central. Corteza cerebral, técnica de plata
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