043 - Universidad Nacional del Nordeste

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Correlación del polimorfismo genotípico m1 (Msp1) con los fenotipos de
inductibilidad de la enzima P1450 en una población normal de Misiones
Gómez Demaio, Hugo1 - Martín, Cristina1 - Brandan,Nora2
Carlucci, M.3 - Bluvstein, Samuel2
1.
2.
3.
Lab. de Investigaciones del C’IETEMM - Hosp. Prov. de Pediatría.
Mariano Moreno s/n. - (3300) Posadas - Misiones.
Facultad de Medicina - UNNE.
Hospital Ramón Madariaga - Posadas - Misiones - E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
La exposición a hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs)- componentes o vehículos de la mayoría de los
agroquímicos usados en nuestra región- produce en los tejidos de los mamíferos, la inducción de la enzima
aryl hidrocarburo hidroxilasa (AHH)- Citocromo P1450 - para su detoxificación . La AHH está codificada
por el gen ambiental CYP1A1. La cantidad de enzima sintetizada en este proceso es una característica
fenotípica (expresión del gen) variable de un individuo a otro y se hereda siguiendo las leyes de Mendel. En
linfocitos humanos se describen tres fenotipos de respuesta, según la cantidad de enzima producida para la
detoxificación de un HAP: de baja, intermedia y alta respuesta. Al grupo de respuesta alta pertenece sólo el
10% de la población caucásica, y estos, frente a la exposición con un HAP, tienen un riesgo mayor de
presentar mutagénesis, carcinogénesis , teratogénesis ( errores del desarrollo embrionario de línea media,
como es por ejemplo, el mielomeningocele) o enfermedades por toxicidad.
En trabajos anteriores publicamos las frecuencias halladas de los fenotipos mencionados utilizando como
metodología, la incorporación de Uridina tritiada al ARN mensajero del gen activado. En una población de
recién nacidos normales del Servicio de Neonatología del Hospital Madariaga de Posadas (Misiones) (n=60),
hallamos 45% de baja inducción; 46% de inducción intermedia y 12% de inducción alta, valores similares a
los de población caucásica, evaluados por otros autores con otra metodología (p: 0,52). En los pacientes con
MMC (n=60), hallamos : 60% y 40%, en los de intermedia y alta inducción, respectivamente y ninguno en el
grupo de baja respuesta, diferentes significativamente de sus controles normales.(p: 0,0001).
La diferencia para detoxificar los HAPs halladas en los pacientes con MMC, hicieron necesario el estudio del
gen CYP1A1 cuyos polimorfismos ( distintas variantes según mutaciones en el mismo) se correlacionarían
con los fenotipos descriptos. La determinación de las frecuencias de los grupos susceptibles en poblaciones
normales expuestas a contaminantes ambientales, permitiría la identificación de los individuos en riesgo de
presentar mutaciones y se podría establecer la relación entre carga genética y agresión ambiental, en la
etiopatogenia del MMC y otros defectos del desarrollo embrionario de línea media, así como el desarrollo de
un modelo animal en ratas con genotipo susceptible.
MATERIALES Y METODOS
Se extrae el ADN a partir de 300 µl de sangre de cordón umbilical de 60 recién nacidos normales, tomadas
como control, del Servicio de Neonatología del Hospital Madariaga de Posadas, Misiones. Se amplifica el
extremo 3' del gen CYP1A1, con la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa usando los primers
C47: 5’ CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT 3’ y C44: 5’ TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT 3’ , en las
siguientes condiciones: una denaturación inicial a 95º C por 5’; luego 25 ciclos con una hibridización a 68º
por 1’; extensión a 72ºC por 1’ y denaturación a 95ºC por 1’. Al cabo del final de los ciclos, una extensión a
72º por 3’. Los fragmentos amplificados se digieren luego con MspI ( New England Biolabs) según
recomendaciones del producto, a 37ºC por 2 horas.Los productos son sujetos a electroforesis en un gel de
agarosa al 1,8% y se visualizan con tinción con Bromuro de Etidio. El marcador de peso molecular utilizado
es el de 100 pares de bases (New England Biolabs). Se identifican las variables alélicas de acuerdo al patrón
de bandas visualizadas con la tinción. Dichas variantes se manifiestan luego del corte con la enzima de
restricción Msp1 ( endonucleasa que reconoce y corta las secuencias C ↓ CGG. El genotipo m1/m1, es aquel
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en donde no se produce la mutación, por lo cual no hay sitio de corte para la enzima en ninguno de los alelos.
Se visualiza por lo tanto, una sola banda de 340pb que corresponde al fragmento amplificado del gen. (Fig 1).
El genotipo m1/m2, es aquel en el que en un alelo se introduce el sitio de corte y el otro es normal,
observándose tres bandas.: una de 340pb en el alelo considerado salvaje, y en el alelo mutado, dos bandas , de
200 pb y 140 pb , resultante de los dos fragmentos en los que se corto el salvaje. Y el genotipo m2/m2,es el
doble mutado, observándose , por lo tanto, una banda de 200 pb y otra de 140 pb para los dos alelos.
Fig 1: Visualización en el gel de agarosa al 1,8% de las bandas del extremo3’ del gen CYP1A1 , luego de
amplificar y cortar con la enzima Msp1 , teñidas con Bromuro de Etidio.
m1/m1
m1/m2
m2/m2
340 pb
200 pb
RFLP
3’-Msp1
140 pb
RESULTADOS
Se han observado en el 45% de los recién nacidos normales estudiados, la variante m1/m1, correlacionada
con el fenotipo de respuesta baja; 45% de los mismos, exhibieron la variante m1/m2 y el 10%, la variante
m2/m2. Estos resultados son similares a los reportados por nosotros para los tres fenotipos. (p< 0,05).
Tabla 1
Tabla 1: Comparación de los fenotipos de inductibilidad enzimática, con el polimorfismo Msp1 en una
población normal de recién nacidos en Misiones.
Polimorfismo Msp1
GEN CYP1A1
( N= 30.Población normal)
Fenotipos de inductibilidad.
Enzima AHH
(N= 60.Población normal)
-Gómez Demaio y col, 1997
m1/m1
47% ( 14)
Baja
45% (27)
m2/m2
43% (13)
Intermedia
43% (26)
m1/m2
10% ( 3)
Alta
12% ( 7)
Chi-cuadrado= 0,226 ; P del chi-cuadrado= 0,893
No significativa.
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DISCUSION
Las frecuencias genotípicas para las variantes alélicas del polimorfismo Msp1 del gen estudiado, se
correlacionan con las frecuencias fenotípicas de inducción de la enzima, para la cual codifica este gen.
Esto es significativo, debido a que la metodología que utilizamos anteriormente, para la determinación de
los fenotipos, fue la de incorporación de uridina tritiada al ARNm de la enzima.
CONCLUSIONES
La determinación de las frecuencias genotípicas de estas variantes alélicas en poblaciones normales
expuestas a contaminantes ambientales, permite la identificación de los individuos en riesgo. En los
pacientes afectados de mielomeningocele, así como en otros pacientes con defectos del desarrollo
embrionario de línea media, como la fisura labiopalatina, estos estudios permitirían establecer el riesgo
asociado a las formas mutadas del gen ambiental.