Conservación de Cepas de Colección

Conservación de Cepas de Colección
Bioq. María de los Angeles Sosa
Instituto de Medicina Regional – UNNE
Instituto de Medicina Regional Resistencia ‐ Chaco
¿Qué es una Colección de cultivos
microbianos?
Son entidades en donde se realizan una serie de actividades cuyo objetivo principal es preservar , mantener y distribuir cepas con sus características originales.
•Colecciones de investigación
CEREMIC, IMR
IMR--M, Malbrán
•Colecciones industriales
Colección Instituto Finlay (Cuba)
•Colecciones de servicio
ATCC, CBS
y Cultivos puros, evitar las contaminaciones
Cultivos puros evitar las contaminaciones
y Sobrevida del 70 al 80% del inoculo
y Genéticamente estables
Conservación de cepas
Conservación de cepas
Métodos de conservación a largo plazo:
• Liofilización
• Criopreservación (N2 líquido, ‐30, ‐80º C)
Métodos de conservación alternativos
Métodos
de conservación alternativos
• Transferencia periódica. ‐ Bajo capa de aceite mineral
• Conservación en agua destilada . Método de Castellani
Conservación en agua destilada Método de Castellani
Métodos de conservación restringidos
• Desecación en papel de filtro
p p
• Desecación en suelo, arena, silica gel
• Secado Liquido o L‐Drying
Métodos de conservación a largo plazo Criopreservación
• La congelación disminuye la actividad metabólica de una célula por l di i ió d
la disminución de agua disponible.
di
ibl
• Se guardan en ampollas selladas ( vidrio o plástico: crioviales) con un agente crioprotector
un agente crioprotector
• Es el mejor método de conservación a largo plazo.
• Requiere aparatos especiales, es honeroso
• Suministro constante de energía o NL.
S i i
d
í NL
• No apto para el envío de las cepas. Factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las cepas
bld dd l
• Temperatura de almacenamiento: Temperatura de almacenamiento:
9 Nitrógeno líquido a –195ºC, o bien en su fase gaseosa a –140ºC
gaseosa a 140 C.
9Ultrafreezer de hasta –96ºC. 9Congelador –20ºC –40ºC no son aconsejables
9Congelador –20ºC , –40ºC, no son aconsejables para algunos grupos .
• Alta densidad celular: Alta densidad celular:
Usar entre 107 ‐ 104 células/ml: Lisis de parte del inóculo. Edad de las
de las células
• Que mo. se va a conservar, gran variabilidad. ,g
Velocidad de crecimiento promedio (18 hs, 1 semana, 20 días)
• Deben estar maduras, lo ideal es preservarla en fase log tardía o al inicio de su fase
fase log tardía o al inicio de su fase estacionaria.mayor resistencia a la congelacion y descongelacion. • Si es una cepa que tiene un estado de esporulación hacerlo en ese momento
esporulación, hacerlo en ese momento.
Nucleación cristalina
• Una Velocidad de Congelación de 1 a 10 º C/min
g
/
minimiza el efecto de la concentración de los solutos durante la nucleación. • Congelación paulatina evita la Ruptura celular!!!
€ Crioprotector:
• Son compuestos químicos no tóxicos con facilidad
para atravesar la membrana celular y acumularse
intracelularmente.
• reducen al mínimo los efectos perjudiciales del
aumento de la concentración de solutos y la formación
de cristales de hielo.
• Examinar sus propiedades tóxicas (DMSO>glicerol)
• Los penetrantes mejores que los no penetrantes
Los mas usados:
€ Glicerol 10%
€ Sacarosa 7% + inositol 7%
€ Leche descremada 10% (vol/vol)
€ DMSO 5% (vol/vol)
€ Período
de equilibrio:
se inocula en el medio liquido, se incuba hasta la fase estacionaria centrifugar se retira el
la fase estacionaria, centrifugar, se retira el pellet y se resuspende en 2‐5ml caldo, añadir el crioprotector
el crioprotector.
• Tiempo: 30 minutos a Tº ambiente. El agente
crioprotector puede ser tóxico para las células si el tiempo de
equilibrio es demasiado largo.
• Fraccionamiento en viales
“Lote de reserva”
“Lotes de trabajo”
Freezer -80ºC
IMR UNNE
RCIA CHACO
Freezer -80ºC
LABORATORIO CENTRAL DE
CORRIENTES
CORRIENTES
Suministro especial
de energía eléctrica
Espacio
sp c o físico
s co
refrigerado
Estabilizador,
elevador de tensión
Grupo electrógeno
Reconstitución (deshielo)
Reconstitución (deshielo)
• Velocidad y temperatura de descongelado: Velocidad y temperatura de descongelado:
• Descongelación rápida: Baño María a 37ºC. D
l ió á id B ñ M í 37ºC
• Crioviales: – Criotolerancia, tapa a rosca y o‐ring. Máxima capacidad de almacenamiento y facilidad de manejo. – No llenar, colocar entre 0,5 a 1,0 ml N ll
l
05 10 l
de la suspensión de célular. CRIOPERLAS
Perlas de cerámica que se impregnan con la solución celular a congelar y al reconstituir b t
basta con emplear una o varias bolitas sin necesidad de descongelar el resto.
l
i b lit i
id d d d
l
l t
Recuperación post congelado
post congelado
• STREESS!!
STREESS!! Una vez recuperadas nunca utilizar estos Una vez recuperadas nunca utilizar estos
microorganismos inmediatamente en pruebas fisiológicas realizar 1 o 2 pasajes previos
fisiológicas, realizar 1 o 2 pasajes previos.
• Transferir a medios adecuados (caldos o medios agarizados)
i d )
• Tiempo de incubación: puede disminuir la velocidad de crecimiento.
Criopreservación
Ventajas
j :
¾
¾
¾
¾
Viabilidad 7 a 10 años
No se detectaron cambios genéticos
Apto para una gran variedad de mo.
Simple, pre‐tratamiento mínimo.
Desventajas:
¾
¾
¾
¾
Equipamiento y mantenimiento $$$.
Equipamiento
y mantenimiento $$$
Criotubos, racks para criotubos, etc.
Monitoreo de la Tº.
Suministro constante de energía eléctrica, grupo electrógeno.
d
í lé
l
ó
Liofilización
•Combina una congelación (‐60°C) y luego secado al vacío. (Secado por sublimación)
•Para
Para bacterias, levaduras, bacterias levaduras
esporulados y virus. •Mayor sobrevida para bacterias gram (+) que Gram (‐). •Viabilidad hasta 30 años. •Espacio reducido los liófilos
•Espacio reducido, los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC), con lo cual su envío es muy cómodo.
Lioprotectores
• No utilizar glicerol, genera liófilos muy viscosos. g
,g
y
• No DMSO porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del agua puede dañar a las células.
células
• Si:
9Inositol 5% la mayoría de las bacterias
5% la mayoría de las bacterias
9Proteosa peptona‐glicerol para bacterias,
9leche descremada 10‐20 % para hongos y actinomicetos ti
i t
9glutámico‐glutamato para las bacterias lácticas
9Sacarosa
Sacarosa 7% 7% + peptona 7%
peptona 7%
Consideraciones
• Tipo de microorganismo
• Inoculo: 108‐109 células/ml bacterias, 105‐107 hongos
• Tº durante la sublimación: lo más baja posible, sin subir por encima de –50ºC.
• Grado de deshidratación alcanzado: humedad menor al 1% • Atmósfera de oxígeno en el tubo: cerrados al vacío para evitar la presencia de oxígeno (rehidratación, oxidación)
i d
í
( hid
ió
id ió )
• Condiciones de almacenamiento: En oscuridad y la Tº debe ser constante 18ºC o refrigerar
constante, 18ºC o refrigerar.
Reconstitución del liófilo
Reconstitución del liófilo
Pasos:
9Se toman los viales de la parte superior, cubren con
ggaza p
para evitar explosión
p
al ingreso
g
de aire.
9Se inyectan 0.1‐0.4 ml de medio enriquecido con
pipeta Pasteur o jeringa.
9Se agita y se disuelve, luego transferir a el medio de
cultivo adecuado.
Mayor sobrevida, al mantener elevada la
Presion osmótica durante la rehidratación!!
Liofilización
Ventajas:
¾
¾
¾
¾
¾
¾
Viabilidad y longevidad elevada Promedio 20 años
No se detectaron cambios genéticos
Apto para una gran variedad de mo.
Fácil manipuleo y transporte de los liófilos
Protección total ante posibles contaminantes
Protección total ante posibles contaminantes
Producción a gran escala
D
Desventajas
t j :
¾
¾
¾
¾
¾
Equipamiento inicial y mantenimiento $$$.
Muchos mo. no resisten
Existen algunos daños genéticos y/o selección
Laborioso
Requiere personal especializado
Métodos de conservación é d d
ó
alternativos
Métodos de conservación
Transferencia periódica
f
i
iódi
• Método común de conservacion que consiste en la q
resiembra periódica del cultivo en un medio fresco.
• El intervalo de transferencia varia con el mo, debiendo considerarse el medio de cultivo adecuado
onsiderarse el medio de lti o ade ado
• Mantener a T amb o 4º C durante 15 días a 2 meses.
• Bajo capa de aceite mineral o vaselina estéril Bajo capa de aceite mineral o vaselina estéril ( Evita la ( Evita la
desecación y ↓ metabolismo) Refrigerado, mantiene hasta 3 años.
Neisseria
N
i
i sp. (1 año)
(1 ñ )
Salmonella sp (35 años)
Consideraciones
Retardar el envejecimiento alargando los eta da e e ejec e to a a ga do os
periodos entre dos resiembras: 9↓Inóculo
9↓nutrientes del medio (Agar min, agar cepa)
9 inocular en profundidad y no en estría, los anaerobios facultativos crecen más rápido en presencia de O2
facultativos crecen más rápido en presencia de O2 (productos tóxicos)
9Almacenar a 4ºC‐8ºC.
• Los mo. muy aerobios no se pueden guardar en tubos completamente cerrados.
Métodos de conservación
T
Transferencia periódica
f
i
iódi
Ventajas: ¾ Viabilidad: 2 ó 3 años.
¾ No requiere equipamiento especializado.
¾ No “estress” ¾ Rehabilitación + rápida.
Desventajas:
¾ Variaciones genéticas!!!
Variaciones genéticas!!!
¾ Deshidratación. ¾ Contaminación. ¾ Supervisión técnica constante. ¾ Espacio físico de almacenamiento.
Métodos de conservación
Método de Castellani
Método de Castellani
• Es un método muy utilizado con altos porcentajes de viabilidad (hongos filamentosos, levaduras y algunas bacterias)
• Suspensión de bacterias, levaduras, esporas o bloques p
,
, p
q
de agar en agua destilada estéril o agua de mar.
• Inoculo menor a 104‐105 células/ml para bacterias y levaduras. levaduras.
• Tº amb y a 4ºC. Ej: Candida sp y Dermatofitos.
Ej: Candida
y Dermatofitos
Métodos de conservación
Método de Castellani
Método de Castellani
Ventajas:
¾ Viabilidad 5 años o más.
¾ Almacenamiento : mesada o heladera. ¾ No contaminación con ácaros.
No contaminación con ácaros.
¾ Alto % de recuperación. ¾ Bajo % variaciones genéticas.
Desventajas:
Desventajas
¾ Estabilidad de los caracteres es buena (?? Virulencia, poder fermentativo)
¾ Personal entrenado.
P
l
d
¾ Tubos con o‐ring (deshidratación).
¾ Solo cepas con buena esporulación.
Métodos de conservación Restringidos
Secado líquido
o
Leche descremada 5%
•Bacterias
Bacterias y levaduras
y levaduras
•TRANSPORTE
•Viabilidad 2 o 3 años
Desecación en Silica gel
Desecación en Silica
Muy bueno para hongos y bacterias!!!
M
b
h
b
i !!!
Pasos:
• Preparación del inoculo 10
Preparación del inoculo 109 – 1010 cél/ml
•Distribución de la suspensión a disecar sobre la silica gel esterilizada a 160º C 3 horas (cambio de color)
horas (cambio de color)
•Colocar e en disecador 12 horas a 4ºC
•Distribución de los gránulos en tubos de polipropileno.
•Congelado.
Reconstitución (sacar 1 granulo)
(sacar 1 granulo)
•Reconstitución
Micoteca
i
d l Dpto. Micología
del
l í
Instituto de Medicina Regional
IMR-M
Directores: Gustavo Giusiano –
Magdalena Mangiaterra
Curadores: María de los Angeles Sosa
Mariana Fernández
P
Personal
l Técnico:
Té i
Liliana
Lili
Alegre
Al
Departamento de Micología
Instituto de Medicina Regional
Repique en Medio
Dixon o LN
(Purificación)
Pruebas de
identificación
presuntiva
Fraccionamiento y
archivo
Etiquetado
Registro
computarizado
Controles
periódicos de
viabilidad
Control de
inventario
Pruebas de
identificación
definitiva
Registro manual
Paso 1: Repique en
Medio Dixon o LN
((Purificación))
La incubación se realiza en atmosfera
húmeda a Tº promedio 32ºC, 5 a 7 días.
Considerar la velocidad de crecimiento:
Rápida ( < 3
días)
Media (5-7 días)
M pachydermatis M furfur,
M.pachydermatis
furfur M
sympodialis
M. slooffiae
Lenta > 7 dias
M. globosa,
M
globosa M
M. restricta,
restricta M.
M obtusa,
obtusa
M japonica, M. dermatis, M. nana
M. yamatoensis, M. equina, M.
caprae
M. cuniculi (LN > 7dias y mDA ( 14
días)
Paso 2: Pruebas de
identificación
presuntiva
Paso 3:
Identificación
definitiva
EXTRACCION
Cepa aislada
-Shock
Shock térmico
Amplificación
26s ARN ribosomal
RFLP
Enzimas Cfo
f I y MboI
PCR RFLP 1
(CfoI)
Corrida
electroforética
PCR screening
Paso 4: Registro
manual
A) Nombre (identificatorio del cultivo)
B) Nombre y dirección del depositante.
C) Fuente, sustrato o huésped de donde se aisló o derivó y fecha
de aislamiento.
D) Origen geográfico (lugar de origen.)
E) Número del material según el depositante
depositante, o número de otras
colecciones si fue depositado en otra parte.
F) Medio y condiciones de crecimiento, condiciones de
almacenamiento.
almacenamiento
G) Hoja de seguridad (Información de riesgos)
Base de datos
Base de datos
Paso 5: Registro computarizado
Fraccionamiento
y archivo
“Lote de reserva”
“Lotes de trabajo”
Freezer -80ºC
IMR UNNE
RCIA CHACO
Freezer -80ºC
LABORATORIO CENTRAL DE
CORRIENTES
CORRIENTES
Suministro especial
de energía eléctrica
Espacio
sp c o físico
s co
refrigerado
Fraccionamiento
y archivo
Estabilizador,
elevador de tensión
Grupo electrógeno
CONTROLES DE CALIDAD
CONTROLES DE CALIDAD:
Realizarlo ANTES Y DESPUÉS DE LA PRESERVACIÓN.
‰ DE VIABILIDAD Y PUREZA
‰ DE ESTABILIDAD DE CARACTERES RELEVANTES.
‰ REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO.
REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO.
‰ MÉTODOS DE PRESERVACIÓN.
‰ FRECUENCIA DE CONTROLES DE MANTENIMIENTO (1 control al año)
Control de viabilidad
€
€
MEDIO Leeming
g Notman ((14 días a 32ºC como.max))
% de recuperación de viables = Colonias /INOCULO (104) = %
Control de inventario
Información mínima requerida:
requerida:
€ Metodología de preservación
€ Localización e identificación del material almacenado (en
que lugar
q
g físico))
€ Fecha de conservación
€ Numero de pasajes
Š Acrecentar el número de cepas de la colección.
Acrecentar el número de cepas de la colección
Š Aplicar un 2do método de conservación: Liofilizar las cepas que puedan soportar esta metodología.
Š Completar la caracterización de las existentes.
Š Incrementar el personal técnico Š Certificar las cepas
Š Promover la sustentabilidad Š Fomentar cambios de política en las Instituciones (Universidad, SeCyT)
Š Trabajar en red (FELACC).
RESUMEN RESUMEN
Bacterias
‰Transferencias simples: algunos meses
‰Transferencias
simples: algunos meses
‰Almacenamiento con aceite mineral: 1‐2 años
‰C
‰Congelación a ‐20°C: 1‐3 años
l ió
20°C 1 3 ñ
‰Secado y freezado en silica gel: 6 años
‰Congelación a ‐70°C: 1‐10 años
‰N liq y liofilización: hasta 30 años
Bibliografía
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Agradecimientos
D t de Micología Dpto
d Mi l í
IMR
Dr. Gustavo Giusiano
Lic. Magdalena Mangiaterra
Bioq. Florencia Rojas Bioq. Mariana Fernandez
Bioq Maria Emilia Cattana
Bioq. Maria Emilia Cattana
Bioq. Sergio Toma Vanacore
Tec. Liliana Alegre