“Detección y análisis molecular de Rotavirus a partir de aguas
Anuncio
1 Universidad de la República – Facultad de Ciencias Sección Virología “Detección y análisis molecular de Rotavirus a partir de aguas provenientes de plantas de tratamiento de aguas residuales”. Tesina de grado Licenciatura en Bioquímica Gabriela Betancour Curutchet Tutor: Mabel Berois http://www.canstockphoto.es/imagenes-fotos/rna.html Montevideo, 2013 2 Indice Resumen ……………………………………………………………………………………… 4 Abreviaturas …………………………………………………………………………………... 5 1 Introducción 1.1 El agua, los microorganismos y la salud humana …………………………………… 6 1.1.1 El agua y los microorganismos …………………………………………………….... 6 1.1.2 Los virus entéricos en el ambiente ………………………………………………….. 7 1.2 Virus entéricos en aguas: antecedentes en la región ………………………………. 8 1.3 Situación en Uruguay …………………………………………………………………. 11 1.3.1 Monitoreo de aguas en Uruguay ………………………………………………….. 11 1.3.2 Antecedentes de estudios de Rotavirus y otros virus entéricos en Uruguay …. 12 1.4 Los Rotavirus …………………………………………………………..………………. 14 1.4.1 Generalidades de Rotavirus ……………………………………………..………… 14 1.4.2 Estructura y genoma …………………………………………………...…………… 15 1.4.3 Clasificación …………………………………………….……………………………. 22 1.4.4 Epidemiología molecular ……………………………………..…………………….. 24 2 Objetivos 2.1 Objetivos generales …………………………………………………………………… 26 2.2 Objetivos específicos ……………………………………………………………….… 26 3 3 Materiales y métodos 3.1 Muestreo ………………………………………………..………………………………. 27 3.2 Concentración de las partículas virales …………….……………………………….. 28 3.3 Extracción de ARN genómico ………………………………………………………... 28 3.4 Detección del genoma viral ……………………………………………..……………. 29 3.5 Genotipificación del genoma viral ……………………………………..……….……. 30 3.6 Detección y cuantificación del genoma viral ……………………………….……….. 33 4 Resultados 4.1 Detección del genoma viral …………………………………………………..………. 34 4.2 Genotipificación del genoma viral ……..……………………………………………… 36 4.3 Secuenciación y análisis filogenético …………………………………………………37 4.4 Detección y cuantificación del genoma viral ………………………………………... 41 5 Discusión ………………………………………………………………………………… 44 6 Conclusión y perspectivas ……………………………………………………………… 49 7 Bibliografía ………………………………………………………………………………. 51 8 Agradecimientos …………………………………………………………………………. 64 4 Resumen _____________________________________________________________________ Los Rotavirus, transmitidos principalmente por la vía fecal-oral, son la causa más común de gastroenteritis infecciosa en infantes y niños jóvenes tanto en países desarrollados como en desarrollo. Este virus puede ser encontrado en altas concentraciones en heces, posee bajas dosis infectivas y, a través de aguas contaminadas, puede convertirse en una seria amenaza para la salud humana. Es por esto que merece una especial atención en lo que respecta al tratamiento que reciben las aguas residuales transportadas por el sistema de saneamiento. En el presente trabajo se analizaron muestras de dos diferentes plantas de tratamiento de aguas residuales, una consistente en un sistema de lagunas (SL): laguna anaerobia, facultativa y de maduración, ubicado en la localidad de Ecilda Paullier; y la otra una planta de tratamiento terciario de aguas residuales con radiación ultravioleta (PTAR), en la ciudad de Canelones. Las muestras fueron tomadas en diferentes puntos de cada proceso de manera bimensual durante un año, hallándose un 36,6% de positividad para la presencia de Rotavirus por PCR convencional. Un 100% de las muestras de afluentes de la PTAR resultaron positivas para la detección del virus mediante PCR en tiempo real, mientras que en el caso de los afluentes del SL el porcentaje fue de 71,4%. La mayoría de las muestras de la PTAR mostraron una carga viral nula, o en su defecto una reducción en la misma, tras el tratamiento con radiación UV. Mediante análisis filogenético, se pudieron determinar los diferentes G-tipos, encontrándose genotipos comunes, como G1 y G9, y otros no tanto como G3 y G10, que a pesar de que generalmente circulan en animales, agruparon con secuencias humanas. La secuencia G10 encontrada agrupó con una cepa G10P[9] inusual, con estrecha relación con una cepa bovina. En cuantos a los P-tipos detectados, los mismos fueron los más ampliamente distribuidos a nivel mundial, P[4] y P[8], así como también genotipos menos frecuentes como P[9] y P[11]. Las secuencias P[11] agruparon en un cluster constituido enteramente de secuencias bovinas. Este estudio de Rotavirus en aguas residuales forma parte de trabajos pioneros en el área de la virología ambiental en nuestro país, siendo el primer trabajo que realiza la detección, cuantificación y caracterización molecular de Rotavirus en aguas residuales de dos plantas con diferente tipo de tratamiento del interior del Uruguay. 5 Abreviaturas _____________________________________________________________________ ADN Ácido desoxirribonucleico ARN Ácido ribonucleico ADNc Ácido desoxirribonucleico copia ARNm Ácido ribonucleico mensajero DTT Ditiotreitol dNTP Desoxinucleótidos trifosfato nt Nucleótidos HCl Ácido clorhídrico KCl Cloruro de potasio µl Micro litros µM Micro molar MgCl2 Cloruro de magnesio M Molar mM Mili molar ng Nano gramos ORF “Open Reading Frame” (Marco abierto de lectura) pb Pares de bases PBS Buffer fosfato salino PCR Reacción en cadena de la polimerasa qPCR PCR cuantitativa PM Peso molecular PTAR Planta de tratamiento de aguas residuales rpm Revoluciones por minuto RT Retrotranscripción ICC-PCR Cultivo celular intregrado a PCR Taq Enzima Taq polimerasa SL Sistema de lagunas U Unidades UV Ultravioleta UTR “Untranslated región” (Región no traducible) 6 1. Introducción 1.1 El agua, los microorganismos y la salud humana _____________________________________________________________________ 1.1.1 El agua y los microorganismos El agua de baja calidad plantea una de las mayores amenazas para la salud humana. Billones de casos de enfermedades gastrointestinales ocurren cada año en el mundo, y la Organización Mundial de la Salud declaró que las enfermedades causantes de diarrea contribuyen a aproximadamente un 4,1% del total global de enfermedades, y son responsables por la muerte de 1.8 millones de personas cada año. Del total de las enfermedades, el 88% son atribuidas a un inseguro suministro de agua, saneamiento e higiene, y está mayormente concentrado en niños de países en desarrollo [Bosch y cols., 2008]. Los microorganismos patógenos asociados al agua constituyen una problemática substancial teniendo en consideración que los mismos pueden ser de distinta clase: bacterias causantes del cólera o la leptospirosis, entre otras, parásitos responsables de la equistomatosis, y las diversas familias de virus implicadas en numerosas enfermedades que actualmente aquejan a la población mundial. La mayoría de los virus asociados con la transmisión por el agua son los virus entéricos, dentro de ellos encontramos distintas familias que incluyen virus como Rotavirus, Norovirus, Adenovirus, Astrovirus, Virus de la Hepatitis A o Poliovirus los cuales son causantes de diversas enfermedades, aunque otros géneros menos frecuentes también pueden ser detectados, como Picobirnavirus, Bocavirus y Coronavirus [Symonds y cols., 2009]. El agua no potable, así como el agua de mar, son importantes desde el punto de vista de la persistencia de estos virus por tiempos extensos en estos ambientes, lo cual incrementa la probabilidad de la exposición humana por contacto recreacional y acumulación en mariscos de consumo humano. Los virus patogénicos son generalmente más resistentes que los indicadores bacterianos durante tratamientos convencionales de aguas de desecho, como lo son la cloración y filtración, y son capaces de resistir a disolventes de lípidos. En el ambiente, los virus entéricos pueden sobrevivir bajo un amplio rango de pH y por extensos períodos a bajas temperaturas, habiéndose reportado virus que han permanecido infectivos tras 130 días en agua de mar, tras 120 días en agua dulce y aguas residuales, y por más de 100 días en el suelo de 20 a 30 °C [Fong y Lipp, 2005]. 7 1.1.2 Los virus entéricos en el ambiente Los virus entéricos pueden encontrarse naturalmente en ambientes acuáticos o, más comúnmente, son introducidos en ellos como consecuencia de actividades humanas como vertido de efluentes y desagües. Pueden ser transportados en el ambiente a través de aguas subterráneas, estuarios de agua, agua de mar, ríos, aerosoles emitidos por plantas de tratamientos de aguas residuales, aguas tratadas insuficientemente y pozos que reciben aguas de desecho tratadas y sin tratar. Estos virus son transmitidos por vía fecal-oral, primeramente infectando y replicando en el tracto gastrointestinal del hospedero. Los virus entéricos son excretados en cantidades extremadamente altas en las heces de individuos infectados, típicamente entre 105 y 1011 partículas virales por gramo de materia, pudiendo ser en algunos virus incluso más [Bosch y cols., 2008, Fong y Lipp, 2005]. Los virus entéricos son de preocupación para la salud pública debido a que causan enfermedades agudas con dosis infectivas bajas. La probabilidad de infección debido a la exposición a un Rotavirus es de 31%, y tan sólo una partícula viral es requerida para causar la infección de un 1% de los adultos sanos sin anticuerpos para el virus [Fong y Lipp, 2005]. Se ha llegado a concluir que el riesgo de infección cuando se consumen virus del agua potable es 10-10000% mayor que el riesgo en cuanto a exposiciones similares con bacterias patogénicas [Haas y cols., 1993]. Desde los años 80, mediante importantes avances en el área de la virología ambiental, los virus entéricos han sido aislados de fuentes de agua potable contaminada, aguas recreacionales, ríos urbanos, y mariscos cosechados de agua contaminada, y vinculados con brotes originados en estos ambientes [Fong y Lipp, 2005]. Está reconocido que la enfermedad viral gastrointestinal más común es aquella producida por Rotavirus y Norovirus provocando diarrea en la población infantil y adulta, respectivamente. Sin embargo, los brotes de gastroenteritis virales transmitidas por el agua mejor documentados están relacionados con Norovirus. Otros virus gastrointestinales así como los Rotavirus son los Astrovirus, y también han sido implicados ocasionalmente en estos tipos de brotes [Bosch y cols., 2008]. En la mayoría de los países las regulaciones aún se basan solamente en indicadores bacterianos como enterococos, coliformes fecales y coliformes totales para evaluar la calidad microbiológica del agua. Sin embargo, los indicadores bacterianos no siempre reflejan el riesgo de muchos patógenos importantes (virus, bacterias patógenas viables pero no cultivables y protozoos). De hecho, virus entéricos infecciosos han sido aislados de ambientes acuáticos que están bajo los niveles aceptados por los 8 indicadores bacterianos; se han encontrado virus relacionados con brotes vinculados a la ingestión de aguas que se encuentran dentro de los estándares de coliformes fecales [Fong y Lipp, 2005]. Los patógenos virales en la mayoría de los casos presentan especificidad de hospedero, debido a esto han sido sugeridos como una herramienta prometedora para determinar la fuente de los contaminantes fecales en ambientes acuáticos, pudiendo ser usados conjuntamente con indicadores bacterianos, para evaluar la calidad del agua y mejorar la vigilancia de la salud pública. En general, los virus entéricos muestran un gran potencial para ser usados como indicadores de la calidad del agua, para evaluar los riesgos asociados con la transmisión de virus infecciosos [Fong y Lipp, 2005]. Por lo mencionado anteriormente en relación al alto grado de persistencia que presentan muchos virus entéricos en aguas, merece una especial atención el tratamiento que reciben las aguas residuales. Estas aguas contienen, entre otras cosas, los virus que se excretan en las heces y que son transportados por el sistema de saneamiento [Symonds y cols., 2009]. El sistema de saneamiento es el encargado de recoger, transportar, realizar un tratamiento y finalmente, darle una disposición final a los líquidos residuales. Los líquidos residuales pueden ser aguas negras, formadas por aquellas provenientes de las industrias, las de uso doméstico y las generadas por los seres humanos; y las aguas blancas, formadas por aquellas provenientes del lavado de calles, como las acumuladas durante las lluvias [IM, 2012]. En Uruguay se entiende por saneamiento a los sistemas comprendidos por redes de alcantarillado con disposición final en una planta de tratamiento, así como también a otros sistemas de evacuación, tratamiento o disposición de aguas residuales. [Obras Sanitarias del Estado, 2013] 1.2 Virus entéricos en aguas: antecedentes en la región _____________________________________________________________________ En la región, la problemática respecto a la calidad del agua en un país con tanta superficie y variabilidad demográfica como es Brasil, ha desarrollado un remarcado interés en los estudios ambientales, donde los virus y el agua ocupan un rol preponderante. En el año 1993 aparece como primer antecedente en la región un trabajo en donde se procesan muestras de desagües de hogares y también de arroyos, donde Rotavirus es detectado en un 20,6% y 34,5%, respectivamente, por 9 métodos inmunofluorescencia indirecta y de inmunoperoxidasa directa [Mehnert y Stewien, 1993]. En 2008, se publica un trabajo desarrollado en la localidad de Manaus, en donde el objeto de estudio fueron aguas superficiales asociadas a la recreación de los habitantes, y en donde en el 44,2% de las muestras fueron detectados Rotavirus mediante PCR convencional, así como también Adenovirus y Norovirus en menores porcentajes. Lo interesante es que en la mayoría de estas aguas la contaminación fecal no estaba demostrada por indicadores bacterianos como los coliformes totales [Miagostovich y cols., 2008]. En el año 2009 se publica otro trabajo que evalúa la presencia de Norovirus en aguas, antes y después de su tratamiento, en una planta en Rio de Janeiro. En este caso, estos virus fueron detectados en ambas situaciones comprobando así la eficacia parcial de los métodos de desinfección, al menos contra este virus, presente en un 53% de las muestras tratadas, detectadas mediante PCR cuantitativa a partir del genoma viral [Victoria y cols., 2009]. En 2010, fue publicado un trabajo en el cual se evaluó la presencia y viabilidad de virus entéricos en lodos y aguas residuales de una planta de tratamiento de la ciudad de Florianópolis, Brasil [Schlindwein y cols., 2010]. Para el caso de Rotavirus se pudo ver que, de un 33,3% de muestras positivas de lodos ante la detección del genoma viral, 25 % mostró ser viable por ICC-PCR; pero para el caso de las muestras de aguas residuales, del 41,6% de las muestras positivas, ninguna mostró viabilidad por ICC-PCR, sugiriendo la baja infectividad del virus en estas muestras. También en 2010, se publicó un estudio en el cual muestras de agua de fuentes como: agua de mar, laguna de agua salobre, aguas residuales, agua potable de fuentes con y sin cloro y agua procedente de un arroyo contaminado; así como también ostras de dos diferentes zonas de cultivo, fueron analizadas por nested PCR, RT-PCR, PCR cuantitativa, y la viabilidad se analizó por ICC-PCR. Se encontró que el 19% de las muestras de aguas fueron positivas en la detección de Rotavirus, mientras que los ensayos de viabilidad mostraron que sólo el 12,5% se trataba de virus infectivos [Rigotto y cols., 2010]. En 2010 Barril y colaboradores publicaron un trabajo en el cual se planteó como objetivo determinar si los genotipos de Rotavirus del grupo A y el patrón estacional de los meses de frío descrito en pacientes con diarrea era reflejado en lo encontrado en aguas residuales, lo cual podría ser representativo de los genotipos circulantes en la población. La distribución de este virus en muestras de efluentes de una planta de tratamiento de aguas residuales en la ciudad de Córdoba, Argentina, fue comparada 10 con aquella observada en los casos clínicos de esta localidad. Se encontró que la distribución proporcional de los genotipos del virus fue similar en aguas residuales y en muestras clínicas durante los meses de frío [Barril y cols., 2010]. En 2011, Blanco Fernández y colaboradores, en Córdoba, Argentina, realizaron un trabajo en el que se evaluó la presencia de Norovirus en muestras de aguas residuales y aguas colectadas del río Suquía, siendo éste el primer informe sobre detección y caracterización del virus en aguas residuales en este país. Los Norovirus detectados en este estudio estaban filogenéticamente más relacionados con otros de otras regiones más que con secuencias locales anteriores. En las muestras ambientales, se detectaron dos variantes genotípicas, una de las cuales se encontraba ampliamente distribuida, reflejando co-circulación y posibilidad de recombinación [Blanco Fernández y cols., 2011]. Más recientemente, en 2012, el mismo equipo de trabajo publicó un estudio en el que fue evaluada la presencia de Norovirus en cinco ríos de Argentina entre 2005 y 2011. Norovirus estuvo presente en todas las muestras, con diferentes patrones en aguas impactadas por comunidades de diferentes tamaños. En ríos afectados por poblaciones de tamaño medio, como Salta y Córdoba, sólo uno o dos genotipos fueron hallados en invierno. Sin embargo, en la ciudad de Buenos Aires, con mucha más población, el genotipo prevalente fue el mismo que el encontrado en Salta y Córdoba, pero se encontraron también genotipos adicionales, sin una estacionalidad clara. Análisis filogeográficos, filodinámicos y de difusión espacio-temporal fueron realizados [Blanco Fernández y cols., 2012]. También en 2012, Poma y colaboradores establecieron un conjunto de datos a tomar como línea de base para caracterizar la calidad del agua del río, identificar cambios en el tiempo, y el diseño de una estrategia de seguimiento racional, para lo cual utilizaron datos de un año de monitoreo mensual del río contaminado Arenales, en Argentina. Los datos fueron analizados estadísticamente para correlacionar las variables fisicoquímicas y microbiológicas, las variaciones estacionales y longitudinales de la calidad del agua, y determinar la similitud entre los sitios de estudio. Los diferentes virus y parásitos encontrados no se correlacionaban con la concentración de coliformes termotolerantes. Dentro de los virus que fueron incluídos en este estudio, se encontraban Norovirus y Adenovirus [Poma y cols., 2012]. 11 1.3 Situación en Uruguay _____________________________________________________________________ 1.3.1 Monitoreo de aguas en Uruguay El territorio uruguayo se encuentra comprendido dentro del acuífero Guaraní, una de las mayores reservas de agua dulce en el mundo. Si bien nuestro país no cuenta actualmente con problemas para suministrar el agua potable, es esencial una buena gestión de uno de los recursos naturales más importantes, de impacto a nivel económico y de la salud pública. En Montevideo, el monitoreo de la calidad del agua lo realiza la Intendencia de Montevideo, mientras que a nivel nacional, en el interior del país, es realizado por OSE (Obras Sanitarias del Estado) en colaboración con la DINAMA (Dirección Nacional de Medio Ambiente), participando también una red privada y pública de laboratorios especializados. Los lugares monitoreados son: zonas costeras, la cuenca del Río Santa Lucía, y en particular, la zona de Fray Bentos en torno a la planta Botnia. Los controles específicos realizados incluyen diversos análisis físicos así como productos químicos (cloros, nitratos, metanos, etc.). Los coliformes totales y termotolerantes son los únicos agentes microbiológicos controlados, quedando por fuera virus y parásitos. Esta situación determina que al día de hoy el conocimiento acerca de la circulación de estos organismos patógenos en nuestro país, tanto en aguas de abastecimiento, en aguas de recreación y en aguas servidas antes y después de su tratamiento, sea nulo constituyendo así un riesgo importante para la población y el medio ambiente [Obras Sanitaris del Estado, 2013]. La empresa estatal OSE tiene a su cargo el abastecimiento del agua potable a nivel nacional y el sistema de saneamiento en el interior del país, realiza diferentes tipos de tratamientos a las aguas residuales empleando diversas tecnologías en función de la cantidad de población y las condiciones de los cuerpos receptores; éstos últimos generalmente suelen ser ríos o mar abierto. La carga que accede a la planta de tratamiento presenta dos flujos entremezclados, uno de agua y otro de barro. El flujo de agua recibe un pre-tratamiento y luego el tratamiento en sí, cada uno compuesto por etapas diferentes. El pre-tratamiento consiste en procesos físicos de acondicionamiento del líquido residual, para que no afecte y facilite los demás procesos de depuración. La primera unidad, una reja, retiene elementos mayores a la separación entre las barras de la misma. Cuanto mayor es el caudal, más rápido se depositan los materiales aguas 12 arriba de la reja, lo que tiende a obstruirla, debiéndose realizar una limpieza. En esta instancia se puede encontrar con una unidad desarenadora, la cual recolecta toda la arena y materiales similares, sedimentándola y evitando que esto suceda en las unidades siguientes. También suelen construirse otras unidades para evitar problemas posteriores: desengrasador, tanques de homogenización. Luego, el tratamiento primario tiene el propósito de remover materia en suspensión y flotante. El sistema más común es un sedimentador, que puede remover hasta el 60% de los sólidos en suspensión y el 30% de la DBO (Demanda Biológica de Oxígeno), pero no podrá remover suspensiones coloidales ni sólidos disueltos, para lo que se necesita un tratamiento secundario. La sedimentación primaria también dispone de digestores para barro sedimentado. Por último, las instalaciones poseen un espacio para el secado de barro digerido, que una vez solidificado se extrae de la planta debidamente acondicionado. En el tratamiento secundario el objetivo es reducir la concentración de materia orgánica. Para líquidos domésticos se usan generalmente procesos de oxidación biológica, siendo los más comunes: filtros percoladores, procesos de barros o lodos activados, lagunas aireadas y lagunas de estabilización. Muchos de estos procesos se complementan con procesos de separación de sólidos de los efluentes, como sedimentadores, espesadores de lodo y lechos de secado o filtros prensa de bandas o centrífugas. En el tratamiento terciario se aplican reactivos para favorecer la coagulación y decantación de sales de fósforo y de nitrógeno, que no perjudican a la mayoría de los cursos de agua en donde están disueltas, pero son nutrientes para las algas. Se maximizan así los niveles de depuración del efluente que se verterá al curso receptor. Existen tratamientos en los que se exponen los afluentes a luz ultravioleta. También puede haber un vertido directo, donde no se aplica ningún tratamiento a la carga de afluentes recogidos por la red de alcantarillado sanitario y se vierte directamente a través de emisarios, en puntos alejados de los cursos de agua, con corrientes apropiadas para autodepuración y alejamiento de zonas costeras inmediatas [Obras Sanitaris del Estado, 2013]. 1.3.2 Antecedentes de estudios de Rotavirus y otros virus entéricos en Uruguay Uno de los primeros antecedentes del estudio de Rotavirus en Uruguay fue un estudio realizado por Torres y colaboradores en el año 2001. En este trabajo se estudiaron 13 256 casos de diarrea en niños de entre 1 a 20 meses de edad con diarrea persistente o aguda del Hospital Pereira Rossell en la ciudad de Montevideo. Los resultados obtenidos mediante inmunoensayo indicaron que un 16,4% de las muestras fueron positivas para Rotavirus [Torres y cols., 2001]. En 2003, se determinaron genotipos de Rotavirus por primera vez en el país, donde se detectó al virus mediante PCR convencional en un 32% de los casos de diarrea de niños menores de 2 años que realizaron una consulta o necesitaron tratamiento médico en el período 1996-1999 en la institución de salud CASMU de Montevideo [Berois y cols., 2003]. En este estudio se detectó el serotipo G1, del cual se detectaron dos linajes; el serotipo G2 que estuvo presente en 1997 y el G4, que agrupó con cepas argentinas, durante 1998. En 2008, se finalizó un trabajo en el que se estudió la variabilidad genética de Rotavirus en 23 muestras clínicas provenientes de la institución de salud CASMU de Montevideo, detectándose, mediante RT-PCR y posterior análisis filogenético, al genotipo G2 en un 30% de las muestras y al G9 en un 70%, sin detectarse genotipos comunes (G1, G3 y G4) y detectándose al genotipo G9 por primera vez en el país [Alberti, 2008]. Luego, en 2010, se realizó un estudio en el cual se caracterizaron genotípicamente 41 muestras clínicas provenientes de pacientes pediátricos del Hospital Pereira Rossell del año 2002, donde se detectó mediante multiplex RT-PCR que un 48,7% de las muestras fueron G4P[8] [Bengochea, 2010]. Los trabajos sobre el estudio de Rotavirus en muestras ambientales en nuestro país son trabajos pioneros que han sido enmarcados, en conjunto con el desarrollo de esta tesina, en un proyecto CSIC I + D titulado “Detección de virus entéricos en aguas residuales y tratadas en Uruguay” [CSIC, 2010]. Dentro de éstos estudios, se encuentra un monitoreo cualitativo y cuantitativo de Rotavirus, Astrovirus y Norovirus en aguas residuales de afluentes, efluentes tratados con UV y efluentes sin tratamiento con UV en dos PTAR en las ciudades de Melo y Treinta y Tres. En ambos puntos de colecta, al menos uno de los virus fue detectado en el 57% de las muestras (16/28), Norovirus y Astrovirus en un 39%, mientras que Rotavirus se halló en un 32%. En la mayoría de los casos el tratamiento de las plantas logró reducir o incluso eliminar la carga viral de las distintas muestras [Lizasoaín, 2012]. Más allá del proyecto mencionado, también un trabajo pionero en el área, es aquel en el cual se determinó por primera vez la presencia de Rotavirus del grupo A, Norovirus y Enterovirus en cuatro puntos de colecta sobre el río Uruguay: Fray Bentos, Paysandú, Salto y Bella Unión, observándose una gran circulación de éstos virus, 14 principalmente en Paysandú. Rotavirus se halló en un 48,5% de las muestras, Enterovirus en un 41,6%, Norovirus GII en un 39,4% y Norovirus GI en un 21%. Este estudio indica la alta contaminación de aguas residuales por estos virus, vertidas directamente sobre este río, lo cual indica un riesgo para la población que entra en contacto con este curso de agua [García, 2012]. En otro trabajo realizado en 2012 en nuestro país, se muestrearon aguas de los vertederos de la zona este de la costa de Montevideo, analizándose 30 muestras de agua residual. Se detectó mediante PCR convencional, Norovirus GII en un 30% de las muestras y GI en un 3,3%, y mediante PCR en tiempo real se detectó Norovirus GII en un 33% y GI en un 13,3%. Mostrándose un incremento de un 6,6% en la sensibilidad de la PCR en tiempo real por sobre la convencional [Alberti, 2012]. Por otra parte, se estudió la presencia de tres virus entéricos en aguas recreacionales en 3 microcuencas del área metropolitana, ciudad de Barros Blancos, Canelones. Las aguas testeadas fueron de cañadas, cunetas, tajamares, pozos, haciendo a un total de 16 cuerpos de agua, todos muy relacionados con el baño y recreación de la población. Por PCR convencional, se halló un 50% de las muestras que fueron positivas para Norovirus en los dos primeros muestreos, disminuyendo luego las detecciones. Este estudio de aguas recreacionales fue ampliado con valores obtenidos tras otras detecciones virales, de indicadores bacterianos y de parásitos; entre los demás virus se detectó Rotavirus en un 56% en el primer muestreo, disminuyendo en los restantes; y Picobirnavirus con un máximo de 19% en el tercer muestreo [CEUTA, 2013]. 1.4 Los Rotavirus _____________________________________________________________________ 1.4.1 Generalidades de Rotavirus Rotavirus, virus entéricos transmitidos por vía fecal-oral, es la causa más común de gastroenteritis infecciosa en infantes y niños de corta edad tanto en países desarrollados como en países en desarrollo (Fig. 1.1). La infección normalmente se manifiesta con nausea, malestar, dolor de cabeza, calambres abdominales, diarrea y fiebre; incluso puede ser asintomática. El tiempo de incubación de la enfermedad diarreica provocada por este virus es de menos de 48 horas [Anderson y Weber, 2004, Estes y Kapikian, 2007]. 15 La resistencia a la inactivación, así como también la alta carga viral en heces, pueden contribuir a la transmisión eficiente del Rotavirus humano. Esto se concluye de la estabilidad observada en varios Rotavirus humanos y animales a temperatura ambiente y en bajas dosis. Sin embargo, una alta humedad relativa, de alrededor de 80%, resulta en una rápida pérdida de la infectividad del Rotavirus humano [Estes y Kapikian, 2007]. Los Rotavirus desarrollan un patrón de infección estacional con picos epidémicos en los meses más fríos de cada año. La causa de esto se desconoce, pero la influencia de una humedad relativa baja ha sido sugerida como un factor que favorece la supervivencia de Rotavirus en superficies. Sin embargo, una correlación entre la humedad relativa con el patrón temporal de infección no ha sido observada [Estes y Kapikian, 2007]. Fig. 1.1. Incidencia estimada de muertes por diarrea causada por Rotavirus por 100000 niños menores de 5 años de edad (extraído de Chandran y cols., 2010). 1.4.2 Estructura y genoma Los Rotavirus son virus no envueltos de 70-75 nm de diámetro, caracterizados por poseer un genoma de ARN doble cadena de 11 segmentos, cubierto por tres capas proteicas concéntricas con simetría icosaédrica, que codifican seis proteínas estructurales y seis no estructurales [Greenberg y Estes, 2009]. La apariencia morfológica de las partículas virales de Rotavirus es distintiva, pudiendo visualizarse tres tipos de partículas por microscopía electrónica. Las partículas completas se 16 asemejan a una rueda con rayos cortos y bien definidos y con borde homogéneo, de ahí su nombre (del latín rota: rueda). La partícula infecciosa completa también se denomina TLP, del inglés “triple-layered particle”. Las partículas que carecen de la capa más exterior, DLPs (double-latered particles), se describen como partículas rugosas debido a que muestran subunidades triméricas proyectándose en la periferia de la cápside interna; y las partículas más sencillas, aquellas con sólo la capa más interna, las SLPs (single-layered particles) o “cores” [Charpilienne y cols., 2001, Estes y Kapikian, 2007] (Fig. 1.2). Fig. 1.2. Micrografía electrónica del virus SA11, A: DLPs, B: TLPs. (Barra equivale a 100nm.). (Adaptado de Crawford y cols., 1994) La secuencia nucleotídica de los 11 segmentos de ARN doble hebra de Rotavirus es conocida para varias cepas de Rotavirus. La cepa prototipo SA11 de simio fue el primer genoma completamente secuenciado, con segmentos que van desde 3.302 pb (segmento 1) hasta 667 pb (segmento 11) [Estes y Kapikian, 2007, Ramig y cols., 2005]. Las secuencias de las diferentes cepas de Rotavirus muestran características generales de estructura en cada uno de los segmentos genómicos. (Fig. 1.3; Fig. 1.4). Cada segmento de ARN en la hebra de sentido positivo comienza con dos guanidinas en el extremo 5’ seguidas por un conjunto de secuencias conservadas que forman parte de una secuencia 5’ no codificante (UTR: “untranslated region”, 9-49 nucleótidos (nt)). Sigue un marco abierto de lectura (ORF) codificante para el producto proteico que termina con el codón stop siguiente (en el caso del segmento 11 los ORF son dos), y luego otro fragmento no codificante conteniendo un subconjunto de secuencias 3’ terminales conservadas (3’ UTR, 17-182 nt) y terminando con dos citidinas en el extremo 3’ terminal. La mayoría de los ARNm terminan con la secuencia consenso 5’UGUGACC-3’, que contienen señales importantes para la expresión génica y la replicación genómica, y los últimos cuatro nucleótidos de los ARNm pueden funcionar como potenciadores de la traducción. La longitud de las secuencias 3’ y 5’ no codificantes varían para los diferentes genes, pero las regiones no codificantes de cepas homólogas están altamente conservadas, y ninguna señal de poliadenilación es encontrada en el 3’ de los genes. Todos los genes secuenciados poseen al menos un 17 gran ORF luego de cada primer codón de iniciación, aunque algunos genes tienen ORFs en fase, como en el caso de los genes 7, 9 y 10, o fuera de fase, como el caso del único gen que no es monocistrónico, el gen 11 [Estes y Kapikian, 2007]. Fig. 1.3. Características generales de la estructura de los genes de Rotavirus (Adaptado de Estes y Kapikian, 2007) Fig. 1.4. Los 11 segmentos de ARN doble hebra del virus de simio SA11 se muestran separados por migración en gel de poliacrilamida. Cada segmento genómico numerado codifica para al menos una proteína, proteína viral (VP) o proteína no estructural (Adaptado de Hyser y Estes, 2009). Como ya se anticipó desde el punto de vista morfológico, la cápside consiste en tres capas concéntricas. La capa más externa del virus infeccioso, de geometría icosaédrica con T=13, se compone de la glicoproteína VP7 y de la hemaglutinina VP4, 18 formando púas diméricas. La proteína VP4 es clivada in vitro por la tripsina para dar lugar a VP5 y VP8, que parecen tener un papel importante en la adsorción celular [Anderson y Weber, 2004, Ludert y cols., 1996]. La capa intermedia la componen trímeros de la proteína VP6 organizados en un entramado icosaédrico con un T=13. La capa más interna, con un T=1, está compuesta por 120 moléculas de la proteína VP2 de 102 KDa, la cual tiene un dominio de unión al ácido nucleico se encuentra localizado entre los aminoácidos 1 y 132, y encierra los 11 segmentos de ARN doble cadena. Canales acuosos penetran las capas de VP6 y VP2, permitiendo acceder al interior de la partícula a los cationes divalentes y nucleótidos [McClain y cols., 2010, Prasad y cols., 1988, Zeng y cols., 1994] (Fig. 1.5). Los complejos de la polimerasa viral, que consisten en una ARN polimerasa ARN dependiente (VP1) y guanilil transferasa (VP3), se encuentran asociados a la superficie interna de la capa de VP2, próximos a la mayoría de los doce ejes múltiples [Li y cols., 2009, McClain y cols., 2010, Prasad y cols., 1996]. VP3 además de unirse al ARN formando complejos con la polimerasa VP1, es la encargada de incorporar la caperuza en el extremo 5’ de los ARNm virales [Estes y Kapikian, 2007]. La sincronización del empaquetamiento genómico y la replicación es regulado en parte por las interacciones entre VP1 y el core formado por VP2 [Guglielmi y cols., 2010, McDonald y Patton, 2009]. La polimerasa se une a la secuencia consenso 3’ del ARNm de manera que mantiene el extremo terminal del ARN de polaridad positiva fuera del registro del sitio activo de la enzima, produciendo un complejo estable catalíticamente inactivo [Lu y cols., 2008]. Ha sido hipotetizado que la polimerasa durante su empaquetamiento, unida al ARN y estando autoinhibida, se activa subsecuentemente cuando es unida por VP2 [Guglielmi y cols., 2010, Lu y cols., 2008, McDonald y cols., 2009]. Tras la activación de VP1, la secuencia consenso 3’ funciona como un promotor mínimo, ayudando al inicio de la síntesis del ARN de polaridad negativa dentro del core de la partícula [Tortorici y cols., 2010, Wentz y cols., 1996]. 19 Fig. 1.5. Ubicación de las diferentes proteínas estructurales en la partícula viral de Rotavirus. (Adaptado de Infección por Rotavirus, 2010) La proteína mayor de cápside, VP6, que como ya se mencionó, fue la primera utilizada para la clasificación de Rotavirus, comprende más del 80% de la masa de la partícula y presenta una estructura cristalográfica organizada en dos dominios: el dominio superior con una estructura tipo sándwich β, como en otras proteínas virales de cápside, y un dominio inferior con un arreglo característico de α hélices [Charpilienne y cols., 2002, Estes y cols., 1985]. La presencia de esta proteína en el virus se asocia a la actividad de la polimerasa viral. En el interior del citoplasma de la célula infectada, donde la partícula se encuentra como DLP, la falta de VP6 hace a la partícula viral transcripcionalmente inactiva [Bican y cols., 1982]. Las capa formada por las 780 moléculas de VP6 arregladas en trímeros interacciona con la capa de la proteína VP2 subyacente predominantemente a través de superficies hidrofóbicas, aunque la base de la capa de VP6 muestra un potencial electrostático de superficie global negativo [Charpilienne y cols., 2002, Estes y Kapikian, 2007]. 20 La cápside más externa de Rotavirus se conforma por 260 trímeros de la glicoproteína VP7, de 37 KDa, la proteína externa más abundante que conforma la superficie lisa de la partícula [Ludert y cols., 2002]. Esta glicoproteína une calcio y se ha visto que, “in vitro”, la quelación del mismo resulta en la solubilización de la cápside externa del virión [Cohen y cols., 1979, Dormitzer y cols., 2000]. Recientemente, se halló que VP7, así como también VP4, cuentan con motivos de unión a secuencias, miembros de la familia de las α/β integrinas, que han sido propuestos como mediadores en la adsorción y entrada del virus a la célula hospedadora [Guerrero y cols., 2000, Hewish y cols., 2000]. Es VP7 quien interactúa con la punta de los trímeros de VP6, y se utiliza para la clasificación de estos virus, según su genotipo, en los distintos G-tipos [Estes y Kapikian, 2007]. La cápside más externa del virión también está compuesta por 60 dímeros de la proteína de 88 KDa, VP4. El clivaje proteolítico de VP4 en dos subunidades no asociadas covalentemente, VP8*, de 28 KDa, y VP5* de 60 KDa, potencian de gran manera la infectividad viral [Gilbert y Greenberg, 1998]. Este proceso “in vivo” ocurre en el lumen del intestino, mientras que “in vitro” se lleva a cabo por la tripsina, proteasa específica por el clivaje luego de los residuos de arginina y lisina. VP8*, la porción amino-terminal de VP4, es la subunidad involucrada en la unión a receptores específicos en la superficie de célula, mientras que VP5*, la porción carboxilo-terminal, contiene motivos de secuencia que se creen involucrados en la penetración del virus en la célula hospedera. Se cree que estos procesos de unión hacen a cambios conformacionales. Según esta proteína se clasifica a los Rotavirus en los diferentes Ptipos [Fiore y cols., 1991, Gilbert y Greenberg, 1998, Kalica y cols., 1983, Ruggeri y Greenberg, 1991]. El ARN de Rotavirus, además de codificar las seis proteínas virales (VP) que conforman la cápside viral, codifica seis proteínas no estructurales (NSP), cuyas funciones están menos definidas en cuanto a sus roles en el ciclo replicativo del virus. La proteína NSP1, codificada por el segmento 5, es una proteína básica con un dominio en dedos de zinc en su extremo amino terminal une el ARN, e interactúa y degrada el factor 3 regulador de interferón, IRF-3 [Estes y Kapikian, 2007, Graff y cols., 2002]. La proteína NSP2, como también la NSP5, están asociadas con los intermediarios de replicación “in vivo”, sugiriendo que podrían participar en eventos tempranos de la 21 replicación del ARN viral [Aponte y cols., 1996, Patton y Gallegos, 1988]. NSP2 posee una actividad desestabilizante de hélice y actividad nucleósido trifosfatasa, indicando un posible rol en desenrollar y empacar el ARN viral [Jayaram y cols., 2002, Taraporewala y cols., 1999, Taraporewala y Patton, 2001]. NSP5 es una fosfoproteína O-glicosilada que se autoensambla en dímeros, tiene una actividad de unión al ARN no específica y una actividad autoquinasa [Blackhall y cols., 1997, González y Burrone, 1991, Vende y cols., 2002]. La coexpresión de NSP2 y NSP5 en células no infectadas genera estructuras similares a viroplasma, donde NSP2 regula la hiperfosforilación de NSP5 [Afrikanova y cols., 1998, Fabbretti y cols., 1999]. El rol de NSP6, proteína la cual es codificada por un marco abierto de lectura alternativo del gen 11, en el proceso de replicación permanece sin conocerse, pero ha sido sugerido un rol regulatorio en su asociación con NSP5 [Estes y Kapikian, 2007]. La traducción de los ARNm virales que poseen un Cap pero no están poliadenilados es facilitada por la acción de la proteína no estructural NSP3. Esta proteína funciona de la misma forma que la proteína celular “poly(A) binding protein” (PABP), interactuando el extremo amino terminal con el 3’ de la secuencia consenso del ARNm viral y el extremo C-terminal con eIF4G como lo hace PABP, pero con mayor afinidad. Este evento conduce a NSP3 a desalojar a PABP de eIF4G para el potenciamiento de la traducción de los ARNm de Rotavirus y la concomitante incapacidad de traducción de los ARNm celulares [Vende y cols., 1998]. La proteína NSP4, la única no estructural que no se une al ARN, tiene múltiples dominios y un número de funciones en aumento, entre ellas: un rol clave en el proceso de ensamblaje. NSP4 ha sido estudiada extensivamente por su rol en la morfogénesis viral y porque funciona como una enterotoxina. El dominio C-terminal citoplasmático (aa 161 al 175) funciona en la morfogénesis viral actuando como un receptor intracelular en la membrana del retículo endoplasmático (RE), uniendo las DLPs y ayudando al desnudamiento de estas partículas dentro del lúmen del RE. Este rol de receptor de NSP4 es apoyado por la observación de los DLPs unidos a la membrana del RE conteniendo sólo NSP4. La glicosilación de NSP4 no es requerida para unir a los DLPs o para la oligomerización, pero es requerida para su interacción con la calnexina. NSP4 también tiene un sitio de unión para VP4, y jugaría un rol en remover la envoltura transitoria [Estes y Kapikian, 2007]. En 1996, fue demostrado que NSP4 inducía diarrea dependiendo de la edad en un modelo animal de ratones que imitaban la enfermedad causada por infección por Rotavirus, y esto ha sido confirmado para proteínas NSP4 de varios Rotavirus, del 22 grupo A y de otros. Estos resultados explican cómo NSP4 podría actuar como factor de virulencia [Ball y cols., 1996, Horie y cols., 1999]. 1.4.3 Clasificación Los Rotavirus se encuentran clasificados en el género Rotavirus, dentro de la familia Reoviridae, conjuntamente con los géneros: Orthoreovirus, Orbivirus, Coltivirus, Aquareovirus, Cypovirus, Fijivirus, Phytoreovirus, Oryzavirus, Seadornavirus, Idnoreovirus y Mycoreovirus (Tabla 1) [Mertens y cols., 2005]. TABLA 1. Clasificación de Rotavirus grupo A Familia: Reoviridae Géneros: Aquareovirus Rotavirus Grupos: Infectan: Seadornavirus Rotavirus A Animales y humanos Orbivirus Rotavirus B Animales y humanos Orthoreovirus Rotavirus C Animales y humanos Oryzavirus Rotavirus D Animales Fijivirus Rotavirus E Animales Idnoreovirus Rotavirus F Animales Mycoreovirus Rotavirus G Animales Coltivirus Cypovirus Phytoreovirus Los Rotavirus están clasificados serológicamente por un esquema que presenta la presencia de múltiples grupos (serogrupos) y múltiples serotipos dentro de cada grupo. Un grupo de Rotavirus (o serogrupo) incluye virus que comparten antígenos de reacción cruzada que son detectables por varios métodos serológicos como lo son la Inmunofluorescencia, immunosorbent el assay”), ensayo e IEM inmunoenzimático (inmuno ELISA electromicroscopía). (“enzyme-linked Los Rotavirus comprenden siete diferentes grupos (A-G), donde los grupos A, B y C son encontrados tanto en humanos como en animales, mientras que los Rotavirus de los grupos D, E, F y G hasta ahora sólo han sido encontrados en animales. Los determinantes antigénicos, o antígenos comunes, son encontrados en la mayoría de las proteínas estructurales, y probablemente en varias de las proteínas no estructurales [Estes y Kapikian, 2007]. 23 La primera proteína de Rotavirus usada para su clasificación fue la proteína estructural VP6. VP6 es una proteína altamente inmunogénica en el virión [Ciarlet y Estes, 2002, Svensson y cols., 1987] y los ensayos inmunológicos más sensibles están basados en la detección de esta proteína. Esta proteína posee distintos epítopes que permiten distinguir especificidades de subgrupos (SG) de Rotavirus A: virus SG I, SG II, SG I + II, o SG no-I, no-II Más recientemente, basado en la caracterización molecular, sólo dos grupos (denominados genogrupos) fueron distinguidos dentro de los Rotavirus humanos del grupo A (genogrupo I: SGI; genogrupo II: SG II, SG I + II y SG no-I, no-II) [Ciarlet y Estes, 2002, Estes y Kapikian, 2007]. Los Rotavirus del grupo A están clasificados en serotipos, definidos por la reactividad de los virus en ensayos de neutralización utilizando suero hiperinmune. Con estos ensayos 15 serotipos de VP7, o G-tipos (por glicoproteína) han sido identificados, pudiendo abarcar cada uno cepas de origen animal y humano. Los ensayos de neutralización pueden medir la reactividad de un anticuerpo contra los dos antígenos neutralizantes de la cápside externa (VP7 y VP4). Sin embargo, en la mayoría de los casos, la actividad detectada predominante es con la glicoproteína VP7, ya que la misma abarca un mayor porcentaje de la cápside externa del virión; o, alternativamente, con hiperinmunización, VP7 induce selectivamente anticuerpos altamente específicos [Estes y Kapikian, 2007]. En algunos casos, una cepa de Rotavirus no reacciona claramente en ensayos de neutralización recíprocos con antisuero hiperinmune, lo cual usualmente se debe a que los dos virus comparados poseen distintas formas inmunogénicas de la proteína VP4, la cual también es un antígeno neutralizante, que induce una respuesta humoral [Estes y Kapikian, 2007]. Los Rotavirus son clasificados en un sistema binario, similar al usado con virus influenza, en el cual distintos serotipos de VP4 y VP7 son reconocidos. Sin embargo, la falta de un suero de tipificación fácilmente disponible o de anticuerpos monoclonales para diferentes tipos de VP4 ha obstaculizado la clasificación de los serotipos de VP4 o P-tipos (por proteína sensible a proteasa). Es por esto que las propiedades de VP4 han sido estudiadas principalmente por análisis de secuencia, detectándose genotipos diferentes de VP4. Para VP7, ha sido establecida una correlación entre genotipo y serotipo [Estes y Kapikian, 2007]. 24 1.4.4 Epidemiología molecular Hasta el momento se han reportado a partir de estudios genómicos al menos 27 G- tipos y 35 P-tipos en especies de mamíferos y aves [Matthijnssens y cols., 2011, Santos y Hoshino, 2005, World Health Organization, 2012], de los cuales 12 G-tipos y 15 P-tipos han sido encontrados infectando humanos. Alrededor de un 90% de las cepas humanas de Rotavirus incluyen las combinaciones: P[8]G1, P[4]G2, P[8]G3, P[8]G4 y P[8]G9, de las cuales la cepa con la combinación P[8]G1 representa la combinación más comúnmente encontrada [Santos y Hoshino, 2005]. Castello y colaboradores en 2004 publicaron una revisión de 9 años a la fecha de las cepas de Rotavirus circulantes en América Latina. Para esto se tomaron en cuenta 15 estudios de 5 países, juntando un total de 1989 muestras. Del total de las muestras, 12% eran de infecciones múltiples con más de una cepa, y 20 % no fueron totalmente tipificables. Del resto de las muestras, 1354, que fueron totalmente tipificadas, 83% mostraron 4 cepas comunes: P[8]G1 (40%), P[4]G2 (30%), P[8]G3 (6%), P[8]G4 (7%). Las cepas inusuales, como las G5, eran comunes en la región; las cepas G9 emergentes se distribuían ampliamente; varios reordenantes entre cepas humanas y animales también fueron halladas; y algunos serotipos comunes, como G3 y G4, fueron de origen animal. También se halló un serotipo inusual, G12, en muestras argentinas detectadas en el último tiempo del estudio [Castello y cols., 2004]. En 2011, Linhares y colaboradores realizaron una revisión sistemática y un análisis de toda la evidencia disponible reportada entre 1990 y 2009 sobre el peso de la enfermedad por Rotavirus y la circulación de cepas en Latinoamérica y El Caribe. En este trabajo se encontró que el G-tipo detectado más comúnmente fue G1 (34,2%), seguido de G9 (14,6%) y G2 (14,4%); mientras que los P-tipos más prevalentes detectados fueron: P[8] (56,2%), P[4] (22,1%) y P[1] (5,4%). Las asociaciones P-G tipo más comunes fueron: P[8]G1 (17,9%), P[4]G2 (9,1%) y P[8]G9 (8,8%) [Linhares y cols., 2011]. Contrario a los datos reportados tras este trabajo, en Norteamérica y Europa los serotipos G1-G4 ocurren en más del 95% de las infecciones por Rotavirus, con sólo las cepas G1 representando un 70% [Sanchez Padilla y cols., 2009]. Estas diferencias son esperadas debido a la diversidad de tipos antigénicos y a la combinación de cepas de Rotavirus que parecen darse más en los países en desarrollo [Estes y Kapikian, 2007]. 25 Los P-tipos P[8] y P[4], como se indicó, son los predominantes en Latinoamérica y El Caribe, pero los porcentajes son mayores en Europa y Norteamérica y menores en África [Santos y Hoshino, 2005, Steele y cols., 2003]. G9 combinado con P[8] o P[6] es el segundo G-tipo más frecuente, y su circulación global se refleja en que la cantidad de países que reportan estas cepas ha aumentado notablemente en los últimos 10 años [Gentsch y cols., 2005, Iturriza Gomara y cols., 2001, Santos y Hoshino, 2005, Steele y cols., 2003]. En la región, una alta prevalencia de cepas G9 ha sido detectada en Brasil desde 1998, y en Argentina y Paraguay desde 1999 [Bok y cols., 2001, Coluchi y cols., 2002, Leite y cols., 2008, O’Ryan y cols., 2001]. Otros estudios recientes también han reportado la presencia del genotipo G5 en Brasil [Alfieri y cols., 1996, Leite y cols., 1996], Argentina [Bok y cols., 2001] y Paraguay [Coluchi y cols., 2002]. En nuestro país, un estudio mostró el resultado del procesamiento de 23 muestras positivas para Rotavirus provenientes del hospital CASMU de Montevideo del año 2006, donde se encontraron los genotipos G2 y en G9 en un 30% y 70%, respectivamente. Sin detectarse otros genotipos más comunes como G1, G3 y G4, este trabajo se destaca por ser la primera ocasión en la que se detecta al genotipo G9 en el país, además de ser el más prevalente del mismo [Alberti, 2008]. Según la OMS (Organización Mundial de la Salud), son dos las vacunas recomendadas contra Rotavirus humano. Una de ellas, Rotarix®, es una vacuna atenuada de RVA humano, monovalente, diseñada a partir de una cepa humana G1P[8], el genotipo más prevalente a nivel mundial. De hecho se ha visto que niños infectados con una cepa de este genotipo desarrollan amplias respuestas de neutralización con reactividad cruzada con los otros genotipos mayormente detectados en humanos en todo el mundo: G3P[8], G4[8], G9P[8] y G2P[4]. Y la otra vacuna, RotaTeq®, es una vacuna pentavalente, diseñada a partir de cepas reordenantes bovinas-humanas, todas las cuales derivan de una cepa parental bovina con un único gen de VP4 o VP7 de origen humano. Esta última vacuna fue formulada para contener los genotipos: G1, G2, G3, G4 y P[8] [Angel y cols., 2007]. 26 2. Objetivos 2.1 Objetivos generales _____________________________________________________________________ Evaluar la presencia de Rotavirus en aguas residuales tratadas así como en el afluente de dos plantas de saneamiento de O.S.E., de forma de contribuir a determinar la diseminación ambiental de este virus. 2.2 Objetivos específicos _____________________________________________________________________ Monitoreo de Rotavirus en un sistema de lagunas de la localidad de Ecilda Paullier y una planta de tratamiento terciario de aguas residuales con radiación UV en la ciudad de Canelones, de manera bimensual durante un año. Concentración de las partículas virales a partir de muestras ambientales. Detección y cuantificación del genoma viral. Caracterización molecular y análisis filogenético de los genomas de Rotavirus detectados. 27 3. Materiales y métodos 3.1 Muestreo _____________________________________________________________________ Se realizaron 7 muestreos bimensuales en dos diferentes sistemas de tratamiento de aguas residuales: una planta de tratamiento de aguas residuales (PTAR), ubicada en la ciudad de Canelones, y un sistema de lagunas (SL), ubicado en la localidad de Ecilda Paullier (Fig. 3.1). La PTAR de Canelones es una planta de tratamiento terciario donde se emplea un tratamiento con radiación UV, con un caudal 4.293 m³/d, cubriendo una población de 19.700 habitantes. Por su parte, el SL de Ecilda Paullier consta de tres lagunas de diferente composición, donde el agua del afluente pasa primeramente a una laguna anaerobia, luego a una laguna facultativa, y por último a una laguna de maduración, de menor profundidad. En ésta última planta, el caudal es de 188 m³/d, y cubre una población de 2.600 habitantes. Fig. 3.1. Ubicación geográfica de los sistemas de tratamiento de aguas residuales estudiados en el presente trabajo. 28 3.2 Concentración de las partículas virales _____________________________________________________________________ El procedimiento aplicado en la concentración de partículas virales presentes en aguas se basó en las técnicas descritas por Pina y colaboradores 1998 y modificado por Bofill y colaboradores (2000) [Bofill Mas y Girones, 2000, Pina y cols., 1998], y se detalla a continuación. Se centrifugan 42 ml de la muestra una hora a 40.000 rpm, a 4 oC (ultracentrífuga Beckman, rotor 60Ti). Se descarta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con 4 ml de glicina 0.25 N, pH 9.5, colocando la resuspensión en tubo Nalgene OAK Ridge. Se incuba con hielo 30 minutos, agitando cada 5 minutos. Se agregan 4 ml de PBS 2X frío y 100 µl de fago PP7 como control interno, y se centrifuga 20 minutos a 12.000 rpm. Se recupera el sobrenadante, se coloca en tubo de ultrcentrífuga, y se centrifuga una hora a 110.000 xg, a 4 oC (ultracentrífuga Beckman, rotor 60Ti). Se descarta el sobrenadante y se resuspende el sedimento en 300 µl de PBS 1X, el guarda a -80 oC. 3.3 Extracción de ARN genómico _____________________________________________________________________ Para esta etapa se empleó el sistema comercial de extracción de ARN viral (Qiagen, QIAamp Viral RNA Mini Kit), siguiendo las indicaciones del proveedor. Primeramente se tomó un volumen de 560 µl de buffer AVL conteniendo 5.6 µl de carrier de ARN, el cual se adicona con el fin de aumentar la unión del ácido nucleico viral a la membrana del kit y reducir las posibilidades de degradación del ARN viral. Se agregan 140 µl de la concentración de partículas virales obtenidas en el paso anterior, se agita por 15 segundos y se incuba a temperatura ambiente (15-25 oC) durante 10 minutos. Se agregan 560 µl de etanol (96-100%) y se agita por 15 segundos. Esta solución se agregan a una columna Mini QIAmp y se centrifuga 1 minuto a 8.000 rpm, descartando el filtrado. Se agregan 500 µl del buffer AW1 y se centrifuga 1 minuto a 8.000 rpm, descartándose el tubo conteniendo el filtrado. Luego se agrega el buffer AW2, 500 µl, y se centrifuga 3 minutos a velocidad máxima (13.400 rpm). Por último, se coloca la columna en un tubo nuevo de 1.5 ml, descartando el anterior tubo colector. Se agregan 60 µl del buffer AVE, se incuba a temperatura ambiente por 1 minuto y se centrifuga 1 minuto a 8.000 rpm, conservándose el filtrado, el cual se almacena a -80 o C. 29 3.4 Detección del genoma viral _____________________________________________________________________ La etapa de detección del genoma viral se realizó mediante técnicas de biología molecular, más precisamente una retrotranscripción (RT) seguido de una PCR, específica contra una región conservada del genoma. Para la RT se empleará oligonucleótidos hexaméricos randómicos los cuales son utilizados para obtener un ADN copia de todo el ARN que haya en la mezcla. En el siguiente paso de PCR se amplificará parte del gen de la proteína de la cápside intermedia de Rotavirus: VP6, mediante la utilización de primers específicos [Tabla 2] y siguiendo los protocolos descritos por Logan y colaboradores (2002) para detectar un fragmento de 140 pb [Logan y cols., 2002]. Los productos se analizarán por electroforesis en gel de agarosa 1,5%. En la etapa de RT se toman 8 µl de la suspensión obtenida en el paso de extracción y se desnaturaliza el ARN doble hebra a 65 oC durante 5 minutos con 0.8 µl de oligonucleótidos hexaméricos (300 ng/µl), 1µl de dNTPs (10 mM) y 0.2 µl de agua desionizada estéril. Se mantiene en hielo durante 3 minutos para que los oligonucleótidos se hibriden con el ARN doble hebra. Se agregan 10 µl de una mezcla conteniendo 4 µl de buffer 5X First Strand Tris-HCl (250mM, pH 8,3, Invitrogen Inc.), 2 µl de DTT (0,1 M), 0.5 µl de RNAsa OUT (10U/µl, Invitrogen Inc.), 1 µl de la enzima Superscript II (200U/µl, Invitrogen Inc.) y 2.5 µl de agua desionizada estéril. Se realiza un ciclado de 10 minutos a 25 oC, 50 minutos a 42 oC, y 10 minutos a 70 oC. Para la PCR se toman 2.5 µl del ADNc obtenido en la RT y se mezclan con 22.5 µl de una mezcla conteniendo 0.25 µl de la polimerasa Taq Pol (5 U/µl, Fermentas) con 2.5 µl de buffer 10X Tris-HCl con KCl (100 mM, pH 8,8), 1 µl de MgCl2 (25 mM), 0.5 µl de dNTPs (10 mM), 0.5 µl cebadores específicos (10 µM) y 16.25 µl de agua desionizada estéril. Se mantiene 3 minutos a 94 oC para inactivación, y se dan 40 ciclos de los cuales cada uno comprende: desnaturalización durante 30 segundos a 94 oC, hibridación por 45 segundos a 50 oC y polimerización durante 45 segundos a 72 oC; finalmente, un ciclo de 7 minutos a 72 oC. 30 TABLA 2. Oligonucleótidos para la detección de VP6 Gen target Cebadores Rotavirus A RotaA-fwd1 (VP6) RotaA-fwd2 RotaA.rev1 RotaA.rev2 Secuencia (5’-3’) Posición GGATGTCCTGTACTCCTTGTCAAAA GGAGGTTCTGTACTCATTGTCAAAAA TCCAGTTTGGAACTCATTTCCA TCCAGTTTGAAAGTCATTTCCATT 26-50 26-51 170-149 170-147 Para el caso del fago control, PP7, la amplificación se lleva a cabo de la misma manera que para el caso de la proteína VP6 de Rotavirus, pero los primers específicos son 247f (5’ GTTATGAACCAATGTGGCCGTTAT 3’) y 320r (5’ CGGGATGCCTCTGAAAAAAG 3’) para detectar un fragmento de 74 pb [Rajal y cols., 2007]. El material genético se visualizó en geles de agarosa al 2%, utilizándose 1 µl de GoodView® cada 20 ml de gel. 3.5 Genotipificación del genoma viral _____________________________________________________________________ La determinación de los G y P-tipos presentes en las muestras se realizó mediante una PCR anidada, en la que se amplifica directamente un fragmento conservado de los genes que codifican para cada las proteínas VP7 y VP4. En esta PCR semianidada se parte de un fragmento obtenido en una primera ronda de amplificación y se utilizan cebadores diseñados contra secuencias internas conservadas de cada gen. El procedimiento para la RT es el mismo que se describió para el paso de detección del genoma viral (3.4). En el siguiente paso de PCR se amplificará un fragmento de los genes de la proteína de la cápside externa de Rotavirus: VP7 y VP4, mediante la utilización de primers específicos [Tablas 2 y 3] y siguiendo los protocolos descritos por Gómara y colaboradores (2001) y Simmonds y colaboradores (2008), respectivamente. Los productos se analizarán por electroforesis en gel de agarosa 1,5% [Gómara y cols., 2001, Simmonds y cols., 2008]. 31 TABLA 2. Oligonucleótidos para genotipificación de VP7 [Das y cols., 1994, Gouvea y cols., 1990, Gouvea, 1993]. OLIGONUCLEÓTIDO SECUENCIA RA4 (End9) 5’ GGT CAC ATC ATA CAA TTC TAA TCT AAG 3’ RA1 (Beg9) 5’ GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG G 3’ RA2 5’ GGA CCA AGA GAA AAC GTA GC 3’ POSICIÓN FRAGMENTO 1062-1036 1-28 1062 pb 805-824 257 pb Fig. 3.2. Oligonucleótidos para la amplificación de VP7 por la técnica de PCR anidada. Para la amplificación de la región conservada del gen de VP7, de 257 pb, se realiza una primera ronda de amplificación, donde se parte de 6 µl de la RT, los cuales se mezclan con 19 µl que contienen: 0.25 µl de la polimerasa Taq Pol (5 U/µl, SBS) con 2.5 µl de su buffer 10X Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 (con 500 mM KCl y 20 mM MgCl2), 1.5 µl de MgCl2 (25mM), 1 µl de dNTPs (10 mM) y 0.5 µl de cada uno de los cebadores específicos, Beg-9 y End-9 (10 µM) (Tabla 2, fig. 3.2), y 12.75 µl de agua desionizada estéril. El ciclado de la primera ronda de amplificación es de 3 minutos a 94 oC, 30 ciclos de un minuto a 94 oC, un minuto a 46 oC y 2 minutos a 72 oC; y 7 minutos a 72 oC. Luego, se toman 2 µl de la primera ronda de amplificación y se mezclan con 48 µl de una mezcla conteniendo 0.5 µl de Taq Pol (5 U/µl, SBS) con 5 µl de su buffer 10X Tris-HCl con 500 mM KCl y 20 mM MgCl2 (100 mM, pH 8,0), 2 µl de dNTPs (10 mM), 2 µl de cada cebador: RA2 (10 µM) y End-9 (10 µM) (Tabla 2, fig. 3.2), y 36.5 µl de agua desionizada estéril. El ciclado para esta segunda ronda, tras 3 minutos a 94 oC, será de 30 ciclos de un minuto a 94 oC, 2 minutos a 42 oC, y un minuto a 72 oC; y un ciclo de 7 minutos a 72 oC. Para el caso de la amplificación de la secuencia conservada interna del gen que codifica para VP4, el protocolo es el mismo que para la amplificación de la región 32 conservada de VP7, siendo los cebadores específicos Con2dg, Con3dg, y Con1dg, Con2dg, para la primera y segunda ronda respectivamente (Tabla 3, fig. 3.3). TABLA 3. Oligonucleótidos para genotipificación de VP4 [Abbaszadegan y cols., 1999, Castello y cols., 2006, Gentsch y cols., 1992]. OLIGONUCLEÓTIDO SECUENCIA Con2dg 5’ ATT YCN GRC CAY TTA TAH CC 3’ Con3dg 5’ TGS YKW SBY TMA TTT ATA GAC A 3’ Con1dg 5’ YTR CCA CCM ATK CAR AAT AC 3’ POSICIÓN FRAGMENTO 868-887 11-32 876 pb 686-705 201 pb Fig. 3.3. Oligonucleótidos para la amplificación de VP4 por la técnica de PCR anidada. Posteriormente, los productos de PCR obtenidos tras amplificación de fragmentos conservados de VP7 y VP4 son purificados con un Kit comercial (General Electric, Macherey Nagel). Los productos purificados se envían a procesar al servicio de secuenciación del Instituto Pasteur Montevideo (IPMON), para finalmente proceder con el análisis filogenético, donde se procesan las secuencias con el programa BioEdit 7.09 y se analizan con el programa MEGA 5. El árbol filogenético fue construido usando el método de Neighbor – Joining y el cálculo de distancia mediante el algoritmo de Tamura – Nei. El soporte estadístico se realizó mediante 1000 réplicas de Bootstrap, y se utilizaron secuencias de diferentes genotipos de Rotavirus de la base de datos del GenBank. 33 3.6 Detección y cuantificación del genoma viral _____________________________________________________________________ Todas las muestras de agua residual, previamente analizadas en la etapa de detección del genoma viral de Rotavirus por PCR convencional, fueron cuantificadas ® por la técnica de PCR en tiempo real con tecnología TaqMan , amplificándose un segmento de 86 pb del gen que codifica la proteína no estructural NSP3 [Zeng y cols., 2008]. Para calcular la cantidad relativa de copias genómicas de Rotavirus presentes en las muestras de aguas residuales, se realizó una curva estándar empleando como matriz ADN plasmídico de cantidad conocida (8 diluciones seriadas a partir de un stock de 3 x 1010 copias/µl) con un inserto del gen NSP3 de Rotavirus. La cantidad del ADNc en la muestra es interpolada en la curva estándar que es corrida simultáneamente. Los estándares, así como cada una de las muestras, se realizaron en duplicado. En la sonda, “the minor groove binder” (MGB) fue utilizado para mejorar la especificidad y sensibilidad de una sonda convencional Taqman. El “colorante” indicador fluorescente en el extremo 5’ de la sonda es la 6-carboxi-fluoresceína (FAM) y en el extremo 3’ se encuentra un quencher no fluorescente conjugado al MGB [Zeng y cols., 2008]. En esta etapa de PCR cuantitativa fue utilizado el kit “SensiMixTMII Probe Kit” (BIOLINE®). Se parte de 2 µl de ADNc de cada muestra, obtenido como se detalla en 3.4, y se mezcla con un mix que contiene: 12.5 µl del SensiMixTMII Probe 2x, 0.5 µl de Rox 1/10 ((5-carboxy-X-rodamina, succinimidil éster, 2.5 µM), 1 µl de la sonda NSP3 (Applicel, 5 µM) 1 µl de cada cebador, NSP3-For y NSP3-Rev (10 µM), y se lleva a 23 µl con agua desionizada estéril. El ciclado es el siguiente: 10 minutos a 95 oC para la desnaturalización, y 40 ciclos de 15 segundos a 95 oC y 1 minuto a 60 oC, para la hibridación y la extensión [Zeng y cols., 2008]. 34 4. Resultados 4.1 Detección del genoma viral _____________________________________________________________________ Se procesaron 7 muestreos bimensuales, desde Setiembre de 2011 hasta Octubre de 2012, realizados en la ciudad de Canelones y Ecilda Paullier. Las muestras pertenecen a tres puntos de la PTAR de Canelones: afluente sin tratamiento, efluente previo al tratamiento con UV y efluente posterior al tratamiento con UV; y a tres puntos del SL de Ecilda Paullier: afluente sin tratamiento, laguna facultativa y laguna de maduración (Fig. 3.1). Posterior a la concentración de partículas virales de cada una de las muestras de agua residual, se procede a la detección del genoma viral y del fago control mediante la técnica de RT-PCR y el posterior análisis de los productos de amplificación en geles de agarosa al 2% (Fig. 4.1). PM 1 2 3 4 5 6 7 8 PM 1 PP7 74 pb 300 pb 200 pb 100 pb A 2 3 4 5 6 7 RV VP6 140 pb 300 pb 200 pb 100 pb B FIG. 4.1. Resultado de la PCR para detección del genoma viral. A: resultado de la PCR para la detección del fago control PP7 (PM: marcador de peso molecular de 100pb GeneRulerTM Thermo Scientific, 1-6: muestras de agua residual, 7: extracción de fago, 8: control negativo). B: resultado de la PCR para la detección de VP6 (PM: marcador de peso molecular de 100pb GeneRulerTM Thermo Scientific, 1-6: muestras de agua residual, 7: control negativo) (Fig. 4.1 A). El fago PP7 inoculado en cada una de las muestras en la etapa de ultracentrifugación fue detectado en la totalidad de las muestras, validando así todo el proceso de concentración para aguas residuales. Tras la PCR para la detección de un fragmento conservado de la región codificante para la proteína VP6 en cada una de las muestras durante los 7 muestreos, de un total de 41 muestras, 15 resultaron positivas (36,6%). En los muestreos de Setiembre 2011 y Noviembre 2011 las detecciones totales fueron 3 en cada mes, en el muestreo de Febrero 2012 fueron 4, en Abril 2012 no hubo ninguna muestra positiva, en los muestreos de Junio y Agosto 2012 fueron 2 en cada mes y en Octubre 2012 sólo una (Tabla 4; Fig. 4.2 A). En el caso de las muestras del SL de Ecilda Paullier, el número de detecciones fue el mismo en las muestras de afluentes y de ambas lagunas; en 35 cambio, en el caso de la PTAR de Canelones, las detecciones fueron mayoritarias en muestras de afluentes y anteriores al tratamiento con UV, siendo las detecciones en muestras tratadas con UV nulas (Fig. 4.2 B). TABLA 4. Resultados de las detecciones virales. Muestras Setiembre 2011 Noviembre 2011 Febrero 2012 Ecilda Paullier/Afluente + + - - - + - Ecilda Paullier/Laguna Facultativa Ecilda Paullier/Laguna Maduración Canelones/Afluente - - + - + + - - + + - + - - + No se recibió + - - - + + + + - - - - - - - - - - - Canelones/Efluente antes de UV Canelones/Efluente después de UV Abril 2012 Junio 2012 Agosto 2012 Octubre 2012 Detección total de Rotavirus por RT-PCR en los 7 muestreos 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Setiembre 2011 A Noviembre 2011 Febrero 2012 Abril 2012 Detección de Rotavirus por RT-PCR / Ecilda Paullier Agosto 2012 Octubre 2012 Detección de Rotavirus por RT-PCR / Canelones 4 4 3 2 1 0 3 2 1 0 B Junio 2012 Ecilda Paullier / Ecilda Paullier / Ecilda Paullier / Afluente Laguna Laguna de Facultativa Maduración C Canelones / Canelones / Canelones / Afluente Efluente antes Efluente de UV después de UV FIG. 4.2. Detección del genoma viral de Rotavirus mediante PCR en las plantas de tratamiento de aguas residuales. A: resultados de las detecciones por muestreo; B: resultados de las detecciones por punto de muestreo en el SL; C: resultados de las detecciones por punto de muestreo en la PTAR. 36 4.2 Genotipificación del genoma viral _____________________________________________________________________ Se procedió a la amplificación directa de un fragmento conservado de los genes que codifican para las proteínas VP7 y VP4, para luego determinar los G y P-tipos mediante un análisis filogenético. En esta etapa se parte del fragmento obtenido en la primera ronda de amplificación y se utilizan primers específicos contra secuencias internas conservadas de cada gen (Tablas 2 y 3; Fig. 3.2 y 3.3). Para la amplificación del fragmento conservado de la región codificante para VP7, se partió del producto obtenido en una primera ronda de amplificación (1062 pb) con los oligonucleótidos Beg-9 (RA1) y End-9 (RA4), y se amplificó un fragmento menor en una segunda ronda de amplificación, de 257 pb, empleando los oligonucleótidos RA2 y End-9. Los productos obtenidos se analizaron en un gel de agarosa al 1,5% (Fig. 4.3 A). De un total de 41 muestras, 8 resultaron positivas para el gen de VP7 (19,5%), de las cuales la mayoría fueron muestras de laguna facultativa del SL de Ecilda Paullier y muestras de afluentes de la PTAR de Canelones (Tabla 5). Para la amplificación de la región conservada de VP4, tras la amplificación de un fragmento de 876 pb con los cebadores Con2dg y Con3dg en una primera ronda, se realizó una segunda ronda de amplificación con los cebadores Con1dg y Con2dg. Los fragmentos de 201 pb obtenidos se analizaron por corrida electroforética en un gel de agarosa al 1,5%. En esta instancia fueron 15 muestras las positivas para la detección de VP4 (36,6%), siendo la mayoría muestras del punto de laguna facultativa del SL de Ecilda Paullier. PM 300 pb 200 pb 100 pb A 1 2 3 4 5 6 7 RV VP7 257 pb RV VP4 201 pb PM 1 2 3 4 5 6 7 400 pb 300 pb 200 pb B FIG. 4.3. Detección de los genes VP7 (A) y VP4 (B) de Rotavirus mediante PCR anidada. Geles de agarosa al 1,5%, material genético visualizado con GoodView® . PM: marcador de peso molecular de 100pb GeneRulerTM Thermo Scientific; 1-6: muestras; 7: control negativo. 37 TABLA 5. Resultados de las detecciones de los conservados de VP7 y VP4. SL Ecilda Paullier Muestreos Afluente Laguna Laguna de facultativa maduración Set/11 Nov/11 Feb/12 Abr/12 Jun/12 Ago/12 Oct/12 VP4 VP7 VP4 VP4 VP4 VP7/VP4 VP7/VP4 VP7/VP4 VP7 PTAR Canelones Afluente Efluente Efluente antes de después de UV UV VP4 VP4 VP7 VP4 VP4 VP4 VP7/VP4 VP4 VP7 VP4 4.3 Secuenciación y análisis filogenético _____________________________________________________________________ Los productos de PCR obtenidos en la instancia de amplificación de los fragmentos conservados, tanto para el caso de VP7 como de VP4, fueron purificados a partir de la banda en el gel y enviados a secuenciar al servicio de secuenciación del IPMON. De los 8 productos que se purificaron para el caso de VP7, fueron 6 las secuencias finalmente obtenidas para el posterior análisis filogenético por tratarse de secuencias adecuadas para dicho análisis, representando un 14,6% del total de las muestras. De las dos restantes, una poseía mucho ruido, haciendo imposible la lectura de la secuencia, y otra no se pudo purificar. (Fig. 4.4 A). Para el caso de VP4, de las 15 muestras que habían resultado positivas, 8 fueron las utilizadas para el análisis filogenético de esta proteína, representando un 19,5% de la totalidad de las muestras (Fig. 4.4 B). 38 PM 1 2 3 4 5 6 7 8 RV VP7 257 pb 300 pb 200 pb 100 pb A PM 1 2 3 300 pb 200 pb 100 pb 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 RV VP4 201 pb B FIG. 4.4. Resultado de la purificación de las muestras positivas para VP7 y VP4. Geles de agarosa al 1,5%, material genético visualizado con GoodView® . A: gel sembrado con las muestras tras purificación de los productos de PCR anidada para VP7 (PM: marcador de peso molecular de 100pb GeneRulerTM Thermo Scientific; 1-8: muestras). B: gel sembrado con las muestras tras purificación de los productos de PCR anidada para VP4 (PM: marcador de peso molecular de 100pb GeneRulerTM Thermo Scientific; 1-15: muestras). Las 20 secuencias obtenidas fueron utilizadas en un análisis filogenético posterior. Para llevar a cabo el mismo las secuencias fueron procesadas con el programa BioEdit 7.09 y luego analizadas con el programa MEGA5. El árbol filogenético fue construido usando el método de Neighbor – Joining y el cálculo de distancia mediante el algoritmo de Tamura – Nei. El soporte estadístico se realizó mediante 1000 réplicas de Bootstrap, y se utilizaron secuencias de diferentes genotipos de Rotavirus de la base de datos del GenBank. Tras obtenerse el árbol filogenético basado en parte de la secuencia codificante para la proteína VP7, se detectaron genotipos comúnmente detectados a partir de muestras clínicas, como G1 y G9, así como también genotipos que, a pesar de que mayormente circulan en animales, agruparon con genotipos humanos, G3 y G10, los cuales no habían sido detectados previamente en nuestro laboratorio a partir de muestras clínicas. En particular, la secuencia G10 obtenida agrupa con una cepa inusual G10P[9] (Fig. 4.5). 39 FIG. 4.5. Análisis filogenético de las secuencias de VP7. El árbol fue construido usando el método de Neighbor – Joining y el cálculo de distancia mediante el algoritmo de Tamura – Nei. El soporte estadístico se realizó mediante 1000 réplicas de Bootstrap. Se utilizaron secuencias de diferentes genotipos de Rotavirus de la base de datos del GenBank; se indican las secuencias de este trabajo con un rombo. 40 Por otra parte, al realizar el árbol filogenético con parte de la secuencia codificante para la proteína VP4, los P-tipos obtenidos fueron P4 y P8, lo más ampliamente distribuidos a nivel mundial, así como también genotipos P9 y P11. Las secuencias P11 fueron de origen bovino, las mismas agrupan en un cluster enteramente de secuencias bovinas. Las secuencias P9 agruparon con la misma cepa G10P[9] inusual, con la que agrupa la secuencia G10 de este trabajo. (Fig. 4.6). FIG. 4.6. Análisis filogenético de las secuencias de VP4. El árbol fue construido usando el método de Neighbor – Joining y el cálculo de distancia mediante el algoritmo de Tamura – Nei. El soporte estadístico se realizó mediante 1000 réplicas de Bootstrap, Se utilizaron secuencias de diferentes genotipos de Rotavirus de la base de datos del GenBank; se indican las secuencias de este trabajo con un rombo. 41 4.4 Detección y cuantificación del genoma viral _____________________________________________________________________ A modo de obtener una mayor información acerca de la carga viral se procedió a la detección del genoma viral por PCR en tiempo real (Real Time - PCR) con tecnología TaqMan®. Para obtener la cantidad relativa de ARN de Rotavirus de las muestras de aguas residuales, ADN plasmídico de cantidad conocida, de 107 a 100 copias/µl, conteniendo un fragmento del gen NSP3 de Rotavirus, es usado como estándar externo para generar una curva estándar o de calibración. La cantidad del ADNc blanco en la muestra es interpolada en la curva estándar que es corrida simultáneamente. Los estándares, así como cada una de las muestras, se realizan en duplicado (Fig. 4.7). A 40 y = -3,5426x + 43,103 R² = 0,9885 35 30 Ct 25 20 15 10 5 0 0 B 1 2 3 4 5 6 7 8 Copias genómicas/µL FIG. 4.7. Estandarización de la curva de amplificación por PCR cuantitativa del genoma viral. A: amplificación de las diluciones seriadas, por duplicado, de ADN plasmídico con un inserto del gen NSP3 de rotavirus (10E6-10E1 copias genómicas/µl). B: curva de calibración obtenida al graficar la cantidad de copias genómicas/µl promedio de los estándares en función de los valores de Ct. Se muestra la ecuación de la recta y el valor de R 2. 42 La cantidad del ADNc blanco en la muestra es interpolada en la curva estándar que se corrida de manera simultánea, obteniéndose de esta forma la carga viral, en copias genómicas/ml., de cada una de las muestras de los 7 muestreos (Tabla 6). En el 100% de las muestras de afluentes de la PTAR Canelones se detectó la presencia del genoma de Rotavirus; en cambio, para las muestras de afluentes del SL de Ecilda Paullier sólo se lo detectó en un 71,4%. La mayoría de las muestras de la PTAR mostraron una carga viral nula, o en su defecto una reducción en la misma, tras el tratamiento con radiación UV. Un efecto similar se observó en las muestras del SL, donde se detectó una carga viral reducida o nula en las muestras de laguna de maduración (Fig. 4.8 A y B). TABLA 6. Resultados de la cuantificación por PCR en tiempo real de las muestras de ambos sistemas de tratamiento de aguas residuales en 7 muestreos bimensuales. FECHA Setiembre 2011 Noviembre 2011 Febrero 2012 Abril 2012 Junio 2012 Agosto 2012 Octubre 2012 MUESTRA ROTAVIRUS [copias/mL] EP Afluente EP Laguna Facultativa EP Laguna Maduración CAN Afluente CAN Efluente antes UV CAN Efluente después UV EP Afluente EP Laguna Facultativa EP Laguna Maduración CAN Afluente CAN Efluente antes UV CAN Efluente después UV EP Afluente EP Laguna Facultativa EP Laguna Maduración CAN Afluente CAN Efluente antes UV CAN Efluente después UV EP Afluente EP Laguna Facultativa EP Laguna Maduración CAN Afluente CAN Efluente antes UV 6,95E+03 3,97E+04 1,95E+03 1,71E+03 1,23E+04 1,14E+04 NR 1,41E+03 7,18E+03 2,05E+03 2,22E+03 1,60E+03 7,67E+03 1,22E+03 1,87E+03 CAN Efluente después UV EP Afluente EP Laguna Facultativa EP Laguna Maduración Can Afluente CAN Efluente antes UV CAN Efluente después UV EP Afluente EP Laguna Facultativa EP Laguna Maduración 1,25E+03 2,1E+04 1,28E+03 3,59E+03 3,86E+03 Can Afluente CAN Efluente antes UV CAN Efluente después UV EP Afluente EP Laguna Facultativa EP Laguna Maduración Can Afluente CAN Efluente antes UV CAN Efluente después UV 3,97E+04 1,70E+04 3,24E+04 2,94E+04 6,50E+04 2,67E+04 1,27E+04 43 RV SL Ecilda Paulier 8 7 6 Log número 5 de copias genómicas/ 4 mL 3 2 1 0 Afluente Laguna Facultativa Laguna de Maduración A RV PTAR Canelones 8 7 Log número de copias genómicas/ mL 6 5 4 3 2 1 0 Afluente Efluente antes de UV Efluente después de UV B FIG. 4.8. Cuantificación del genoma viral de Rotavirus por qPCR según los puntos de muestreo. Cada línea une los tres puntos muestreados, cada muestreo se representa con diferente color. A: resultado de la PCR cuantitativa de las muestras del SL; B: resultado de la PTAR. 44 5. Discusión _____________________________________________________________________ La calidad del agua es de vital importancia para la salud humana. El hecho que exista un gran número de enfermedades transmitidas por el agua, saneamientos inadecuados y regulaciones mayormente basadas en indicadores bacterianos, los cuales son menos resistentes que los virus patogénicos; ha obligado a prestar especial atención al estudio de los virus en este tipo de ambientes. Los virus que se encuentran mayormente asociados a la transmisión por el agua son los virus entéricos, altamente resistentes, de bajas dosis infectivas y excretados en alto número en las heces, de los cuales Norovirus y Rotavirus, afectando adultos y niños, respectivamente, son los principales exponentes tanto en países desarrollados como en desarrollo. Generalmente, estos virus son introducidos en el ambiente como consecuencia de actividades humanas y se han aislado de fuentes de agua potable contaminada, aguas recreacionales, ríos urbanos, aguas residuales y mariscos contaminados, por lo que se han vinculado con brotes originados en estos ambientes. En las aguas residuales pueden encontrarse grandes cantidades de virus entéricos que se excretan en las heces y son transportadas por el sistema de saneamiento. Previo a la deposición final de estas aguas en los diferentes cuerpos receptores, se debe dar una especial importancia al tratamiento dado a las mismas, debido a la presencia de estos patógenos altamente resistentes. Es entonces por la gran importancia y constante seguimiento que merecen los procesos con lo que se tratan a las aguas previamente al contacto humano, que se han empezado a ahondar en estudios de virología ambiental, tanto en aguas recreacionales como residuales. Como ya se mencionó, este, en conjunto con otros trabajos sobre el estudio de los virus entéricos en muestras ambientales en nuestro país, son pioneros en la detección de estos virus en aguas. En este trabajo se detectó la presencia de Rotavirus en aguas residuales, para lo cual se llevaron a cabo, a lo largo de un año, 7 muestreos bimensuales de aguas procedentes de dos tipos de sistemas de tratamiento de aguas residuales, un sistema de lagunas y una planta de tratamiento terciario y radiación UV (Fig. 3.1). Primeramente, debido a la baja concentración de los virus entéricos en aguas, las partículas virales presentes en cada una de las muestras se concentraron mediante una técnica basada en una serie de ultracentrifugaciones, ampliamente utilizada en nuestro laboratorio para el mismo fin. El bacteriófago PP7, inoculado en esta etapa en 45 cada una de las muestras como control interno, se detectó luego en las siguientes etapas, descartando así fallos durante la concentración, extracción y/o procedimientos de PCR (Fig. 4.1 A). La detección del virus se realizó mediante una PCR convencional, contra un fragmento conservado de la región codificante para la proteína neutralizante VP6. Las muestras ambientales de aguas residuales pueden potencialmente contener una gran cantidad de inhibidores de PCR, resultando en falsos negativos, el hecho de haber obtenido la amplificación del fago en todas las muestras confirma que el procedimiento llevado a cabo ha sido correcto, no detectándose inhibidores en el proceso. El 36,6% de las muestras resultaron positivas por PCR convencional (Tabla 4). Los resultados obtenidos no siguen el patrón de estacionalidad esperado para Rotavirus, con picos de detección en los meses más fríos. Sin embargo, cabe preguntarse cuán significativos son estos datos, si los resultados cambiarían al realizar más muestreos y/o tomar más muestras de los diferentes puntos a evaluar (Fig. 4.2 A). En el caso de las muestras de la PTAR de Canelones, las detecciones fueron mayoritarias en muestras de afluentes y anteriores al tratamiento con UV, siendo las detecciones en muestras tratadas con UV nulas. Sin embargo, en el SL de Ecilda Paullier, al pasar de las muestras de afluentes a las de laguna facultativa y luego de maduración no se encontró la disminución esperada en detecciones virales (Fig. 4.2 B y C). Para poder determinar los genotipos presentes en cada una de las muestras, se amplificaron fragmentos conservados de los genes codificantes para las proteínas de cápside externa VP7 y VP4 mediante PCR anidada (Fig. 4.3). La técnica empleada es aplicada tanto en detección de Rotavirus en muestras ambientales de aguas provenientes de afluentes y efluentes de plantas de saneamiento, así como también en muestras clínicas; de hecho esta técnica es aplicada en muestras clínicas en otras líneas de investigación de nuestro laboratorio. El 19,5% de las muestras resultaron positivas para la detección de VP7 y 36,6% para VP4. En esta instancia, los resultados obtenidos en el caso del SL de Ecilda Paullier fueron la mayoría en muestras de afluentes y/o laguna facultativa, con sólo una detección en muestras de laguna de maduración (VP7). Sin embargo, para el caso de la PTAR de Canelones, el número de muestras positivas luego del tratamiento con radiación UV fue el mismo, no se observó una disminución como en el caso de la detección de VP6. Nuevamente debe plantearse cuan significativos son los datos obtenidos, si cambiarían al aumentar la toma de muestras [Tabla 5]. 46 Mientras que en la etapa de detección de VP6 el 36,6% de las muestras resultaron positivas; en la detección de VP7 y VP4, las muestras positivas fueron el 46%. Al detectar VP6, las detecciones que coincidieron con las de VP7 y VP4 fueron del 50% del total de las muestras positivas para dicha proteína. En el caso de VP7 y VP4, el porcentaje de coincidencias en detecciones respecto a VP6 fue similar, 47%. Si bien la tendencia general en cada uno de los muestreos fue la disminución de las detecciones a medida que avanza el tratamiento, en el SL las detecciones de VP6 en las muestras de la laguna de maduración, etapa final, fueron 3 a lo largo de todos los muestreos; sin embargo las detecciones de VP7 y VP4 fueron sólo una. Para el caso de la PTAR en cambio, las detecciones en la etapa final, tras el tratamiento con luz ultravioleta fueron mayores para VP7 y VP4. Se encontró que en un 100% de las muestras de afluentes de la PTAR Canelones se detectó la presencia de Rotavirus; en cambio, las muestras de afluentes del SL de Ecilda Paullier resultaron positivas para la detección del virus en un 71,4% (Tabla 6). Los porcentajes de detección mediante la PCR cuantitativa fueron mucho mayores respecto a los de ambas PCR convencionales realizadas en este trabajo. Para la detección de VP6, las muestras del SL que resultaron positivas fueron 43%, mientras que las de afluentes de PTAR 50%; y para VP7 y VP4, fueron de 29% y 57%, respectivamente. Esto demuestra la mayor sensibilidad en la detección viral de esta técnica, empleada rutinariamente en nuestro laboratorio en muestras ambientales. La mayoría de las muestras de la PTAR mostraron una carga viral nula, o en su defecto una reducción en la misma, tras el tratamiento con radiación UV. Un efecto similar se observó en algunos de los muestreos de SL, donde se detectó una carga viral reducida o nula en las muestras de laguna de maduración, si bien no fue el efecto mayoritario (Fig. 4.7). En esta oportunidad se pudo observar claramente el efecto de la radiación UV, debido a que la profundidad de la laguna maduración, que es menor que la de las lagunas anteriores (anaerobia y facultativa), hace a que dicha radiación llegue mejor a todos sus puntos. Este efecto no pudo ser observado para el SL en la etapa de detección por PCR convencional. Se realizó un análisis filogenético con las muestras positivas de la etapa de amplificación de las regiones conservadas de VP7 y VP4. Seis secuencias de VP7 se pudieron analizar e indicaron la presencia de genotipos comunes, detectados anteriormente en nuestro laboratorio a partir de muestras clínicas, como lo son los genotipos G1 y G9, así como también nuevos genotipos, como G3 y G10, que a pesar de que generalmente circulan en animales, agruparon con secuencias humanas (Fig. 47 4.5). En particular, la secuencia G10 encontrada agrupó con una cepa G10P[9] inusual (AY855063), la cual fue aislada de un niño de dos años hospitalizado con diarrea, vómitos y fiebre, en estrecha relación con una cepa bovina, B223, con genotipo G10P[11], con una identidad aminoacídica del 96,7% [Volotão y cols., 2006]. Los genotipos G10 son comúnmente detectados en ganado, y esporádicamente en humanos, con excepción de India, donde han sido detectados con alta frecuencia en neonatos o niños sintomáticos y neonatos asintomáticos. El genotipo P[9], se haya comúnmente en gatos, siendo entonces esta inusual cepa G10P[9], que agrupa con la secuencia G10 hallada en este estudio, una cepa única que ha pasado por varios rearreglos entre cepas humanas, bovinas y felinas [Volotão y cols., 2006]. En cuantos a los P-tipos detectados en este trabajo, los mismos fueron los más ampliamente distribuídos a nivel mundial, P[4] y P[8], así como también genotipos menos frecuentes como P[9] y P[11] (Fig. 4.6). En particular, las secuencias P[11] detectadas son de origen bovino; las mismas agrupan en un cluster enteramente de secuencias bovinas, una de ellas de la cepa B223, mencionada anteriormente [Hardy y cols., 1992]. Las secuencias P[9] halladas en este trabajo agruparon con la misma cepa inusual G10P[9] (AY855066), una cepa de la que existe evidencia de haber pasado por varios rearreglos entre cepas humanas, bovinas y felinas. El único caso en el que se pudo determinar tanto el G-tipo como el P-tipo presente en la muestra fue en la proveniente de la laguna facultativa del SL del muestreo de Agosto de 2012, donde el G-tipo detectado fue G9 y el P-tipo P[9], siendo la secuencia P[9] a su vez, aquella que agrupa con la cepa inusual ya descrita. Los genotipos detectados en este estudio probablemente coincidan con aquellos circulantes en cada una de las poblaciones, tanto de la localidad de Ecilda Paullier como para el caso de la ciudad de Canelones. Estos datos nos aportan información de base respecto a los genotipos circulantes en la población, lo cual debería ser verificado con un muestreo y estudio de muestras clínicas de ambas poblaciones. La efectividad del tratamiento sobre las muestras en cada uno de los dos sistemas se encuentra limitada por la falta de ensayos respecto a la infectividad de las partículas virales en cada una de las muestras que resultaron positivas. El hecho de que sea detectado el genoma viral en una muestra no implica que se trate de una partícula viral infectiva, puede suceder que una muestra positiva ante la detección por PCR convencional o real time PCR no sea infectiva, que haya perdido su capacidad de 48 replicación en las células del hospedero. Es necesario poder determinar si el genoma viral que se detecta se encontraba o no dentro de partículas infectivas. El cultivo celular integrado a PCR, ICC-PCR, por sus siglas en inglés “Integrated Cell Culture – PCR”, que consta de un pasaje por cultivo celular previo a la instancia de amplificación o cuantificación, supera las desventajas individuales de la técnica de PCR y de la de cultivo celular, ayudando a deshacerse de los inhibidores de PCR y proporcionando un sistema de amplificación in vitro que aumenta el número de virus, diferenciando entre infecciosos y no infecciosos [Reynolds, 2004]. Este estudio, pionero junto a otros trabajos sobre el estudio de virus entéricos en muestras ambientales en nuestro país, enmarcado en un proyecto CSIC I + D titulado “Detección de virus entéricos en aguas residuales y tratadas en Uruguay”, es el primer trabajo en el área de la virología ambiental que realiza la detección, cuantificación y caracterización molecular de Rotavirus en dos plantas con diferentes sistemas de tratamiento de aguas residuales. Tanto en el SL como el la PTAR se comprobó una disminución en las detecciones y carga viral de las muestras a medida que se avanzó en los respectivos procesos; sin embargo, esta disminución fue más notoria en el caso de la PTAR, tratamiento con radiación UV. Se logra evidenciar entonces la eficacia de ambos tratamientos en cuanto a la detección del virus en aguas residuales, si bien este efecto sólo es mayoritario en el caso de la PTAR de Canelones. Sin embargo, no es posible concluir nada respecto a la infectividad luego de cada tratamiento, debido a que, como ya se mencionó, la detección del genoma viral no implica la presencia de partículas virales viables e infectivas. 49 6. Conclusión y perspectivas _____________________________________________________________________ Se detectó la presencia de Rotavirus en aguas residuales en un 36,6% de las muestras mediante PCR convencional para la detección de VP6, en la mayoría de los casos previo a su tratamiento tanto en el SL como en la PTAR. Estos resultados, conjuntamente con otros de trabajos de detección de virus entéricos en aguas residuales, en el norte del país, son pioneros en el área. Sólo en el caso de la PTAR, mediante tratamiento con luz UV, el efecto de dicha radiación en la detección de este virus en aguas residuales pudo demostrarse por PCR convencional. Las detecciones mostraron un patrón distinto al esperado en cuanto a estacionalidad, siendo lo esperado picos de detección en los meses más fríos. Por PCR en tiempo real, en ambos casos hubo una disminución en la carga viral tras recibir el tratamiento, si bien no fue el efecto mayoritario en el caso del SL. Los porcentajes de detección mediante la PCR cuantitativa fueron mucho mayores respecto a los de ambas PCR convencionales realizadas en este trabajo, demostrando la mayor sensibilidad en la detección de esta técnica. Se genotipificaron las muestras de aguas residuales mediante un análisis filogenético. Se detectaron G-tipos comunes (G1-G9), detectados anteriormente en nuestro laboratorio a partir de muestras clínicas, y nuevos genotipos (G3-G10), que generalmente circulan en animales. Los P-tipos detectados fueron los más ampliamente distribuidos a nivel mundial (P[4]-P[8]), así como también genotipos menos frecuentes (P[9]-P[11]). Las secuencias G10 y P[9] encontradas agruparon con una cepa G10P[9] inusual, que ha pasado por varios rearreglos entre cepas humanas, bovinas y felinas. 50 Es necesario integrar a la etapa de PCR un paso previo por cultivo celular: ICC-PCR, para poder determinar si el genoma viral que se detecta se encuentra o no dentro de partículas infectivas. A nivel estadístico, sería adecuado sumar etapas de muestreo para ver cuán significativos son los resultados obtenidos. Estos datos serían de gran aporte si se realizara un estudio similar con muestras clínicas de la localidad de Ecilda Paullier y la ciudad de Canelones. 51 7. Bibliografía _____________________________________________________________________ 1. Abbaszadegan, M., Stewart, P. and LeChevallier, M., A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR. Appl Environ Microbiol, 1999. 65(2): p. 444-9. 2. Afrikanova, I., Fabbretti, E., Miozzo, M. C. and Burrone, O. R., Rotavirus NSP5 phosphorylation is up-regulated by interaction with NSP2. J Gen Virol, 1998. 79(11): p. 2679–86. 3. Alberti, A., Estudio epidemiológico de la proteína VP7 de Rotavirus Humano circulantes en Uruguay. Tesina de grado, 2008. Facultad de Ciencias, Universidad de la República. Montevideo, Uruguay. 4. Alberti, A., Detección molecular y variabilidad genética de Norovirus en pacientes y en aguas residuales del Uruguay. Tesis de maestría, 2012. Facultad de Ciencias, Universidad de la República. Montevideo, Uruguay. 5. Alfieri, A. A., Leite, J. P., Nakagomi, O., Kaga, E., Woods, P. A., Glass, R. I. and Gentsch, J. R., Characterization of human rotavirus genotype P[8]G5 from Brazil by probe-hybridization and sequence. Archives of Virology, 1996. 141(12): p. 2353–64. 6. Anderson, E. J. and Weber, S. G. Rotavirus infection in adults. Lancet Infect Dis, 2004; 4(2): p. 91–9. 7. Angel, J., Franco, M. A. and Greenberg, H.B. Rotavirus vaccines: recent developments and future considerations. Nat Rev Microbiol, 2007. 5(7): p. 529-39. 8. Aponte, C., Poncet, D. and Cohen, J. Recovery and characterization of a replicase complex in rotavirus-infected cells by using a monoclonal antibody against NSP2. J Virol, 1996. 70(2): p. 985–91. 9. Ball, J. M., Tian, P., Zeng, C. Q., Morris, A. P. and Estes, M. K., Age-dependent diarrhea induced by a rotaviral nonstructural glycoprotein. Science, 1996. 272(5258): p. 101-4. 52 10. Barril, P. A., Giordano, M. O., Isa, M. B., Masachessi, G., Ferreyra, L. J., Castello, A. A., Glikmann, G. and Nates, S. V., Correlation between Rotavirus A genotypes detected in hospitalized children and sewage samples in 2006, Córdoba, Argentina. J Med Virol, 2010. 82(7): p. 1277–81. 11. Bengochea, V., Genotipificación de Rotavirus mediante múltiplex RT-PCER en Uruguay. Tesina de grado, 2010. Facultad de Ciencias, Universidad de la República. Montevideo, Uruguay. 12. Berois, M., Libersou, S., Rusii, J., Arbiza, J. and Cohen, J., Genetic Variation in the VP7 Gene of Human Rotavirus Isolated in Montevideo-Uruguay From 1996-1999. J Med Virol, 2003. 71(3): p. 456-62. 13. Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A. and Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J Virol, 1982. 43(3): p. 1113-7. 11 14. Blackhall, J., Fuentes, A., Hansen, K. and Magnusson, G. Serine protein kinase activity associated with rotavirus phosphoprotein NSP5. J Virol, 1997. 71(1): p. 138-144. 15. Blanco Fernández, M. D., Torres, C., Martínez, L. C., Giordano, M. O., Masachessi, G., Barril, P. A., Isa, M. B., Campos, R. H., Nates, S.V. and Mbayed, V. A., Genetic and evolutionary characterization of norovirus from sewage and surface waters in Córdoba City, Argentina. Infect Genet Evol, 2011. 11(7): p. 1631-7. 16. Blanco Fernández, M. D., Torres, C., Poma, H. R., Riviello López, G., Martínez, L. C., Cisterna, D. M., Rajal, V. B., Nates, S. V. and Mbayed, V. A., Environmental surveillance of Norovirus in Argentina revealed distinct diversity patterns, seasonality and spatio-temporal diffusion processes. Sci Total Environ, 2012. 437: p. 262-69. 17. Bofill Mas, S., Pina, S. and Girones, R., Documenting the Epidemiologic Patterns of Polyomaviruses in Human Populations by Studying Their Presence in Urban Sewage. Appl Environ Microbiol, 2000. 66(1): p. 238-245. 53 18. Bok, K., Castagnaro, N., Borsa, A., Nates, S., Espul, C., Fay, O., Fabri, A., Grinstein, S., Miceli, I., Matson, D. O. and Gómez, J. A., Surveillance for rotavirus in Argentina. J Med Virol, 2001. 65(1): p. 190-8. 19. Bosch, A., Guix, S., Sano, D. and Pintó, R.M., New tools for the study and direct surveillance of viral pathogens in water. Curr Opin Biotechnol, 2008. 19(3): p. 295301. 20. Castello, A. A., Arvay, M. L., Glass, R. I. and Gentsch, J., Rotavirus strain surveillance in Latin America: a review of the last nine years. The Pediatr Infect Dis J, 2004. 23(10): p. 168-172. 21. Castello, A. A., Argüelles, M. H., Rota, R. P., Olthoff, A., Jiang, B., Glass, R. I., Gentsch, J. R. and Glikmann, G., Molecular epidemiology of group A rotavirus diarrhea among children in Buenos Aires, Argentina, from 1999 to 2003 and emergence of the infrequent genotype G12. J Clin Microbiol, 2006. 44(6): p. 204650. 22. CEUTA, UdelaR, IM. (2013). Estudio microbiológico de las aguas de lugares de recreación y baños: Virus. En: Diagnóstico socioambiental orientado al estudio de la parasitosis intestinales y zoonosis: una experiencia de investigación participativa en un contexto de alta vulnerabilidad social en Ciudad Barros Blancos, Canelones, Uruguay. CEUTA, Montevideo, p. 54-55. 23. Chandran, A., Fitzwater, S., Zhen, A. and Santosham, M., Prevention of rotavirus gastroenteritis in infants and children: rotavirus vaccine safety, efficacy, and potential impact of vaccines. Biologics, 2010. 4: p. 213-29. 24. Charpilienne, A., Nejmeddine, M., Berois, M., Parez, N., Neumann, E., Hewat, E., Trugnan, G. and Cohen, J., Individual rotavirus-like particles containing 120 molecules of fluorescent protein are visible in living cells. J Biol Chem, 2001. 276(31): p. 29361-7. 25. Charpilienne, A., Lepault, J., Rey, F. and Cohen, J. Identification of Rotavirus VP6 Residues Located at the Interface with VP2 That Are Essential for Capsid Assembly and Transcriptase Activity. J Virol, 2002. 76(15): p. 7822–31. 54 26. Ciarlet, M. and Estes, M. (2002) Rotaviruses: basic biology, epidemiology and methodologies. Encyclopedia of Environmental Microbiology, p. 2573-2773. 27. Cohen, J., Laporte, J., Charpilienne, A. and Scherrer, R., Activation of rotavirus RNA polymerase by calcium chelation. Arch Virol, 1979. 60(3-4):177–86. 28. Coluchi, N., Munford, V., Manzur, J., Vazquez, C., Escobar, M., Weber, E., Mármol, P. and Rácz, M. L., Detection, subgroup specificity, and genotype diversity of rotavirus strains in children with acute diarrhea in Paraguay. J Clin Microbiol, 2002. 40(5): p. 1709–1714. 29. Crawford, S. E., Labbé, M., Cohen, J., Burroughs, M. H., Zhou, Y. J. and Estes, M. K., Characterization of virus-like particles produced by the expression of rotavirus capsid proteins in insect cells. J Virol, 1994. 68(9): p. 5945-52. 30. CSIC. Proyecto CSIC I + D, “Detección de virus entéricos en aguas residuales y tratadas en Uruguay”, 2010. 31. Das, B. K., Gentsch, J. R., Cicirello, H. G., Woods, P. A., Gupta, A., Ramachandran, M., Kumar, R., Bhan, M. K. and Glass, R. I., Characterization of rotavirus strains from newborns in New Delhi, India. J Clin Microbiol, 1994. 32(7): p. 1820-2. 32. Dormitzer, P. R., Greenberg, H. B. and Harrison, S. C., Purified recombinant rotavirus VP7 forms soluble, calcium-dependent trimers. Virology, 2000. 277(2):420-28. 33. Estes, M. K., Graham, D. Y. and Petrie, B. L. (1985) Antigenic structure of rotaviruses. En: M. H. V. Van Regenmortel, A. R. Neurath (eds), Immunochemistry of viruses: the basis for serodiagnosis and vaccines. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, p. 389-405. 34. Estes, M. K. and Kapikian, A. Z. (2007) Rotaviruses. En: Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A., Roizman, B., Straus, S. E. (eds). Fields Virology, 5th edn, Vol. 2. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, p. 1917-74. 55 35. Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F. and Burrone, O. R., Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. J Gen Virol, 1999. 80(2): P. 333–9. 36. Fiore, L., Greenberg, H. B. and Mackow, E. R., The VP8 fragment of VP4 is the rhesus rotavirus hemagglutinin. Virology, 1991. 181(2): p. 553-63. 37. Fong, T. T. and Lipp, E. K., Enteric viruses of humans and animals in aquatic environments : health risks , detection , and potential water quality assessment tools. Microbiol Mol Biol Rev, 2005. 69(2): p. 357-71. 38. García, M., Identificación e investigación de virus gastroentéricos en la cuenca del Río Uruguay. Tesina de grado, 2012. Facultad de Ciencias, Universidad de la República. Montevideo, Uruguay. 39. Gentsch, J.R., Glass, R. I., Woods, P., Gouvea, V., Gorziglia, M., Flores, J., Das, B. K. and Bhan, M. K., Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1992. 30(6): p. 1365-73. 40. Gentsch, J. R., Laird, A. R., Bielfelt, B., Griffin, D. D., Banyai, K., Ramachandran, M., Jain, V., Cunliffe, N. A., Nakagomi, O., Kirkwood, C. D., Fischer, T. K., Parashar, U. D., Bresee, J. S., Jiang, B. and Glass, R.I., Serotype diversity and reassortment between human and animal rotavirus strains: implications for rotavirus vaccine programs. J Infect Dis, 2005. 192(1): p. 146-159. 41. Gilbert, J. M. and Greenberg, H. B., Cleavage of Rhesus Rotavirus VP4 after Arginine 247 Is Essential for Rotavirus-Like Particle-Induced Fusion from Without. J Virol, 1998. 72(6): p. 5323-7. 42. Gómara, M. I., Cubitt, D., Desselberger, U. and Gray, J. Amino acid substitution within the VP7 protein of G2 rotavirus strains associated with failure to serotype. J Clin Microbiol, 2001. 39(10): p. 3796-98. 43. González, S. A. and Burrone, O. R., Rotavirus NS26 is modified by addition of single O-linked residues of N-acetylglucosamine. Virology, 1991. 182(1): 8–16. 56 44. Gouvea, V., Glass, R. I., Woods, P., Taniguchi, K., Clark, H. F., Forrester, B. and Fang, Z. Y., Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. J Clin Microbiol, 1990. 28(2): p. 276-82. 45. Gouvea, V. (1993), PCR detection of rotavirus. En: Persing, Tenover, White (eds). Diagnostic Molecular Microbiology, Principles and Applications. Washington DC, ASM press. 46. Graff, J. W., Mitzel, D. N., Weisend, C. M., Flenniken, M. L. and Hardy, M. E., Interferon Regulatory Factor 3 Is a Cellular Partner of Rotavirus NSP1. J Virol, 2002 76(18): P. 9545-50. 47. Greenberg, H. B. and Estes, M.K., Rotaviruses: from pathogenesis to vaccination. Gastroenterology, 2009. 136(6): p. 1939–51. 48. Guerrero, C. A., Méndez, E., Zárate, S., Isa, P., López, S. and Arias, C.F., Integrin alpha(v)beta(3) mediates rotavirus cell entry. Proc. Natl Acad Sci USA, 2000. 97(26): p. 14644-9. 49. Guglielmi, K. M., McDonald, S. M. and Patton, J. T., Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. J Biol Chem, 2010. 285(24): p. 18123-8. 50. Haas, C. N., Rose, J. B., Gerba, C. P. and Regli, S., Risk assessment of viruses in drinking water. Risk Anal, 1993. 13(5): p. 545-52. 51. Hardy, M. E., Gorziglia, M. and Woode, G. N., Amino acid sequence analysis of bovine rotavirus B223 reveals a unique outer capsid protein VP4 and confirms a third bovine VP4 type. Virology, 1992. 191(1): p. 291-300. 52. Hewish, M. J., Takada, Y. and Coulson B. S., Integrins alpha2beta1 and alpha4beta1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells. J Virol, 2000. 74(1): 228-36. 53. Horie, Y., Nakagomi, O., Koshimura, Y., Nakagomi, T., Suzuki, Y., Oka, T., Sasaki, S., Matsuda, Y. and Watanabe, S., Diarrhea induction by rotavirus 57 NSP4 in the homologous mouse model system. Virology, 1999. 262(2): p. 398407. 54. Hyser, J. M. and Estes, M. K., Rotavirus Vaccines and Pathogenesis: 2008. Curr Opin Gastroenterol, 2009. 25(1): 36–43. 55. IM. Sistema de Saneamiento de Montevideo. 2012; Disponible en: http://www.montevideo.gub.uy/ciudadania/desarrolloambiental/saneamiento/sistema-de-saneamiento. 56. Iturriza-Gomara, M., Isherwood, B., Desselberger, U. and Gray, J., Reassortment in vivo: driving force for diversity of human rota- virus strains isolated in the United Kingdom between 1995 and 1999. J Virol, 2001. 75(8): p. 3696-705. 57. Jayaram, H., Taraporewala, Z., Patton, J. T. and Prasad, B. V., Rotavirus protein involved in genome replication and packaging exhibits a HIT-like fold. Nature, 2002. 417(6886): p. 311-5. 58. Kalica, A. R., Flores, J. and Greenberg, H. B., Identification of the rotaviral gene that codes for hemagglutination and protease-enhanced plaque formation. Virology, 1983. 125(1): p. 194-205. 59. Kineseología al alcance de todos. Infección por Rotavirus. 2010. Disponible en: http://kinexpert.bligoo.com/content/view/1041102/Infeccion-por-Rotavirus.html 60. Leite, J.P., Alfieri, A. A., Woods, P. A., Glass, R. I. and Gentsch, J. R., Rotavirus G and P types circulating in Brazil: characterization by RT-PCR, probe hybridization, and sequence analysis. Arch Virol, 1996. 141(12): 2365-74. 61. Leite, J. P., Carvalho-Costa, F. A. and Linhares, A. C., Group A rotavirus genotypes and the ongoing Brazilian experience: a review. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2008; 103(8): 745-53. 62. Li, Z., Baker, M.L., Jiang, W., Estes, M.K. and Prasad, B.V., architecture at subnanometer resolution. J Virol, 2009. 83(4):1754-66. Rotavirus 58 63. Linhares, A. C., Stupka, J. A., Ciapponi, A., Bardach, A. E., Glujovsky, D., Aruj, P. K., Mazzoni, A., Rodriguez, J. A., Rearte, A., Lanzieri, T. M., Ortega-Barria, E. and Colindres, R., Burden and typing of rotavirus group A in Latin America and the Caribbean: systematic review and meta-analysis. Rev Med Virol, 2011. 21(2): p. 89–109. 64. Lizasoaín, A., Análisis de virus entéricos en plantas de tratamiento de aguas residuales en el interior de Uruguay. Tesina de grado, 2012. Facultad de Ciencias, Universidad de la República. Montevideo, Uruguay. 65. Logan, C., O’Leary, J. J. and O’Sullivan, N., Real-Time Reverse TranscriptionPCR for Detection of Rotavirus and Adenovirus as Causative Agents of Acute Viral Gastroenteritis in Children. J Clin Microbiol, 2002. 44(9): p. 3189-95. 66. Lu, X., McDonald, S. M., Tortorici, M. A., Tao, Y. J., Vasquez-Del Carpio, R., Nibert, M. L., Patton, J. T. and Harrison, S. C., Mechanism for coordinated RNA packaging and genome replication by rotavirus polymerase VP1. Structure, 2008. 16(11): p. 1678-88. 67. Ludert, J. E., Feng, N., Yu, J. H., Broome, R. L., Hoshino, Y. and Greenberg, H. B., Genetic mapping indicates that VP4 is the rotavirus cell attachment protein in vitro and in vivo. J Virol, 1996. 70(1): p. 487-93. 68. Ludert, J. E., Ruiz, M. C., Hidalgo, C. and Liprandi, F., Antibodies to rotavirus outer capsid glycoprotein VP7 neutralize infectivity by inhibiting virion decapsidation. J Virol, 2002. 76(13): p. 6643-51. 69. Matthijnssens, J., Ciarlet, M., McDonald, S. M., Attoui, H., Bányai, K., Brister, J. R., Buesa, J., Esona, M. D., Estes, M. K., Gentsch, J. R., Iturriza-Gómara, M., Johne, R., Kirkwood, C. D., Martella, V., Mertens, P. P., Nakagomi, O., Parreño, V., Rahman, M., Ruggeri, F. M., Saif, L. J., Santos, N., Steyer, A., Taniguchi, K., Patton, J. T., Desselberger, U. and Van Ranst, M., Uniformity of rotavirus strain nomenclature proposed by the Rotavirus Classification Working Group (RCWG). Arch Virol, 2011. 156(8): p. 1397-413. 59 70. McClain, B., Settembre, E., Temple, B. R., Bellamy, A.R. and Harrison, S. C., Xray crystal structure of the rotavirus inner capsid particle at 3.8 A resolution. J Mol Biol, 2010: 397(2): p. 587-99. 71. McDonald, S. M. and Patton, J. T. (2009), Core-associated genome replication mechanisms of dsRNA viruses. En: Cameron, C., Gotte, M. and Raney, K. D. (eds). Viral genome replication. Springer Science and Business Media, New York, NY, p. 201-24. 72. McDonald, S. M., Tao, Y. J. and Patton, J. T., The ins and outs of four-tunneled Reoviridae RNA- dependent RNA polymerases. Curr Opin Struct Biol, 2009. 19(6): p. 775-82. 73. Mehnert, D. U. and Stewien, K. E., Detection and distribution of rotavirus in raw sewage and creeks in Sao Paulo, Brazil. Appl Environ Microbiol, 1993. 59(1): p. 140-3. 74. Mertens, P. P. C., Duncan, R., Attoui, H. and Dermody, T. S. (2005), Reoviridae. En: Fauquet, C., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U. and Ball, L. A. (eds). Virus Taxonomy: Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Alsevier, Academic Press; Amsterdam, Holland, p. 447-560. 75. Miagostovich, M. P., Ferreira, F. F., Guimarães, F. R., Fumian, T. M., DinizMendes, L., Luz, S. L., Silva, L. A. and Leite, J. P., Molecular detection and characterization of gastroenteritis viruses occurring naturally in the stream waters of Manaus, central Amazonia, Brazil. Appl Environ Microbiol, 2008. 74(2): p. 37582. 76. O'Ryan, M., Pérez-Schael, I., Mamani, N., Peña, A., Salinas, B., González, G., González, F., Matson, D.O. and Gómez, J., Rotavirus-associated medical visits and hospitalizations in South America: a prospective study at three large sentinel hospitals. Pediatr Infect Dis J, 2001; 20(7): p. 685-93. 77. O. S. E. Obras Sanitarias del Estado. Tratamientos aplicados. 2013; Disponible en: http://www.ose.com.uy/s_tratamientos_aplicados 60 78. Patton, J. T., and Gallegos, C. O., Structure and protein composition of the rotavirus replicase particle. Virology, 1988. 166(2): p. 358-65. 79. Pina, S., Puig, M., Lucena, F., Jofre, J. and Girones, R. Viral Pollution in the Environment and in Shellfish: Human Adenovirus Detection by PCR as an Index of Human Viruses Appl Environ Microbiol, 1998. 64(9): p. 3376-3382. 80. Poma, H. R., Gutiérrez Cacciabue, D., Garcé, B., Gonzo, E. E. and Rajal, V.B., Towards a rational strategy for monitoring of microbiological quality of ambient waters. Sci Total Environ, 2012. 433: p. 98-109. 81. Prasad, B. V., Wang, G. J., Clerx, J. P. and Chiu, W., Three-dimensional structure of rotavirus. J Mol Biol, 1988. 199(2): p. 269-75. 82. Prasad, B. V., Rothnagel, R., Zeng, C. Q., Jakana, J., Lawton, J. A., Chiu, W. and Estes, M. K., Visualization of ordered genomic RNA and localization of transcriptional complexes in rotavirus. Nature, 1996. 382(6590): p. 471-73. 83. Rajal, V. B., McSwain, B. S., Thompson, D. E., Leutenegger, C. M., Kildare, B. J. and Wuertz, S., Validation of hollow fiber ultrafiltration and real-time PCR using bacteriophage PP7 as surrogate for the quantification of viruses from water samples. Water Res, 2007. 41(7): p. 1411-22. 84. Ramig, R. F., Ciarlet, M., Mertens, P. P. C. and Dermody, T. S., Rotavirus. En: Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U. and Ball, L. A., (eds). Virus Taxonomy: Eight Report of the International Committee on taxonomy of Viruses. Elsevier, Academic Press; Amsterdam, Holland: 2005. p. 484-496. 85. Reynolds, K. A., Integrated cell culture/PCR for detection of enteric viruses in environmental samples. Methods Mol Biol, 2004. 268: p. 69-78. 86. Rigotto, C., Victoria, M., Moresco, V., Kolesnikovas, C. K., Corrêa, A. A., Souza, D. S., Miagostovich, M. P., Simões, C. M. and Barardi, C. R., Assessment of adenovirus, hepatitis A virus and rotavirus presence in environmental samples in Florianopolis, South Brazil. J Appl Microbiol, 2010. 109(6): p. 1979-87. 61 87. Ruggeri, F. M., and Greenberg, H. B., Antibodies to the trypsin cleavage peptide VP8* neutralize rotavirus by inhibiting binding of virions to target cells in culture. J Virol, 1991. 65(5): p. 2211-9. 88. Sanchez-Padilla, E., Grais, R. F., Guerin, P.J., Steele, A. D., Burny, M. E. and Luquero, F.J., Burden of disease and circulating serotypes of rotavirus infection in sub- Saharan Africa: systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis, 2009; 9(9): 567–576. 89. Santos, N. and Hoshino, Y., Global distribution of rotavirus serotypes/genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine. Rev Med Virol, 2005. 15(1): p. 29-56. 90. Schlindwein, A. D., Rigotto, C., Simões, C. M. and Barardi, C. R., Detection of enteric viruses in sewage sludge and treated wastewater effluent. Water Sci Technol, 2010. 61(2): p. 537-44. 91. Simmonds, M. K., Armah, G., Asmah, R., Banerjee, I., Damanka, S., Esona, M., Gentsch, J. R., Gray, J. J., Kirkwood, C., Page, N. and Iturriza-Gómara, M., New oligonucleotide primers for P-typing of rotavirus strains: Strategies for typing previously untypeable strains. J Clin Virol, 2008. 42(4): p. 368-73. 92. Steele, A. D., Peenze, I., de Beer, M. C., Pager, C.T., Yeats, J., Potgieter, N., Ramsaroop, U., Page, N. A., Mitchell, J. O., Geyer, A., Bos, P. and Alexander, J. J., Anticipating rotavirus vaccines: epidemiology and surveillance of rotavirus in South Africa. Vaccine, 2003. 21(5-6): p. 354-60. 93. Svensson, L., Sheshberadaran, H., Vesikari, T., Norrby, E. and Wadell, G., Immune response to rotavirus polypeptides after vaccination with heterologous rotavirus vaccines (RIT 4237, RRV-1). J Gen Virol, 1987. 68(7): p. 1993-9. 94. Symonds, E.M., Griffin, D. W. and Breitbart, M., Eukaryotic viruses in wastewater samples from the United States. Appl Environ Microbiol, 2009. 75(5): p. 1402-9. 95. Taraporewala, Z., Chen, D. and Patton, J. T., Multimers formed by the rotavirus nonstructural protein NSP2 bind to RNA and have nucleoside triphosphatase activity. J Virol, 1999. 73(12): p. 9934-43. 62 96. Taraporewala, Z. F., and Patton, J. T., Identification and characterization of the helix-destabilizing activity of rotavirus nonstructural protein NSP2. J Virol, 2001 75(10): p. 4519-27. 97. Torres, M. E., Pírez, M. C., Schelotto, F., Varela, G., Parodi, V., Allende, F., Falconi, E., Dell'Acqua, L., Gaione, P., Méndez, M. V., Ferrari, A. M., Montano, A., Zanetta, E., Acuña, A. M., Chiparelli, H. and Ingold, E., Etiology of children's diarrhea in Montevideo, Uruguay: associated pathogens and unusual isolates. J Clin Microbiol, 2001. 39(6): p.2134-9. 98. Tortorici, M. A., Broering, T. J., Nibert, M. L. and Patton, J. T., Template recognition and formation of initiation complexes by the replicase of a segmented double-stranded RNA virus. J Biol Chem, 2003. 278(35): p. 32673-82. 99. Vende, P., Piron, M., Castagne, N., Cohen, J. and Poncet, D., Rotavirus RNAbinding protein NSP3 interacts with eIF4GI and evicts the poly(A) binding protein from eIF4F. EMBO J, 1998. 17(19): p. 5811-21. 100. Vende, P., Taraporewala, Z. F. and Patton, J. T., RNA-binding activity of the rotavirus phosphoprotein NSP5 includes affinity for double-stranded RNA. J Virol, 2002. 76(10): p.5291-9. 101. Victoria, M., Guimarães, F. R., Fumian, T. M., Ferreira, F. F., Vieira, C. B., Shubo, T., Leite, J.P. and Miagostovich, M. P., One year monitoring of norovirus in a sewage treatment plant in Rio de Janeiro, Brazil. J Water Health, 2009. 8(1): p. 158-65. 102. Volotão, E. M., Soares, C. C., Maranhão, A. G., Rocha, L. N., Hoshino, Y. and Santos, N. Rotavirus surveillance in the city of Rio de Janeiro – Brasil during 2000-2004: detection of unusual strains with G8P[4] or G10P[9] specifities. J Med Virol, 2006. 78(2): p. 263-72. 103. Wentz, M. J., Patton, J. T. and Ramig, R. F., The 3’-terminal consensus sequence of rotavirus mRNA is the minimal promoter of negative-strand RNA synthesis. J Virol, 1996. 70(11): p. 7833-41. 63 104. WHO. World Health Organization. Global rotavirus information and surveillance bulletin. Reporting period: January through December 2010. 2012. Disponible en: http://www.who.int/nuvi/surveillance/Final_RV_bulletin_Jan_Dec_2010_Data.pdf 105. Zeng, C. Q., Labbé, M., Cohen, J., Prasad, B. V., Chen, D., Ramig, R. F. and Estes, M. K., Characterization of rotavirus VP2 particles. Virology, 1994. 201(1): p. 55-65. 106. Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L. and Vesikari, T., One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis. J Virol Methods, 2008. 153(2): p. 238-40. 64 8. Agradecimientos _____________________________________________________________________ Este trabajo, la dedicación y los sueños que llevan detrás, fue realizado gracias a muchas personas que han forjado la persona que hoy soy. Mis maestros que me acompañaron en los hermosos años en el Jardín No140 primero, y en la Escuela No10 luego. Mis profesores que siguieron el trabajo de los maestros sin dejar de brindarme la mejor educación que mi país, debo decir con orgullo, me dio gratuitamente, sólo pidiéndome a cambio un poco de entusiasmo y otro tanto más de esfuerzo. Mis amigas y amigos, aquellos que han estado a mi lado desde siempre, que Dios me ha dado la dicha de conservarlos a pesar de todo; y a aquellos que esta hermosa carrera me ha dado. Mi amiga adorada Elisa, quien a pesar de habernos dejado con tantos momentos por compartir hace mucho tiempo, ha estado presente en cada día de mi vida, lo está y lo seguirá estando. Mi familia, los primos y primas, los tíos, que nunca dejaron de preguntar por mí y mis exámenes, aquellos que nunca olvidaron prender las velitas a la hora de rendir, quienes en estos difíciles momentos de mi vida nunca dejaron de estar. A mis hermanos, a mi sobrina, soles adorados de mi vida, luchadores incansables. Todos los docentes de Facultad de Ciencias que me han formado en estos años, quienes despertaron en mí una profunda admiración, al grado de grabar en mi memoria clases y charlas de esas que no se pueden comprar. Quiero agradecerle a Mabel Berois por la oportunidad y la confianza, a Juan Arbiza por abrirme las puertas de su laboratorio, a toda la sección virología por todos los momentos compartidos. A Luciana Gillman y Alvaro Alberti, a Virginia Bengochea y Andrés Cabrera, quienes tuvieron infinita paciencia. A Darío Porley por el aguante, los mates y el oído. A la Universidad de la República y a mi paisito por mi educación. A la ANII y al CSIC por la oportunidad. 65 Pero por sobre todo, quiero agradecerle a la mujer más luchadora, a aquella que antes de pensar en si misma pensó en nosotros, la mujer más linda que he conocido, la que siempre estuvo, la que siempre escuchó, la que siempre aconsejó, eterna confidente; la que sacó adelante a mis hermanos contra todo pronóstico, a quién ha dejado todo por mí, a mi madre, el ser que yo más amo, y a quién estaré eternamente agradecida. Mi felicidad hoy es para vos madre mía.
